CN104744593A

CN104744593A - 一种抗肿瘤血管生成免疫复合肽及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN104744593A
Application number: CN201310726540.3A
Authority: CN
Inventors: 万晓春; 吕卫东
Original assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Current assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date: 2013-12-25
Filing date: 2013-12-25
Publication date: 2015-07-01

Abstract

本发明提供了一种抗肿瘤血管生成免疫复合肽，所述抗肿瘤血管生成免疫复合肽包括血管内皮细胞生长因子VEGF的免疫原性表位、血小板衍生生长因子PDGF的免疫原性表位和促红细胞生成素EPO的免疫原性表位。该抗肿瘤血管生成免疫复合肽具有靶向VEGF、PDGF和EPO三种靶向位点的能力，从而更有效地抑制肿瘤生长；此外，该抗肿瘤血管生成免疫复合肽能作为主动免疫疫苗，能有效降低抗体药物免疫原性反应；本发明还提供了一种抗肿瘤血管生成免疫复合肽的制备方法和应用。

Description

一种抗肿瘤血管生成免疫复合肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药材料领域，具体涉及一种抗肿瘤血管生成免疫复合肽及其制备方法和应用。

背景技术

Judah folkman于1971年提出肿瘤的生长依赖于血管新生的理论，从而开创了肿瘤依赖性血管新生治疗的新纪元。越来越多的证据表明，肿瘤生长依赖于血管新生，以血管相关抗原为靶点的疫苗可以引发机体产生特异性细胞或体液免疫反应，抑制血管的形成，从而起到阻止肿瘤细胞生长和转移的作用。

血管内皮细胞生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）和刺激促红细胞生成素（EPO）是促进肿瘤血管生长作用的关键因子，是诱导血管生成的重要调节因素。在肿瘤的发生和发展过程中，肿瘤组织的缺氧环境会诱导VEGF和PDGF的表达，释放的VEGF和PDGF等血管生成刺激因子反过来刺激血管生成并为肿瘤组织供氧，其中，PDGF与其受体结合后，又可刺激EPO的分泌，EPO可促进红细胞生成，从而进一步为肿瘤的生长及转移提供足够的氧气。

目前，同时针对VEGF、PDGF和EPO三种靶点的疫苗还未见报道，因此，有必要提供一种能同时针对VEGF、PDGF和EPO三种靶点的疫苗及治疗方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种抗肿瘤血管生成免疫复合肽，该抗肿瘤血管生成免疫复合肽包括血管内皮细胞生长因子VEGF的免疫原性表位、血小板衍生生长因子PDGF的免疫原性表位和促红细胞生成素EPO的免疫原性表位，具有靶向VEGF、PDGF和EPO三种靶向位点的能力，从而更有效地抑制肿瘤生长；此外，该抗肿瘤血管生成免疫复合肽能作为主动免疫疫苗，能有效降低抗体药物免疫原性反应；本发明还提供了一种抗肿瘤血管生成免疫复合肽的制备方法和应用。

第一方面，本发明提供了一种抗肿瘤血管生成免疫复合肽，所述抗肿瘤血管生成免疫复合肽包括血管内皮细胞生长因子VEGF的免疫原性表位、血小板衍生生长因子PDGF的免疫原性表位和促红细胞生成素EPO的免疫原性表位。

优选地，所述血管内皮细胞生长因子VEGF的免疫原性表位的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述血小板衍生生长因子PDGF的免疫原性表位选自如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示氨基酸序列中的至少一种，所述促红细胞生成素EPO的免疫原性表位选自如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示氨基酸序列中的至少一种。

优选地，所述血管内皮细胞生长因子VEGF的免疫原性表位、血小板衍生生长因子PDGF的免疫原性表位和促红细胞生成素EPO的免疫原性表位之间通过连接肽连接。

进一步优选地，所述连接肽的氨基酸序列为GGGGS或GGGGSCGGGGS。

优选地，本发明提供的抗肿瘤血管生成免疫复合肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示。

具体地，SEQ ID NO:7为：

MLSDHSIRSGGGGSQVRKIEIVRKKPIFKKATGGGGSRTVRVRRPPKGKHRKFKGGGGSCGGGGSPLGLPVLGAPPRLICDGGGGSPKKDRARQEKKSVRGKGGGGSNITVPDTKVNF。

该序列组成分别标示如下：

本发明通过计算机模拟，结合生物信息学等方法设计了多种抗肿瘤血管生成免疫复合肽的氨基酸序列，所述复合肽的氨基酸序列包括了VEGF、PDGF和EPO三种蛋白质的免疫原性表位。

本发明提供了以VEGF、PDGF、EPO为靶点的抗肿瘤血管生成免疫复合肽能同时靶向VEGF、PDGF和EPO三种靶向位点，比单一靶向用药更能有效抑制肿瘤血管生成，从而更有效地抑制肿瘤生长；其次，由于VEGF、PDGF和EPO三种靶向位点相互之前还具有协同作用，理论上可以联合使用单抗药物靶向多靶点进行治疗，但是有报道指出纯粹联合使用单抗药物，比如VEGF和PDGF的单抗药物，效果并不理想，而本发明提供的疫苗比单抗联合药物的效果更好。

此外，本发明提供了以VEGF、PDGF、EPO为靶点的抗肿瘤血管生成免疫复合肽能作为主动免疫疫苗，与单抗药物的被动免疫治疗相比，不仅能有效降低抗体药物免疫原性反应的风险，其主动免疫的方式还有助于引起人体更特异、更有效的免疫反应，提高免疫系统的攻击能力，从而更有效的抑制肿瘤生长；另外，该多靶点抗肿瘤血管生成免疫复合肽比传统的单一靶向的疫苗的药物耐受性更好。

第二方面，本发明提供了一种抗肿瘤血管生成免疫复合肽的制备方法，所述制备抗肿瘤血管生成免疫复合肽的方法为如下所述方法中的任一一种：

a.采用固相合成法合成复合肽，所述复合肽包括血管内皮细胞生长因子VEGF的免疫原性表位、至少一种血小板衍生生长因子PDGF的免疫原性表位和至少一种促红细胞生成素EPO的免疫原性表位，得到所述抗肿瘤血管生成免疫复合肽；

b.采用原核表达载体或真核表达载体表达具有编码抗肿瘤血管生成免疫复合肽的目的基因，经蛋白质纯化后，得到抗肿瘤血管生成免疫复合肽，所述抗肿瘤血管生成免疫复合肽包括血管内皮细胞生长因子VEGF的免疫原性表位、血小板衍生生长因子PDGF的免疫原性表位和促红细胞生成素EPO的免疫原性表位。

优选地，所述血管内皮细胞生长因子VEGF的免疫原性表位的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述血小板衍生生长因子PDGF的免疫原性表位的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示，所述促红细胞生成素EPO的免疫原性表位的氨基酸序列如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示。

进一步优选地，所述连接肽的氨基酸序列为GGGGS或GGGGSCGGGGS。

本发明采用的固相合成法合成抗肿瘤血管生成免疫复合肽，纯度高，效率高，适合工业化制备；本发明提供的采用基因工程表达目的基因，随后进行蛋白质纯化得到抗肿瘤血管生成免疫复合肽的方法，成本低，适合用于各种科学研究或小量生产。

优选地，所述固相合成法为Fmoc法。

第三方面，本发明提供了如第一方面所述的抗肿瘤血管生成免疫复合肽在制备预防、治疗或诊断癌症的药物中的应用。

本发明提供了的抗肿瘤血管生成免疫复合肽及其制备方法和应用具有如下有益效果：

（1）本发明提供的抗肿瘤血管生成免疫复合肽具有靶向VEGF、PDGF和EPO三种靶向位点的能力，能有效抑制肿瘤生长；

（2）本发明提供的抗肿瘤血管生成免疫复合肽能作为主动免疫疫苗，有助于引起人体更特异、更有效的免疫反应，提高免疫系统的攻击能力，从而更有效的抑制肿瘤血管生成；

（3）本发明提供的抗肿瘤血管生成免疫复合肽的制备方法纯度高，效率高，适合工业化制备。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

实施例

一种抗肿瘤血管生成免疫复合肽的制备方法，包括以下步骤：

1、多肽合成：采用多肽合成仪(CS536，美国CSBio公司)合成如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，得到所述抗肿瘤血管生成免疫复合肽。

2、多肽纯化的仪器和条件：反向高效液相色谱（RP-HPLC）仪Shimadzu高效液相色谱系统/Discovery C18色谱柱，设置检测波长：220nm；纯度为92%。

3、质谱鉴定多肽分子量是否与理论相符合：激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)（BIFI EXTMIII德国），分子量为12KD。

粗肽合成后经液相色谱纯化后，采用MALDI-TOF MS进行表征，质谱信号显示本实施例制得了纯品多肽，可满足蛋白质分子相互作用研究。

为充分说明本发明实施例制备的抗肿瘤血管生成免疫复合肽的有益效果，

本发明还提供了效果实施例，如下所示：

效果实施例

①采用实施例1制备的抗肿瘤血管生成免疫复合肽免疫C57BL/6J小鼠，包括以下步骤：

（1）分别取PBS、实施例1制备的抗肿瘤血管生成免疫复合肽免疫小鼠，初次免疫按照100ug/只/次，将复合肽与弗氏完全佐剂1∶1比例完全乳化后，皮下多点注射，间隔三周后，第二次免疫，100ug/只，将复合肽与弗氏不完全佐剂混合乳化后免疫小鼠，皮下多点注射，间隔三周后第三次免疫，方法同第二次免疫，第三次免疫后七天，小鼠断尾取血，分别测定抗VEGF、抗EPO、抗PDGF抗体的滴度。

（2）ELISA法测定抗VEGF抗体的滴度

VEGF包被ELISA板，50ng/孔，4℃包被过夜，质量分数5％的脱脂乳37℃封闭2h，加系列稀释的小鼠抗血清，37℃孵育1h，用PBS-T洗涤3次，加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗(1∶6000)孵育30min。用PBS-T洗涤5次，TMB避光显色10min，2mol/L硫酸终止显色，酶标仪450nm测定A值，结果显示本发明的抗肿瘤血管生成免疫复合肽的抗VEGF抗体的滴度为1:16000，这说明了本发明的抗肿瘤血管生成免疫复合肽VEGF的抗原表位具有免疫原性，可在体内引起抗体反应，中和VEGF的促血管生成作用。

（3）ELISA法测定抗EPO抗体的滴度

EPO包被ELISA板，50ng/孔，4℃包被过夜，质量分数5％的脱脂乳37℃封闭2h，加系列稀释的小鼠抗血清，37℃孵育1h，用PBS-T洗涤3次，加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗(1∶6000)孵育30min。用PBS-T洗涤5次，TMB避光显色10min，2mol/L硫酸终止显色，酶标仪450nm测定A值，结果显示本发明的抗肿瘤血管生成免疫复合肽的抗EPO抗体的滴度为1:8000，这说明了本发明的抗肿瘤血管生成免疫复合肽EPO的抗原表位具有免疫原性，在体内引起抗EPO反应，中和EPO的促进肿瘤生长的作用。

（3）ELISA法测定抗PDGF抗体的滴度

PDGF包被ELISA板，50ng/孔，4℃包被过夜，质量分数5％的脱脂乳37℃封闭2h，加系列稀释的小鼠抗血清，37℃孵育1h，用PBS-T洗涤3次，加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗(1∶6000)孵育30min。用PBS-T洗涤5次，TMB避光显色10min，2mol/L硫酸终止显色，酶标仪450nm测定A值，结果显示本发明的抗肿瘤血管生成免疫复合肽的抗PDGF抗体的滴度为1:32000，这说明了本发明的抗肿瘤血管生成免疫复合肽PDGF的抗原表位具有免疫原性，在体内引起抗PDGF反应，中和PDGF的促进肿瘤生长的作用。

（4）肿瘤生长抑制实验检测抗肿瘤血管生成免疫复合肽抑制肿瘤血管生成效果

步骤（1）免疫小鼠第三次免疫后第10天，将处于指数增长期的B16黑色素瘤细胞，每只1×10⁵皮下接种于有后肢外侧，10天后PBS组有可触及肿瘤，隔天测量肿瘤体积，计算公式为V＝π/6(a×b²)作出肿瘤生长曲线，计算抑瘤率为65％，结果说明了本发明的抗肿瘤血管生成免疫复合肽可以显著抑制肿瘤的生长。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种抗肿瘤血管生成免疫复合肽，其特征在于，所述抗肿瘤血管生成免疫复合肽包括血管内皮细胞生长因子VEGF的免疫原性表位、血小板衍生生长因子PDGF的免疫原性表位和促红细胞生成素EPO的免疫原性表位。

2.如权利要求1所述的一种抗肿瘤血管生成免疫复合肽，其特征在于，所述血管内皮细胞生长因子VEGF的免疫原性表位的氨基酸序列如SEQID NO:1所示，所述血小板衍生生长因子PDGF的免疫原性表位选自如SEQID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示氨基酸序列中的至少一种，所述促红细胞生成素EPO的免疫原性表位选自如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示氨基酸序列中的至少一种。

3.如权利要求1所述的一种抗肿瘤血管生成免疫复合肽，其特征在于，所述血管内皮细胞生长因子VEGF的免疫原性表位、血小板衍生生长因子PDGF的免疫原性表位和促红细胞生成素EPO的免疫原性表位之间通过连接肽连接。

4.如权利要求3所述的一种抗肿瘤血管生成免疫复合肽，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列为GGGGS或GGGGSCGGGGS。

5.如权利要求1所述的一种抗肿瘤血管生成免疫复合肽，其特征在于，所述抗肿瘤血管生成免疫复合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

6.一种抗肿瘤血管生成免疫复合肽的制备方法，其特征在于，所述制备抗肿瘤血管生成免疫复合肽的方法为如下所述方法中的任一一种：

7.如权利要求6所述的一种抗肿瘤血管生成免疫复合肽的制备方法，其特征在于，所述血管内皮细胞生长因子VEGF的免疫原性表位的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述血小板衍生生长因子PDGF的免疫原性表位的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示，所述促红细胞生成素EPO的免疫原性表位的氨基酸序列如SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:6所示。

8.如权利要求6所述的一种抗肿瘤血管生成免疫复合肽的制备方法，其特征在于，所述血管内皮细胞生长因子VEGF的免疫原性表位、血小板衍生生长因子PDGF的免疫原性表位和促红细胞生成素EPO的免疫原性表位之间通过连接肽连接。

9.如权利要求8所述的一种抗肿瘤血管生成免疫复合肽的制备方法，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列为GGGGS或GGGGSCGGGGS。

10.如权利要求1所述的抗肿瘤血管生成免疫复合肽在制备预防或治疗癌症的药物中的应用。