CN102959088A - 用于预测对TNF-α抑制剂治疗的反应性的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了通过测定遗传因素而测定或预测受试者对于使用TNFα抑制剂诸如TNFα抗体进行治疗的反应性的方法。
Description
相关申请的引用
本申请要求2010年2月2日提交的美国临时申请第61/300,807号、2010年6月10日提交的美国临时申请第61/353,595号、2010年6月28日提交的美国临时申请第61/359,009号、2010年11月2日提交的美国临时申请第61/409,461号和2011年1月19日提交的美国临时申请第61/434,296号的优先权,各申请的全部内容,包括说明书、任何附图以及序列表,均以引用的方式并入本文。
序列表
本申请包含通过EFS-Web以ASCII格式提交的序列表,并且其全文据此以引用的方式并入。创建于2011年2月1日的所述ASCII拷贝被命名为11781316.txt并且大小为28,619字节。
发明背景
类风湿性关节炎(RA)被认为是一种慢性的炎性自身免疫障碍。RA是致残的并且痛苦的炎性病症,其可由于疼痛和关节破坏而导致活动能力的实质丧失。RA导致了关节的软组织肿胀。
对RA的常规治疗是基于针对整体的RA患者群体而发展的方法。因此,已知的治疗可导致一些患者在确认有效疗法之前反复经历无效治疗。因此,存在着对于更好地治疗RA以及为给定的患者鉴定出有效的治疗选择的个性化医疗的需求。能够充分地预测RA患者对治疗剂的反应应有利于治疗。提前鉴别出有可能对给定治疗剂有反应的患者还使RA患者受到能够足够早期地接受治疗以,例如,预防不可逆的关节损伤和导致残疾。
已经鉴定出多种RA的生物标志物与所述RA疾病状态相关联(参见,例如Poole与Dieppe(1994)Seminars in Arthritis and Rheumatism23:17;Nakamura(2000)J Clin Lab Analysis 14:305;以及Young等(2001)Annals Rhuematic Diseases 60:545;Rioja等((2008)Arthritis &Rheum 58(8):2257)。在一些情况下,生物标志物还确认为影响特定治疗性抗体的临床疗效。例如,已经发现FCGR2A和FCGR3A多态性影响抗体英夫利昔单抗(infliximab)在RA患者中的临床疗效(Canete等(2009)Ann Rheum Dis 68:1547;Tsukahara等(2008)Ann Rheum Dis 67:1791)。尽管存在这些发现,对于确定哪些RA患者将对各种不同治疗选项具有反应的更为有效的手段仍存在着需求。
发明内容
对有助于预测或评估给定的RA治疗的效能的遗传标志物的鉴别仍是一个挑战。本发明至少部分地鉴别了三种生物标志物,其可单独用于或彼此结合地用于预测患有类风湿性关节炎的受试者对于TNFα抑制剂的治疗是否将具有反应性。本发明是基于(至少部分地)对可用于评估受试者对于治疗的反应性(例如在施用治疗如人TNFα抗体或其抗原结合部分之前或与之同时)的分子标志物的鉴别。具体而言,本发明提供了可用于确定患有自身免疫疾病诸如类风湿性关节炎(RA)的受试者对于TNFα抑制剂的治疗是否具有反应性的方法和组合物。本发明是基于(至少部分地)在受试者中特定等位基因如HLA-DRB1共同表位(HLA-DRB1SE)、IL-4R I50V多态性和/或FcγRIIb I232T多态性的存在或拷贝数与对于TNFα抑制剂和/或甲氨蝶呤(MTX)治疗的提高的或降低的反应性相关的观测结果。
因此,在一个方面,本发明提供了用于在患有自身免疫失调如类风湿性关节炎(RA)的受试者中确定、预测或评估对于TNFα抑制剂治疗的反应性的方法,并且提供了治疗患有自身免疫失调如RA的受试者的方法,其包括确定所述受试者的基因型,其中所述基因型表示所述受试者对于TNFα抑制剂的治疗具有反应性。
在一个方面,本发明提供了用于预测患有自身免疫失调如类风湿性关节炎(RA)的受试者对于TNFα抑制剂治疗的反应性的方法,所述方法包括确定来自所述受试者的样品中HLA-DRB1共同表位(HLA-DRB1SE)等位基因的存在或例如拷贝数,其中所述HLA-DRB1SE等位基因的一个或两个拷贝的存在表示所述受试者对于所述TNFα抑制剂的治疗具有反应性。
在一个方面,本发明提供了用于治疗患有自身免疫疾病诸如类风湿性关节炎(RA)的受试者的方法,所述方法包括对所述受试者施用TNFα抑制剂以用于治疗RA,前提是在来自所述受试者的样品中存在HLA-DRB1共同表位(HLA-DRB 1SE)等位基因的至少一个拷贝,例如一个或两个拷贝。
在一个相关的方面,本发明提供了用于治疗患有自身免疫疾病诸如类风湿性关节炎(RA)的受试者的方法,所述方法包括测定来自所述受试者的样品中HLA-DRB1共同表位(HLA-DRB1SE)等位基因的拷贝数,以及在所述受试者具有一个或两个拷贝的所述HLA-DRB1SE等位基因的情况下对所述受试者施用治疗有效量的所述TNFα抑制剂。
在一个方面,本发明提供了用于治疗患有自身免疫疾病诸如类风湿性关节炎(RA)的受试者的方法,所述方法包括测定来自所述受试者的样品中HLA-DRB1共同表位(HLA-DRB1 SE)等位基因的拷贝数以及IL-4R I50等位基因的存在,以及在所述受试者不具有HLA-DRB1 SE等位基因且所述受试者在所述样品中具有至少一个(优选两个)IL-4R I50等位基因的情况下对所述受试者施用治疗有效量的TNFα抑制剂。
在另一个方面,本发明提供了确定TNFα抑制剂对于治疗患有自身免疫疾病如类风湿性关节炎(RA)的受试者将是否有效的方法,所述方法包括检测来自所述受试者的样品中至少一个拷贝的HLA-DRB1共同表位(HLA-DRB1 SE)等位基因的存在,其中所述HLA-DRB1 SE等位基因的存在表示所述TNFα抑制剂对于所述受试者中所述自身免疫疾病如RA的治疗是有效的。
在一个实施方案中,通过分析样品中的核酸如DNA或蛋白质而测定所述HLA-DRB1 SE等位基因的拷贝数。在另一个实施方案中,使用选自由微阵列分析、DNA测序或PCR技术组成的组的分析方法测定所述HLA-DRB1 SE等位基因的拷贝数,所述PCR技术包括但不限于等位基因特异性PCR。
在本发明的特定实施方案中,所述方法进一步包括测定来自所述受试者的样品中IL-4R I50等位基因的拷贝数,其中所述IL-4R I50等位基因(AA或AG)在所述样品中的存在表示所述受试者对于TNFα抑制剂的治疗具有反应性。
在其它的实施方案中,本发明的方法进一步包括确定来自所述受试者的样品中两个FcγRIIb T232等位基因(FcγRIIb-CC)的存在,其中所述两个FcγRIIb T232等位基因(FcγRIIb-CC)在所述样品中的存在表示所述受试者对于所述TNFα抑制剂的治疗具有反应性。
在其它的实施方案中,本发明的方法进一步包括测定来自所述受试者的样品中IL-4R I50等位基因的拷贝数以及确定来自所述受试者的样品中两个FcγRIIb T232等位基因(FcγRIIb-CC)的存在,其中所述IL-4R I50等位基因(AA或AG)在所述样品中的存在以及两个FcγRIIb T232等位基因(FcγRIIb-CC)在所述样品中的存在表示所述受试者对于所述TNFα抑制剂的治疗具有反应性。
在一个方面,本发明提供了预测患有自身免疫疾病如类风湿性关节炎(RA)的受试者对于TNFα抑制剂治疗的反应性的方法,所述方法包括测定来自所述受试者的样品中FcγRIIb T232等位基因的拷贝数,其中两个拷贝的所述FcγRIIb T232等位基因(FcγRIIb-CC)的存在表示所述受试者对于所述TNFα抑制剂的治疗具有反应性。
在另一个方面,本发明提供了用于治疗患有自身免疫疾病诸如类风湿性关节炎(RA)的受试者的方法,所述方法包括对所述受试者施用TNFα抑制剂以用于治疗所述自身免疫疾病如RA,前提是在来自所述受试者的样品中存在两个拷贝的所述FcγRIIb T232等位基因(FcγRIIb-CC)。
在又一个方面,本发明提供了确定TNFα抑制剂对于治疗患有自身免疫疾病如类风湿性关节炎(RA)的受试者是否有效的方法,所述方法包括检测来自所述受试者的样品中FcγRIIb T232等位基因的拷贝数,其中两个拷贝的所述FcγRIIb T232等位基因(FcγRIIb-CC)的存在表示所述TNFα抑制剂对于所述受试者的所述自身免疫疾病如RA的治疗是有效的。
在一个实施方案中,通过分析所述样品中的核酸如DNA或蛋白质而确定所述FcγRIIb T232等位基因的存在。在另一个实施方案中,使用选自由微阵列分析、DNA测序或PCR技术组成的组的分析方法确定所述FcγRIIb T232等位基因的存在,所述PCR技术包括但不限于等位基因特异性PCR。
在一个方面,本发明提供了预测患有自身免疫疾病如类风湿性关节炎(RA)的受试者对于TNFα抑制剂治疗的反应性的方法,所述方法包括测定来自所述受试者的样品中IL-4R V50等位基因的拷贝数,其中两个拷贝的所述IL-4R V50等位基因(GG)在所述样品中的存在表示所述受试者对于所述TNFα抑制剂的治疗应不具有反应性,除非所述受试者还具有至少一个拷贝的HLA-DRB1SE等位基因。
在一个实施方案中,通过分析所述样品中的核酸如DNA或蛋白质而测定所述IL-4R V50等位基因的拷贝数。在另一个实施方案中,使用选自由微阵列分析、DNA测序或PCR技术组成的组的分析方法测定所述IL-4R V50等位基因的拷贝数,所述PCR技术包括但不限于等位基因特异性PCR。
本发明还包括用于确定或预测患有自身免疫疾病诸如类风湿性关节炎(RA)的受试者对TNFα抑制剂治疗的反应性的方法,所述方法包括确定来自所述受试者的样品中IL-4R I50等位基因的存在,其中所述IL-4R I50等位基因(优选地是两个拷贝的所述IL-4R I50等位基因,如AA基因型)在所述样品中的存在表示所述受试者对于所述TNFα抑制剂的治疗具有反应性。
在一个实施方案中,通过分析所述样品中的核酸如DNA或蛋白质而确定所述IL-4R I50等位基因的存在。在另一个实施方案中,使用选自由微阵列分析、DNA测序或PCR技术如但不限于等位基因特异性PCR组成的组的分析方法确定所述IL-4R I50等位基因的存在。
本发明还包括用于治疗患有自身免疫疾病诸如类风湿性关节炎(RA)的受试者的方法,所述方法包括确定来自所述受试者的样品中IL-4RV50等位基因的存在,以及在所述受试者具有至少一个IL-4R I50等位基因(如,基因型为AA或AG)的情况下对所述受试者施用治疗有效量的TNFα抑制剂。
在一个实施方案中,通过分析所述样品中的核酸如DNA或蛋白质而确定所述IL-4R I50等位基因的存在。在另一个实施方案中,使用选自由微阵列分析、DNA测序或PCR技术如但不限于等位基因特异性PCR组成的组的分析方法确定所述IL-4R I50等位基因的存在。
本发明还提供了预测患有自身免疫疾病诸如类风湿性关节炎(RA)的受试者对TNFα抑制剂治疗的反应性的方法,所述方法包括测定来自所述受试者的样品中HLA-DRB1共同表位(HLA-DRB1SE)等位基因的拷贝数以及来自所述受试者的样品中IL-4R I50等位基因的拷贝数,其中所述样品中所述HLA-DRB1SE等位基因的存在以及所述IL-4R I50等位基因(AA或AG)的存在表示所述受试者对于所述TNFα抑制剂的治疗具有反应性。
在一个方面,本发明提供了用于治疗患有自身免疫疾病诸如类风湿性关节炎(RA)的受试者的方法,所述方法包括对所述受试者施用TNFα抑制剂以用于治疗RA,前提是在来自所述受试者的样品中存在一个或两个拷贝的HLA-DRB1共同表位(HLA-DRB1SE)等位基因以及一个或两个拷贝的存在IL-4R I50等位基因(AA或AG)。
在另一个方面,本发明提供了确定TNFα抑制剂对于治疗患有自身免疫疾病如类风湿性关节炎(RA)的受试者是否有效的方法,所述方法包括确定来自所述受试者的样品中至少一个拷贝的HLA-DRB1共同表位(HLA-DRB1SE)等位基因的存在以及测定来自所述受试者的样品中IL-4R I50等位基因的拷贝数量,其中所述HLA-DRB1 SE等位基因的存在以及一个或两个拷贝的所述IL-4R I50等位基因(AA或AG)的存在表示所述TNFα抑制剂在所述受试者中对RA的治疗是有效的。
在一个实施方案中,通过分析所述样品中的核酸如DNA或蛋白质而确定所述IL-4R I50等位基因的存在。在另一个实施方案中,使用选自由微阵列分析、DNA测序或PCR技术如但不限于等位基因特异性PCR组成的组的分析方法确定所述IL-4R I50等位基因的存在。
在本发明的一个实施方案中,所述受试者是人。
在本发明的另一个实施方案中,所述RA是早期类风湿性关节炎。
在又一个实施方案中,所述方法确定或预测所述受试者的临床反应性。
在另一个实施方案中,所述受试者经诊断患有病程低于1年的RA。
在另一个实施方案中,所述受试者具有>3.2的DAS28。
在另一个实施方案中,所述受试者先前未经历全身性抗TNFα疗法、MTX或>2种DMARD进行的治疗,和/或者未患有其它急性炎症性关节疾病。
在另一个实施方案中,对所述受试者进一步,例如同时地,施用MTX。
在另一个实施方案中,对所述受试者每周施用一次MTX,并且每2周施用一次阿达木单抗(adalimumab)。
在一个实施方案中,本发明的方法包括分析样品(或来自受试者的多个样品)的多种遗传标志物,包括,例如,所述HLA-DRB1SE等位基因(例如,其拷贝数)和所述IL-4R I50等位基因两种。或者,本发明包括分析样品的所述HLA-DRB1 SE等位基因(例如,其拷贝数)和所述IL-4R V50等位基因(例如,确定受试者对于等位基因是否是纯合的)。此外,FcγRIIb I232T单核苷酸多态性(SNP)可单独使用或结合本文所述的任意方法使用,包括所述HLA-DRB1 SE等位基因的拷贝数和/或所述IL-4R I50等位基因的存在和/或所述受试者对于所述IL-4R V50等位基因是否是纯合的。
在一个实施方案中,所述TNFα抑制剂是抗TNFα抗体或其抗原结合部分,或是融合蛋白,如依那西普(etanercept)。
在一个实施方案中,所述抗TNFα抗体或其抗原结合部分选自由人抗体、嵌合抗体、人源化抗体和多价抗体所组成的组。
在一个实施方案中,所述抗TNFα嵌合抗体或其抗原结合部分是英夫利昔单抗。
在一个实施方案中,所述抗TNFα人抗体或其抗原结合部分是阿达木单抗或戈利木单抗(golimumab)。
在一个实施方案中,所述抗TNFα人源化抗体或其抗原结合部分是聚乙二醇瑟妥珠单抗(certolizumab pegol)。
在一个实施方案中,所述抗TNFα人抗体或其抗原结合部分是分离的人抗体,根据表面等离子体共振测定其以1×10-8M或更低的Kd以及1×10-3s-1或更低的f速率常数kof与人TNFα解离,并且其在标准的体外L929分析中以1×10-7M或更低的IC50中和人TNFα细胞毒性。
在一个实施方案中,所述抗TNFα人抗体或其抗原结合部分是具有以下特征的分离的人抗体:根据表面等离子体共振测定,以1×10-3s-1或更低的速率常数koff与人TNFα解离;具有包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由在第1、4、5、7或8位上的单丙氨酸置换或由在1、3、4、6、7、8和/或9位上的1至5个保守氨基酸置换而从SEQ ID NO:3修饰而成的氨基酸序列的轻链CDR3结构域;并且具有包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列或由在第2、3、4、5、6、8、9、10或11位上的单丙氨酸置换或由在2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12位上的1至5个保守氨基酸置换而从SEQ ID NO:4修饰而成的氨基酸序列的重链CDR3结构域。
在一个实施方案中,所述抗TNFα人抗体或其抗原结合部分是分离的人抗体,其具有包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)以及包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)。
本发明的特征还在于用于预测或评估受试者对于TNFα抑制剂治疗自身免疫疾病如类风湿性关节炎(RA)的反应性的试剂盒,所述试剂盒包括用于确定来自所述受试者的样品中HLA-DRB1 SE等位基因的存在的工具,以及基于所述HLA-DRB1 SE等位基因的拷贝数而对所述受试者推荐治疗的指导,其中所述HLA-DRB1 SE等位基因的存在表示所述受试者对于所述TNFα抑制剂的治疗具有反应性。
可根据本领域中已知的标准方法确定所述HLA-DRB1 SE等位基因的存在。在一个实施方案中,用于测定所述HLA-DRB1 SE等位基因的拷贝数的工具包括与HLA-DRB1 SE杂交的核酸。在另一个实施方案中,用于测定所述HLA-DRB1 SE等位基因的拷贝数的工具包括与对应于HLA-DRB1 SE的蛋白质结合的抗体。
在一个实施方案中,所述试剂盒进一步包括用于确定来自所述受试者的样品中IL-4R I50等位基因的存在的工具,以及基于所述IL-4RI50等位基因的存在而对所述受试者推荐治疗的指导,其中所述IL-4RI50等位基因与所述HLA-DRB1 SE等位基因的组合存在表示所述受试者对于TNFα抑制剂的RA治疗具有反应性。
在一个方面,本发明提供了用于预测或评估受试者对于TNFα抑制剂治疗自身免疫疾病如类风湿性关节炎(RA)的反应性的试剂盒,所述试剂盒包括用于确定来自所述受试者的样品中FcγRIIb T232等位基因的存在的工具,以及基于两个FcγRIIb T232等位基因(FcγRIIb-CC)的存在而对所述受试者推荐治疗的指导,其中所述两个FcγRIIb T232等位基因的存在表示所述受试者对于所述TNFα抑制剂的治疗具有反应性。
在一个实施方案中,用于确定所述FcγRIIb T232等位基因的存在的工具包括与编码FcγRIIb T232的核酸分子或其包含I232T SNP的部分杂交的核酸。在另一个实施方案中,用于确定所述FcγRIIb T232等位基因的存在的工具包括特异性地与对应于FcγRIIb T232蛋白的蛋白质结合的抗体。
在一个实施方案中,所述试剂盒进一步包括用于确定来自所述受试者的样品中IL-4R I50等位基因的存在的工具,以及基于所述IL-4RI50等位基因的存在而对所述受试者推荐治疗的指导,其中所述IL-4RI50等位基因与所述FcγRIIb-CC等位基因的组合存在表示所述受试者对于所述TNFα抑制剂的RA治疗具有反应性。任选地,所述试剂盒进一步包括用于检测来自所述受试者的样品中HLA-DRB1 SE等位基因的存在的工具,以及基于所述HLA-DRB1 SE等位基因的存在而对所述受试者推荐治疗的指导,其中所述FcγRIIb-CC等位基因、所述IL-4R I50等位基因和所述HLA-DRB1 SE等位基因的组合存在表示所述受试者对于所述TNFα抑制剂的RA治疗具有反应性。
在又一个实施方案中,所述试剂盒进一步包括用于检测来自所述受试者的样品中HLA-DRB1 SE等位基因的存在的工具,以及基于所述HLA-DRB1 SE等位基因的存在而对所述受试者推荐治疗的指导,其中所述FcγRIIb-CC等位基因和所述HLA-DRB 1SE等位基因的组合存在表示所述受试者对于所述TNFα抑制剂的RA治疗具有反应性。
在一个实施方案中,所述试剂盒进一步包括用于从所述受试者获得所述样品的工具。
本发明还提供了用于预测或评估受试者对于TNFα抑制剂治疗自身免疫疾病如类风湿性关节炎(RA)的反应性的试剂盒,所述试剂盒包括用于确定来自所述受试者的样品中IL-4R I50等位基因的存在的工具,以及基于所述IL-4R I50等位基因的存在而对所述受试者推荐治疗的指导,其中在样品中所述IL-4R I50等位基因(优选两个拷贝的所述IL-4RI50等位基因)的存在表示所述受试者对于所述TNFα抑制剂的治疗具有反应性。
在一个实施方案中,用于确定所述IL-4R I50等位基因的存在的工具包括与IL-4R I50杂交的核酸。在另一个实施方案中,用于确定所述IL-4R I50等位基因的存在的工具包括与对应于IL-4R I50蛋白的蛋白质结合的抗体。
本发明的进一步特征在于用于预测或评估受试者对于TNFα抑制剂治疗自身免疫疾病如类风湿性关节炎(RA)的反应性的试剂盒,所述试剂盒包括用于测定来自所述受试者的样品中IL-4R V50等位基因的拷贝数的工具,以及基于所述IL-4R V50等位基因的存在而对所述受试者推荐治疗的指导,其中在样品中两个拷贝的所述IL-4R V50等位基因表示所述受试者对于所述TNFα抑制剂的治疗不具有反应性,除非所述受试者还具有至少一个拷贝的所述HLA-DRB1SE等位基因。
在一个实施方案中,用于确定所述IL-4R V50等位基因的存在的工具包括与IL-4R V50杂交的核酸。在一个实施方案中,用于确定所述IL-4R V50等位基因的存在的工具包括与对应于IL-4R V50蛋白的蛋白质结合的抗体。
在一个实施方案中,本发明的试剂盒包括用于测定在样品(或来自受试者的多个样品)中多种遗传标志物的存在和/或拷贝数的工具,所述遗传标志物包括,例如,所述HLA-DRB1SE等位基因(例如,其拷贝数)和所述IL-4R I50等位基因两者。或者,所述试剂盒包括用于测定所述HLA-DRB1SE等位基因(例如,其拷贝数)和所述IL-4R V50等位基因的存在和/或拷贝数的工具。此外,本发明的试剂盒可包括用于单独地或与本文所述的任意试剂盒(包括包含用于测定所述HLA-DRB 1SE等位基因的存在和/或拷贝数和/或所述IL-4R I50等位基因的存在和/或所述受试者对于所述IL-4R V50等位基因是否纯合的工具的试剂盒)结合确定所述FcγRIIb I232T单核苷酸多态性(SNP)的存在和/或拷贝数的工具。
在一个实施方案中,所述TNFα抑制剂是抗TNFα抗体或其抗原结合部分,或是融合蛋白如依那西普。
在一个实施方案中,所述抗TNFα抗体或其抗原结合部分选自由人抗体、嵌合抗体、人源化抗体和多价抗体所组成的组。
在一个实施方案中,所述抗TNFα嵌合抗体或其抗原结合部分是英夫利昔单抗。
在一个实施方案中,所述抗TNFα人抗体或其抗原结合部分是阿达木单抗或戈利木单抗。
在一个实施方案中,所述抗TNFα人源化抗体或其抗原结合部分是聚乙二醇瑟妥珠单抗。
在一个实施方案中,所述抗TNFα人抗体或其抗原结合部分是分离的人抗体,根据表面等离子体共振测定其以1×10-8M或更低的Kd以及1×10-3s-1或更低的速率常数koff与人TNFα解离,并且其在标准的体外L929分析中以1×10-7M或更低的IC50中和人TNFα细胞毒性。
在一个实施方案中,所述抗TNFα人抗体或其抗原结合部分是具有以下特征的分离的人抗体:根据表面等离子体共振测定,以1×10-3s-1或更低的速率常数koff与人TNFα解离;具有包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由在第1、4、5、7或8位上的单丙氨酸置换或由在1、3、4、6、7、8和/或9位上的1至5个保守氨基酸置换而从SEQ ID NO:3修饰而成的氨基酸序列的轻链CDR3结构域;和具有包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列或由在第2、3、4、5、6、8、9、10或11位上的单丙氨酸置换或由在2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12位上的1至5个保守氨基酸置换而从SEQ ID NO:4修饰而成的氨基酸序列的重链CDR3结构域。
在一个实施方案中,所述抗TNFα人抗体或其抗原结合部分是分离的人抗体,其具有包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)以及包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)。
本文所述的本发明的所有实施方案,包括在本发明的不同方面中所描述的实施方案,根据设想可与任意其他实施方案进行组合,除非不适合或明示地排除。
附图简述
图1示出了OPTIMA研究的设计。
图2示出了按照所述HLA-DRB1 SE等位基因的存在,治疗组(阿达木单抗+甲氨蝶呤对比安慰剂+甲氨蝶呤)之间在第26周达到ACR20、ACR50和ACR70反应的受试者的百分点差异。
图3示出了按照所述HLA-DRB1 SE等位基因的存在,治疗组(阿达木单抗+甲氨蝶呤对比安慰剂+甲氨蝶呤)之间在第26周符合LDA和缓解(remission)的DAS28标准的受试者的百分点差异。
图4示出了按照所述IL-4等位基因(AA、AG和GG)的存在,治疗组(阿达木单抗+甲氨蝶呤对比安慰剂+甲氨蝶呤)之间在第26周达到ACR20、ACR50和ACR70反应的受试者的百分点差异。
图5示出了按照IL-4等位基因(AA、AG和GG)的存在,治疗组(阿达木单抗+甲氨蝶呤对比安慰剂+甲氨蝶呤)之间在第26周符合LDA和缓解的DAS28标准的受试者的百分点差异。
图6示出了柱状图,其显示按照SE拷贝数,具有IL-4R-AA的经阿达木单抗治疗的患者在第26周获得ACR50和DAS28的百分比。
图7示出了柱状图,其显示按照SE拷贝数,具有IL-4R-AG的经阿达木单抗治疗的患者在第26周获得ACR50和DAS28的百分比。
图8以图示了按照SE拷贝数,在具有IL-4R-GG的经阿达木单抗治疗的患者第26周获得ACR50和DAS28的百分比。
图9示出了按照基因型描述具有DAS28低疾病活动的患者百分比的柱状图。
发明详述
定义
为使本发明更易于理解,首先定义特定的术语。
本文所使用的术语“人TNFα”(本文缩写为hTNFα或简写作hTNF)意指人细胞因子,其以17kD的分泌形式和26kD的膜结合形式存在,其生物活性形式由非共价结合的17kD分子的三聚体组成。hTNFα的结构进一步描述于(例如)Pennica,D.等人(1984)Nature 312:724-729;Davis,J.M.等人(1987)Biochemistry 26:1322-1326;及Jones,E.Y.等人(1989)Nature 338:225-228中。在一个实施方案中,术语人类TNFα意图包括重组人类TNFα(rhTNFα),其可由标准重组表达方法制备或购买得到(R&D Systems,目录第210-TA号,Minneapolis,MN)。TNFα也称作TNF。
所述术语“TNFα抑制剂”包括干扰TNFα活性的药剂。该术语也包括本文中所述的各抗TNFα人类抗体及抗体部分以及美国专利第6,090,382号、第6,258,562号、第6,509,015号及美国专利申请序号09/801185及10/302356中所述的那些抗TNFα人类抗体及抗体部分。在一个实施方案中,用于本发明的TNFα抑制剂为抗TNFα抗体或其片段,其包括英夫利昔单抗(Remicade,Johnson and Johnson;描述于美国专利第5,656,272号中,该专利引入本文作为参考)、CDP571(人源化单株抗TNFαIgG4抗体)、CDP 870(人源化单株抗TNFα抗体片段;聚乙二醇瑟妥珠单抗或CIMZIA;UCB Group)、抗TNF dAb(Peptech)、CNTO 148(戈利木单抗;Medarex and Centocor,参见WO 02/12502)和阿达木单抗(HUMIRA,Abbott Laboratories,人抗TNF mAb,作为D2E7描述于US 6,090,382中)。美国专利第6,593,458号;第6,498,237号;第6,451,983号;和第6,448,380号中描述了可在本发明中使用的另外的TNF抗体,各专利以引用的方式并入本文。在另一个实施方案中,所述TNFα抑制剂是TNF融合蛋白,例如依那西普(ENBREL,Amgen;描述于WO 91/03553和WO 09/406476中,其以引用的方式并入本文)。在另一个实施方案中,所述TNFα抑制剂是重组TNF结合蛋白(r-TBP-I)(Serono)。
本文所使用的术语“抗体”意指包含4条多肽链(由二硫键相互连接的2条重(H)链及2条轻(L)链)的免疫球蛋白分子。各重链包含一个重链可变区(本文中缩写为HCVR或VH)及一个重链恒定区。该重链恒定区包含3个域(CH1、CH2及CH3)。各轻链包含一个轻链可变区(本文中缩写为LCVR或VL)及一个轻链恒定区。该轻链恒定区包含1个域CL。VH及VL区可进一步再分为高变区,称作互补决定区(CDR),其中散布有更保守的区,称作构架区(FR)。VH及VL各包含3个CDR及4个FR,按以下顺序从氨基末端至羧基末端排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本发明的抗体进一步详细描述于美国专利第6,090,382号、第6,258,562号及第6,509,015号中,各专利全文以引用的方式并入本文。
本文所使用的术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”(或简称为“抗体部分”)指的是抗体的一个或多个片段,其保持了特异性结合于抗原(如hTNFα)的能力。据显示抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段实施。结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fabc、Fv、单链和单链抗体。术语抗体的″抗原结合部分″内包含的结合片段的实施例包括(i)Fab片段,由VL、VH、CL及CH1域组成的单价片段;(ii)F(ab′)2片段,包含在铰链区由二硫桥连接的2个Fab片段的二价片段;(iii)由VH及CH1域组成的Fd片段;(iv)由抗体的单臂VL域及VH域组成的Fv片段,(v)dAb片段(Ward等人(1989)Nature 341:544-546),其由VH域组成;及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外,尽管Fv片段的2个域(VL及VH)由各自基因编码,但是其可使用重组方法由能使其成为单一蛋白链的合成连接体连接,其中VL及VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv);参见例如Bird等人(1988)Science 242:423-426;及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。该单链抗体也包括于术语抗体的″抗原结合部分″中。也包括单链抗体的其它形式,例如双抗体。双抗体为二价、双特异性抗体,其中VH及VL域表达于单一多肽链上,但使用太短而不能使其在相同链上的两个域之间配对的连接体,因此使该域与另一链的互补域配对并形成两个抗原结合位点(参见例如Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448;Poljak等人(1994)Structure 2:1121-1123)。本发明的抗体部分进一步详细描述于美国专利第6,090,382号、第6,258,562号、第6,509,015号中,各专利全文以引用的方式并入本文。
再另外地,抗体或其抗原结合部分可以是较大的免疫粘附分子的部分,所述免疫粘附分子通过所述抗体或抗体部分与一种或多种其它蛋白质或肽的共价或非共价结合而形成。这类免疫粘附分子的实例包括使用抗生蛋白链菌素核心区域以形成四聚的scFv分子(Kipriyanov,S.M.等(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101)以及使用半胱氨酸残基、标志物肽和C末端多组氨酸标签以形成双价和生物素化的scFv分子(Kipriyanov,S.M.等(1994)Mol.Immunol.31:1047-1058)。可使用常规技术诸如分别对完整抗体进行的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化而从完整抗体制备抗体部分,诸如Fab和F(ab′)2片段。此外,如本文所述的,可使用标准重组DNA技术获得抗体、抗体部分和免疫粘附分子。
本文使用的″保守氨基酸置换″为一个氨基酸残基被具有类似侧链的另一氨基酸残基置换。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在现有技术中定义,所述侧链包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分枝侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
“嵌合抗体”指的是其中各重链和轻链的氨基酸序列的一部分与源自特定物种或属于特定类属的抗体中的对应序列同源,而所述链的其余区段与来自另一物种的对应序列同源的抗体。在一个实施方案中,本发明的特征在于嵌合抗体或抗原结合片段,其中轻链和重链的可变区模拟了源自一种哺乳动物物种的抗体的可变区,而恒定部分与源自另一物种的抗体中的序列同源。在本发明的优选实施方案中,通过将来自小鼠抗体的CDR嫁接到人抗体的框架区上而制备嵌合抗体。
“人源化抗体”指的是包括至少一条包含实质上来自人抗体链(称为受体免疫球蛋白或抗体)的可变区框架残基以及实质上来自非人抗体(如小鼠)的至少一个互补决定区(CDR)的链的抗体。除CDR的嫁接外,人源化抗体一般进行进一步的改造以改善亲和性和/或免疫原性。
术语“多价抗体”指的是包含多于一个抗原识别位点的抗体。例如,“双价”抗体具有两个抗原识别位点,而“四价”抗体具有四个抗原识别位点。术语“单特异性”、“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”等指的是多价抗体中存在的不同抗原识别位点特异性的数目(与抗原识别位点的数目不同)。例如,“单特异性”抗体的抗原识别位点全部结合相同的表位。“双特异性”或“二重特异性”抗体具有至少一个结合第一表位的抗原识别位点以及至少一个结合不同于所述第一表位的第二表位的抗原识别位点。“多价单特异性”抗体具有多个抗原识别位点,其全部结合相同的表位。“多价双特异性”抗体具有多个抗原识别位点,其中一些结合第一表位并且其中一些结合不同于所述第一表位的第二表位。
本文所使用的术语“人抗体”意在包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包含并非由人种系免疫球蛋白序列所编码的氨基酸残基(例如,通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变所引入的突变),例如在CDR和特别是在CDR3中。但是,本文所使用的术语“人抗体”并非意在包括其中源自另一种哺乳动物物种诸如小鼠的种系的CDR序列已被嫁接到人框架序列上的抗体。
本文使用的术语″重组人抗体″包括由重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体,例如使用转染至宿主细胞(以下进一步描述)内的重组表达载体表达的抗体;自重组、组合人抗体文库(以下进一步描述)分离的抗体;从对于人类免疫球蛋白基因而言为转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体(参见例如Taylor等人(1992)Nucl.Acids Res.20:6287);或由包含将人类免疫球蛋白基因序列剪接为其它DNA序列的任意其它方式制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组人抗体具有从人类种系免疫球蛋白序列衍生的可变区及恒定区。然而,在某些实施方案中,这些重组人抗体经受体外突变(或当使用对于人类Ig序列而言为转基因的动物时的体内体细胞突变),并且因此重组抗体的VH及VL区的氨基酸序列为当衍生自人类种系VH及VL序列且与人类种系VH及VL序列相关时可能并非体内天然存在于人类抗体种系所有组成部分内的序列。
可通过本领域中已知的重组DNA技术制备这些嵌合的、人源化的、人的以及双特异性的抗体,例如使用描述于PCT国际申请第PCT/US86/02269号;欧洲专利申请第184,187号;欧洲专利申请第171,496号;欧洲专利申请第173,494号;PCT国际公开号第WO86/01533号;美国专利第4,816,567号;欧洲专利申请第125,023号;Better等(1988)Science 240:1041-1043;Liu等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439-3443;Liu等(1987)J.Immunol.139:3521-3526;Sun等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214-218;Nishimura等(1987)CancerRes.47:999-1005;Wood等(1985)Nature 314:446-449;Shaw等(1988)J.Natl.Cancer Inst.80:1553-1559);Morrison(1985)Science229:1202-1207;Oi等(1986)BioTechniques 4:214;美国专利第5,225,539号;Jones等(1986)Nature 321:552-525;Verhoeyan等(1988)Science239:1534;以及Beidler等(1988)J.Immunol.141:4053-4060,Queen等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989),US 5,530,101、US5,585,089、US 5,693,761、US 5,693,762,Selick等的WO 90/07861以及Winter的US 5,225,539中的方法。
本文所使用的“分离的抗体”意指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(如,特异性地结合hTNFα的分离的抗体基本上不含特异性地结合hTNFα之外的抗原的抗体)。但是,特异性地结合hTNFα的分离的抗体可对其它抗原,诸如对来自其它物种的TNFα分子具有交叉反应性。此外,分离的抗体可基本上不含其它细胞物质和/或化学物质。
本文使用的″中和抗体″(或″中和hTNFα活性的抗体″)是指其与hTNFα结合导致hTNFα的生物活性受抑制的抗体。此hTNFα的生物活性的抑制可通过测定一种或多种hTNFα生物活性指标(例如hTNFα诱导的细胞毒性(体外或体内)、hTNFα诱导的细胞活化及hTNFα对hTNFα受体的结合)而评估。这些hTNFα生物活性指标可通过一种或多种现有技术中已知的若干体外或体内标准分析进行评估(参见美国专利第6,090,382号)。优选地,抗体中和hTNFα活性的能力通过抑制hTNFα诱导的L929细胞的细胞毒性而评估。作为hTNFα活性的其他或替代性参数,可评估作为hTNFα诱导的细胞活化的测量值的抗体抑制hTNFα诱导的ELAM-1在HUVEC上表达的能力。
本文使用的术语″表面等离振子共振″是指例如使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,NJ)由检测生物感应器基质内蛋白质浓度改变从而分析实时生物特异性相互作用的光学现象。进一步的描述参见美国专利第6,258,562号的实施例1和等(1993)Ann.Biol.Clin.51:19;等(1991)Biotechniques11:620-627;Johnsson等(1995)J.Mol.Recognit.8:125;以及Johnnson等(1991)Anal.Biochem.198:268。
本文所使用的术语“koff”意指抗体从抗体/抗原复合体解离的脱离速率常数。
本文所使用的术语“Kd”意指特定抗体-抗原相互作用的解离常数。
本文所使用的术语“IC50”意指抑制目的生物终点(endpoint)(如中和细胞毒性活性)所需的抑制剂浓度。
本文所使用的术语“剂量”指的是施用于受试者的TNFα抑制剂的量。
本文所使用的术语“给药”指的是为实现治疗目的(如,类风湿性关节炎的治疗)而进行的物质(如,抗TNFα抗体)的施用。
“给药方案”表述了TNFα抑制剂的治疗时间表,例如在长时间内和/或在整个疗程期间的治疗时间表,如在第0周施用TNFα抑制剂的第一个剂量,随后以双周的给药方案施用TNFα抑制剂的第二剂量。
本文所使用的术语“双周给药方案”、“双周给药”和“双周施用”指的是对受试者施用物质(如,抗TNFα抗体)以实现治疗目的的时程(timecourse),例如整个治疗过程。所述双周给药方案并不意在包括每周的给药方案。在一个实施方案中,每9-19天、每11-17天、每13-15天和每14天施用所述物质。在一个实施方案中,在治疗的第0周在受试者中开始所述双周给药方案。在另一个实施方案中,以双周给药方案施用维持剂量(maintenance dose)。在一个实施方案中,根据双周给药方案施用负荷(loading)和维持剂量。在一个实施方案中,双周给药包括其中从第0周开始每两周对受试者施用TNFα抑制剂的剂量的给药方案。在一个实施方案中,双周给药包括其中在给定的时间段,如4周、8周、16周、24周、26周、32周、36周、42周、48周、52周、56周等连续地每两周对受试者施用TNFα抑制剂剂量的给药方案。双周给药方法还描述于US 20030235585中,其以引用的方式并入本文。
短语″与第二药剂联合的第一药剂″中的术语″联合″包括共同施用第一药剂及第二药剂,例如其可溶解于或混合于相同的药学上可接受的载体中,或施用第一药剂随后施用第二药剂,或施用第二药剂随后施用第一药剂。因此,本发明包括联合治疗的方法及联合药物组合物。
短语″伴随治疗″中的术语″伴随″包括在第二药剂存在下施用药剂。伴随治疗方法包括共同施用第一、第二、第三或其他药剂的方法。伴随治疗方法也包括在第二或其他药剂存在下施用第一或其他药剂的方法,其中该第二或其他药剂(例如)可以预先施用。伴随治疗方法可由不同参与者逐步执行。例如,一名参与者可将第一药剂施用于受试者且第二参与者可将第二药剂施用于该受试者,且给药步骤可同时或几乎同时或在不同时间进行,只要该第一药剂(及其他药剂)在该第二药剂(及其他药剂)存在之后施用即可。参与者与受试者可为相同实体(例如人)。
本文使用的术语″联合疗法″是指施用两种或两种以上的治疗物质,例如抗TNFα抗体及另一药物。该其它药物可在抗TNFα抗体之前或之后或同时施用。
本发明的上下文中使用的术语“治疗”意在包括用于类风湿性关节炎治疗的治疗性处理,以及预防性或抑制性措施。例如,术语治疗可包括在类风湿性关节炎发作前或发作后施用TNFα抑制剂,由此预防或消除疾病或障碍的体征。另举一例,在类风湿性关节炎出现临床表现后施用TNFα抑制剂以对抗与类风湿性关节炎相关的症状和/或并发症以及障碍构成了对所述疾病的“治疗”。此外,在发病后和出现临床症状和/或并发症后施用药剂构成了对类风湿性关节炎的“治疗”,其中施用影响了所述疾病或障碍的临床参数且可能影响所述疾病的改善。在一个实施方案中,受试者中对类风湿性关节炎的治疗包括减轻体征和症状。在另一个实施方案中,受试者中对类风湿性关节炎的治疗包括诱导类风湿性关节炎的主要临床反应。在另一个实施方案中,受试者中对类风湿性关节炎的治疗包括抑制结构性损伤的进展。在一个实施方案中,类风湿性关节炎的治疗包括改善患有中度至重度活跃疾病的成人患者的身体机能。
“需要治疗的”对象包括已经患有类风湿性关节炎的哺乳动物诸如人,其包括疾病或障碍有待于预防的那些。
在本发明的方法和组合物中使用的TNFα抑制剂包括干扰TNFα活性的任意药剂。在优选的实施方案中,所述TNFα抑制剂可中和TNFα活性,特别是与类风湿性关节炎以及相关的并发症和症状有关的有害TNFα活性。
在一个实施方案中,本发明使用的TNFα抑制剂是TNFα抗体(本文又称为TNFα抗体)或其抗原结合片段,其包括嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。可用于本发明中的TNFα抗体的实例包括但不限于,英夫利昔单抗(REMICADE,Johnson and Johnson;描述于美国专利第5,656,272号,其以引用的方式并入本文)、CDP571(人源化单克隆抗TNFαIgG4抗体)、CDP 870(人源化单克隆抗TNFα抗体片段)、抗TNFdAb(Peptech)、CNTO 148(戈利木单抗;Medarex and Centocor,参见WO 02/12502)和阿达木单抗(HUMIRA,Abbott Laboratories,人抗TNF mAb,作为D2E7描述于US 6,090,382中)。美国专利第6,593,458号;第6,498,237号;第6,451,983号和第6,448,380号中描述了可在本发明中使用的另外的TNF抗体,各专利以引用的方式并入本文。
可用于本发明的方法和组合物中的TNFα抑制剂的其它实例包括依那西普(Enbrel,描述于WO 91/03553和WO 09/406476)、可溶性I型TNF受体、聚乙二醇化的可溶性I型TNF受体(PEGs TNF-R1)、p55TNFR IgG(来那西普(Lenercept))和重组TNF结合蛋白(r-TBP-I)(Serono)。
在一个实施方案中,术语“TNFα抑制剂”不包括英夫利昔单抗。在一个实施方案中,术语“TNFα抑制剂”不包括阿达木单抗。在另一个实施方案中,术语“TNFα抑制剂”不包括阿达木单抗和英夫利昔单抗。
在一个实施方案中,术语“TNFα抑制剂”不包括依那西普并且任选地不包括阿达木单抗、英夫利昔单抗以及不包括阿达木单抗和英夫利昔单抗。
在一个实施方案中,术语“TNFα抗体”不包括英夫利昔单抗。在一个实施方案中,术语“TNFα抗体”不包括阿达木单抗。在另一个实施方案中,术语“TNFα抗体”不包括阿达木单抗和英夫利昔单抗。
本文所使用的术语“患者”指的是任何单个的动物,更优选地指哺乳动物(包括人和这类非人动物诸如犬、猫、马、兔、动物园动物、牛、猪、绵羊以及非人灵长目动物),治疗为其所需。最为优选的情况下,在本文中所述患者是人。
本文所使用的“受试者”是任何正在经历或已经经历了RA的一个或多个体征、症状或其它指征适用于治疗的单个人类受试者,包括患者,无论其是例如,新近被诊断或此前被诊断并且正在经受反复或复发,还是处于RA的风险之中,无论出于何种原因。受试者意在包括参与临床研究试验而并未表现出疾病的任何体征的任何受试者,或参与流行病学研究的受试者,或一度被用作为对照的受试者。受试者可能此前已经使用RA药物(包括TNFα抑制剂)进行过治疗或未曾经历这样的治疗。
“试剂盒”是任意制品(如包装或容器),其包含至少一种试剂,例如用于治疗RA的药物,或包含用于特异性检测本发明的生物标志物基因或蛋白质的探针。所述制品优选地作为用于实施本发明的方法的单元进行推销、分配或销售。
所述术语“样品”一般地指任意生物样品,其获自个体、体液、身体组织、细胞系、组织培养物或其它来源。体液是,例如淋巴、血清、新鲜全血、外周血单核细胞、冷冻全血、血浆(包括新鲜或冷冻的)、尿液、唾液、精液、滑膜液以及脊髓液。样品还包括滑膜组织、皮肤、毛囊和骨髓。用于从哺乳动物获得组织活检样品和体液的方法在本领域中是众所周知的。如果单独使用术语“样品”,其应仍表示所述“样品”是“生物样品”,即所述术语可互换地使用。“遗传样品”是包含遗传物质的样品,诸如核酸,尤其是DNA。通常,可通过常规手段从样品中提取遗传物质并且对其进行多态性和等位基因分析以确定生物标志物的存在或表达。遗传样品包括血液和其它体液以及组织和细胞。
动词“测定”和“评估”具有相同的含义并且在本申请全文中可互换地使用。
发明的实施方案中使用的遗传标志物
本发明提供了三种遗传标志物,即HLA-DRB1 SE等位基因、IL-4R I50V单核苷酸多态性(SNP)和/或FcγRIIb I232T SNP(单独使用或彼此组合使用),其用于评估患有类风湿性关节炎的受试者对于TNFα抑制剂治疗是否具有反应性,所述TNFα抑制剂包括,例如抗TNFα人抗体,诸如阿达木单抗。
如本文中所使用的,序列中的单个氨基酸以AN或NA或ANA进行表示,其中A是所述序列中的氨基酸且N是在所述序列中的位置。例如,I50V是在第50位氨基酸上的单氨基酸多态性,其中异亮氨酸(I)存在于所述群体中较为多见的蛋白质变体中,而缬氨酸(V)存在于较不多见的变体中。在另一个实例中,I50代表第50位上的异亮氨酸。
HLA-DRB1共同表位(SE)
所述HLA-DRB1共同表位(HLA-DRB1SE)等位基因是显示为导致了1/3的RA易感性并且参与调控疾病活动性的遗传因子(参见Calin A等,Arthritis Rheum.32:1221-5(1989))。所述HLA-DRB1SE等位基因由于其在所述HLA-DRB1等位基因的第3高可变区中的第70-74位处的序列相似性被统称为“共同表位”(SE)等位基因(Gregersen等,ArthritisRheum.,30:1205-1213(1987))。HLA-DRB1的核苷酸和氨基酸序列是已知的并且可见于,例如GenBank登录号第NM_002124.2号和第NP_002115号,其全部内容以引用的方式并入本文。所述HLA-DRB1SE等位基因中最高保守的氨基酸序列是第72-74位上的“RAA”。在一个实施方案中,适用于本发明的方法和组合物中的HLA-DRB1 SE等位基因是HLA-DRB1*0101(QRRAA)(SEQ ID NO:43)、*0102(QRRAA)(SEQ ID NO:44)、*0103(DERAA)(SEQ ID NO:45)、*03(QKRGR)(SEQ ID NO:46)、*0401(QKRAA)(SEQ ID NO:47)、*0402(DERAA)(SEQ ID NO:48)、*0403(QRRAE)(SEQ ID NO:49)、*0404(QRRAA)(SEQ ID NO:50)、*0405(QRRAA)(SEQ ID NO:51)、*0407(QRRAE)(SEQ ID NO:52)、*0408(QRRAA)(SEQ ID NO:53)、*0411(QRRAE)(SEQ ID NO:54)、*07(DRRGQ)(SEQ ID NO:55)、*08(DRRAL)(SEQ IDNO:56)、*0901(RRRAE)(SEQ ID NO:57)、*1001(RRRAA)(SEQ ID NO:58)、*1101(DRRAA)(SEQ ID NO:59)、*1102(DERAA)(SEQ ID NO:60)、*1103(DERAA)(SEQ ID NO:61)、*1104(DRRAA)(SEQ ID NO:62)、*12(DRRAA)(SEQ ID NO:63)、*1301(DERAA)(SEQ ID NO:64);*1302(DERAA)(SEQ ID NO:65);*1303(DKRAA)(SEQ ID NO:66)、*1323(DERAA)(SEQ ID NO:67)、*1401(RRRAA)(SEQ ID NO:68)、*1402(QRRAA)(SEQ ID NO:69)、*1404(RRRAE)(SEQ ID NO:70)、*15(QARAA)(SEQ ID NO:71)和*16(DRRAA)(SEQ ID NO:72)中的一种或多种(参见,例如Essentials of Genomic andPersonalized Medicine,G.Ginsberg与H.Willard编著(2010)AcademicPress,San Diego,CA,p.553,其内容明确地以引用的方式并入本文;在所述HLA-DRB1 SE等位基因后的括号内显示的氨基酸残基对应于NP_002115的残基70-74)。在另一个实施方案中,适用于本发明的方法的HLA-DRB1SE等位基因是*01如*0101、*0102和*0103,*04如*0401、*0402、*0403、*0404、*0405、*0407、*0408和*0411,*1001和*14如*1401、*1402和*1404中的一种或多种。
IL-4R
白介素4受体(IL-4R)是多功能的细胞因子,其在免疫应答的调控中发挥作用(Nelms等(1999)Ann Rev Immunol 17:701)。所述IL-4R I50V(A→G[I50V])单核苷酸多态性(SNP)是与早期关节侵蚀相关的遗传标志物(参见Prots I.等,Arthritis Rheum.54:1491-500(2006))。本文所使用的“IL-4R I50V单核苷酸多态性”或“IL-4R I50V SNP”指的是在IL-4R的氨基酸序列第50位上的变异。这一等位基因变异是异亮氨酸向缬氨酸的变化,该变化由对应编码基因中的对应多核苷酸从A向G的变化所导致。IL-4R的核苷酸和氨基酸序列是已知的并且可见于,例如GenBank登录号第NM_000418.2号、第NM_001008699号、第NP_000409.1号和第NP_001008699.1号,其全部内容以引用的方式并入本文。IL-4R的核酸和氨基酸序列还可见于美国专利第7205106号,其以引用的方式并入本文。成熟IL-4R蛋白的氨基酸和核酸序列还在下文以SEQ IDNo:38和39提供。
MKVLQEPTCVSDYMSISTCEWKMNGPTNCSTELRLLYQLVFLLSEAHTCPENNGGAGCVCHLLMDDVVSADNYTLDLWAGQQLLWKGSFKPSEHVKPRAPGNLTVHTNVSDTLLLTWSNPYPPDNYLYNHLTYAVNIWSENDPADFRIYNVTYLEPSLRIAASTLKSGISYRARVRAWAQCYNTTWSEWSPSTKWHNSYREPFEQHLLLGVSVSCIVILAVCLLCYVSITKIKKEWWDQIPNPARSRLVAIIIQDAQGSQWEKRSRGQEPAKCPHWKNCLTKLLPCFLEHNMKRDEDPHKAAKEMPFQGSGKSAWCPVEISKTVLWPESISVVRCVELFEAPVECEEEEEVEEEKGSFCASPESSRDDFQEGREGIVARLTESLFLDLLGEENGGFCQQDMGESCLLPPSGSTSAHMPWDEFPSAGPKEAPPWGKEQPLHLEPSPPASPTQSPDNLTCTETPLVIAGNPAYRSFSNSLSQSPCPRELGPDPLLARHLEEVEPEMPCVPQLSEPTTVPQPEPETWEQILRRNVLQHGAAAAPVSAPTSGYQEFVHAVEQGGTQASAVVGLGPPGEAGYKAFSSLLASSAVSPEKCGFGASSGEEGYKPFQDLIPGCPGDPAPVPVPLFTFGLDREPPRSPQSSHLPSSSPEHLGLEPGEKVEDMPKPPLPQEQATDPLVDSLGSGIVYSALTCHLCGHLKQCHGQEDGGQTPVMASPCCGCCCGDRSSPPTTPLRAPDPSPGGVPLEASLCPASLAPSGISEKSKSSSSFHPAPGNAQSSSQTPKIVNFVSVGPTYMRVS
(SEQ ID NO:38)(以黑体/下划线标出了I50V SNP)
atgaaggtcttgcaggagcccacctgcgtctccgactacatgagcatctctacttgcgagtggaagatgaatggtcccaccaattgcagcaccgagctccgcctgttgtaccagctggtttttctgctctccgaagcccacacgtgttccctgagaacaacggaggcgcggggtgcgtgtgccacctgctcatggatgacgtggtcagtgcggataactatacactggacctgtgggctgggcagcagctgctgtggaagggctccttcaagcccagcgagcatgtgaaacccagggccccaggaaacctgacagttcacaccaatgtctccgacactctgctgctgacctggagcaacccgtatccccctgacaattacctgtataatcatctcacctatgcagtcaacatttggagtgaaaacgacccggcagatttcagaatctataacgtgacctacctagaaccctccctccgcatcgcagccagcaccctgaagtctgggatttcctacagggcacgggtgagggcctgggctcagtgctataacaccacctggagtgagtggagccccagcaccaagtggcacaactcctacagggagcccttcgagcagcacctcctgctgggcgtcagcgtttcctgcattgtcatcctggccgtctgcctgttgtgctatgtcagcatcaccaagattaagaaagaatggtgggatcagattcccaacccagcccgcagccgcctcgtggctataataatccaggatgctcaggggtcacagtgggagaagcggtcccgaggccaggaaccagccaagtgcccacactggaagaattgtcttaccaagctcttgccctgttttctggagcacaacatgaaaagggatgaagatcctcacaaggctgccaaagagatgcctttccagggctctggaaaatcagcatggtgcccagtggagatcagcaagacagtcctctggccagagagcatcagcgtggtgcgatgtgtggagttgtttgaggccccggtggagtgtgaggaggaggaggaggtagaggaagaaaaagggagcttctgtgcatcgcctgagagcagcagggatgacttccaggagggaagggagggcattgtggcccggctaacagagagcctgttcctggacctgctcggagaggagaatgggggcttttgccagcaggacatgggggagtcatgccttcttccaccttcgggaagtacgagtgctcacatgccctgggatgagttcccaagtgcagggcccaaggaggcacctccctggggcaaggagcagcctctccacctggagccaagtcctcctgccagcccgacccagagtccagacaacctgacttgcacagagacgcccctcgtcatcgcaggcaaccctgcttaccgcagcttcagcaactccctgagccagtcaccgtgtcccagagagctgggtccagacccactgctggccagacacctggaggaagtagaacccgagatgccctgtgtcccccagctctctgagccaaccactgtgccccaacctgagccagaaacctgggagcagatcctccgccgaaatgtcctccagcatggggcagctgcagcccccgtctcggcccccaccagtggctatcaggagtttgtacatgcggtggagcagggtggcacccaggccagtgcggtggtgggcttgggtcccccaggagaggctggttacaaggccttctcaagcctgcttgccagcagtgctgtgtccccagagaaatgtgggtttggggctagcagtggggaagaggggtataagcctttccaagacctcattcctggctgccctggggaccctgccccagtccctgtccccttgttcacctttggactggacagggagccacctcgcagtccgcagagctcacatctcccaagcagctccccagagcacctgggtctggagccgggggaaaaggtagaggacatgccaaagcccccacttccccaggagcaggccacagacccccttgtggacagcctgggcagtggcattgtctactcagcccttacctgccacctgtgcggccacctgaaacagtgtcatggccaggaggatggtggccagacccctgtcatggccagtccttgctgtggctgctgctgtggagacaggtcctcgccccctacaacccccctgagggccccagacccctctccaggtggggttccactggaggccagtctgtgtccggcctccctggcaccctcgggcatctcagagaagagtaaatcctcatcatccttccatcctgcccctggcaatgctcagagctcaagccagacccccaaaatcgtgaactttgtctccgtgggacccacatacatgagggtctct
(SEQ ID NO:39)(以黑体/下划线标出了I50V SNP)
FcγRIIb
Fcγ受体IIb(FcγRIIb;亦称为CD32或FCGR2B)参与免疫复合体的吞噬作用以及B细胞的抗体生产的调控。FcγRIIb I232T((T→C[I232T])SNP与患有明确的侵蚀性疾病的患者的快速放射性关节损伤以及其它疾病如狼疮相关(参见Radstake等,Arthritis Rheum.54:3828-37(2006);Kono等(2005)Hum Mol Genetic 14:2881)。本文所使用的“FcγRIIb I232T单核苷酸多态性”或“FcγRIIb I232T SNP”指的是在FcγRIIb的氨基酸序列第232位上的变异。这一等位基因变异是异亮氨酸向苏氨酸的变化,该变化由对应编码基因中的对应多核苷酸从T向C的变化所导致。FcγRIIb的核苷酸和氨基酸序列是已知的并且可见于,例如GenBank登录号第NM_001002273.2号、第NM_001002274.2号、第NM_001002275.2号、第NM_001190828.1号、第NM_004001.4号、第NP_001002273.1号、第NP_001002274.1号、第NP_001002275.1号、第NP_001177757.1号、第NP_003992.3号,其全部内容以引用的方式并入本文。FcγRIIb的示例性氨基酸和核苷酸序列在下文分别以SEQ ID No:40和41提供。
MGILSFLPVLATESDWADCKSPQPWGHMLLWTAVLFLAPVAGTPAAPPKAVLKLEPQWINVLQEDSVTLTCRGTHSPESDSIQWFHNGNLIPTHTQPSYRFKANNNDSGEYTCQTGQTSLSDPVHLTVLSEWLVLQTPHLEFQEGETIVLRCHSWKDKPLVKVTFFQNGKSKKFSRSDPNFSIPQANHSHSGDYHCTGNIGYTLYSSKPVTITVQAPSSSPMGIIVAVVTGAVAAIVAAVVALIYCRKKRISANPTNPDEADKVGAENTITYSLLMHPDALEEPDDQNRI
(SEQ ID NO:40)(以黑体/下划线标出了I232T SNP;无信号序列的登录号第NP_001002274号)
atgggaatcctgtcattcttacctgtccttgccactgagagtgactgggctgactgcaagtccccccagccttggggtcatatgcttctgtggacagctgtgctattcctggctcctgttgctgggacacctgcagctcccccaaaggctgtgctgaaactcgagccccagtggatcaacgtgctccaggaggactctgtgactctgacatgccgggggactcacagccctgagagcgactccattcagtggttccacaatgggaatctcattcccacccacacgcagcccagctacaggttcaaggccaacaacaatgacagcggggagtacacgtgccagactggccagaccagcctcagcgaccctgtgcatctgactgtgctttctgagtggctggtgctccagacccctcacctggagttccaggagggagaaaccatcgtgctgaggtgccacagctggaaggacaagcctctggtcaaggtcacattcttccagaatggaaaatccaagaaattttcccgttcggatcccaacttctccatcccacaagcaaaccacagtcacagtggtgattaccactgcacaggaaacataggctacacgctgtactcatccaagcctgtgaccatcactgtccaagctcccagctcttcaccgatggggatcattgtggctgtggtcactgggatgctgtagcggccattgttgctgctgtagtggccttgatctactgcaggaaaaagcggatttcagccaatcccactaatcctgatgaggctgacaaagttggggctgagaacacaatcacctattcacttctcatgcacccggatgctctggaagagcctgatgaccagaaccgtatttag
(SEQ ID NO:41)(以黑体/下划线标出了I232T SNP;登录号第NM_001002274号)
诊断
在一个方面,本发明提供了用于预测或评估患有或易患类风湿性关节炎的受试者对于抗TNFα抑制剂的反应性的方法。所述方法通常包括测定获自所述受试者的生物样品中HLA-DRB1SE、IL-4R I50V SNP和/或FcγRIIb I232T SNP存在与否(如其拷贝数),其中特定等位基因在所述样品中的存在是所述受试者响应于所述TNFα抑制剂的治疗的表示。
在一个实施方案中,使用本文所描述和本领域中已知的方法,可针对与SNP相关的一种或两种等位基因的存在而测试来自受试者的样品。例如,可针对所述IL-4R I50等位基因(或在替代的情况下,所述IL-4R V50等位基因)的存在测试受试者的样品以确定所述受试者是否具有AA(I50I)、AG(I50V)或GG(V50V)基因型,并且因此确定所述受试者对于TNFα抑制剂治疗是否具有反应性。类似地,可针对所述FcγRIIb I232等位基因(或在替代的情况下,FcγRIIb T232等位基因)的存在测试受试者的样品以确定所述受试者是否具有TT(I232I)、TC(I232T)或CC(T232T)基因型,并且因此确定所述受试者对于TNFα抑制剂治疗是否具有反应性。根据下文描述,SNP的检测指的是确定受试者具有哪种或哪些等位基因。
在一个实施方案中,通过使用本文所描述的和本领域中已知的方法,可针对HLA-DRB1 SE等位基因的存在而测试来自受试者的样品。例如,可在,针对所述HLA-DRB1的SE区域在例如DNA或蛋白质中的存在而测试来自受试者的样品。应当注意,还可针对所述HLA-DRB1 SE等位基因的缺失(等同于SE等位基因计数为0)在而测试所述样品。
可使用本文所述的方法和/或使用任意商购的试剂盒和/或本领域众所周知的技术实现对所述HLA-DRB1 SE等位基因、IL-4R I50V SNP和/或FcγRIIb I232T SNP的检测。例如,根据所附实施例中的描述,可将使用Protrans S4测序试剂盒(Medipro)进行的高分辨率分型用于测定患者是否具有HLA-DRB1 SE纯合性或杂合性,使用Assay-on-Demand(Applied Biosystems)进行的等位基因特异性PCR用于测定IL-4R(A至G[I50V])SNP,并且使用Assay-by-Design(Applied Biosystems)进行的等位基因特异性PCR用于测定FcγRIIb(T至C[I232T])变异体。
用于检测所述遗传标志物(SE和/或多态性)的方法包括检验来自受试者的样品中所述SNP或SE的存在和/或表达的方案。在所述生物样品中HLA-DRB1SE等位基因、IL-4R I50和/或V50等位基因(由此而区分I50V多态性)以及/或者FcγRIIb I232等位基因和/或T232等位基因(由此而区分I232T多态性)存在与否的检测还可使用任意其它众所周知的技术实施,诸如聚合酶链反应(PCR)扩增反应、逆转录酶PCR分析、单链构象多态性分析(SSCP)、错配切割检测、异源双链分析、Southern印迹分析、Western印迹分析、脱氧核糖核酸测序、限制性片段长度多态性分析、单倍型分析、血清型分析以及其组合或亚组合。
例如,可使用,例如Northern印记分析方法、Southern印记分析方法、斑点杂交、PCR分析、阵列杂交、RNA酶保护分析、FISH方法、CGH方法、RNA芯片方法或DNA芯片方法如DNA SNP芯片微阵列(如Affymetrix的微阵列系统或Illumina的BeadArray Technology)针对例如遗传标志物mRNA或DNA方便地分析这样的样品,包括组织或细胞样品。DNA SNP芯片微阵列是商购可获得的,其包括DNA微阵列快照(microarray snapshot)。在一个实施方案中,使用微阵列分析实施本发明的方法和试剂盒。在一个实施方案中,使用包含特异于HLA-DRB1 SE、FcγRIIb I232T SNP和/或IL-4R I50V SNP的核酸探针的基因芯片或DNA微阵列实施本发明的方法。
例如,mRNA样品可获自所述受试者(如,通过标准方法从外周血单核细胞分离)并且可使用标准分子生物学技术如PCR分析检测所述mRNA样品中编码HLA-DRB1SE等位基因、IL-4R I50和/或V50等位基因以及/或者FcγRIIb I232和/或T232等位基因的mRNA的表达。优选的PCR分析方法是逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)。用于mRNA样品分析的其它合适系统包括微阵列分析(如,使用Affymetrix的微阵列系统或Illumina的BeadArray Technology)。
例如,还可将实时PCR(RT-PCR)分析如定量PCR分析用于检测本文所述的生物标志物存在与否,并且这些方法在本领域中是众所周知的。在本发明的一个说明性实施方案中,用于检测生物样品中FcγRIIbI232T SNP mRNA的方法包括使用至少一种引物通过逆转录从所述样品制备cDNA;使用FcγRIIb I232T SNP多核苷酸作为正义和反义引物扩增如此制备的cDNA以扩增其中的FcγRIIb I232T SNP cDNA;并且检测所述扩增的FcγRIIb I232T SNP cDNA的存在。此外,这些方法可包括一个或多个使得可以测定生物样品中FcγRIIb I232T SNP mRNA水平的步骤(如,通过同时检验“管家(housekeeping)”基因如肌动蛋白家族成员的对比性对照mRNA序列水平)。任选地,可测定所述扩增FcγRIIbI232T SNP cDNA的序列。
在一个特定的实施方案中,可使用TAQMANTM 5′-等位基因鉴别分析、基于限制性片段长度多态性PCR的分析或PYROSEQUENCERTM设备通过RT-PCR技术对所述IL-4R I50V或FcγRIIb I232T多态性进行基因分型。此外,可使用美国专利第7,175,985号中阐明的检测基因变异或多态性的方法,所述专利以引用的方式并入。在这一方法中,利用处于靶核酸序列的特定区域上的杂交的3′末端(其通过互补链合成而合成)合成了核酸,所述靶核酸序列以与下一轮互补链合成的起点相同的链的核苷酸序列存在。
用于PCR的探针可使用可检测标记物进行标记,诸如,例如放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。可采用这些探针和引物检测在样品中SNP或SE多核苷酸的存在并且用作检测表达SE或SNP蛋白质的细胞的工具。技术人员应了解,可根据本文提供的序列制备大量不同的引物和探针并将其有效地用于扩增、克隆和/或检验SNP或SE mRNA的存在和/或水平。
也可对本发明的任意遗传标志物或其部分进行测序以确定样品中所述SNP或SE存在与否。在本发明的方法中可使用用于对HLA-DRB1 SE等位基因、IL-4R I50和/或V50等位基因以及/或者FcγRIIbI232和/或T232等位基因的一条或两条链进行测序的任意众所周知的方法,诸如描述于,例如美国专利第5,075,216号、Engelke等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85,544-548以及Wong等(1987)Nature 330,384-386;Maxim与Gilbert(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74:560;或Sanger(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74:5463中的方法。此外,可使用多种自动测序程序中的任意一种。参见,例如Naeve,C.W.等(1995)Biotechniques 19:448,其包括通过质谱法进行的测序(参见,例如PCT国际公开号第WO 94/16101号;Cohen等(1996)Adv.Chromatogr.36:127-162;以及Griffin等(1993)Appl.Biochem.Biotechnol.38:147-159)。在一个实施方案中,对来自受试者样品的HLA-DRB1 SE等位基因进行直接测序以确定所述受试者是否具有所述HLA-DRB1 SE等位基因的至少一个拷贝。
如上所述,对HLA-DRB1 SE等位基因、IL-4R I50等位基因和/或IL-4R V50等位基因以及/或者FcγRIIb I232或T232等位基因的存在与否的测定可包括,例如限制性片段长度多态性分析。限制性片段长度多态性分析(RFLPS)是基于限制性酶位点的变化。此外,序列特异性核酶的使用(参见,例如美国专利第5,498,531号)可被用于对特异性核酶切割位点的存在进行评分。
用于测定HLA-DRB1 SE等位基因、IL-4R I50等位基因V50等位基因以及/或者FcγRIIb I232等位基因或T232等位基因的存在与否的另一技术涉及使用根据例如Wallace等(1981)Nucl.Acids Res.9,879-894中的描述的互补的、标记的寡核苷酸探针杂交正在进行分析的DNA片段(靶DNA)。由于包含甚至单一碱基对错配的DNA双链体也表现出高的热不稳定性,因此可将差异熔融温度用于区分完全与探针互补的靶DNA和仅有单核苷酸差异的靶DNA。根据例如美国专利第4,683,194号中的描述,已对这一方法进行调整以用于检测特定限制性位点的存在与否。所述方法涉及使用跨越了限制性位点的经末端标记的寡核苷酸探针,所述探针杂交于靶DNA。随后将杂交的双链体DNA与适用于该位点的限制性酶一起孵育。通过使用所述限制性核酸内切酶消化所述探针和靶之间的双链体对,切割重新形成的限制性位点。如果检测到变短的探针分子,则所述特定限制性位点存在于所述靶DNA中。
用于测定HLA-DRB1 SE等位基因、IL-4R I50和/或V50等位基因以及/或者FcγRIIb I232等位基因和/或T232等位基因的存在与否的其它方法包括其中将针对切割剂的保护用于检测RNA/RNA或RNA/DNA异源双链体中错配碱基的方法(根据例如Myers等(1985)Science 230:1242中的描述)。通常情况下,“错配切割”的现有技术由提供异源双链而开始,所述异源双链通过将包含多态性序列的(经标记)RNA或DNA与获自样品的潜在多态性的RNA或DNA进行杂交而形成。使用切割双链体的单链区域(诸如由于所述对照和样品链之间的碱基对错配而存在的单链区域)的试剂处理所述双链化的双链体。例如,可使用RNA酶处理RNA/DNA双链体,并且可使用S1核酸酶处理DNA/DNA杂合体从而对错配区域进行酶消化。在其它实施方案中,可使用羟胺或四氧化锇并且使用哌啶处理DNA/DNA或RNA/DNA双链体以消化错配区域。在对错配区域进行消化之后,随后根据大小在变性聚丙烯酰胺凝胶上分离所产生的物质。参见,例如Cotton等(1988)Proc.Natl Acad SciUSA 85:4397;Saleeba等(1992)Methods Enzymol.217:286-295。在优选的实施方案中,可对对照DNA或RNA进行标记以用于检测。
在另一个实施方案中,可将电泳迁移率的改变用于确定HLA-DRB1 SE等位基因、IL-4R I50和/或V50等位基因以及/或者FcγRIIbI232和/或T232等位基因的存在与否。例如,可将单链构象多态性(SSCP)用于检测各种HLA-DRB1 SE、IL-4R I50V和/或FcγRIIb I232T等位基因间的电泳迁移率的差异(根据例如Orita等(1989)Proc Natl.Acad.Sci.USA:86:276;Cotton(1993)Mutat Res 285:125-144;以及Hayashi(1992)Genet Anal Tech Appl 9:73-79中的描述)。可对样品和对照核酸中的单链DNA片段进行变性并且使其复性。单链核酸的二级结构根据序列而变化,所得的电泳迁移率的变化使得能够甚至对单个碱基变化进行检测。可使用经标记的探针标记或检测所述DNA片段。可通过使用RNA(而非DNA)增强所述分析的灵敏度,其中二级结构对于序列的变化更为敏感。在一个优选的实施方案中,所述方法使用异源双链分析以根据电泳迁移率的变化而分离双链的异源双链分子(Keen等(1991)Trends Genet.7:5)。
在又一个实施方案中,使用变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析核酸分子在包含变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中的移动(根据例如Myers等(1985)Nature 313:495中的描述)。当DGGE作为分析方法使用时,可修饰DNA以确保其并不完全变性,例如通过PCR而添加高融点GC富集DNA的约40bp的GC钳(GC clamp)。在进一步的实施方案中,使用温度梯度取代变性梯度以鉴定对照和样品DNA的迁移率差异(Rosenbaum与Reissner(1987)Biophys Chem 265:12753)。
用于确定HLA-DRB1SE等位基因、IL-4R I50V SNP和/或FcγRIIbI232T SNP存在与否的其它技术的实例包括但不限于,选择性寡核苷酸杂交、选择性扩增或选择性引物延伸。例如,可制备其中所述多态性区域被置于中心的寡核苷酸引物,并且随后在允许仅发现完全匹配的杂交的条件下将其与靶DNA进行杂交(Saiki等(1986)Nature 324:163;Saiki等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6230)。当这些等位基因特异性寡核苷酸结合于杂交膜并且与标记的靶DNA杂交时,所述寡核苷酸与PCR扩增的靶DNA或大量的不同多态性杂交。
用于确定HLA-DRB1 SE等位基因、IL-4R I50V SNP和/或FcγRIIbI232T SNP存在与否的另一方法是引物延伸方法,其包括将标记的寡核苷酸引物与模板RNA或DNA杂交以及随后使用DNA聚合酶和三磷酸脱氧核苷将所述引物延伸至所述模板的5′末端。随后通过根据大小进行分级,例如通过变性聚丙烯酰胺凝胶的电泳,而完成对所述标记引物延伸产物的解析。这一方法通常被用于比较同源DNA片段并且用于检测由于核苷酸插入或缺失而导致的差异。由于大小是用于表征引物延伸产物的唯一标准,因此核苷酸置换而导致的差异未被检测。
此外,用于基因分型的任意公知方法,诸如SNP(如DNA测序、杂交技术、基于PCR的分析、基于荧光染料和淬灭剂的PCR分析(Taqman PCR检测系统)、基于RFLP的技术、单链构象多态性(SSCP)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、化学错配切割(CMC)、基于异源双链分析的系统、基于质谱法的技术、侵入性切割分析(invasive cleavage assay)、多态性比率测序(PRC)、微阵列、滚环延伸分析(a rolling circle extension assay)、基于HPLC的技术、基于DHPLC的技术、寡核苷酸延伸分析(OLA)、基于延伸的分析(ARMS,(扩增阻碍突变系统)、ALEX(扩增阻碍突变线性延伸(Amplification Refractory Mutation Linear Extension))、SBCE(单碱基链延伸)、分子信标分析(molecular beacon assay)、侵入者技术(invader)(Third wave technologies)、连接酶链反应分析、基于5′-核酸酶分析的技术、杂交毛细管阵列电泳(CAE)、焦磷酸测序、蛋白质截短分析(PTT)、免疫分析、单倍型分析和固相杂交(斑点杂交、反相斑点杂交、芯片),在本领域中是众所周知的并且描述于,例如Siitari,Nucleicacid diagnostics market,Technology Review 125/2002,ISDN 1239-758;Caplin(1999)Biochemica 1:5-8;Neville,(2002)BioTechniques 32:34-43;Underhill(197)Genome Res 7:996-1005;Oefner(2000)J Chromatogr BBiomed Sci Appl 739:345-55以及专利公开号第U.S.20010049586号中,并且可用于本发明的方法中。
用于测定HLA-DRB1 SE等位基因、IL-4R I50V SNP和/或FcγRIIbI232T SNP存在与否的又一适当方法是对来自受试者的生物样品的血清分型,其在ELISA分析中使用了,例如针对HLA-DRB1SE等位基因、IL-4R I50V SNP和/或FcγRIIb I232T SNP的可商购获得的抗体。
在特定的情况下,可使用检测试剂针对HLA-DRB1 SE等位基因、IL-4R I50和/或V50等位基因以及/或者FcγRIIb I232和/或T232等位基因在蛋白质水平的表达而分析样品,所述检测试剂检测由标志物的mRNA编码的蛋白质产物。例如,如果与待检测的HLA-DRB1 SE等位基因、IL-4R I50等位基因或IL-4RV50等位基因以及/或者FcγRIIb I232或T232等位基因的蛋白质产物而非其它蛋白质特异性地结合的抗体试剂可得,那么可使用本领域中已知的基于抗体的标准技术如FACS分析、ELISA等将这一抗体试剂用于在来自受试者的样品或源自该样品的制备物中检测所述HLA-DRB1 SE等位基因、IL-4R I50等位基因或V50等位基因以及/或者FcγRIIb I232或T232等位基因的表达。在一个实施方案中,所述抗体可区分所述I50 IL-4R等位基因和所述V50 IL-4R等位基因的两种蛋白质产物。在另一个实施方案中,所述抗体可区分所述FcγRIIb I232等位基因和所述FcγRIIb T232等位基因的两种蛋白质产物。在一个实施方案中,用于所述检测方法的抗体可识别HLA-DRB1蛋白的氨基酸70-74,并且在进一步的实施方案中,其对于所述SE是特异性的。
获自患有或易患类风湿性关节炎的受试者的任意样品可用于测定HLA-DRB1 SE等位基因、IL-4R I50V SNP和/或FcγRIIb I232T SNP的存在与否。例如,所述样品可以是获自所述受试者的任意液体或其亚组分,例如血液、呕吐物、关节液、唾液、淋巴液、囊液、尿液、由支气管灌洗所采集的液体、由腹腔冲洗所采集的液体或妇科液体。在一般情况下,所述液体可以是获自所述受试者的血样或其组分。所述样品还可以是获自所述受试者的任意组织或其片段或其亚组分,例如骨骼、结缔组织、软骨、肺、肝、肾、肌肉组织、心脏、胰脏以及皮肤。
用于从受试者中获取样品的技术或方法在本领域中是众所周知的并且包括,例如通过口腔拭子或漱口而获取样品;采血;或获取组织活检样品。可使用本领域中众所周知的技术以及下文实施例部分中描述的技术实现分离液体或组织样品的亚组分(如细胞或RNA或DNA)。
在另一个方面,本发明涉及用于预测或评估患有或易患类风湿性关节炎的受试者对TNFα抑制剂的反应性的方法,所述方法通过使源自受试者的生物样品接触能够检测所述样品中HLA-DRB1 SE等位基因、IL-4R I50V SNP和/或FcγRIIb I232T SNP的存在与否的试剂而进行,其中所述HLA-DRB1 SE等位基因和/或所述IL-4R I50等位基因和/或FcγRIIb-CC等位基因(T232T)在所述样品中存在是所述受试者对TNFα抑制剂具有反应性的指示,由此预测或评估受试者对于所述TNFα抑制剂的反应性。通过使源自所述受试者的生物样品接触能够检测所述样品中HLA-DRB1 SE等位基因、IL-4R I50V SNP和/或FcγRIIb I232TSNP的存在与否的试剂,所述样品有必要以某些方式从其原初形式转化或改变从而实现对所述样品中HLA-DRB1 SE等位基因、IL-4R I50VSNP和/或FcγRIIb I232T SNP的存在与否的检测。用于接触所述生物样品的试剂可以是,例如适用于对所述样品中存在的所述HLA-DRB1 SE等位基因、IL-4R I50或V50等位基因和/或FcγRIIb I232或T232等位基因(例如,HLA-DRB1 SE等位基因(如,对应于氨基酸70-74的核酸序列)、IL-4R I50或V50等位基因(即,区别所述SNP的区域)和/或FcγRIIb I232或T232等位基因内的独特区域)进行扩增和/或测序和/或标记的PCR/测序引物、核苷酸和酶,能够检测所述样品中HLA-DRB1SE等位基因、区分IL-4R I50V SNP和/或区分FcγRIIb I232T SNP的抗体、限制性酶和/或微阵列。
可通过使用由适当处理器执行的软件程序进行生物标志物表达水平或存在的测量。适当的软件和处理器在本领域中是众所周知的并且可商购获得。所述程序可体现于存储在实体介质上,诸如CD-ROM、软盘、硬盘、DVD或结合于所述处理器的内存上的软件中,但是本领域的普通技术人员应当容易地了解所述完整的程序或其部分可替代地由除处理器之外的设备执行,和/或以众所周知的方式体现于固件和/或专用的硬件中。
在对本文所确定的基因或其表达产物的表达水平或存在进行测量并且对受试者对于TNFα抑制剂治疗是否可能有反应性进行确定之后,可记录所述分析结果、发现、诊断、预测和/或治疗建议并与,例如技术人员、医师和/或患者进行交流。在特定的实施方案中,使用计算机与相关方面交流这些信息,诸如患者和/或参与的医师。在一些实施方案中,进行所述分析或在不同于对所述结果或诊断进行交流的国家或地区的国家或地区中分析所述分析试验的结果。
在一个优选的实施方案中,基于本文的一种或多种遗传标志物的测试受试者中遗传标志物的表达水平或存在而作出的诊断、预测和/或治疗建议在完成所述分析并且做出所述诊断和/或预测后被尽可能快地与所述受试者交流。可由所述受试者的治疗医师就所述结果和/或相关信息与所述受试者交流。或者,可通过任意交流方式包括书面、电子形式的交流诸如电子邮件或电话直接与测试受试者交流所述结果。可通过使用计算机协助交流,诸如在电子邮件通讯的情况下。在特定的实施方案中,可使用电信领域中的技术人员熟悉的计算机硬件和软件的组合自动地生成和传达包含诊断测试结果和/或由所述测试所作出的结论和/或基于所述测试的治疗建议的交流。美国专利第6,283,761号中描述了面向医疗保健的交流系统的一个实例;但是,本发明并不限于使用这一特定交流系统的方法。在本发明的方法的特定实施方案中,可在不同的(例如国外)地区实施全部或某些方法步骤,其包括样品分析、疾病诊断和对分析结果和诊断的交流。
使用TNFα抑制剂的治疗方案的选择和使用
如果观测到HLA-DRB1 SE等位基因、IL-4R I50和/或V50等位基因以及/或者FcγRIIb I232和/或T232等位基因在患有或易患类风湿性关节炎(RA)的受试者中的存在与否影响所述受试者对于使用TNFα抑制剂(如,人TNFα抗体或其抗原结合部分,诸如但不限于阿达木单抗)进行治疗的反应性,则可根据HLA-DRB1 SE等位基因、IL-4R I50和/或V50等位基因以及/或者FcγRIIb I232和/或T232等位基因在所述受试者中的存在与否为所述受试者选择适当的治疗方案。因此,在一个实施方案中,本发明提供了用于选择TNFα抑制剂的治疗方案的方法,所述方法基于HLA-DRB1 SE等位基因、IL-4R I50和/或V50等位基因以及/或者FcγRIIb I232和/或T232等位基因在所述受试者中的存在与否。在另一个方面,所述方法进一步包括根据所述治疗方案对所述受试者施用TNFα抑制剂,从而在所述受试者中治疗了类风湿性关节炎。在另一个方面,所述方法还进一步包括根据所述治疗方案对受试者施用MTX和TNFα抑制剂两者,从而在所述受试者中治疗类风湿性关节炎。
在一个方面,本发明提供了用于在患有或易患类风湿性关节炎的受试者中因医疗目的而选择使用TNFα抑制剂(如,人TNFα抗体或其抗原结合部分,诸如但不限于阿达木单抗)的治疗方案的方法。所述方法包括在所述受试者中测定HLA-DRB1 SE等位基因、IL-4R I50和/或V50等位基因以及/或者FcγRIIb I232和/或T232等位基因的存在与否(或拷贝数);以及基于HLA-DRB1 SE等位基因、IL-4R I50和/或V50等位基因以及/或者FcγRIIb I232和/或T232等位基因在所述受试者中的存在与否(或拷贝数)而选择使用TNFα抑制剂的治疗方案。
在一个方面,本发明提供了预测患有类风湿性关节炎(RA)的受试者对TNFα抑制剂(如,人TNFα抗体或其抗原结合部分,诸如但不限于阿达木单抗)治疗的反应性的方法,所述方法通过确定所述受试者是否具有HLA-DRB1 SE等位基因而进行。在一个方面,从所述受试者获取样品并且针对HLA-DRB1 SE等位基因的存在(或不存在/或拷贝数)对其进行评估。在另一个方面,本发明提供了通过施用TNFα抑制剂治疗患有RA的受试者的方法,前提是在来自所述受试者的样品中存在HLA-DRB1共同表位(HLA-DRB1 SE)等位基因的至少一个拷贝。在一个实施方案中,针对HLA-DRB1共同表位(HLA-DRB1 SE)等位基因的至少一个拷贝的存在而测试来自所述受试者的样品。根据下文实施例中的描述,所述HLA-DRB1 SE等位基因的至少一个拷贝的存在表示所述受试者对于TNFα抑制剂治疗具有反应性。
在一个方面,本发明提供了预测患有类风湿性关节炎(RA)的受试者对使用TNFα抑制剂(如,人TNFα抗体或其抗原结合部分,诸如但不限于阿达木单抗)进行治疗的反应性的方法,所述方法通过测定所述受试者是否具有FcγRIIb T232等位基因(或在替代的情况下测定所述受试者是否具有FcγRIIb I232等位基因)而进行。在一个方面,从所述受试者获取样品并且针对FcγRIIb T232等位基因的存在(或不存在/或拷贝数)(或在替代的情况下针对所述受试者是否具有FcγRIIb I232等位基因)进行评估。在另一个方面,本发明提供了通过施用TNFα抑制剂治疗患有RA的受试者的方法,前提是在来自所述受试者的样品中存在两个拷贝的FcγRIIb T232等位基因。根据下文实施例中的描述,所述FcγRIIb-CC等位基因的存在表示所述受试者对于使用TNFα抑制剂进行治疗具有反应性。
在本发明的一个实施方案中,结合FcγRIIb I232和/或FcγRIIb T232等位基因的存在对HLA-DRB1 SE等位基因的存在(或不存在/或拷贝数)进行测试以确定患有RA的受试者对于使用TNFα抑制剂(如,人TNFα抗体或其抗原结合部分,诸如但不限于阿达木单抗)进行治疗是否具有反应性。在本发明的一个实施方案中,结合IL-4R I50和/或IL-4R V50等位基因的存在对HLA-DRB1SE等位基因的存在进行测试以确定患有RA的受试者对于使用TNFα抑制剂进行治疗是否具有反应性。在本发明的一个实施方案中,结合IL-4R I50和/或IL-4R V50等位基因的存在以及FcγRIIb I232和/或FcγRIIb T232等位基因的存在对HLA-DRB1 SE等位基因的存在进行测试以确定患有RA的受试者对于使用TNFα抑制剂进行治疗是否具有反应性。在一个实施方案中,结合IL-4R I50和/或IL-4R V50等位基因的存在对FcγRIIb I232和/或FcγRIIb T232等位基因的存在进行测试以确定患有RA的受试者对于使用TNFα抑制剂进行治疗是否具有反应性。
在一个实施方案中,可将本文所述的遗传标志物用于选择对于使用TNFα抑制剂(如,人TNFα抗体或其抗原结合部分,诸如但不限于阿达木单抗)进行治疗具有反应性的患有RA的患者的方法中。
在一个实施方案中,在确定等位基因的存在时所述方法可包括测定所述等位基因的拷贝数。或者,所述分析方法可仅确定所述遗传标志物的存在与否。
在另一个实施方案中,本发明还提供了使用TNFα抑制剂治疗患有类风湿性关节炎的受试者的方法。所述方法包括确定所述受试者中HLA-DRB1 SE等位基因、IL-4R I50和/或V50等位基因以及/或者FcγRIIb I232和/或T232等位基因的存在与否;基于所述受试者中HLA-DRB1 SE等位基因、IL-4R I50和/或V50等位基因以及/或者FcγRIIb I232和/或T232等位基因的存在与否而选择使用TNFα抑制剂的治疗方案,以及根据所述治疗方案施用所述TNFα抑制剂,从而针对所述类风湿性关节炎治疗所述受试者。
所选的治疗方案一般包括下列参数中的至少一种并且可包含多种或全部下列参数:选择用于施用的药剂类型、剂量、制剂、施用途径和/或施用频率。
根据下文实施例中的描述,包括,例如在具有至少一个拷贝的所述HLA-DRB1 SE等位基因或所述FcγRIIb-CC等位基因的受试者中,使用阿达木单抗和甲氨蝶呤的联合疗法关联于与甲氨蝶呤单一疗法相比有显著改善的临床反应。此外,对于在IL-4R I50等位基因(AA或AG)来说是纯合或杂合的患者观察到了对阿达木单抗和甲氨蝶呤的显著增强的临床反应,但其未见于具有两个IL-4R V50等位基因(GG)的患者中。FcγRIIb-CC与获得临床反应显著地关联。此外,综合来说,SE拷贝数的效应在IL-4R-AA和FcγRIIb-TT野生型背景下被消除,但当存在至少一个拷贝的所述IL-4R(AG或GG)或FcγRIIb(TC或CC)遗传变异体时所述效应是明显的。
本文所述的治疗方法可包括对受试者施用TNFα抑制剂以实现治疗目的,例如,获得特定的ACR反应如ACR20、ACR50、ACR70和/或改善DAS28评分,包括,例如,DAS28低疾病活动性(DAS28 LDA)或DAS28缓解。
DAS28(疾病活性动评分)在本领域中已知为在患病受试者中对类风湿性关节炎活动性的公认度量。在计算中包括下列参数:触痛关节数(Number of joints tender to the touch)(TEN);肿胀关节数(SW);红细胞沉降率(ESR);疾病活动性的患者评估(VAS;mm)(参见,Van derHeijde等,Ann Rheum Dis 1990;49:916-20)。在修正的DAS(DAS28)中评估了28个关节(参见Prevoo MLL等,Arthritis Rheum 1995;38:44-8)。
美国风湿病学会对类风湿关节炎改善(ACR20、ACR50和ACR70反应)的基本标准被开发用于向类风湿性关节炎(RA)治疗提供疗效量度。ACR20、ACR50和ACR70分别需要超过20%、50%和70%的改善。反应性标准详述于Felson DT,Anderson JJ,Boers M,Bombardier C,Furst D,Goldsmith C等,American College of Rheumatology preliminarydefinition of improvement in rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum1995;38:727-35中,其以引用的方式并入本文。通常,在筛选时、基线处和频繁地在治疗期间对患者进行临床检查。在12周时根据美国风湿病学会对类风湿关节炎改善的基本标准(ACR20)测量了体征和症状的初级效力。另外的主要终点(primary endpoint)包括在6至12个月期间评估放射性改变以评估结构损伤的变化。
在一个实施方案中,根据双周给药方案使用TNFα抑制剂治疗所述受试者。双周给药方案进一步描述于美国申请第10/163657号中(US20030235585),其以引用的方式并入本文。
在本发明的一个方面,以固定剂量(与mg/kg剂量成对比)对患有RA的受试者施用所述TNFα抑制剂。在一个实施方案中,所述固定剂量是约20-80mg、约20-60mg、约30-50mg或约40mg。在进一步的实施方案中,所述固定剂量是约50mg。
在一个实施方案中,每两周对所述受试者皮下施用40mg的人TNFα抗体或其抗原结合部分以进行RA治疗。
在本发明的另一个方面中,根据每月给药方案使用TNFα抑制剂治疗所述受试者。在一个实施方案中,每月一次对所述受试者皮下施用50mg的人TNFα抗体或其抗原结合部分以进行RA治疗。
在进一步的实施方案中,将所述TNFα抑制剂与甲氨蝶呤结合施用于所述受试者以用于RA治疗。
本发明的TNFα抑制剂
特别优选的TNFα抑制剂是生物试剂,其已被FDA批准在人体中用于治疗类风湿性关节炎,或正处于针对类风湿性关节炎治疗的临床测试中。
在一个实施方案中,本发明特征在于预测或测定TNFα抑制剂对类风湿性关节炎治疗的疗效的用途和组合物,其中所述TNFα抗体是分离的人抗体或其抗原结合部分,其以高亲和性和低解离速率结合人TNFα并且还具有高中和能力。优选地,用于本发明的人抗体是重组的中和人抗hTNFα抗体。本发明的最为优选的重组的中和抗体在本文中称作D2E7,亦称为HUMIRA或阿达木单抗(所述D2E7 VL区的氨基酸序列在SEQ ID NO:1中示出;所述D2E7VH区的氨基酸序列在SEQ IDNO:2中示出;VL和VH结构域的核酸序列分别描述于SEQ ID No:36和37中)。D2E7(阿达木单抗/HUMIRA)的特性已被描述于Salfeld等的美国专利第6,090,382号、第6,258,562号和第6,509,015号中,其各自以引用的方式并入本文。
在一个实施方案中,所述TNFα抑制剂是作为阿达木单抗的生物仿制药物的全长人TNFα抗体。在一个实施方案中,所述TNFα抑制剂高度类似于阿达木单抗,并且可能,例如在临床非活性成分中包含细微差别。在一个实施方案中,所述TNFα抑制剂与阿达木单抗可互换并且在任何给定的患者中例如能够产生与阿达木单抗相同的临床结果。
在一个实施方案中,本发明的方法包括测定D2E7抗体和抗体部分、D2E7相关抗体和抗体部分或具有与D2E7等同性能(诸如以低解离动力学与hTNFα高亲和性结合和高中和能力)的其它人抗体和抗体部分治疗类风湿性关节炎的疗效。在一个实施方案中,本发明提供了使用分离的人抗体或其抗原结合部分进行的治疗,根据表面等离子体共振测定,所述分离的人抗体或其抗原结合部分以1×10-8M或更低的Kd以及1×10-3s-1或更低的速率常数koff与人TNFα解离,并且其在标准的体外L929分析中以1×10-7M或更低的IC50中和人TNFα细胞毒性。更为优选地,所述分离的人抗体或其抗原结合部分以5×10-4s-1或更低的koff,或更为优选地以1×10-4s-1或更低的koff与人TNFα解离。更为优选地,所述分离的人抗体或其抗原结合部分在标准的体外L929分析中以1×10-8M或更低的IC50中和人TNFα细胞毒性,或更为优选地以1×10-9M或更低的IC50进行中和,并且愈加优选地以1×10-10M或更低的IC50进行中和。在优选的实施方案中,所述抗体是分离的人重组抗体或其抗原结合部分。
本领域中众所周知抗体的重链和轻链CDR3结构域在抗体对抗原的结合特异性/亲和性中起着重要作用。因此,在另一个方面,本发明涉及通过施用人抗体而治疗克罗恩病,所述人抗体对于与hTNFα的结合具有缓慢的解离动力学和具有在结构上与D2E7的轻链和重链CDR3结构域相同或相关的轻链和重链CDR3结构域。D2E7 VL CDR3的位置9可由Ala或Thr占据而不会显著影响Koff。因此,D2E7 VL CDR3的共同基序包含氨基酸序列:Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A)(SEQ ID NO:3)。另外,D2E7 VH CDR3的位置12可由Tyr或Asn占据而不会显著影响Koff。因此,D2E7VH CDR3的共同基序包含氨基酸序列:V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/N)(SEQ ID NO:4)。此外,如美国专利第6,090,382号的实施例2中所阐述,D2E7重链及轻链的CDR3域适合以单一丙氨酸残基(在VL CDR3内的位置1、4、5、7或8或在VH CDR3内的位置2、3、4、5、6、8、9、10或11)置换而不会显著影响Koff。另外,熟练技术人员应当理解,如果D2E7 VL及VH CDR3域适合经丙氨酸置换,则CDR3域内其它氨基酸的置换可以是可能的,同时仍保持抗体的低解离速率常数,尤其为通过保守氨基酸置换。优选地,在D2E7VL和/或VH CDR3域内进行不超过1至5个保守氨基酸置换。更优选地,在D2E7 VL和/或VH CDR3域内进行不超过1至3个保守氨基酸置换。另外,保守氨基酸置换不应在对结合hTNFα而言关键的氨基酸位置上进行。D2E7 VL CDR3的位置2和5和D2E7 VH CDR3的位置1和7看来对于与hTNFα的相互作用似乎是关键的,并且因此优选地不在这些位置上进行保守氨基酸置换(尽管如上所述在D2E7VL CDR3的位置5上进行丙氨酸置换是可接受的)(参见美国专利第6,090,382号)。
因此,在另一个实施方案中,所述抗体或其抗原结合部分优选地包含以下特征:
a)以如通过表面等离振子共振测定的1×10-3s-1或更低的Koff速率常数从人类TNFα上解离;
b)具有一个轻链CDR3域,其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或通过位置1、4、5、7或8处的单一丙氨酸置换或通过位置1、3、4、6、7、8和/或9处的1至5个保守氨基酸置换而由SEQ ID NO:3修饰的氨基酸序列;
c)具有一个重链CDR3域,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或通过位置2、3、4、5、6、8、9、10或11处的单一丙氨酸置换或通过位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12处的1至5个保守氨基酸置换而由SEQ ID NO:4修饰的氨基酸序列。
更优选地,该抗体或其抗原结合部分以5×10-4s-1或更低的Koff从人类TNFα上解离。甚至更优选地,该抗体或其抗原结合部分以1×10-4s-1或更低的Koff从人类TNFα上解离。
在又一个实施方案中,所述抗体或其抗原结合部分优选地包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR),所述轻链可变区具有包含SEQID NO:3的氨基酸序列或由在第1、4、5、7或8位上的单丙氨酸置换从SEQ ID NO:3修饰而成的氨基酸序列的CDR3结构域,所述重链可变区具有包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由在第2、3、4、5、6、8、9、10或11位上的单丙氨酸置换从SEQ ID NO:4修饰而成的氨基酸序列的CDR3结构域。在一个实施方案中,所述LCVR进一步具有包含SEQ ID NO:5(即,所述D2E7VL CDR2)的氨基酸序列的CDR2结构域并且所述HCVR进一步具有包含SEQ ID NO:6(即,所述D2E7VH CDR2)的氨基酸序列的CDR2结构域。在一个实施方案中,所述LCVR进一步具有包含SEQ ID NO:7(即,所述D2E7 VL CDR1)的氨基酸序列的CDR1结构域并且所述HCVR进一步具有包含SEQ IDNO:8(即,所述D2E7VH CDR1)的氨基酸序列的CDR1结构域。VL的构架区优选来自VκI人类种系家族,更优选来自A20人类种系Vk基因,且最优选来自美国专利第6,090,382号的图1A及1B中所示的D2E7 VL构架序列。VH的构架区优选来自VH3人类种系家族,更优选来自DP-31人类种系VH基因,且最优选来自美国专利第6,090,382号的图2A及2B中所示的D2E7VH构架序列。
因此,在另一个实施方案中,所述抗体或其抗原结合部分优选地含有包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)(即D2E7VL)及包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)(即D2E7VH)。在某些实施方案中,该抗体包含重链恒定区,例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。优选地,该重链恒定区为IgG1重链恒定区或IgG4重链恒定区。此外,该抗体可包含轻链恒定区,κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。优选地,该抗体包含κ轻链恒定区。或者,该抗体部分可为(例如)Fab片段或单链Fv片段。
在其它的实施方案中,本发明包含分离的人抗体或其抗原结合部分的用途,其包含D2E7相关VL和VH CDR3结构域。例如抗体或其抗原结合部分具有轻链可变区(LCVR),该LCVR具有包含选自SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR3域;或具有重链可变区(HCVR),该HCVR具有包含选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR3域。
还可使用嵌合和人源化鼠抗hTNFα抗体实施本发明的方法,对该抗体已经进行了针对类风湿性关节炎治疗的临床测试(参见,例如Elliott,M.J.等,(1994)Lancet 344:1125-1127;Elliot,M.J.等,(1994)Lancet344:1105-1110;Rankin,E.C.等,(1995)Br.J.Rheumatol.34:334-342)。
可对本发明的方法和组合物中使用的TNFα抗体进行修饰以改善对于类风湿性关节炎的治疗。在一些实施方案中,该TNFα抗体或其抗原结合片段被化学修饰以提供所需的效应。例如,本发明的抗体及抗体片段的聚乙二醇化作用可由本领域中已知的任意聚乙二醇化反应进行,如(例如)以下参考文献中所述:Focus on Growth Factors 3:4-10(1992);EP 0 154 316;及EP 0 401 384(均全文引入本文作为参考)。优选地,使用反应性聚乙二醇分子(或类似的反应性水溶性聚合物)通过酰化反应或烷基化反应进行聚乙二醇化作用。用于本发明的抗体及抗体片段的聚乙二醇化作用的优选的水溶性聚合物为聚乙二醇(PEG)。如本文中使用的″聚乙二醇″包括已经用来衍生化其它蛋白质的任意形式的PEG,例如单(Cl-ClO)烷氧基聚乙二醇或芳氧基聚乙二醇。
制备本发明的聚乙二醇化抗体及抗体片段的方法通常应包括以下步骤:(a)在由此使抗体或抗体片段连接于一个或多个PEG基团的条件下使抗体或抗体片段与例如PEG的反应性酯或醛衍生物的聚乙二醇反应,及(b)获得反应产物。本领域技术人员应当清楚地基于已知参数及所需结果选择最佳反应条件或酰化反应。
通常可通过施用本文所述的TNFα抗体或抗体片段而将聚乙二醇化的抗体或抗体片段用于治疗类风湿性关节炎。通常与未聚乙二醇化抗体及抗体片段相比,聚乙二醇化抗体及抗体片段的半衰期延长。聚乙二醇化抗体及抗体片段可单独使用、一起使用或与其它药物组合物联合使用。
在本发明的另一实施方案中,TNFα抗体或其片段可以被改变,其中该抗体的恒定区被修饰以相对于未修饰的抗体减少至少一种恒定区调节的生物效应功能。为了修饰本发明的抗体从而使其显示出对Fc受体降低的结合,可使抗体的免疫球蛋白恒定区片段在对Fc受体(FcR)相互作用所必需的特定区突变(参见,例如Canfield,S.M与S.L.Morrison(1991)J.Exp.Med.173:1483-1491;以及Lund,J.等(1991)J.of Immunol.147:2657-2662)。降低抗体的FcR结合力也可减少依赖于FcR相互作用的其它效应功能,例如调理作用及吞噬作用及抗原依赖性细胞毒性。
本发明的方法中使用的抗体或抗体片段可以衍生化或连接于另一功能分子(例如另一个肽或蛋白质)。因此,本发明的抗体及抗体部分包括本文中所述的人类抗hTNFα抗体的衍生化及其它修饰形式,包括免疫粘附分子。例如,本发明的抗体或抗体部分可(通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其它方式)功能性连接于一种或多种其它分子实体上,例如另一抗体(例如双特异性抗体或双抗体)、可检测剂、细胞毒性剂、药剂和/或可调节抗体或抗体部分与另一分子(例如链霉抗生物素核心区或聚组氨酸标记)结合的蛋白质或肽。
一种类型的衍生化抗体通过使两种或多种(相同种类或不同种类的)抗体交联而产生(例如产生双特异性抗体)。适当的交联剂包括具有由适当间隔基分开的两种不同反应性基团的异双功能交联剂(例如间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同双功能交联剂(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)。这些交联剂购自Pierce Chemical Company,Rockford,IL。
可用来使本发明的抗体或抗体部分衍生化的有用的可检测试剂包括荧光化合物。示例性荧光可检测试剂包括荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白等。也可以诸如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化物酶等可检测酶使抗体衍生化。当用可检测酶使抗体衍生化时,通过添加该酶用其来生成可检测反应产物的其他试剂进行检测。例如,当存在可检测剂辣根过氧化物酶时,添加过氧化氢及二氨基联苯胺导致生成可检测的有色反应产物。也可采用生物素使抗体衍生化,并通过间接测量抗生物素蛋白或链霉抗生物素的结合进行检测。
可通过在宿主细胞中对免疫球蛋白轻链和重链基因的重组表达而制备用于本发明的方法和组合物的抗体或抗体部分。为重组表达抗体,用一种或多种携带编码抗体的免疫球蛋白轻链及重链的DNA片段的重组表达载体转染宿主细胞,使得轻链及重链在宿主细胞内表达并且优选地分泌至培养宿主细胞的培养基中,抗体可自该培养基回收。标准重组DNA方法用来获得抗体重链及轻链基因,将这些基因引入重组表达载体中,并且将这些载体导入宿主细胞内,诸如Sambrook,Fritsch与Maniatis(编著),Molecular Cloning;A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989),Ausubel,F.M.等(编著)CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates,(1989)以及描述于Boss等的美国专利第4,816,397号中所描述。
为表达阿达木单抗(D2E7)或阿达木单抗(D2E7)相关抗体,首先获得编码轻链及重链可变区的DNA片段。这些DNA可通过使用聚合酶链反应(PCR)扩增及修饰种系轻链及重链可变序列而获得。人类重链及轻链可变区基因的种系DNA序列在本领域中已知(参见,例如“Vbase”人种系序列数据库(human germline sequence database);还参见Kabat,E.A.等,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版号第91-3242号;Tomlinson,I.M.等,(1992)“The Repertoire of Human Germline VHSequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with DifferentHypervariable Loops”J.Mol.Biol.227:776-798;以及Cox,J.P.L.等(1994)“A Directory of Human Germ-line V78 Segments Reveals a Strong Bias intheir Usage”Eur.J.Immunol.24:827-836,各文献内容明确地以引用的方式并入本文)。为获得编码D2E7或与D2E7相关的抗体的重链可变区的DNA片段,通过标准PCR扩增人类种系VH基因的VH3家族成员。最优选地,扩增DP-31VH种系序列。为获得编码D2E7或与D2E7相关的抗体的轻链可变区的DNA片段,通过标准PCR扩增人类种系VL基因的VKI家族成员。最优选地,扩增A20VL种系序列。适用于扩增DP-31种系VH及A20种系VL序列的PCR引物可基于先前引用的文献中所揭示的核苷酸序列使用标准方法进行设计。
一旦获得种系VH及VL片段,则可使这些序列突变以编码本文中所揭示的D2E7或与D2E7相关的氨基酸序列。首先将由种系VH及VL DNA序列编码的氨基酸序列与D2E7或与D2E7相关的VH及VL氨基酸序列比较以鉴定与种系不同的D2E7或与D2E7相关的序列中的氨基酸残基。随后,使用遗传密码测定应进行哪些核苷酸改变,使种系DNA序列的适当核苷酸突变,从而使突变的种系序列编码D2E7或与D2E7相关的氨基酸序列。种系序列的诱变通过例如PCR介导的突变(其中突变的核苷酸引入PCR引物中,使得PCR产物含有该突变)或定点诱变的标准方法进行。
此外应当注意,如果通过PCR扩增所获得的“种系”序列编码在框架区内与实际种系结构的氨基酸差异(即,与所述实际种系序列相比在扩增的序列中的差异,例如由于体细胞突变所导致的差异),那么理想的是将这些氨基酸差异改变回实际种系序列(即,框架残基向所述种系结构的“回复突变”)。
一旦(如上所述通过种系VH和VL基因的扩增及诱变)获得编码D2E7或与D2E7相关的VH和VL片段的DNA片段,则这些DNA片段可通过标准重组DNA技术进一步操作,例如使可变区基因转变为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中,编码VL或VH的DNA片段有效连接于编码另一种蛋白质例如抗体恒定区或柔性连接体的另一种DNA片段。如本发明内容中所使用的术语″有效连接″意思是使两个DNA片段连接,使得由这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在框内。
编码VH区的分离的DNA可通过使编码VH的DNA有效连接于另一编码重链恒定区(CH1、CH2及CH3)的DNA分子而转变为全长重链基因。人类重链恒定区基因的序列在本领域中已知(参见,例如Kabat,E.A.等,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版号第91-3242号),并且包含这些区的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区,但最优选为IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因而言,编码VH的DNA可有效连接于另一仅编码重链CH1恒定区的DNA分子。
编码VL区的分离的DNA可通过使编码VL的DNA有效连接于另一编码轻链恒定区(CL)的DNA分子而转变为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人类轻链恒定区基因的序列在本领域中已知(参见,例如Kabat,E.A.等,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版号第91-3242号),并且包含这些区的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可为κ或λ恒定区,但最优选为κ恒定区。
为产生scFV基因,将编码VH和VL的DNA片段操作性地连接于编码柔性接头(例如,编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3(SEQ ID NO:42))的另一种片段,从而所述VH和VL序列可以作为连续的单链蛋白质而表达,使所述VL和VH区通过所述柔性接头相连接(参见,例如Bird等,(1988)Science 242:423-426;Huston等,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883;McCafferty等,Nature(1990)348:552-554)。
为表达用于本发明的抗体或抗体部分,将如上所述获得的编码部分或全长轻链及重链的DNA插入表达载体内,使得这些基因有效连接于转录及翻译控制序列。在本发明内容中,术语″有效连接″意思是将抗体基因连接至载体内使得载体内的转录及翻译控制序列起调节抗体基因的转录及翻译的预期功能。选择表达载体及表达控制序列以使其可与所使用的表达宿主细胞相容。可将抗体轻链基因及抗体重链基因插入各自载体中,或更通常地将两种基因均插入相同表达载体中。通过标准方法(例如连接抗体基因片段和载体上的互补限制性位点,或者若不存在限制性位点则钝端连接)将抗体基因插入表达载体中。在插入D2E7或与D2E7相关的轻链或重链序列之前,该表达载体可以已经携带抗体恒定区序列。例如,一种使D2E7或与D2E7相关的VH及VL序列转变为全长抗体基因的方法是将其分别插入已编码重链恒定区及轻链恒定区的表达载体中,使得VH片段有效连接于该载体内的CH片段且VL片段有效连接于该载体内的CL片段。另外或者可替代地,重组表达载体可编码促进抗体链从宿主细胞中分泌的信号肽。可将抗体链基因克隆到载体中使得该信号肽框内连接于抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的信号肽)。
除抗体链基因之外,本发明的重组表达载体携带控制抗体链基因在宿主细胞内表达的调控序列。术语″调控序列″意思是包括控制抗体链基因转录或翻译的启动子、增强子及其它表达控制组件(例如聚腺苷酸化信号)。这些调控序列描述于(例如)Goeddel;Gene ExpressionTechnology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990)中。熟练技术人员应当了解包括选择调控序列的表达载体的设计可取决于例如待转化的宿主细胞的选择、所需的蛋白质表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列包括在哺乳动物细胞内引导高水平蛋白质表达的病毒组件,例如由以下病毒衍生的启动子和/或增强子:巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))及多瘤病毒。关于病毒调节组件及其序列的进一步描述,参见例如Stinski的美国专利第5,168,062号、Bell等人的美国专利第4,510,245号及Schaffner等人的美国专利第4,968,615号。
除抗体链基因及调节序列之外,用于本发明的重组表达载体可携带其他序列,例如调节载体在宿主细胞内复制的序列(例如复制起点)及选择性标记基因。选择性标记基因有助于选择已导入载体的宿主细胞(参见例如均为Axel等人的美国专利第4,399,216号、第4,634,665号及第5,179,017号)。例如,通常选择性标记基因赋予已导入载体的宿主细胞对例如G418、潮霉素或氨甲喋呤的药物的抗性。优选的可选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用氨甲喋呤选择/扩增在dhfr-宿主细胞中使用)及neo基因(用于G418选择)。
为表达轻链及重链,由标准技术将编码重链及轻链的表达载体转染至宿主细胞内。术语″转染″的各种形式包括通常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的大量技术,例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管在原核或真核宿主细胞内表达本发明的抗体在理论上是可能的,然而抗体最优选地在真核细胞中表达,最优选地在哺乳动物宿主细胞内表达,因为这些真核细胞、尤其哺乳动物细胞比原核细胞更有可能组装且分泌适当折叠的免疫活性抗体。已报导抗体基因的原核表达对于活性抗体的高产量生产无效(Boss,M.A.与Wood,C.R.(1985)Immunology Today 6:12-13)。
优选用于表达本发明的重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括描述于Urlaub与Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220中的dhfr-CHO细胞,其与DHFR可选择标记物一起使用,如,描述于R.J.Kaufman与P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621中的标记物)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞及SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时,通过培养宿主细胞足以使抗体在宿主细胞内表达或更优选地使抗体分泌至宿主细胞于其中生长的培养基内的一段时间来产生抗体。抗体可使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收。
宿主细胞也可用于产生完整抗体的部分,例如Fab片段或scFv分子。应了解以上程序的变化在本发明的范围内。例如,可能期望用编码本发明的抗体的轻链或重链(但并非两者)的DNA转染宿主细胞。也可利用重组DNA技术除去编码对于结合hTNFα并非必需的轻链及重链的任一个或两者的一些或全部DNA。由这些经截短DNA分子表达的分子也包含于本发明的抗体中。此外,可通过标准化学交联方法使本发明的抗体与第二抗体交联产生双抗体,其中一条重链及一条轻链为本发明的抗体且另一条重链及轻链对除hTNFα之外的抗原具有特异性。
在用于重组表达本发明的抗体或其抗原结合部分的优选系统中,通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链与抗体轻链的重组表达载体导入dhfr-CHO细胞。在重组表达载体内,抗体重链及轻链基因各自有效连接于CMV增强子/AdMLP启动子调节组件以驱动高水平的基因转录。重组表达载体也携带DHFR基因,其允许选择已使用氨甲喋呤选择/扩增用载体转染的CHO细胞。培养选择后的转化株宿主细胞以表达抗体重链及轻链并且从培养基中回收完整抗体。使用标准分子生物学技术制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化株、培养宿主细胞并且从培养基中回收抗体。
鉴于上述内容,可用于重组表达本发明中所使用的抗体和抗体部分的核酸、载体和宿主细胞组合物包括核酸以及包含所述核酸的载体,其包含所述人TNFα抗体阿达木单抗(D2E7)。编码所述D2E7轻链可变区的核苷酸序列在SEQ ID NO:36中示出。所述LCVR的CDR1结构域包含核苷酸70-102,CDR2结构域包含核苷酸148-168并且CDR3结构域包含核苷酸265-291。编码所述D2E7重链可变区的核苷酸序列在SEQ ID NO:37中示出。所述HCVR的CDR1结构域包含核苷酸91-105,CDR2结构域包含核苷酸148-198并且CDR3结构域包含核苷酸295-330。技术人员应了解,可使用遗传编码和标准分子生物学技术从编码所述D2E7 LCVR和HCVR的核苷酸序列得到编码D2E7相关抗体或其部分(如,CDR结构域,诸如CDR3结构域)的核苷酸序列。
除本文中所揭示的D2E7或其抗原结合部分或与D2E7相关的抗体之外的本发明的重组人类抗体可通过筛选使用由衍生自人类淋巴细胞的mRNA制备的人类VL及VH cDNA制备的重组组合抗体库、优选scFv噬菌体展示库而分离。制备及筛选这些库的方法在本领域中已知。除商业上可购得的用于产生噬菌体展示库的试剂盒(例如PharmaciaRecombinant Phage Antibody System,目录号27-9400-01;及StratageneSurfZAPTM噬菌体展示试剂盒,目录号240612)之外,尤其适用于产生及筛选抗体展示库的方法及试剂的实例可发现于(例如)Ladner等人美国专利第5,223,409号;Kang等人PCT公开第WO 92/18619号;Dower等人PCT公开第WO 91/17271号;Winter等人PCT公开第WO92/20791号;Markland等人PCT公开第WO 92/15679号;Breitling等人PCT公开第WO 93/01288号;McCafferty等人PCT公开第WO92/01047号;Garrard等人PCT公开第WO 92/09690号;Fuchs等人(1991)Bio/Technology 9:1370-1372;Hay等人(1992)Hum AntibodHybridomas 3:81-65;Huse等人(1989)Science 246:1275-1281;McCafferty等人,Nature(1990)348:552-554;Griffiths等人(1993)EMBO J 12:725-734;Hawkins等人(1992)J Mol Biol 226:889-896;Clackson等人(1991)Nature 352:624-628;Gram等人(1992)PNAS 89:3576-3580;Garrard等人(1991)Bio/Technology 9:1373-1377;Hoogenboom等人(1991)Nuc AcidRes 19:4133-4137;及Barbas等人(1991)PNAS 88:7978-7982中。
在一个优选实施方案中,为分离对hTNFα具有高亲和力及低解离速率常数的人类抗体,首先使用Hoogenboom等人,PCT公开第WO93/06213号中所述的表位印记方法使用对hTNFα具有高亲和力及低解离速率常数的鼠抗hTNFα抗体(例如MAK 195,登录号为ECACC 87050801的杂交瘤)选择对hTNFα具有类似结合活性的人类重链及轻链序列。此方法中所使用的抗体库优选为如McCafferty等人,PCT公开第WO 92/01047号、McCafferty等人,Nature(1990)348:552-554及Griffiths等人,(1993)EMBO J 12:725-734中所述制备并筛查的scFv库。scFv抗体库优选地使用重组人类TNFα作为抗原进行筛查。
一旦选择初始人类VL及VH片段,则进行″混合及匹配(mix andmatch)″试验(其中筛选不同对的初始选择的VL及VH片段用于hTNFα结合),以选择优选的VL/VH对组合。另外,为了进一步改善对hTNFα结合的亲和力和/或降低对hTNFα结合的解离速率常数,优选的VL/VH对的VL及VH片段可在类似于天然免疫应答过程中引起抗体亲和力成熟的体内体细胞突变过程的过程中随机突变,优选地在VH和/或VL的CDR3域内突变。该体外亲和力成熟可使用分别与VH CDR3或VL CDR3互补的PCR引物通过扩增VH及VL区实现,这些引物已采用四种核苷酸碱基的随机混合物在特定位置″掺入(spike)″,使得产生的PCR产物编码VH及VL片段,其中随机突变作用已被导入VH和/或VL CDR3域。可再次筛选用于结合hTNFα的这些随机突变的VH及VL片段,并且可以选择显示对于hTNFα结合而言高亲和力及低解离速率的序列。
从重组免疫球蛋白展示库筛选并分离本发明的抗hTNFα抗体之后,可从展示包装(例如从噬菌体基因组)回收编码选择的抗体的核酸,并通过标准重组DNA技术亚克隆到其它表达载体中。如果需要,可以将核酸进一步操作,以产生本发明的其它抗体形式(例如连接于编码例如其他恒定区的其他免疫球蛋白域的核酸)。如以上进一步详细描述的,为了表达通过筛选组合文库而分离的重组人类抗体,将编码抗体的DNA克隆到重组表达载体中,并导入哺乳动物宿主细胞。
分离对hTNFα具有高亲和性和低解离速率常数的人中和抗体的方法描述于美国专利第6,090,382号、第6,258,562号和第6,509,015号中,其各自以引用的方式并入本文。
用于本发明的方法中的抗体、抗体部分及其它TNFα抑制剂可引入适于施用于受试者的药物组合物中。通常,该药物组合物包含抗体、抗体部分或其它TNFα抑制剂及药学上可接受的载体。本文使用的″药学上可接受的载体″包括生理上相容的任意及所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗剂及吸收延迟剂及其类似物。药学上可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲液、右旋糖、甘油、乙醇等的一种或多种及其组合。在许多情况中,优选地组合物中包括等渗剂,例如糖、例如甘露醇、山梨糖醇的多元醇或氯化钠。药学上可接受的载体可进一步包括少量辅助物质,例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂,其增加抗体、抗体部分或其它TNFα抑制剂的保存期或有效性。
用于本发明的方法和组合物中的组合物可以以多种形式存在。这些形式包括(例如)液体、半固体及固体药剂形式,例如液体溶液(例如可注射及可输注溶液)、分散液或悬浮液、锭剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。优选的形式取决于预期的给药方式及治疗应用。通常,优选的组合物为可注射或可输注溶液形式,例如类似于以其它抗体或其它TNFα抑制剂用于人类的被动免疫的那些组合物的组合物。优选的给药方式为非肠胃(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)方式。在一个优选的实施方案中,抗体或其它TNFα抑制剂由静脉内输注或注射施用。在另一优选的实施方案中,抗体或其它TNFα抑制剂由肌肉内或皮下注射施用。
治疗组合物在制造及储存条件下通常必须为无菌且稳定的。可将该组合物配制为溶液、微乳液、分散液、脂质体或适于高药物浓度的其它有序结构。无菌可注射溶液可通过采用以上列举的成份的一种或组合将活性化合物(即抗体、抗体部分或其它TNFα抑制剂)以所需要的量引入适当溶剂中并根据需要随后过滤灭菌而制备。一般而言,分散液通过将活性化合物引入含有碱性分散介质及来自以上列举的那些成份的所需其它成份的无菌载体中而制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况中,优选的制备方法为真空干燥及冷冻干燥,其产生活性成份加上来自其预先无菌过滤的溶液的任意其他所需成份的粉剂。溶液的适当流动性可(例如)通过使用例如卵磷脂的包衣,由在分散液情况中保持所需粒径及由使用界面活性剂而得以保持。可注射组合物的延迟吸收可通过将例如硬脂酸盐及明胶的延迟吸收剂包含于组合物中而获得。
在一个实施方案中,本发明包括药物组合物,其包含有效的TNFα抑制剂和药学上可接受的载体,其中所述有效的TNFα抑制剂可用于治疗类风湿性关节炎。
在一个实施方案中,将用于本发明的方法的抗体或抗体部分并入根据PCT/IB03/04502和美国申请第20040033228号中描述的药物制剂中,上述申请以引用的方式并入本文。这一制剂包括浓度为50mg/ml的D2E7抗体(阿达木单抗),其中一个预填充的注射器包含40mg的抗体用于皮下注射。包含高浓度阿达木单抗的替代性的制剂在US20090291062和US20100278822中有所描述,其各自的内容以引用的方式并入本文。
可通过本领域中已知的多种方法施用本发明的抗体、抗体部分和其它TNFα抑制剂,尽管对于大量的治疗性应用,优选的施用途径/模式是肠胃外,如皮下注射。在另一个实施方案中,施用是通过静脉内注射或输注进行的。
如技术人员应了解的,施用途径/模式应根据所需结果而变化。在特定的实施方案中,活性化合物可使用保护所述化合物免于快速释放的载体进行制备(诸如控释制剂),包括植入物、透皮贴片和微胶囊化递送系统。可使用生物可降解的生物相容性聚合物,诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这些制剂的大量方法被授予专利或通常为本领域的技术人员所知。参见,例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,Robinson编著,Dekker,Inc.,New York,1978。
在一个实施方案中,用于本发明的TNFα抗体和抑制剂通过皮下向受试者递送。在一个实施方案中,所述受试者对其自身施用所述TNFα抑制剂,包括但不限于,TNFα抗体或其抗原结合部分。
还可以以蛋白质晶体制剂的形式施用用于本发明的TNFα抗体和抑制剂,所述蛋白质晶体制剂包括包封于聚合物载体内的蛋白质晶体的组合以形成包衣颗粒。所述蛋白质晶体制剂的包衣颗粒可具有球状形态并且可以是直径最高为500微米的微球,或其可具有某些其它形态并且是微颗粒。蛋白质晶体的增高的浓度使本发明的抗体得以进行皮下递送。在一个实施方案中,通过蛋白质递送系统递送本发明的TNFα抗体,其中将一种或多种蛋白质制剂或组合物施用于患有TNFα相关失调的受试者。制备全抗体晶体或抗体片段晶体的稳定化制剂的组合物和方法也描述于WO 02/072636中,其以引用的方式并入本文。在一个实施方案中,通过使用本发明的治疗方法将包含描述于PCT/IB03/04502和美国申请第20040033228号中的晶体化抗体片段的制剂用于治疗类风湿性关节炎,所述文献以引用的方式并入本文中。
在特定的实施方案中,本发明的抗体、抗体部分或其它TNFα抑制剂可通过口腔施用,例如,使用惰性稀释剂或可同化的可食用载体。还可将所述化合物(以及在需要的情况下的其它成份)装入硬壳或软壳明胶胶囊中、压制成片剂或直接加入受试者的饮食中。对于口腔药物施用,可将所述化合物与赋形剂合并并且以可消化的片剂、含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬液、糖浆、薄片等形式使用。为通过肠胃外施用以外的方式施用本发明的化合物,使用防止化合物失活的材料涂覆所述化合物或共同施用所述化合物可能是必需的。
补充的活性化合物也可以引入组合物中。在某些实施方案中,用于本发明的方法中的抗体或抗体部分与一种或多种包括类风湿性关节炎抑制剂或拮抗剂的其他治疗剂共配制和/或共施用。例如,本发明的抗hTNFα抗体或抗体部分可与一种或多种结合与TNFα相关障碍关联的其它靶标的其他抗体(例如结合其它细胞因子或结合细胞表面分子的抗体)、一种或多种细胞因子、可溶性TNFα受体(参见例如PCT公开第WO 94/06476号)和/或一种或多种抑制hTNFα产生或活性的化学药剂(例如如PCT公开第WO 93/19751号中所述的环己烷-亚基衍生物)或其任意组合共配制和/或共施用。此外,本发明的一种或多种抗体可与两种或两种以上上述治疗剂组合使用。这些组合疗法可有利地利用以更低剂量施用的治疗剂,因此避免由于与各种单一疗法相关的患者可能出现的副作用、并发症或低水平应答。
本发明的药物组合物可包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明抗体或抗体部分。“治疗有效量”是指在剂量上及对于所需要的时间而言对获得所需治疗结果有效的量。抗体、抗体部分或其它TNFα抑制剂的治疗有效量可根据例如个体的疾病状态、年龄、性别及体重及抗体、抗体部分、其它TNFα抑制剂在个体内引起所需应答的能力等因素而变化。治疗有效量也为其中治疗有益效果超过抗体、抗体部分或其它TNFα抑制剂的任意有毒或有害效果的量。″预防有效量″是指在剂量上及对于所需要的时间而言对获得所需预防结果有效的量。通常,由于预防剂量在疾病的较早期阶段之前或在疾病的较早期阶段时用于受试者,因此预防有效量比治疗有效量要小。
本发明的试剂盒
本发明还提供了用于评估受试者对用于治疗类风湿性关节炎(RA)的TNFα抑制剂的反应性的试剂盒,以及用于治疗患有类风湿性关节炎(RA)的受试者的试剂盒。这些试剂盒包括用于测定HLA-DRB1SE、IL-4R I50和/或V50等位基因以及/或者FcγRIIb I232和/或T232等位基因的拷贝数的工具和使用所述试剂盒的说明。
本发明的试剂盒可以任选地包含可用于实施本发明的方法的另外组分。例如,所述试剂盒可包含用于从受试者获取生物样品的工具、对照样品(如来自受试者的样品)、一个或多个样品隔室、描述了本发明方法的实施的说明材料以及特定的对照/标准品。
所述说明可以是,例如,用于实施分析方法以评估结果的印刷说明书。
用于从受试者中分离生物样品的工具可包括一种或多种试剂,所述试剂可用于从受试者中获取流体或组织。用于从受试者获取生物样品的工具还可包括从血样中分离外周血单核细胞的工具,例如通过对单核细胞的阳性选择或通过去除单核细胞以外的所有其它细胞类型的阴性选择。
本发明的试剂盒可进一步包含TNFα抑制剂。
优选地,所述试剂盒被设计用于人类受试者。
可将本发明的试剂盒用于测定患有RA的受试者对于TNFα抑制剂是否具有有效的反应。这些试剂盒可包含载体工具,其经区室化以在封闭空间中接受一个或多个容器工具诸如药瓶、药管等,所述各容器工具包含将用于本方法中的独立元素之一。例如,一个容器工具可包含进行或可进行可检测标记的探针。这些探针可以是分别对于蛋白质或生物标志物(HLA-DRB1 SE、IL-4R I50V SNP和/或FcγRIIb I232 SNP)基因或信息特异性的抗体或多肽。在所述试剂盒利用核酸杂交以检测靶核酸的情况下,所述试剂盒还可具有容纳用于扩增靶核酸序列的核苷酸的容器和/或容纳报告体工具的容器,诸如结合于报告体分子(诸如酶的、荧光的或放射性同位素的标记)的生物素结合蛋白,如抗生物素蛋白和抗生蛋白链菌素。
这些试剂盒一般包含上述容器以及一个或多个其它容器,其包含从商业和用户角度上看是需要的材料,包括缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和具有使用指导的包装插页。所述容器上可存在标签以标明所述组合物用于特定应用并且还可标明用于体内或体外用途的指示,诸如上文所述的用途。
本发明的试剂盒具有大量的实施方案。典型的实施方案是包含容器、所述容器上的标签以及包含于所述容器内的组合物的试剂盒,其中所述组合物包含一种或多种多核苷酸,其在严格条件下杂交于所述IL-4R I50V SNP和/或FcγRIIb I232 SNP和/或HLA-DRB1 SE的互补序列,并且所述容器上的标签标明了所述组合物可被用于评估样品中IL-4R I50V SNP和/或FcγRIIb I232 SNP和/或HLA-DRB1 SE的存在,并且其中所述试剂盒包含将所述多核苷酸用于评估特定样品类型中所述SNP和/或SE RNA或DNA的存在的指导。
另一个方面是是包含容器、所述容器上的标签以及包含于所述容器内的组合物的试剂盒,其中所述组合物包含结合于蛋白质或自身抗体生物标志物的一级抗体,并且所述容器上的标签标明了所述组合物可被用于评估样品中这些蛋白质或抗体的存在,并且其中所述试剂盒包含将所述抗体用于评估特定样品类型中生物标志物蛋白的存在的指导。所述试剂盒可进一步包含用于制备样品以及将抗体应用于所述样品的一系列指示和材料。所述试剂盒可包含一级和二级抗体,其中所述二级抗体与标记物偶联,例如,酶标记物。
所述试剂盒的其它任选组分包括一种或多种缓冲剂(如,封闭缓冲剂、洗涤缓冲剂、底物缓冲剂等)、其它试剂诸如可被酶标记物化学修饰的底物(如,生色团)、抗原修复溶液(epitope retrieval solution)、对照样品(阳性和/或阴性对照)、对照玻片等。试剂盒还可包含用于解释使用所述试剂盒所获得的结果的指导。
在进一步的具体实施方案中,对于基于抗体的试剂盒,所述试剂盒可包含,例如:(1)第一抗体(如,连接于固体支持物的抗体),其结合于生物标志物蛋白;以及任选地,(2)不同的第二抗体,其结合于所述蛋白质或所述第一抗体并且偶联于可检测标记物。
对于基于寡核苷酸的试剂盒,所述试剂盒可包含,例如:(1)寡核苷酸,例如可检测地标记的寡核苷酸,其杂交于编码生物标志物蛋白的核酸序列,或(2)可用于扩增生物标志物核酸分子的引物对。所述试剂盒还可包含,例如,缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。所述试剂盒可进一步包含检测所述可检测标记所必需的组分(如,酶或底物)。所述试剂盒还可包含对照样品或一系列对照样品,其可进行分析并且与测试样品进行比较。所述试剂盒的各组分可被包封到单个容器内,并且多个容器可与用于解释使用所述试剂盒进行分析的结果的指导一同全部被包括于单一包装内。
本发明还提供了包含有用于治疗RA的材料的制品。所述制品包含容器以及在所述容器上或与之关联的标签或包装插页。在这一方面,所述包装插页处于所述容器上或与之关联。适当的溶器包括,例如,药瓶、小瓶、注射器等。所述容器可由多种材料形成,诸如玻璃或塑料。所述容器容纳或包含有效于治疗RA的拮抗剂并且可具有无菌接入端口(例如,所述容器可以是静脉内溶液包或具有可被皮下注射针头刺透的瓶塞的药瓶)。所述组合物中至少一种活性剂是B细胞拮抗剂。所述标签或包装插页标明了所述组合物被用于在适合治疗的受试者中治疗RA,其具有针对拮抗剂和被提供的其它任何药剂的给药量和间隔的具体指导。
本文的试剂盒和制品还包含信息,例如包装插页或标签形式的信息,其标明了所述组合物被用于在来自患有疾病的患者的遗传样品中检测到表现出本文的多态性和/或SE的基因型的情况下治疗RA。所述插页或标签可以是任意形式,诸如纸件或电子媒介,例如,磁性记录媒介(如软盘)或CD-ROM。所述标签或插页还可包含有关所述试剂盒或制品中的药物组合物和剂型的其它信息。
这些信息通常有助于患者和医师有效并安全地使用所述包封的药物组合物和剂型。例如,在所述插页中可提供有关所述拮抗剂的下列信息:药代动力学、药理学、临床研究、疗效参数、适应症和用途、禁忌症、警示、注意事项、不良反应、过度剂量、适当剂量和施用、如何供应、适当储存条件、参考和专利信息。
在本发明的特定实施方案中提供了制品,其包含并共同包装有包含TNFα抑制剂和药学上可接受的载体的药物组合物以及标签,所述标签申明所述抑制剂或药物组合物被指明用于治疗患有RA的患者,已经从所述患者获取了显示IL-4R I50V SNP和/或FcγRIIb I232 SNP和/或HLA-DRB1 SE等位基因的存在的样品。这可通过评定IL-4R I50V SNP和/或FcγRIIb I232 SNP和/或HLA-DRB1 SE等位基因作为生物标志物的遗传表达而显示。
本发明还提供了用于制备TNFα抑制剂或其药物组合物的方法,其包括在包装内将所述TNFα抑制剂或药物组合物与标签相结合,所述标签申明所述TNFα抑制剂或药物组合物被指明用于治疗患有RA的患者,已经从所述患者获取了显示了HLA-DRB1 SE等位基因和/或FcγRIIb I232 SNP和/或IL-4R I50V SNP的存在的遗传样品。或者,可单独地描述与相关于反应的各SNP相关联的特定等位基因。所述标签可进一步申明,这可通过评定IL-4R I50V SNP和/或FcγRIIb I232 SNP和/或HLA-DRB1 SE等位基因作为生物标志物的遗传表达而显示。很明显,可单独地描述本发明中所鉴定的各遗传标志物或彼此结合进行描述。
本申请全文中提及的所有参考文献、专利和公开专利申请的内容以引用的方式并入本文。
本发明通过下列实施例进一步说明,其不应被解释成为限制。
实施例
实施例1:早期类风湿性关节炎对于使用阿达木单抗加甲氨蝶呤对比单独使用甲氨蝶呤进行治疗的反应:通过遗传标志物分析预测临床反应
下列研究和实施例2-4检验了对于使用TNFα抑制剂、阿达木单抗加甲氨蝶呤对比单独使用甲氨蝶呤对治疗类风湿性关节炎(RA)的遗传因素贡献。
本研究的目的在于在OPTIMA(多中心随机化双期双盲研究,其用于在患有早期类风湿性关节炎的患者中针对使用甲氨蝶呤和阿达木单抗联合疗法进行的治疗启动确定最佳方案)的子研究中前瞻性地分析在使用阿达木单抗(ADA)和甲氨蝶呤(MTX)的联合疗法或MTX单一疗法26周后严重RA的3种遗传风险因子(HLA-DRB1共同表位(SE)、FcγRIIb和IL-4R)与临床疾病活动性的关联。
OPTIMA是具有26周的和52周的时期的不间断78周研究。适合的患者具有<1年的RA(1987年修正的ACR分类)、28关节疾病活动性计分(DAS28)>3.2、≥6的肿胀关节(TJC68≥6)和≥8的压痛关节(SSJC66≥8)。患者具有≥28mm/h的升高的红细胞沉降率(ESR)或≥1.5mg/dL的C-反应性蛋白以及≥1的下列参数:>1的侵蚀、类风湿性因子阳性(RF+)或抗环瓜氨酸化肽抗体阳性(抗CCP+)。排除标准包括对全身抗TNFα疗法、使用MTX的治疗或>2种疾病改变性抗关节炎药物(DMARD)的先前治疗、其它急性炎性关节疾病或者4周内或2月内分别进行了类固醇或手术治疗。
根据需要通过等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)和直接测序针对所述HLA-DRB1SE(纯合性或杂合性)、所述FcγRIIb I232T单核苷酸多态性(SNP)(通过使用Assay-on-Demand(Applied Biosystems)进行的等位基因特异性PCR)以及所述IL-4R I50V SNP(通过使用Assay-on-Demand(Applied Biosystems)进行的等位基因特异性PCR)的存在对患者进行基因分型。
根据图1中所示出,在治疗的最初26周中(第1时期)MTX初治患者最初1∶1随机化而接受每周口服MTX(逐步升高至20mg)加上通过皮下注射接受每两周阿达木单抗(ADA)40mg或安慰剂(PBO)。在第2时期中,那些联合疗法的反应者,例如达到DAS28低疾病活动行(LDA)标准(DAS28<3.2)的受试者,被重新进行1∶1随机处理以在第26-78周中保持ADA+MTX或“降级”为PBO+MTX。在初始的PBO+MTX单一疗法组中,在第1时期后达到DAS28 LDA的受试者在第2时期中在PBO+MTX上保持盲化。在第22周和/或26周未能满足所述DAS28LDA标准的任意受试者在第26周后接受开放标签的ADA+MTX。遗传数据与第26周的临床反应关联。
为进行临床评估,在第26周后使用非反应者归因途径(non-responder imputation approach)测定相对基线ACR评分达到20%、50%和70%改善的受试者百分比。在第26周评估DAS28(CRP)1评分。使用非反应者归因途径测定达到LDA(DAS28<3.2)和缓解标准(DAS28<2.6)的受试者比例。
为进行统计分析,使用卡方检验或在数据稀少的情况下使用费希尔确切检验(Fisher’s exact test)以评估治疗组间的等位基因分布。卡方检验用于比较在治疗组内和组间达到ACR20/50/70和DAS28LDA(<3.2)或缓解(<2.6)的受试者比例。
研究群体包括1032名患者,其在最初26周期间被随机分为PBO+MTX(N=517)或ADA+MTX(N=515)。在第1时期期间,106名受试者(10%)提前终止(PBO+MTX:N=57,11%;以及ADA+MTX:N=49,10%)。在入组的1032名受试者中,894名受试者(87%)具有可用于该子分析的遗传数据(PBO+MTX:N=451,87%;以及ADA+MTX:N=443,86%)。
在下表1中可见,在两个治疗组内全部3种遗传因子处于哈代-温伯格(Hardy Weinberg)平衡中。所述MTX和ADA+MTX组在携带所述HLA-DRB1SE的患者百分比上(分别为63%对比67%)或在携带所述SE的0、1或2个拷贝的患者百分比上(MTX:37%、48%、15%;ADA+MTX:33%、49%、19%)无显著差异。类似地,所述MTX和ADA+MTX组之间具有IL-4R I50V等位基因的患者百分比无显著差异(A等位基因纯合性:29%对33%;G等位基因纯和性:20%对20%;杂合性:52%对47%)。与之相反和偶然地,所述FcγRIIb I232T等位基因的分布在组间差异显著,因而将该等位基因排除于进一步分析。实施例4中提供了对所述FcγRIIb I232T等位基因的分析。
表1.等位基因分布
aP值基于卡方检验。
以HLA-DRB1 SE和IL-4R等位基因分层的受试者的基线人口学统计和疾病特征分别在表2和表3中给出。
表2.依照HLA-DRB1 SE拷贝数的基线人口学统计和疾病特征
*治疗组间的显著性差异(193/213,91%PBO+MTX,177/213,83%ADA+MTX,P=0.02)。
aN=301;bN=428;cN=149;dN=311;eN=430。
表3.依照IL-4R等位基因的基线人口学统计和疾病特征
aN=267;bN=436;cN=175;dN=274;eN=442。
总体上,与PBO+MTX治疗组中的受试者相比,接受ADA+MTX联合疗法的受试者到26周的反应显著更好。
根据下面图2和表4a-4c所示出的,HLA-DRB1 SE拷贝数与临床反应相关联。但是,尽管对于所述MTX组提高的拷贝数与美国风湿病学会分级评分改善(ACR20、ACR50和ACR70)和28关节疾病活动性评分的缓解标准的改善下降相关联,而对于所述ADA+MTX组,提高的拷贝数显著地并且直接地与更佳临床反应相关(如,对于0、1和2拷贝的ACR50:所述MTX组为40%、33%和29%,相对于所述ADA+MTX组的42%、53%和65%)。这些数据表明,在具有至少1个拷贝的所述SE的受试者中,与MTX单一疗法相比使用ADA+MTX的联合疗法与显著改善的ACR20/50/70反应率相关,并且表明在具有1或2个拷贝的SE等位基因的受试者中观察到了对于ADA+MTX的ACR反应的累加性提高。
表4a.按照HLA-DRB1 SE的存在列出的第26周的ACR20反应率
#治疗组内反应比较的P值;*治疗组间差异的P值;P值基于卡方检验。
表4b.按照HLA-DRB1 SE的存在列出的第26周的ACR50反应率
#治疗组内反应比较的P值;*治疗组间差异的P值;P值基于卡方检验。
表4c.按照HLA-DRB1 SE的存在列出的第26周的ACR70反应率
#治疗组内反应比较的P值;*治疗组间差异的P值;P值基于卡方检验。
此外,根据图3和下文表5所示出的,在具有至少1个拷贝的所述SE的受试者中,与MTX单一疗法相比使用ADA+MTX联合疗法与显著改善的DAS28反应关联。在具有1或2个拷贝的所述SE等位基因的受试者中观察到了达到DAS28 LDA标准的ADA+MTX受试者比例的累加性提高。SE的存在与对MTX单一疗法的DAS28反应无关联。
表5.按照HLA-DRB1 SE的存在列出的在第26周达到LDA和缓解的DAS28标准的受试者比例
#治疗组内反应比较的P值;*治疗组间差异的P值;P值基于卡方检验。
下面图4和表6a-6c中可见,对于在所述IL-4R I50等位基因上是纯合或杂合的ADA+MTX患者观察到了显著增强的临床反应,但这未见于具有两个IL-4R V50等位基因的患者。带有至少一个IL-4R I50等位基因(AA或AG)的受试者对于使用ADA+MTX进行的联合疗法表现出相对于MTX单一疗法显著改善的ACR反应。与具有IL-4R V50V等位基因(GG)的ADA+MTX受试者相比,使用ADA+MTX治疗的对于所述IL-4R I50等位基因是纯合(AA)或杂合(AG)的受试者具有显著增强的ACR20反应。根据ACR20/50/70反应率评估,IL-4R等位基因与PBO+MTX的差异反应并不关联。
表6a.依照IL-4R等位基因列出的第26周的ACR20反应率
表6b.依照IL-4R等位基因列出的第26周的ACR50反应率
表6c.依照IL-4R等位基因列出的第26周的ACR70反应率
下面图5和表7中可见,对于ACR反应,带有至少一个IL-4R I50等位基因(AA或AG)的受试者对于使用ADA+MTX进行的联合疗法表现出相对于MTX单一疗法显著改善的DAS28反应。与具有所述IL-4RV50V等位基因(GG)的ADA+MTX受试者相比,使用ADA+MTX治疗的对于所述I50等位基因是纯合(AA)或杂合(AG)的受试者的较高比例达到了DAS28LDA。相反地,所述I50等位基因的存在与使用MTX单一疗法进行治疗达到DAS28LDA和缓解标准的受试者的比例降低的倾向相关。
表7.按照IL-4R等位基因列出的在第26周达到LDA和缓解的DAS28标准的受试者比例
#比较治疗组内反应的P值;*治疗组间差异的P值;P值基于卡方检验。
综上所述,所述HLA-DRB1共同表位和IL-4R I50V多态性独立地与患有早期RA的患者中的差异治疗反应相关。所述HLA-DRB1共同表位或IL-4R I50等位基因的存在在使用阿达木单抗加甲氨蝶呤进行治疗的患者中提高了临床反应。与使用甲氨蝶呤单一疗法相比,在使用阿达木单抗加甲氨蝶呤进行的26周治疗后,所述HLA-DRB1共同表位和所述IL-4R I50等位基因独立地与增强的临床反应相关。因此,本研究的结果表明,所述HLA-DRB1 SE和所述IL-4R I50V对ADA+MTX疗法的临床反应有所贡献。因此,遗传标志物分析在患有早期RA的患者中可有助于个性化医疗并且可用于预测受试者对于使用TNFα抑制剂治疗RA是否具有反应性。
实施例2:基因相互作用在对阿达木单抗加甲氨蝶呤相对单独甲氨蝶呤的反应的影响:OPTIMA试验的六个月结果
对影响类风湿性关节炎(RA)疾病严重性及对治疗的反应的遗传因子的鉴定可指导个性化治疗方法。为探索候选遗传因子对于疾病活动性变化的影响,下列研究检验了遗传因子对于使用阿达木单抗加甲氨蝶呤对比单独使用甲氨蝶呤对于治疗类风湿性关节炎(RA)的贡献。
OPTIMA是具有26周的和52周的时间段的不间断78周研究。所述研究设计和患者适合性/排除标准的详细内容描述于上文实施例1中。简而言之,适合的患者具有<1年的RA、DAS28>3.2、≥6的SJC、≥8的TJC。ESR≥28mm/h或CRP≥1.5mg/dL,以及≥1的下列参数:>1的侵蚀、RF+或抗CCP+(见上文)。将MTX初治患者随机分为每两周40mg的ADA加MTX或者安慰剂(PBO)+MTX(见上文)。根据需要通过等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)和直接测序针对所述HLA-DRB1共同表位(SE)、所述FcγRIIb I232T单核苷酸多态性(SNP)以及所述IL-4R I50V SNP的存在对患者进行基因分型。通过独立地根据针对各等位基因的遗传背景以及对于SE和IL-4R的等位基因组合而检验对26周治疗的临床反应。
治疗组中的受试者表现出0、1或2个拷贝的所述HLA-DRB1 SE的相当的分布(分别为,PBO+MTX:37%、48%、15%;ADA+MTX:33%、49%、19%,P=0.28,参见上文表1)。类似地,所述IL-4R等位基因AA、AG和GG在治疗组间类似地分布(分别为,PBO+MTX:29%、52%、20%;ADA+MTX:33%、47%、20%,P=0.38,参见上文表1)。但是,所述FcγRIIb等位基因与此不同地在治疗组间为相当的(参见上文表1),并且在本实施例中未对该SNP进行进一步的分析,而是于实施例4中提供分析。
所述SE的存在并未影响对于单独MTX的治疗反应(如,对于0、1或2个拷贝ACR50为40%、33%和29%,P=0.23,参见上表4)。相反,在接受ADA+MTX的受试者中治疗反应率随着所述SE的增加拷贝而相应地增强(对于0、1、2个SE ACR50为42%、53%和65%,P=0.004,参见上文表4)。因此,对于ADA+MTX受试者,1个拷贝的所述SE的存在相对于所述PBO+MTX组产生了20%的ACR50提高(P<0.001),并且相当于PBO+MTX,在ADA+MTX中2个拷贝的SE提高ACR50 36%(P<0.001)。参见上文表4。
类似地,对于MTX的临床反应未受到IL-4R等位基因的影响,而在具有AA或AG IL-4R等位基因的受试者中使用ADA+MTX的治疗结果有所增强。参见上文表6。
在所述PBO+MTX组中,对于所述SE和IL-4R等位基因组合的治疗反应的检验并未显示因基因型而在治疗反应中出现变化,这支持了单个等位基因分析的结果。但是,在所述SE不存在的情况下IL-4R基因型影响了对于ADA+MTX的治疗反应,而所述SE的存在掩盖了所述IL-4R等位基因的效果(见表8)。
表8.HLA-DRB1 SE与IL-4R之间的遗传相互作用
本文所报道的结果显示,对于阿达木单抗加甲氨蝶呤的临床反应独立地受到所述HLA-DRB1共同表位和IL-4R等位基因两者的影响,而在对于甲氨蝶呤单一疗法的反应上基因型不存在影响。此外,在对使用阿达木单抗加甲氨蝶呤进行治疗的反应中,所述HLA-DRB1共同表位与IL-4R等位基因之间存在相互作用。
实施例3:遗传相互作用在对阿达木单抗加甲氨蝶呤对比单独甲氨蝶呤的反应的影响:OPTIMA试验的六个月结果
背景
对影响类风湿性关节炎(RA)疾病严重性和对治疗的反应的遗传因素的鉴定可指导个性化治疗方法。虽然特定的遗传因素已经涉及到类风湿性关节炎(RA)的易感性及其严重性,但基因组成分对于针对生物性RA治疗的反应的效果尚未受到广泛研究。
目的
本研究的目的在于研究随着使用阿达木单抗(ADA)加甲氨蝶呤(MTX)或单独使用MTX进行治疗后候选遗传因子对于疾病活动性变化的影响。此外,还研究了使用阿达木单抗(ADA)加甲氨蝶呤(MTX)或单独使用MTX进行治疗后候选遗传因子对于患有早期RA的患者的疾病活动性变化的影响。
方法
研究设计(图1)
OPTIMA是第4期多中心双阶段双盲安慰剂对照的随机化临床试验,其用于确定在患有早期RA的患者中针对使用甲氨蝶呤和阿达木单抗联合疗法进行的治疗启动的最佳方案。对于适合患者的关键入组标准是:
1)年龄18岁
2)根据诊断(1987年ACR分类标准(1987 ACR-classificationcriteria))RA<1年
3)DAS28>3.2
4)TJC68≥8并且SJC66≥6
5)ESR≥28mm/h或CRP≥1.5mg/dL
在本遗传亚组研究中的受试者对参与试验提供了另外的书面自愿知情同意书。
在最初的26周,将MTX初治患者1∶1随机分为ADA(每两周40mg)+MTX(逐渐递增到第8周为20mg/周)或者安慰剂(PBO)+MTX。
向第22周和/或第26周未能达到LDA(DAS28<3.2)的任何受试者提供使用开放标签的ADA+MTX进行继续治疗的选择。
对在第22周和第26周达到LDA的使用ADA+MTX进行初始治疗的反应者受试者进行再度随机化以用于到第78周为止的期间比较连续的联合疗法和ADA撤药。在第22周和第26周具有LDA的PBO+MTX受试者在MTX单一疗法上保持盲法。
总而言之,OPTIMA是具有26周和52周时间段的不间断78周研究。适合的患者具有<1年的RA、DAS28>3.2、≥6的SJC、≥8的TJC。ESR≥28mm/h或CRP≥1.5mg/dL,以及≥1的下列参数:>1的侵蚀、RF+或抗CCP+。将MTX初治患者随机分为每两周ADA 40mg+MTX或安慰剂(PBO)+MTX。根据需要通过等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)和直接测序针对所述HLA-DRB1共同表位(SE)、所述FcγRIIb I232T单核苷酸多态性(SNP)以及所述IL-4R I50V SNP的存在对患者进行基因分型。对于各等位基因独立地通过基因背景以及根据SE和IL-4R的等位基因组合检验对26周治疗的临床反应。
遗传分析
为确定HLA-DRB1 SE纯和性或杂合性,在双步骤程序中进行HLA-DRB1分型。首先,使用LABType SSO分析(One Lambda Inc.)在低分辨率水平上对全部患者进行分型。随后使用基于序列的分型(AlleleSEQR,Abbott Molecular Diagnostics)在高分辨率水平上对DRB1*01、*04、*10和*14阳性患者进行分型。在情况不明时,另外使用了来自Biotest的DRB高分辨率SSO试剂盒。
在特定的情况下,使用Protrans S4 Sequencing Kits(Medipro)进行的高分辨率分型用于测定患者是否具有HLA-DRB1SE纯和性或杂合性。
使用Assay-on-Demand(Applied Biosystems)进行的等位基因特异性PCR用于测定IL-4R(A至G[I50V])SNP。
使用Assay-by-Design(Applied Biosystems)进行的等位基因特异性PCR用于测定FcγRIIb(T至C[I232T])变体。
临床评估
使用非反应者归因途径分析测定在第26周时相对于基线获得ACR评分50%的改善的受试者百分比。使用非反应者归因途径测定在第26周获得DAS28(CRP)缓解(DAS28<2.6)的受试者百分比。
统计分析
使用卡方检验或在数据稀少的情况下使用费希尔确切检验评估治疗组间的等位基因分布。使用多元逻辑回归评估治疗、单个等位基因、治疗与遗传成分间的相互作用以及基线人口学统计和疾病特征对26周临床反应的效应。
结果:
研究群体
受试者安排
所述OPTIMA试验对1032名患者随机化:PBO+MTX:N=517以及ADA+MTX:N=515
在最初的26周期间内,106名受试者(10%)提前终止:PBO+MTX:N=57,11%,以及ADA+MTX:N=49,10%。
在本遗传子研究中,1032名受试者中的894名(87%)具有可用于本分析的基因型数据:
PBO+MTX:N=451,87%
ADA+MTX:N=443,86%
基线特征
随机化并非根据等位基因型进行分层:
各治疗组中的受试者表现出类似的所述HLA-DRB1 SE和IL-4R等位基因变体的分布;但是FcγRIIb SNP分布并不均等并且被排除于进一步分析之外(参见下表9),但其在描述于实施例4中的独立分析中进行分析。
表9:等位基因分布。表达所标示的基因型的受试者的数目(%)。
aP值基于卡方检验。
在所有治疗组间等位基因变体之间的基线人口学统计和疾病特征是类似的(表10和表11):
抗CCP+患者的提高的百分比被发现伴随着所述SE的拷贝增加。
与具有1个SE等位基因的ADA+MTX患者相比,对在PBO+MTX组中具有1个拷贝的所述SE患者确认了更多的吸烟者。
表10:按照SE拷贝数列出的基线人口学统计和疾病特征
*治疗组之间的显著差异(193/213,91%PBO+MTX,177/213,83%ADA+MTX,P=0.02).
aN=301;bN=428;cN=149;dN=311;eN=430.
表11:按照IL-4R等位基因列出的基线人口学统计和疾病特征
aN=267;bN=436;cN=175;dN=274;eN=442.
治疗反应
为控制可能的混淆变量,使用多元回归分析以研究遗传因子对于基线人口学统计和疾病状态变量的影响。在多元回归中,ADA+MTX的治疗效应对于在第26周获得ACR50和DAS28缓解是显著的(P<0.001)。
SE拷贝数
ACR50
在所述2个治疗组中观察到了相反的反应率模式:在PBO+MTX组中的ACR50反应显示出随SE多元性而降低的趋势(表4),而对在具有较高SE存在的(表4)的受试者中对ADA+MTX的ACR50反应率提高。
由于SE拷贝数与2个治疗组中的治疗反应的反向相关性,在各治疗组内推导了进一步的多元模型。据发现,当考虑性别、吸烟者、RF+、抗CCP+、TJC68和DAS28的基线变量时,在PBO+MTX组中SE拷贝数存在显著效应(对于2×SE对比0×SE,OR值[95%置信区间,CI]:0.469[0.247,0.893])。此外,在ADA+MTX组中,据发现SE拷贝数的效应也是显著的(对于2×SE对比0×SE,OR值[95%CI]:2.048[1.127,3.722])。
DAS28缓解
在PBO+MTX受试者中,SE拷贝数对于DAS28缓解无效应(表5)。但是,在具有提高拷贝的SE的ADA+MTX受试者中观察到了提高的DAS28反应率的模式(表5)。此外,根据多元回归,在PBO+MTX或ADA+MTX组中SE拷贝数对于DAS28缓解无显著效应。
IL-4R等位基因
ACR50
对于接受ADA+MTX或PBO+MTX的受试者IL-4R等位基因对于第26周的ACR50无明显影响(表6)。
DAS28缓解
对于PBO+MTX或ADA+MTX治疗组中的受试者IL-4R等位基因不影响第26周DAS28缓解反应率(表7)。多元回归支持了这些观察,其中IL-4R等位基因对于任一治疗反应变量无显著效应。
结合的等位基因效应
与来自单个组分分析的发现相一致,使用ADA+MTX治疗的患者中ACR50和DAS28反应率在存在至少1个拷贝的SE的情况下有所增强,而IL-4R AA等位基因纯合的受试者除外(图6、7和8)。SE和IL-4R等位基因组合对于PBO+MTX的反应率不具有一致的影响模式(数据未示出)。
总之,治疗组中受试者对于0、1或2个拷贝的HLA-DRB1 SE表现出相当的分布(分别为,PBO+MTX:37%、48%、15%;ADA+MTX:33%、49%、19%,P=0.28)。类似地,IL-4R等位基因AA、AG和GG在治疗组间类似地分布(分别为,PBO+MTX:29%、52%、20%;ADA+MTX:33%、47%、20%,P=0.38)。但是,FcγRIIb等位基因与此不同在治疗组间相当地分布,因而未对该SNP进行下面的分析(进一步的分析提供于下文实施例4中)。SE的存在并未影响对于单独使用MTX进行治疗的反应(如,对于0、1或2个拷贝ACR50为40%、33%和29%,P=0.23)。相反,在接受ADA+MTX的受试者中治疗反应率随着SE的拷贝增加而相应地增强(对于0、1、2个SE,ACR50为42%、53%和65%,P=0.004)。因此,对于ADA+MTX受试者,1个拷贝的SE的存在相对于PBO+MTX组产生了20%的ACR50提高(P<0.001),并且在ADA+MTX中2个拷贝的SE相对于PBO+MTX提高ACR5036%(P<0.001)。类似地,对于MTX的临床反应未受到IL-4R等位基因的影响,而在具有AA或AG IL-4R等位基因的受试者中使用ADA+MTX的治疗结果有所增强。在PBO+MTX组中,对于SE和IL-4R等位基因组合的治疗反应的检验并未因基因型而在治疗反应中显示出变化,这支持了自单个等位基因分析获得的结果。在SE不存在的情况下IL-4R基因型影响了ADA+MTX的治疗反应,而SE的存在掩盖了IL-4R等位基因的效果(参见上文表8)。
结论
据发现,与使用ADA+MTX进行治疗相比于使用PBO+MTX在26周治疗中达到ACR50或DAS28提供了显著的优势。即使考虑了基线人口学统计和疾病状态变量,HLA-DRB1共同表位对于治疗反应(ACR50)显示出显著效果。此外,IL-4R在多元回归中对于ACR50或DAS28缓解反应未表现出明显的效果。因此,对影响TNFα抑制剂拮抗剂的治疗反应的遗传成分的了解可有助于指导治疗决策。
综上所述,对于阿达木单抗加甲氨蝶呤的临床反应独立地受到所述HLA-DRB1共同表位和IL-4R等位基因的影响,而在对于甲氨蝶呤单一疗法的反应上基因型不存在影响。因此,在对使用阿达木单抗加甲氨蝶呤进行治疗的反应中,所述HLA-DRB1共同表位与IL-4R等位基因之间存在相互作用。
实施例4:在患有早期类风湿性关节炎的患者中HLA-DRB1、IL-4R和FcγRIIb在对阿达木单抗加甲氨蝶呤的治疗反应的遗传影响:26周的OPTIMA结果
已知遗传因素影响类风湿性关节炎的表现、严重性和放射性进展。它们对抗TNFα剂治疗反应的效应不甚明了。
本研究的目的在于按照三种候选基因座检验在26周的治疗后对于阿达木单抗加甲氨蝶呤(ADA+MTX)或安慰剂(PBO)+MTX的反应:HLA-DRB1共同表位(SE)、IL-4R I50V变体和FcγRIIb I232T多态性。
方法
具有<1年的RA和活动性疾病(DAS28>3.2、ESR≥28mm/h或CRP≥1.5mg/dL)及或者>1的侵蚀、RF+或者抗CCP+的年龄≥18岁的MTX初治患者在26周中经随机分为ADA+MTX(N=515)或PBO+MTX(N=517)。本分析提供了HLA-DRB1 SE拷贝数(0×、1×或2×)、IL-4RI50V(AA、AG或GG)和FcγRIIb I232T(TT、TC、CC)等位基因的26周的临床结果。使用非应答归因计算达到ACR20/50/70和DAS28低疾病活动性(LDA,DAS28<3.2)和缓解(DAS28<2.6)的患者的百分比。使用多元逻辑回归评估潜在的混淆性基线变量的影响。分类基线解释变量(categorical baseline explanatory variable)包括性别、吸烟者、RF(>50或≤50IU)、抗CCP(≥3×或<3×ULN)、CRP(≥1.5或<1.5mg/dl)以及侵蚀的存在(0或>0)。还包括基线TJC68、SJC66和DAS28的连续值。
结果:
在本亚研究中,分别有451和443名随机分为PBO+MTX或ADA+MTX的患者可获得遗传数据。对于SE和IL-4R,治疗组间的等位基因分布是类似的。在(PBO-MTX)对比(ADA+MTX)的两个治疗组中患者间FcγRIIb等位基因是不均等地分布的,因为PBO+MTX组具有更多的TC和更少的CC FcγRIIb患者。在两个治疗组间未进行针对FcγRIIb的比较;然而,在单一组内分析全部三种FcγRIIb基因型对各自治疗的反应的影响是可能的。
对于各基因座,在等位基因间基线人口统计学是类似的。注意到具有更多拷贝SE的患者中抗CCP+患者的比例较高。
对ADA+MTX的反应随着提高的SE拷贝数而提高,随着IL-4R-GG而降低,并且随着FcγRIIb-CC而提高。对于PBO+MTX组中的患者检测到了相反的模式(如,DAS28<3.2,图9)。
由于这一差异,在各治疗组中进行了多元逻辑回归。在对使用PBO+MTX进行治疗的反应中,SE拷贝数显示了对于ACR20和ACR50的显著负面效应。IL-4R和FcγRIIb未能显示出对于PBO+MTX的26周反应的显著相关性。
在ADA+MTX反应的模型中,SE拷贝数与达到ACR20/50/70和DAS28 LDA显著相关。优势比(odds ratio)表明,具有2个拷贝的SE的患者达到这些目标的可能性是具有0个SE等位基因的患者的大约2倍。单独的IL-4R对ADA+MTX的26周治疗反应没有影响。FcγRIIb-CC显著地与达到ACR70和DAS28缓解相关,其优势比高于FcγRIIb-TC 10倍。综合来说,SE拷贝数的效应果在IL-4R-AA和FcγRIIb-TT野生型背景中被消除,但当存在至少一个拷贝的IL-4R或FcγRIIb遗传变体时所述效应是明显的。
总而言之,无论遗传背景如何,与PBO+MTX相比,ADA+MTX组中的患者的治疗反应率更高。根据多元逻辑回归模型,单独IL-4R与治疗结果不相关。所述HLA-DRB1 SE和FcγRIIb是对ADA+MTX治疗反应的独立的显著正向预测因子。这些基因座之间的潜在相互作用证明需要对这些遗传组分在对抗TNFα剂的反应中的作用进行进一步探索,尽管通过本文提供的数据已经明了HLA-DRB1 SE和FcγRIIb单独或组合(和/或与IL-4R进一步组合)均是患者对于TNFα抑制剂治疗的反应的预测因子。
等同
本领域的技术人员应了解或能够仅使用常规实验便可确定本文所述的本发明特定实施方案的大量等同物。这些等同物意在由下列权利要求所涵盖。
参考文献
1.Disease Activity Score(DAS)in Rheumatoid Arthritis.[网站]http://www.das-score.nl/www.das-score.nl/index.html 2006年8月21日上线。
2.John M.Davis III y Eric L.Matteson.Reumatol Clin.2009;5(4):143-146。
Claims (45)
1.一种预测患有类风湿性关节炎(RA)的受试者对于TNFα抑制剂治疗的反应性的方法,所述方法包括确定来自所述受试者的样品中HLA-DRB1共同表位(HLA-DRB1 SE)等位基因的存在,其中至少一个拷贝的所述HLA-DRB1 SE等位基因的存在表示所述受试者对于所述TNFα抑制剂治疗具有反应性。
2.一种用于治疗患有类风湿性关节炎(RA)的受试者的方法,其包括对所述受试者施用TNFα抑制剂以用于治疗RA,前提是在来自所述受试者的样品中存在至少一个拷贝的HLA-DRB1共同表位(HLA-DRB1SE)等位基因。
3.一种确定TNFα抑制剂对于治疗患有类风湿性关节炎(RA)的受试者是否有效的方法,所述方法包括检测来自所述受试者的样品中至少一个拷贝的HLA-DRB1共同表位(HLA-DRB1 SE)等位基因的存在,其中所述HLA-DRB1 SE等位基因的存在表示所述TNFα抑制剂对于所述受试者的RA治疗是有效的。
4.根据权利要求1、2或3中任一项所述的方法,其中通过分析所述样品中的核酸或蛋白质而测定所述HLA-DRB1 SE等位基因的存在。
5.根据权利要求1、2或3中任一项所述的方法,其中使用选自由微阵列分析、DNA测序或PCR技术所组成的组的分析方法测定所述HLA-DRB1 SE等位基因的存在。
6.根据权利要求1、2或3中任一项所述的方法,其进一步包括确定来自所述受试者的样品中IL-4R I50等位基因的存在,其中所述IL-4R I50等位基因(AA或AG)在所述样品中的存在表示所述受试者对于所述TNFα抑制剂的治疗具有反应性。
7.根据权利要求1、2或3中任一项所述的方法,其进一步包括确定来自所述受试者的样品中两个FcγRIIb T232等位基因(FcγRIIb-CC)的存在,其中在所述样品中两个FcγRIIb T232等位基因(FcγRIIb-CC)的存在表示所述受试者对于所述TNFα抑制剂的治疗具有反应性。
8.根据权利要求7所述的方法,其进一步包括确定来自所述受试者的样品中IL-4R I50等位基因的存在,其中所述IL-4R I50等位基因(AA或AG)在所述样品中的存在表示所述受试者对于所述TNFα抑制剂的治疗具有反应性。
9.一种预测患有RA的受试者对于TNFα抑制剂的治疗的反应性的方法,所述方法包括测定来自所述受试者的样品中FcγRIIb T232等位基因的拷贝数,其中两个拷贝的所述FcγRIIb T232等位基因(FcγRIIb-CC)的存在表示所述受试者对于所述TNFα抑制剂的治疗具有反应性。
10.一种用于治疗患有类风湿性关节炎(RA)的受试者的方法,其包括对所述受试者施用TNFα抑制剂以用于治疗RA,前提是在来自所述受试者的样品中存在两个拷贝的FcγRIIb T232等位基因(FcγRIIb-CC)。
11.一种用于确定TNFα抑制剂对于治疗患有类风湿性关节炎(RA)的受试者是否有效的方法,所述方法包括测定来自所述受试者的样品中FcγRIIb T232等位基因的拷贝数,其中两个拷贝的所述FcγRIIbT232等位基因(FcγRIIb-CC)的存在表示所述TNFα抑制剂对于所述受试者的RA治疗是有效的。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的方法,其中通过分析所述样品中的核酸或蛋白质而确定所述FcγRIIb T232等位基因的存在。
13.根据权利要求9-11中任一项所述的方法,其中使用选自由微阵列分析、DNA测序或PCR技术所组成的组的分析方法确定所述FcγRIIb T232等位基因的存在。
14.一种预测患有RA的受试者对于TNFα抑制剂的治疗的反应性的方法,所述方法包括测定来自所述受试者的样品中IL-4R V50等位基因的拷贝数,其中两个拷贝的所述IL-4R V50等位基因(GG)在所述样品中的存在表示所述受试者对于所述TNFα抑制剂的治疗不具有反应性,除非所述受试者还具有至少一个拷贝的HLA-DRB1 SE等位基因。
15.根据权利要求14所述的方法,其中通过分析所述样品中的核酸或蛋白质而测定所述IL-4R V50等位基因的拷贝数。
16.根据权利要求14所述的方法,其中使用选自由微阵列分析、DNA测序或PCR技术所组成的组的分析方法测定所述IL-4R V50等位基因的拷贝数。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法,其中所述TNFα抑制剂是抗TNFα抗体或其抗原结合部分,或融合蛋白。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述融合蛋白是依那西普。
19.根据权利要求17所述的方法,其中所述抗TNFα抗体或其抗原结合部分选自由人抗体、嵌合抗体、人源化抗体和多价抗体所组成的组。
20.根据权利要求19所述的方法,其中所述抗TNFα嵌合抗体或其抗原结合部分是英夫利昔单抗。
21.根据权利要求19所述的方法,其中所述抗TNFα人抗体或其抗原结合部分是阿达木单抗或戈利木单抗。
22.根据权利要求19所述的方法,其中所述抗TNFα人抗体或其抗原结合部分是分离的人抗体,根据表面等离子体共振测定其以1×10-8M或更低的Kd以及1×10-3s-1或更低的速率常数koff与人TNFα解离,并且其在标准的体外L929分析中以1×10-7M或更低的IC50中和人TNFα细胞毒性。
23.根据权利要求19所述的方法,其中所述抗TNFα人抗体或其抗原结合部分是分离的人抗体,其具有以下特征:
a)根据表面等离子体共振测定,以1×10-3s-1或更低的速率常数koff与人TNFα解离;
b)具有包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由在第1、4、5、7或8位上的单丙氨酸置换或由在1、3、4、6、7、8和/或9位上的1至5个保守氨基酸置换而从SEQ ID NO:3修饰而成的氨基酸序列的轻链CDR3结构域;以及
c)具有包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由在第2、3、4、5、6、8、9、10或11位上的单丙氨酸置换或由在2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12位上的1至5个保守氨基酸置换而从SEQ ID NO:4修饰而成的氨基酸序列的重链CDR3结构域。
24.根据权利要求19所述的方法,其中所述人抗TNFα抗体或其抗原结合部分是分离的人抗体,其具有包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)以及包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法,其中所述受试者经诊断患有病程少于1年的RA。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法,其中所述受试者具有>3.2的DAS28。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法,其中对所述受试者进一步施用MTX。
28.根据权利要求1、3、9和11中任一项所述的方法,其中所述方法测定或预测所述受试者的临床反应性。
29.一种用于预测受试者对于TNFα抑制剂治疗类风湿性关节炎(RA)的反应性的试剂盒,所述试剂盒包括
用于确定来自所述受试者的样品中HLA-DRB1 SE等位基因的存在的工具,以及
根据所述HLA-DRB1 SE等位基因的存在而对所述受试者推荐治疗的指导,其中所述HLA-DRB1 SE等位基因的存在表示所述受试者对于所述TNFα抑制剂的RA治疗具有反应性。
30.根据权利要求29所述的试剂盒,其中用于确定所述HLA-DRB1 SE等位基因的存在的工具包括以下两者任一
与编码HLA-DRB1 SE的核酸分子或其包含所述SE区域的部分杂交的核酸,或
特异性地结合与HLA-DRB1 SE对应的蛋白质的抗体。
31.根据权利要求29或30所述的试剂盒,其进一步包括
用于检测来自所述受试者的样品中IL-4R I50等位基因的存在的工具,以及
根据所述IL-4R I50等位基因的存在而对所述受试者推荐治疗的指导,其中所述IL-4R I50等位基因和所述HLA-DRB1 SE等位基因的共同存在表示所述受试者对于TNFα抑制剂的RA治疗具有反应性。
32.一种用于预测或评估受试者对于TNFα抑制剂治疗类风湿性关节炎(RA)的反应性的试剂盒,所述试剂盒包括
a)用于确定来自所述受试者的样品中FcγRIIb T232等位基因的存在的工具,以及
b)根据两个FcγRIIb T232等位基因(FcγRIIb-CC)的存在而对所述受试者推荐治疗的指导,其中所述两个FcγRIIb T232等位基因的存在表示所述受试者对于所述TNFα抑制剂的RA治疗具有反应性。
33.根据权利要求32所述的试剂盒,其中所述用于确定FcγRIIbT232等位基因的存在的工具包括以下两者任一
与编码FcγRIIb T232的核酸分子或其包含I232T SNP的部分杂交的核酸,或
特异性地结合与FcγRIIb T232蛋白质对应的蛋白质的抗体。
34.根据权利要求32或33所述的试剂盒,其进一步包括
用于检测来自所述受试者的样品中IL-4R I50等位基因的存在的工具,以及
根据所述IL-4R I50等位基因的存在而对所述受试者推荐治疗的指导,其中所述IL-4R I50等位基因和所述FcγRIIb-CC等位基因的共同存在表示所述受试者对于所述TNFα抑制剂的RA治疗具有反应性。
35.根据权利要求34所述的试剂盒,其进一步包括
用于检测来自所述受试者的样品中HLA-DRB1 SE等位基因的存在的工具,以及
根据所述HLA-DRB1 SE等位基因的存在而对所述受试者推荐治疗的指导,其中所述FcγRIIb-CC等位基因、所述IL-4R I50等位基因以及所述HLA-DRB1 SE等位基因的共同存在表示所述受试者对于所述TNFα抑制剂的RA治疗具有反应性。
36.根据权利要求32或33所述的试剂盒,其进一步包括
用于检测来自所述受试者的样品中HLA-DRB1 SE等位基因的存在的工具,以及
根据所述HLA-DRB1 SE等位基因的存在而对所述受试者推荐治疗的指导,其中所述FcγRIIb-CC等位基因和所述HLA-DRB1 SE等位基因的共同存在表示所述受试者对于所述TNFα抑制剂的RA治疗具有反应性。
37.根据权利要求29-36中任一项所述的试剂盒,其进一步包括用于从所述受试者中获得所述样品的工具。
38.根据权利要求29-37中任一项所述的试剂盒,其中所述TNFα抑制剂是抗TNFα抗体或其抗原结合部分,或融合蛋白。
39.根据权利要求38所述的试剂盒,其中所述融合蛋白是依那西普。
40.根据权利要求38所述的试剂盒,其中所述抗TNFα抗体或其抗原结合部分选自由人抗体、嵌合抗体、人源化抗体和多价抗体所组成的组。
41.根据权利要求40所述的试剂盒,其中所述抗TNFα嵌合抗体或其抗原结合部分是英夫利昔单抗。
42.根据权利要求40所述的试剂盒,其中所述抗TNFα人抗体或其抗原结合部分是阿达木单抗或戈利木单抗。
43.根据权利要求40所述的试剂盒,其中所述抗TNFα人抗体或其抗原结合部分是分离的人抗体,根据表面等离子体共振测定,其以1×10-8M或更低的Kd以及1×10-3s-1或更低的速率常数koff与人TNFα解离,并且其在标准的体外L929分析中以1×10-7M或更低的IC50中和人TNFα细胞毒性。
44.根据权利要求40所述的试剂盒,其中所述抗TNFα人抗体或其抗原结合部分是分离的人抗体,其具有以下特征:
a)根据表面等离子体共振测定,以1×10-3s-1或更低的速率常数koff与人TNFα解离;
b)具有包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由在第1、4、5、7或8位上的单丙氨酸置换或由在1、3、4、6、7、8和/或9位上的1至5个保守氨基酸置换而从SEQ ID NO:3修饰而成的氨基酸序列的轻链CDR3结构域;以及
c)具有包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由在第2、3、4、5、6、8、9、10或11位上的单丙氨酸置换或由在2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12位上的1至5个保守氨基酸置换而从SEQ ID NO:4修饰而成的氨基酸序列的重链CDR3结构域。
45.根据权利要求40所述的试剂盒,其中所述抗TNFα人抗体或其抗原结合部分是分离的人抗体,其具有包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)以及包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)。
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