CN107922975A - 治疗眼科病症的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的特征在于识别患者可能对抗VEGF治疗有反应的方法。此外,在那些被识别为不包括一种或多种上述眼科反应标志物的患者中,本发明的特征在于用EPO拮抗剂(例如,单独或与VEGF拮抗剂组合)进行治疗。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年8月12日提交的美国临时申请No.62/204,115的权益,在此通过引用将其并入本文。
技术领域
本公开涉及用于治疗罹患眼科病症的患者的预测方法、个性化治疗、试剂盒、可传递形式的信息以及方法。
背景技术
糖尿病性视网膜病变(DR)是糖尿病的微血管并发症,具有复杂的多因素发病机制。越来越多的证据表明遗传因素对不依赖于血糖控制(glycemic control)和糖尿病的持续时间的DR的易感性的重要意义。与DR风险相关的最显著的遗传因素是促红细胞生成素(EPO)基因(rs1617640)中的功能多态性。这个多态性位于EPO启动子区域,并且在三个欧美人群(cohort)中T等位基因与增殖型DR(PDR)显著相关。荧光素酶启动子测定显示与G等位基因相比,T等位基因造成报道子表达增加了25倍。另外,具有TT基因型的正常个体的人玻璃体内EPO浓度比具有GG基因型的个体的玻璃体内EPO浓度高7.5倍。
EPO是在糖尿病人和小鼠眼中观察到的有效的血管生成因子。EPOmRNA浓度在缺血诱导的视网膜新血管形成的小鼠模型中增加,并且该新血管形成通过抑制EPO来抑制。在PDR眼的新血管组织中强烈检测到EPO受体免疫反应性。
发明概述
一方面,本发明的特征在于选择性治疗罹患眼科病症的患者的方法,包括基于具有一种或多种眼科反应标志物的患者,向患者选择性施用治疗有效量的VEGF拮抗剂,该眼科反应标志物包括:在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶之外的核苷酸的单个等位基因,在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶之外的核苷酸的两个等位基因,在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的单个等位基因以及在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的两个等位基因。
另一方面,本发明的特征在于选择性治疗罹患眼科病症的患者的方法,包括基于具有在基因座rs1617640处具有胸腺嘧啶的至少一个等位基因(例如,在基因座rs1617640处具有胸腺嘧啶的两个等位基因)的患者,向患者选择性施用治疗有效量的EPO拮抗剂,或施用VEGF拮抗剂和EPO拮抗剂的组合。
另一方面,本发明的特征在于用VEGF拮抗剂选择性治疗罹患眼科病症的患者的方法,包括:
a)基于具有一种或多种眼科反应标志物的患者,选择用VEGF拮抗剂治疗的患者,该眼科反应标志物选自:在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的单个等位基因,在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的两个等位基因,在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的单个等位基因和在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的两个等位基因;和
b)此后,向患者施用治疗有效量的VEGF拮抗剂。
另一方面,本发明的特征在于用EPO拮抗剂,或用VEGF拮抗剂和EPO拮抗剂的组合选择性治疗罹患眼科病症的患者的方法,包括:
a)基于具有在基因座rs1617640处具有胸腺嘧啶的至少一个等位基因(例如,两个等位基因)的患者,选择用VEGF和EPO拮抗剂治疗的患者;和
b)此后,向患者施用治疗有效量的VEGF拮抗剂和/或EPO拮抗剂。
另一方面,本发明的特征在于用VEGF拮抗剂选择性治疗罹患眼科病症的患者的方法,包括:
a)测定来自患者的生物样品中的一种或多种眼科反应标志物,该眼科反应标志物选自:在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的单个等位基因,在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的两个等位基因,在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的单个等位基因和在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的两个等位基因;和
b)此后,向患者选择性施用VEGF拮抗剂。
另一方面,本发明的特征在于用EPO拮抗剂,或用VEGF拮抗剂与EPO拮抗剂的组合选择性治疗罹患眼科病症的患者的方法,包括:
a)测定来自患者的生物样品中至少一个在基因座rs1617640处具有胸腺嘧啶的等位基因(例如,两个等位基因);和
b)此后,向患者选择性施用VEGF拮抗剂和/或EPO拮抗剂。
另一方面,本发明的特征在于用VEGF拮抗剂选择性治疗罹患眼科病症的患者的方法,包括:
a)测定来自患者的生物样品中的一种或多种眼科反应标志物,该眼科反应标志物选自:在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的单个等位基因,在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的两个等位基因,在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的单个等位基因和在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的两个等位基因;
b)此后,基于来自具有一种或多种眼科反应标志物的患者的生物样品,选择用VEGF拮抗剂治疗的患者,该眼科反应标志物选自:在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶之外的核苷酸的单个等位基因,在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶之外的核苷酸的两个等位基因,在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的单个等位基因和在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的两个等位基因;和
c)此后,施用治疗有效量的VEGF拮抗剂。
另一方面,本发明的特征在于用EPO拮抗剂,或用VEGF拮抗剂与EPO拮抗剂的组合选择性治疗罹患眼科病症的患者的方法:
a)测定来自患者的生物样品中在基因座rs161764处具有胸腺嘧啶的至少一个等位基因(例如,两个等位基因);
b)此后,基于来自具有在基因座rs161764处具有胸腺嘧啶的至少一个等位基因的患者的生物学样品,选择用VEGF拮抗剂和EPO拮抗剂的组合治疗的患者;和
c)此后,施用治疗有效量的VEGF拮抗剂和/或EPO拮抗剂。
另一方面,本发明的特征在于用于治疗罹患眼科病症的患者的VEGF拮抗剂,其特征在于基于具有一个或多个眼科反应标志物的患者,向患者施用治疗有效量的VEGF拮抗剂,该眼科反应标志物包括:在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的单个等位基因,在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶之外的核苷酸的两个等位基因,在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的单个等位基因和在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的两个等位基因。
在一个相关的方面,本发明的特征在于用于治疗罹患眼科病症的患者的EPO拮抗剂,其特征在于基于在基因座rs1617640处具有胸腺嘧啶的至少一个等位基因(例如,两个等位基因)的患者,向患者施用治疗有效量的EPO拮抗剂。
另一方面,本发明的特征在于预测罹患眼科病症的患者将对用VEGF拮抗剂治疗有反应的可能性的方法,包括测定来自患者的生物样品中存在或不存在一种或多种眼科反应标志物,该眼科反应标志物包括:在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的单个等位基因,在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶之外的核苷酸的两个等位基因,在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的单个等位基因和在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的两个等位基因。
另一方面,本发明的特征在于预测罹患眼科病症的患者将对EPO拮抗剂或VEGF拮抗剂与EPO拮抗剂的组合的治疗有反应的可能性的方法,包括测定来自患者的生物样品针对在基因座rs1617640处具有胸腺嘧啶的至少一个等位基因(例如,两个等位基因)的存在或不存在。
在另一方面,本发明的特征在于产生用于预测罹患眼科病症的患者对用VEGF拮抗剂治疗的反应性的可传递形式的信息的方法,包括基于一个或多个眼科反应标志物的存在,确定患者对VEGF拮抗剂治疗的反应增加的可能性,该眼科反应标志物选自:在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的单个等位基因,在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的两个等位基因,在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的单个等位基因和在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的两个等位基因,并将确定步骤的结果记录在有形或无形介质形式上用于传递。
在另一方面,本发明的特征在于产生用于预测罹患眼科病症的患者对用EPO拮抗剂,或用VEGF拮抗剂和EPO拮抗剂的组合治疗的反应性的可传递形式的信息的方法,包括基于在基因座rs1617640处具有胸腺嘧啶的至少一个等位基因(例如,两个等位基因)的存在,确定患者对用EPO拮抗剂,或用VEGF拮抗剂和EPO拮抗剂的组合治疗的反应增加的可能性,并将确定步骤的结果记录在有形或无形介质形式上用于传递。
在另一实施方案中,本发明的特征在于确定具有视网膜病症的个体对用VEGF拮抗剂治疗的反应性的方法,该方法包括:
(i)从患有视网膜病症的个体分离样品;
(ii)进行检测一种或多种眼科反应标志物的测定,该眼科反应标志物选自在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的单个等位基因,在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的两个等位基因,在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的等位基因和在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的两个等位基因;
(iii)如果样品中存在一种或多种眼科反应标志物,则将该个体指定为VEGF拮抗剂反应者。
而且,本发明的特征在于确定具有视网膜病症的个体对用EPO拮抗剂治疗的反应性的方法,该方法包括:
(i)从患有视网膜病症的个体分离样品;
(ii)进行检测在基因座rs1617640处具有胸腺嘧啶的至少一个等位基因的存在的测定;
(iii)如果样品中存在眼科反应标志物,则将该个体指定为EPO拮抗剂反应者。
此外,本发明的某些方面的特征在于确定患有视网膜病症的个体是否应该用VEGF拮抗剂治疗的方法,该方法包括:
(i)从个体中分离样品;
(ii)进行检测在基因座rs1617640处具有胸腺嘧啶的至少一个等位基因的存在的测定;
(iii)确定个体应该用VEGF拮抗剂治疗。
另一方面,本发明的特征在于患有视网膜病症的个体是否应该用VEGF拮抗剂治疗的方法,该方法包括:
(i)从个体中分离样品;
(ii)进行检测一种或多种眼科反应标志物的检测,该眼科反应标志物选自在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的单个等位基因,在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的两个等位基因,在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的等位基因和在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的两个等位基因;
(iii)确定个体应该用VEGF拮抗剂治疗。
而且,在某些方面,本发明的特征在于用于预测对VEGF拮抗剂的反应的试剂盒,该试剂盒包含检测一种或多种眼科反应标志物所必需的试剂,该眼科反应标志物选自在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的单个等位基因,在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸,在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的单个等位基因以及在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的两个等位基因。
最后,在某些方面,本发明的特征在于用于预测对VEGF拮抗剂的反应的试剂盒,该试剂盒包括检测在基因座rs1617640处具有胸腺嘧啶的至少一个等位基因(例如,两个等位基因)的存在所必需的试剂。
上述方法可以可选地还包括从患者获得生物样品的步骤,其中获得步骤在检测步骤之前进行。
前述测定步骤中的任一个可以优选地包括测定生物样品中包括基因座rs161764和/或基因座rs2010963的基因组序列。这种测定可以是例如聚合酶链反应(PCR)、基于TaqMan的测定、直接测序、动态等位基因特异性杂交、高密度寡核苷酸SNP阵列、限制性片段长度多态性(RFLP)测定、引物延伸测定、寡核苷酸连接酶测定、分析单链构象多态性、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、变性高效液相层析、高分辨率熔解分析、DNA错配结合蛋白测定、毛细管电泳、Southern印迹、流式细胞术、HPLC和质谱分析法。生物样品可以包括例如滑液、血液、血清、粪便、血浆、尿、眼泪、唾液、脑脊液、白细胞样品和组织样品。
在任何上述方法中,眼科病症是黄斑变性(例如年龄相关性黄斑变性),糖尿病性黄斑水肿或糖尿病性视网膜病变。而且,在任何上述方法中,VEGF拮抗剂是VEGF结合分子或VEGF(例如VEGFA)受体结合分子。VEGF(例如VEGFA)结合分子可以是例如抗VEGFA抗体或其抗原结合部分或衍生物(例如贝伐单抗(bevacizumab)或雷珠单抗(ranibizumab),选自美国专利申请公开20120014958中所述的NVS4、NVS80、NVS81、NVS82、NVS83、NVS84和NVS85的抗体或其抗原结合部分或衍生物,或在美国专利申请公开20140186350中所述的VEGFA抗体或其抗原结合部分或衍生物。
此外,前述方法的抗EPO拮抗剂可以是例如抗体或抗原结合部分或其衍生物,例如具有如美国专利申请公开号2014/0199306中所公开的FabsNVS1、NVS2、NVS3或NVS4(包括抗体或其包括Fabs NVS1-4的衍生物)的CDR序列的抗体或其抗原结合部分或衍生物。
附图简述
图1是示出用治疗的DME患者中EPO基因型对BCVA反应的影响的图。
图2是示出用和激光治疗的DME患者中EPO基因型对BCVA反应的影响的图。
图3是示出用激光治疗的DME患者中EPO基因型对BCVA反应的影响的图。
图4是示出用治疗的AMD患者中EPO基因型对BCVA反应的影响的图。
图5是示出用Lucentis和激光治疗的AMD患者中EPO基因型对BCVA反应的影响的图。
图6是示出在用治疗的DME患者中VEGF基因型对BCVA反应的影响的图。
图7是示出在用和激光治疗的DME患者中VEGF基因型对BCVA反应的影响的图。
图8是示出在用激光治疗的DME患者中VEGF基因型对BCVA反应的影响的图。
图9是示出在用治疗的AMD患者中VEGF基因型对BCVA反应的影响的图。
图10是示出在用和激光治疗的AMD患者中VEGF基因型对BCVA反应的影响的图。
图11是示出在用治疗的AMD患者中EPO和VEGF基因型对BCVA反应的累加影响的图。
图12是示出用和激光治疗的AMD患者中EPO和VEGF基因型对BCVA反应的累加影响的图。
发明详述
本发明部分基于以下发现:在眼科病症的治疗(例如)中,某些基因组标志物(本文称为“眼科反应标志物”)对于抗VEGF疗法的结果具有预测性。具体而言,本发明人已经发现人促红细胞生成素启动子中的多态性对抗VEGF治疗的功效的预测性。此外,本发明人发现,单独VEGF的5'UTR中的特定多态性或与EPO多态性组合的存在提供了关于对抗VEGF疗法的预测反应的额外信息。因此,本发明的特征在于识别患者可能对抗VEGF治疗有反应的方法。此外,在那些被识别为不包括一种或多种上述眼科反应标志物的患者中,本发明的特征在于用EPO拮抗剂(例如,单独或与VEGF拮抗剂组合)进行治疗。
具体而言,本发明部分基于这样的观察,即在单独使用VEGF拮抗剂的治疗(例如在患有年龄相关的黄斑变性的个体中)对具有在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的至少一个等位基因的患者更有效。此外,在这种患者中用VEGF拮抗剂治疗在具有在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的两个等位基因的患者中甚至更有效。本发明还部分基于这样的观察,即VEGF[5'UTR]中的多态性是抗VEGF单一疗法的功效的进一步预测因子。在这种情况下,在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的单个等位基因的存在表明VEGF单一疗法的功效增加,而具有该鸟嘌呤的两个等位基因则表明更高的功效。最后,本发明是基于这样的观察,即总体上,在基因座rs1617640和rs2010963处(例如在2、3或全部4个等位基因中)存在上述多态性(当与没有两种多态性组合的个体进行比较时),代表抗VEGF单一疗法的功效的更大可能性。
此外,本发明的特征在于预测患者的基因座rs1617640处的一个或多个等位基因中胸腺嘧啶的存在表明用EPO拮抗剂治疗的功效。在此,本发明的特征在于用单独的EPO拮抗剂或用EPO拮抗剂与VEGF拮抗剂组合治疗这些患者(例如那些具有年龄相关的黄斑变性的患者)。
除非另行指出,否则与数值x有关的术语“约”是指+/-10%。
如本文所使用的,术语“个体”和“患者”包括任何人。
术语“测定”用于指识别、筛选、探查、测试测量或确定的行为,该行为可以通过任何常规手段来执行。例如,可以通过使用ELISA测定、Northern印迹、成像、基因测序、表型分析、单元型分析、质谱分析等来测定样品中是否存在特定的遗传标记。术语“检测”(及类似)意指从给定来源提取特定信息的行为,这可以是直接的或间接的。在本文公开的预测方法的一些实施方案中,通过例如查询数据库间接检测在生物样品中给定物(例如,等位基因等)的存在。术语“测定”和“确定”考虑物质的转化,例如借助将该样品进行物理测试,将生物样品(例如血液样品或其他组织样品)从一种状态转化为另一种状态。
术语“获得”意指例如通过物理干预(例如,活组织检查、抽血)或非物理干预(例如经由服务器传递信息)等以任何方式获得拥有权。
使用短语“测定生物样品...”等类似短语来意指可测试(直接地或间接地)样品中给定的眼科反应标志物的存在或不存在。将会被理解的是:在一种物质存在表示一种概率而一种物质不存在表示不同的概率的情形中,则可使用这样的物质的存在或不存在来指导治疗决定。例如,通过确定在患者中特定反应等位基因的实际存在或通过确定在患者中特定反应等位基因的不存在,可确定患者是否具有眼科反应标志物。在这样的两个情形中,已经确定该患者是否具有眼科反应标志物的存在。
术语“VEGF”是指人VEGF-A,并且包括VEGF-A的多态性变体和VEGF-A的功能等同物。根据本公开的VEGF-A的功能等同物优选与野生型VEGFA具有至少约85%、95%、96%、97%、98%或甚至99%的总体序列同一性。
如本文所用的“VEGF拮抗剂”是指能够拮抗(例如,降低、抑制、减少、延迟)VEGF功能、表达和/或信号传导(例如通过阻断VEGF与VEGF受体的结合)的分子。VEGF拮抗剂的非限制性实例包括VEGF结合分子和VEGF受体结合分子。在公开的方法、方案、试剂盒、工艺、用途和组合物的一些实施方案中,使用VEGF拮抗剂。
“VEGF结合分子”意指能够单独或与其他分子组合来结合人VEGF抗原的任何分子。结合反应可以通过标准方法(定性测定)来显示,包括例如结合测定、竞争测定或用于测定VEGF与其受体结合的抑制的生物测定或任何种类的结合测定,其参照阴性对照测试,其中具有不相关的特异性但理想地是相同同种型的抗体。VEGF结合分子的非限制性实例包括小分子、VEGF受体诱饵(decoy),和由B细胞或杂交瘤产生的与VEGF结合的抗体、或其嵌合抗体、CDR移植抗体或人抗体或任何片段(例如F(ab’)2和Fab片段),以及单链或单结构域抗体。优选地,VEGF结合分子拮抗(例如降低、抑制、减少、延迟)VEGF功能、表达和/或信号传导。在公开的方法、方案、试剂盒、工艺、用途和组合物的一些实施方案中,使用VEGF结合分子。
“VEGF受体结合分子”意指能够单独与其他分子组合来结合人VEGF受体的任何分子。结合反应可以通过标准方法(定性测定)来显示,包括例如结合测定、竞争测定或用于确定VEGF受体对VEGF的结合抑制的生物测定或任何种类的结合测定,其参照阴性对照,其中使用不相关的特异性但理想地是相同同种型的抗体。VEGF受体结合分子的非限制性实例包括小分子、VEGF受体诱饵和由B细胞或杂交瘤产生的与VEGF结合的抗体,及其嵌合抗体、CDR移植抗体或人抗体或任何片段(例如F(ab’)2和Fab片段),以及单链或单结构域抗体。优选地,VEGF受体结合分子拮抗(例如降低、抑制、减少、延迟)VEGF功能、表达和/或信号传导。在公开的方法、方案、试剂盒、工艺、用途和组合物的一些实施方案中,使用VEGF受体结合分子。
术语“Epo蛋白”或“Epo抗原”或“EPO”或“Epo”可互换使用,并是指不同物种中的促红细胞生成素蛋白。人、食蟹猴(cynomolgus)、小鼠、大鼠和兔Epo的蛋白质序列是公众可获得的。人EPO也可以被高度糖基化。
术语“Epo受体”或“EPOR”可互换使用,并是指促红细胞生成素受体蛋白质,并是指不同物种中的促红细胞生成素受体蛋白质。Winkelmann J.C.,Penny L.A.,Deaven L.L.,Forget B.G.,Jenkins R.B.Blood 76:24-30(1990)已经描述了EPOR。
如本文所用,“EPO拮抗剂”是指能够拮抗(例如降低、抑制、减少、延迟)EPO功能、表达和/或信号传导(例如通过阻断EPO与EPO受体的结合)的分子。EPO拮抗剂的非限制性例子包括EPO结合分子和EPO受体结合分子。在公开的方法、方案、试剂盒、工艺、用途和组合物的一些实施方案中,使用EPO拮抗剂。
“EPO结合分子”是意指能够单独或与其他分子组合来结合人EPO抗原的任何分子。结合反应可以通过标准方法(定性测定)显示,包括例如结合测定、竞争测定或生物测定以确定EPO与其受体结合的抑制或任何种类的结合测定,其参照阴性对照测试,其中具有不相关的特异性但理想地是相同同种型的抗体。VEGF结合分子的非限制性实例包括小分子、VEGF受体诱饵和由B细胞或杂交瘤产生的与VEGF结合的抗体,及其嵌合抗体、CDR移植抗体或人抗体或任何片段(例如F(ab’)2和Fab片段),以及单链或单结构域抗体。优选地,VEGF结合分子拮抗(例如降低、抑制、减少、延迟)VEGF功能、表达和/或信号传导。在公开的方法、方案、试剂盒、工艺、用途和组合物的一些实施方案中,使用VEGF结合分子。
如本文所提及的术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合部分或单链。天然存在的“抗体”是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分成高变区,称为高变区或互补决定区(CDR),散布有更保守的区域,称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成,从氨基末端到羧基末端依次排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。在公开的方法、方案、试剂盒、工艺、用途和组合物的一些实施方案中,使用针对VEGF、EPO、VEGF受体或EPO受体的抗体,优选针对VEGF或EPO的抗体。
本文使用的术语抗体的“抗原结合部分”是指保留特异性结合抗原(例如VEGF或EPO)的能力的抗体的片段。已经显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段进行。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的例子包括Fab片段,由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段;F(ab)2片段,包含在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段;由VH和CH1结构域组成的Fd片段;由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段;dAb片段(Ward等人,1989Nature 341:544-546),其由VH结构域组成;和分离的CDR。此外,尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码,但是可以使用重组方法通过合成接头连接,使得它们可以制成单一蛋白质链,其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv);参见例如Bird等人,1988Science 242:423-426;和Huston等,1988Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5879-5883)。这样的单链抗体也旨在包含在术语“抗体”中。单链抗体和抗原结合部分可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得,在公开的方法、方案、试剂盒、工艺、用途和组合物的一些实施方案中,使用抗VEGF或EPO抗体的单链抗体或抗原结合部分。
如本文所用,“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。如本文所用,术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单分子组合物的抗体分子的制备。如本文所用,术语“人抗体”旨在包括具有可变区的抗体,其中框架区和CDR区均源自人源序列。“人类抗体”不需要由人类、人类组织或人类细胞产生。本公开的人抗体可以包括不由人序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变,通过在抗体基因重组过程中体内的连接处的N核苷酸添加或通过体内体细胞突变)。
术语“KD”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的解离速率。这里使用的术语“KD”是指由Kd与Ka之比(即Kd/Ka)获得的解离常数,并表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可以使用本领域已经建立的方法来确定。用于确定抗体的KD的方法是通过使用表面等离振子共振,或者使用生物传感器系统如系统。
术语“亲和力”是指在单个抗原位点处抗体与抗原之间相互作用的强度。在每个抗原位点内,抗体“臂”的可变区在很多位点通过弱的非共价力与抗原相互作用;相互作用越多,亲和力就越强。评估抗体对各种物种的VEGF或EPO的结合亲和力的标准测定法是本领域已知的,包括例如ELISA、蛋白质印迹和RIA。抗体的结合动力学(例如结合亲和力)也可以通过本领域已知的标准测定来评估,例如通过Biacore分析。
如根据本领域已知和本文所述的方法确定的,“抑制”这些VEGF或EPO功能性质(例如,生物化学、免疫化学、细胞、生理学或其他生物学活性等)中的一种或多种的抗体将是被理解为涉及相对于不存在抗体时(或当存在不相关的特异性的对照抗体时)所见的特定活性的统计学显著降低。抑制VEGF或EPO活性的抗体影响统计学上显著的降低,例如至少约10%、至少50%、80%或90%的测量参数,并且在公开的方法、用途、工艺、试剂盒和组合物的某些实施方案中,所使用的VEGF或EPO抗体可以抑制VEGF或EPO功能活性的大于95%、98%或99%。
除非另有说明,术语“衍生物”用于定义VEGF或EPO拮抗剂的氨基酸序列变体和共价修饰(例如聚乙二醇化、脱酰胺化、羟基化、磷酸化、甲基化等)。“功能性衍生物”包括具有与所公开的VEGF或EPO拮抗剂相同的定性生物学活性的分子。功能衍生物包括本文公开的VEGF或EPO拮抗剂的片段和肽类似物。片段包含根据本公开的多肽序列内的区域,例如特定序列的区域。本文公开的VEGF和EPO拮抗剂的功能衍生物优选包含与本文公开的VEGF或EPO结合分子的VH和/或VL序列具有至少约65%、75%、85%、95%、96%、97%、98%或甚至99%总体序列同一性并且基本保留结合人VEGF或EPO的能力的VH和/或VL结构域。
短语“基本上相同”意指与特定参考序列相比,相关氨基酸或核苷酸序列(例如VH或VL结构域)将是相同的或具有非实质性差异(例如,通过保守氨基酸取代)。非实质性的差异包括轻微的氨基酸改变,例如在特定区域(例如VH或VL结构域)的5个氨基酸序列中1或2个取代(例如,保守取代,如丝氨酸交换苏氨酸,或在不参与抗体活性、结构完整性、补体固定等的位置的取代)。在抗体的情况下,第二抗体具有相同的特异性并且具有至少50%的亲和力。与本文公开的序列基本上相同的序列(例如至少约85%的序列同一性)也是本公开内容的一部分。在一些实施方案中,衍生物VEGF或EPO抗体的序列同一性可以是与公开的序列具有约90%或更高,例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。
关于天然多肽及其功能性衍生物的“同一性”在本文中定义为候选序列中与相应的天然多肽的残基相同的氨基酸残基,在比对序列和引入空位(并且不考虑任何保守性取代作为序列同一性的一部分)之后(如果需要的话)达到最大百分比同一性的百分比。N-或C-末端延伸或插入都不应被解释为减小同一性。用于比对的方法和计算机程序是众所周知的。百分比同一性可以通过标准比对算法确定,例如Altshul等人((1990)J.Mol.Biol.,215:403-410)描述的基本局部比对搜索工具(BLAST);Needleman等人的算法((1970)J.Mol.Biol.,48:444453);或Meyers等人的算法。((1988)Comput.Appl.Biosci.,4:1117)。一组参数可以是具有空位罚分12,空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blosum 62得分矩阵。也可以使用PAM120权重残基表,使用将空位长度罚分为12以及空位罚分4并入ALIGN程序(版本2.0)中的E.Meyers和W.Miller((1989)CABIOS,4:11-17)的算法确定两个氨基酸或核苷酸序列之间的百分比同一性。
“氨基酸”是指所有天然存在的L-α氨基酸,例如并且包括D-氨基酸。短语“氨基酸序列变体”是指与根据本公开内容的序列相比,其氨基酸序列具有一些差异的分子。氨基酸序列变体包括取代变体(在本发明的多肽中至少一个氨基酸残基被移除并且在相同位置插入不同氨基酸的那些)、插入变体(具有一个或多个氨基酸紧邻本发明多肽中特定位置的氨基酸处插入的多肽)和缺失变体(根据本公开在多肽中移除一个或多个氨基酸的多肽)。
术语“药学上可接受的”意指不干扰活性成分的生物活性的有效性的无毒材料。
与化合物(例如VEGF或EPO结合分子或另一种药剂)有关的术语“给药/施用”用于指通过任何途径将该化合物递送给患者。
如本文所用,“治疗有效量”是指在向患者(例如人)施用单剂量或多剂量时对于治疗、预防、防止发病、治愈、延缓、减轻病症或复发性病症的至少一种症状的严重性,或者对患者存活的延长超过不存在这种治疗的情况下的预期有效的VEGF或EPO拮抗剂的量。当应用于单独给药的单个活性成分时,该术语指该单独的成分。当应用于组合时,该术语是指导致治疗效果的活性成分的组合量,无论是连续或同时组合给药。
如本文所用,与视网膜血管疾病相关的任何病况或病症、与糖尿病性视网膜病相关的病况或病症和/或与黄斑水肿相关的病况或病症的术语“治疗(动词)”或“治疗(名词)”在一个方面是指改善疾病或病症(即,减缓或阻止或减少疾病的发展或其至少一种临床症状)。另一方面,“治疗(动词)”或“治疗(名词)”是指减轻或改善至少一个身体参数,包括那些患者可能无法辨别的身体参数。在又一个方面,“治疗(动词)”或“治疗(名词)”是指在身体上(例如稳定可辨别的症状)、生理上(例如稳定身体参数)或两者来调节疾病或病症。在又一方面,“治疗(动词)”或“治疗(名词)”是指预防或延迟疾病或病症的发作或发展或进展。涉及本文所述的适应症的“预防”,包括与视网膜血管疾病相关的任何病况或病症、与糖尿病性视网膜病相关的病况或病症和/或与黄斑水肿相关的病况或病症,其意指任何预防或减缓恶化在具有如下所述的视觉功能,视网膜解剖学,视网膜血管疾病参数,糖尿病性视网膜病变疾病参数和/或黄斑水肿疾病参数的恶化风险的患者中的所述恶化的作用。更具体而言,与视网膜血管疾病、糖尿病性视网膜病相关的病况或病症,和/或黄斑水肿相关的病况或病症相关的病况或病症的“治疗”是指导致或预期导致视功能和/或视网膜解剖的改善或保存的任何作用。用于评估疾病的治疗和/或预防的方法是本领域已知的并在下文中描述。
短语“对治疗有反应”用于表示患者在被递送特定治疗时显示出来自所述治疗的临床上有意义的益处。短语“对治疗有反应”意指比较而不是绝对的反应。例如,预计具有眼科反应标志物的眼科患者比不具有眼科反应标志物的眼科患者更有利于用VEGF拮抗剂治疗。这些眼科反应标志物的载体对VEGF拮抗剂的治疗反应更有利,并且可以简单地说是对用VEGF拮抗剂“治疗有反应”。
短语“接收数据”用来表示通过任何可用的手段,例如口头、电子(例如通过电子邮件、编码在磁盘或其他介质上)、书面等获得信息。
如本文所使用的,关于患者的“选择”和“选择的”用于意指基于(由于)具有预定标准的特定患者(例如,患者有眼科反应标志物),特别选自较大的一组患者中的特定患者。类似地,“选择性治疗”是指向具有特定疾病的患者提供治疗,其中该患者是基于具有预定标准的特定患者,特别选自较大的一组患者。类似地,“选择性施用”是指向患者施用的药物,该患者是基于(由于)具有预定标准的特定患者,例如特定的遗传或其他生物学标记,特别选自较大的一组患者。通过选择、选择性治疗和选择性施用,意味着基于患者的特定生物学向患者递送个性化疗法,而不是仅基于具有特定疾病的患者而递送标准治疗方案。关于本文使用的治疗方法,选择不是指偶然地治疗具有例如眼科反应标志物的患者,而是指基于具有眼科反应标志物的患者向患者施用VEGF拮抗剂的慎重选择。因此,选择性治疗与标准治疗不同,标准治疗向所有患者递送特定药物,不管其等位基因状态如何。
如本文所用,“预测”表示本文所述的方法提供信息以使得卫生保健提供者能够确定具有选自视网膜血管疾病、黄斑水肿、糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、增殖型糖尿病视网膜病和VEGF介导的病症的个体将对VEGF和/或EPO结合分子的治疗有反应或对VEGF和/或EPO结合分子的治疗更有利的反应。这并不是指以100%的准确性来预测反应的能力。相反,本领域技术人员将会理解它是指增加的概率。
如本文所使用的,“可能性”和“可能”是事件将有可能发生的度量。它可以与“概率”互换使用。可能性是指比猜测更可能,但不如确定性的概率。因此,如果一个合理的人使用常识、培训或经验得出的结论是,根据情况,事件有可能,那么事件是可能的。在一些实施方案中,一旦确定可能性,可用VEGF和/或EPO结合分子治疗患者(或继续治疗,或进行增加剂量的治疗),或可不用VEGF和/或EPO结合分子治疗患者(或停止治疗,或进行降低剂量的治疗)。
短语“增加的可能性”是指事件将发生的概率增加。例如,本文的一些方法允许预测患者是否将表现出对VEGF和/或EPO结合分子治疗的反应增加的可能性,或对VEGF和/或EPO结合分子的治疗的反应比具有选自视网膜血管疾病,黄斑水肿,糖尿病性视网膜病,糖尿病性黄斑水肿,增殖型糖尿病性视网膜病和不具有特定基因型(例如眼科反应标志物)的VEGF介导的病症的眼病的患者的反应更好的增加的可能性。
如本文所用,“SNP”是指“单核苷酸多态性”。单核苷酸多态性是当基因组(或其他共有序列)中的单个核苷酸在个体的生物物种成员或成对染色体之间不同时发生的DNA序列变异。大多数SNP只有两个等位基因,并且一个通常在人群中更常见。SNP可以存在于基因的外显子或内含子,基因的上游或下游非翻译区,或纯基因组位置(即非转录)中。当基因的编码区发生SNP时,由于遗传密码的冗余性,SNP可以是沉默的(即,同义多态性),或者SNP可以导致编码多肽序列的改变(即,非同义多态性)。在本公开中,SNP通过它们的单核苷酸多态性数据库(dbSNP)rs编号例如“rs1617640”或“rs2010963”来识别。dbSNP是国家生物技术信息中心(NCBI)与国家人类基因组研究所(NHGRI)合作开发和托管的不同物种内部和之间遗传变异的免费公共档案库。
多态性位点(例如SNP)通常在目的群体的基因组中的保守序列之前和后面跟随该保守序列,因此多态性位点的位置通常可以参考共有核酸序列(例如三十至六十个核苷酸)来进行,其包含多态性位点,这在SNP的情况下通常被称为“SNP背景序列”。本文公开的SNP的背景序列可以在从www.ncbi.nlm.nih.gov/snp可获得的NCBI SNP数据库中找到。或者,多态性位点的位置可通过其在参考序列(例如,GeneBank保藏)中相对于基因起始,mRNA转录物,BAC克隆或甚至相对于蛋白质翻译的起始密码子(ATG)的位置来识别。本领域技术人员理解,由于与共有序列或参考序列相比较在个体基因组中存在一个或多个插入或缺失,特定多态性位点的位置可能不会发生在目标群体中每个个体的参考或背景序列中的精确相同的位置处。当向本领域技术人员提供待检测多态性位点处的可选等位基因的标识且出现该多态性位点的参比序列或背景序列其一或两者时,本领域技术人员通常设计稳健的特异性精确分析用于检测任何给定个体中多态性位点处的可选等位基因。因此,本领域技术人员会理解,通过参照参比或背景序列中(或相对于这一序列中的起始密码子)的特定位置指明本文所阐述任意多态性位点的位置仅是出于方便起见,且任何具体列举的核苷酸位置字面上包括任意个体中相同多态性位点在相同基因座中实际所处的任何核苷酸位置,所述个体是指用任何本文所述基因分型方法或本领域已知的其他基因分型方法就本发明遗传标志物作测试的个体。
除SNP之外,遗传多态性还包括发生在基因增强子、外显子、内含子、启动子、5'UTR、3'UTR等中的易位、插入、取代、缺失等。
如本文所用,“rs1617640”是指位于人EPO基因的启动子内的SNP。rs1617640多态性位点位于染色体位置[chr7:100719675](构建体[107];组装体[GRCh38.p2]),其是[Contig NT_007933.16]的位置[38212896]。
如本文所用,“rs2010963”是指位于人VEGFA基因的[5'UTR]内的SNP。rs2010963多态性位点位于染色体位置[chr6:43770613](构建体[107];组装体[GRCh38.p2],其是Contig[NT_007592.16]的位置[43710613]。
如本领域技术人员所认识到的,含有特定SNP的核酸样品可以是互补的双链分子,并因此提及有义链上的特定位点也指互补反义链上的相应位点。类似地,提及在染色体的一条链的两个拷贝上针对SNP获得的特定基因型等同于在另一条链的两个拷贝上针对相同SNP获得的互补基因型。
如本文所用,“基因组序列”是指存在于基因组中的DNA序列,并且包括等位基因内的区域、等位基因本身或含有目的等位基因的染色体的更大的DNA序列。
术语“探针”是指可用于特异性检测另一种物质的任何物质组分。探针可以是与眼科反应标志物的基因组序列特异性杂交的寡核苷酸(包括偶联寡核苷酸)或眼科反应标志物的核酸产物。缀合的寡核苷酸是指与发色团或含有配体(例如抗原)的分子共价结合的寡核苷酸,其对受体分子(例如抗原特异性抗体)是高度特异的。探针也可以是PCR引物,例如与另一引物一起,用于扩增眼科反应标志物内的特定区域。此外,探针可以是特异性结合这些等位基因的多肽产物的抗体。在优选的实施方案中,探针与核酸序列(优选基因组DNA)特异性杂交或特异性结合目的等位基因的多肽序列。
短语“特异性杂交”用于指严格杂交条件下的杂交。严格的条件是本领域技术人员已知的并且可见于Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。在该参考文献中描述了水性和非水性方法,并且任一种均可以使用。严格杂交条件的一个例子是在约45℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交,接着在50℃下在0.2XSSC,0.1%SDS中至少一次洗涤。严格杂交条件的第二个例子是在约45℃下在6X SSC中杂交,接着在55℃下在0.2X SSC,0.1%SDS中至少一次洗涤。严格杂交条件的另一个例子是在约45℃下在6X SSC中杂交,接着在60℃下在0.2X SSC,0.1%SDS中至少一次洗涤。严格杂交条件的另一个实例是在约45℃下在6X SSC中杂交,接着在65℃下在0.2X SSC,0.1%SDS中至少一次洗涤。高严格条件包括在65℃下在0.5M磷酸钠,7%SDS中杂交,接着在65℃下在0.2X SSC,1%SDS中至少一次洗涤。
短语“核酸的区域”用于指示较大序列的核酸内的较小序列。例如,基因是染色体的区域,外显子是基因的区域等。
在多肽的背景中术语“特异性结合”用于意指化合物结合给定的多肽靶标(例如VEGF或EPO)而不是随机地结合不需要的多肽。然而,“特异性结合”不排除与不期望的多肽的一些交叉反应性,只要交叉反应性不干扰探针提供给定多肽靶的存在的有用量度的能力即可。
术语“能够”用于意指实现给定结果的能力,例如能够检测特定物质存在的探针意味着该探针可以用于检测特定物质。
“寡核苷酸”是指短的核苷酸序列,例如2-100个碱基。
如本文所用,术语“生物样品”是指来自患者的样品,其可以用于识别、诊断、预测或监测的目的。优选的样品包括滑液、血液、血源性产品(如血沉暗黄层(buffy coat)、血清和血浆)、淋巴液、尿、眼泪、唾液、毛球细胞、脑脊液、口腔拭子、粪便、滑液、滑膜细胞、痰或组织样品(例如软骨样品)。此外,本领域技术人员将认识到,一些样品将在分馏或纯化程序(例如从全血中分离DNA)后更容易分析。
VEGF拮抗剂
各种公开的药物组合物、方案、工艺、用途、方法和试剂盒都利用VEGF拮抗剂,例如VEGF结合分子(例如VEGF抗体或其抗原结合部分,例如雷珠单抗(Lunexis))或VEGF受体结合分子(例如,VEGF受体抗体或其抗原结合部分)。VEGF拮抗剂包括雷珠单抗(Ferrara N等人,Retina.2006年10月;26(8):859-70)、贝伐单抗(Ferrara N等人,Nat Rev DrugDiscov.2004年5月;3(5):391-400)、阿柏西普(pagaptanib,Stewart MW等人,Nat RevDrug Discov.2012年3月30日;11(4):269-70),KH902(Zhang M等人,Mol.Vis.2008年1月10日;),MP0112(Campochiaro PA等人,Am J.Ophthalmol.2013年4月;155(4):697-704),pegaptanib(Gragoudas ES等人,N Engl J.Med.2004年12月30日;351(27):2805-16),CT-322(Dineen SP等人,BMC Cancer.2008年11月27日;8:352,doi:10.1186/1471-2407-8-352),美国专利申请公开20140186350(其通过引用整体并入本文)中描述的抗VEGF抗体和片段,包括NVS4,NVS80,NVS81,NVS82,NVS83,NVS84和NVS85,和US20120014958(其明确通过引用整体并入本文)描述的抗-VEGF抗体和片段。术语VEGF拮抗剂还包括任何上述分子的衍生物。
EPO拮抗剂
各种公开的药物组合物、方案、工艺、用途、方法和试剂盒都利用EPO拮抗剂,例如EPO结合分子(例如EPO抗体或其抗原结合部分,或EPO受体结合分子(例如EPO受体抗体或其抗原接合部分)。EPO拮抗剂的实例包括具有Fab NVS1、NVS2、NVS3或NVS4的CDR序列、重链、轻链,或重链和轻链的组合的抗体或其衍生物(包括包含Fab NVS1-4的抗体或其衍生物),如下表和美国专利申请公开号2014/0199306中公开的,其通过引用整体并入本文。
EPO拮抗剂序列表
眼科病症
所公开的方法可用于眼科病症的诊断、治疗、预防和/或改善,所述眼科病症包括与视网膜血管疾病相关的病状或病症,即视网膜退化或变得功能失调的病状、病症或疾病。这包括与糖尿病性视网膜病变(DR)相关的病状或病症,与糖尿病性黄斑水肿(DME)、增殖型糖尿病性视网膜病变(PDR)、非增殖型糖尿病性视网膜病变(NPDR)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、视网膜静脉闭塞(RVO)、多灶性脉络膜炎、近视性脉络膜新血管形成或早产儿视网膜病变相关的病状或病症。可通过EPO和/或VEGF抑制治疗的视网膜血管疾病的解剖学特征包括黄斑水肿、静脉扩张、血管迂曲(vessel tortuosity)、通过荧光素血管造影术测量的血管渗漏、视网膜出血和微血管异常(例如微动脉瘤、棉花斑点、IRMA)、毛细血管脱落、白细胞粘附、视网膜缺血、视盘的新血管形成、后极的新血管形成、虹膜新血管形成、视网膜内出血、玻璃体出血、黄斑疤痕、视网膜下纤维化和视网膜纤维化。
术语“与糖尿病性视网膜病相关的病状或病症”是指由于糖尿病(1型或2型)对视网膜血管系统、视网膜代谢、视网膜色素上皮细胞、血-视网膜屏障的影响或晚期糖基化终产物(AGEs)、醛糖还原酶活性、糖基化血红蛋白和蛋白激酶C的眼部水平,视网膜退化或变得功能失调的病状。糖尿病性视网膜病变患者的视力损失可能是视网膜缺血、黄斑水肿、血管渗漏、玻璃体出血的结果,或是葡萄糖水平升高对视网膜神经元的直接影响。可通过Epo抑制治疗的糖尿病性视网膜病的解剖学特征包括微动脉瘤、棉花斑点、静脉扩张、黄斑水肿、视网膜内微血管异常(IRMA)、视网膜内出血、血管增生、视盘的新血管形成、发红和视网膜缺血。“糖尿病黄斑水肿”发生在糖尿病性视网膜病变患者中,并且可以发生在疾病的任何阶段。
术语“与黄斑水肿相关的病状或病症”是指由于视网膜血管漏出液体而发生黄斑肿胀或增厚的病状或病症(“黄斑水肿”)。黄斑水肿发生于视网膜血管疾病,并且常常是其并发症。与黄斑水肿相关的特定病状或病症包括糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、增殖型糖尿病性视网膜病、非增殖型糖尿病性视网膜病、年龄相关性黄斑变性、视网膜静脉阻塞、多灶性脉络膜炎、近视性脉络膜新血管形成或早产儿视网膜病。通过抑制Epo来治疗黄斑水肿可以通过眼底检查、光学相干断层扫描和改善的视敏度来确定。
测定技术、诊断方法和生成可传递形式的信息的方法
所公开的方法可用于治疗、预防或改善眼科病症,以及预测眼科病症患者对用VEGF和/或EPO拮抗剂治疗的反应的可能性。这些方法尤其采用确定患者是否在来自患者的样品中具有眼科反应标志物。
可以通过任何适用的常规手段来分析来自患者的生物样品中是否存在眼科反应标志物。可以使用许多生物样品来识别等位基因或蛋白质的存在,基因或蛋白质的表达水平以及蛋白质的活性,例如血液、滑液、血沉暗黄层、血清、血浆、淋巴、粪便、尿、眼泪、唾液、脑脊液、口腔拭子、痰液或组织。生物样品中的各种来源可以用于所公开的方法中,例如,可以测定从生物样品获得的基因组DNA以检测眼科反应标志物,或者可以测定眼科反应标志物的产物,例如核酸产物(例如,DNA、前体mRNA、mRNA、微小RNA等)和从生物样品获得的多肽产物(例如,表达的蛋白质)。
如实施例中所述,我们发现与其他等位基因相比,在基因座rs1617640处存在胸腺嘧啶(例如,基因座rs1617640处的两个等位基因中的胸腺嘧啶)导致对雷珠单抗的降低的敏感性。部分基于这一发现,本发明的特征在于选择性治疗在基因座rs1617640处不具有(一个或多个)胸腺嘧啶的个体。
另外,如实施例中所述,我们发现与其他等位基因相比,在基因座rs2010963处存在胞嘧啶(例如,基因座rs2010963处的两个等位基因中的胞嘧啶)导致对雷珠单抗的降低的敏感性。部分基于这一发现,本发明的特征在于选择性治疗在基因座rs2010963处不具有(一个或多个)胞嘧啶的个体。
可通过本领域内熟知的方法(例如苯酚/氯仿提取、来自GentASSystems(Qiagen,CA)的纯化系统)从生物样品制备用于SNP检测的DNA(基因组和cDNA)。检测DNA序列可包括检验位于该区域内的有义链或反义链处的一个或多个核苷酸。可使用序列特异性探针(例如来自Taqman、Beacons、Scorpions的水解探针;或检测标志物或多态性的杂交探针)从获自PCR的DNA(基因组或cDNA)检测患者中多态性的存在。为检测多态性可设计序列特异性探针,从而其与目的等位基因的基因组DNA特异性杂交,或在一些情形下与目的RNA特异性杂交。可根据在www.ncbi.nlm.nih.gov/snp可获得的NCBI SNP资料库的背景序列设计针对多态性位点(例如SNP)的引物和探针。这些探针可被标记用于直接检测或接触特异性结合探针的另一可检测分子。也可通过DNA结合剂检测PCR产物。然后可通过本领域内可用的任意DNA测序方法对这些PCR产物进行测序。或者可通过使用任意测序方法(例如但不限于桑格测序、焦磷酸测序或二代测序)进行测序来检测等位基因的存在(Shendure J.和Ji,H.,Nature Biotechnology(1998),Vol.26,Nr 10,第1135-1145页)。用于SNP的已优化等位基因鉴别分析可购自AppliedBiosystems(Foster City,California,USA)。
可应用各种技术来探询特定多态性(例如SNP),包括例如基于杂交的方法,例如动态等位基因特异性杂交(DASH)基因分型、通过分子信标的多态性位点(例如SNP)检测(Abravaya K.,等人(2003)Clin ChemLab Med.41:468-474)、Luminex xMAPIllumina技术和市售高密度寡核苷酸SNP阵列(例如Affymetrix HumanSNP 5.0实施可跨越500,000个人类SNP进行基因分型的全基因组分析)、来自Illumina的例如Human660W-Quad和Human1.2M-Duo);基于酶的方法,例如限制性片段长度多态性(RFLP)、基于PCR的方法(例如四引物ARMS-PCR)、Invader分析(Olivier M.(2005)Mutat Res.573(1-2):103-10)、各种引物延伸分析(纳入检测形式中,例如MALDI-TOF质谱、电泳、印迹法和ELISA类方法)、分析和寡核苷酸连接酶分析;和其他扩增后方法,例如单链构象多态性的分析(Costabile等人(2006)Hum.Mutat.27(12):1163-73)、温度梯度胶电泳(TGGE)、变性高效液相层析、高分辨率解链分析、DNA错配结合蛋白分析(例如来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的MutS蛋白以不同亲和力结合不同单核苷酸错配且可用于毛细管电泳来区分所有六组错配)、(购自AppliedBiosystems的专有SNP检测系统)、毛细管电泳、质谱分析法和各种测序方法(例如焦磷酸测序和二代测序)等。用于SNP基因分型的市售试剂盒包括(例如)Fluidigm DynamicIFCs(Fluidigm)、基因分型分析(Applied Biosystems)、Gold(Sequenom)、Probe PCR试剂盒(Quiagen)等。
在一些实施方式中,使用杂交分析检测患者中多态性位点(例如SNP)的存在。在杂交分析中,根据来自样品的核酸与互补核酸分子(例如寡核苷酸探针)杂交的能力来测定遗传标志物的存在。可使用各种杂交分析。在一些分析中,通过可视化结合的探针(例如Northern分析或Southern分析),直接检测探针与目的序列的杂交。在这些分析中,分离DNA(Southern分析)或RNA(Northern分析)。然后使用一系列在基因组中很少剪切且不接近任意所分析标志物的限制酶来剪切DNA或RNA。然后(例如在琼脂糖凝胶上)分离DNA或RNA,并转移至膜。使经标记(例如通过纳入放射性核苷酸或结合剂(例如))的探针与膜在低、中或高严格条件下接触。去除未结合探针且通过使标记探针可视化来检测结合的存在。在一些实施方式中,可使用阵列(例如系统(Sequenom,SanDiego,California,USA))来对个体进行基因分型。
也可改进传统基因分型方法以用于基因分型。这些传统方法包括(例如)DNA扩增技术(例如PCR和其变体)、直接测序、与Luminex技术联用的SSO杂交、SSP分型和SBT。
序列特异性寡核苷酸(SSO)分型使用PCR靶扩增,杂交PCR产物与珠粒上一组固定的序列特异性寡核苷酸,通过颜色形成检测结合探针的扩增产物,随后进行数据分析。本领域技术人员应理解,可使用各种市售试剂盒实施所阐述的序列特异性寡核苷酸(SSO)杂交,例如由OneLambda公司(Canoga Park,CA)提供的那些或与技术(Luminex公司,TX)联用的Lifecodes HLA分型试剂盒(Tepnel Life Sciences公司SSO是反向SSO(rSSO)DNA分型解决方案,其使用序列特异性寡核苷酸(SSO)探针和编码颜色的微球体来鉴别HLA等位基因。通过聚合酶链反应(PCR)扩增靶DNA,然后与珠粒探针阵列杂交。该分析发生于96孔PCR板的单个孔中,因此可一次性处理96份样品。
序列特异性引物(SSP)分型是基于PCR的技术,其使用序列特异性引物用于基于DNA的分型。SSP方法是基于以下原理:在受控PCR条件下,只有与靶序列具有完全匹配序列的引物才可得到扩增产物。设计等位基因序列特异性引物对来选择性扩增就单个等位基因或等位基因群而言特异性的靶序列。PCR产物可在琼脂糖凝胶上可视化。匹配存在于所有样品中非等位基因序列的对照引物对作为内部PCR对照以验证PCR扩增的效率。本领域技术人员会理解,可使用各种市售试剂盒(例如Olerup SSPTM试剂盒(Olerup,PA)或(Invitrogen),或Allset andTMGold DQA1低分辨率SSP(Invitrogen))实施使用所阐述的序列特异性引物分型的低、中和高分辨率基因分型。
基于序列的分型(SBT)是基于以下过程:PCR靶扩增,随后是PCR产物测序和数据分析。
在一些情形下,也可使用RNA(例如成熟mRNA、前mRNA)来测定特定多态性的存在。例如,EPO mRNA的量可以用作EPO启动子活性的替代物。可使用本领域内已知的任意方法来分析转录自给定基因的mRNA序列,包括但不限于Northern印迹分析、核酸酶保护分析(NPA)、原位杂交、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、RT-PCR ELISA、基于TaqMan的定量RT-PCR(基于探针的定量RT-PCR)和基于SYBR green的定量RT-PCR。
在一些情况下,可以通过分析眼科反应标志物的多肽产物作为EPO启动子活性的替代物来确定患者中多态性的存在。可以使用本领域中任何已知的方法进行多肽产物的检测,包括但不限于免疫细胞化学染色、ELISA、流式细胞术、蛋白质印迹、分光光度法、HPLC和质谱分析法。
一种用于检测样品中的多肽产物的方法借助于探针,该探针是能够与标志物蛋白(例如能够结合EPO蛋白的抗体)特异性相互作用的结合蛋白。优选地,可以使用标记的抗体,其结合部分或其他结合配偶体。抗体可以是来源于单克隆或多克隆的,也可以是生物合成产生的。结合配偶体也可以是天然存在的分子或合成产生的。使用本领域中描述的标准蛋白质检测方法来确定复合蛋白质的量。免疫学测定设计、理论和方案的详细综述可以在本领域的许多文章中找到,包括Practical Immunology,Butt,W.R.编,Marcel Dekker,NewYork,1984。多种测定法可用于检测具有标记的抗体。直接标记包括附着于抗体的荧光或发光标签、金属、染料、放射性核素等。间接标记包括本领域众所周知的各种酶,如碱性磷酸酶、过氧化氢酶等。在一步测定法中,多肽产物(如果存在的话)被固定,并与标记的抗体孵育。标记的抗体结合固定的靶分子。洗涤去除未结合的分子后,测定样品的标签。
本公开还考虑使用对蛋白质或多肽特异的固定化抗体。可将抗体固定在各种固体载体上,例如磁性或层析基质颗粒、分析位置的表面(例如微量滴定孔)、固体基底材料的部分(例如塑胶、尼龙、纸)等。可通过在固体载体上以阵列形式涂覆抗体或多种抗体来制备分析条带。然后可将此条带浸入测试样品中且然后通过洗涤和检测步骤快速处理以生成可测量信号(例如色斑)。
在两步测定中,可将EPO与未标记抗体一起培育。然后使未标记抗体复合物(若存在)结合至对于未标记抗体具有特异性的另一经标记抗体。洗涤样品并分析标记的存在。用于标记抗体的标志物选择将根据应用而变化。然而,本领域技术人员可易于确定标志物的选择。可使用放射性原子、酶、发色团或荧光部分或比色标志标记的抗体。标志性标记的选择也取决于所需的检测限制。酶测定(ELISA)通常能检测通过酶标记复合物与酶底物的相互作用形成的发色产物。放射性原子的一些示例包括32P、125I、3H和14P。酶的一些实施例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。发色团部分的一些示例包括荧光素和若丹明。抗体可通过本领域内已知的方法偶联至这些标记。例如,酶和发色团分子可通过偶合剂(例如二醛、碳二亚胺、二马来酰亚胺等)偶联至抗体。或者,偶联可通过配体-受体对发生。一些适宜的配体-受体对包括(例如)生物素-亲和素或-链霉亲和素和抗体-抗原。
在一方面中,本发明涵盖使用夹心式技术来检测生物样品中的多肽产物。该技术需要两种能够结合目的蛋白质的抗体:例如,一种固定于固体载体上且一种游离在溶液中,但标记有某容易检测的化合物。可用于第二抗体的化学标记的示例包括但不限于放射性同位素、荧光化合物和酶或暴露于反应物或酶底物时生成发色或电化学活性产物的其他分子。在将含有多肽产物的样品置于此系统中时,多肽产物结合至固定抗体和经标记抗体。结果得到位于载体表面的"夹心式"免疫复合物。通过洗涤掉未结合样品组份和过量经标记抗体并测量在载体表面上与蛋白质复合的经标记抗体的量来检测复合蛋白。如果使用具有良好检测限制的标记,夹心式免疫分析具有高度特异性且极其敏感。
优选地,通过放射性免疫分析或酶联免疫分析、竞争性结合酶联免疫分析、点渍法、Western印迹、层析(优选高效液相层析(HPLC))或本领域内已知的其他分析来检测样品中多肽产物的存在。可直接或间接检测抗体与蛋白质或多肽的特异性免疫结合。
在实施本文所阐述的任意需要测定眼科反应标志物存在的方法时,可通过查阅含有关于患者遗传组成的足够信息的数据储存库来进行该测定以确定患者是否具有目的标志物。优选地,数据储存库列示个体中存在(或不存在)的基因型。数据储存库可包括个体的病历、医学数据卡、通过计算机或其他电子或非电子介质(其上可储存适当信息或遗传数据)可获得的文件(例如文本ASCII文件)。如本文所使用,医学数据卡是可携式储存装置,例如磁性数据卡、智能卡(其具有板上处理单元且由例如德国慕尼黑的Siemens等供应商出售)或闪存卡。若数据储存库是计算机可及文件,则这些文件可位于各种介质上,包括服务器、用户端、硬盘、CD、DVD、个人数字助理(例如智能电话、掌上计算机)、磁带录音机、压缩盘、计算机内部ROM(只读存储器)或互联网或万维网。本领域技术人员应了解计算机可及文件储存的其他介质。
通常,一旦测定眼科反应标志物的存在后,可将结果通知医师或遗传顾问或患者或其他研究者。具体地,可将该结果置于可传输形式的信息中,其可被传送或传输至其他研究者或医师或遗传顾问或患者。这一形式可变化且可以是有形的或无形的。所测试个体的结果可以描述性陈述、图、相片、图表、图像或任何其他视觉形式呈现。例如,PCR产物的凝胶电泳影像可用于解释这些结果。显示在个体等位基因中出现变体的图也用于指示测试结果。关于EPO表达水平、EPO蛋白水平/活性、或眼科反应标志物存在的陈述也可用于指示测试结果。这些陈述和视觉形式可记录在有形介质(例如纸、计算机可读介质(例如软盘、压缩盘等))或无形介质(例如呈因特网或内部网上的电子邮件或网址形式的电子介质)上。另外,结果也可以声音形式记录并经由电话、传真、无线移动电话、互联网电话等,通过任何合适介质(例如模拟或数字电缆线、光纤电缆等)传输。所有这些形式(有形和无形)均可构成"可传输形式信息"。因此,关于测试结果的信息和数据可在世界任意地方产生并可传输至不同位置。例如,在离岸进行基因分型分析时,可产生关于测试结果的信息和数据并置入上述的可传输形式。因此,可将呈可传输形式的测试结果输入美国。因此,本公开也涵盖产生可传输形式信息的方法,所述信息含有个体中EPO表达水平、EPO蛋白水平/活性、或眼科反应标志物存在。该形式的信息可用于预测罹患眼科病症的患者对用VEGF和/或EPO拮抗剂治疗的反应性、基于该信息选择治疗过程以及基于该信息选择性治疗患者是有用的。
本文公开了预测罹患眼科病症的患者将对用VEGF和/或EPO拮抗剂治疗有反应的可能性的方法,包括检测来自患者的生物样品中是否存在至少一种眼科反应标志物。如上所述,含有眼科反应标志物的一个或多个等位基因的存在与抗VEGF单一疗法将有效的可能性增加有关。如上所述,个体可以具有少至零和多达四个含有眼科反应标志物的等位基因(两个,每一个对于在基因座rs1617640处存在除胸腺嘧啶以外的核酸和在基因座rs2010963处存在鸟嘌呤)。因此,眼科反应标志物的数量越多,抗VEGF单一疗法的功效的可能性就越大。相反,个体中存在的眼科反应标志物越少,建议使用EPO拮抗剂治疗的可能性就越大。具体而言,在基因座rs1617640处存在一个或多个胸腺嘧啶提示用EPO拮抗剂治疗。
在一些实施方案中,该方法进一步包括从患者获得生物样品的步骤,其中获得的步骤在测定步骤之前进行。
在一些实施方案中,通过测定生物样品的至少一个眼科反应标志物的核酸产物,至少一个眼科反应标志物的多肽产物,或至少一个眼科反应标志物的等同遗传标记来检测该至少一个眼科反应标志物。在一些实施方案中,通过测定生物样品的至少一个眼科反应标志物的基因组序列来检测眼科反应标志物。在一些实施方案中,生物样品选自由滑液、血液、血清、粪便、血浆、尿、眼泪、唾液、脑脊液、白细胞样品和组织样品组成的组。
本文还公开了预测具有选自视网膜血管疾病、黄斑水肿、糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、增殖型糖尿病性视网膜病和VEGF介导的病症的眼病的患者对用VEGF拮抗剂和/或EPO拮抗剂治疗有反应的可能性的各种方法,包括相对于对照,检测来自患者的生物样品中的EPO表达水平(例如mRNA、cDNA等)、EPO蛋白水平和/或EPO活性水平;其中相对于对照的EPO表达水平降低、EPO蛋白水平降低和/或EPO活性水平降低表明患者将对VEGF拮抗剂治疗(例如,用VEGF拮抗剂)有反应的可能性增加。在这样的实施方案中,对照是来自已知对VEGF拮抗剂治疗反应不佳的个体的EPO表达水平、EPO蛋白水平或EPO活性水平的参照水平。
本文还公开了预测具有选自视网膜血管疾病、黄斑水肿、糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、增殖型糖尿病性视网膜病和VEGF介导的病症的眼病的患者对用VEGF和/或EPO拮抗剂治疗有反应的可能性的各种方法,包括相对于对照,检测来自患者的生物样品中的眼科反应标志物、EPO表达水平(例如mRNA、cDNA等)、EPO蛋白水平和/或EPO活性水平;其中相对于对照相似的EPO表达水平、相似的EPO蛋白水平或相似的EPO活性水平表明患者将对VEGF和/或EPO拮抗剂治疗有反应的可能性增加。在这样的实施方案中,对照是来自已知对VEGF和/或EPO拮抗剂的治疗反应良好的个体的EPO表达水平、EPO蛋白质水平或EPO活性水平。
在一些实施方案中,通过选自Northern印迹分析、聚合酶链反应(PCR)、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、基于TaqMan的测定法、直接测序、动态等位基因特异性杂交、高密度寡核苷酸SNP阵列、限制性片段长度多态性(RFLP)测定法、引物延伸测定法、寡核苷酸连接酶测定法、单链构象多态性分析、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、变性高效液相层析、高分辨率熔解分析、DNA错配结合蛋白测定法、毛细管电泳、Southern Blot、免疫分析、免疫组织化学、ELISA、流式细胞仪、Western印迹、HPLC和质谱分析法等技术检测所述至少一种眼用反应标志物的存在、EPO表达水平或EPO蛋白质水平/活性。
在一些实施方案中,眼科病症是视网膜血管疾病。在一些实施方案中,眼科病症是黄斑水肿。在一些实施方案中,眼科病症是糖尿病性视网膜病变。在一些实施方案中,眼科病症是糖尿病性黄斑水肿。在一些实施方案中,眼科病症是增殖型糖尿病性视网膜病变。
治疗方法以及VEGF和EPO拮抗剂的使用
所公开的方法允许临床医生向患有眼病(例如视网膜血管疾病、黄斑水肿、糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、增殖型糖尿病性视网膜病和VEGF介导的病症)的患者提供个性化治疗,即它们允许确定是否用VEGF拮抗剂、EPO拮抗剂或VEGF和EPO拮抗剂的组合选择性治疗患者。以这种方式,临床医生可以使罹患眼科疾病(例如,视网膜血管疾病、黄斑水肿、糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、增殖型糖尿病性视网膜病和VEGF介导的病症)的患者的整个群体中的VEGF和/或EPO拮抗的益处最大化并使其风险最小化)。应当理解,VEGF和EPO拮抗剂可用于治疗、预防或改善在此公开的眼科病症(例如,视网膜血管疾病、黄斑水肿、糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、增殖型糖尿病性视网膜病和VEGF介导的病症)。
当与药学上可接受的载体组合时,VEGF和/或EPO拮抗剂可以用作药物组合物。除了VEGF和/或EPO拮抗剂之外,这样的组合物还可以包含载体、各种稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂和本领域公知的其他物质。载体的特点将取决于施用途径。用于所公开的方法的药物组合物还可以含有用于治疗特定的靶向病症的另外的治疗剂。例如,药物组合物还可以包含抗炎剂。这些另外的因子和/或药剂可以被包括在药物组合物中以产生与VEGF和/或EPO拮抗剂的协同效应,或者使由VEGF和/或EPO拮抗剂引起的副作用最小化。
在实践本公开的一些治疗方法或用途时,将治疗有效量的VEGF和/或EPO拮抗剂施用患者(例如人)。虽然可以理解的是,所公开的方法根据眼科反应标志物的存在提供对患者的选择性治疗,但这并不排除如果患者最终用VEGF和/或EPO拮抗剂,这样的VEGF和/或EPO拮抗剂疗法必然是唯一的疗法。实际上,如果选择患者用VEGF和/或EPO拮抗剂进行治疗,那么VEGF和/或EPO拮抗剂可以根据本公开的方法单独或与其他治疗眼科疾病的治疗剂组合施用患者。当与一种或多种另外的治疗剂共同施用时,VEGF和/或EPO拮抗剂可以与其他治疗剂同时施用,或者依次施用。如果顺序施用,主治医师将决定施用VEGF和/或EPO拮抗剂与其他治疗剂组合的适当顺序,以及共同递送的合适剂量。
优选的是玻璃体内施用。其他施用方法包括静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下、或者在靶部位的近侧施用。药学上可接受的载体应适合于玻璃体内、静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。取决于给药途径,可将活性化合物(即抗体,双特异性和多特异性分子)包被在材料中以保护化合物免受可使化合物失活的酸和其他天然条件的作用。
试剂盒
本发明还包括用于检测患者中的眼科反应标志物的试剂盒。这样的试剂盒可用于预测患有选自视网膜血管疾病、黄斑水肿、糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、增殖型糖尿病视网膜病和VEGF介导的病症的眼病的患者是否可能对用VEGF和/或EPO拮抗剂治疗有反应(或具有更高的反应)。例如,试剂盒可以包含能够检测生物样品中的眼科反应标志物的探针(例如,寡核苷酸、抗体、标记的化合物或其他试剂)。试剂盒还可以包含用于提供患者将对用VEGF和/或EPO拮抗剂治疗反应的可能性的预测的说明书。
探针可与基因组序列、核酸产物或多肽产物特异性杂交。示例性探针是与例如rs1617640(例如来自DNA,cDNA,mRNA等)的反应等位基因特异性杂交的寡核苷酸或缀合的寡核苷酸;引物-延伸寡核苷酸、等位基因特异性引物、等位基因特异性引物、等位基因特异性探针和引物延伸引物的组合等。试剂盒可任选含有靶向内部控制等位基因的探针,其可为一般人群中所呈现的任何等位基因。设计内部控制等位基因的检测以确保试剂盒的性能。所公开试剂盒也可包含(例如)缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。试剂盒也可包含用于检测可检测试剂(例如酶或底物)所需的组件。试剂盒也可含有可被分析并与所含测试样品进行比较的对照样品或一系列对照样品。试剂盒的各组件通常封闭于个体容器内,且所有不同容器都与使用说明书一起位于单一包装内。
此类试剂盒还可以包含VEGF和/或EPO拮抗剂或包含VEGF和/或EPO拮抗剂的药物组合物。以这种方式,这样的试剂盒可用于使用VEGF和/或EPO拮抗剂选择性治疗患有眼科疾病的患者。此外,此类试剂盒可包含用于施用拮抗剂的工具(例如,注射器和小瓶、预充式注射器、预充式笔)和使用说明。这些试剂盒可含有用于治疗眼科疾病(例如与封闭的VEGF和/或EPO拮抗剂组合递送)的其他治疗剂(如上文所述)。
短语“用于施用的工具”用于表示用于向患者全身性施用药物的任意可用器具,包括但不限于预填充注射器、小瓶和注射器、注射笔、自动注射器等。使用这些物品,患者可自施用药物(即靠自身力量施用药物)或医师可施用药物。
小结
在以上伴随的描述中阐述了本公开的一个或多个实施方案的细节。尽管在本公开的实践或测试中可以使用与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料,但现在描述优选的方法和材料。本公开的其他特征、目的和优点将从说明书和权利要求中显而易见。在说明书和所附权利要求书中,除非背景另有明确说明,否则单数形式包括复数指示物。除非另外定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本说明书中引用的所有专利和出版物都通过引用并入本文。呈现以下实施例是为了更全面地说明本公开的优选实施方案。这些实施例决不应被解释为限制由所附权利要求限定的所公开的患者内容的范围。
实施例
以下实施例的目标是:
研究EPO启动子多态性(rs1617640)对于AMD和DME患者对Lucentis反应的影响。
研究VEGF多态性(rs2010963)对于AMD和DME患者对Lucentis反应的影响。
研究两种多态性对于AMD和DME患者对Lucentis反应的加性效应。
方法描述
样品和DNA提取
两项DME(CRFB002D2301和CRFB002D2303)和三项AMD临床研究(CRFB002A2302、CBPD952A2309和CBPD952A2308)被纳入本药物遗传学评估。在含有乙二胺四乙酸(EDTA)的管中收集一个10mL血液样品用于脱氧核糖核酸(DNA)提取。血液抽取后,将样品倒置8至10次以防止凝结。使用PUREGENETM DNA分离试剂盒(D-50K)(Gentra,Minneapolis,MN)从全血中提取基因组DNA。
基因分型
共有对316例DME患者和458例湿-AMD患者分别进行了EPO启动子多态性(rs1617640)和VEGF多态性(rs2010963)的基因分型。在ABI7900测序仪(AppliedBiosystems,Foster City,CA)上使用TaqManAssays-by-Design和Assays-on-Demand。基因分型根据制造商的说明书(Applied Biosystems,Foster City,CA)使用5ng的基因组DNA。基因分型要求每个测定>95%。
临床变量
研究眼基线处最佳矫正视力(BCVA)的平均值。
研究眼的BCVA从基线到12个月的平均变化。
注射剂的数量。
数据分析
分析中使用具有末次观察结转(LOCF)的意向性治疗(ITT)人群。所有具有可评估基因型数据的患者均纳入分析。两个DME临床试验CRFB002D2301和CRFB002D2303在分析中合并以增加样品量。同样,三项AMD临床研究CRFB002A2302、CBPD952A2309和CBPD952A2308也在分析中合并。
使用线性回归模型来检测遗传因子与临床变量之间的关联性。年龄、性别、种族、研究中心和基线值作为协变量包括在模型中。评估加性遗传模型。所有的统计测试都是双尾的。没有为多重检验调整P值。使用SAS9.2。
结果
EPO基因型的人口学特征和基线BCVA
共有301名DME和453名湿-AMD患者分别具有可评估的EPO启动子多态性(rs1617640)的基因型数据。基因型数据在卡方检验中没有偏离Hardy-Weinberg平衡,p<0.05,所以没有发现基因分型失败或群体混合的证据。所有具有可评估基因型数据的患者均纳入分析。表1和表2总结了人口学特征。除DME患者的种族外,EPO基因型的人口学特征没有显著差异。大约有91%的具有TT的DME患者是白种人,而只有39%的具有GG的DME患者是白种人。
表1
通过EPO基因型的DME患者的人口统计学和基线BCVA
表2
通过EPO基因型的AMD患者的人口统计学和基线BCVA
在DME研究的一个中有一大部分亚洲人(表3)。结果可能提示亚洲人和白种人EPO基因型频率存在显著差异。如表3所示,亚洲人的TT频率显著高于白种人(69.42%vs34.12%)。另外,白种人的EPO基因型频率在DME和AMD之间非常相似。然而,由于本研究中缺乏匹配的对照,因此尚不清楚所观察到的基因型频率是否暗示与疾病有关。
表3
按种族和疾病的EPO基因型频率
此外,测试了EPO基因型对基线视力的影响。如表1和表2所示,EPO基因型之间的基线BCVA没有显著差异。
在DME患者中EPO启动子多态性对的反应的影响
两个DME临床试验CRFB002D2301和CRFB002D2303被合并用于检测EPO启动子多态性与对的反应之间的关联性的存在。在CRFB002D2303研究中有很大一部分亚洲人。但是在合并的两项研究中,白种人和亚洲人之间对的反应没有显著差异。进行ANCOVA模型以评估EPO基因型对主要临床终点BCVA的影响。三个治疗组单独进行分析。结果显示在表4、图1、图2和图3中。除了在第3和第5个月的单一疗法之外,基因型组之间对的反应的差异不显著(p<0.05)。具有风险等位基因(T)的DME患者倾向于具有低于无风险等位基因者的BCVA改善。
如图1、图2和图3所示,在整个临床研究中,12个月的治疗期间对Lucentis的反应有很高的可变性。因此,为了确定Lucentis在DME患者中的总体疗效,分析12个月内BCVA的平均改善。在单独用Lucentis治疗的患者中观察到EPO基因型与BCVA平均改善之间有关联的有趣趋势(p<0.1)。这个结果支持第3和5个月的发现。
表4
EPO基因型对于在DME患者中BCVA对Lucentis反应的影响
EPO启动子多态性对于AMD患者Lucentis反应的影响
将EPO启动子多态性研究扩展到AMD患者以比较两种不同疾病之间对的反应的遗传效应。最初,对于AMD患者的分析预计会有负面结果,因为迄今为止没有证据表明EPO启动子多态性与AMD之间存在关联。
三个AMD临床试验CRFB002A2302,CBPD952A2309和CBPD952A2308被合并用于检测EPO启动子多态性与对的反应之间是否存在关联。进行ANCOVA模型以评估EPO基因型对主要临床终点BCVA的影响。结果列于表5、图4、图5和图6中。
出人意料的是,EPO基因型对BCVA改善的效果在AMD患者中比在DME患者中更显著。在第7、8、9、11和12个月时,基因型组间的单一疗法的反应差异显著(p<0.05)(表5)。第5、6和10个月也有关联趋势(p<0.1)(表5)。
如图4所示,GG基因型(n=44)患者在接受单一疗法2个月后,BCVA方面的表现优于GT或TT基因型患者。GT基因型患者(n=117)从第6个月开始表现好于TT基因型患者(n=91)。EPO基因型的BCVA改善的差异在AMD患者中也比在DME患者中观察到的差异更大。
表5
EPO基因型对于在AMD患者中BCVA对Lucentis反应的影响
VEGF基因型的人口学特征和基线BCVA
我们进一步将这种药物遗传学分析扩展到VEGF多态性(rs2010963),因为VEGF是的靶标,而rs2010963与DR和AMD相关(Errera等人,(2007)Diabetes Care.30(2):275-9;Janik-Papis K等人,(2009)Exp Mol Pathol.87(3):234-8)。有趣的是,最近的研究表明,rs2010963的C等位基因与人视网膜中较高的VEGF基因表达相关。
总共306名DME和456名湿-AMD患者分别具有可评估的VEGF多态性的基因型数据。基因型数据在卡方检验中没有偏离Hardy-Weinberg平衡,p<0.05,所以没有发现基因分型失败或群体混合的证据。所有具有可评估基因型数据的患者均纳入分析。
人口学特征总结在表6和表7中。与EPO基因型数据类似,除了DME患者的种族之外,VEGF基因型之间的人口学特征没有显著差异。大约65%的具有GG的DME患者是白种人,而38%的具有CC的DME患者是白种人。如上所述,结果可能提示亚洲人和白种人之间VEGF基因型频率不同。此外,VEGF基因型之间的基线BCVA没有显著差异(表6和表7)。
表6
通过VEGF的DME患者的人口学和基线BCVA
表7
通过VEGF的AMD患者的人口学和基线BCVA
如表8所示,亚洲人的GG基因型频率显著高于白种人(41.14%对28.10%)。另外,在白种人中观察到DME和AMD之间VEGF基因型的类似频率。
表8
VEGF基因型(rs2010963)频率
在DME患者中VEGF多态性对的反应的影响
合并两个DME临床试验,并进行ANCOVA模型以评估VEGF多态性对主要临床终点BCVA的影响。结果显示在表9、图6、图7和图8中。在任何时间点观察到基因型组之间对的反应没有显著差异。接受Lucentis治疗的患者的VEGF基因型和BCVA改善在第10和11个月之间存在关联性的趋势(p<0.1)(表9)。具有CC基因型的DME患者比具有CG或GG基因型的患者倾向于具有较少的BCVA改善。
表9
VEGF基因型对于DME患者对的BCVA反应的影响
在AMD患者中VEGF多态性对的反应的影响
合并三个AMD临床试验,并通过ANCOVA模型测试VEGF多态性对主要临床终点BCVA的影响。结果列于表10、图9和图10。在第3、5、8、9、10和11月,单一疗法的反应差异在基因型组之间显著(p<0.05)。在第6个月也有趋势(p<0.1)(表10)。
如图9所示,具有CC基因型的患者(n=27)单独用Lucentis治疗12个月后仅改善了1.48个字母。相比之下,CG(n=103)和GG(n=123)基因型的患者分别改善了6.25和6.77个字母。
表10在AMD患者中VEGF基因型对Lucentis的BCVA反应的影响
在AMD患者中EPO和VEGF多态性对的反应的加性效应
对治疗的反应是复杂的并受多种因素的影响。为了测试对反应的加性遗传效应的可能性,基因型数据根据EPO和VEGF基因中的风险等位基因的数量进行分层。通过ANCOVA模型测试风险等位基因对主要临床终点BCVA的加性效应。该分析仅针对AMD患者进行,而对于DME患者则不进行,因为在具有4个风险等位基因的组中患者数量极少。结果显示在表11、图11和图12中。
在第8、9和11个月,在风险组之间,单一疗法的反应差异显著(p<0.05)。在第5、6和10个月也有趋势(p<0.1)(表11)。0(n=18),1(n=84)和2(n=92)风险等位基因(图11)携带者对Lucentis单一疗法的反应没有显著差异。这些患者在12个月内改善了大约7.5个字母。相比之下,3个风险等位基因(n=45)的携带者显示中度改善(3.29个字母),而4个风险等位基因(n=12)的携带者在12个月中显示出BCVA(-4.75个字母)的显著下降。总体结果表明这两个基因对的反应具有显著的加性遗传效应。
表11在AMD患者中EPO和VEGF对于Lucentis的BCVA反应的加性效应
Claims (61)
1.一种选择性治疗罹患眼科病症的患者的方法,包括基于具有一种或多种眼科反应标志物的患者,向所述患者选择性施用治疗有效量的VEGF拮抗剂,所述眼科反应标志物选自:在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的单个等位基因,在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的两个等位基因,在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的单个等位基因和在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的两个等位基因。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述方法包括基于具有在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的两个等位基因的患者,向所述患者选择性施用所述VEGF拮抗剂。
3.如权利要求1或2所述的方法,其中所述方法包括基于具有在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的单个等位基因的患者,向所述患者选择性施用所述VEGF拮抗剂。
4.如权利要求1或2所述的方法,其中所述方法包括基于具有在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的两个等位基因的患者,向所述患者选择性施用所述VEGF拮抗剂。
5.一种选择性治疗罹患眼科病症的患者的方法,包括基于具有在基因座rs1617640处具有胸腺嘧啶的至少一个等位基因的患者,向所述患者选择性施用治疗有效量的EPO拮抗剂,或施用VEGF拮抗剂和EPO拮抗剂的组合。
6.如权利要求5所述的方法,其中基于具有在基因座rs1617640处具有胸腺嘧啶的两个等位基因的患者,向所述患者施用所述治疗有效量的VEGF拮抗剂和EPO拮抗剂。
7.一种用VEGF拮抗剂选择性治疗罹患眼科病症的患者的方法,包括:
a)基于具有一种或多种眼科反应标志物的患者,选择用VEGF拮抗剂治疗的患者,所述眼科反应标志物选自:在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的单个等位基因,在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的两个等位基因,在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的单个等位基因和在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的两个等位基因;和
b)此后,向患者施用治疗有效量的VEGF拮抗剂。
8.如权利要求7所述的方法,其中基于具有在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶之外的核苷酸的两个等位基因的患者,选择所述患者用VEGF拮抗剂进行治疗。
9.如权利要求7或8所述的方法,其中基于具有在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的单个或两个等位基因的患者,选择所述患者用VEGF拮抗剂进行治疗。
10.一种用EPO拮抗剂,或用VEGF拮抗剂和EPO拮抗剂的组合选择性治疗罹患眼科病症的患者的方法,包括:
a)基于具有在基因座rs1617640处具有胸腺嘧啶的至少一个等位基因的患者,选择用VEGF和EPO拮抗剂治疗的患者;和
b)此后,向患者施用治疗有效量的VEGF拮抗剂和/或EPO拮抗剂。
11.一种用VEGF拮抗剂和EPO拮抗剂的组合选择性治疗罹患眼科病症的患者的方法,包括:
a)基于具有在基因座rs1617640处具有胸腺嘧啶的两个等位基因的患者,选择用VEGF和EPO拮抗剂治疗的患者;和
b)此后,向患者施用治疗有效量的VEGF拮抗剂和/或EPO拮抗剂。
12.一种用VEGF拮抗剂选择性治疗罹患眼科病症的患者的方法,包括:
a)测定来自患者的生物样品中的一种或多种眼科反应标志物,所述眼科反应标志物选自:在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶之外的核苷酸的单个等位基因,在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶之外的核苷酸的两个等位基因,在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的单个等位基因和在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的两个等位基因;和
b)此后,向患者选择性施用所述VEGF拮抗剂。
13.如权利要求12所述的方法,其中所述测定包括测定患者的在基因座rs1617640处具有不同于胸腺嘧啶的核苷酸的一个或多个等位基因。
14.如权利要求12或13所述的方法,其中所述测定包括测定患者的在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的一个或多个等位基因。
15.一种用EPO拮抗剂,或用VEGF拮抗剂和EPO拮抗剂的组合选择性治疗罹患眼科病症的患者的方法,包括:
a)测定来自患者的生物样品中至少一个在基因座rs1617640处具有胸腺嘧啶的等位基因;和
b)此后,向患者选择性施用所述VEGF拮抗剂和/或EPO拮抗剂。
16.一种用EPO拮抗剂,或用VEGF拮抗剂和EPO拮抗剂的组合选择性治疗罹患眼科病症的患者的方法,包括:
a)测定来自患者的生物样品中在基因座rs1617640处具有胸腺嘧啶的两个等位基因;和
b)此后,向患者选择性施用所述VEGF拮抗剂和/或EPO拮抗剂。
17.一种用VEGF拮抗剂选择性治疗罹患眼科病症的患者的方法,包括:
a)测定来自患者的生物样品中的一种或多种眼科反应标志物,所述眼科反应标志物选自:在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶之外的核苷酸的单个等位基因,在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶之外的核苷酸的两个等位基因,在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的单个等位基因和在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的两个等位基因;
b)此后,基于来自具有一种或多种眼科反应标志物的患者的生物样品,选择用VEGF拮抗剂治疗的患者,所述眼科反应标志物选自:在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的单个等位基因,在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶之外的核苷酸的两个等位基因,在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的单个等位基因和在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的两个等位基因;和
c)此后,施用治疗有效量的VEGF拮抗剂。
18.如权利要求17所述的方法,其中基于具有在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的两个等位基因的生物样品,选择所述患者。
19.如权利要求17或18所述的方法,其中基于具有在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的单个等位基因的生物样品,选择所述患者。
20.如权利要求17或18所述的方法,其中基于具有在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的两个等位基因的生物样品,选择所述患者。
21.一种用EPO拮抗剂,或用VEGF拮抗剂和EPO拮抗剂的组合选择性治疗罹患眼科病症的患者的方法:
a)测定来自患者的生物样品中至少一个在基因座rs161764处具有胸腺嘧啶的等位基因;
b)此后,基于来自具有在基因座rs161764处具有胸腺嘧啶的至少一个等位基因患者的生物学样品,选择用VEGF拮抗剂和EPO拮抗剂的组合治疗的患者;和
c)此后,施用治疗有效量的VEGF拮抗剂和/或EPO拮抗剂。
22.一种用EPO拮抗剂,或用VEGF拮抗剂和EPO拮抗剂的组合选择性治疗罹患眼科病症的患者的方法,包括:
a)测定来自患者的生物样品中至少两个在基因座rs161764处具有胸腺嘧啶的等位基因;
b)此后,基于来自具有在基因座rs161764处具有胸腺嘧啶的两个等位基因的患者的生物样品,选择用VEGF拮抗剂和EPO拮抗剂的组合治疗的患者,和
c)此后,施用治疗有效量的VEGF拮抗剂和/或EPO拮抗剂。
23.如权利要求12至22中任一项所述的方法,其中所述测定步骤包括测定所述生物样品的包含基因座rs161764和/或基因座rs2010963的基因组序列。
24.如权利要求12-23中任一项所述的方法,其中所述生物样品选自滑液、血液、血清、粪便、血浆、尿、眼泪、唾液、脑脊液、白细胞样品和组织样品。
25.如权利要求12至24中任一项所述的方法,其中所述测定步骤包括选自以下的技术:聚合酶链反应(PCR)、基于TaqMan的测定、直接测序、动态等位基因特异性杂交、高密度寡核苷酸SNP阵列、限制性片段长度多态性(RFLP)分析、引物延伸分析、寡核苷酸连接酶分析、单链构象多态性分析、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、变性高效液相层析、高分辨率熔解分析、DNA错配结合蛋白测定、毛细管电泳、Southern印迹、流式细胞术、HPLC和质谱分析法。
26.用于治疗罹患眼科病症的患者的VEGF拮抗剂,其特征在于基于具有一种或多种眼科反应标志物的患者,而向所述患者施用治疗有效量的VEGF拮抗剂,所述一种或多种眼科反应标志物选自:在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的单个等位基因,在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的两个等位基因,在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的单个等位基因以及在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的两个等位基因。
27.用于治疗罹患眼科病症的患者的VEGF拮抗剂,其特征基于具有在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶之外的核苷酸的两个等位基因的患者,而向所述患者施用在于治疗有效量的VEGF拮抗剂。
28.用于治疗罹患眼科病症的患者的VEGF拮抗剂和EPO拮抗剂的组合,其特征在于基于具有在基因座rs1617640处具有胸腺嘧啶的至少一个等位基因的患者,而向所述患者施用治疗有效量的VEGF拮抗剂和EPO拮抗剂的组合。
29.用于治疗罹患眼科病症的患者的VEGF拮抗剂和EPO拮抗剂的组合,其特征在于基于具有在基因座rs1617640处具有胸腺嘧啶的至少两个等位基因的患者,而向所述患者施用治疗有效量的VEGF拮抗剂和EPO拮抗剂的组合。
30.用于治疗罹患眼科病症的患者的EPO拮抗剂,其特征在于基于具有至少一个在基因座rs1617640处的胸腺嘧啶的等位基因的患者,而向所述患者施用治疗有效量的EPO拮抗剂。
31.用于治疗罹患眼科病症的患者的EPO拮抗剂,其特征在于基于具有至少两个在基因座rs1617640处具有胸腺嘧啶的等位基因的患者,而向所述患者施用的治疗有效量的EPO拮抗剂。
32.一种预测罹患眼科病症的患者对用VEGF拮抗剂治疗有反应的可能性的方法,包括测定来自患者的生物样品中存在或不存在一种或多种选自以下的眼科反应标志物:在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的单个等位基因,在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶之外的核苷酸的两个等位基因,在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的单个等位基因和在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的两个等位基因。
33.一种预测罹患眼科病症的患者对用VEGF拮抗剂治疗有反应的可能性的方法,包括测定来自患者的生物样品中存在或不存在在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶之外的核苷酸的两个等位基因。
34.一种预测罹患眼科病症的患者对使用EPO拮抗剂,或使用VEGF拮抗剂与EPO拮抗剂的组合的治疗有反应的可能性的方法,包括测定来自患者的生物样品中存在或不存在至少一个在基因座rs1617640处具有胸腺嘧啶的等位基因。
35.一种预测罹患眼科病症的患者对用EPO拮抗剂,或用VEGF拮抗剂与EPO拮抗剂的组合的治疗有反应的可能性的方法,包括测定来自患者的生物样品中存在或不存在两个在基因座rs1617640处具有胸腺嘧啶的等位基因。
36.如权利要求32至35中任一项所述的方法,还包括从所述患者获得所述生物样品的步骤,其中在所述检测步骤之前执行所述获得步骤。
37.如权利要求32至35中任一项所述的方法,其中所述测定步骤包括测定所述生物样品的一种或多种眼科反应标志物的基因组序列,所述眼科反应标志物选自:在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的单个等位基因,在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的两个等位基因,在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的单个等位基因以及在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的两个等位基因。
38.如权利要求32-37中任一项所述的方法,其中所述生物样品选自由滑液、血液、血清、粪便、血浆、尿、眼泪、唾液、脑脊液、白细胞样品和组织样品。
39.如权利要求32-38中任一项所述的方法,其中所述测定步骤包括选自以下的技术:聚合酶链反应(PCR)、基于TaqMan的测定、直接测序、动态等位基因特异性杂交、高密度寡核苷酸SNP阵列、限制性片段长度多态性(RFLP)分析、引物延伸分析、寡核苷酸连接酶分析、单链构象多态性分析、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、变性高效液相层析、高分辨率熔解分析、DNA错配结合蛋白测定、毛细管电泳、Southern印迹、流式细胞术、HPLC和质谱分析法。
40.一种用于产生可传递形式的信息的方法,所述信息用于预测罹患眼科病症的患者对用VEGF拮抗剂治疗的反应,所述方法包括基于一个或多个眼科反应标志物的存在,确定患者对VEGF拮抗剂治疗的反应的增加的可能性,所述眼科反应标志物选自:在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的单个等位基因,在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的两个等位基因,在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的单个等位基因和在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的两个等位基因,并将确定步骤的结果记录在有形或无形介质形式上用于传递。
41.一种产生用于预测罹患眼科病症的患者对用VEGF拮抗剂治疗的反应性的可传递形式的信息的方法,包括基于在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的两个等位基因的存在,确定患者对VEGF拮抗剂治疗的反应的增加的可能性,并将确定步骤的结果记录在有形或无形介质形式上用于传递。
42.一种用于产生用于预测罹患眼科病症的患者对用EPO拮抗剂,或用VEGF拮抗剂和EPO拮抗剂的组合治疗的反应性的可传递形式的信息的方法,包括基于至少一个在基因座rs1617640处具有胸腺嘧啶的等位基因的存在,确定患者对用EPO拮抗剂,或用VEGF拮抗剂和EPO拮抗剂的组合治疗的反应的增加的可能性,并将确定步骤的结果记录在有形或无形介质形式上用于传递。
43.一种产生用于预测罹患眼科病症的患者对用EPO拮抗剂,或用VEGF拮抗剂与EPO拮抗剂的组合治疗的反应性的可传递形式的信息的方法,包括基于在基因座rs1617640处具有胸腺嘧啶的两个等位基因的存在,确定患者对EPO拮抗剂治疗,或VEGF拮抗剂和EPO拮抗剂的组合治疗的反应的增加的可能性,并将确定步骤的结果记录在有形或无形介质形式上用于传递。
44.如前述权利要求中任一项所述的方法或用途,其中所述眼部病症是黄斑变性。
45.如权利要求36所述的方法或用途,其中所述黄斑变性是年龄相关性黄斑变性。
46.如权利要求1-43中任一项所述的方法或用途,其中所述眼科病症是糖尿病性黄斑水肿。
47.如权利要求1-43中任一项所述的方法或用途,其中所述眼科病症是糖尿病性视网膜病变。
48.如前述权利要求中任一项所述的方法或用途,其中所述VEGF拮抗剂是VEGF结合分子或VEGF受体结合分子。
49.如权利要求48所述的方法或用途,其中所述VEGF结合分子或VEGF受体结合分子是VEGFA结合分子。
50.如权利要求49所述的方法或用途,其中所述VEGFA结合分子是抗VEGFA抗体或其抗原结合部分或衍生物。
51.如权利要求50所述的方法或用途,其中所述抗VEGFA抗体或其抗原结合部分或衍生物选自贝伐单抗或雷珠单抗。
52.如权利要求51所述的方法或用途,其中所述抗VEGFA抗体或其抗原结合部分或衍生物是雷珠单抗。
53.如权利要求50所述的方法或用途,其中所述抗VEGFA抗体或其抗原结合部分或衍生物选自:美国专利申请公开20120014958中描述的NVS4、NVS80、NVS81、NVS82、NVS83、NVS84和NVS85,或美国专利申请公开20140186350中描述的VEGFA抗体或其抗原结合部分或衍生物。
54.如前述权利要求中任一项所述的方法或用途,其中所述抗EPO拮抗剂是抗体或其抗原结合部分或衍生物。
55.如权利要求54所述的方法或用途,所述抗EPO拮抗剂是抗体或其抗原结合部分或衍生物选自具有美国专利申请公开号2014/0199306中所公开的Fab NVS1、NVS2、NVS3或NVS4(包括包含Fabs NVS1-4的抗体或其衍生物)的CDR序列的抗体或其衍生物。
56.一种确定具有视网膜病症的个体对用VEGF拮抗剂治疗的反应性的方法,所述方法包括:
(i)从患有视网膜病症的个体分离样品;
(ii)进行检测一种或多种眼科反应标志物的测定,所述眼科反应标志物选自在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的单个等位基因,在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的两个等位基因,在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的等位基因和在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的两个等位基因;
(iii)如果样品中存在一种或多种眼科反应标志物,则将该个体指定为VEGF拮抗剂反应者。
57.一种确定具有视网膜病症的个体对用EPO拮抗剂治疗的反应性的方法,所述方法包括:
(i)从患有视网膜病症的个体分离样品;
(ii)进行检测在基因座rs1617640处具有胸腺嘧啶的至少一个等位基因的存在的测定;
(iii)如果样品中存在眼科反应标志物,则将该个体指定为EPO拮抗剂反应者。
58.一种确定患有视网膜病症的个体是否应该用VEGF拮抗剂治疗的方法,所述方法包括:
(i)从个体中分离样品;
(ii)进行检测在基因座rs1617640处具有胸腺嘧啶的至少一个等位基因的存在的测定;
(iii)确定个体应该用VEGF拮抗剂治疗。
59.一种确定患有视网膜病症的个体是否应该用VEGF拮抗剂治疗的方法,所述方法包括:
(i)从个体中分离样品;
(ii)进行检测一种或多种眼科反应标志物的检测,所述眼科反应标志物选自在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的单个等位基因,在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的两个等位基因,在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的等位基因和在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的两个等位基因;
(iii)确定个体应该用VEGF拮抗剂治疗。
60.一种用于预测对VEGF拮抗剂的反应的试剂盒,所述试剂盒包含检测在基因座rs1617640处具有胸腺嘧啶的至少一个等位基因的存在所必需的试剂。
61.一种用于预测对VEGF拮抗剂的反应的试剂盒,所述试剂盒包含检测一种或多种眼科反应标志物所必需的试剂,所述眼科反应标志物选自在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的单个等位基因,在基因座rs1617640处具有除胸腺嘧啶以外的核苷酸的两个等位基因,在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的单个等位基因以及在基因座rs2010963处具有鸟嘌呤的两个等位基因。
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