ES2369415T3 - Procedimientos de diagnóstico que implican la determinación del número de copias de genes y de snp en el grupo de genes fc rii/fc riii y sondas para utilizar en dichos procedimientos para detectar la susceptibilidad a enfermedades autoinmunes y la eficacia de su tratamiento. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para determinar si un individuo está predispuesto a desarrollar la enfermedad de Kawasaki (KD) o Púrpura Trombocitopénica Idiopática (ITP), que comprende: - determinar en una muestra aislada de dicho individuo la cantidad de los genes en el grupo de genes FcγRII/FcγRIII, comprendiendo dicho grupo de genes los genes FCGR2C, FCGR3A, FCGR2A y FCGR3B, que codifican un FcγR activador y FCGR2B que codifica un FcγR inhibidor, en el que la determinación de la cantidad de dichos genes comprende, como mínimo, determinar la presencia del gen FCGR2C-ORF, opcionalmente además comprende detectar un polimorfismo de nucleótido simple (SNP) en un exón, intrón y/o región promotora, como mínimo, de un gen seleccionado del grupo que comprende FCGR2C, FCGR2B, FCGR2A, FCGR3A y FCGR3B; y - correlacionar dicha cantidad con la cantidad observada en una población sana; en el que una cantidad mayor de los genes que codifican un FcγR activador, y/o una cantidad menor del gen que codifica un FcγR inhibidor es indicativa de que tiene mayor probabilidad de desarrollar KD o ITP.

Description

Procedimientos de diagnóstico que implican la determinación del número de copias de genes y de SNP en el grupo de genes FC RII/FC RIII y sondas para utilizar en dichos procedimientos para detectar la susceptibilidad a enfermedades autoinmunes y la eficacia de su tratamiento

La presente invención se refiere a los sectores de la inmunología y la medicina molecular. En particular, se refiere a procedimientos de diagnóstico que implican la determinación de la cantidad de genes intactos del grupo de genes FcγRII/FcγRIII y la utilización de los mismos en tratamiento de enfermedades, por ejemplo, para predecir si un individuo está predispuesto a contraer una enfermedad o para predecir la respuesta terapéutica de un paciente individual. También se refiere a las sondas y construcciones de ácidos nucleicos para utilizar en dichos procedimientos.

La secuenciación del genoma humano ha dado lugar a muchos avances técnicos y ha estimulado el descubrimiento de varios hitos de la genómica. Un área es el desarrollo de un amplio conjunto de marcadores polimórficos para el mapeo de genes. La forma más común de la variación de la secuencia de ADN es un polimorfismo de nucleótido simple (SNP), pero, además, existen polimorfismos de repetición de microsatélites y polimorfismos de inserción/deleción. Mientras que los microsatélites y SNP han sido muy bien caracterizados en términos de su localización genómica y sus frecuencias en distintas poblaciones, los polimorfismos de inserción/deleción no están tan bien caracterizados. Trabajos recientes (véase, por ejemplo, Sebat J. y otros, Large-scale copy number polymorphism (CNP) in the human genome. Science 2004, 305: 525-528) describen la identificación de grandes (de varias kilobases a megabases) deleciones y duplicaciones de fragmentos de ADN cuando se compararon genomas de individuos normales. La identificación y caracterización de los polimorfismos de número de copias (CNP) muestran que, además de diferencias de un solo nucleótido, los genomas de individuos no relacionados tienen grandes regiones de miles hasta millones de nucleótidos que son diferentes.

Desde una perspectiva funcional, las diferencias del número de copias del gen puede contribuir a la variación en la expresión génica. Los CNP de regiones de codificación y reguladoras es probable que puedan afectar la expresión de genes en los niveles de transcrito y/o proteína. Estudios de expresión génica han demostrado que diferencias sutiles en los niveles de expresión de genes tienen consecuencias significativas. Por ejemplo, el polimorfismo de número de copias del grupo de genes de las defensinas probablemente explica la variación natural en el nivel de expresión de DEFB4 que, a su vez, podrían explicar las diferencias individuales en la defensa inmune (Linzmeier y otros, Genomics 2005; 86:423-30). Por otra parte, González y otros (Science. 2005; 307:1434-40) informaron que la posesión de un número de copias de CCL3L1 menor que el promedio de la población se asocia con una susceptibilidad marcadamente aumentada del VIH/ síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Cappuzzo y otros (J. Natl Cancer Inst. 2005; 97:643-55) dieron a conocer que pacientes con cáncer de pulmón no de células pequeñas avanzado cuyas células tumorales contienen copias adicionales del gen del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) pueden ser más propensas a responder al medicamento gefitinib (Iressa), y sugirieron que este elevado número de copias de genes puede ser una manera eficaz de determinar la eficacia de gefitinib.

Por lo tanto, se está acumulando evidencia de que los polimorfismos de número de copias (CNP) y su efecto global sobre la expresión de genes contribuye de manera significativa a la variación que subyace en las diferencias individuales en la predisposición a enfermedades complejas.

Es un objetivo de la presente invención dar a conocer nuevos marcadores de diagnóstico para enfermedades autoinmunes, en particular, marcadores que se pueden utilizar para predecir si a) el individuo está predispuesto para desarrollar una enfermedad autoinmune y, b) una vez que el individuo ha sido diagnosticado con una enfermedad autoinmune, si el individuo individual seguirá un curso severo o benigno de la enfermedad o si la enfermedad se desarrollará en una forma crónica y, c) si el individuo individual diagnosticado con una enfermedad autoinmune responderá a ciertos tipos de terapia.

Estos objetivos se cumplen por el descubrimiento que los genes del grupo de genes FcγRII/FcγRIII se utilizan de forma adecuada como marcadores de pronóstico para las principales enfermedades autoinmunes, así como para predecir el desarrollo de la enfermedad y/o la respuesta a la terapia con inmunoglobulina intravenosa (IgIV). Tal como se describe en detalle más adelante, los inventores se dedicaron a medir el número de copias y los SNP de genes en el grupo de genes FcγRII y FcγRIII humanos en el cromosoma 1q21-23. Mediante la utilización de cebadores diseñados para hibridar en las regiones de los genes FcγRII y RIII que son específicos para los genes, se determinó el número de copias de los genes FcγRII y FcγRIII en individuos humanos que sufren de una enfermedad autoinflamatoria. Más específicamente, los datos obtenidos de pacientes que sufren de una enfermedad autoinflamatoria en la infancia, la denominada enfermedad de Kawasaki, y de pacientes que tienen púrpura trombocitopénica inmune (ITP) se compararon con los individuos de control.

La enfermedad de Kawasaki es un síndrome febril agudo en la infancia, que se caracteriza por una vasculitis principalmente de las arterias de tamaño mediano. Puesto que no hay pruebas específicas para diagnosticar la enfermedad, el diagnóstico se hace mediante criterios clínicos. En esta forma de vasculitis pediátrica, se utilizan altas dosis de infusiones de inmunoglobulina intravenosa como tratamiento estándar para prevenir la lesión de la arteria coronaria. Tal como se da a conocer en el presente documento, se encontró que los pacientes con la enfermedad de Kawasaki como promedio tienen una cantidad diferente del número habitual de dos genes FCGR2B por genoma, cuando se normalizaron en relación a varios genes de referencia (CYBB como gen ligado al cromosoma X, SRY como gen ligado al cromosoma Y y ALB que codifica la proteína plasmática albúmina de suero humana, como un gen autosómico). Las variaciones del número de copias del gen en los pacientes e individuos de control se muestran en los ejemplos más adelante. Burnea y otros (Genes Immun. 2005; 6(5): 438-44) dan a conocer la asociación de la variación genética en el gen de IL-4 o regiones unidas a éste y la susceptibilidad y patogénesis de la enfermedad de Kawasaki.

La ITP es una enfermedad caracterizada por trombocitopenia con líneas celulares normales de otra manera y sin otra explicación para la trombocitopenia aislada. La destrucción de las plaquetas sensibilizadas por anticuerpos por las células fagocíticas que contienen FcγR en el sistema retículoendotelial juega un papel importante, aunque la patofisiología exacta de este trastorno autoinmune no se conoce de forma precisa. El papel de los preceptores de Fc se ha subrayado por el hecho que el tratamiento con inmunoglobulina intravenosa (IVIg), a través del bloqueo de los receptores de Fc para IgG y la esplenectomía (extracción del órgano que destruye las plaquetas) son opciones de tratamiento eficaces. Dijstolbloem y otros (Trends Immunol. 2001; 22(9): 510-6) describen el tratamiento de enfermedades autoinmunes relacionadas con la desregulación de receptores de Fcγ, entre las que está púrpura trombocitopenia idiopática, con Ig intravenosa (IVIg).

Estudios anteriores relacionados con polimorfismos en el grupo de genes FCGR en pacientes con ITP muestran resultados contradictorios. En un estudio que involucró 116 pacientes con ITP, los presentes inventores encontraron una variación aumentada en el grupo de genes FCGR2 y FCGR3 en pacientes caucásicos en comparación con pacientes caucásicos sanos de control. Por ejemplo, un 82% de la población sana es homocigótica para un SNP que convierte una glutamina en el marco de lectura abierto (ORF) de FGCR2C en un codón de parada, haciendo de FCGR2 un seudogén no expresado. El resto (18%) de la población sana contiene FCGR2-ORF. Por el contrario, se encontró que el 36% de los pacientes con ITP portan, como mínimo, un alelo FCGR2-ORF, que da como resultado la expresión de un PcγRIIc funcionalmente activo. Además, se observó una diferencia significativa en la frecuencia genotípica y alélica del polimorfismo promotor –386G/C. El genotipo –386CC fue raro y solamente se observó en un paciente con ITP. En las mismas series de muestras de ADN, se confirmó que la sobrerrepresentación observada previamente del SNP en FCGR3A que codifica la variante PcyRIIa-158V, es la más prevalente en ITP con comienzo en la infancia (p=0,0006) y no en ITP con comienzo en la adultez (p=0,3).

Estos estudios indican que las cantidades relativas de FcγR activadoras contra inhibidoras son indicativas del desarrollo de una enfermedad autoinmune. Se ha informado anteriormente que anticuerpos contra FcγRII pedido por el solicitante el 13.4.11 podrían hacer una distinción entre sano y enfermo en autoinmunidad u otra, pero esto es correcto. Aunque la relevancia de dicho desequilibrio entre los receptores de FcγRII activadores e inhibidores se ha sugerido de forma repetida, hasta la fecha todos estos estudios se han basado en la utilización de anticuerpos no específicos que, en primer lugar, no pueden diferenciar entre las diferentes isoformas de FcγRII [Nakatani y otros, Clin. Exp. Immunol. 1999; 117:418-22; Van Wijngaarden y otros, Rheumatology 2003; 42:681-8]. Además, los autores a menudo se refieren a patrones de tinción con anticuerpos monoclonales (MoAbs) en células inmunes que se conoce que tienen niveles de expresión altamente variables de FcγRs debido a la activación in vivo o in vitro por factores de crecimiento, citoquinas o desencadenadores inflamatorios. La solicitud de patente de EEUU 2004/0186045 da a conocer anticuerpos que se unen específicamente a FcγRIIB con mayor afinidad que a FcγRIIA y un procedimiento para el diagnóstico de púrpura trombocitopenia idiopática empleando dichos anticuerpos. Los presentes inventores muestran que los “MoAbs específicos de FcγRIIb” recientemente desarrollados que siempre se había asumido que se unían exclusivamente a FcγRIIb, también se unen a células que expresan FcγRIIc. Debido a los dominios extracelulares idénticos de FcγRIIb y FcγRIIc, estas observaciones son de esperar en individuos que portan el alelo no común FCGB2C-ORF y, por lo tanto, que expresan FcγRIIc. En resumen, una estrategia genética para cuantificar la variabilidad de los CNP y SNP en el grupo de genes FCGR, preferentemente en un ensayo único tal como se ha propuesto por los presentes inventores, es la manera más fiable de ensayar la susceptibilidad a la enfermedad, la severidad de la enfermedad y la eficacia del tratamiento en procesos mediados por IgG a partir de cambios en este grupo de genes.

En el presente documento, la presente invención da a conocer un procedimiento para determinar si un individuo está predispuesto para desarrollar la enfermedad de Kawasaki o púrpura trombocitopénica idiopática que comprende la determinación en una muestra aislada de dicho individuo de la cantidad de los genes en el grupo de genes FcγRII/FcγRIII, comprendiendo dicho grupo de genes los genes FCGR2C, FCGR3A, FCGR2A y FCGR3B, que codifican un FcγR activador y FCGR2B que codifica un FcγR inhibidor, en el que la determinación de la cantidad de dichos genes comprende, como mínimo, determinar la presencia del gen FCGR2C-ORF, opcionalmente además comprende detectar un polimorfismo de nucleótido simple (SNP) en un exón, intrón y/o región promotora, como mínimo, de un gen seleccionado del grupo que comprende FCGR2C, FCGR2B, FCGR2A, FCGR3A y FCGR3B; y correlacionar dicha cantidad con la cantidad observada en una población sana, en el que una cantidad mayor del gen que codifica un FcγR activador (es decir, FCGR2C, FCGR3A, FCGR2A y FCGR3B) y/o una cantidad menor del gen que codifica un FcγR inhibidor (es decir, FCGR2B) es indicativa de que tiene mayor probabilidad de desarrollar la enfermedad de Kawasaki o ITP.

La expresión “FcγR activador” se refiere a un FcγR que es funcionalmente activo y capaz de proporcionar señalización estimuladora o positiva. También comprende las variantes “hiperactivas” o receptores mutantes que muestran una mayor actividad en comparación con sus homólogos normales, por ejemplo resultantes de un SNP. De forma similar, un “FcγR inhibidor” se refiere a un FcγR que es funcionalmente activo y capaz de proporcionar señalización inhibitoria o negativa.

Según la presente invención, un gen puede ser una secuencia genómica tal como una secuencia de ADNc. Una “muestra aislada de dicho individuo” puede ser cualquier tipo de muestra biológica o biopsia que comprende material celular, plasma, suero, orina, esputo, licor, etc. del individuo. Los ácidos nucleicos se pueden extraer mediante métodos conocidos en la técnica para obtener una muestra de ácido nucleico, por ejemplo, utilizando los kits de extracción de ADN o ARN comerciales.

La patente de EEUU 5.830.652 da a conocer la evaluación de la susceptibilidad relativa de un individuo a una enfermedad autoinmune mediante la detección del patrón alélico de un gen FCGR. Se dan a conocer sondas de oligonucleotidos específicas de alelo para la determinación del genotipo de los genes del grupo de genes FCGRII/III.

Kyogoku y otros (Arthritis Rheum. 2002; 46(5): 1242-54) dan a conocer un procedimiento para determinar la susceptibilidad genética para SLE mediante la caracterización de los SNP del gen receptor de Fcγ mediante la determinación del genotipo de los genes FCGR2B, FCGR2A, FCGR3A y FCGR3B. Jazwinska y otros (Clin Exp Immunol. 1991, 83(1); 47-51 analizaron la distribución de FCGR2 en SLE y escleroderma utilizando análisis de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción. La distribución de FCGR2 en SLE y escleroderma no se diferenciaron de forma significativa de los controles.

Karassa y otros (Biomed Pharmacother, 2004: 58(5):286-91) dan a conocer que el polimorfismo de FCGR2 puede ser un factor de riesgo para SLE, síndrome antifosfolípidos (APS) y trombocitopenia inducida por heparina (HIT).

Su y otros (Genes Immun. 2002; 3 Suppl 1:551-8) dan a conocer un SNP en el gen FCGR2C que resulta en un codón de parada en el exón tres. Además, se da a conocer una frecuencia alélica mayor para FCGR2C-parada que para FCGR2C-ORF en la población humana. Los autores concluyen que no existe diferencia en la distribución FCGR2C-ORF/FCGR2C-parada en la población sana y en pacientes con SLE.

De Haas y otros (Blood. 1995; 86(6):2403-13) describen la determinación del genotipo para el polimorfismo NA del gen FCGR3B en individuos deficientes de FCGR3B utilizando un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa alineando un cebador específico de alelo y un ensayo de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción en base a transferencia Southern y deleción adicional del gen FCGR2C. De Haas y otros investigaron la asociación de la deficiencia de FCGR2C y SLE. No sugirieron que la presencia de FCGR2C/ORF podría ser indicativa para ITP, KD o SLE.

Es conocido que los genes intactos FCGR2A, FCGR2C (por ejemplo, FCGRRC-ORF) FCGR3A y FCGR3B codifican receptores de FcγRII y FcγRIII activadores, mientras que FCGR2B codifica un FcγRIIb inhibidor. Sin querer estar unidos a ninguna teoría en particular, los presentes inventores han propuesto que un cambio en el equilibrio entre la cantidad o actividad de receptores de FcγRII y FcγRIII activadores por una parte y por otro lado del receptor de FcγRIIb inhibidor está asociado con la enfermedad autoinmune. Esto está en consonancia con la identificación de pacientes con la enfermedad autoinflamatoria de Kawasaki (KD) o ITP que tienen tres en vez de los dos alelos habituales del gen FCGR3A para el receptor de FcγRIIIa activador y el aumento de FCGR2C-ORF observado tanto en KD como en ITP.

En una realización preferente, un procedimiento según la presente invención comprende, por lo tanto, determinar la cantidad relativa de receptores de Fcγ activadores contra inhibidores y comparar la cantidad relativa encontrada en una población de control sana correspondiente. Un aumento en la proporción entre receptores activadores sobre inhibidores es un indicador de tener o desarrollar KD o ITP.

Será evidente para el experto en la materia que un procedimiento según la presente invención puede implicar la detección de diferentes genes activadores y/o inhibidores. En una realización, un procedimiento según la presente invención comprende determinar la cantidad del gen FCGR2C intacto, preferentemente FCGR2C-ORF. Debido a que FCGR2C no se expresa como un receptor activador funcional en la mayoría de una población sana que es homocigótica para el seudogén de FCGR2C debido al alelo de parada de FCGR3C, la presencia de un alelo de FCGR2C-ORF intacto desplazará el equilibrio hacia un exceso relativo de señales estimuladoras.

En un procedimiento según la presente invención la cantidad de gen FcγRII o FcγRIII activador y/o inhibidor se puede determinar en el nivel genómico y/o transcripcional, modificación propuesta por el solicitante el 13.4.11.

La determinación en el nivel genómico es preferente ya que los análisis genómicos habitualmente son rápidos, fiables y no requieren de personal altamente calificado. Por ejemplo, puede implicar la determinación de polimorfismos de número de copias del gen FcγR (CNP) y/o el análisis de alteraciones genómicas, por ejemplo, SNP, que afectan directa o indirectamente la transcripción génica o la función del producto génico.

Los procedimientos para detectar CNP son conocidos en la técnica. La mayoría de los procedimientos conocidos se basan en procedimientos de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativos (Q-PCR). La reacción Q-PCR se caracteriza por un aumento exponencial en la cantidad de producto de PCR en los primeros ciclos, que llega a una fase de meseta ya que los productos de reacción se vuelven inhibidores. Cuanto mayor sea el número de copias inicial del gen diana, se detecta antes el aumento de la fluorescencia y se alcanza un valor menor del número de ciclos umbral (Ct). La posibilidad de la medición directa del producto de PCR acumulado después de cada ciclo de amplificación, sin etapas intermedias, asegura la alta especificidad de los ensayos Q-PCR. Actualmente existen cuatro tipos de sondas diferentes TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.), Molecular Beacons, Scorpions®, sondas FRET y el colorante de unión a ADN SYBR® Green (Molecular Probes), se utilizan generalmente para Q-PCR. SYBR Green es un colorante fluorogénico que muestra poca fluorescencia en solución, pero emite una señal fluorescente fuerte tras la unión a ADN de doble cadena.

Gittinger y otros (Tissue Antigens. 2002; 60(1):64-70) describen la determinación del número de copias de FCGR3B correlacionando la cantidad de genes diana con la cantidad de un gen de referencia con una PCR cinética en tiempo real utilizando la técnica LightCycler.

Reilly y otros (Immunogenetics. 1994; 40:456) describen la determinación del número de copias de FCGR2A, FCGR2B y FCGR2C en individuos humanos utilizando la tecnología de transferencia Southern. Se identificó un individuo que carece de ambos genes FCGR2C.

El principio de diseño de sondas y la utilización en amplificación de la sonda dependiente de ligación múltiple (MLPA) se da a conocer en Schouten y otros (Nucleic Acids Res. 2002; 30(12):e57).

Los estudios que utilizan Q-PCR para detectar el número de copias de genes implican procedimientos relativamente cuantitativos que se basan en la detección de un gen de referencia para calcular el número de copias del gen, es decir, el gen de interés se normaliza a un gen endógeno adecuado (“housekeeping”). Hasta la fecha, el gen ALB que codifica la albúmina es generalmente utilizado para la comparación directa y la cuantificación como referencia estándar de oro. Por ejemplo, Thiel y otros (2002) utilizaron ALB como un gen de referencia interna para detectar el número de genes que codifican la proteína 22 de la mielina periférica (PMP22) en el cromosoma 17p11.2-12, cuyo gen es responsable de la neuropatía hereditaria de Charcot-Marie-Tooth (CMT1A). La misma estrategia con la albúmina como estándar interno fue aplicada por Schaeffeler y otros (2003) para determinar la dosis del gen CYP2D6 por genoma para estudiar los fenotipos de metabolismo del fármaco. Ambos Thiel y Schaeffeler utilizaron la tecnología Taqman con sondas Taqman. Una estrategia similar con ALB como un gen de referencia se llevó a cabo por Layfield y otros (2003) utilizando la tecnología LightCycler con SYBR Green para cuantificar el número de copias de genes de receptor de EGF en adenocarcinoma colorrectal.

En todos estos estudios, el número de genes de albúmina se supone que es 2 en total -es decir, uno situado en el cromosoma materno número 4 y uno en el cromosoma paterno número 4 en cualquier individuo. Este supuesto ha sido aceptado como un "hecho" sin una verificación adecuada o prueba inequívoca. Sin embargo, los presentes inventores observaron que el número de copias de ALB varía considerablemente (2 o más) entre individuos humanos y, por lo tanto, no es tan estable como se esperaba. Parece que el gen ALB no podría ser utilizado como gen de referencia fiable en estudios de dosis génica. Por lo tanto, se propusieron identificar un gen de referencia que tiene una variación menor en el número de copias, en comparación con el "gen estándar de oro ALB” que codifica albúmina de suero humana, que puede servir como un gen de referencia más fiable en los estudios de dosis génica. Este objetivo se cumplió mediante la observación de que el gen CYBB, localizado en humanos en el cromosoma X, tiene una variación notablemente baja en el número de copias. Utilizando cebadores específicos para CYBB que hibridan en el exón 8 o alrededor del mismo del gen CYBB, los presente inventores cribaron más de controles (hombres y mujeres), más de 200 portadores obligados (mujeres), más de 300 pacientes de sexo masculino y aproximadamente 30 fetos en un esfuerzo de diagnóstico prenatal de rutina. Este cribado no reveló ninguna variación en el número de copias de CYBB.

En consecuencia, la presente invención se refiere a un procedimiento para determinar el número de copias de los genes dianas FCGR2A, FCGR2B, FCGR2C, FCGR3A y FCGR3B, u ortólogos de los mismos, en el genoma de un individuo, que comprende detectar la cantidad de dichos genes dianas en relación con la cantidad de un gen de referencia en una muestra de ácido nucleico de dicho individuo, en el que el gen de referencia es el gen CYBB o un ortólogo del mismo. Preferentemente, el individuo es un mamífero, más preferentemente un ser humano.

El gen CYBB (alias del gen son CGD; NOX2; GP91-1; GP91PHOX) fue identificado en Xp21. Éste codifica la proteína CYBB, también conocida como glicoproteína 91 (gp91)-phox, citocromo b888 beta polipéptido, citocromo b245 beta polipéptido. El citocromo b888 se compone de la cadena alfa (CYBA) y beta (CYBB) del citocromo b558. Se ha propuesto como un componente principal del sistema oxidasa microbicida de los fagocitos. La deficiencia de CYBB es uno de los seis defectos bioquímicos descritos asociados con la enfermedad granulomatosa crónica (EGC).

El procedimiento preferentemente implica la detección de uno o más genes dianas y dicho gen CYBB utilizando la tecnología Q-PCR.

Otros procedimientos para el análisis cuantitativo de ácidos nucleicos también pueden ser utilizados, tales como transferencia Southern o amplificación de sonda dependiente de ligación múltiple (MLPA). El experto en la materia será capaz de diseñar conjuntos adecuados de cebadores de PCR para la detección del gen o genes dianas y el gen CYBB. En una realización, CYBB se detecta utilizando cebadores específicos de CYBB en el exón 8 o alrededor del mismo, ya que se encontró que con éste se obtenía alta eficiencia de la PCR. Sondas adecuadas para detectar productos de PCR amplificados incluyen SYBR Green I Dye, sondas de hidrólisis o sondas de hibridación. Las dos tecnologías de PCR cuantitativas más utilizadas son la tecnología Taqman® de Applied Biosystems y la tecnología LightCycler de Roche. En un aspecto, se emplea la tecnología LightCycler®. El sistema funciona con capilares de vidrio. Se puede aplicar aire caliente y frío, lo que permite una rampa rápida -30 ciclos en 20 minutos. El proceso de PCR se controla mediante la cuantificación de la fluorescencia de los colorantes que se unen al ADN para la detección general de ADN de doble cadena, o con sondas de hibridación, para controlar la cantidad de una secuencia diana específica. Las sondas se irradian con un diodo que emite luz azul (470 nm), que excita colorantes amarillos incluyendo fluoresceína (FAM, FTTC) y SybrGreen. La luz fluorescente emitida es detectada en tres canales de luz verde (530 nm, fluoresceína), luz roja (640 nm, LightCycler® Red 640) e infrarrojo cercano (710 nm, LC Red 705).

En una realización preferente, el procedimiento de la presente invención comprende la determinación del número de copias de uno o más genes diana intactos del grupo de genes FcγRII/FcγRIII mediante PCR, utilizando una construcción de ácido nucleico recombinante ("construcción de referencia”) que comprende un número conocido de copias de genes seleccionados del grupo que comprende FCGR2A, FCGR2B, FCGR2C, FCGR3A y FCGR3B u ortólogos de los mismos, un fragmento o fragmentos de los mismos, así como un número conocido de copias del gen de referencia. Por lo tanto, la presente invención se refiere a una “construcción de referencia” de ácido nucleico recombinante que comprende dos segmentos, un primer segmento que comprende el gen de interés seleccionado del grupo que comprende FCGR2A, FCGR2B, FCGR2C, FCGR3A y FCGR3B u ortólogos de los mismos, o un fragmento de los mismos, y un segundo segmento que comprende un gen de referencia, o un fragmento del mismo, preferentemente en el que la proporción entre dicho primer y dicho segundo fragmento es de 1:1.

La construcción de referencia, por ejemplo, es un plásmido o vector que comprende, como mínimo, dichos primer y segundo fragmentos. El primer segmento con la secuencia o secuencias del gen diana y el segundo segmento con la secuencia del gen de referencia se pueden ligar directamente sustancialmente el uno al otro, o pueden estar separados por un segmento de aminoácidos. El espacio entre los dos segmentos no es de particular relevancia, siempre y cuando ambos segmentos estén presentes en la misma construcción. El orden del primer y segundo segmentos dentro de la construcción es irrelevante. Por las razones mencionada anteriormente, una construcción de ácido nucleico tal como se ha descrito comprende como un gen de referencia el CYBB humano, o un ortólogo relevante del mismo en el caso en que se va a determinar el número de copias de un individuo no-humano. Los ortólogos del CYBB humano son conocidos en la técnica. En un aspecto específico, la construcción de referencia comprende, como mínimo, 50 pares de bases del CYBB humano. Se ha encontrado que la ligación de 198 pb del exón 8 del gen CYBB a un fragmento de un gen diana (por ejemplo, el gen FCGR, véase más adelante) dio muy buenos resultados.

De la comparación del gen de referencia (segmento) y el gen diana (segmento) en una proporción conocida (por ejemplo, 1:1), por un lado con el ADN diana que contiene un número de copias desconocido para estos genes, se puede calcular las diferencias exactas en la eficiencia de amplificación de la PCR y, por lo tanto, la proporción exacta de los genes a partir de la técnica LightCycler o Taqman. Una gran ventaja de utilizar una construcción de referencia para determinar el número de copias de un gen diana reside en el hecho de que la construcción externa que contiene tanto el gen diana como gen de referencia corrige en cada ciclo las diferencias en la eficiencia de amplificación de la PCR y la cantidad de genes provocadas por las variaciones en la cantidad de muestra inicial. Esta aplicación hace que el análisis de dosis génica sea robusto y fiable.

Se da a conocer un procedimiento para determinar si una persona está predispuesta para desarrollar KD o ITP tal como se describe a continuación, comprendiendo dicho procedimiento la determinación, preferentemente mediante Q-PCR, de la cantidad de los genes diana FCGR2C, FCGR2B, FCGR2A, FCGR3A y FCGR3B (u ortólogos de los mismos en caso que el procedimiento se aplique a individuos no humanos), y la presencia de un gen de referencia en una muestra de ácido nucleico de dicho individuo, en el que el gen de referencia es el gen CYBB utilizando como control externo una construcción de ácido nucleico recombinante que comprende, como mínimo, un fragmento del gen diana y un fragmento del gen de referencia.

El experto en la materia entenderá que un procedimiento de detección de la presente invención que utiliza CYBB como gen de referencia y/o ADN de control recombinante no se limita con respecto a un gen diana en particular o grupo de genes diana a los que se les determinará el número de copias.

En una realización, un procedimiento de la presente invención implica el análisis de los SNP de una o más regiones, por ejemplo, la región del promotor, que controla la velocidad y la extensión de la transcripción del gen FcγR. Los polimorfismos en la región del promotor en el nucleótido -386 y -120 están vinculados a la actividad transcripcional del gen FCGR2B (Su y otros, J Immunol. 2004, 172:7186-91). Se han identificado cuatro haplotipos diferentes, es decir, 2B.1 o "tipo salvaje" (-386G/-120T); 2B.2 (-386C/-120T), que puede ser un polimorfismo más frecuente en el promotor del (pseudo)gen FCGR2C; 2B.3 (-386G/-120A) y 2B.4 (-386C/-120A). El haplotipo 2B.4 se describió que tiene una actividad transcripcional mejorada en comparación con el haplotipo 2B.1. Se encontró que las diferencias en las relaciones de ARNm de FcγRIIa/FcγRIIb2 en neutrófilos (véase más adelante) estaban relacionadas con estos polimorfismos. Se encontró una fuerte asociación con el haplotipo 2B.4 y la relación de ARNm de FcγRIIa/FcγRIIb2 1:1, mientras que la relación de 2:1 estaba altamente asociada y las relaciones 3:1 y 4:1 de ARNm de FcγRIIa/FcγRIIb2 incluso estrictamente asociadas con el haplotipo 2B.1 con actividad transcripcional baja. Estos resultados indican que el aumento de la transcripción de FCGR2B en neutrófilos está relacionada, modificación propuesta por el solicitante el 13.4.11, con el haplotipo 2B.4, lo cual resulta en proporciones de ARNm de FcγRIIa/FcγRIIb2 más bajas. El hecho de que las células mononucleares de los mismos donantes muestran relaciones ampliamente variables y no fijas de ARNm de FcγRIIa/FcγRIIb2 demuestra otros factores genéticos a ser identificados.

Un procedimiento de PCR de particular interés para la presente invención implica la tecnología de amplificación de la sonda dependiente de ligación múltiple (MLPA), originalmente descrita por Schouten y otros (Nucleic Acids Res. 2002; 30:e57). La MPLA es muy específica y requiere un mínimo de 20 ng de ADN genómico a analizar. Por ejemplo, se puede utilizar para la cuantificación relativa de 40 secuencias de ADN diferentes en una reacción fácil de llevar a cabo y utiliza más de un gen de referencia. Entre las aplicaciones conocidas de la técnica MLPA se incluyen la detección de deleciones y duplicaciones de exones en los oncogenes humanos, la detección de trisomías tales como el síndrome de Down, la caracterización de las aberraciones cromosómicas en líneas celulares y muestras de tumores, así como detección de SNP o mutaciones. La cuantificación relativa de ARNm mediante MLPA es otra aplicación que se ha descrito (Eldering y otros, 2003 Nucleic Acids Res. 2003; 31:e153).

En la MLPA, no son amplificados los ácidos nucleicos de la muestra sino las sondas que se añaden a las muestras mediante PCR y se cuantifican. La amplificación de las sondas depende de la presencia de secuencias diana de la sonda en la muestra. Cada conjunto de sondas comprende dos oligonucleótidos, dos sondas sintéticas o una sonda sintética y una sonda derivada de M13, que se hibridan a sitios adyacentes de la secuencia diana. Estas sondas hibridadas se ligan, lo que permite la amplificación posterior. Todas las sondas ligadas tienen secuencias finales idénticas que permiten la amplificación por PCR simultánea con la utilización de un par de cebadores universales. Al variar la longitud de la sonda para cada sonda, esto dará lugar a un producto de amplificación de tamaño único entre 130 y 480 pb. Las secuencias de las sondas diana son habitualmente pequeñas (de 50 a 100 nucleótidos). El requisito previo de una reacción de ligación ofrece la posibilidad de discriminar entre diferencias de nucleótidos individuales. El análisis de SNP se lleva a cabo de forma conveniente mediante la tecnología de MLPA utilizando sondas de MLPA específicas de la diana. Los presentes inventores diseñaron dos mezclas de sondas de MLPA nuevas para detectar secuencias específicas de FCGR dentro de los exones, intrones y regiones promotoras, así como para detectar los SNP específicos de FCGR2B, FCGR2C, FCGR3A,y FCGR3B (véanse figura 1 y tabla 2). Esto es un logro importante, ya que los genes FCGR2A, FCGR2B y FCGR2C muestran un grado extremadamente elevado de homología, al igual que los genes FCGR3A,y FCGR3B. Se da a conocer un procedimiento para la detección de CNP y/o SNP a nivel genómico mediante el análisis MLPA, en el que, como mínimo, se utiliza una de las sondas indicadas en negrita en la tabla 2A o 2B. Preferentemente, comprende la utilización de todas las sondas indicadas en negrita en la tabla 2A y/o 2B. Más preferentemente, comprende, en un tubo de reacción, la utilización de todas las sondas de la tabla 2A (mezcla de sondas 1) y en un tubo de reacción por separado, las sondas de la tabla 2B (mezcla de sondas 2). Las tablas 2C, 2D y 2E muestran las secuencias diana que son detectadas por las sondas de las tablas 2A y 2B, es decir, la secuencia de la sonda es complementaria a la secuencia diana. También se describe en el presente documento una sonda de MLPA que se utiliza de forma adecuada en un método de la presente invención, siendo seleccionada dicha sonda de las tablas 2C, 2D o 2E. En un aspecto específico, la presente invención se refiere a una sonda de FCGR3 capaz de detectar una secuencia diana, tal como se muestra en la tabla 2D. También se describe una sonda de control que detecta una secuencia diana de la tabla 2E. Además, se describe la utilización, como mínimo, de una de las secuencias diana descritas en las tablas 2C, 2D y 2E en un procedimiento para determinar un CNP o un SNP en el grupo de genes FcγRII/FcγRIII.

Se pueden utilizar métodos analíticos de ácidos nucleicos (ADN) convencionales para detectar la cantidad de un gen FcγRII o RIII según la presente invención. Para una reseña sobre análisis cuantitativo de ácidos nucleicos, véase Ding y Cantor (2004), J. Biochem. Mol. Biol. Vol 37, No.1, págs. 1-10. El análisis por (Q-) PCR es particularmente conveniente para el propósito de la presente invención. Entre las técnicas de PCR preferentes se incluyen LightCycler y la tecnología MLPA.

Solo a modo de ilustración, el procedimiento de la presente invención se ejemplifica mediante el análisis del material obtenido de dos tipos de pacientes, que sufren cada uno de una enfermedad autoinmune diferente.

Un aspecto específico se refiere a un procedimiento para determinar si un individuo está predispuesto a desarrollar

ITP, que comprende determinar, en una muestra aislada de dicho individuo, la cantidad de genes, del grupo de genes FcγRII/FcγRIII, comprendiendo dicho grupo de genes FcγRII/FcγRIII los genes FCGR2C, FCGR3A, FCGR2A y FCGR3B que codifican un FcγR activador y FCGR2B, que codifica un FcγR inhibidor, en el que determinar la cantidad de dichos genes comprende, como mínimo, determinar la presencia del gen FCGR2C-ORF, además comprende opcionalmente detectar un polimorfismo de nucleótido simple (SNP) en un exón, intrón y/o región promotora, como mínimo, de un gen seleccionado del grupo que comprende FCGR2C, FCGR2B, FCGR2A, FCGR3A y FCGR3B, y correlacionar dicha cantidad con la cantidad observada en una población sana; en el que una cantidad aumentada de genes que codifican un FcγR activador y/o una cantidad disminuida de gen que codifica un FcγR inhibidor, es indicativa de que tiene una alta probabilidad de desarrollar ITP. Preferentemente, el procedimiento comprende detectar la cantidad del gen FCGR2C-ORF, determinar las frecuencias de alelos del SNP de FCGR3A para la variante o variantes FcγRIIIa-158F y/o FcγRIIIa-158V, y/o determinar la frecuencia de alelos para el polimorfismo promotor –386G/C.

Otros aspectos específicos se refieren a un procedimiento para determinar si un individuo está predispuesto a desarrollar la enfermedad de Kawasaki (KD), que comprende determinar en una muestra aislada de dicho individuo la cantidad de genes, del grupo de genes FcγRII/FcγRIII, comprendiendo dicho grupo de genes FcγRII/FcγRIII los genes FCGR2C, FCGR3A, FCGR2A y FCGR3B que codifican un FcγR activador y FCGR2B, que codifica un FcγR inhibidor, en el que determinar la cantidad de dichos genes comprende, como mínimo, determinar la presencia del gen FCGR2C-ORF, además comprende opcionalmente detectar un polimorfismo de nucleótido simple (SNP) en un exón, intrón y/o región promotora, como mínimo, de un gen del grupo que comprende FCGR2C, FCGR2B, FCGR2A, FCGR3A y FCGR3B, y correlacionar dicha cantidad con la cantidad observada en una población sana; en el que una cantidad aumentada de genes que codifican un FcγR activador y/o una cantidad disminuida de gen que codifica un FcγR inhibidor, es indicativa de que tiene una alta probabilidad de desarrollar KD.

Nunca se había observado variación en la unión de la sonda al exón 8 de FCGR2B en controles sanos o miembros de varias familias multigeneracionales para determinar los patrones de herencia en el grupo de genes FCGR. Preferentemente, el procedimiento comprende detectar la cantidad de FCGR2B, por ejemplo, mediante la detección de pérdida o ganancia de producto de amplificación del exón 3 de FCGR2B, del gen FCGR2C-ORF y/o de la cantidad de FCGR3A (por ejemplo, mediante análisis de CNP). Más preferentemente, un procedimiento para determinar la predisposición para KD comprende, como mínimo, determinar la presencia de la unión de la sonda del exón 8 de FCGR2B y del gen FCGR2C-ORF.

SECCIÓN EXPERIMENTAL

Los receptores Fc son proteínas en la superficie de todos los leucocitos y plaquetas que son capaces de unirse a inmunoglobulinas, especialmente cuando éstas se encuentran en forma de complejo con antígenos en un complejo inmunitario. Los receptores Fc-gamma (FcγR) se unen específicamente a la inmunoglobulina G (IgG). FcγR existe en un número de isoformas, a saber, FcγR de tipo I, tipo II y tipo III. FcγRI es un receptor con una alta afinidad por IgG, mientras que FcγRII y FcγRIII tienen una menor afinidad. La distribución de estos receptores sobre los distintos tipos de leucocitos se muestra en la tabla 1.

Tabla 1. Diversidad de Fc R y distribución celular

Subclase

Genes Distribución celular Motivo

FcγRI

FCGR1 monocitos, macrófagos, neutrófilos tratados con IFNγ o G(M)-CSF ITAM en cadenas γ

FcγRIIa

FCGR2A monocitos, macrófagos, neutrófilos, linfocitos B y plaquetas ITAM en FcγR

FcγRIIb

FCGR2B linfocitos B (macrófagos, neutrófilos) ITAM en FcγR

FcγRIIc

FCGR2C ??? ITAM en FcγR

FcγRIIIa

FCGR3A células NK, macrófagos ITAM en cadenas γ

FcγRIIIb

FCGR3B neutrófilos, eosinófilos tratados con IFNγ ITAM en cadenas γ

La unión de IgG (en un complejo) a los FcγR, en general, induce la activación celular, tal como, por ejemplo, la absorción de los complejos inmunes, liberación de proteínas citotóxicas y la generación de especies de oxígeno reactivo por los leucocitos fagocíticos (neutrófilos, eosinófilos y monocitos/macrófagos).También la producción de inmunoglobulinas, la producción de citoquinas y las reacciones citotóxicas de subpoblaciones específicas de linfocitos son inducidas por los receptores Fcγ. Esta activación de las células está mediada por un denominado motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptor (ITAM), ubicado en la cola citoplasmática del propio FcγRo en regiones citoplásmicas de proteínas asociadas, que se vuelve fosforilada después de la reticulación de FcγR en la superficie celular por el complejo inmune. Sin embargo, también hay un FcγR que inhibe la respuesta inmune. Este FcγRIIb contiene un motivo ITIM inhibidor en su cola citoplasmática, que se asocia con tirosina fosfatasas que contrarrestan la fosforilación del motivo ITAM. Por lo tanto, una respuesta inmune equilibrada está mediada por un equilibrio entre las señales de los FcγR activadores y el FcγRIIb inhibidor.

Recientemente, ha quedado clara la importancia del FcγRIIb inhibidor a partir de estudios con ratones “knock-out”.

Estos ratones, que carecen de FcγRIIb, fueron sometidos a un tratamiento que induce reacciones inflamatorias en la piel, pulmones, articulaciones o riñón. Resultó que los ratones “knock-out” desarrollaron excesivas reacciones inflamatorias autoinmunes y crónicas, lo que demuestra claramente que la inhibición de la respuesta inmune mediante señales de FcγRIIb es indispensable para una reacción fisiológica normal a un reto antigénico (Clynes y otros. J. Exp. Med. 1999; 189:179; Yuasa y otros, J. Exp. Med. 1999, 189:187; Bolland y Ravetch, Immunity 2000;

13: 277). Por esa razón, han sido investigados pacientes con la enfermedad autoinmune SLE para determinar la presencia de SNP en su gen de FcγRIIb FCGR2B. Sin embargo, hasta ahora, no se ha encontrado una correlación evidente entre la presencia de ciertos polimorfismos y la susceptibilidad a esta enfermedad.

La citobanda 1q21-23 es una de las regiones implicadas en la susceptibilidad a múltiples enfermedades autoinmunes. Los genes FcγRII/III se encuentran en 1q23, y una nueva familia de genes, genes similares al receptor de Fc (FCRL, también conocidos como FcRHs), se agrupan próximos a 1q21 (Davis y otros, 2001, 2002). Los FCRL tienen una alta homología estructural con los genes clásicos que codifican los FcγR, aunque los ligandos y la función de las proteínas similares a FcR aún no se conocen. La región 1q23 es un locus candidato para la susceptibilidad a SLE y las variantes en los genes FcγRII/III clásicos explican parcialmente la susceptibilidad a enfermedades (Tsao, 2003; Ravetch y Bolland, 2001;. Kyogoku y otros, 2002). Aunque 1q21-23 es una buena región candidata para contener genes de susceptibilidad a artritis reumatoide, la asociación de los FcγR clásicos con susceptibilidad a enfermedades sigue siendo controvertida (Nieto y otros, 2001;. Radstake y otros, 2003).

Los presentes inventores estudiaron los genes en el grupo FcγR y los cambios en los mismos en detalle en la enfermedad de Kawasaki, una enfermedad autoinflamatoria importante y en ITP, una enfermedad hematológica autoinmune.

La enfermedad de Kawasaki es un síndrome febril agudo en la infancia, que se caracteriza por una vasculitis de las arterias, principalmente de tamaño mediano. Puesto que no hay pruebas específicas para diagnosticar la enfermedad, el diagnóstico se hace sobre criterios clínicos. En primer lugar, la fiebre debe estar presente durante más de cinco días, sin responder a antibióticos o antipiréticos. Además, como mínimo, deben estar presentes cuatro de los cinco síntomas siguientes: linfadenopatía, edema y eritema de manos y pies, una erupción polimorfa, conjuntivitis bilateral, enantema e inflamación de las membranas mucosas (Kawasaki, 1979, Burns y Glode, 2004). La incidencia de la enfermedad de Kawasaki es de 5-17 por 100 000 en Europa y Estados Unidos, sobre todo en niños menores de cinco años. Por razones desconocidas la incidencia en Japón es de 135 por 100 000. En aproximadamente un 25% de los niños la vasculitis conducirá a lesiones aneurismáticas coronarias (CAL) detectadas por ecocardiografía, que puede aparecer durante la fase aguda de la enfermedad cuando no ha sido tratada. Esto hace que sea la principal causa de cardiopatía adquirida en niños. La vasculitis coronaria puede causar la muerte por ruptura repentina al convertirse el diámetro en gigante, o causar una perturbación del flujo y trombosis en las lesiones aneurismáticas, lo que resulta en infarto agudo de miocardio. Después de la recuperación, la enfermedad de Kawasaki puede conducir finalmente a enfermedades del corazón en la adolescencia o en la adultez temprana debido a estenosis progresiva y calcificación de las arterias coronarias afectadas.

El tratamiento consiste en una sola dosis elevada de inmunoglobulina intravenosa (IVIg) (2 g/kg) en infusión de 8-12 horas y aspirina, lo que resulta en una disminución de las complicaciones de un 5-16% (Newburger y otros, 1991, Tse y otros, 2002). Hasta la fecha, se conoce poco sobre los mecanismos de funcionamiento de la IVIg y por qué esta terapia tiene éxito en muchos y falla en otros pacientes con la enfermedad de Kawasaki, especialmente en los más jóvenes. El manejo inadecuado o eliminación insuficiente de antígenos microbianos mediante los mecanismos dependientes de IgG, en algunas personas, puede ser responsable de esta diferencia.

Los pacientes con ITP sufren de una tendencia al sangrado. El bajo número de plaquetas en la circulación de estos pacientes es causada por la presencia de auto-anticuerpos contra las plaquetas. La terapia estándar es, de nuevo, la IVIg o corticosteroides.

El lupus eritematoso sistémico (SLE) es la enfermedad autoinmune arquetípica, dadas sus complejas manifestaciones clínicas y moleculares. Al igual que otras enfermedades reumáticas, un manejo adecuado depende de forma crítica de la correcta evaluación de la actividad de la enfermedad, daño de órganos y la calidad de vida. Los pacientes con SLE sufren de una enfermedad autoinmune caracterizada por la producción de autoanticuerpos antinucleares causados por un fallo de la tolerancia de las células B y deposición en el tejido de complejos inmunes. De esta manera, los linfocitos B juegan un papel clave en la patogénesis de SLE por mecanismos dependientes de autoanticuerpos e independientes de autoanticuerpos. Además, las interacciones aberrantes entre células B y T son críticas para la aparición y progresión de la enfermedad. Entre los nuevos agentes que directamente fijan como diana las células inmunes anormales en SLE se incluyen anticuerpos de depleción o modulación de células B, rituximab (anti-CD20) y epratuzumab (anti-CD22) y el tolerógeno anti-ADNds LJP394. Las células del sistema inmune también se pueden manipular de forma indirecta a través de los efectos de las citoquinas. Para las células B, anti-BAFF (factor de activación de células B de la familia de necrosis tumoral) proporciona un ejemplo de esta estrategia. Otras citoquinas más pleiotrópicas también pueden ser bloqueadas en SLE. Además del bloqueo de la interleuquina-10 (IL-10), la primera estrategia anti-citoquinas examinada, se trata principalmente que se ha centrado la atención en la terapia anti-TNF, siendo una promesa para algunos pacientes con nefritis lúpica. Muchas otras

citoquinas, tales como IL-6, IL-18, y los interferones de tipo I, representan interesantes dianas de futuro en las que el antagonismo depende de las propiedades de neutralización, así como de los efectos mediados por FcγR.

La artritis reumatoide, artritis idiopática juvenil, las espondiloartropatías seronegativas que incluyen artritis psoriásica y SLE, son todas ejemplos de enfermedades reumáticas en las que la inflamación está asociada con la patología esquelética. Aunque algunos de los mecanismos de remodelación esquelética son comunes entre estas enfermedades, cada enfermedad tiene un impacto singular sobre el hueso articular o en el esqueleto axial o apendicular. El bloqueo de TNF por los denominados biológicos (anticuerpos monoclonales murinos humanizados anti-TNF o moléculas quiméricas diseñadas como dominios de unión al extremo N-terminal derivados de receptores auténticos y cola Fc de unión a FcγR del extremo C-terminal) con fuertes propiedades de unión a TNF han impactado de forma significativa en la terapia de una serie de enfermedades autoinmunes crónicas, tales como las enfermedades reumáticas mencionadas anteriormente, así como la enfermedad inflamatoria intestinal. La experiencia con esta terapia en artritis reumatoide (AR) y enfermedad de Crohn (CD) ha extendido su aplicación a otras enfermedades autoinmunes y ha conducido a beneficios terapéuticos aumentados. Otra estrategia prometedora ha sido bloquear las interacciones coestimuladoras entre las células T y B en enfermedades reumáticas, por ejemplo, mediante la inhibición de la vía de unión CD40-CD40 con anticuerpo monoclonal anti-unión CD40 o de la vía de B7 con la quimera CTLA4-Ig. Aún existen muchas limitaciones, pero las perspectivas para el futuro de dichos productos biológicos es interesante. Las propiedades de unión a Fcγ de estos productos biológicos hace que la eficacia terapéutica esté sujeta a la misma influencia de los FcγR tal como se ha demostrado en el caso de la inmunoglobulina intravenosa a través de actividades mediadas por FcγR.

LEYENDAS DE LAS FIGURAS

Figura 1: Localización de las sondas de MLPA en el grupo de genes FCGR2 (panel A) y en el grupo de genes FCGR3 (Panel B). Se pueden utilizar varias sondas en cada gen por separado para determinar los CNP y los SNP. Nótese que la sonda que reconoce FCGR3B-NA1 es la misma que reconoce FCGR3A.

Figura 2. Distribución de las relaciones de ARNm de Fc-γRIIa y Fc-γRIIb en cincuenta individuos caucásicos sanos.

Figura 3: Expresión y función.

A. Distribución de la expresión de ARNm de FcγRIIc en leucocitos.

B. La expresión de FcγRII en células NK está limitada al genotipo FCGR2C-ORF. Las células de la sangre se incubaron con CD56 y CD32. Los linfocitos fueron separados en base a su patrón de dispersión frontal / dispersión lateral. La población de células NK se determinó como los linfocitos positivos a CD56.

C. La expresión de FcγRIIc en células NK está modulada por IL-15 pero no por IL-12. Los PBMC fueron aislados y cultivados. La expresión en células NK CD56+ se midió mediante citometría de flujo con CD32 en los tiempos indicados. Hubo una expresión significativamente mayor en el día 2 y 5 de las células NK estimuladas con IL-15 (p=0,01, n=5)

D. El ARNm de Fc-γRIIc está fuertemente regulado de forma creciente por GM-CSF en células de donadores de FCGR2C-ORF. Se aislaron neutrófilos y PBMC y se cultivaron durante 4 horas con el estímulo indicado. El ARNm de Fc-γRIIc se midió mediante RT-PCR cuantitativa. GM-CSF regula fuertemente de forma creciente el ARNm de Fc-γRIIc en neutrófilos y en menor medida en PBMC de donadores con el genotipo FCGR2C-ORF, pero no en donadores FCGR2C-parada (p=0,0001 y p=0,01, respectivamente; n=5-8).

E. ADCCr. Se aislaron PBL y la funcionalidad de Fc-γRIIc se evaluó mediante ADCCr. Células de donadores con el genotipo FCGR2C-parada y FCGR2C-ORF destruyeron dianas recubiertas con anti-Fc-γRII con cinéticas similares (paneles superior izquierda e inferior izquierda, respectivamente). Por el contrario, solamente las células de donadores con el genotipo FCGR2C-ORF fueron capaces de destruir dianas recubiertas con anti-Fc-γRII (panel inferior derecha)(n=4).

F. ADCCr con células estimuladas. Se obtuvieron PBL y posteriormente se cultivaron durante 2 días con

o sin IL-2 o IL-15. A continuación, las células se recogieron y se utilizaron en un ADCCr. Células de donadores con el genotipo FCGR2C-parada y FCGR2C-ORF destruyeron dianas recubiertas con anti-Fc-γRIII (panel a la izquierda). En ambos casos, IL-15, y en menor medida IL-2, mejoraron la lisis específica de las dianas recubiertas con anti-Fc-γRIII (n=3). Por el contrario, solamente las células de donadores con el genotipo FCGR2C-ORF fueron capaces de destruir dianas recubiertas con anti-FcγRII (panel a la derecha). En este caso, nuevamente IL-15 mejoró notablemente la lisis celular específica (n=3).

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Validación del gen CYBB como gen de referencia

Secuencias de cebadores:

Albúmina Cebador Alb-F: 5’-TGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTT-3’ Cebador Alb-R: 5’-CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT-3’

FCGR2B FCGR2Bex3-(Eco I)-F: 5’-CTCTCAAGCTCCTTGGGCTTCCTCTTCT-3’ FCGR2Bex3-(Not I)-R: 5’-ACCCCCCTTTCCTGCAAACCTCTGC-3’

Crom. Y SRY 109F: 5’-TGGCGATTAAGTCAAATTCGC-3’ SRY 245R: 5’-CCCCCTAGTACCCTGACAATGTATT-3’

CYBB CYBBex8-(HindIII)-F: 5’-GAGATCAAGCTTATGTCAAATATTTAAGCAAGCCTAC-3’ CYBBex8-(Xho I)-R: 5’-GAGATCCTCGAGACTTGTCCATGATATAGTTAGACAC-3’

Construcción FCGR2B/ALB

Para cuantificar el número de copias FCGR2B con RT-PCR cuantitativa, se preparó una construcción que contiene un fragmento de 80 pb del gen ALB y un fragmento de 400 bp de FCGR2B por BaseClear Labservices BV. Para el protocolo detallado nos referimos a BaseClear Labservices B.V, código de proyecto 11926.

En resumen, se llevó a cabo una PCR en una muestra de ADN humano para obtener un producto de PCR del fragmento de gen ALB utilizando los cebadores Alb-F y Alb-R y el par de cebadores FCGR2B-ex3-F y FCGR2B-ex3-R para obtener el fragmento del exón 3 de FCGR2B. Los productos de PCR se hicieron romos y se fosforilaron (uno de los productos). Los productos se ligaron durante toda la noche y se llevó a cabo una PCR (en el producto de la ligación) con el fin de amplificar el fragmento total de 480 bp. Los productos de PCR se clonaron en un vector pGEMT-easy, los clones fueron recogidos y secuenciados para confirmar la secuencia.

Construcción FCGR2B/CYBB

Debido a que se observó una variación en el número de copias del gen ALB, se preparó una nueva construcción con CYBB como gen de referencia/calibrador. La construcción se basa en un plásmido que contiene un fragmento de 217 pb del gen CYBB y el fragmento de 400 pb del gen FCGR2B. Para esta construcción, se utilizó un fagémido Bluescript SK +/-. Utilizando un protocolo estándar de clonación, el fragmento CYBB se clonó en el fagémido SK Bluescript +/-utilizando las enzimas de restricción HindIII y XhoI. Los clones fueron recogidos y secuenciados para confirmar la secuencia de CYBB insertada. Posteriormente, se clonó el fragmento de FCGR2B utilizando las enzimas de restricción EcoRI y NotI. Una vez más, los clones se secuenciaron para confirmar las secuencias insertadas. El plásmido se hizo lineal con la enzima de restricción ScaI. La construcción que contiene el fragmento CYBB también se puede utilizar en combinación con otros genes diana o fragmentos de los mismos (por ejemplo, FCGR2A, FCGR2C).

PCR cuantitativa en tiempo real

La amplificación mediante PCR se llevó a cabo en un instrumento LightCycler (Roche, Almere, Países Bajos), con la versión de software 3.5. La reacción se llevó a cabo con LightCycler FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I (Roche). La temperatura de alineación de los cebadores ALB y FCGR2B fue de 65ºC, para los cebadores CYBB fue de 60ºC. La mezcla de reacción consistió en 4 µl del plásmido o 4 µl (100 ng) de ADN genómico, 1 µl del cebador directo y 1 µl del cebador inverso (1 µM), 4 µl de la mezcla LightCycler FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I (Roche) y 10 µl de agua. La PCR comienza con una etapa de incubación previa durante 10 minutos a 95ºC seguida de 40 ciclos de desnaturalización de 5 s a 95ºC, alineamiento de los cebadores a 60ºC o 65ºC dependiendo de los cebadores utilizados durante 30 s, seguido de extensión a 72ºC durante 15 s. Al final de 40 ciclos, se generó una curva de fusión para determinar la especificidad de los productos amplificados. Una serie de diluciones en serie de 10 veces de la construcción que contiene FCGR2B/ALB o la construcción que contiene FCGR2B/CYBB (1:1) se utilizó para construir una curva estándar con la que se cuantificó cada muestra. Se utilizaron los valores del ciclo umbral (Ct) de las muestras de la construcción diluidas en serie, determinados por el "método del máximo de la segunda derivada", para calcular y trazar una curva de regresión lineal, tal como la realizada por el software. A partir de esta regresión, se puede evaluar la calidad de la curva estándar mediante la pendiente y el coeficiente de correlación (r). La pendiente de la curva se utilizó para calcular la eficiencia de la reacción de la PCR (E). La E de las diferentes combinaciones de cebadores de la PCR no difirieron en más de 0,05. Los 4 puntos de la curva estándar se asignaron cantidades sin dimensiones 1.000, 100, 10 y 1, respectivamente. Posteriormente, el software puede asignar una cantidad sin dimensiones a las muestras no conocidas en función de su valor Ct observado. Las muestras no conocidas se evaluaron por duplicado. Para cada muestra el valor calculado de FCGR2B, en dependencia del valor de Ct, se dividió por el valor calculado para el gen de referencia/calibrador utilizado en el ensayo (ya sea albúmina o CYBB).

Cuando se utilizó la construcción FCGR2B/ALB para la curva estándar, un resultado observado de una muestra no conocida (cantidad de FCGR2B/cantidad de ALB) de 1 significa que el individuo porta la misma cantidad de número de copias de FCGR2B en comparación con ALB (hasta ahora se cree generalmente que son dos copias). Como CYBB es un gen unido al cromosoma X, cuando se utiliza la construcción FCGR2B/CYBB, la interpretación del resultado depende de si el ADN analizado es masculino o femenino.

Resultados

De los primeros resultados obtenidos con la construcción FCGR2B/ALB se hizo evidente que el gen ALB noes un buen gen de referencia. Los valores observados de los resultados de las muestras no conocidas, por ejemplo, de 0,25 implicaría un número de copias de 0,5 de FCGR2B. Los presentes inventores han planteado la hipótesis de que este resultado sólo puede ser observado cuando un individuo porta una copia de FCGR2B y 4 copias del gen que codifica la albúmina, o dos copias de FCGR2B y 8 copias de ALB. Para probar esta hipótesis se llevó a cabo una RT-PCR cuantitativa con cebadores específicos para el cromosoma Y y el gen ALB. Se utilizó una serie de diluciones de 10 veces de ADN de un hombre para construir una curva estándar. Para un hombre, el resultado esperado sería 1 (cantidad de productos del cromosoma Y/cantidad de productos de ALB, tal como es comparable con la curva estándar utilizada). Sin embargo, para la muestra mencionada anteriormente se observó un resultado de 0,5. Los presentes inventores llegaron a la conclusión de que esto sólo puede explicarse para 4 copias del gen de la albúmina. Para probar esta hipótesis aún más, también se llevó a cabo una PCR cuantitativa con cebadores específicos de CYBB y ALB. Una vez más, se utilizaron diluciones en serie de 10 veces de un hombre para construir la curva estándar. El resultado de este ensayo confirmó los resultados anteriores observados. Por lo tanto, la construcción que contiene FCGR2B/ALB no se utilizó más y se desarrolló una nueva construcción que contiene FCGR2B/CYBB. La construcción que contiene CYBB como una gen de referencia/calibrador también se utilizó para preparar las siguientes construcciones: FCGR2A/CYBB, FCGR2C/CYBB.

Ejemplo 2: Determinación del número de copias en pacientes con enfermedades autoinmunes utilizando la tecnología LightCycler

Utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 1, se analizaron 40 pacientes con la enfermedad de Kawasaki (KD) y 40 controles sanos emparejados por edad. En 17 pacientes con KD se observó una pérdida del número de copias de FCGR2B, mientras que esto sólo se observó en 8 controles (p<0,05).

Ejemplo 3: PCR de transcriptasa inversa cuantitativa para la cuantificación de los transcritos

Se aisló ARNm a partir de 107 neutrófilos purificados y se transcribieron de forma inversa en ADNc. Se diseñaron cebadores que contenían intrones para amplificar de forma específica el cDNA y excluir la amplificación de ADN genómico, obteniendo productos de 100 pb para β-glucuronidasa (GUS), 244 pb para FcγRIIa y 243 pb para FcγRIIb2.

Secuencias de cebadores:

β-Glucuronidasa (GUS)

cebador directo: 5'-GAAAATATGTGGTTGGAGAGCTCATT-3 ',

cebador inverso:

5'-CCGAGTGAAGATCCCCTTTTTA-3 '.

FcγRIIa

cebador directo: 5'-ATCATTGTGGCTGTGGTCATTGC-3 ',

cebador inverso:

5'-TCAGGTAGATGTTTTTATCATCG-3 '.

FcγRIIb2

cebador directo: 5'-GGAAAAAGCGCATTTGAGCCAATC-3 ',

cebador inverso:

5'-GGAAATACGAGATCTTCCCTCTCTG-3 '.

Reacción en cadena de la polimerasa

La amplificación mediante PCR se llevó a cabo en un instrumento LightCycler (Roche, Almere, Países Bajos), con la versión de software 3.5. La reacción se llevó a cabo con LightCycler FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I (Roche), que ha sido optimizado por el fabricante de manera que ya no es necesaria la optimización de MgCl2. La temperatura de alineación utilizada para todos los cebadores fue de 60ºC. La mezcla de reacción consistió en 2 µl de ADNc, 1 µM de cada combinación de cebadores y 4 µl de la mezcla LightCycler FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I (Roche) en un total de 20 µl. Todos los ADNc amplificados se compararon con el estándar dentro del mismo ciclo experimental y en cada ciclo experimental se utilizó el mismo estándar, aunque hubo muy poca variación en los estándares entre los ciclos experimentales. Para la amplificación, se utilizó el siguiente protocolo de LightCycler. Se eliminó la hendidura química de la Taq polimerasa mediante incubación previa durante 10 minutos a 95ºC para activar la Taq polimerasa; la plantilla se amplificó durante 40 ciclos de desnaturalización de 5 segundos a 95ºC, alineación de los cebadores a 60ºC durante 30 segundos, seguido por la extensión a 72ºC durante 15 segundos. La cantidad de fluorescencia se midió al final de cada ciclo a 72ºC. Al final de los 40 ciclos, se generó una curva de fusión para determinar las características únicas del ADN amplificado. Para identificar el producto obtenido, se

sometió a un gel de agarosa al 1% p/v, para determinar el tamaño. Posteriormente, la banda obtenida se purificó mediante GFX PCR DNA y el kit de purificación Gel Band (Amersham Biosciences) siguiendo las instrucciones del fabricante para eliminar el exceso de los dNTP y los cebadores. El producto se secuenció mediante Big-Dye Terminator Cycle Sequencing (versión 1.1) y el programa ABI Prism (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). La secuencia obtenida se verificó con BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) para determinar la especificidad. Todos los productos obtenidos eran únicos y no se superponían con otras isoformas.

Curvas estándar y de cuantificación relativa

Como una fuente de ADNc para las curvas estándar con las que se normalizaron todas las muestras, se aislaron neutrófilos a partir de una capa de aféresis leucocitaria obtenida del banco de sangre North-West (Sanquin). Se llevaron a cabo diluciones en serie de 10 veces a partir del ADNc obtenido con las que se cuantificó cada muestra con el procedimiento descrito en la Nota Técnica No. LC 13/2001 (Roche Applied Science). En resumen, se utilizaron los valores del ciclo umbral (CT), determinados mediante el programa LightCycler, para calcular y trazar una curva de regresión lineal, tal como la realizada por el programa. A partir de esta regresión, se puede evaluar la calidad de la curva estándar por la pendiente y el coeficiente de correlación (r). La pendiente de la línea se utilizó para determinar la eficiencia de la reacción (E). A partir de los CT y las eficiencias obtenidas, se puede calcular la

CpT(C)-CpT(S) : ER

relación normalizada con la siguiente fórmula: ETCpR(C)-CpR(S), en la que ET es la eficiencia de la PCR del gen diana, ER la eficiencia de la PCR del gen de referencia, CpT(C) es la CT medida del gen diana determinada por el estándar o calibrador, CpT(S) es la CT medida del gen diana determinada para la muestra, CpR(C) es la CT medida del gen de referencia del calibrador o estándar, y la CpR(S) es la CT medida del gen de referencia de la muestra.

Validación de la RT-PCR cuantitativa para las isoformas FcγRII en el LightCycler

Para estudiar los niveles de expresión de las isoformas de FcγRII en neutrófilos, se llevó a cabo una RT-PCR cuantitativa relativa mediante el instrumento LightCycler. Esta técnica dio lugar a un procedimiento altamente sensible y específico para determinar los niveles de expresión de ARNm de FcγRIIa y FcγRIIb2 en neutrófilos. Las pendientes de los estándar para cada reacción de PCR fueron de aproximadamente –3,3, dando una eficiencia de aproximadamente 2, lo que indica que durante cada ciclo se duplicó el producto específico. Además, cada conjunto de cebadores utilizados dio lugar a una curva de fusión específica con su propia temperatura de fusión (Tm), mientras que los controles que no eran plantillas mostraron una curva de fusión diferente o ningún producto en absoluto. La figura 2 muestra que se encontraron relaciones de ARNm de neutrófilos distintas para FcγRIIa:FcγRIIb en una población caucásica normal.

Ejemplo 4: ensayo MLPA con sondas de nuevo desarrollo

Se aisló ADN, ya sea con el kit de aislamiento de ADN Puregene (Biozym, Hess, Oldendorf, Alemania) o el kit QIAamp DNA Blood (Qiagen, Hilden, Alemania). Para analizar el grupo de genes FCGR se utilizó un ensayo de Amplificación de Sonda por Ligación Múltiple. Se diseñaron nuevas sondas que son altamente específicas para los genes FCGR2A, FCGR2B, FCGR2C, FCGR3A y FCGR3B. Como el grupo de genes FCGR es muy homólogo, esto no fue posible para todos los sitios. Como mínimo, se diseñaron 3 sondas por gen para cubrir cada gen individual. De esta manera, se pueden estudiar los CNP y las inserciones/deleciones parciales. Se diseñaron sondas por separado para estudiar los SNP conocidos (funcionales) en FCGR2A (131 H/R), FCGR2B (232 I/T), promotor de FCGR2B y C (-386, -120), FCGR3A (NA1 /NA2 /SH) y FCGR3B (158 V/F). Para una descripción de la ubicación y las secuencias diana específicas de las sondas véanse las figuras 1A y 1B y la tabla 2 más adelante. Las sondas se prepararon según Schouten y otros, 2002. Debido a la homología entre ciertas sondas, las sondas tienen que ser divididas en dos mezclas independientes (sonda MIX 1 y sonda MIX 2, véanse las tablas 2A y 2B, respectivamente) para evitar la competencia.

Tabla 2A: “Sonda MIX 1”. Las sondas en negrita indican aquellas que se requieren para una respuesta fiable del ensayo. Las secuencias diana de las sondas se muestran en las tablas 2C, D y E.

Longitud

Sonda # Posición gen/crom. Comentarios

130

0797-L0463 Crom. control 5q31

136

2271-L2327 Sonda de control, Crom. 1p36

142

3605-L2972 FCGR2A, exón 1 (D01A)

148

3610-L2977 FCGR2C, exón 7 (D07)

154

2679-L2144 Sonda de control, Crom. 1q25

160

3616-L2983 FCGR3A, exón 3 (D03) SNP detecta la variante NA1 y FCGR3A

172

2677-L2143 Sonda de control, Crom. 1q25

181

3611-L2978 FCGR2B, exón 1 (D01A) Detecta también FCGR2C

193

3606-L2973 FCGR2A, exón 1 (D01B)

202

4812-L4198 FCGR2B, 232I/T (D05B) SNP detecta la variante 232-I frecuente

211

3609-L2976 FCGR2C, exón 6 (D06)

Longitud

Sonda # Posición gen/crom. Comentarios

220

3619-L2986 FCGR2B, intrón 3 (D03) En la frontera intrón/exón del exón 4

229

1487-L1095 Sonda de control, Crom. 16q24

238

0974-L0561 Sonda de control, Crom. 14q12

265

1325-L0874 Sonda de control, Crom. 17p13

274

3613-L2980 FCGR2B, exón 6 (D06A)

283

3608-L2975 FCGR2A, exón 5 (D05A)

292

3162-L2603 Sonda de control, Crom. 11p11

301

1916-L1460 Sonda de control, Crom. 1q21

310

3618-L2985 FCGR3B, exón 5 (D05)

319

3612-L2979 FCGR2B, exón 7 (D07A)

328

1918-L1462 Sonda de control, Crom. 1q21

337

3614-L2981 FCGR3A, exón 1 (D01)

346

3615-L2982 FCGR3B, exón 1 (D01)

355

4813-L4187 FCGR2A, 131H/R (D04A) SNP detecta la variante 131-H

373

2560-L2023 Sonda de control, Crom. 3q23

382

2908-L2302 Sonda de control, Crom. Xq23

391

4816-L4190 FCGR3A, 158V/ F (D04) SNP detecta la variante 158-F

400

4818-L4192 FCGR2C, 2C-parada-específico

Tabla 2B: “Sonda MIX 2”. Las sondas en negrita indican aquellas que se requieren para una respuesta fiable del ensayo. Las secuencias diana de las sondas se muestran en las tablas 2C, D y E.

Longitud

Sonda # Posición gen/crom. Comentarios

130

0797-L0463 Sonda de control, Crom. 5q31

136

2271-L2327 Sonda de control, Crom. 1p36

142

4817-L4191 FCGR2B, exón 3 (D03B) Detecta FCGR2B y FCGR2C-ORF

148

3610-L2989 FCGR2A, exón 7 (D07)

154

2679-L2144 Sonda de control, Crom. 1q25

165

3616-L2990 FCGR3B, exón 3 (D03) SNP detecta la variante NA2

172

2677-L2143 Sonda de control, Crom. 1q25

181

3611-L2978 FCGR2B, el exón 1 (D01A) Detecta FCGR2B y FCGR2C

202

4812-L4186 FCGR2B, 232I/T (D05B) SNP detecta la variante 232-T rara

211

4815-L4189 FCGR2A, exón 6 (D06B)

220

3619-L2994 FCGR2C, intrón 3 (D03) En la frontera intrón/exón del exón 4

229

1487-L1095 Sonda de control, Crom. 16q24

238

0974-L0561 Sonda de control, Crom. 14q12

247

4821-L4195 FCGR2A, exón 3 (D03C)

265

1325-L0874 Sonda de control, Crom. 17p13

274

3613-L2980 FCGR2B, exón 6 (D06A)

283

4819-L4193 FCGR3B, SH (D03SH) SNP variante FCGR3*3(SH)

292

3162-L2603 Sonda de control, Crom. 11p11

301

1916-L1460 Sonda de control, Crom. 1q21

310

3618-L2993 FCGR3A, exón 5 (D05)

319

3612-L2979 FCGR2B, exón 7 (D07A)

328

1918-L1462 Sonda de control, Crom. 1q21

355

4814-L4188 FCGR2A, 131H/R (D04B) SNP detecta la variante 131-R

373

2560-L2023 Sonda de control, Crom. 3q23

382

2908-L2302 Sonda de control, Crom. Xq23

391

4816-L4196 FCGR3A, 158V/F (D04) SNP detecta la variante 158-V y FCGR3B

Tabla 2C: Información de secuencia de las sondas FCGR2 utilizadas

Longitud / Mix 1 Mix 2

Sonda # Gen / # Secuencia detectada

142

3605-L2972 FCGR2A-D01A GTCTCAGAATGTATGTCCCAGAAACCTGTGGCTGCTTCAA

..... 193

3606-L2973 FCGR2A-D01B ATAGTCATCCCAGCACTGTGCCAACGTCCAGTGGGTTTTA

..... 247

4821-L4195 FCGR2A-D03C TCTGTGACTCTGACATGCCAGGGGGCTCGCAGCCCTGAGA

355

4813-L4187 FCGR2A-D04A AAATCCCAGAAATTCTCCCATTTGGATCCCACCTTCTCCAT

Longitud / Mix 1 Mix 2

Sonda # Gen / # Secuencia detectada

..... 355

4814-L4188 FCGR2A-D04B GGAGAAGGTGGGATCCAAACGGGAGAATTTCTGGGATTTT

283

3608-L2975 FCGR2A-D05A TCATTGCGACTGCTGTAGCAGCCATTGTTGCTGCTAGT

..... 211

4815-L4189 FCGR2A-D06B AGATGGCTGGGATTACTCACCTCAAATTGGGCAGCCTTCA

..... 181

3611-L2978 FCGR2B-D01A ATAGCACAGCTGTCCACAGAAGCATATGACCCCAAGGCTG

220

3619-L2986 FCGR2B-D03 CTGAAAGACACAAAAAACCGCAGAGGACCCGGGAGGTCTT

..... 220

3619-L2994 FCGR2B-D03B CTGAAAGACACAGAAAACCCCAGAGGACCCGGGAGGTCTT

..... 142

4817-L4191 FCGR2B-D03B GGCAGAGAGAGGAGGTAGCATGAAGAAGAGGAAGCCCAGG

..... 202

4812-L4186 FCGR2BD05B-C GTGGCTGTGGTCACTGGGACTGCTGTAGCGGCCATTGTTG

202

4812-L4198 FCGR2BD05B-T GTGGCTGTGGTCACTGGGATTGCTGTAGCGGCCATTGTTG

..... 274

3613-L2980 FCGR2B-D06A CAATCCCACTAATCCTGATGAGGCTGACAAAGTTGGGGTG

.....319

3612-L2979 FCGR2B-D07A CAATCACCTATTCACTTCTCATGCACCCGGATGCTCTGGA

211

3609-L2976 FCGR2C-D06 GAAGGCTGCCCAATTTGAGATGAGTAATCCCAGCCATCTC

..... 148

3610-L2989 FCGR2C-D07 GCCATCAGAAAGAGACAACTTGAAGAAACCAACAATGACT

148

3610-L2977 FCGR2C-D07 GCCATCAGAAAGAGACAACCTGAAGAAACCAACAATGACT

400

4815-L4192 FCGR2C-PARADA TTGGGCTTCCTCTTCCTCACGCTACCTCCTCTCTCTGCCC

Tabla 2D: Información de secuencia de las sondas FCGR3 utilizadas

Longitud / Mix 1 Mix 2

Sonda # Gen / # Secuencia detectada

337

3614-L2981 FCGR3A-D01 TCCAGGCTCTTTCCTTCCTGGTCCTGTTCTATGGTGGGGC

160

3616-L2983 FCGR3A-D03 CTCAATGGTACAGGGTGCTCGAGAAGGACAGTGTGACTCT

391

4816-L4190 FCGR3A-D04 CTACTTCTGCAGGGGGCTTTTTGGGAGTAAAAATGTGTCT

..... 391

4816-L4196 FCGR3A-D04 CTACTTCTGCAGGGGGCTTGTTGGGAGTAAAAATGTGTCT

..... 310

3618-L2993 FCGR3A-D05 AGACTGGAAGGACCATAAATTTAAATGGAGAAAGGACCCT

346

3615-L2982 FCGR3B-D01 TCCACCCATCTCTGTCACCTGCCAGTTTCCTTTCTTGAA

….. 165

3616-L2990 FCGR3B-D03 CTCAATGGTACAGCGTGCTTGAGAAGGACAGTGTGACTCT

310

3618-L2985 FCGR3B-D05 AGACTGGAAGGACCATAAACTTAAATGGAGAAAGGACCCT

Tabla 2E: Información de secuencia de las sondas de control utilizadas

Longitud / Mix 1 Mix 2

Sonda # Gen / # Secuencia detectada

130

0797-L0463 IL4-D01 CACTGCAAATCGACACCTATTAATGGGTCTCACCTCCCAA

136

2271-L2327 CAB45-D01 CCACCAGGAGGTCTTCCTAGGCAAGGACCTGGGTGGCTTT

154

2679-L2144 HRPT2-D11 GAGGGTGCATCTGCCCGGAAGACTCAGACTCCTGCAGCCC

229

14871-L1095 FANCA-D15 AAGAAGGCCCTGGTCTTCCTGTTTACGTTCTTGTCAGAAC

238

0974-L0561 TINF2-D01 GCGGACGCTGCGTGGAACATTTTCCGCGAGTACTGGAGTT

265

1325-L0874 ASPA-D05 GCCATTGAGGTCTATAAAATTATAGAGAAAGTTGATTACC

292

3162-L2603 MNYBPC3-D29 CGCTTCCGCATGTTCAGCAAGCAGGGAGTGTTGACTCTGG

301

1916-L1460 LMNA-D02 AGGGTGACCTGATAGCTGCTCAGGCTCGGCTGAAGGACCT

328

1918-L1462 LMNA-D04 AGACCCGACTGGTGGAGATTGACAATGGGAAGCAGAGTGA

Longitud / Mix 1 Mix 2

Sonda # Gen / # Secuencia detectada

373

2560-L2023 ATR-D47 AGACCCATGTTCTTGACATTGAGCAGCGACTACAAGGTGT

382

2908-L2302 PAK3-D01 GTAACAACCGGGATTCTTCAGCACTCAACCACAGCTCCAA

Ensayo MLPA

El ensayo MLPA se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (MLP Holland BV, Amsterdam, Países Bajos). En resumen, se desnaturalizaron 5 µl de ADN (20 ng/µl) a 98ºC durante 5 minutos y, a continuación, se enfriaron hasta 25ºC en un termociclador con tapa térmica. Se añadieron a cada muestra 1,5 µl de mezcla de sondas y 1,5 µl de tampón y se incubó durante 1 min a 95ºC, seguido de 16 horas a 60ºC. A continuación, se añadieron 32 µl de mezcla Ligasa-65 a cada muestra, mientras estaban a 54ºC, seguido de una incubación de 15 minutos a 54ºC y 5 minutos a 98ºC. Esta mezcla de ligación se diluyó cuatro veces. Se añadieron 10 µl de mezcla de polimerasa que contiene un único par de cebadores. Inmediatamente después de añadir la mezcla de polimerasa se inició la reacción de PCR. Las condiciones de la PCR fueron de 36 ciclos de 30 segundos a 95ºC, 30 segundos a 60ºC, 60 segundos a 72ºC, seguidos de 20 min a 72ºC. A continuación de la reacción de PCR, se mezcló 1 µl de la reacción de PCR con 0,5 µl de estándar de tamaño interno CXR 60-400 (Promega) y 8,5 µl de formamida desionizada y se incubó durante 10 minutos a 90ºC. A continuación, los productos fueron separados mediante electroforesis en un ABI-3100.

Análisis de los datos

El análisis de un número limitado de muestras se puede hacer mediante un examen visual de los picos de la electroforesis capilar. Para el análisis de un gran número de muestras se utiliza de forma adecuada el programa Genemarker (v 1.30). En resumen, los perfiles de los picos de las electroforesis capilares se importan al programa y, a continuación, se normalizan las señales para la intensidad de las señales utilizando las sondas de control asignadas. Como MLPA es una forma de cuantificación relativa, una muestra tiene que ser asignada como muestra de referencia. La altura normalizada (o el área) del producto de amplificación de la sonda de la muestra desconocida se divide por la altura normalizada de ese producto de amplificación de la referencia. Una relación entre 0,8-1,2 se considera normal, por debajo de 0,8 se considera como pérdida en el número de copias y por encima de 1,2 se considera como aumento del número de copias.

Resultados en pacientes con la enfermedad de Kawasaki

Los SNP; mediante los procedimientos convencionales de PCR de SNP no se pudieron detectar diferencias significativas en muestras de 170 pacientes con la enfermedad de Kawasaki (Biezeveld y otros, Fc gamma Receptors in Kawasaki disease, The involvement of Fc gamma receptor gene polymorphisms in Kawasaki disease (“Receptores en la enfermedad de Kawasaki, La implicación de los polimorfismos del gen receptor FC gamma en la enfermedad de Kawasaki”). Clin Exp Immunol. 2007; 106-111). Se analizaron ADN de 70 muestras conocidas (utilizadas en un estudio previo con procedimientos de PCR convencionales para determinar el genotipo de los SNP en el grupo de genes FCGR) con el ensayo MLPA para validar las sondas que identifican los SNP. Las únicas discrepancias observaras fueron provocadas por el hecho de que con los procedimientos convencionales no es posible una cuantificación absoluta y, por lo tanto, una muestra con sólo un alelo FCGR3B se tipificó como NA2/NA2 (homocigotos) en vez de NA2/nulo con el nuevo procedimientos MLPA.

Los CNP; se ensayaron ADN de 70 pacientes con la enfermedad de Kawasaki (KD) y 100 controles caucásicos sanos.

-

En 30 muestras de KD se observó producto de amplificación del exón 3 de FCGR2B, mientras que éste no se observó en ninguna de las muestras de control.

-

En 23 muestras de KD (32%) se observó un FCGR2C-ORF (marco abierto de lectura en el exón 3), que da como resultado un receptor activador, en comparación con el 18% en los controles sanos (p<0,05).

-

En 3 muestras de KD se observaron 3 copias del gen completo FCGR3A, no encontradas en las muestras de control.

-

En 3 muestras de KD y dos muestras de control se observaron 3 copias del gen completo FCGR3B, sin estar presente la variante SH en una de las copias.

Resultados en pacientes con ITP

Se ensayaron ADN de 116 muestras de pacientes con ITP mediante el ensayo MLPA. Se encontró una variación aumentada en los grupos de genes FCGR2 y FCGR3 en pacientes con ITP caucásicos en comparación con los controles caucásicos sanos (n=100).

-

En el gen FCGR2C, un SNP en el exón 3 convierte una glutamina en el marco de lectura abierto (ORF) al codón de parada que se encuentra de forma más común. En el grupo de control, el 82% de los individuos fueron homocigóticos de FCGR2Cparada/parada . Mientras que, el gen FCGR2C-ORF estuvo presente en el 18% de los individuos sanos, FCGR2C-ORF se encontró en el 35% de los pacientes con la enfermedad autoinmune hematológica ITP (n=116; relación de posibilidades (OR): 2,4, intervalo de confianza del 95% (95%CI): 1,3-4,3; p=0,009). Se tiene la evidencia que el gen FCGR2C-ORF traduce a un receptor de IgG activador en la membrana celular, ejerciendo actividad mediada por anticuerpos, tal como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) por las células del sistema inmunitario.

-

También se observó una diferencia significativa en la frecuencia del genotipo (p=0.01) y alelos (p=0,02) para el polimorfismo promotor –386G/C. El genotipo -386CC fue raro y solamente se observó en un paciente con ITP.

-

En la misma serie de muestras de ADN, se confirmó la sobrerrepresentación observada previamente del SNP en FCGR3A que codifica la variante FcγRIIIa-158V, que es la más prevalente en ITP con comienzo en la infancia (p=0,0005) y no en ITP con comienzo en la adultez (p=0,3).

Variantes de empalme de FCGR2C

Hasta la fecha, se han descrito cinco variantes de empalme de FcγRIIc, dos de las cuales resultan en un receptor anclado a membrana, es decir, FcγRIIc1 codificado por el transcrito completo y FcγRIIc3 descrito como que le falta el exón 7. Se ha planteado la hipótesis que el empalme alternativo del transcrito FcγRIIc está restringido al alelo FCGR2C-parada. Para investigar esto, se clonaron los transcritos FcγRIIc de un único individuo con un genotipo FCGR2CORF/ORF y tres individuos con un genotipo FCGR2CORF/parada en un vector de expresión bacteriano y se obtuvo la secuencia, como mínimo, de 20 clones por individuo. Después de secuenciar todos estos clones, se encontró que los individuos con genotipo FCGR2CORF/ORF o FCGR2CORF/parada solo expresan FcγRIIc1 (datos no mostrados).

Distribución de la expresión de FCGR2C

A continuación, se investigó la expresión de ARNm de las isoformas de FcγRII en neutrófilos, monocitos, células NK, células T y células B de voluntarios sanos. Se encontraron transcritos de FcγRIIa, FcγRIIb2 y FcγRIIc, pero no de FcγRIIb1, en neutrófilos y monocitos, mientras que las células B solamente contenían FcγRIIb1 (FcγRIIb1 contiene el exón 6 de FCGR2B, FcγRIIb2 no contiene este exón). Las células T no expresaron ninguna de las isoformas de FcγRII, mientras que las células NK solamente expresaron FcγRIIc.

Expresión de FcγRIIc en células NK

FCGR2A, FCGR2B y FCGR2C tienen una homología de secuencia de un 92-96%. No existen anticuerpos monoclonales disponibles que puedan distinguir realmente entre FcγRIIa, FcγRIIb y FcγRIIc, lo que hace difícil la cuantificación de la expresión de proteínas en las células. Sin embargo, se ha encontrado que las células NK solamente expresan ARNm de la isoforma FcγRIIc. Por esta razón, se examinó la expresión de FcγRIIc en células NK de individuos con el genotipo FCGR2CORF/parada y el genotipo FCGR2Cparada/parada. Se encontró que la presencia de un alelo de FCGR2C-ORF se correlaciona con la expresión de FcγRII en células NK, mientras que la ausencia de un alelo funcional se corresponde con la ausencia de FcγRII en células NK (figura 3B y tabla 3). Por lo tanto, se concluyó que FcγRIIc está presente en células NK.

Tabla 3 5

expresión

MLPA PCR específico de gen

Muestra

Células NK MFI FCGR2C parada/ORF 2B/C-386 2B-386 2B-120 2C-386 2C-120

1

no nd parada/parada W

2

no nd parada/parada W

3

no nd parada/parada W

4

no nd parada/parada W

5

no nd parada/parada W

6

no nd parada/parada W

7

no nd parada/parada W

8

no nd parada/parada W

9

no nd parada/parada W

10

no nd parada/parada W

11

sí 590 ORF/parada He GC TA GC TT

12

sí 1188 ORF/parada He GC TA GC TT

13

sí 1648 ORF/parada He GC TA GC TT

14

sí 2602 ORF/parada He GC TA GC TT

expresión

MLPA PCR específico de gen

15

sí 2123 ORF/parada He GC TA GC TT

16

sí 1109 ORF/parada He GC TA GC TT

17

sí 2380 ORF/parada He GC TA GC TT

18

sí 1243 ORF/parada He GC TA GC TT

19

sí 1394 ORF/parada He CC AA GC TT

20

sí 1629 ORF/parada He GC TA GC TT

Activación in vitro de células NK

La expresión de FcγRIIc en células NK se midió 3 veces en varios intervalos de tiempo (intervalo de 2 a 5 meses) en cuatro individuos con el genotipo FCGR2CORF/parada. Se observó poca fluctuación en el tiempo (MFI ± SEM: 1707 ± 211). El posterior ensayo en cultivos de células NK con los activadores de células NK IL-2 o IL-15 mostró la capacidad para modular la expresión de FcγR en células NK. Se encontró que IL-2 e IL-15 regulan de forma ascendente la expresión superficial de FcγRIIIa en células NK. Por el contrario, la expresión de FcγRIIc se reguló de forma descendente durante el cultivo, aunque IL-15 rescató de forma significativa la pérdida de expresión de FcγRIIc en comparación con IL-12 o medio (figura 3C).

Debido a que la expresión superficial de FcγRIIc en neutrófilos y monocitos en la actualidad no puede ser controlada por la falta de anticuerpos específicos, la regulación de ARNm de FcγRIIc en estas células se ensayó después de incubar neutrófilos así como PBMC con los activadores inflamatorios LPS, GM-CSF o TNFα. En particular, GM-CSF indujo una fuerte regulación ascendente de ARNm de FcγRIIc en neutrófilos obtenidos de individuos con un genotipo

FCGR2CORF/parada

, mientras que esto se encontró en un grado significativamente inferior en individuos con un genotipo FCGR2Cparada/parada (p<0,01, figura 3D).

Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos redirigida

Para evaluar si la expresión de FcγRIIc en células inmunes innatas era funcionalmente activa, se ensayó la capacidad de las células NK de destruir dianas recubiertas con anticuerpos. Para fijar como diana de forma selectiva a FcγRIIc o FcγRIIIa en las células NK, se empleó el ensayo rADCC, que implica la línea celular P815 de mastocitoma murino que porta FcγR cargada con anticuerpos anti-FcγRII o anti-FcγRIII.

Las células NK de un donador de genotipo FCGR2CORF/parada destruyeron las células diana cargadas con anti-FcγRII y anti-FcγRIII (figura 3E). Por el contrario, las células NK de un donador de genotipo FCGR2Cparada/parada solamente fueron capaces de destruir células diana cargadas con anti-FcγRIII. Cuando se redujo la expresión de FcγRIIc cultivando células NK en presencia de citoquinas activadoras, el efecto de reticulación de FcγRIIc en el ensayo rADCC mostró una capacidad de destrucción aún más pronunciada en las células NK activadas con IL-2 o IL-15 (figura 3F).

En conclusión, estos datos muestran que FCGR2C-ORF predispone a ITP. Los presentes inventores han demostrado que FcγRIIc es expresada por fagocitos y células NK y que esto mejora las funciones hacia dianas recubiertas por anticuerpos. Además, se ha demostrado que en condiciones inflamatorias (GM-CSF o IL-15), la función de FcγRIIc es incluso adicionalmente mejorada. Por lo tanto, en conjunto, estos resultados muestran que FCGR2C es un gen expresado de forma variable altamente relevante para la inmunidad y que puede servir como marcador de pronóstico y diagnóstico para evaluar la susceptibilidad y severidad de infecciones y enfermedades autoinmunes.

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento para determinar si un individuo está predispuesto a desarrollar la enfermedad de Kawasaki (KD) o Púrpura Trombocitopénica Idiopática (ITP), que comprende:

   -

   determinar en una muestra aislada de dicho individuo la cantidad de los genes en el grupo de genes FcγRII/FcγRIII, comprendiendo dicho grupo de genes los genes FCGR2C, FCGR3A, FCGR2A y FCGR3B, que codifican un FcγR activador y FCGR2B que codifica un FcγR inhibidor, en el que la determinación de la cantidad de dichos genes comprende, como mínimo, determinar la presencia del gen FCGR2C-ORF, opcionalmente además comprende detectar un polimorfismo de nucleótido simple (SNP) en un exón, intrón y/o región promotora, como mínimo, de un gen seleccionado del grupo que comprende FCGR2C, FCGR2B, FCGR2A, FCGR3A y FCGR3B;y

   -

   correlacionar dicha cantidad con la cantidad observada en una población sana; en el que una cantidad mayor de los genes que codifican un FcγR activador, y/o una cantidad menor del gen que codifica un FcγR inhibidor es indicativa de que tiene mayor probabilidad de desarrollar KD o ITP.

2. 2.

   Procedimiento, según la reivindicación 1, que comprende detectar la cantidad del gen FCGR2C-ORF en combinación con la determinación de las frecuencias de alelos del SNP FCGR3A para la variante o variantes FcγRIIIa-158F y/o FcγRIIIa-158V, y/o determinar la frecuencia de alelos para el polimorfismo promotor de FCGR2B o C –386G/C.

3. 3.

   Procedimiento, según la reivindicación 1, que comprende detectar la cantidad del gen FCGR2C-ORF en combinación con la detección de la cantidad del gen FCGR3A.

4. 4.

   Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la determinación del número de copias comprende correlacionar la cantidad de genes dianas con la cantidad de un gen de referencia en una muestra de ácido nucleico de dicho individuo, en el que el gen de referencia es el gen CYBB o un ortólogo del mismo.

5. 5.

   Procedimiento, según la reivindicación 4, en el que dicho gen de referencia CYBB se detecta utilizando cebadores específicos de CYBB en el exón 8 o alrededor del mismo.

6. 6.

   Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 – 5, que comprende la detección, como mínimo, de un SNP en la región promotora del gen FCGR2B/C, y/o la detección, como mínimo, de un SNP en el gen FCGR3A, preferentemente aquellas que resulten en las variantes FcγRIIIa-158F y/o FcγRIIIa-158V.

7. 7.

   Procedimiento, según la reivindicación 6, en el que dicho, como mínimo, un SNP en la región promotora del gen FCGR2B/C es un SNP en el nucleótido –386 y/o –120, preferentemente haplotipo 2B.1 (-386C/-120A).

8. 8.

   Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende la utilización de tecnología de amplificación de sonda dependiente de ligación múltiple (MLPA).

9. 9.

   Procedimiento, según la reivindicación 8, utilizando una sonda MLPA capaz de detectar una secuencia diana según cualquiera de las SEQ ID NO: 15 a 52, preferentemente una sonda FCGR2 capaz de detectar una secuencia diana según cualquiera de las SEQ ID NO: 15 a 33 y/o una sonda FCGR3 capaz de detectar una secuencia diana según cualquiera de las SEQ ID NO: 34 a 41.