CN101378772A - 组织保护性肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的组织保护性肽。本发明的组织保护性肽可以与组织保护性受体复合物结合。特别地，本发明涉及来源于细胞因子受体配体(包括促红细胞生成素(EPO))的部分或与该部分具有共有序列的组织保护性肽，所述部分不参与配体与受体复合物的结合，例如与EPO受体同二聚体的结合。相应地，本发明的组织保护性肽来源于细胞因子受体配体的区域的氨基酸序列，这些序列通常位于与受体复合物相对的配体蛋白质区域之上或之内，即，通常来源于当配体与受体结合时背向该受体复合物的配体蛋白质区域的氨基酸序列。本发明进一步涉及用于工程构建合成性组织保护性肽的共有序列。这些组织保护性肽也包括设计为模拟组织保护性受体配体(例如EPO)内关键氨基酸残基的空间位置的片段、嵌合体以及肽。本发明还包括使用本发明的组织保护性肽治疗或预防疾病或障碍的方法。本发明还包括使用本发明的组织保护性肽增强可兴奋组织功能的方法。

Description

组织保护性肽及其用途
1.引言
本发明涉及新的组织保护性肽。本发明的组织保护性肽可以与组织保护性受体复合物结合。特别地，本发明涉及来源于细胞因子受体配体(包括促红细胞生成素(EPO))的部分或与该部分具有共有序列的组织保护性肽，这些部分不参与配体与受体复合物的结合，例如与EPO受体同二聚体的结合。相应地，本发明的组织保护性肽来源于细胞因子受体配体的区域的氨基酸序列，这些序列通常位于与受体复合物相对的配体蛋白质区域之上或之内，即，通常来源于当配体与受体结合时背向受体复合物的配体蛋白质区域的氨基酸序列。本发明进一步涉及用于工程构建合成性组织保护性肽的共有序列。这些组织保护性肽也包括设计为模拟组织保护性受体配体(例如EPO)内关键氨基酸残基的空间位置的片段、嵌合体以及肽。
本发明还包括使用本发明的组织保护性肽治疗、预防或改善疾病或障碍和/或治疗、恢复或改善组织损伤的方法。本发明还包括使用本发明的组织保护性肽增强可兴奋组织功能的方法。
2.发明背景
促红细胞生成素(“EPO”)是一种糖蛋白激素，通常与红细胞压积的保持有关，最近发现，与组织保护有关。成熟的人EPO蛋白包含165个氨基酸，分子量为34kDa，糖基残基占分子重量的大约40％。EPO分子包含四个螺旋，这些螺旋在水环境中通过它们的疏水域相互作用，形成主要为球形的结构(Cheetham等人，1998，Nat.Struct.Biol.5:861-866，在此全文引用作为参考)。本发明源自一发现，即某些朝向水环境(即背向疏水性、球形中心核心)的氨基酸介导组织保护。可以根据对申请人已经鉴定的组织保护性区域的理解来衍生或者设计肽。
如上所述，EPO是多能性的。在其激素作用中，EPO通过其在红系祖细胞成熟为红细胞中的作用来调节红细胞压积。EPO在红系祖细胞的成熟过程中起抗细胞凋亡剂的作用，使祖细胞成熟为红细胞。组织氧水平的降低(缺氧)引发肾脏产生的促红细胞生成素增加，这导致红细胞生成增多。由于肾脏正常地产生大多数血清促红细胞生成素，则肾功能的损失例如慢性肾衰竭导致EPO产生减少并且通常导致贫血。类似地，贫血也可以起因于其它慢性疾病，例如癌症，或与这些疾病有关的治疗，如直接抑制EPO产生的化学治疗。商业上可以获得的重组促红细胞生成素已经可从Ortho Biotech公司(Raritan，NJ)商标为PROCRIT和Amgen公司(Thousand Oaks，CA)商标为EPOGEN的产品获得，并且已经用于治疗因晚期肾病、应用AZT(齐多夫定)对HIV感染患者、肿瘤患者的治疗、以及化学治疗引起的贫血。当前，高糖基化的促红细胞生成素，ARANESPTM(Amgen，Thousand Oaks，CA)，可用于贫血的治疗。另外，这些化合物已经用于提高经历手术的患者的红细胞压积，以减少对异体输血的需要。
最近，有几条证据暗示EPO也以旁分泌-自分泌的方式在局部起作用，以使组织损伤最小化。例如，EPO改善了含氧量低的细胞微环境，并且减少了由代谢性应激引起的程序性细胞死亡。这两种活性部分地通过EPO与特异性细胞表面受体的相互作用来调节，该受体部分地由促红细胞生成素受体(“EPOR”)蛋白质组成。EPOR是一种大约66kDa的蛋白质，是1型细胞因子受体家族的成员。该家族包括基于胞外域共有的同源性而归类在一起的受体，包括白介素IL-2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL9、IL11、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白血病抑制因子(LIF)、睫状神经营养因子(CNTF)、血小板生成素、生长激素和促乳素的受体。这些受体的保守的胞外域具有大约200个氨基酸的长度，在氨基末端区域包含4个在位置上保守的半胱氨酸残基(Cys 294、Cys 283、Cys 248和Cys 238，它们似乎对于受体的保持和结构完整性是关键性的(Murray，1996，Harpers Biochemistry第24版，第524-526页，Appilion & Lange公司；Caravella等人，1996，Protein:Struct.Funct.Gen.24:394-401，均在此全文引用作为参考)和接近跨膜域的Trp-Ser-X-Trp-Ser(SEQ ID NO:58)基序。
在红细胞生成方面，EPOR以类似于1型细胞因子受体家族内的其它受体的方式起作用。首先，受体配体，例如EPO，与预先形成的EPOR二聚体(EPOR)2结合。已经确定EPO通过配体表面上两个不同的区域与经典的(EPOR)2同二聚体受体的胞外域相互作用:高亲和力受体结合位点(位点1)和低亲和力受体结合位点(位点2)。与位点1相关的EPO的氨基酸序列是TKVNFY，SEQ ID NO:2，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸44-49，和SNFLRG，SEQ ID NO:3，对应于SEQ IDNO:1的氨基酸146-151；与位点2相关的序列是VLERY，SEQ ID NO:4，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸11-15，和SGLRS，SEQ ID NO:5，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸100-104(Cheetham等人，1998，Nature Structural Biology 5:861-866，在此全文引入作为参考)。EPOR同二聚体的活化导致与EPOR相关的信号蛋白例如Jak2酪氨酸激酶的酪氨酸磷酸化，该信号蛋白随后又可活化几个不同的通路，包括，例如，磷脂酰肌醇(PI)3-激酶通路、Ras/MAP激酶通路和/或STAT通路。这些通路触发由促红细胞生成素介导的红细胞生成所必需的抗细胞凋亡功能(Kirito等人，2002，Blood 99:102-110；Livnah等人，1999，Science283:987-990；Naranda等人，2002，Endocrinology 143:2293-2302；Remy等人，1999，Science 283:990-993；以及Yoshimura等人，1996，The Oncologist1:337-339，均在此全文引入作为参考)。
最近，申请人发现EPO的组织保护性质由一种受体介导，该受体不仅包含EPOR，而且包含另外一种受体蛋白质，β共同受体(“βc”)。EPOR/βc受体与同二聚体(EPOR)2不同，是一种杂合物(heterocomplex)(见下文)，并且已知在可兴奋组织的保护中起作用。参见，例如，2001年12月28日提交的WO2004/096148和PCT号PCT7US01/49479，2000年12月29日提交的美国专利申请号09/753,132，以及2002年7月3日提交的美国专利申请号10/188,905，均在此全文引用作为参考。尽管申请人已经明确βc受体是这些可兴奋组织中组织保护通路的核心，但是该受体的活化配体的结构还不清楚。
3.发明概述
本发明涉及在应答性细胞、组织或器官中具有至少一种细胞保护活性的分离的多肽，该多肽含有包含以下共有序列的氨基酸基序:(a)H1-N1-(X)n-N2-H2，其中n为0、1、2、3、4或5；(b)H1-N1-(X)n-N2-L1，其中n为0、1、2、3、4或5；(c)L1-N1-(X)n-N2-H1，其中n为0、1、2、3、4或5；(d)H1-N1-(L)n-P1-H2，其中n为0或1；或(e)H1-P1-(L)n-N1-H2，其中n为0或1，并且其中H1和H2为疏水性氨基酸，N1和N2为带负电荷的氨基酸，X为任意氨基酸，L1为极性氨基酸，P1为带正电荷的氨基酸。在某些实施方案中，本发明的肽还缺乏红细胞生成活性，例如，不增加接受者的血红蛋白或红细胞压积。在进一步的实施方案中，本发明的分离的多肽由不超过10个、不超过15个、不超过20个或不超过30个氨基酸组成。在其它实施方案中，分离的肽与SEQ IDNO:1所示的成熟人促红细胞生成素(“EPO”)的氨基酸序列的任意部分具有低于90％、低于85％、低于80％、低于75％、低于70％、低于65％、低于60％、低于55％、低于50％、低于45％、低于40％、低于35％、低于30％、或低于20％的序列同一性，其中EPO的所述部分含有与所述肽相同数目的氨基酸残基。
在上述本发明的某些实施方案中，其中分离的多肽包含结构基序(a)H1-N1-(X)n-N2-H2，其中n为0、1、2、3、4或5(分别表示为序列号6-11，如下文所述)；(b)H1-N1-(L)n-P1-H2，其中n为0或1(分别表示为序列号24-25，如下文所述)；或(e)H1-P1-(L)n-N1-H2，其中n为0或1(分别表示为序列号26-27，如下文所述)，H1和H2可以是相同的疏水性氨基酸。在上文所述的本发明的其它实施方案中，其中分离的多肽包含结构基序(a)H1-N1-(X)n-N2-H2，其中n为0、1、2、3、4或5；(d)H1-N1-(L)n-P1-H2，其中n为0或1；或(e)H1-P1-(L)n-N1-H2，其中n为0或1，H1和H2可以是不同的疏水性氨基酸。在其它实施方案中，本发明提供了分离的多肽，其包含氨基酸基序(a)H1-N1-(X)n-N2-H2，其中n为0、1、2、3、4或5；(b)H1-N1-(X)n-N2-L1，其中n为0、1、2、3、4或5；(c)L1-N1-(X)n-N2-H1，其中n为0、1、2、3、4或5，其中N1和N2可以相同也可以是不同的带负电荷的氨基酸。
本发明提供了包含上述氨基酸基序的分离的多肽，其中所述基序由所述多肽的氨基酸序列内的连续氨基酸形成。在根据该实施方案的特定实施例中，本发明提供了分离的多肽，其包含氨基酸基序:H1-N1-N2-H2(SEQ ID NO:6)、H1-N1-X-N2-H2(SEQ ID NO:7)、H1-N1-X-X-N2-H2(SEQ ID NO:8)、H1-N1-X-X-X-N2-H2(SEQ ID NO:9)、H1-N1-X-X-X-X-N2-H2(SEQ ID NO:10)、H1-N1-X-X-X-X-X-N2-H2(SEQ ID NO:11)、H1-N1-N2-L1(SEQ ID NO:12)、H1-N1-X-N2-L1(SEQ ID NO:13)、H1-N1-X-X-N2-L1(SEQ ID NO:14)、H1-N1-X-X-X-N2-L1(SEQ ID NO:15)、H1-N1-X-X-X-X-N2-L1(SEQ ID NO:16)、H1-N1-X-X-X-X-X-N2-L1(SEQ ID NO:17)、L1-N1-N2-H2(SEQ ID NO:18)、L1-N1-X-N2-H2(SEQ ID NO:19)、L1-N1-X-X-N2-H2(SEQ ID NO:20)、L1-N1-X-X-X-N2-H2(SEQ ID NO:21)、L1-N1-X-X-X-X-N2-H2(SEQ ID NO:22)、L1-N1-X-X-X-X-X-N2-H2(SEQ ID NO:23)、H1-N1-P1-H2(SEQ ID NO:24)、H1-N1-L1-P1-H2(SEQ ID NO:25)、H1-P1-N1-H2(SEQ ID NO:26)或H1-P1-L1-N1-H2(SEQ ID NO:27)，其中H1和H2为疏水性氨基酸，N1和N2为带负电荷的氨基酸，X为任意氨基酸，L1为极性氨基酸，P1为带正电荷的氨基酸。在符合该实施方案的某些方面，其中分离的多肽包含具有氨基酸残基H1和H2的基序，H1和H2可以相同也可以是不同的疏水性氨基酸。在符合该实施方案的其它方面，其中分离的多肽包含具有氨基酸残基N1和N2的基序，N1和N2可以相同也可以是不同的带负电荷的氨基酸。
在其它实施方案中，本发明提供了分离的多肽，其中氨基酸基序是由于多肽三级结构内氨基酸的空间组织而形成的，即，形成基序的氨基酸是在多肽的三维结构即三级结构中空间上彼此相邻的，但是可能被多肽链的一级氨基酸序列内的一个或多个氨基酸隔开。在根据本实施方案的特定实施例中，包含与上述SEQ ID NO:6类似的氨基酸残基H1、N1、N2和H2的氨基酸基序可能由于肽通过蛋白质折叠产生的三级结构而形成，包含例如SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11，其中N1和N2之间的氨基酸残基例如(X)n折叠，使得N1和N2成为线性相邻的。相应地，本发明包括分离的肽，其包含氨基酸基序H1N1N2H2；H1N1N2L1；L1N1N2H1；H1N1(L)nP1H2，其中n为0或1；或H1P1(L)nN1H2，其中n为0或1，该基序是由于所述多肽的三级结构而形成的。在相关实施方案中，其中氨基酸基序包含N1和N2，形成三级结构使得N1和N2的羰基碳之间的距离为大约3
Figure A200680034824D00191
至大约5
Figure A200680034824D00192
优选大约4
Figure A200680034824D00193
至大约5
Figure A200680034824D00194
更优选大约4.4
Figure A200680034824D00195
至大约4.8
Figure A200680034824D00196
在其它实施方案中，其中氨基酸基序包含N1和N2，形成三级结构使得N1和N2之间的距离在空间上被限制，使得两者的电荷分离距离，例如带电荷的侧链，介于大约6.5
Figure A200680034824D00197
至大约9
Figure A200680034824D00198
之间。在相关实施方案中，N1和N2由于位于形成α螺旋的全部或一部分的氨基酸序列中，因此在空间上被限制，并且可以被形成所述螺旋的所述氨基酸的序列中的1个、2个或2个以上的氨基酸所隔开。在其它相关实施方案中，其中氨基酸基序包含N1和P1，形成三级结构使得N1和P1的羰基碳之间的距离为大约3至大约5优选大约4
Figure A200680034824D001911
至大约5
Figure A200680034824D001912
更优选大约4.4至大约4.8
Figure A200680034824D001914
在其它实施方案中，其中氨基酸基序包含N1和P1，形成三级结构使得N1和P1之间的距离在空间上被限制，使得两者的电荷分离距离，例如带电荷的侧链，介于大约6.5
Figure A200680034824D001915
至大约9
Figure A200680034824D001916
之间。在相关实施方案中，N1和P1由于位于形成α螺旋的全部或一部分的氨基酸序列中，因此在空间上被限制，并且可以被形成所述螺旋的所述氨基酸的序列中的1个、2个或2个以上的氨基酸所隔开。在某些实施方案中，在所述多肽三级结构内形成基序的氨基酸被所述多肽线性氨基酸序列中数目相等的间插氨基酸残基彼此隔开。在其它实施方案中，在所述多肽三级结构内形成基序的氨基酸被所述多肽线性氨基酸序列中数目不等的间插氨基酸残基彼此隔开。在某些实施方案中，本发明的分离多肽形成规则的三级结构，例如α-螺旋或β-折叠片，使得所述结构的表面呈现包含所述基序的氨基酸，因而将基序本身，呈现给蛋白质结构和水环境的界面，即在折叠多肽的表面上呈现基序。在优选实施方案中，本发明的多肽在水环境中在生理条件下形成三级结构，例如，PBS(13mM NaH2PO4，137mM NaCl，pH 7.4)，37℃。
在特定实施方案中，本发明提供包含本文上述氨基酸基序的分离的多肽，例如肽A(APPRLICDSRVLERYLLEAKEAE，SEQ ID NO:32)、肽C(NITVPDTKVNFYAWKRMEVG，SEQ ID NO:29)、肽D(QQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLV，SEQ ID NO:30)、肽E(GCAEHCSLNENITVPDTKVN，SEQ ID NO:31)、肽F(RYLLUNITTGC，SEQID NO:33)、肽G(QEQLERALNSS，SEQ ID NO:40)、肽I(CSLNENIQEQLERALNSS，SEQ ID NO:43)、肽J(QEQLERALNSSLRRYINMLTRTR，SEQ ID NO:41)、肽K(WEHVNAIQEARRLL，SEQ ID NO:35)或肽L(KIRSDLTALTESYVKH，SEQID NO:37)。
在某些实施方案中，本发明提供了包含1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、或6个以上本文所述氨基酸基序的分离的多肽。在根据该实施方案的本发明的具体方面，其中分离的多肽包含至少两个本文以上所述的氨基酸基序，所述至少两个基序可以是相同的基序，也可以是不同的基序。
在某些方面，本发明提供了缺乏红细胞生成活性，例如提高接受者中的血红蛋白的分离的多肽。优选地，该分离的多肽缺乏其它活性，包括但不限于血管活性作用(例如血管收缩)、过度活化血小板、促凝活性和刺激凝血细胞和/或红细胞生成依赖性细胞的增殖和/或产生(参见Coleman等人，2006，PNAS103:5965-5970，在此全文引入作为参考)。在其它方面，本发明提供了包含至少一种细胞保护活性的分离的多肽。这种细胞保护活性包括但不限于:保护、维持、增强或恢复应答性哺乳动物细胞、组织或器官的功能或活力。相应地，在一个方面，本发明涉及本文所述的分离的多肽在制备用于保护、维持、增强或恢复应答性哺乳动物细胞和它们相关的细胞、组织或器官的功能或活力的药物组合物中的应用。在相关的实施方案中，所述组合物用于给需要的受试者施用。在优选实施方案中，所述受试者是哺乳动物，优选人类。
在其它方面，本发明涉及本文所述的分离的多肽在制备用于在需要的受试者中保护防止和/或预防应答性组织损伤、用于恢复或复原应答性组织和/或应答性组织功能的药物组合物中的应用。在一个特定方面，由于紧密的内皮细胞屏障，应答性哺乳动物细胞和它们的相关细胞、组织或器官位于脉管系统的远侧。在另一特定方面，从哺乳动物体内分离细胞、组织、器官或其它机体部分，例如用于移植。作为非限定性实例，应答性细胞或组织可以是神经元、眼(例如视网膜)、脂肪、结缔、毛发、牙、粘膜、胰、内分泌、耳、上皮、皮肤、肌肉、心脏、肺、肝、肾、肠、肾上腺(例如肾上腺皮质、肾上腺髓质)、毛细血管、内皮、睾丸、卵巢、骨、皮肤或子宫内膜细胞或组织。进一步地，应答性细胞的非限定性实例包括光感受器(视杆和视锥)、神经节、两极细胞、水平细胞、无长突细胞、米勒细胞、浦肯野细胞、心肌细胞、心律调整细胞(pace maker)、窦房结(sinoatrial node)、窦房结(sinus node)、结合组织、房室结、希氏束、肝细胞、星形细胞、枯否细胞、肾小球膜细胞、肾上皮细胞、小管间质细胞、杯状细胞、肠腺细胞(滤泡细胞)、肠内分泌、球状带、束状细胞(fasciculate)、网状细胞、嗜铬细胞、周细胞、莱迪希细胞、塞尔托利细胞、精子、格拉夫泡囊状卵泡(Graffian follicle)、原始卵泡、胰岛、α-细胞、β-细胞、γ-细胞、F-细胞、骨原细胞、破骨细胞、成骨细胞、子宫内膜基质、子宫内膜、干细胞和内皮细胞。应答性细胞的这些实例只是说明性的。在一个方面，应答性细胞或其相关细胞、组织或器官是可兴奋细胞、组织或器官，或主要包括可兴奋细胞或组织。在本发明的某些方面，可兴奋组织是中枢神经系统组织、周围神经系统组织、心脏组织或视网膜组织。在另一方面，应答性细胞或其相关细胞、组织或器官不是可兴奋细胞、组织或器官，它们也不主要包括可兴奋细胞或组织。
本发明的分离的多肽在应答性细胞中的红细胞生成和/或细胞保护活性可以通过本文描述的或本领域公知的任何方法来评价和/或确定。在某些实施方案中，红细胞生成和/或细胞保护活性通过体外试验确定。在其它实施方案中，红细胞生成和/或细胞保护活性通过体内试验确定。在其中细胞保护活性为神经保护的相关实施方案中，本发明提供了在体外评价所述活性的方法，包括(a)将原代海马神经元的待测培养物与N-甲基-D-天冬氨酸和所述肽接触；和(b)在所述接触48小时后测定细胞活力，由此如果在步骤(b)中测定的细胞活力大于不含所述肽的对照培养物的细胞活力，则该肽具有细胞保护活性。
在特定实施方案中，对其使用上述分离的肽的哺乳动物细胞、组织或器官是已经或将要在至少一种不利于细胞、组织或器官活力的状况下消耗一段时间的细胞、组织或器官。根据该实施方案，本发明的分离的肽提供了对抗这种状况引起的组织损伤的保护和/或预防，在这种状况发生之前、之中或之后在需要的受试者中提供组织和/或组织功能的恢复，或提供它们的复原。这种状况包括创伤性的原位缺氧或代谢功能障碍、手术诱导的原位缺氧或代谢功能障碍，或原位毒素暴露，后者可能与化学治疗或放射治疗有关。在其它实施方案中，本发明的分离的肽提供对抗疾病或障碍引起的组织损伤的保护和/或预防，在这种状况发生之前、之中或之后在需要的受试者中提供组织和/或组织功能的恢复，或提供它们的复原。在相关的实施方案中，所述损伤是由癫痫发作、多发性硬化、中风、高血压、心脏停搏、局部缺血、心肌梗塞、炎症、与年龄相关的认知功能损失、辐射损伤、大脑性瘫痪、神经退行性疾病、阿尔茨海默病、帕金森病、线粒体病、AIDS痴呆、记忆丧失、肌萎缩侧索硬化、酒精中毒、情感障碍、焦虑症、注意力缺乏症、自闭症、库杰二氏(Creutzfeld-Jakob)病、脑或脊髓创伤或缺血、心肺分流术、慢性心力衰竭、黄斑变性、糖尿病神经病变、糖尿病视网膜病、肝炎、胰腺炎、青光眼、视网膜缺血、视网膜创伤、心血管疾病、心肺疾病、呼吸疾病、肾病、泌尿系统疾病、生殖系统疾病、骨病、皮肤病、结缔组织病、胃肠疾病、内分泌异常、代谢异常、或中枢或周围神经系统的疾病或障碍。在其它实施方案中，不利状况是心肺分流术(心肺机)的结果，如在某些手术操作中采用的。在其它实施方案中，所述损伤是认知功能障碍。在一个特定实施方案中，对其使用上述分离的肽的哺乳动物细胞、组织或器官表达βc受体。
在某些实施方案中，本发明还涉及包含上述分离的多肽的药物组合物，其用于给需要的受试者施用。在根据该实施方案的特定方面，本发明的药物组合物进一步包含药学上可接受的载体。这些药物组合物可以配制为用于口服、鼻内、经眼、吸入、经皮、直肠、舌下、阴道或肠胃外施用，或者配制为用于保持离体的细胞、组织或器官活力的灌注液的形式。在本发明的相关实施方案中，受试者是哺乳动物，优选人类。
在其它方面，本发明提供了在有此需要的受试者中促进分子穿过内皮细胞屏障进行转胞吞的方法，包括给所述受试者施用包含与本发明的分离的肽结合的所述分子的组合物。在有关实施方案中，这种结合是与所述分子的结合部位的不稳定的共价键、稳定共价键或者非共价结合。
根据本发明的另一方面，如上所述，本发明的分离的肽能够穿过内皮细胞屏障。在相关实施方案中，该内皮细胞屏障包括血-脑屏障、血-眼屏障、血-睾丸屏障、血-卵巢屏障、血-胎盘、血-心脏、血-肾、血-神经、或血-脊髓屏障。
根据本发明的一个方面，提供了分离的核酸分子，该核酸分子包括编码一种多肽的核苷酸序列，该多肽包括如上所述的分离的多肽。
在本发明的另一实施方案中，提供了分离的核酸分子，该核酸分子包含核苷酸序列(即cDNA、被内含子隔断或未被内含子隔断的核苷酸序列)，该核苷酸序列编码包含如上所述的本发明的分离的多肽或由该多肽组成的多肽。在一个实施方案中，使用有利于在特定宿主细胞中最佳表达的偏好密码子合成编码本发明的分离的多肽的核苷酸序列。这些偏好密码子对于在植物、细菌、酵母、哺乳动物、真菌或昆虫物种的细胞中的表达是最优的。
本发明还提供包含该核酸分子的载体。本发明还提供了包含核酸分子和至少一种与该核苷酸分子可操作连接的调节区的表达载体。在另一实施方案中，本发明提供了包含该表达载体的细胞。在另一实施方案中，提供了包含该核酸分子的遗传工程改造的细胞。
在另一实施方案中，本发明提供了重组制备如上所述的本发明的分离的肽的方法，包括在适合所述肽表达的条件下，在培养基中培养含有核酸分子的宿主细胞，该核酸分子包含编码本发明的多肽的核苷酸序列，以及从所述培养基中回收和/或分离表达的多肽。
3.1术语
当与数字连用时，本文使用的术语“大约”或“近似”是指在所述数字的1％、5％或10％以内的任意数字。
在本发明的方法的上下文中，术语“与......结合施用”是指在疾病、障碍或病症发作之前、同时和/或之后施用化合物。
术语“氨基酸”或提到具体氨基酸意在包括天然存在的蛋白原性(proteogenic)氨基酸以及非天然存在的氨基酸如氨基酸类似物。本领域技术人员应当知道，除非另外明确指出，该定义包括天然存在的蛋白原性(L)-氨基酸，它们的光学(D)-异构体，化学修饰的氨基酸，包括氨基酸类似物，如青霉胺(3-巯基-D-缬氨酸)，天然存在的非蛋白原性(non-proteogenic)氨基酸，如正亮氨酸，和具有本领域已知的氨基酸的特有性质的化学合成的蛋白质。本文使用的氨基酸由如下三字母缩写或单字母符号表示:丙氨酸＝Ala或A，精氨酸＝Arg或R，天冬酰胺＝Asn或N，天冬氨酸＝Asp或D，半胱氨酸＝Cys或C，谷氨酸＝Glu或E，谷氨酰胺＝Gln或Q，甘氨酸＝Gly或G，组氨酸＝His或H，异亮氨酸＝Ile或I，亮氨酸＝Leu或L，赖氨酸＝Lys或K，甲硫氨酸＝Met或M，苯丙氨酸＝Phe或F，脯氨酸＝Pro或P，丝氨酸＝Ser或S，苏氨酸＝Thr或T，色氨酸＝Trp或W，酪氨酸＝Tyr或Y，以及缬氨酸＝Val或V。另外，术语“氨基酸等同物”是指这样的化合物:它们与天然存在的氨基酸的结构不同，但是基本上具有氨基酸的结构，使得它们可以在肽内发生取代，该肽尽管存在取代仍然保留其生物活性。因此，例如，氨基酸等同物可以包括具有侧链修饰或取代的氨基酸，也包括相关的有机酸、酰胺等。术语“氨基酸”意在包括氨基酸等同物。术语“残基”既指氨基酸也指氨基酸等同物。如本领域所公知，氨基酸也可以分为以下类别:(1)疏水性氨基酸:His、Trp、Tyr、Phe、Met、Leu、Ile、Val、Ala；(2)中性亲水性氨基酸:Cys、Ser、Thr；(3)极性氨基酸:Ser、Thr、Asn、Gln；(4)酸性/带负电荷的氨基酸:Asp、Glu；(5)带电荷的氨基酸:Asp、Glu、Arg、Lys、His；(6)带正电荷的氨基酸:Arg、Lys、His；和(7)碱性氨基酸:His、Lys、Arg。
本文使用的“可兴奋组织”指含有可兴奋细胞的组织。可兴奋细胞是对电刺激积极响应并且具有跨细胞膜的电荷差的细胞。可兴奋细胞通常能够产生动作电位。这些细胞一般表达通道，如电压门控通道、配体门控通道，以及牵张通道(stretch channels)，这些通道允许跨膜的离子流(钾、钠、钙、氯等)。可兴奋组织包括神经元组织、肌肉组织和腺组织。可兴奋组织包括但不限于:神经元组织，如周围神经系统(耳和视网膜)和中枢神经系统(脑和脊髓)的组织；心血管组织，如心脏和相关神经的细胞；以及腺组织，如胰腺，其中T型钙通道和细胞-细胞间隙连接一同参与胰岛素的分泌。可兴奋组织的示范性列表包括器官和组织，包括神经、骨骼肌、平滑肌、心肌、子宫、中枢神经系统、脊髓、脑、视网膜、嗅觉系统、听觉系统等。
本文使用的术语“宿主细胞”是指用核酸分子转染的特定受试细胞和该细胞的后代或可能的后代。由于在传代或核酸分子向宿主细胞基因组中整合时可能发生的突变或环境影响，这样的细胞的后代可能与核酸分子转染的亲代细胞不同。
“分离的”或“纯化的”多肽基本上不含来自从中获得该蛋白质或多肽的细胞或组织来源的细胞物质或其它污染蛋白质，或者基本上不含化学合成时的化学前体或其它化学物质。语句“基本上不含细胞物质”包括多肽制品，其中多肽与从中分离或重组产生该多肽的细胞的细胞组分相分离。因此，基本上不含细胞物质的多肽包括含有低于约30％、20％、10％或5％(干重)异源蛋白质(在此也被称为“污染蛋白质”)的多肽制品。当重组制备多肽时，该多肽优选地也基本上不含培养基，即，培养基占蛋白质制品体积的不到约20％、10％或5％。当通过化学合成制备多肽时，该多肽优选地基本上不含化学前体或其它化学物质，即，与参与蛋白质合成的化学前体或其它化学物质相分离。相应地，这些多肽制品具有低于约30％、20％、10％、5％(干重)的感兴趣的抗体以外的化学前体或化合物。在优选实施方案中，本发明的多肽是分离的或纯化的。
“分离的”核酸分子是从该核酸分子的天然来源中存在的其它核酸分子中分离出的核酸分子。而且，“分离的”核酸分子，如cDNA分子，可基本上不含其它细胞物质，或培养基(当通过重组技术制备时)，或者基本上不含化学前体或其它化学物质(当化学合成时)。在特定实施方案中，编码本发明多肽的核酸分子是分离的或纯化的。
本文在提到多肽内的结构时，术语“基序”是指多肽链氨基酸序列内的一组连续的氨基酸和/或所述多肽的三级结构内的一组线性相邻氨基酸。因为基序可以全部地或部分地由于蛋白质折叠而形成，所述基序中相邻的氨基酸可以在多肽的线性氨基酸序列内间隔0、1个或更多、5个或更多、10个或更多、15个或更多、或20个或更多的氨基酸。
本文使用的术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可以互换并且最广义地使用，用于指受约束的(即，具有一些结构元件，例如存在起始形成β转角或β折叠片的氨基酸，或者例如由于存在二硫键连接的Cys残基而环化)或未受约束的(例如线性的)氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明的肽由少于30个氨基酸组成。然而，在阅读本发明的公开内容后，本领域技术人员将认识到用来区分本发明的肽的不是特定肽的长度而是其结合组织保护性受体复合物和/或与本文所述肽竞争结合的能力。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”也指含有氨基酸等同物或其它非氨基酸基团而仍然保持肽的所需功能活性的化合物。肽等同物与常规肽的区别可能在于一个或多个氨基酸被相关的有机酸(如PABA)、氨基酸等替代，或者侧链或官能团的取代或修饰。
术语“预防疾病、障碍或病症”意思是延迟这种疾病、障碍或病症的发作、阻止其进展、阻止其发生、防止、抑制或消除其发生或减少其发病率。术语“预防”的使用并非暗示接受预防性治疗的患者群体中的所有患者都永远不发生所预防的疾病、障碍或病症，而是该患者群体表现为该疾病、障碍或病症的发病率降低。例如，多种流感疫苗在施用该疫苗的人群中并不能100％有效地预防流感。本领域技术人员可以容易地确定预防性治疗将会使其受益的患者和状况，例如但不限于，将要参加可能导致外伤和损伤的活动的个体(例如参加军事作业的士兵、赛车手等)，计划进行手术的患者，具有患遗传性疾病、障碍或病症风险的患者，具有患环境因素引起的疾病、障碍或病症风险的患者，或者具有患特定疾病、障碍或病症风险的部分人群诸如老人、婴儿或免疫系统减弱者，或者具有患疾病、障碍或病症的遗传上的或其它的风险因素的患者。
本文使用的术语“受试者”和“患者”可以互换使用。本文使用的术语“受试者”是指动物，优选哺乳动物，包括非灵长类(例如牛、猪、马、猫、狗、大鼠和小鼠)和灵长类(例如猴或人)，更优选人类。
本文使用的术语“组织保护活性”或“组织保护”是指抑制或延迟细胞、组织或器官损伤或死亡的作用。除非另外指出，相对于不存在本发明的肽的对照条件，评价细胞、组织或器官的损伤或死亡的“延迟”。组织保护活性在多种病症、疾病和细胞、器官和/或组织损伤中有用，例如，在第5.3节中所述。组织保护活性是表达组织保护性受体复合物的组织、细胞和/或器官(即，分别为反应性组织、细胞和/或器官)特有的，例如，但不限于，中枢神经系统的组织。在特定实施方案中，应答性细胞不是红细胞祖细胞。
本文使用的术语“组织保护性受体复合物”是指包含至少一个促红细胞生成素受体亚单位和至少一个β共同受体亚单位的复合物。组织保护性受体复合物可以含有多个促红细胞生成素受体亚单位和/或β共同受体亚单位，以及其它类型的受体或蛋白质。参见WO 2004/096148，其在此全文引用作为参考。
为了确定两个氨基酸序列的百分同一性，为了最佳对比的目的将两个序列比对。然后比较相应氨基酸位点处的氨基酸残基。当第一个序列中的位点与第二个序列的相应位点被相同的氨基酸残基占据时，这两个分子在该位点处是相同的。两个序列之间的百分比同一性是序列共有的相同位点数的函数(即％同一性＝相同重叠位点数/位点总数×100％)。在一个实施方案中，两个序列长度相同。在替代实施方案中，两个序列的长度不同，相应地，百分比同一性是指较短序列与较长序列的一部分的比较，其中所述部分与所述较短序列的长度相同。
4.附图简述
图1显示体内坐骨神经损伤模型的结果，以比较肽J(SEQ ID NO:41)与组织保护分子氨甲酰化EPO(CEPO)的功效，其中肽J(SEQ ID NO:41)是由EPO螺旋B的朝向外侧的氨基酸(即肽G，SEQ ID NO:40)与胰多肽的两亲性螺旋(LRRYINMLTRP，SEQ ID NO:28)组合成的嵌合肽。
图2显示在体内坐骨神经损伤模型中检测的本发明肽的组织保护作用。在该试验中，使大鼠(每组n＝6)的右侧坐骨神经损伤，立即给动物施用PBS，或含有等摩尔浓度的氨甲酰化EPO、EPO肽A(SEQ ID NO:32，对应于SEQ IDNO:1的氨基酸1-23)、肽D(SEQ ID NO:30，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸58-82)或肽G(SEQ ID NO:40)的PBS。肽G(SEQ ID NO:40)基于EPO的螺旋B内的氨基酸，所述氨基酸从EPO分子的球形中心向外朝向亲水性环境内，即存在于多肽的表面上。另外，也包括由已知通过另一受体具有组织保护性的色素上皮衍生因子的区域构建的20个氨基酸作为阴性对照。此后4天的损伤恢复证明肽G(SEQ ID NO:40)和肽D(SEQ ID NO:30)在该体内模型试验中表现出组织保护效果，其效果等同于或者好于氨甲酰化EPO(CEPO)。
图3显示肽D(SEQ ID NO:30)和已知缺乏红细胞生成活性的CEPO的红细胞生成效果，这是通过检测红细胞生成活性的UT-7试验测定的。该体外测定的结果证明肽D(SEQ ID NO:30)和CEPO在高达10,000pM的剂量时都不显示红细胞生成活性。
图4显示体内测定结果，该测定用来确定肽F(SEQ ID NO:33，对应于SEQID NO:1的氨基酸14-29)和肽G(SEQ ID NO:40)是否具有红细胞生成活性，或者诱导针对EPO的中和抗体。结果证明这两种蛋白质在以0.8μg/kg每周3天皮下(s.c.)施用130天时，都未提高大鼠的血红蛋白水平。另外，与施用EPO相反，这两种肽都不引发抗体应答。
图5显示体外研究结果，该结果证明肽D(SEQ ID NO:30)保护运动神经元避免红藻氨酸盐诱导的死亡。
图6显示剂量为0.1ng/ml和1ng/ml的肽D(SEQ ID NO:30)保护P-19细胞避免与血清剥夺(serum deprivation)有关的细胞凋亡。
图7A-B显示在大鼠中进行的大脑中动脉闭塞测定的结果。图7A所示的图证明单剂量4.4μg/kg的肽D(SEQ ID NO:30，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸58-82)能够与每间隔2小时施用的4剂4.4μg/kg一样有效地减少脑中梗塞的体积。图7B显示用来确定大脑中动脉闭塞引起的行为缺陷的脚误(foot fault)试验的结果。图7B显示当以单剂量方案(1×4.4μg/kg)和多剂量方案(4×4.4μg/kg)施用肽D(SEQ ID NO:30)时证明大鼠的行为改善。
图8A-B显示糖尿病神经病变测定的体内测定结果。使用链脲霉素在大鼠中诱发糖尿病。在证实诱发了糖尿病后，用4μg/kg-bw剂量的肽D(SEQ IDNO:30)或PBS腹膜内处理大鼠，每周5次，持续2周。观察大鼠的神经传导速度和热板等待时间(hot plate latency)。图8A证明用肽D(SEQ ID NO:30)处理的大鼠与未处理的大鼠相比表现出提高的传导速度。图8B证明被处理大鼠的热板等待时间比未处理大鼠缩短，进一步证明传导速度提高。
图9A-B显示用EPO螺旋B嵌合体治疗顺铂诱导的神经病和肾病的结果。图9A证明用肽G(SEQ ID NO:40，螺旋B嵌合体)治疗的动物在热板等待时间测定中显示改善的结果。图9B证明肽G(SEQ ID NO:40)治疗的动物的尿量(肾功能的一个测量指标)保持正常。
图10显示肽D(SEQ ID NO:30)对与糖尿病视网膜病有关的视网膜渗漏的效果。该图证明，肽D(SEQ ID NO:30)能够基本上减少被处理动物的视网膜渗漏。
图11显示肾缺血-再灌注模型上肽F(SEQ ID NO:33)或肽G(SEQ ID NO:40)的结果。该图证明在72小时后评价时，这两种肽都减少了缺血-再灌注损伤60分钟引起的损伤得分。
图12说明施用肽F(SEQ ID NO:33)保护小鼠避免了实验性脑型疟。
图13是用肽E(SEQ ID NO:31)处理的鼠EAE模型的临床得分。图13显示实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中神经系统功能的临床过程。每天腹膜内施用4.4μg/kg的肽E。肽E的施用相对于比照显著改善了神经系统功能。临床分期:1.尾巴松弛；2.神经系统功能和/或后肢轻瘫，或慢翻正反射；3.后肢麻痹和/或前肢轻瘫；4.前肢轻瘫；5.垂死或死亡。
5.发明详述
5.1组织保护性肽
促红细胞生成素(“EPO”)的红细胞生成活性已经在本领域中很好地表征(参见，例如，Cheetham等人，1998，Nat.Struct.Biol.5；861-866，在此全文引用作为参考)。EPO通过以桥接各个EPOR亚单位上特定位点的方式与预先形成的促红细胞生成素受体(EPOR)同二聚体(即，(EPOR)2)的胞外部分结合，从而启动红细胞生成。当EPO与(EPOR)2结合时，球形配体的大部分远离结合区且面向外部，背离EPO和(EPOR)2的复合物而朝向水性介质内。申请人已经确定与红细胞生成不同的组织保护是通过不同于(EPOR)2的受体介导的，该受体是由EPOR单体和另一种受体CD131(也被称为β-共同受体亚单位(βc))结合组成的。EPOR和βc相互作用，形成受体异二聚体EPOR-βc。现在还不清楚是否有其它蛋白质参与这一相互作用。本发明公开了由EPO的三维结构衍生的组织保护性肽，特别是由背离EPOR结合位点的EPO部分衍生的组织保护性肽，即，由不与经典的红细胞生成EPOR(EPOR)2同二聚体相互作用的EPO部分衍生的组织保护性肽。不希望被任何特定理论所束缚，申请人认为EPO分子的该部分与组织保护性受体相互作用，由此介导组织保护。
EPO的三维结构被公认为如Cheetham等人，1998，Nat.Struct.Biol.5；861-866(其在此全文引用作为参考)中所述的结构，并且在SEQ ID NO:1(也可以从国家生物技术信息中心蛋白质数据库(Protein Data Bank of the NationalCenter for Biotechnology Information)以条目“1BUY”获取的数据)中显示。当与所述受体结合时远离EPOR同二聚体近膜部分(即，当(EPOR)2同二聚体在细胞表面上表达时远离细胞膜)的EPO分子的部分由下列二级结构组成:环AB(对应于SEQ ID NO:1的氨基酸29-55)、螺旋B(对应于SEQ ID NO:1的氨基酸56-82)、环BC(对应于SEQ ID NO:1的氨基酸83-92)和环CD(对应于SEQ ID NO:1的氨基酸112-138)。在本发明的一个实施方案中，组织保护性肽由对应于EPO分子的这些不同结构的氨基酸序列组成。
不希望被任何特定理论所束缚，申请人认为组织保护性受体是预先形成的，即，EPOR和βc蛋白质亚单位在与EPO相互作用之前功能性结合。EPO是I型细胞因子超家族的成员。I型细胞因子超家族分支的成员的特征是4个螺旋，这些螺旋疏水性相互作用形成球形蛋白，该蛋白的外表面与水性介质相接，被称为“朝向外侧的”。出乎意料的是，申请人已经确定由EPO分子的朝向外侧的部分衍生的一种以上的肽具有组织保护性。更令人惊讶的发现是，由埋藏在EPO:(EPOR)2复合物内部的EPO分子部分衍生的肽以及可还包含红细胞生成结合位点1或2的某些部分的肽在组织保护方面也是非常有效的。为了解释这些发现，申请人提出组织保护性受体的成功活化是由于肽配体内恰当的、空间紧凑的电荷构象。进一步地，这种紧凑的电荷构象具体体现为两种不同的结构基序:(1)彼此相邻的两个带负电荷的氨基酸，且其侧翼为疏水性氨基酸；或(2)彼此紧密相邻的带正电荷的和带负电荷的(即碱性和酸性)氨基酸，并且其侧翼为单个疏水性或极性氨基酸残基。这些电荷的接近可以通过肽键产生的线性结构而发生，即，该结构可以由多肽链中的连续氨基酸形成，或者，这种接近也可以通过蛋白质三级结构即三维结构提供的EPO分子(或其它相关的I型细胞因子分子)不同部分之间的空间关系而发生。不希望被任何特定理论所束缚，申请人认为，这一要求通常说明组织保护性肽将具有一种特有的三级结构(例如螺旋或折叠片)，这种三级结构实现了带电荷的氨基酸对(即，两个带负电荷的氨基酸和/或带正电荷的和带负电荷的氨基酸)所需的空间位置。一个简单的例外是一种线性肽，其中氨基酸对彼此直接相邻，肽骨架提供了所需的刚性。因此，结构基序(1)包含于线性氨基酸残基序列如H1-N1-N1-H2(SEQ ID NO:6)中，或者包含于线性氨基酸残基序列中，其中N1和N2被1、2、3、4、5、6个或更多的插入残基隔开，例如，H1-N1-X-X-X-X-X-N1-H2(SEQ IDNO:11)。
对于组织保护来说，带电荷的氨基酸对的空间取向必须使得羰基碳相隔大约3埃(
Figure A200680034824D00341
)至大约5
Figure A200680034824D00342
，优选地大约4
Figure A200680034824D00343
至大约5
Figure A200680034824D00343
，更优选地大约4.4
Figure A200680034824D00345
至大约4.8
Figure A200680034824D00346
。这可以通过大量方法来实现，例如，通过在简单线性肽中相邻的带电荷的氨基酸(参见，例如，实施例2和肽G，SEQ ID NO:40，表1)，或者对于可以形成α螺旋的肽，带电荷的氨基酸被插入的氨基酸残基隔开(参见，例如，实施例2和肽F，SEQ ID NO:33，表1)。应当注意，当肽位于特定微环境中时，例如处于胞外-细胞表面膜界面处时，也可以形成三级结构(例如两亲性肽中的α螺旋)(参见，Segrest，1990，Proteins 8:103-117，在此全文引入作为参考)。
此外，含有带电荷的氨基酸对由此带电荷的侧链(正电和负电或两个负电)在空间上限制在彼此相距大约6.5
Figure A200680034824D00347
至大约9
Figure A200680034824D00348
之内的肽据预测具有组织保护活性。这在α螺旋中可以由被一个或两个氨基酸隔开的带电荷的对实现，这将或多或少地在螺旋的同一侧提供电荷，其具有所需的大约6.5
Figure A200680034824D00349
至大约9
Figure A200680034824D003410
的间距。这种肽的非限定性实例在肽F中发现(参见，实施例2，SEQ ID NO:33，表1)。本领域技术人员可以为肽设计为获得带电荷的氨基酸的适当三维位置所需的三级结构，以及设计小分子以模模拟肽内的电荷分离。
任意氨基酸的氨甲酰基碳之间或任何两个氨基酸的侧链之间的空间距离可以用任何本领域公知的或者本文所述的任何方法来推断。例如，当蛋白质的三维结构已知时，两个侧链的电荷分离或所述蛋白质的感兴趣的部分内两个氨甲酰基碳之间的空间距离，可以基于公开的或以其它本领域接受的所述感兴趣的部分中的氨基酸残基的三维坐标来计算。当蛋白质的三维结构未知，因而感兴趣的部分未知时，或者基于本文的教导构建三维结构未知的完全合成的肽时，两个侧链的电荷分离或所述肽内两个氨甲酰基碳之间的空间距离，可以利用通过本领域公知的蛋白质模建软件预测的三维结构来估计。这些软件的非限定性实例是Chemical Computing Group(Quebec，加拿大)的MOETM和Accelrys(San Diego，California)的Modeler。类似地，同样可以从上述公司获得的这些预测软件也在本领域中已知用于小分子设计的，因此，本领域普通技术人员基于本文的教导能够制备模拟公开的结构基序的小分子。
可以设计非天然存在的或嵌合的肽，这些肽通过线性氨基酸序列模拟本文以上所述的关键的空间接近。因此，本发明涉及新的组织保护性肽，包括那些显示了这些引发组织保护的结构基序的肽。
本发明还涉及其它I型细胞因子的组织保护性片段的用途，所述细胞因子包括但不限于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-3(IL-3)、血小板生成素(TPO)、睫状神经营养因子(CNTF)和白血病抑制因子(LIF)，它们在结构上与上述的EPO的外部呈现的氨基酸序列同源，并且/或者含有上述结构基序。
进一步地，组织保护性肽可以是嵌合化合物，其基于以上所述的结构基序，仅将不相邻的结构元件和表面呈现的氨基酸相结合。特别是，申请人已经确定向上述序列中增加两亲性肽螺旋提高了肽的功效。
另外，本发明的组织保护性肽包括两个或多个上述肽组合产生的融合肽，或者与相关或不相关的用于特异性转运的大分子如天然EPO、胰岛素或瘦素组合产生的融合肽。
5.1.1片段
A.EPO-衍生的肽片段
本发明涉及新的组织保护性肽，在一个实施方案中，所述组织保护性肽由EPO的氨基酸序列的片段组成，来源于EPO蛋白质的三维结构，特别是，来源于远离EPOR同二聚体的配体结合位点和/或内部部分的EPO区域。这些片段来源于以下EPO结构:(1)环AB和螺旋B的N-末端部分(NITVPDTKVNFYAWKRMEVG，SEQ ID NO:29，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸38-57)；(2)螺旋B的C-末端部分(QQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLV，SEQ ID NO:30，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸58-82)，和(3)由小半胱氨酸环和β-折叠片组成的A-B环的一部分(GCAEHCSLNENITVPDTKVN，SEQ IDNO:31，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸28-47)。在实施例2中证明(参见图1和表1)这些肽片段全部表现出组织保护性质。
意料之外的是，来源于包埋的EPO分子的其它区域的肽和其它包括(EPOR)2结合位点的部分的肽也具有组织保护性。例如，由螺旋A的N末端部分组成的肽(APPRLICDSRVLERYLLEAKEAE，SEQ ID NO:32，对应于SEQ IDNO:1的氨基酸1-23)具有组织保护性(参见，实施例2和表1)，该肽含有EPOR结合位点2的一部分(以下划线标出)。然而，位点2氨基酸的存在不能说明组织保护活性，因为由SEQ ID NO:1的氨基酸14-19(RYLLEAKEAENITTGC，SEQID NO:33)组成的、缺乏SEQ ID NO:1的氨基酸11-13(即，VLE；EPO与EPOR二聚体(EPOR)2结合所需的位点2氨基酸)的肽也具有组织保护性(参见，实施例2和表1，也参见Elliott等人，1997，Blood 89:493，在此全文引入作为参考)。申请人以前已经表明，消除红细胞生成的红细胞生成结合位点内的突变不改变EPO的组织保护性质(Leist等人，Science(2004)305:239，在此全文引入作为参考)。
本领域普通技术人员应当认识到，不同长度的片段可以形成组织保护性肽，尽管该片段的长度优选地少于30个氨基酸。此外，慎重选择所包含的其它分子，例如D-氨基酸或聚乙二醇，也将构成组织保护性肽，但是其具有延长的生物半衰期。
A.结构基序
具体来说，已经鉴定了引发组织保护性受体复合物的下列结构基序:
(a)带负电荷的构象(“结构基序A”)。
在这种结构基序中，肽具有两个带负电荷的氨基酸，它们被多达5个的氨基酸隔开，侧翼为疏水性氨基酸。在结构上可以表示为:
(a1)HNNH；
(a2)HNXNH；
(a3)HNXXNH；
(a4)HNXXXNH；
(a5)HNXXXXNH；或
(a6)HNXXXXXNH，
其中H代表疏水性氨基酸(例如，中度疏水性的氨基酸:甘氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、酪氨酸和色氨酸，优选高度疏水性的氨基酸:丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸)，N代表带负电荷的氨基酸，如谷氨酸或天冬氨酸，X代表任意氨基酸，但是优选亲水性氨基酸。在某些实施方案中，侧翼疏水性氨基酸是相同的。在其它实施方案中，侧翼氨基酸是不同的。
这种结构基序的变化涉及一种肽，其中一个侧翼疏水性氨基酸已经被一个极性氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺替换。
作为使线性序列中两个负电荷相互接近的肽键的替代方案，也可以如上文所述利用三维结构实现必要的电荷接近(第5.1节)。例如，带负电荷的氨基酸可以在空间上在螺旋的外表面上直接靠近，但是在线性肽序列中被额外的氨基酸隔开。例如，在EPO的螺旋A(对应于SEQ ID NO:1的氨基酸10-28)中，E18和E21在三维结构上相邻，但是在线性肽序列中在它们之间具有两个间插氨基酸。作为另外一个实例，在螺旋B(肽D，SEQ ID NO:30；对应于SEQ IDNO:1的氨基酸58-82)中，E62和E72在螺旋表面上被两个氨基酸(Q65和L69)隔开，但是在线性肽中在它们之间具有9个氨基酸。由螺旋A或螺旋B构成的肽具有组织保护性(参见，实施例2和表1，见下文)。相反，肽B(NITTGCAEHCSLNE，SEQ ID NO:34)不具有组织保护性，该肽带有两个距离适当的负电荷(以下划线标出)，但是缺乏侧翼疏水性氨基酸(参见，实施例2和表1，见下文)。
(b)电负性/电正性的氨基酸构象(“结构基序B”)。
在这个结构基序中，肽具有紧邻着电负性氨基酸的电正性氨基酸，且这两个带电荷的氨基酸的侧翼均有一个疏水性氨基酸。其在结构上可以表示为:
(b1)HNPH；或
(b2)HPNH，
其中P代表带正电荷的氨基酸，如精氨酸、赖氨酸或组氨酸，N代表带负电荷的氨基酸谷氨酸或天冬氨酸。和第一种基序一样，两个相反的电荷的彼此接近可以通过三维结构来实现。例如，带正电荷的和带负电荷的氨基酸可以在螺旋表面上在空间上相邻，但是在线性肽序列中被一个或多个氨基酸隔开。例如，在螺旋B(对应于SEQ ID NO:1的氨基酸58-82)中，E72和R76在螺旋外表面上彼此直接相邻，由这种螺旋构成的肽具有组织保护性(参见，实施例2和表1)。
在这种特定基序的一种变形中，电负性和电正性的氨基酸可以被极性氨基酸隔开，例如，
(b3)HNLPH；
(b4)HPLNH，
其中L代表极性氨基酸，如丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺。这种基序的例子是肽E(GCAEHCSLNENITVPDTKVN，SEQ ID NO:34)，它具有组织保护性(参见实施例2和表1)。
假如上述结构基序的核心的长度为4个氨基酸，则该核心结构基序的肽可以引发组织保护性受体。在某些实施方案中，本发明的多肽包含1个结构基序。在替代实施方案中，本发明的多肽包含1个以上、2个以上、3个以上或4个以上的结构基序。在多肽包含至少两个结构基序的某些实施方案中，这些基序是相同的。在多肽包含至少两个结构基序的替代实施方案中，这些基序是不同的。优选地，本领域技术人员可以生成的本发明的多种肽具有不到30个氨基酸的长度。
本领域普通技术人员将会认识到，是上述结构基序而非EPO的实际氨基酸序列对于本发明是重要的。因此，本领域普通技术人员将会认识到，分离肽可与SEQ ID NO:1所示的成熟人促红细胞生成素(“EPO”)氨基酸序列的任意部分具有低于90％、低于85％、低于80％、低于75％、低于70％、低于65％、低于60％、低于55％、低于50％、低于45％、低于40％、低于35％、低于30％或低于20％的序列同一性，其中EPO的所述部分含有与所述肽相同数目的氨基酸残基。
另外，授予O’Brien等人的美国专利号5,700,909(在此全文引入作为参考)公开了EPO的17个氨基酸的肽序列(O’Brien的SEQ ID NO:11)，该肽在NS20Y、SK-N-MC和PC12细胞中诱导生物活性，包括芽生、分化、神经保护和预防神经元细胞死亡。O’Brien的SEQ ID NO:11(设计的epo肽AB(epopeptide AB))尽管预言性地披露了具有红细胞生成活性，但是实际上缺乏这种红细胞生成活性，后来发现其缺乏体内活性。当将epo肽AB注射到小鼠肌肉内时，相邻肌肉中运动终板芽生的频率提高，其提高的方式类似于睫状神经营养因子所诱导的频率提高。这些数据可在这样的概念下解释，即神经元(而不是血液)细胞对EPO内的肽序列产生应答以及EPO可具有分离的神经营养活性区域和血液营养活性区域(Campana等人，Int.J.MoL Med.(1998)1(1):235-241；J.S.O’Brien的美国专利号5,700,909，1997年12月23日授权；J.S.O’Brien的美国专利号5,571,787，1996年11月5日授权；J.S.O’Brien的美国专利号5,714,459，1998年2月3日授权；J.S.O’Brien和Y.Kashimoto的美国专利号5,696,080，1997年12月9日授权)。然而，O’Brien没有认识到基于在肽三级结构中带电荷的氨基酸的邻近而形成的目前的结构基序。
C.I型细胞因子片段
假定空间上紧凑的电荷构象能够活化组织保护性受体，申请人已经发现，I型细胞因子的某些片段预期与组织保护性受体交叉反应。该细胞因子家族包括但不限于白介素(IL)-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、瘦素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白血病抑制因子(LIF)、睫状神经营养因子(CNTF)、血小板生成素(TPO)、生长激素、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、促红细胞生成素(EPO)和促乳素。
对EPO二级结构的考虑为通过氨基酸空间排列制备候选组织保护性肽提供了指导，所述氨基酸来源于位于其它I型细胞因子受体配体内的同源二级结构内的同源氨基酸:例如，已经表明在这些配体中，GM-CSF和IL-3(Kannan，2000，Neuroimmunomod.8:132-141，全文引用作为参考)具有强神经营养和神经保护活性，申请人认为，这很大程度上是通过刺激组织保护性受体所致。例如，考虑这些I型细胞因子的螺旋B:血小板生成素(TPO；蛋白质数据库(PDB)登录号1V7M)中的同源氨基酸包括D62、G65、T68、L69、E72、A76和Q80，其中这些氨基酸以线性排列在空间上彼此相邻；白血病抑制因子(LIF；PDB登录号IEMR)中的同源氨基酸包括E61、R64、Y68、S72、N75和D79；睫状神经细胞营养因子(CNTF；PDB登录号1CNT)中的同源氨基酸包括E71、E75。它们全都是以上(第5.1.1节)所述的基序A的实例，其中用下划线标出的氨基酸带负电荷。
举例说明本文以上(第5.1.1节)所述结构基序B的来源于I型细胞因子的肽的实例包括但不限于:GM-CSF螺旋A片段，WEHVNAIOEARRLL(SEQ IDNO:35)；TPO螺旋A片段，LSKLLRDSHVLH(SEQ ID NO:36)；TPO螺旋B片段:E56，K59；CNTF螺旋A片段，KIRSDLTALTESYVKH(SEQ ID NO:37)；CNTF螺旋B片段:R89，E92。LIF螺旋B片段，GTEKAKLVELYRIVVYL(SEQID NO:38)；和白介素3(IL-3)螺旋A片段，SIMIDEIIHHLKRPPNPL(SEQ IDNO:39)。
上述这些氨基酸只是通过I型细胞因子受体传递信号的细胞因子超家族的一些成员的代表，本领域技术人员将容易地确定该细胞因子超家族的其它成员的同源区域。
5.1.2嵌合体
本发明也涉及“嵌合的”组织保护性肽—结合了EPO分子朝向外侧的氨基酸的非线性结构元件的线性氨基酸序列呈现上述结构基序。本发明嵌合组织保护性肽可以由不同的氨基酸序列的结构元件组合进单个肽中而组成。换句话说，嵌合组织保护性肽可以由来源于非线性的但是相邻的结构元件的氨基酸序列组成，例如来源于SEQ ID NO:1的氨基酸序列110-115、133-136和160-165的片段，该片段将使得螺旋C的C末端部分和环C-D的N末端部分的结构元件、环C-D的β-折叠片、和EPO的C末端部分包含在单个肽中。另外，嵌合组织保护性肽也可以用来选出特定结构的重要特征，例如，特定三级结构的朝向外侧的氨基酸。因此，嵌合组织保护性肽可以由螺旋B氨基酸58、62、65、69、72、76、79、80、83、84和85组成的片段组成(例如肽G，QEQLERALNSS，SEQ ID NO:40)，或者，换句话说，由EPO螺旋B的所有呈现在外部的氨基酸组成。在下文的实施例2中显示这种肽具有组织保护活性(见表1)。
此外，通过连接两亲性肽螺旋可以提高本发明的组织保护性肽的效能。两亲性肽螺旋在本领域中公知，例如，来自通过B类G蛋白偶联受体信号传导的肽(例如，Segrest等人，1990，Proteins 8:103，在此全文引入作为参考)，用于将肽配体固定于细胞膜上。这种螺旋的实例包括但不限于来自下列物质的高度疏水性的区域:降钙素(ALSILVLLQAGS，SEQ ID NO:48)；促肾上腺皮质素释放激素(VALLPCPPCRA，SEQ ID NO:49)；β内啡呔(NAIIKNAYKKG，SEQID NO:50)；高血糖素(GSWQRSLQDTE，SEQ ID NO:51)；胰泌素(GGSAARPAPP，SEQ ID NO:52)；血管活性肠肽(NALAENDTPYY，SEQ IDNO:53)；神经肽Y(GALAEAYPSKP，SEQ ID NO:54)；促性腺激素释放激素(GCSSQHWSYGL，SEQ ID NO:55)；甲状旁腺素(VMIVMLAICFL，SEQ IDNO:56)；胰多肽(LRRYINMLTRP，SEQ ID NO:28)；和降钙素基因相关肽(LALSILVLYQA，SEQ ID NO:57)(在Grace等人，2004，PNAS 101:12836中公开，其在此全文引入作为参考)。例如，一种嵌合肽由具有EPO螺旋B的表面电荷基序的肽(QEQLERALNSS，SEQ ID NO:40)在羧基末端与胰多肽的两亲性螺旋(LRRYINMLTRP，SEQ ID NO:28)相连接而形成。可以对两亲性螺旋的羧基末端进一步修饰而不影响其组织保护性。因此，在进一步的实施例中，将上述嵌合肽的末端脯氨酸置换为序列TR(QEQLERALNSSLRRYINMLTRTR，SEQ ID NO:41)产生了具有强组织保护活性的分子，这在坐骨神经测定中得到证实(参见，图1)。
另外，也可以用其它三级结构代替上述螺旋与组织保护性肽连接。例如，螺旋B外部呈现的氨基酸可以与EPO的AB环内发现的β折叠片(CSLNENI，SEQ ID NO:42)连接，形成具有序列CSLNENIQEQLERALNSS(SEQ ID NO:43)的嵌合肽，该嵌合肽具有组织保护性(参见实施例2和表1)。另外，螺旋C的末端部分存在的氨基酸(ALGKA，SEQ ID NO:44，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸111、112、113、116和118)可以与环CD-部分(LGAQKEAISPPDAASAAPLRTI，SEQ ID NO:45，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸112-133)的全部或一部分组合。优选地，在融合的肽之间存在连接臂来提供柔性，以使连接的肽可以采取适当的结构方向与组织保护性受体复合物结合。这些融合肽可能具有协同作用，和独立的肽相比，连接的肽可能通过与组织保护性受体复合物增强的结合或者延长的生物半衰期，获得更大的组织保护作用。
本领域普通技术人员应当认识到将各种所需的结构元件组合进单个肽从而将这些化合物的组织保护作用最大化的益处。这些嵌合体可以包含氨基酸肽和非氨基酸元件，例如连接子或桥联原子或部分(moities)。
5.1.3融合肽
本发明进一步预期，两种或多种上述组织保护性肽、衍生的片段或嵌合体可以与相关的或不相关的蛋白质如促红细胞生成素、白蛋白等连接。
5.1.4组织保护性肽的制备
本发明的组织保护性肽可以用本领域公知的重组或合成技术来制备。具体而言，固相蛋白质合成适合长度相对较短的组织保护性肽，并且可以提供更高的产率以及更稳定的结果。另外，对于组织保护性肽的制备，固相蛋白质合成还可提供额外的柔性。例如，在合成阶段可以向组织保护性肽中引入所需的化学修饰:在肽合成中可以使用高瓜氨酸而不是赖氨酸，由此在合成后不需要将肽氨甲酰化。
合成
在肽的固相合成中，将具有α-氨基和侧链保护基的氨基酸固定在树脂上。参见，例如，Nilsson，B.，Soellner，M.和Raines，R.Chemical Synthesis of Proteins，Annu.Rev.Biomol Struct.2005.34:91-118；Meldal M.1997.Properties of solidsupports.Methods Enzymol.289:83-104和Songster MF，Barany G.1997.Handlesfor solid-phase peptide synthesis.Methods Enzymol.289:126-74。一般使用两种类型的α-氨基-保护基:酸敏感的叔丁氧羰基(Boc)或碱敏感的9-芴甲氧羰基(Fmoc)。Wellings DA，Atherton E.1997.Standard Fmoc protocols.MethodsEnzymol.289:44-67。在快速且完全地除去这些α-氨基-保护基后，可以将另一具有活化羧基的受保护氨基酸与未保护的树脂结合的胺偶联。通过使用过量的活化的可溶氨基酸，促使偶联反应完成。重复去保护和偶联的循环以完成该序列。利用侧链去保护和切割，树脂产生所需的肽。Guy CA，Fields GB.1997.Trifluoroacetic acid cleavage and deprotection of resin-bound peptides followingsynthesis by Fmoc chemistry.Methods Enzymol.289:67-83和Stewart JM.1997.Cleavage methods following Boc-based solid-phase peptide synthesis.MethodsEnzymol.289:29-44。进行固相蛋白质合成的其它方法在以下文献中公开:Bang，D.和Kent，S.2004.A One-Pot Total Synthesis of Crambin.Angew.Chem.Int.Ed.43:2534-2538；Bang，D.，Chopra，N.和Kent，S.2004.Total Chemical Synthesis ofCrambin.J.Am.Chem.Soc.126:1377-1383；Dawson，P.等人1994.Synthesis ofProteins by Native Chemical Ligation.Science.266:116-119；Kochendoerfer等人2003.Design and Chemical Synthesis of a Homogenous Polymer-ModifiedErythropoiesis Protein.Science.299:884-887(本段中引用的各参考文献均全文引用作为参考)。
必要时，固相肽合成产生的较小的肽可以通过肽连接如天然化学连接相组合。在该方法中，一个肽的N末端半胱氨酸残基的硫醇基(thiolate)攻击第二个肽的C末端硫醚，以实现转硫酯化作用。快速S→N酰基转移后形成酰胺键。参见Dawson，P.等人1994.Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation.Science.266:776-779，其全文在此引用作为参考。
进一步地，本领域普通技术人员将会认识到，本发明的组织保护性肽可以包括模拟肽(peptidomimetics)，包括天然存在的和非天然存在的氨基酸的肽，如类肽(peptoid)。类肽是N-取代的甘氨酸、甘氨胆酸(glycoholic acid)、thiopronine、肌氨酸和塞奥芬(thiorphan)的寡聚体。这些结构倾向于具有(-(C＝O)-CH2-NR-)n的通同结构，其R基团作为侧链。这些类肽可以依照Simon等人，Peptoids:A molecular approach to drug discovery，Proc.Natl.Acad.SciUSA，89:9367-9371(1992)和Li等人，Photolithographic Synthesis of Peptoids，J.AM.CHEM.SOC.2004，126，4088-4089所述的方法，利用固相合成法合成。上述每一文献均在此全文引用作为参考。另外，本发明还涉及与模板肽具有类似特性的模拟肽或肽模拟物、非肽药物的应用(Fauchere，J.(1986)Adv.DrugRes.15:29；Veber和Friedinger(1985)TINS第32页；及Evans等人(1987)J.Med.Chem 30:1229，引用作为参考)。各种类型的模拟肽合成的综述见例如:Methodsof Organic Chemistry(Houben-Weyl)，Sythesis of Peptides andPeptidomimetics-Workbench Edition第E22c卷(主编Goodman M.)2004(George Thieme Verlag Stuttgart，New York，在此全文引入作为参考)。
重组技术
可以应用多种宿主表达载体系统制备本发明的组织保护性肽。这些宿主表达系统代表了可以通过其制备并且随后纯化感兴趣的组织保护性肽的运载体(vehicle)，而且代表了在用适当核苷酸编码序列转化或转染时，可以在原位展示经修饰的促红细胞生成素基因产物的细胞。它们包括但不限于细菌、昆虫、植物、哺乳动物包括人类宿主系统，例如但不限于用含有组织保护性肽编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有促红细胞生成素相关的分子编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的或用含有促红细胞生成素相关的分子编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或携带重组表达构建体的哺乳动物细胞系统，包括人类细胞系统，例如HT1080、COS、CHO、BHK、293、3T3，这些构建体含有来源于哺乳动物细胞基因组的启动子如金属硫蛋白启动子或来源于哺乳动物病毒的启动子如腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子。
另外，可以选择以所需的特定方式调节插入序列的表达、或修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的这种修饰和加工对于蛋白质的功能而言可能是重要的。如本领域普通技术人员所知，不同的宿主细胞具有特定的翻译后加工和修饰蛋白质和基因产物的机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统来确保表达的外源蛋白质的正确修饰和加工。为此目的，可以使用具有初级转录物正确加工、基因产物糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。这样的哺乳动物宿主细胞包括人类宿主细胞，包括但不限于HT1080、CRO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3和WI38。
为了长期、高产率地制备重组肽，优选稳定的表达。例如，可以工程改造稳定表达重组组织保护性细胞因子相关分子基因产物的细胞系。不使用含有病毒复制起点的表达载体，可以用被诸如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等适当的表达调控元件控制的DNA以及选择性标记转化宿主细胞。在引入外源DNA之后，工程化细胞可以在富集培养基中生长1到2天，然后转移到选择性培养基中。重组质粒中的选择性标记使之具有选择抗性，并且允许细胞将质粒稳定地整合到细胞的染色体中，并生长成灶(foci)，其随后可被克隆并扩增为细胞系。该方法可有利地用于工程改造表达组织保护性产物的细胞系。所述工程化细胞系在筛选和评价影响EPO相关分子基因产物的内源活性的化合物中特别有用。
进一步的修饰
可以对组织保护性肽进行额外的修饰。例如，该肽可以用一种或多种(D)-氨基酸合成。选择在本发明的肽中包含(L)-或(D)-氨基酸部分地取决于该肽需要的特性。例如，加入一个或多个(D)-氨基酸可以提供肽在体外或体内提高的稳定性。加入一个或多个(D)-氨基酸还可以提高或降低肽的结合活性，如利用例如本文所述的生物测定法或本领域公知的其它方法所测定的。
将(L)-氨基酸序列的全部或部分置换为相应的对映异构(D)-氨基酸序列在多肽链的相应部分提供光学异构结构。(L)-氨基酸序列的全部或部分序列的颠倒产生了这种肽的逆(retro)-类似物。对映异构的置换(L到D，或D到L)与序列颠倒的组合产生肽的逆-反(retro-inverso)-类似物。本领域技术人员已知，对映异构肽、它们的逆-类似物和它们的逆-反-类似物保持与亲本肽的显著的拓扑学关系，且亲本和它的逆-反-类似物通常获得特别高的相似性。这种关系和相似性可以在肽的生物化学性质中反映出来，特别是相应的肽和类似物与受体蛋白质的高度结合。肽的逆-反-类似物性质的合成已经在例如Methods ofOrganic Chemistry(Houben-Weyl)，Synthesis of Peptides andPeptidomimetics-Workbench Edition第E22c卷(主编Goodman M.)2004(GeorgeThieme Verlag Stuttgart，New York)和其中引用的参考文献中讨论，这些参考文献均在此全文引用作为参考。
氨基酸“修饰”是指对天然存在的氨基酸的改变以产生非天然存在的氨基酸。具有非天然存在的氨基酸的本发明的肽的衍生物可以通过化学合成制备或通过在生物合成中向多肽内位点特异性地引入非天然氨基酸而制备，如Christopher J.Noren，Spencer J.Anthony-Cahill，Michael C.Griffith，Peter G.Schultz，1989 Science，244:182-188所述，其在此全文引用作为参考。
与治疗上有用的肽在结构上类似的肽模拟物可以用来产生等同的治疗或预防效果。通常，模拟肽在结构上类似于模板多肽(即，具有生化性质或药理学活性的多肽)，但是具有一个或多个被选自下组的键任选地置换的肽键:-CH2-NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(顺式和反式)、COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-，所述置换是通过本领域公知的并且在下列参考文献中进一步描述的方法:Spatola，A.F.的“Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides，and Proteins，”B.Weinstein编，Marcel Dekker，New York，第267页(1983)；Spatola，A.F.，Vega Data(1983年3月)，第1卷.第3期，“Peptide BackboneModifications”(一般性综述)；Morely，J.S.，Trends Pharma Sci(1980)第463-468页(一般性综述)；Hudson，D.等人，(1979)Int J Pept Prot Re 14:177-185(-CH2-NH-、-CH2-CH2-)；Spatola，A.F.等人，(1986)Life Sci 38:1243-1249(-CH2-S)；Harm，M.M.，(1982)J Chem Soc Perkin Trans I 307-314(-CH＝CH-，顺式和反式)；Almquist，R.G.等人，(1980)J Med Chem 23:1392(-COCH2-)；Jennings-White，C等人，(1982)Tetrahedron Lett 23:2533(-COCH2-)；Szelke，M等人，European Appln.EP 45665(1982)CA:97:39405(1982)(-CH(OH)CH2-)；Holladay，M.W.等人，(1983)Tetrahedron Lett 24:4401-4404(-C(OH)CH2-)；和Hruby，V.J.，(1982)Life Sci 31:189-199(-CH2-S-)；各文献均在此引用作为参考。
在另一实施方案中，特别优选的非肽键是-CH2NH-。这些肽模拟物相对于多肽实施方案可能具有显著的优点，包括，例如:制备更经济，化学稳定性更高，药理学性质(半衰期、吸收、效能、有效性等)提高，特异性改变(例如，广谱生物活性)，抗原性降低等等。
肽模拟物可能有多种设计。例如，特别考虑到环肽，其中必要的构象通过非肽得以稳定，授予Lobl等人的美国专利号5,192,746、授予Aversa等人的美国专利号5,576,423、授予Shashoua的美国专利号5,051,448和授予Gaeta等人的美国专利号5,559,103(均在此引用作为参考)描述了多种制备这样的化合物的方法。模拟肽序列的非肽化合物的合成也是本领域公知的。Eldred等人，J.Med.Chem.37:3882(1994)(在此全文引用作为参考)描述了模拟肽序列的非肽拮抗剂。同样，Ku等人，J.Med.Chem38:9(1995)(在此全文引用作为参考)进一步阐明了一系列这样的化合物的合成。
在合成后可以进行进一步的修饰。例如，按照于2003年4月17日以公开号20030072737-A1公开并且披露了化学修饰的EPO的美国专利申请号10/188,905，以及按照2003年7月1日提交的美国专利申请号10/612,665和2000年12月29日提交的美国专利申请号09/753,132(在此全文引用作为参考)，可以进一步化学修饰组织保护性肽，即进行氨甲酰化、乙酰化、琥珀酰化等。
另外，组织保护性肽可以由重组组织保护性肽—突变蛋白质(mutein)组成。公开的突变包括替换、缺失(包括内部缺失)、添加(包括产生融合蛋白的添加)、或导致“沉默”改变的氨基酸序列内和/或与氨基酸序列相邻的氨基酸残基的保守替换，以及非保守氨基酸改变和较大的插入和缺失，如以前在发明名称为Recombinant Tissue Protective Cytokines and Encoding Nucleic AcidsThereof for Protection，Restoration，and Enhancement of Responsive Cells，Tissues，and Organs的PCT/US03/20964(在此全文引用作为参考)中所公开的。
保守或非保守氨基酸替换可以在一个或多个氨基酸残基处进行。保守和非保守替换都可以进行。保守置换是在侧链相关的氨基酸家族内发生的置换。遗传编码的氨基酸可以分为四个家族:(1)酸性＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性＝赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性(疏水性)＝半胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、甘氨酸、酪氨酸；和(4)不带电荷的极性的＝天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸。非极性氨基酸可以再分为:强疏水性的＝丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸，和中度疏水性的＝甘氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸。以另外一种方式，全部的氨基酸可以分类为(1)酸性＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性＝赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)脂肪族＝甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸，丝氨酸和苏氨酸任选地被单独归类为脂肪族-羟基；(4)芳香族＝苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；(5)酰胺＝天冬酰胺、谷氨酰胺；和(6)含硫的＝半胱氨酸和甲硫氨酸。(参见，例如，Biochemistry，第4版，L. Stryer编，WH Freeman and Co.，1995，在此全文引用作为参考)。
或者，还可以沿着组织保护性肽的全部或部分编码序列随机引入突变，例如通过饱和突变引入，并且可以对突变体进行生物活性的筛选以鉴定维持活性的突变体。在突变后，可以重组地表达编码的肽，并且可以测定重组组织保护性肽的活性。
在另一实施方案中，可以通过添加聚合物(如聚乙二醇)、糖或其它蛋白质(如融合构建体)进一步修饰组织保护性肽，以试图延长组织保护性肽的半衰期或提高该肽的组织保护作用。这些修饰的实例在WO/04022577 A3和WO/05025606 A1中公开，其在此全文引用作为参考。
5.2检测组织保护性肽的试验
5.2.1生物学筛选或试验
可以检测本发明的组织保护性肽的组织保护活性，例如，保护细胞、组织或器官的活性。保护活性可以用体外和体内试验进一步检测。指示组织保护活性的体外试验包括，例如，细胞增殖试验，细胞分化试验，或者检测被组织保护性受体复合物例如组织保护性细胞因子受体复合物上调的蛋白质或核酸的存在、活性，例如核仁素、脑红蛋白、胞红蛋白或frataxin。例如，脑红蛋白可能参与促进氧的转运或短期贮存。因此，氧转运或贮存试验可被用作为鉴定或筛选调节组织保护活性的化合物的试验。
脑红蛋白响应缺氧或局部缺血在中枢神经系统的细胞和组织中表达，并且可以提供针对损伤的保护(Sun等人2001，PNAS 98:15306-15311；Schmid等人，2003，J.Biol.Chem.276:1932-1935，均在此全文引用作参考)。胞红蛋白在保护中可能起类似的作用，但是它在多种组织中以不同的水平表达(Pesce等人，2002，EMBO 3:1146-1151，在此全文引用作参考)。在本发明的一个实施方案中，可以在将组织保护性肽与细胞接触之前和之后对细胞中被上调的蛋白质的水平进行测定。在某些实施方案中，细胞中与组织保护活性有关的被上调的蛋白质的存在可被用来证实肽的组织保护活性。
核仁素可以保护细胞避免损伤。它在细胞中起到多种作用，包括调节转录过程、序列特异性RNA-结合蛋白质、胞质分裂、成核(nucleogensis)、信号转导、T细胞诱导的细胞凋亡、染色质重塑或复制。它也可以起到细胞表面受体DNA/RNA解旋酶、DNA-依赖的ATPase、蛋白质穿梭(protein shuttle)、转录因子组分、或转录阻抑剂的作用(Srivastava和Pollard，1999，FASEB J.，13:1911-1922；和Ginisty等人，1999，J.Cell Sci.，112:761-772，均全文在此引用作为参考)。
Frataxin是一种涉及线粒体铁代谢的蛋白质，以前曾经证明在体内和体外均被EPO强烈上调(Sturm等人(2005)Eur J Clin Invest 35:711，全文在此引用作为参考)。
可以通过检测细胞中对应于蛋白质的mRNA水平来检测被上调蛋白质的表达。mRNA可以与特异性结合编码被上调蛋白质的核酸的探针杂交。杂交可以由例如Northern印迹法、Southern印迹法、阵列杂交、亲和层析或原位杂交组成。
本发明的多肽的组织保护活性也可以利用体外神经保护试验来检测。例如，可以通过胰蛋白酶消化从新出生的大鼠海马中制备原代神经元培养物，利用任何本领域公知的和/或本文所述的方法培养，例如在MEM-II生长培养基(Invitrogen)，20mM D-葡萄糖，2mM L-谷氨酰胺，10％ Nu-血清(牛；BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ)，2％ B27添加物(Invitrogen)，26.2mM NaHCO3，100U/ml青霉素和1mg/ml链霉素中培养(参见例如，Leist等人，2004，Science305:239-242，在此全文引入作为参考)。在接种后一天，添加1μM胞嘧啶阿拉伯呋喃糖苷。然后将培养了13天的培养物与剂量增高的EPO或CEPO(3-3000pM)预培养24小时。在第14天，除去培养基，在室温下用300μM NMDA的PBS溶液激发该培养物。5分钟后，将预处理的培养基加回到培养物中，然后将培养物放回培养箱中放置24小时。细胞在低聚甲醛中固定，用Hoechst 33342(Molecular Probes，Eugene，OR)染色，对凝缩的凋亡细胞核进行计数。包括NGF(50ng/ml)和MK801(1μM)作为阳性对照。
可以利用动物模型系统证明化合物的组织保护活性，或者证明通过上述本发明的筛选方法鉴定的化合物的安全性和功效。然后可以利用动物模型对通过该试验鉴定的化合物对于感兴趣的一类组织损伤、疾病、病症或综合征的生物活性进行检测。这些动物模型包括经工程改造含有与功能读出系统连接的组织保护性受体复合物的动物，如转基因小鼠。
可以用来检测所鉴定化合物的细胞或组织保护活性功效的动物模型包括，例如，针对Lewis大鼠中急性实验性变态反应性脑脊髓炎发作(EAE；参见实施例12)的保护，小鼠在受到脑外伤、大脑缺血(“中风”；实施例5)或兴奋毒素类刺激的癫痫后认知功能降低的恢复或保护(Brines等人，2000，PNAS，97:10295-10672，在此全文引用作为参考)，针对诱导的视网膜缺血的保护(Rosenbaum等人，1997，Vis.Res.37:3443-51，在此全文引用作为参考)，针对坐骨神经损伤的保护(参见，实施例2)，以及针对心脏缺血-再灌注损伤的保护(体外心肌细胞研究和体内缺血-再灌注损伤，参见，例如Calvillo等人，2003，PNAS100:4802-4806和Fiordaliso等人，2005，PNAS 102:2046-2051，均全文引入作为参考)。这些试验在Grasso等人(2004)Med Sci Monit 10:BR1-3或PCT公开号WO02/053580中进一步详细描述，均全文引入作为参考。其中所述的体内方法针对EPO的施用，然而，已经确定施用组织保护性蛋白质代替EPO也表现出类似的生物活性，例如，Leist等人(2004)Science 305；239-242，在此全文引用作为参考。肽也可以代替进行检测。测定肽的组织保护活性的其它试验是本领域技术人员公知的。
5.2.2细胞结合试验
或者，也可以用细胞结合试验来评价本发明的多肽。例如，可将感兴趣的组织保护性肽与生物学标记如荧光或放射标记的标记物结合，以便易于检测，并且检测它与被转染的表达EPOR和/或βc受体的BaF3细胞的结合。在96孔板中加入8个在生长培养基(RPMI 1640，10％胎牛血清，1mM丙酮酸钠，2mM L-谷氨酰胺)中1:2系列稀释的感兴趣的组织保护性肽，使得每孔中的终体积约为100μl。用生长培养基(见上)将BaF3亲本细胞系和EPOR和/或βc受体转染的BaF3细胞洗涤三次，将沉淀物重悬浮在生长培养基中，计数细胞，并在生长培养基中稀释为5,000细胞/100μl。然后向每个肽稀释液中添加100μl稀释的细胞。然后将检测板在37℃培养箱中培养3-4天。然后洗涤板/细胞，利用荧光读板仪或其它适当的方法读板，以检测与感兴趣的组织保护性肽的生物活性有关的生物标记的水平。
类似地，也可以利用竞争性试验确定组织保护性肽是否具有组织保护性。在竞争性试验中，可将已知具有组织保护性的化合物包括但不限于组织保护性细胞因子，如美国专利申请号10/188,905和10/185,841(均在此全文引用作为参考)中公开的那些，与适当的生物标记物连接。
在96孔板中加入8个用适当生长培养基1:2系列稀释的已知组织保护性化合物/生物标记物，以及相同稀释系列的已知的组织保护性化合物/生物标记物和过量的感兴趣的组织保护性肽。每个稀释物的终体积应当约为100μl。再次如上所述将BaF3细胞接种到培养板中，并进行培养。在适当的时间后，洗涤细胞，利用荧光读板仪或本领域公知的任何其它适当的方法读板，以检测生物标记物。如果含有已知的组织保护性化合物/生物标记物和感兴趣的组织保护性肽的板和/或孔的读数小于仅含有已知的组织保护性化合物/生物标记物的读数，则感兴趣的组织保护性肽具有组织保护性。
5.2.3细胞因子和细胞增殖/分化活性
迄今为止发现的多种蛋白质因子，包括所有已知的细胞因子，在一种或多种因子依赖性细胞增殖试验中表现出活性，因而这些试验可以方便地确认细胞因子的活性。组织保护性肽的活性可以利用若干对细胞系的常规因子依赖性细胞增殖试验中的任意一种来证实，这些细胞系不受限地包括32D、DA2、DAlG、T10、B9、B9/11、BaF3、MC9/G、M+(preB M+)、2E8、RB5、DA1、123、T1165、HT2、CTLL2、TF-1、Mo7e和CMK。这些细胞在存在或不存在组织保护性肽的条件下培养，并且通过例如测量氚化胸苷的掺入或者利用基于3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)代谢分解的比色试验来检测细胞增殖(Mosman，1983，J.Immunol.Meth.65:55-63，全文引入作为参考)。
5.2.4其它试验
如果组织保护性肽表现出组织保护活性，则本领域普通技术人员将认识到，利用一种本领域技术人员已知的神经保护和组织保护试验(例如但不限于P-19和PC-12细胞试验)来验证该结果是有利的。另外，各种体内模型，例如与脊髓损伤、缺血性中风、周围神经损伤、心脏、眼睛、肾脏等有关的动物模型，将有助于进一步表征组织保护性肽。合适的体外和体内试验在美国专利申请号10/188,905和10/185,841中公开，其在此全文引用作为参考。
5.3治疗用途
本领域普通技术人员将认识到，本发明的组织保护性肽可作为治疗或预防多种疾病、障碍和病症的治疗剂。本领域技术人员还将认识到，可以利用这些肽实现对组织保护性受体复合物如组织保护细胞因子复合物的调节。可以用于评价例如上述发明性试验所鉴定的化合物的治疗适应症的体外和体内技术在PCT申请号PCT/US01/49479、美国专利申请号10/188,905和10/185,841中公开，均在此引用作为参考。
上述本发明的组织保护性肽通常可用于预防、治疗性处理或预防性处理主要具有神经或精神症状的人类中枢神经系统或周围神经系统疾病或障碍、眼部疾病、心血管疾病、心肺疾病、呼吸性疾病、肾脏疾病、泌尿和生殖系统疾病、骨病、皮肤病、结缔组织疾病、胃肠疾病、内分泌和代谢异常。应用的实例包括但不限于防止和修复由脑部(缺血性中风、钝伤、蛛网膜下腔出血)、脊髓(局部缺血、钝力外伤)、周围神经(坐骨神经损伤、糖尿病神经病变、腕管综合征)、视网膜(黄斑水肿、糖尿病视网膜病、青光眼)和心脏(心肌梗死、慢性心力衰竭)创伤及所致炎症引起的损伤。具体而言，这些疾病、障碍和病症包括低氧状态，这种状态不利地影响应答性组织，如中枢神经系统组织、周围神经系统组织或心脏组织或视网膜组织中的可兴奋组织，例如脑、心脏或视网膜/眼睛。因此，本发明的组织保护性肽可以用于治疗或预防各种条件和环境下由低氧状态引起的应答性组织的损伤。这些条件和环境的非限定性实例在下文的表格中提供。
组织保护性多肽在调节干细胞活性方面也是有意义的。已经证实，显示组织保护活性的细胞因子，如EPO，能够调动干细胞，在例如再生作用中刺激向损伤区域的迁移并且帮助修复过程。例如，在实验性中风中，EPO在恢复期介导成神经细胞向局部缺血损伤区域的迁移，以使神经元再生(Tsai等人，J.Neurosci(2006)26:1269-74，在此全文引用作为参考)。作为另一个实例，EPO和CEPO将内皮祖细胞从骨髓调动到循环中。这些细胞然后导向远处的区域，并且参与新血管的形成(关于EPO的效果参见Bahlmann等人，2003，Kidney Int.64:1648-1652，在此全文引用作为参考)。不希望被任何特定理论所束缚，相信本文公开的分离的多肽对干细胞的迁移具有相似的作用。
在可用本发明的组织保护性肽治疗和预防的神经元组织病状的实例中，这些病状包括神经元组织含氧减少引起的病状。可以用本发明的组织保护性肽治疗降低神经元组织的氧利用度、导致应激、损伤及最终神经元细胞死亡的任何病症。这些病症通常被称为缺氧和/或缺血，起因于或者包括但不限于中风、血管闭塞、出生前或出生后缺氧、窒息(suffocation)、气哽、接近淹溺、一氧化碳中毒、烟吸入、外伤(包括手术和放射治疗)、窒息(asphyxia)、癫痫、低血糖症、慢性阻塞性肺疾病、肺气肿、成人呼吸窘迫综合征、低血压休克、脓毒性休克、过敏性休克、胰岛素休克、镰状细胞危象、心脏停搏、节律障碍、氮麻醉、和心肺分流术引起的神经性缺乏。
在一个实施方案中，例如，利用本发明的试验鉴定的本发明的组织保护性肽可以单独施用或者作为组合物的一部分施用，以在外科手术或医学操作之前、期间或之后防止由损伤或组织损伤风险引起的损伤或组织损伤。例如，外科手术可以包括肿瘤切除或动脉瘤修复，医学操作可以包括分娩或生产。可用本发明组织保护性肽治疗的由低血糖产生或引起的其它病状包括胰岛素过量，也被称为医源性超高胰岛素血症、胰岛素瘤、生长激素缺乏、低皮质醇症、药物过量和某些肿瘤。
可兴奋神经元组织损伤引起的其它病状包括癫痫发作，如癫痫症、惊厥或慢性癫痫发作。其它可治疗的病症和疾病包括但不限于诸如中风、多发性硬化、低血压、心脏停搏、阿尔茨海默病、帕金森病、大脑性瘫痪、脑或脊髓损伤、AIDS痴呆、与年龄相关的认知功能丧失、记忆丧失、肌萎缩侧索硬化、癫痫发作、酒精中毒、视网膜缺血、青光眼引起的视神经损伤、和神经元损伤等疾病。
本发明的特定组织保护性肽可以用于治疗或预防由疾病病症或多种创伤引起的炎症，如物理或化学诱导的炎症。组织保护性肽还预期用于治疗和预防一种或多种器官或组织中的炎症，包括但不限于脑、脊髓、结缔组织、心脏、肺、肾和尿道、胰、眼和前列腺。这种创伤的非限定性实例包括肌腱炎、脉管炎、慢性支气管炎、胰腺炎、骨髓炎、类风湿性关节炎、肾小球肾炎、视神经炎、颞动脉炎、脑炎、脑膜炎、横贯性脊髓炎、皮肌炎、多肌炎、坏死性筋膜炎、肝炎和坏死性小肠结肠炎。进一步地，组织保护性细胞因子可被用于治疗或预防缺血和非缺血情况引起的炎症，这些情况包括但不限于变态反应、风湿性疾病、运动相关损伤、包括病毒、真菌和细菌在内的感染。炎症可以是急性或慢性的。炎症领域的进一步应用可见2004年9月29日提交的PCT/US2004/031789，其公开号为WO 2005/032467，在此全文引入作为参考。
本发明的特定组织保护性肽可被用来治疗由脱髓鞘或髓鞘损伤引起的中枢神经和周围神经系统疾病。这些疾病被定义为主要涉及未知来源的炎性髓鞘损伤，例外的是髓鞘形成缺陷疾病如脑白质营养不良症，以及由明显原因引起的疾病。多发性硬化症(MS)是一种典型的脱髓鞘疾病，在病理学上，它的特征是改变，主要是炎性脱髓鞘，以及神经胶质增生。由于它的病因还不清楚，因此它的诊断是以临床特征为基础的，即，空间多发性及中枢神经系统损伤随时间的多发性。此外，脱髓鞘疾病还包括急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、炎性弥漫性硬化、急性和亚急性坏死性出血性脑白质炎和横贯性脊髓炎。此外，周围神经组织还依赖许旺氏细胞来维持髓鞘，如果这些细胞受到损伤，则引起周围脱髓鞘疾病。
本发明的组织保护性肽可以用来治疗或预防心脏的疾病和损伤，包括任何与心脏和/或相关组织(例如心包、主动脉和其它相关血管)有关的慢性或急性病理事件，包括缺血-再灌注损伤；充血性心力衰竭；心脏停搏；心肌梗塞；动脉粥样硬化、二尖瓣渗漏、心房扑动、诸如药物(例如多柔比星、赫赛汀、硫利达嗪和西沙必利)的化合物引起的心毒性；寄生虫感染(细菌、真菌、立克次体和病毒，例如梅毒、慢性克鲁斯锥虫感染)引起的心脏损伤；暴发性心脏淀粉样变性；心脏手术；心脏移植；血管成形术、腹腔镜手术、创伤性心脏损伤(例如穿透性或钝性心脏损伤，和主动脉瓣破裂)、胸主动脉瘤的手术修补；肾上主动脉瘤；心肌梗塞或心力衰竭引起的心源性休克；神经源性休克和过敏反应。本发明的组织保护性肽也可以用于治疗那些具有心脏病如心力衰竭风险(即，心脏不能以代谢组织所需的速率泵送血液，或者心脏只有在充盈压升高时才能这样)的个体。具有这种风险的患者包括患有心肌梗塞、冠状动脉病、心肌炎、化学治疗、心肌病、高血压、心脏瓣膜病(最常见的是二尖瓣关闭不全和主动脉狭窄)和毒素(例如乙醇、可卡因等)诱导的心肌病等的患者或者具有患上述疾病风险的患者。
本发明的组织保护性肽可以用来治疗或预防眼睛例如视网膜组织的疾病和损伤。这些疾病包括但不限于视网膜缺血、黄斑变性、视网膜脱落、视网膜色素变性、动脉硬化性视网膜病变、高血压性视网膜病变、视网膜动脉阻塞、视网膜静脉阻塞、低血压和糖尿病视网膜病。
在另一实施方案中，本发明的组织保护性肽和本发明的原理可以用来预防或治疗应答性组织的辐射损伤引起的损伤。本发明的组织保护性肽的进一步应用在于治疗中毒，如神经毒素中毒(例如软骨藻酸蛤贝中毒)、毒素(乙醇、可卡因等)，化学治疗剂或射线照射的结果；山黧豆中毒；关岛(Guam)病；肌萎缩侧索硬化；和帕金森病。
如上所述，本发明还涉及通过外周施用如上所述的组织保护性细胞因子，将本发明的组织保护性肽用于增强哺乳动物应答性细胞、组织和器官中组织功能。有多种疾病和病症适合用该方法治疗。例如，该方法可用于增强可兴奋组织的功能，甚至在不存在任何病症或疾病的情况下，也导致认知功能的提高。进一步地，组织保护细胞因子可用于改善创伤愈合的质量、缩短愈合所需的时间、提高痊愈组织的质量、以及减少伤口引起的粘连的发生率。参见，2004年9月29日提交的、公开号为WO 2005/032467的PCT/US2004/031789，在此全文引入作为参考。本发明的这些用途在下面进一步详细描述，包括人类和非人哺乳动物中学习和训练的提高。
可以用本发明的组织保护性肽治疗或预防的涉及中枢神经系统的病症和疾病包括但不限于:情绪障碍、焦虑症、抑郁症、自闭症、注意力缺陷伴多动症、认知功能障碍。这些病症受益于神经元功能的增强。按照本发明的教导可以被治疗的其它疾病包括睡眠破坏例如睡眠呼吸暂停和旅行相关障碍；蛛网膜下和动脉瘤出血、低血压休克、震荡性损伤、脓毒性休克、过敏性休克、以及各种脑炎和脑膜炎如结缔组织病相关的大脑炎的后遗症，例如狼疮。其它用途包括对以下疾病和病症的预防或保护:神经毒素中毒如软骨藻酸蛤贝中毒、山黧豆中毒和关岛(Guam)病、肌萎缩侧索硬化、帕金森病；对栓塞性或缺血性损伤的手术后治疗；全脑照射；镰状细胞危象；和子痫。
用本发明的组织保护性肽可以治疗或预防的另一类病症包括遗传性或获得性的线粒体功能障碍，它们是以神经元损伤和死亡为典型的多种神经疾病的病因。例如，利氏(Leigh)病(亚急性坏死性脑病)的特征是神经元脱离引起的进行性视力丧失和脑病，以及肌病。在这些情况中，缺陷的线粒体代谢不能供应足够的高能量底物来为可兴奋细胞的代谢提供能量。组织保护性肽优化多种线粒体疾病中缺陷的功能。如上所述，低氧条件不利地影响可兴奋组织。可兴奋组织包括但不限于中枢神经系统组织、周围神经系统组织和心脏组织。除了上述条件以外，本发明的组织保护性肽还可用于治疗吸入性中毒，例如一氧化碳和烟吸入、重度哮喘、成人呼吸窘迫综合征、气哽和接近淹溺。产生低氧条件或通过其它方式诱导应答性组织如可兴奋组织损伤的其它病症包括可以在胰岛素不当给药中发生或者伴随产胰岛素肿瘤(胰岛素瘤)而发生的低血糖症。
描述为源于可兴奋组织损伤的各种神经心理障碍可以用本发明的组织保护性肽治疗。涉及神经元损伤并且可用本发明治疗或预防的慢性疾病包括涉及中枢神经系统和/或周围神经系统的疾病，包括与年龄相关的认知功能丧失和老年性痴呆、慢性癫痫症、阿尔茨海默病、帕金森病、痴呆、记忆丧失、肌萎缩侧索硬化、多发性硬化、结节性硬化症、威尔森氏(Wilson’s)病、大脑和进行性核上麻痹、关岛(Guam)病、路易体痴呆、朊病毒病，如海绵状脑病，例如库贾氏(Creutzfeldt-Jakob)病、亨延顿氏(Huntington’s)病、强直性肌营养不良、弗里德赖希氏(Freidrich’s)共济失调和其它共济失调，以及抽动秽语综合征(Gilles de Ia Tourette syndrome)、癫痫疾病，如癫痫和慢性癫痫发作、中风、脑或脊髓创伤、AIDS痴呆、酒精中毒、自闭症、视网膜缺血、青光眼、自主功能障碍如高血压和睡眠障碍，和神经精神障碍，包括但不限于精神分裂症、情感性分裂症、注意力缺乏症、低落性情感障碍、重郁症、躁狂症、强迫症、使用精神活性物质所致的障碍、焦虑、惊恐症、以及单极和双极情感障碍。其它神经精神和神经退行性疾病包括，例如，美国精神病协会(AmericanPsychiatric Association)的精神障碍诊断和统计手册(Diagnostic and StatisticalManual of Mental Disorders，DSM)所列出的那些，其最新版本在此全部引用作为参考。
另一组使用本发明的组织保护性肽可以治疗或预防的病症包括肾病，如急性和慢性肾衰竭。肾脏的血液供应可能由于多种原因而被切断，这些原因包括侵入血流的感染引起的休克(败血病)、内出血或外出血、严重痢疾或烧伤引起的体液损失、输血反应、心脏停搏或心律失常、手术创伤和肾移植。上述情况引起的通向肾脏的血流减少可使血流减少至危险的低水平，其持续时间长度足以导致急性肾衰竭的形成。血流减少也导致肾脏中的坏死或组织死亡，损伤肾小管细胞。肾衰竭也可能由疾病(间质性和糖尿病性)肾病综合征、感染、损伤(CPB诱导的)、毒素(造影剂诱导的、化学治疗诱导的、环孢菌素)、自身免疫性炎症(例如狼疮、红细胞生成等)引起。本发明的组织保护性肽帮助修复或预防这种损伤，有助于缓解急性肾衰竭。
下表列出了适合用上述组织保护性肽治疗的各种病症和疾病的其它典型的、非限定性的适应症。
Figure A200680034824D00621
Figure A200680034824D00631
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Figure A200680034824D00651
Figure A200680034824D00661
如上所述，这些疾病、障碍或病症只是本发明的组织保护性肽提供的益处范围的示例。因此，本发明通常提供对机械创伤或人类疾病后果的防止性、治疗性或预防性治疗。涉及CNS和/或周围神经系统的疾病、障碍或病症的预防或治疗性或预防性治疗。提供了对具有精神病成分的疾病、障碍或病症的预防或治疗性或预防性治疗。提供了对包括但不限于具有眼睛、心血管、心肺、呼吸、肾脏、泌尿系统、生殖系统、胃肠道、内分泌或代谢成分的疾病、障碍或病症的预防或治疗性或预防性治疗。
在一个实施方案中，这种包含组织保护性肽的药物组合物可以全身性给药，以保护或增强靶细胞、组织或器官。这种给药可以是肠胃外、经吸入、或经粘膜给药，例如经口、经鼻、直肠、阴道内、舌下、经眼、粘膜下或经皮给药。优选地，给药是肠胃外给药，例如通过静脉内或腹膜内注射，也包括但不限于动脉内、肌肉内、真皮内和皮下给药。
对于其它给药途径，例如利用灌注液、向器官内注射、或其它局部给药，将提供药物组合物，该组合物产生如上所述的组织保护性肽的类似水平。优选大约15pM-30nM的水平。
本发明的药物组合物可以包含治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体。在特定实施方案中，术语“药学上可接受的”是指得到联邦或州政府管理部门批准的，或者在美国药典或其它公认的国外药典中列出的用于动物，更优选地用于人类的。术语“载体”是指与治疗剂一同给药的稀释剂、佐剂、赋形剂或运载体(vehicle)。这些药物载体可以是无菌液体，例如在水和油中的盐水溶液，所述油包括石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物静脉内给药时，盐水溶液是优选的载体。盐水溶液和右旋糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别用于注射溶液。适当的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。需要时，组合物还可含有少量的湿润剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂等的形式。该组合物可以用传统的粘合剂和载体如甘油三酯类配制为栓剂。本发明的化合物可以配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与游离氨基形成的盐，例如盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸衍生的盐，以及与游离羧基形成的盐，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等衍生的盐。适当的药物载体的实例在E.W.Martin的“Remington’s PharmaceuticalSciences”中描述，其在此全文引用作为参考。这些组合物将含有治疗有效量的化合物，优选为纯化的形式，以及适量的载体，以提供给患者恰当给药的形式。该制剂应当适合给药模式。
本发明也包含用于提高肽如长效组织保护性肽的经粘膜吸收的制剂。适用于口服的药物组合物可以以如下形式提供:胶囊或片剂；粉剂或颗粒剂；溶液、糖浆或悬浮液(在水或非水的液体中)；可食用的泡沫或打发物(whips)；或乳剂。片剂或硬明胶胶囊可以包含乳糖、淀粉或其衍生物、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁、硬脂酸或其盐。软明胶胶囊可包含植物油、蜡、脂肪、半固体、或液体多元醇等。溶液和糖浆可包含水、多元醇和糖。
用于口服的活性剂可以用延迟活性剂在胃肠道内崩解和/或吸收的材料进行包衣或混合(例如，可以使用单硬脂酸甘油或二硬脂酸甘油)。因此，活性剂的持续释放可以维持很多个小时，如果需要，可以阻止活性剂在胃内降解。用于口服的药物组合物可以经配制促进活性剂由于特定的pH或酶条件在胃肠道的特定部位的释放。
适合于经皮给药的药物组合物可以以旨在延长的时间段内保持与受试者表皮紧密接触的不连续贴剂(discrete patch)的形式提供。适合于局部给药的药物组合物可以以如下形式提供:软膏剂、乳膏剂、悬浮剂、洗剂、粉剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。对于皮肤、口腔、眼睛、或其它外部组织的局部给药，优选使用局部软膏剂或乳膏剂。当配制成软膏剂时，活性成分可以与石蜡或易与水混溶的软膏基质一起使用。或者，活性成分可以与水包油或油包水基质配制成乳膏剂。适合眼睛局部给药的药物组合物包括滴眼剂。在这些组合物中，活性成分可以溶解或悬浮在适当的载体例如水性溶剂中。适合口腔局部给药的药物组合物包括锭剂、软锭剂和漱口剂。
适用于经鼻和肺部给药的药物组合物可以包含固体载体，如粉末(优选的颗粒大小在20微米到500微米范围内)。粉末可以通过鼻吸，即从靠近鼻子的含粉末容器中快速吸入鼻腔的方式来给药。或者，适合经鼻给药的组合物可包含液体载体，如喷鼻剂或滴鼻剂。或者，化合物直接吸入肺中可以通过深吸或者利用通过口腔管伸入到口咽中的装置来实现。这些组合物可以含有活性成分的水性或油性溶液。用于吸入给药的组合物可以用特别调适的装置提供，所述装置包括但不限于，压力气雾器、喷雾器、或吹入器，其可被构造以提供预定剂量的活性成分。在优选实施方案中，本发明的药物组合物直接向鼻腔内给药，或者通过鼻腔或口咽向肺内给药。
适合于直肠给药的药物组合物可以以栓剂或灌肠剂的形式提供。适合于阴道给药的药物组合物可以以阴道栓剂、棉塞剂、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂的形式提供。
适合于肠胃外给药的药物组合物包括水和非水无菌注射溶液或悬浮液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使组合物与预期接受者血液基本上等渗的溶质。可以存在于这些组合物中的其它成分包括，例如，水、醇、多元醇、甘油和植物油。适合于肠胃外给药的组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如，密封的安瓿和小瓶中，并且可以在冻干(冷冻干澡)条件下保存，在这种情况下只需在使用之前即刻加入无菌液体载体，例如注射用无菌盐溶液。临时注射液和悬浮液可以从无菌粉末、颗粒和片剂制备。在一个实施方案中，可提供含有组织保护性肽注射液的自动注射器用于救护车、急诊室和战场情况下紧急使用，甚至用于在家庭环境中自已给药，特别是在可能发生创伤性截断时，例如不小心使用割草机的情况。甚至在医务人员到达现场之前，或者在断趾个体到达急诊室之前，尽可能快地对已切断部分的多个位点施用组织保护性肽，可以提高已切断的足或趾中的细胞和组织在再接后存活的可能性。
在优选实施方案中，按照常规步骤将组合物配制为适合于对人类静脉给药的药物组合物。静脉给药的组合物一般是在无菌等渗水缓冲液中的溶液。如果需要，该组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因，以减轻注射部位的疼痛。这些成分通常分开提供或者以单位剂量形式混合在一起提供，例如，作为冻干粉或无水浓缩物的形式存在于密封的容器内，如标有活性剂的量的安瓶或小药囊中。当通过输注方式施用组合物时，可以用含有无菌药物级水或盐水的输液瓶进行分散。当以注射方式施用组合物时，可以提供含有无菌盐水的安瓿以在施用前混合各成分。
栓剂通常含有0.5％至10％重量的活性成分；口服制剂优选地含有10％至95％的活性成分。
可以提供灌注液组合物用于移植器官浴或原位灌注，或者用于在器官收集前给器官供者的脉管系统施用。这些药物组合物可以含有不适合急性或慢性、局部或全身给个体给药的组织保护性肽水平或组织保护性肽形式，但是在将处理的器官或组织暴露于或返回常规循环之前，在消除或减少其中所含的组织保护性肽水平之前，在尸体、器官浴、器官灌注液或原位灌注液中起到此处预期的功能。
本发明还提供包括一个或多个容器的药包或试剂盒，该容器中充填了本发明药物组合物的一种或多种成分。这些容器任选地可以结合管理药物或生物制品的生产、使用或销售的政府部门所规定的形式的通告，该通告反映了该部门批准生产、使用或销售用于人类给药。
在另一实施方案中，例如，组织保护性肽可以在控释系统中递送。例如，该肽可以利用静脉输注、可植入渗透泵、透皮贴剂、脂质体或其它给药模式施用。在一个实施方案中，可以使用泵(参见Langer，同上；Sefton，1987，CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14:201；Buchwald等人，1980，Surgery 88:507；Saudek等人，1989，N.Engl.J.Med.321:574，均在此全文引用作为参考)。在另一实施方案中，该化合物可以在囊泡中，特别是在脂质体中递送(参见Langer，Science249:1527-1533(1990)；Treat等人，Liposomes in the Therapy of Infectious Diseaseand Cancer，Lopez-Berestein和Fidler(编)，Liss，New York，第353-365页(1989)；WO 91/04014；美国专利号4,704,355；Lopez-Berestein，同上，第317-327页；同上)。在另一实施方案中，可以使用聚合材料(参见Medical Applications ofControlled Release，Langer和Wise(编)，CRC Press:Boca Raton，Florida，1974；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen和Ball(编)，Wiley:New York(1984)；Ranger和Peppas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61，1953；也参见Levy等人，1985，Science 228:190；During等人，1989，Ann.Neurol.25:351；Howard等人，1989，J.Neurosurg.71:105，(均在此全文引用作为参考)。
在另一实施方案中，可以将控释系统置于治疗靶点即靶细胞、组织或器官附近，从而只需要全身剂量的一部分(参见例如，Goodson，MedicalApplications of Controlled Release，第2卷，第115-138页，同上，1984，在此全文引用作为参考)。其它控释系统在Langer(1990，Science 249:1527-1533，在此全文引用作为参考)的综述中讨论。
在另一实施方案中，适当配制的组织保护性肽可以经鼻、经口、经直肠、经阴道、经眼、经皮、肠胃外或舌下方式施用。
在特定实施方案中，可能希望向需要治疗的区域局部施用本发明的组织保护性肽；这可以通过以下方式来实现，例如但不限于:手术中的局部输注、局部使用例如手术后与伤口敷料一起、注射、利用导管、利用栓剂、或利用植入物，所述植入物是多孔的、非多孔的或明胶材料，包括膜例如硅橡胶膜或纤维。该实施方案的非限定性实例是用本发明的组织保护性肽包覆的冠脉支架。
本领域技术人员通过考虑若干因素可以容易地确定优选的有效剂量的选择，这些因素是本领域普通技术人员已知的。这些因素包括组织保护性肽的具体形式和其药代动力学参数，如生物利用度、新陈代谢、半衰期等，这些因素在获得药物化合物管理部门的批准中通常使用的开发过程中已经确定。考虑剂量的其它因素包括有待治疗的病症或疾病或在正常个体中将会获得的益处、患者的体重、给药途径、给药是短期的还是长期的、伴随药物和其它熟知的影响所施用的药物试剂有效性的因素。因此，精确的剂量应当根据专业人员的判断和每名患者的情况来确定，例如根据个体患者的状况和免疫状态，并且根据标准临床技术。
在本发明的另一方面，本发明的药物组合物可以在制剂中包含组织保护性肽和至少一种显示组织保护功能的小分子。合适的小分子包括但不限于类固醇类(例如拉扎洛依和糖皮质激素)、抗氧化剂(例如辅酶Q10、α硫辛酸、NADH)、抗分解代谢酶(例如谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、合成催化净化剂、和模拟物)、吲哚衍生物(例如吲哚胺、咔唑、咔啉)、硝酸中和剂、腺苷/腺苷激动剂、植物化学剂(黄酮类)、草药提取物(银杏和姜黄)、维生素(维生素A、E和C)、氧化酶电子受体抑制剂(例如黄嘌呤氧化酶电子受体抑制剂)、矿物质(例如铜、锌和镁)、非甾体抗炎药(例如阿司匹林、萘普生和布洛芬)、和它们的组合。可以与本发明的药物组合物一起使用的其它试剂包括但不限于:抗炎药(例如皮质类固醇、泼尼松和氢化可的松)、糖皮质激素、类固醇、非甾体抗炎药(例如阿司匹林、布洛芬、双氯芬酸和COX-2抑制剂)、β-激动剂、抗胆碱能药和甲基黄嘌呤、免疫调节剂(例如有机小分子、T细胞受体调节剂、细胞因子受体调节剂、T细胞排除剂、细胞因子拮抗剂、单核因子拮抗剂、淋巴细胞抑制剂或抗癌剂)、金注射剂、柳氮磺吡啶、青霉胺、抗血管形成剂(例如血管抑制素)、TNF-α拮抗剂(例如抗TNFα抗体)和内皮生长抑素)、氨苯砜、补骨脂素(例如甲氧沙林和三甲沙林)、抗疟剂(例如羟氯喹)、抗病毒剂和抗生素(例如红霉素和青霉素)。
在本发明的另一方面，提供灌注液或灌注溶液用于灌注或存储移植器官，灌注溶液包含有效保护应答性细胞和相关细胞、组织或器官的量的组织保护性肽。移植包括但不限于同种异体移植，其中从一个供者中收集器官(包括细胞、组织或其它身体部分)并移植到不同的接受者中，这两者是相同物种；自体移植，其中从身体的一个部分采集器官，并在另一部分进行替代，包括手术台手术，其中可以将器官取出，离体切割、修复或以其它方式操作，例如进行肿瘤切除，然后返回原位点；或异种移植，其中在物种间移植组织或器官。在一个实施方案中，灌注溶液是威斯康辛大学(UW)的溶液(美国专利号4,798,824，在此全文引用作为参考)其中含有大约1至大约25 U/ml(10ng＝IU)的组织保护性肽、5％的羟乙基淀粉(分子量为大约200,000至大约300,000，基本上不含乙二醇、氯乙醇、氯化钠和丙酮)；25mM KH2PO4；3mM谷胱甘肽；5mM腺苷；10mM葡萄糖；10mM HEPES缓冲液；5mM葡萄糖酸镁；1.5mMCaCl2；105mM葡萄糖酸钠；200,000单位青霉素；40单位胰岛素；16mg地塞米松；12mg酚红；pH为7.4-7.5，渗透压约为320mOsm/l。使用该溶液在移植前保存尸体肾和胰。使用该溶液，保存可以延长到超过尸体肾保存推荐的30小时的限度。这种特定的灌注液只是许多这样的溶液的示例，这些溶液通过包含有效量的组织保护性肽而适合于本用途。在进一步的实施方案中，灌注溶液含有大约1至大约500ng/ml的组织保护性肽，或者大约40至大约320ng/ml的组织保护性肽。如上所述，在本发明的该方面可以使用任何形式的组织保护性肽。
尽管为了本文的目的，组织保护性肽的优选接受者是人类，但是本发明的方法同样可用于其它哺乳动物，特别是驯养动物、家畜、宠物和动物园动物。然而，本发明并非限定性于此，其益处可以应用于任何哺乳动物。
在离体发明的进一步的方面，可以使用任何组织保护性肽，例如但不限于上述组织保护性肽。
在本发明的另一方面，提供用于提高细胞、组织或器官活力的方法和组合物，这些细胞、组织或器官没有被内皮细胞屏障从脉管系统中分离，所述提供方法包括使这些细胞、组织或器官直接接触含有组织保护性肽的药物组合物，或者向组织或器官的脉管系统施用或接触含有组织保护性肽的药物组合物。被处理组织或器官中应答性细胞增强的活性引起其所发挥的正面作用。
类似于以促红细胞生成素为基础的其它组织保护性化合物，本发明的组织保护性肽可能从具有内皮细胞紧密连接的器官例如脑、视网膜和睾丸的腔表面转移到其毛细血管内皮细胞的基膜表面。因此，跨过屏障的应答性细胞是组织保护性肽的有益效果的敏感靶点，含有应答性细胞并且全部或部分地依赖于应答性细胞的其它细胞型或组织或器官可以是本发明的方法的靶点。不希望被任何特定理论所束缚，在转胞吞作用后，组织保护性肽可以与应答性细胞上的组织保护性受体相互作用，所述细胞例如是神经元、眼(例如视网膜)、脂肪、结缔组织、毛发、牙齿、粘膜、胰腺、内分泌、听觉、上皮、皮肤、肌肉、心脏、肺、肝、肾、小肠、肾上腺(例如肾上腺皮质、肾上腺髓质)、毛细血管、内皮、睾丸、卵巢或子宫内膜细胞，且受体结合可以启动信号转导级联，导致应答性细胞或组织内基因表达程序的激活，导致保护细胞或组织或器官免遭损伤，例如毒素、化疗剂、放射治疗、缺氧等造成的损害。在另一个实施方案中，根据PCT申请号PCT/US01/49479、美国专利申请号10/188,905和10/185,841的教导(在此引用作为参考)，组织保护性肽可以与一种可穿过屏障的化合物如氨甲酰化的促红细胞生成素交联以穿过屏障。因此，下文详细描述了保护含有应答性细胞的组织免遭损伤或缺氧应激并且增强该组织的功能的方法。
在本发明一个实施方案的操作中，哺乳动物患者进行治疗癌症的全身化学治疗，包括放射治疗，该治疗通常具有副作用，如神经、肺、心脏、卵巢或睾丸损伤。在化学治疗和/或放射治疗之前和期间如上所述进行包含组织保护性肽的药物组合物的给药，以保护各种组织和器官免遭化疗剂的伤害，例如保护睾丸。治疗可以持续到化疗剂的循环水平降到对哺乳动物身体的潜在危险水平以下。
在本发明的另一个实施方案的操作中，计划从汽车事故遇难者处收集各种器官移植到多个接受者中，其中一些器官需要延长距离和延长时间的运输。在器官收集之前，给供者输注含有本文所述的组织保护性肽的药物组合物。给所要运输的收集的器官灌注含有本文所述的组织保护性肽的灌注液，并且贮存在含有组织保护性肽的浴槽中。用搏动灌注装置给某些器官连续灌注含有本发明的组织保护性肽的灌注液。在器官运输过程中和原位植入和再灌注中发生了最少的器官功能的损坏。
在本发明的另一个实施方案中，危险活动的参加者可以服用一剂含有组织保护性肽的药物组合物，其剂量足以阻止(即延迟发作、抑制或停止)、防止或减轻应答性细胞、组织或器官损伤引起的伤害。特别是，这种处理方法可用于易遭受损伤的各种职业，例如但不限于职业运动员(跳水员、赛车手、足球运动员等)、军事人员(士兵、伞兵)、紧急事件处理人员(警察、消防员、EMS和救灾人员)、特技表演者和建筑工人。另外，涉及组织保护性肽在如下的娱乐项目中的预防性用途，包括但不限于具有受伤危险的攀岩、绳索下降、跳伞、赛车、自行车赛车、足球、橄榄球、棒球和跳水。
在本发明的另一个实施方案中，修复心脏瓣膜的手术操作需要暂时的心麻痹和动脉闭塞。在手术前，给患者输注组织保护性肽。这种治疗防止了低氧缺血细胞损伤，特别是在再灌注后。另外，本发明的药物组合物也可以预防性地用于使个体为手术做好准备，以限制与手术操作有关的创伤，或者帮助个体从手术操作中恢复。尽管这种使用含有组织保护性肽的药物组合物进行治疗的方法为手术操作提供了预防性用途，但是其特别可用于诱导暂时的局部缺血事件的操作，包括但不限于旁路术(冠状动脉旁路)、血管成形术、截肢术和移植，以及直接对应答性细胞、组织或器官进行的手术，如脑和脊髓手术，和心脏直视手术。这些手术可涉及心肺(心脏肺)旁路的使用。
在本发明的另一个实施方案中，在任何手术操作如心肺旁路术中可以使用本发明的组织保护性肽。在一个实施方案中，在旁路术之前、期间和/或之后施用如上所述的含有组织保护性肽的药物组合物，以保护脑、心脏和其它器官的功能。
在将本发明的组织保护性肽用于离体应用或体内应用以治疗应答性细胞如神经元组织、视网膜组织、心脏、肺、肝脏、肾脏、小肠、肾上腺皮质、肾上腺髓质、毛细血管内皮、睾丸、卵巢或子宫内膜细胞或组织的上述实例中，本发明提供了适于保护或增强远离脉管系统的应答性细胞、组织或器官的剂量单位形式的药物组合物，该形式包含范围在约0.01pg至7.5mg、5pg至6.5mg、1pg至5mg、500pg至5mg、1ng至5mg、500ng至5mg、1μg至5mg、500μg至5mg或1mg至5mg的组织保护性肽，和药学上可接受的载体。在优选实施方案中，组织保护性肽的量在大约0.5pg至1mg的范围内。在优选实施方案中，该制剂含有无红细胞生成活性的组织保护性肽。
在本发明的另一方面，可以施用组织保护性肽恢复遭受脑外伤的哺乳动物的认知功能。在5天或30天的延迟后，与安慰剂处理的哺乳动物相比，施用组织保护性肽能够恢复功能，表明组织保护性肽具有再生或恢复脑活性的能力。因此，本发明也涉及组织保护性肽在制备用于治疗脑外伤和其它认知功能障碍的药物组合物中的用途，这种治疗包括损伤后(例如3天、5天、1周、1个月或更长)治疗。本发明还涉及通过施用有效量的组织保护性肽治疗损伤后认知功能障碍的方法。本文所述的任何组织保护性肽都可以用于本发明的这一方面。
此外，本发明的这一恢复方面涉及本文所述的任何组织保护性肽在制备用于恢复细胞、组织或器官功能障碍的药物组合物中的用途，其中在导致这种功能障碍的最初的损伤后开始治疗。而且，应用本发明的组织保护性肽进行治疗可以在急性期以及慢性期贯穿疾病或病症的过程。
本发明的组织保护性肽可以全身施用，其施用剂量为每次施用约1ng至约100μg/kg体重，优选约5-50μg/kg体重，最优选约10-30μg/kg体重。这种有效剂量在施用后足以达到大于约80、120或160ng/ml血清的组织保护性肽血清水平。这种血清水平可以在施用后大约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小时后达到。必要时该剂量可以重复。例如，只要临床上需要可以每天重复给药，或者在适当的间隔后给药，例如每1-12周，优选地每1-3周给药一次。在一个实施方案中，有效量的组织保护性肽和药学上可接受的载体可以包装在单剂量瓶或其它容器中。在另外一个实施方案中，使用能够发挥此处所述的活性但是不引起血红蛋白浓度或红细胞压积增加的组织保护性肽。在试图长期提供本发明的方法的情况下，这种组织保护性肽是优选的。
5.4转胞吞作用
载体分子和组织保护性肽 本发明进一步涉及通过施用组合物促进组织保护性肽穿过哺乳动物的内皮细胞屏障转运的方法，该组合物包含与载体肽结合的组织保护性肽，该载体肽能够穿过内皮细胞屏障，例如如上所述的促红细胞生成素。体内某些器官中内皮细胞之间的紧密连接对某些分子的进入产生屏障。为了治疗被屏障的器官内的各种病症，可能需要促进组织保护性肽通过的手段。
作为载体分子的组织保护性肽 本发明的组织保护性肽可以作为载体用于递送其它分子通过血-脑屏障和它们可以穿过的其它类似的屏障。制备含有希望与组织保护性肽一同穿过屏障的分子的组合物，且该组合物的外周施用导致组合物穿过屏障的转胞吞作用。待转运通过屏障的分子与组织保护性肽之间的结合可以是不稳定的共价键，在这种情况下，在穿过屏障后从与组织保护性肽的结合中释放出分子。如果分子的所需药理学活性被保持或者不受与组织保护性肽结合的影响，则可以施用这种复合物。
本领域技术人员应当知道各种通过共价、非共价和其它方式将分子与本发明的组织保护性肽和上述其它试剂结合的手段。此外，对组合物功效的评价可以在实验系统中容易地进行。分子与组织保护性肽的结合可以利用多种方法实现，包括不稳定的共价结合、交联等。可以采用生物素/亲和素相互作用；例如，生物素化的本发明的组织保护性肽可以与亲和素和希望转运的分子的不稳定偶联物复合。如上所述，可以通过重组或合成方法制备杂合分子，例如，包括该分子的具有所需药理活性的结构域和负责肽组织保护性受体活性调节的结构域的融合或嵌合多肽。该分子中可以包含蛋白酶切割位点。
分子可以通过多功能分子即多功能交联剂与本发明的组织保护性肽偶联。本文使用的术语“多功能分子”包括具有一个可相继反应多次的官能团的分子如甲醛，以及具有一个以上的反应基的分子。本文使用的术语“反应基”是指交联剂上的官能团，它与分子(例如将要递送通过内皮细胞屏障的肽、蛋白质、碳水化合物、核酸，特别是激素、抗生素、或抗癌剂)上的官能团反应，由此在交联剂和该分子之间形成共价键。术语“官能团”保持它在有机化学领域的标准含义。可以使用的多功能分子优选是生物相容的连接子，即它们在体内不致癌，无毒，并且基本上没有免疫原性。多功能交联剂，例如本领域公知和本文所述的那些，可以在动物模型中容易地检测以确定其生物相容性。多功能分子优选是双功能的。本文使用的术语“双功能分子”是指具有两个反应基的分子。双功能分子可以是异双功能或同双功能的。异双功能交联剂允许矢量偶联。特别优选的是，多功能分子具有足够的水溶性，以在水溶液如pH 6-8的缓冲水溶液中进行交联反应，并且生成的偶联物保持水溶性，以具有更有效的生物分布。多功能分子一般与氨基或巯基官能团共价键合。然而，本发明也涉及对其它官能团如羧酸或羟基具有反应性的多功能分子。
同双功能分子具有至少两个反应性官能团，这些官能团是相同的。同型双功能分子上的反应性官能团包括，例如，醛基和活性酯基团。具有醛基的同型双功能分子包括，例如戊二醛和subaraldehyde。戊二醛作为交联剂的应用在Poznansky等人，Science 223，1304-1306(1984)中公开。具有至少两个活性酯单位的同双功能分子包括二羧酸和N-羟基琥珀酰亚胺的酯。这种N-琥珀酰亚胺酯的实例包括辛二酸二琥珀酰亚胺酯和二硫-双-(琥珀酰亚胺丙酸酯)，和它们的可溶性二磺酸和二磺酸盐，例如它们的钠盐和钾盐。这些同双功能试剂可从Pierce，Rockford，Illinois获得。
异双功能分子具有至少两个不同的反应基。这些反应基与不同的官能团例如存在于肽和分子上的官能团反应。与异双功能交联剂上的反应基反应的两种不同的官能团通常是氨基，例如赖氨酸的ε氨基；巯基，例如半胱氨酸上的硫醇基；羧酸，例如天冬氨酸上的羧酸盐；或羟基，例如丝氨酸上的羟基。
当然，本发明的组织保护性肽中的一些可能没有可用于某些交联剂的适当的反应基；然而，本领域技术人员充分了解根据本发明组织保护性肽中可用于交联的基团来选择交联剂。
当异双功能分子的反应基与氨基形成共价键时，共价键通常是酰胺键或亚胺键。与氨基形成共价键的反应基可以是，例如，活化的羧基、卤代羰基或酯基。优选的卤代羰基是氯羰基。酯基优选地是活性酯基团，例如N-羟基-琥珀酰亚胺酯基团。
其它官能团一般是硫醇基，能够转化为硫醇基的基团，或与硫醇基形成共价键的基团。共价键通常是硫醚键或二硫键。与巯基形成共价键的反应基可以是，例如，与硫醇基反应的双键或活化的二硫键。含有能与硫醇基反应的双键的反应基有马来酰亚氨基，尽管其它反应基如丙烯腈也是可能的。反应性二硫基可以是，例如，2-吡啶基二硫基或5，5’-二硫代-双-(2-硝基苯甲酸)基团。含有反应性二硫键的异双功能试剂的一些例子包括3-(2-吡啶基-二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(Carlsson，等人，1978，Biochem J.，173:723-737)、S-4-琥珀酰亚氨基氧羰基-α-甲基苄基硫代硫酸钠和4-琥珀酰亚氨基氧羰基-α-甲基-(2-吡啶基二硫基)甲苯。优选3-(2-吡啶基-二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯。含有具有与硫醇基反应的双键的反应基的异双功能试剂的一些例子包括4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和间-马来酰亚氨基苯甲酸珀酰亚胺酯。
其它异双功能分子包括3-(马来酰亚氨基)丙酸琥珀酰亚胺酯、4-(对-马来酰亚氨基-苯基)丁酸硫代琥珀酰亚胺酯、4-(N-马来酰亚氨基甲基-环己烷)-1-羧酸硫代琥珀酰亚胺酯、马来酰亚氨基苯甲酰-N-羟基-琥珀酰亚胺酯。优选间-马来酰亚氨基苯甲酸的钠磺酸盐。上述多种异双功能试剂和它们的磺酸盐可从Pierce化学品公司，Rockford，Illinois，美国获得。
本领域技术人员可以容易地确定是否需要上述偶联为可逆的或不稳定的。可以在体外检测偶联物的期望的药理活性。如果偶联物保持两种性质(被偶联的分子的性质和组织保护性肽的性质)，则可以在体内检测其适用性。如果被偶联的分子需要从组织保护性肽中分离才具有活性，则优选与长效促红细胞生成素或长效组织保护性细胞因子的不稳定键或可逆结合。在体内检测之前也可以利用标准体外方法检测不稳定性。
关于如何制备和使用这些以及其它多功能试剂的其它信息可以从以下出版物或本领域可以获得的其它文件中获得:
Carlsson，J.等人，1978，Biochem.J.173:723-737；
Cumber，J.A.等人，1985，Methods in Enzymology 112:207-224；
Jue，R.等人，1978，Biochem 17:5399-5405；
Sun，T.T.等人，1974，Biochem.13:2334-2340；
Blattler，W.A.等人，1985，Biochem.24:1517-152；
Liu，F.T.等人，1979，Biochem.18:690-697；
Youle，RJ.和Neville，D.M.Jr.，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:5483-5486；
Lerner，R.A.等人，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:3403-3407；
Jung，S.M.和Moroi，M.，1983，Biochem.Biophys.Acta 761:162；
Caulfield，M.P.等人，1984，Biochem.81:7772-7776；
Staros，J.V.，1982，Biochem.21:3950-3955；
Yoshitake，S.等人，1979，Eur.J.Biochem.101:395-399；
Yoshitake，S.等人，1982，J.Biochem.92:1413-1424；
Pilch，P.F.和Czech，M.P.，1979，J.Biol.Chem.254:3375-3381；
Novick，D.等人，1987，J.Biol.Chem.262:8483-8487；
Lomant，A.J.和Fairbanks，G.，1976，J.MoI.Biol.104:243-261；
Hamada，H.和Tsuruo，T.，1987，Anal.Biochem.160:483-488；或
Hashida，S.等人，1984，J.Applied Biochem.6:56-63，均在此全文引用作为参考。
另外，Means和Feeney，1990，Bioconjugate Chem.1:2-12综述了交联方法，在此全文引用作为参考。
由本发明的组合物和上述方法穿过的屏障包括但不限于血-脑屏障、血-眼屏障、血-睾丸屏障、血-卵巢屏障、血-神经屏障、血-脊髓屏障和血-胎盘屏障。
穿过内皮细胞屏障转运的候选分子包括，例如，激素如生长激素、神经营养因子、抗生素、抗病毒药、或抗真菌药如通常被大脑和其它被屏障的器官排除的那些、肽放射性药物、反义药物、抗体和针对生物活性剂的抗病毒药、药物和抗癌剂。这些分子的非限定性实例包括激素如生长激素、神经生长因子(NGF)、脑源神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子β1(TGFβ1)、转化生长因子β2(TGFβ2)、转化生长因子β3(TGFβ3)、白介素1、白介素2、白介素3和白介素6、AZT、抗肿瘤坏死因子抗体和免疫抑制剂如环孢菌素。另外，染料或标记物可以连接到本发明的组织保护性肽上以便为了诊断目的显示大脑和其它被屏障器官内的细胞、组织或器官。作为例子，用来显示大脑内的斑块的标记物可以连接到组织保护性肽上，以确定患者的阿尔茨海默病的进展。
本发明还涉及组合物，其包含将要通过转胞吞作用通过内皮细胞紧密连接屏障转运的分子和如上所述的组织保护性肽。本发明进一步涉及如上所述的分子和组织保护性肽细胞因子的偶联物在制备用于穿过如上所述的屏障递送分子的药物组合物中的用途。
PCT/US01/49479(在此全文引用作为参考)中提供了各种动物模型和神经保护和转胞吞作用的体外测试，用来证明本发明的组织保护性肽的有效性。对于转胞吞作用，评价与本发明的长效促红细胞生成素偶联的模型蛋白质在肠胃外施用后向脑内的转运。这些在体外模型和动物模型中的测试对本发明的化合物在其它哺乳动物种包括人类中的功效具有预测性。
参照下面的非限定性实施例可以更好地理解本发明，这些实施例作为本发明的示例提供。提供以下实施例是为了更充分地说明本发明的优选实施方式。然而，它们不应以任何方式被视为对本发明范围的限制。
6.实施例
实施例1:肽合成方法
A.肽A(SEQ ID NO:32，对应于EPO氨基酸序列38-57)和肽B(SEQ IDNO:34，对应于EPO氨基酸序列58-82)的合成
肽A，SEQ ID NO:32，和肽B，SEQ ID NO:34，是EPO的片段(见表1)，使用“原位中和”Boc化学分步固相肽合成法合成，该方法在Band，D.，Chopra，N和Kent，S.，“Total Synthesis of Crambin，”J.AM.CHEM.SOC.2004，126，1377-1383(全文引入作为参考)中描述。简要地说，在-OCH2-Pam-树脂(游离“羧基肽”)或HSCH2CH2CO-Leu-OCH2-Pam-树脂(“硫酯肽”)上合成对应于EPO氨基酸序列38-57(肽C，NITVPDTKVNFYAWKRMEVG，SEQ ID NO:29)和EPO氨基酸序列58-82(肽D，QQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLV，SEQ IDNO:30)的两个片段。在合成过程中，对各种氨基酸的侧链进行如下保护:Arg(Tos)、Asn(Xan)、Asp(OcHex)、Cys(4-CH3Bzl)或Cys(ACM)、Glu(OcHex)、Lys(2-Cl-Z)、Ser(Bzl)、Thr(Bzl)、Tyr(Br-Z)。在肽链装配后，将肽脱保护，同时通过在0℃用含有对-甲酚的无水HF(90:10，v/v)处理1小时从树脂支持物上切下肽。减压蒸发HF后，用冷却的二乙醚沉淀并研磨粗产物，将肽溶解在含有0.1％ TFA的50％乙腈水溶液中，并且用制备型HPLC系统纯化。使用LC-MS确认肽组成。
实施例2.肽介导的组织保护的确认
使用坐骨神经试验检测组织保护性肽的任何组织保护活性。用异氟烷(Baxter NPC 10019-773-60)和台面式实验室麻醉系统(流量计设定为2-3升/分钟，55psi)将Sprague-Dawley大鼠(250-300克)(每组6只，包括对照)麻醉至少3分钟。然后将大鼠置于恒温毯上，以确保操作过程中大鼠的体核温度保持在35-37℃。通过直肠探针监测体核温度。通过四头肌剥离在腿中部暴露被麻醉大鼠的右侧坐骨神经；穿过平行于并覆盖四头肌的皮肤用15号手术刀形成2cm的切口，并且切开四头肌用解剖剪暴露坐骨神经。然后除去坐骨神经周围的膜。2-0号编织丝线(Ethicon，685-G)在神经下通过，缝合线的末端通过保持与神经垂直的引导器。然后将缝合线的末端与非弹性索系在一起，然后将非弹性索绕在滑轮系统(带有NYL滑轮的MTD 1/4”B(PO号04174-01)，具有稳定器)上，并且缓慢释放连接到非弹性索上的100克重量。将该重量悬挂1分钟，之后切断丝线缝合线释放重量。
然后使用1/2cc的胰岛素注射器将剂量为289pmol/kg的氨甲酰化促红细胞生成素、剂量为289pmol/kg的来自系列A-J的一种肽(见表1)或PBS注射到尾静脉中。用不遵照以上教导的来自色素上皮衍生生长因子(PEDF)的20个氨基酸的片段(对应于氨基酸102-121)作为对照。
然后闭合肌肉和手术切口，向大鼠内皮下注射5ml乳酸盐林格溶液。在恢复过程中使用加热毯使大鼠的体核温度保持在35-37℃。
在之后4天，将大鼠置于数字扫描仪扫描表面上的直径为30cm的丙烯酸管中，测定大鼠的后趾外张。等待5分钟使其顺从后，对大鼠的后足进行扫描，清楚地显示全部5趾。每只大鼠进行三次可接受的扫描。通过扫描测量趾伸展(Toe Spread)(第一趾球部与第五趾球部之间的距离)和中间趾伸展(Intermediate Toe Spread)(第二趾球部与与第四趾球部的距离)。然后按照S.Erbayraktar等人，2003，Proc Natl Acad Sci U S A 100，6741-6746(在此全文引用作为参考)所述计算静态坐骨神经指数，并且进行统计学分析。
除肽B(SEQ ID NO:34)、H(SEQ ID NO:47)和PEDF衍生物之外的所有肽具有同样的保护性，静态坐骨神经指数(“SSI”)为大约-0.57，与之相比，PBS/PEDF片段的SSI为约-67或约-68(图2)。图2还显示了阳性肽与氨甲酰化促红细胞生成素相比，其功效即使没有提高，也至少是相等的。
表1还显示了受试肽的羰基碳之间的大致距离。使用Cheetham等人，1998，Nat.Struct.Biol.5:861-866(引用作为参考)提供的三维坐标计算距离。检测为组织保护活性阳性的肽的羰基碳与羰基碳之间的距离/间隔介于大约3
Figure A200680034824D0086160907QIETU
与大约5
Figure A200680034824D0086160907QIETU
之间。
表1.
采用体内生物测定(坐骨神经损伤模型)测定的代表性肽的组织保护效果
 
肽类别 肽 EPO序列 结构 羰基碳之间的大致距离(埃) 剂量[nmol/kg-bw] 坐骨神经试验
A)EPO片段 A 1-23 APPRLICDSRVLERYLLEAKEAE(SEQ ID ND:32)APPRLICDSRVLERYLLEAKEAE(SEQ ID NO:32) 4.64.4 29、290、1450 +
B 24-37 NITTGCAEHCSLNE(SEQ IDNO:34) 2.8 290 -
C 38-57 NITVPDTKVNFYAWKRMEVG(SEQ ID NO:29) 4.6 290 +
D 58-82 QQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLV(SEQ ID NO:30) 4.8 29、290、1450 +
E 28-47 GCAEHCSLNENITVPDTKVN(SEQ ID NO:31) 4.4 290 +
F 14-29 RYLLEAKEAENITTGC(SEQ IDNO:33) 3.6 290 +
B)螺旋
 
面
G 58、62、65、69、72、76、79、80、83、84、85 QEQLERALNSS(SEQ ID NO:40) 3.6 290 +
H 71、72、75、76、77 SELRGQ(SEQ ID NO:47) 7.2 290 -
C)嵌合体
I 肽G+β-折叠片(33-39) CSLNENIQEQLERALNSS(SEQID NO:43) 290 +
J 肽G+胰多肽螺旋 QEQLERALNSSLRRYINMLTRTR(SEQ ID NO:41) 290 +
B)I型细胞因子基序 K GM-CSF螺旋A(13-26) WEHVNAIQEARRLL(SEQ IDNO:35)WEHVNAIQEARRLL(SEQ IDNO:35)WEHVNAIQEARRLL(SEQ IDNO:35) 3.64.64.6 290 +
L CNTF螺旋A(26-41) KIRSDLTALTESYVKH(SEQ IDNO:37) 4.7 290 +
实施例3.组织保护性肽无红细胞生成活性
A.体外评价:
将UT-7epo，人促红细胞生成素依赖的白血病细胞系，用于测定肽的红细胞生成能力。UT-7epo细胞(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen(DSMZ)，目录号ACC 363)在含有10％FBS和5ng/ml促红细胞生成素的完全RPMI-1640培养基中生长。暴露于促红细胞生成素的细胞的增殖/存活(＝活力增加)应答由经典的红细胞型促红细胞生成素受体介导，并且是促红细胞生成素-变体刺激经典促红细胞生成素受体的能力的定量量度。
将UT-7epo细胞转移到新鲜的含有10％供体牛血清、4mM L-谷氨酰胺并且补充了5ng/ml重组人促红细胞生成素的完全RPMI 1640培养基中。细胞保持在每瓶含有20ml培养基的75cm2烧瓶中，置于含5％CO2的37℃潮湿培养箱中48小时。在试验的第2天，即48小时，将细胞从烧瓶中转移到50-ml锥形管中，在室温下以1,000rpm离心5分钟。弃去上清液，用10ml饥饿培养基(3％供体牛血清，4mML-谷氨酰胺)洗涤细胞两次。然后将细胞重悬浮在饥饿培养基中，通过吹吸行为获得单细胞悬浮液。用饥饿培养基稀释重悬浮的细胞，获得4×105细胞/ml的密度，并且以每个25cm2烧瓶10ml的总培养体积铺盘。培养4小时后，再将细胞转移到50-ml锥形管中。对照细胞自始至终用5ng/ml的重组人促红细胞生成素保持。
用饥饿培养基将细胞稀释为200,000细胞/ml，以100μl/孔接种于96孔板上，并且暴露于不同浓度的促红细胞生成素、氨甲酰化的促红细胞生成素、和肽D，SEQ ID NO:30。使用含3％血清的RPMI 1640培养基中的系列10倍稀释液产生从0.2pM到20nM的待测化合物的浓度。在进一步培养48小时后，向每孔中加入15ml WST-1细胞增殖试剂溶液(Roche)，并且在CO2中37℃培养1小时。混合1分钟后，用读板仪读板(在450nm处的吸光度，减去650nm处的背景吸光度)。
肽D在高达10,000pM的剂量时显示没有红细胞生成活性(图3)。优选地，该肽在低于1μg/ml的剂量时，更优选地在低于10μg/ml的剂量时，没有红细胞生成活性。
B.体内评价:
为了评价组织保护性肽F(SEQ ID NO:33)或肽G(SEQ ID NO:40，如上文所述，由螺旋B存在的残基构成的肽)的红细胞生成活性，每周三次给雄性SpragueDawley大鼠皮下施用0.8μg/kg的肽。剂量方案对应于以前确定的引起最大红细胞生成的EPO等同剂量(基于摩尔)。定期利用自动化分析仪(Keska公司)测定血红蛋白浓度。
在研究过程中，肽B或肽C都不显示任何红细胞压积增加(图4；示出了对于等摩尔剂量的EPO的应答，用于比较)。对于EPO在3周后观察到血红蛋白的减少是由于产生了抗-EPO中和抗体，该抗体引起纯红细胞再生障碍。相反，肽G或肽F没有观察到中和抗体应答。
实施例4.肽在体外试验中具有组织保护性
利用多种体外试验可以容易地评价肽的组织保护。例如，利用红藻氨酸盐诱导的小鼠运动神经元死亡可以确定针对于兴奋毒性的保护。如前所述(Siren等人，2001，PNAS 98:4044，在此全文引入作为参考)，从15天大的Sprague-Dawley大鼠胚胎中获得脊髓。前角用胰蛋白酶消化，以300×g通过4％BSA垫离心10分钟。将细胞(代表混合的神经元-胶质培养物)以2,000个细胞/cm2的密度接种在用聚-DL鸟氨酸和层粘连蛋白预包被的24-mm孔培养板中。通过免疫淘选(immunopanning)进一步纯化运动神经元，将细胞以低密度(20,000个细胞/cm2)接种在用聚-DL鸟氨酸和层粘连蛋白预包被的且含有完全培养基[Neurobasal/B27(2％)；0.5mM L-谷氨酰胺；2％马血清；25mM2-巯基乙醇；25mM谷氨酸盐；1％青霉素和链霉素；1ng/ml BDNF]的24-mm孔培养板上。在第4天和第6天向培养物中再添加培养基(不含谷氨酸盐)。
在培养的第6天通过与红藻氨酸(对于混合的神经元-胶质培养物为5mM；对于纯化的培养物为50mM)培养48小时诱导细胞死亡。在诱导细胞死亡前72小时向培养物中添加肽D(5ng/mL)或运载体。然后弃去培养基，用4％(体积/体积)的多聚甲醛的PBS溶液固定细胞40分钟，用0.2％Triton X-100通透化处理，用10％(体积/体积)FCS的PBS溶液封闭，与抗非磷酸化神经微丝抗体(SMI-32；1:9,000)培养过夜，利用亲和素-生物素法用二氨基联苯胺显示。通过计数盖玻片四边内的SMI-32阳性细胞在形态学上评价运动神经元的活力，并且使用H33258进行凋亡体的染色。
肽D(SEQ ID NO:30，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸58-82)完全保护运动神经元避免了红藻氨酸盐引起的损伤(图5)。
或者，也可以使用采用小鼠P19细胞的试验测定肽引起的组织保护，小鼠P19细胞是神经元样的，在去除血清后通过凋亡而死亡。如以前所述(Siren等人，2001，PNAS 98:4044，在此全文引用作为参考)，使用P19克隆P19S1801A1比较肽D(SEQ ID NO:30)和EPO的组织保护。在添加了2mM L谷氨酰胺；100单位/ml的青霉素G；100mg/ml的硫酸链霉素(GIBCO)；10％(体积/体积)FBS(HyClone)并且含有1.2g/L NaHCO3和10mM Hepes缓冲液的DMEM(下文中称为完全培养基)中，细胞保持不分化。无血清培养基含有与以上相同的成分，但是去除了血清，并添加了5mg/ml胰岛素；100mg/ml转铁蛋白；20nM孕酮；100mM腐胺；30nM Na2SeO3(来自Sigma)。为进行实验，50％汇合的细胞用EPO或运载体预处理过夜，用胰蛋白酶解离，用无血清培养基洗涤，并且以104个细胞/cm2的终密度接种于组织培养瓶中单独的或添加有EPO的无血清培养基中。细胞活力用台盼蓝排除法和血细胞计数仪测定。
基于重量，肽C，SEQ ID NO:29(对应于SEQ ID NO:1的氨基酸38-57)在防止p19细胞凋亡上比EPO至少强10倍(图6)。
实施例5.大脑中动脉闭塞模型
体重为250-280g的雄性Crl:CD(SD)BR大鼠从Charles River，Calco，意大利获得。按照Brines等人，2000，PNAS USA 97:10526-10531(在此全文引用作为参考)的教导进行手术。简言之，用水合氯醛(400mg/kg-bw，腹膜内)麻醉大鼠，暴露颈动脉，通过两次缝合阻塞右颈动脉，并切断。靠近右眼眶形成的钻孔允许看见大脑中动脉(“MCA”)，其在鼻动脉的远端烧灼。为了围绕这一固定的MCA损伤产生半暗带(边缘带区)，用精细镊通过牵引阻塞对侧颈动脉1小时，然后再次打开。
Sprague Dawley大鼠(每组8只)进行上述MCAO方案。在阻塞释放时给大鼠施用PBS、氨甲酰化促红细胞生成素(44μg/kg)或肽D(氨基酸58-82；4.4μg/kg)。另外，对另一组在阻塞后每间隔2小时分4剂施用肽D(氨基酸58-82；4.4μg/kg)。为了评价损伤，在手术24小时后，按照以前所述的方案对大鼠进行行为测试，或者在通过对脑切片进行四唑盐染色测量损伤体积。
图7A显示的图证明了MCAO方案产生的损伤体积。单剂量或多剂量的肽D(SEQ ID NO:30)的治疗使MCAO手术所致的损伤体积缩小了大约三分之二:这在统计学上等同于氨甲酰化促红细胞生成素的组织保护作用。
(b)组织保护性细胞因子的治疗窗口
本实施例重复如上所述的MCAO方案。在阻塞步骤后，在颈动脉中建立再循环后立即(即发生局部缺血后1小时)给大鼠施用PBS、氨甲酰化促红细胞生成素(44μg/kg，静脉内)或肽D(SEQ ID NO:30)(4.4μg/kg)。另外，在阻塞后每间隔2小时分4剂施用肽D(SEQ ID NO:30)(每次4.4μg/kg-bw)。(每组8只大鼠)。
(c)行为测试
也按照脚误(foot fault)行为方案测试一组单独的大鼠。按照Markgraf等人，1992，Brain Research 575:238-246(在此全文引用作为参考)所述，大鼠在抬高的网格大小为30mm的30cm×30cm不锈钢网格板上测试。将大鼠置于网格上时，大鼠将试图来回移动，并且其脚偶然会踩入网格孔中而不是踩在网格上(“脚误”)。测量1分钟内的脚误数。
再灌注后用肽D(SEQ ID NO:30)处理的大鼠比PBS处理的大鼠发生较少的脚误(图7B)。施用多剂量的肽D(SEQ ID NO:30)后没有观察到明显的额外的益处。尽管在接受多剂量肽的组中平均脚误数较少，但是观察到的与接受单剂量组的差异不显著。
实施例6.糖尿病神经病变
如以前所述(Bianchi等人，2004，Proc Natl Acad Sci USA 101，823-828，在此全文引入作为参考)，通过给禁食的大鼠腹膜内施用60mg/kg单剂量的链脲菌素，在Sprague Dawley大鼠(Charles River，Calco，意大利)中诱导糖尿病。血清葡萄糖水平升高到大于每分升300mg(mg％)则证实为糖尿病(正常水平<100mg％)。然后每周5次用肽D(SEQ ID NO:30；4μg/kg)或运载体腹膜内处理糖尿病动物。诱导糖尿病状态2周后，利用尾神经测量神经传导速度。
如图8A所示，糖尿病动物显示尾神经传导速度从大约22m/s(正常)降至大约19m/s。肽D(SEQ ID NO:30)的施用伴随着传导速率增加至大约23m/s。
另外，通过在“热板”测试中测量爪缩回的时间来定量热疼痛阈值。缩回等待时间被定义为置于热板上与后爪缩回舔拭之间的时间。每只动物测试两次，休息间隔30分钟。在诱导糖尿病4周后测量后爪热阈值。肽D(SEQ IDNO:30)缩短了糖尿病动物在热板上的等待时间(图8B)。
实施例7:保护坐骨神经和肾脏免遭顺铂诱导的损伤
如Bianchi等人，2006，Clin Cancer Res 12:2607-2612(在此全文引入作为参考)所述，给雄性Sprague-Dawley大鼠腹膜内施用2mg/kg的顺铂(CDDT)，每周两次，持续5周。将动物分组，每组6只。在5周的CDDT给药期间，动物还腹膜内接受0.4μg/kg-bw的肽G(SEQ ID NO:40)或PBS，每周三次。对照组接受PBS而不是CDDT。热板等待时间如以上实施例6所述确定。
接受CDDT和仅接受PBS的动物表现出等待时间比对照组延长:即，CDDT与受损的热敏度有关。相反，接受肽的动物表现正常的热板等待时间(图9A)。
用肽处理也防止了CDDT诱导的多尿(图9B)。具体而言，已经接受PBS的动物表现为每日尿量从大约30mL/天显著增加为大约47mL/天。相反，接受组织保护性肽的动物与接受PBS而不是CDDT的对照动物没有显著差异。
实施例8:防止糖尿病诱导的视网膜血管渗漏
组织保护性肽对高血糖诱导的视网膜血管渗漏的有益效果可以用大鼠糖尿病视网膜病模型来确定。在该模型中，如Xu等人，2001，Invest.Ophthal.Vis.Sci 42:789-794(在此全文引用作为参考)所述，使用伊文思蓝(Evans blue)测定从血管向组织中的渗漏。伊文思蓝与白蛋白紧密结合，因此保留在循环内，除非发生血管壁渗漏，如无法控制的糖尿病所致。
在该模型中，禁食的雄性Sprague-Dawley大鼠接受单剂量的链脲霉素(60mg.kg，腹膜内)。两天后，在证实发展为糖尿病后(空腹血清葡萄糖大于300mg％)，将动物分为6只动物一组，以及不接受链脲菌素的对照组。给两个糖尿病组腹膜内施用4μg.kg的肽D(SEQ ID NO:30)，每周5天，或者按照相同的日程施用PBS。在不受控的糖尿病发生3周后，将动物麻醉并且静脉内施用伊文思蓝染料(30mg/kg)，允许该染料循环2小时。然后利用心脏穿刺给动物灌注PBS，直到流出液澄清，然后施用4％多聚甲醛。然后取下眼睛，从眼球上小心地剥下视网膜。将视网膜在甲酰胺中于80℃培养18小时测定视网膜的伊文思蓝含量。然后去除上清液，保存用于分析，将视网膜完全干燥并称重。上清液中的伊文思蓝浓度用分光光度计测定，并且建立溶解在甲酰胺中的伊文思蓝的标准曲线。
如图10所见，接受肽D(SEQ ID NO:30)给药的动物与对照组相比，视网膜内伊文思蓝染料没有增多。相反，只接受PBS的糖尿病动物显示视网膜伊文思蓝含量增加，表明血管渗漏已经发生。
实施例9:防止急性肾衰竭
组织保护性肽对于防止局部缺血情况下的肾脏损伤也是有效的。将成年雄性Wistar大鼠麻醉，在腹部形成切口，以显示两条肾动脉。利用无创血管钳压迫两条动脉60分钟，完全停止肾血流。然后去掉血管钳恢复循环，并静脉内施用290pmol/kg-bw的肽F(SEQ ID NO:33)或肽G(SEQ ID NO:40)。另外一个局部缺血组只静脉内施用PBS。
再灌注72小时后，将动物麻醉，利用多聚甲醛进行灌注-固定。将固定的动物径向对半切开，并在室温下浸没在10％甲醛中进一步固定一天。肾脏的组织学评价按照Sharpies等人，2005，J Amer Soc Nephrol:15:2115(全文引用作为参考)的方案进行。简言之，在用梯度乙醇脱水后，将肾片包埋在石蜡中，切成5微米的切片，并固定在载玻片上。载玻片上的切片用二甲苯脱蜡，用苏木精和伊红复染，在光学显微镜下检查。每个肾检查100个视野，对每个肾小管分布给予0-3的得分:0，组织学正常；1，肾小管细胞膨胀，刷状缘丢失，核凝缩，核损失可达三分之一；2，类似于得分1，但是多于三分之一，少于三分之二的肾小管显示核损失；3，多于三分之二的肾小管显示核损失。将所有得分加起来计算每个肾的组织学得分，最大得分为300。
肽F(SEQ ID NO:33)或肽G(SEQ ID NO:40)的施用对照组相比伴随着损伤得分的显著减少(p<0.05)。
实施例11.组织保护性肽在脑型疟中的功效
按照Kaiser等人，2006，J.Infect.Dis.193:987-995(在此全文引用作为参考)所述建立脑型疟啮齿动物模型。7周龄的雌性CBA/J小鼠按每组20只动物分组。每组通过腹膜内施用剂量为106PbA感染的红细胞用伯氏疟原虫(Plasmodiumberghei Anka，PbA)进行感染。小鼠在第4、5、6天接受腹膜内注射的剂量为2.6μg/kg的PBS或肽F(SEQ ID NO:33)。在追踪观察中收集临床状态和血涂片的数据(终点为30天)。按照Kaplan-Meier法计算累积长期存活率，并且用时序检验法(log rank test)比较各组。存活时间是从变量。p-值<0.05被认为具有显著性。
如图12所示，对照组(盐水)的所有小鼠到第8天都死亡。相反，接受肽F(SEQ ID NO:33)的小鼠显示延长的存活期，使用时序检验法，与对照组相比有显著差异(p<0.005)。
实施例12:组织保护性肽在鼠EAE模型中的功效
按照Savino等人，2006，J Neuroimmunol 172:27-37(在此全文引入作为参考)所述，在C57BL/6雌性小鼠(6-8周龄)中诱发实验性自身免疫性脑脊髓炎(“EAE”)。通过在胁部用总量为200μg的MOG35-55(Multiple Peptide Systems，San Diego，CA，美国)皮下免疫来诱导EAE，所述MOG35-55置于补充了8mg/ml结核分枝杆菌(H37RA株；Difco，Detroit，MI，美国)的不完全弗氏佐剂(Sigma，St.Louis，MO，美国)中。将动物饲养在无特定病原体的条件下，使它们自由获取食物和水。小鼠在免疫时和48小时后静脉内接受500ng的百日咳毒素(Sigma)。每天记录体重和临床得分(0＝健康，1＝尾巴松弛，2＝共济失调、和/或后肢轻瘫、或慢翻正反射、28C，3＝后肢麻痹和/或前肢轻瘫，4＝前肢下肢轻瘫，5＝垂死或死亡)。食物丸和饮用水置于笼底的Petri皿中，以使病鼠能够食用和饮用。从免疫后第4天开始，每天皮下施用剂量为4.4mg/kg-bw的肽E(SEQ ID NO:31)。
肽E(SEQ ID NO:31)的施用显著缩短了被治疗动物中AEA的时程并且减轻了其临床表现的严重程度(p<0.01)(图13)。
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，这些实施方案旨在作为本发明的各个方面的单一说明，功能上等同的方法和组分也在本发明的范围内。实际上，基于上述描述和附图，除了本文所显示和描述的，本发明的各种改变对本领域技术人员将是显而易见的。这些改变预期落入所附权利要求书的范围之内。
此处引用的所有参考文献均为了所有目的而在此全文引用作为参考。
序列表
<110>迈克尔·布莱尼
     安东尼·赛拉米
     托马斯·科尔曼
<120>组织保护性肽及其用途
<130>10165-032-228
<150>60/705,741
<151>2005-08-05
<150>60/706,276
<151>2005-08-08
<150>60/831,737
<151>2006-07-18
<160>58
<170>Windows的FastSEQ 4.0版
<210>1
<211>165
<212>PRT
<213>人工序列
Figure A200680034824E00991
Figure A200680034824E01011
Figure A200680034824E01021
Figure A200680034824E01031
Figure A200680034824E01041
Figure A200680034824E01061
Figure A200680034824E01081
<210>14
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>包含氨基酸结构基序A的分离的EPO多肽的变体
<220>
<221>变体
<222>1
<223>Xaa＝任何疏水性氨基酸
<220>
<221>变体
<222>2，5
<223>Xaa＝任何带负电荷的氨基酸(相同或不同)
<220>
<221>变体
<222>3，4
<223>Xaa＝任何氨基酸(相同或不同)
<220>
<221>变体
<222>6
Figure A200680034824E01111
Figure A200680034824E01131
Figure A200680034824E01141
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>包含氨基酸结构基序A的分离的EPO多肽的变体
<220>
<221>变体
<222>1
<223>Xaa＝任何极性氨基酸
<220>
<221>变体
<222>2，4
<223>Xaa＝任何带负电荷的氨基酸(相同或不同)
<220>
<221>变体
<222>3
<223>Xaa＝任何氨基酸
<220>
<221>变体
<222>5
<223>Xaa＝任何疏水性氨基酸
Figure A200680034824E01181
Figure A200680034824E01191
Figure A200680034824E01201
Figure A200680034824E01211
Figure A200680034824E01221
Figure A200680034824Q0123084204QIETU
<210>25
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>包含氨基酸结构基序A的分离的EPO多肽的变体
<220>
<221>变体
<222>1，5
<223>Xaa＝任何疏水性氨基酸
<220>
<221>变体
<222>2
<223>Xaa＝任何带负电荷的氨基酸
<220>
<221>变体
<222>3
<223>Xaa＝任何极性氨基酸
<220>
Figure A200680034824E01251
Figure A200680034824E01261
Figure A200680034824E01271
Figure A200680034824E01281
Figure A200680034824E01291
Figure A200680034824E01311
Figure A200680034824E01321
Figure A200680034824E01341
Figure A200680034824E01351
<210>47
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽H-由EPO氨基酸61，72，75，76，77组成
<400>47
Figure A200680034824Q01362
<210>48
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>降钙素
<400>48
Figure A200680034824Q01363
Figure A200680034824E01371
Figure A200680034824E01381
Figure A200680034824E01391
Figure A200680034824E01401
Figure A200680034824E01411

Claims (57)

1.分离的多肽，由不超过30个氨基酸的序列组成，并且包含以下氨基酸基序:
(a)H1-N1-(X)n-N2-H2，其中，n为0-5；
(b)H1-N1-(X)n-N2-L1，其中，n为0-5；或者
(c)L1-N1-(X)n-N2-H1，其中n为0-5；并且其中H1和H2为疏水性氨基酸，N1和N2为带负电荷的氨基酸，X为任意氨基酸，L1为极性氨基酸；
并且其中所述多肽在应答性细胞、组织或器官中具有细胞保护活性。
2.分离的多肽，由不超过30个氨基酸的序列组成，并且包含以下氨基酸基序:
(a)H1-N1-(L)n-P1-H2，其中n为0-1；或者
(b)H1-P1-(L)n-N1-H2，其中n为0-1；
并且其中H1和H2为疏水性氨基酸，N1为带负电荷的氨基酸，L1为极性氨基酸，P1为带正电荷的氨基酸；
并且其中所述多肽在应答性细胞、组织或器官中具有细胞保护活性。
3.分离的多肽，包含:
(i)与和所述多肽具有相同数目氨基酸残基的SEQ ID NO:1的任意部分具有少于90％的序列同一性的氨基酸序列；和
(ii)以下氨基酸基序:
(a)H1-N1-(X)n-N2-H2，其中n为0-5；
(b)H1-N1-(X)n-N2-L1，其中n为0-5；或者
(c)L1-N1-(X)n-N2-H1，其中n为0-5；
并且其中H1和H2为疏水性氨基酸，N1和N2为带负电荷的氨基酸，X为任意氨基酸，L1为极性氨基酸；
并且其中所述多肽在应答性细胞、组织或器官中具有细胞保护活性。
4.分离的多肽，包含:
(i)与和所述多肽具有相同数目氨基酸残基的SEQ ID NO:1的任意部分具有不到90％的序列同一性的氨基酸序列；和
(ii)以下氨基酸基序:
(a)H1-N1-(L)n-P1-H2，其中n为0-1；或
(b)H1-P1-(L)n-N1-H2，其中n为0-1；
并且其中H1和H2为疏水性氨基酸，N1为带负电荷的氨基酸，L1为极性氨基酸，P1为带正电荷的氨基酸；
并且其中所述多肽在应答性细胞、组织或器官中具有细胞保护活性。
5.权利要求1或3的分离的多肽，其中所述多肽的三级结构导致的N1和N2之间的距离为大约至大约
Figure A200680034824C00032
6.权利要求5的分离的多肽，其中所述距离为大约
Figure A200680034824C00033
至大约
Figure A200680034824C00034
7.权利要求6的分离的多肽，其中所述距离为大约
Figure A200680034824C00035
至大约
Figure A200680034824C00036
8.权利要求2或4的分离的多肽，其中所述多肽的三级结构导致的N1和P2之间的距离为大约
Figure A200680034824C00037
至大约
Figure A200680034824C00038
9.权利要求8的分离的多肽，其中所述距离为大约
Figure A200680034824C00041
至大约
Figure A200680034824C00042
10.权利要求9的分离的多肽，其中所述距离为大约
Figure A200680034824C00043
至大约
Figure A200680034824C00044
11.分离的多肽，由不超过30个氨基酸的序列组成，并且包含以下氨基酸基序:
(a)H1N1N2H2；
(b)H1N1N2L1；或
(c)L1N1N2H1，
该基序是由于所述多肽的三级结构而形成的，使得N1和N2的羰基碳之间的距离为大约3
Figure A200680034824C0004133447QIETU
至大约5
Figure A200680034824C0004133447QIETU
，其中H1和H2为疏水性氨基酸，N1和N2为带负电荷的氨基酸，L1为极性氨基酸；
并且其中所述多肽在应答性细胞、组织或器官中具有细胞保护活性。
12.分离的多肽，由不超过30个氨基酸的序列组成，并且包含以下氨基酸基序:
(a)H1N1(L)nP1H2，其中n为0-1；或
(b)H1P1(L)nN1H2，其中n为0-1；
该基序是由于所述多肽的三级结构而形成的，使得N1和P2的羰基碳之间的距离为大约3
Figure A200680034824C0004133447QIETU
至大约5
Figure A200680034824C0004133447QIETU
，其中H1和H2为疏水性氨基酸，N1为带负电荷的氨基酸，L1为极性氨基酸，P1为带正电荷的氨基酸；
并且其中所述多肽在应答性细胞、组织或器官中具有细胞保护活性。
13.分离的多肽，其包含:
(i)与和所述多肽具有相同数目氨基酸残基的SEQ ID NO:1的任意部分具有不到90％的序列同一性的氨基酸序列；和
(ii)以下氨基酸基序:
(a)H1N1N2H2；
(b)H1N1N2L1；或
(c)L1N1N2H1，
该基序是由于所述多肽的三级结构而形成的，使得N1和N2的羰基碳之间的距离为大约
Figure A200680034824C00051
至大约
Figure A200680034824C00052
，其中H1和H2为疏水性氨基酸，N1和N2为带负电荷的氨基酸，L1为极性氨基酸；
并且其中所述多肽在应答性细胞、组织或器官中具有细胞保护活性。
14.分离的多肽，其包含:
(i)与和所述多肽具有相同数目氨基酸残基的SEQ ID NO:1的任意部分具有不到90％的序列同一性的氨基酸序列；和
(ii)以下氨基酸基序:
(a)H1N1(L)nP1H2，其中n为0-1；或
(b)H1P1(L)nN1H2，其中n为0-1；
该基序是由于所述多肽的三级结构而形成的，使得N1和P2的羰基碳之间的距离为大约至大约
Figure A200680034824C00054
其中H1和H2为疏水性氨基酸，N1为带负电荷的氨基酸，L1为极性氨基酸，P1为带正电荷的氨基酸；
并且其中所述多肽在应答性细胞、组织或器官中具有细胞保护活性。
15.权利要求1、3和5-7中任意一项的分离的多肽，其中所述氨基酸基序为(a)，并且其中H1和H2为相同的疏水性氨基酸。
16.权利要求11或13的分离的多肽，其中所述氨基酸基序为(a)，并且其中H1和H2为相同的疏水性氨基酸。
17.权利要求1、3和5-7中任意一项的分离的多肽，其中所述氨基酸基序为(a)，并且其中H1和H2为不同的疏水性氨基酸。
18.权利要求11或13的分离的多肽，其中所述氨基酸基序为(a)，并且其中H1和H2为不同的疏水性氨基酸。
19.权利要求2、4和8-10中任意一项的分离的多肽，其中所述氨基酸基序为(a)或(b)，并且其中H1和H2为相同的疏水性氨基酸。
20.权利要求12或14的分离的多肽，其中所述氨基酸基序为(a)或(b)，并且其中H1和H2为相同的疏水性氨基酸。
21.权利要求2、4和8-10中任意一项的分离的多肽，其中所述氨基酸基序为(a)或(b)，并且其中H1和H2为不同的疏水性氨基酸。
22.权利要求12或14的分离的多肽，其中所述氨基酸基序为(a)或(b)，并且其中H1和H2为不同的疏水性氨基酸。
23.权利要求1、3和5-7中任意一项的分离的多肽，其中所述氨基酸基序为(a)、(b)或(c)，并且其中N1和N2为相同的带负电荷的氨基酸。
24.权利要求11或13的分离的多肽，其中所述氨基酸基序为(a)、(b)或(c)，并且其中N1和N2为相同的带负电荷的氨基酸。
25.权利要求1、3和5-7中任意一项的分离的多肽，其中所述氨基酸基序为(a)、(b)或(c)，并且其中N1和N2为不同的带负电荷的氨基酸。
26.权利要求11或13的分离的多肽，其中所述氨基酸基序为(a)、(b)或(c)，并且其中N1和N2为不同的带负电荷的氨基酸。
27.权利要求1-26中任意一项的分离的多肽，其中所述肽由I型细胞因子衍生而来。
28.权利要求27的分离的多肽，其中该I型细胞因子是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白介素-3、血小板生成素、睫状神经营养因子或白血病抑制因子。
29.权利要求1-28中任意一项的分离的多肽，其中所述多肽进一步包含至少另外一种下列氨基酸基序:
(a)H1-N1-(X)n-N2-H2，其中n为0-5；
(b)H1-N1-(X)n-N2-L1，其中n为0-5；
(c)L1-N1-(X)n-N2-H1，其中n为0-5；
(d)H1-N1-(L)n-P1-H2，其中n为0-1；
(e)H1-P1-(L)n-N1-H2，其中n为0-1；
(f)H1N1N2H2；
(g)H1N1N2L1；
(h)L1N1N2H1；
(i)H1N1(L)nP1H2，其中n为0-1；或
(j)H1P1(L)nN1H2，其中n为0-1；
其中基序(f)、(g)或(h)是由于所述多肽的三级结构而形成的，使得N1和N2的羰基碳之间的距离为大约3
Figure A200680034824C0004133447QIETU
至大约5
Figure A200680034824C0004133447QIETU
；其中基序(i)或(j)是由于所述多肽的三级结构而形成的，使得N1和P2的羰基碳之间的距离为大约
Figure A200680034824C00081
至大约
Figure A200680034824C00082
且其中H1和H2为疏水性氨基酸，N1和N2为带负电荷的氨基酸，X为任意氨基酸，L1为极性氨基酸，且P1为带正电荷的氨基酸。
30.权利要求29的分离的多肽，其中至少两种所述基序是不同的。
31.权利要求1-29中任意一项的分离的多肽，其中所述多肽是进一步包含两亲性肽螺旋的嵌合肽。
32.权利要求31的分离的多肽，其中所述两亲性肽螺旋包含氨基酸序列ALSILVLLQAGS(SEQ ID NO:48)；VALLPCPPCRA(SEQ ID NO:49)；NAIIKNAYKKG(SEQ ID NO:50)；GSWQRSLQDTE(SEQ ID NO:51)；GGSAARPAPP(SEQ ID NO:52)；NALAENDTPYY(SEQ ID NO:53)；GALAEAYPSKP(SEQ ID NO.54)；GCSSQHWSYGL(SEQ ID NO:55)；VMIVMLAICFL(SEQ ID NO:56)；LRRYINMLTRP(SEQ ID NO:28)；或LALSILVLYQA(SEQ ID NO:57)。
33.权利要求1-30中任意一项的分离的多肽，其中所述多肽不增加接受者中的血红蛋白。
34.权利要求1-31中任意一项的分离的多肽，其中所述细胞保护活性保护、维持、增强或恢复所述细胞、组织或器官的功能和/或存活力。
35.权利要求1-32中任意一项的分离的多肽，其中所述多肽在神经元、骨、眼、脂肪、结缔组织、毛发、牙齿、粘膜、胰、内分泌、耳、上皮、皮肤、肌肉、心脏、肺、肝、肾、肠、肾上腺、毛细血管、内皮、睾丸、卵巢或子宫内膜细胞或组织中具有细胞保护活性。
36.权利要求1-32中任意一项的分离的多肽，其中所述多肽在干细胞中具有细胞保护活性。
37.权利要求1-32中任意一项的分离的多肽，其中所述多肽在可兴奋组织中具有细胞保护活性。
38.权利要求35的分离的肽，其中所述可兴奋组织是中枢神经系统组织、周围神经系统组织、心脏组织或视网膜组织。
39.权利要求1-36中任意一项的分离的肽，其中所述肽能够穿过内皮细胞屏障。
40.权利要求37的分离的肽，其中所述内皮细胞屏障包括血-脑屏障、血-眼屏障、血-睾丸屏障、血-卵巢屏障、血-神经屏障或血-脊髓屏障。
41.包含权利要求1-38中任意一项的分离的多肽和药学上可接受的载体的药物组合物。
42.权利要求39的药物组合物，其中所述组合物配制用于口服、鼻内、经眼、吸入、经皮、经直肠、舌下或肠胃外给药。
43.权利要求39的药物组合物，其中所述组合物配制为灌注液。
44.保护、维持或增强从哺乳动物体内分离的应答性细胞、组织或器官的活力的方法，包括将所述细胞、组织或器官暴露于药物组合物，包括将所述细胞、组织或器官暴露于权利要求39、40或41的药物组合物。
45.权利要求1-38中任意一项的分离的肽在制备用于在需要的受试者中保护和/或预防组织损伤、用于恢复或用于复原组织和/或组织功能的药物组合物中的用途。
46.权利要求1-38中任意一项的分离的肽在制备用于在需要的受试者中预防、治疗性处理或预防性处理心血管疾病、心肺疾病、呼吸性疾病、肾脏疾病、泌尿系统疾病、生殖系统疾病、骨病、皮肤病、胃肠疾病、内分泌异常、代谢异常、认知功能障碍、或中枢或周围神经系统的疾病或障碍的药物组合物中的用途。
47.权利要求43或44的用途，其中所述受试者是哺乳动物。
48.权利要求45的用途，其中所述哺乳动物是人。
49.促进分子通过有此需要的受试者的内皮细胞进行转胞吞的方法，包括给所述受试者施用包含与权利要求1-38中任意一项的分离的肽结合的所述分子的组合物。
50.权利要求47的方法，其中所述结合是与所述分子的结合位点的不稳定的共价键、稳定的共价键、或非共价结合。
51.包含编码权利要求1-38中任意一项的分离的肽的核苷酸序列的分离的核酸。
52.包含权利要求49的核酸的载体。
53.权利要求50的载体，该载体是表达载体。
54.含有权利要求51的表达载体的宿主细胞。
55.重组制备权利要求1-38中任意一项的分离的肽的方法，所述方法包括i)在适合表达所述肽的条件下，在培养基中培养权利要求52的宿主细胞，和ii)从所述培养基中回收和分离所述肽。
56.权利要求2的分离的肽，其中所述肽包含氨基酸序列肽A(APPRLICDSRVLERYLLEAKEAE，SEQ ID NO:32)、肽C(NITVPDTKVNFYAWKRMEVG，SEQ ID NO:29)、肽D(QQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLV，SEQ ID NO:30)、肽E(GCAEHCSLNENITVPDTKVN，SEQ ID NO:31)、肽F(RYLLUNITTGC，SEQIDNO:33)、肽G(QEQLERALNSS，SEQ ID NO:40)、肽I(CSLNENIQEQLERALNSS，SEQ ID NO:43)、肽J(QEQLERALNSSLRRYINMLTRTR，SEQ ID NO:41)、肽K(WEHVNAIQEARRLL，SEQ ID NO:35)或肽L(KIRSDLTALTESYVKH，SEQID NO:37)。
57.权利要求1-38中任意一项的分离的肽，其中所述至少一种细胞保护活性是神经保护，该活性利用方法在体外评价，该方法包括:
(a)将原代海马神经元的待测培养物与N-甲基-D-天冬氨酸和所述肽接触；和
(b)在所述接触后48小时测定细胞活力，
使得如果在步骤(b)中测定的细胞活力大于不含所述肽的对照培养物的细胞活力，则该肽具有细胞保护活性。
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