CN102212111A - 小分子多肽和小分子多肽脂质体及其运用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，特别涉及小分子多肽脂质体，含有如SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列，其使创伤性脑损伤大鼠的运动功能和感觉功能得到明显改善，脑组织凋亡神经细胞数目显著降低、存活神经细胞数目显著增加，损伤部位脑组织炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素1β(IL-1β)的mRNA水平明显减低，与促红细胞生成素比较，连续注射不诱导大鼠造血功能。

Description

小分子多肽和小分子多肽脂质体及其运用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及小分子多肽和小分子多肽脂质体及其运用。

背景技术

创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)是指各种原因致使颅脑受到钝性、利性或加速/减速的作用力，导致的脑功能受损，是威胁人类生命的重要病因，在我国和全球是40岁以下人群导致死亡的最主要病因。TBI年发生率在发达国家约为200/10万人口，在我国八十年代约为56/10万人口，随着我国交通、建筑事业的高速发展以及运动损伤、意外事故和自然灾害等因素的存在其年发病率也在增长，目前认为TBI年发生率在我国超过100/10万人口。TBI在我国死亡率约为10.8％，成植物人状态的约为2.6％，严重致残率约为2.2％，中度致残率约为7.2％，严重危害人类生命和健康，也给家庭和社会带来沉重的经济负担。

目前对TBI的治疗仍采用传统的减轻脑水肿、降低颅内压、防止继发性脑损害和积极防治并发症等综合处理措施，由于对TBI的病理生理学研究尚无突破性进展，尚无针对T B I生理病理过程的特效药物。既往的脑损伤研究中，当人们认识到脑损伤后继发损害的某一机制时，都试图采取某种方式干预这一生化级联过程以降低病死率及致残率，如兴奋性氨基酸拮抗剂、自由基清除剂、抗炎性反应药物、Ca2+拮抗剂等，尽管有多个临床II期试验显示具有良好效果，但在临床III期试验中均无明显的临床意义。最近，美国国立神经疾病与中风研究院(NINDS)组织专家进行了大宗病例的多项研究，通过分析讨论发现，谷氨酸受体拮抗剂、激素、自由基清除剂、Ca2+拮抗剂、生长激素/胰岛素样生长因子、缓激肽拮抗剂、抗癫痫药物等，至今还没有一种药物能通过前瞻性双盲临床对照研究证实其对TBI有确切的效果。相关研究证实，49种脑蛋白类药物，包括脑活素、脑水解蛋白、神经节甘酯等，虽然在实验研究中疗效明显，但在临床上还没有一种药物获得认可。因此急需研究开发T B I治疗药物。

促红细胞生成素是由肾脏分泌的分子量为30.4kD的细胞因子。它与促红细胞生成素受体结合后，刺激红系祖细胞增殖、分化、成熟、抑制其凋亡，增加成熟红细胞的数量从而参与机体的造血功能。研究显示促红细胞生成素不仅有促红细胞生成的作用，还具有抑制炎症和组织保护功能，在多种不同损伤疾病模型，如自身免疫性疾病和组织缺血性损伤中均有治疗作用。促红细胞生成素在神经系统疾病的治疗方面有重要潜能，比如缺血性卒中、脑出血、蛛网膜下腔出血、脑外伤、帕金森病、自身免疫性脑脊髓炎等疾病。例如在脑外伤模型中，促红细胞生成素治疗相比空白组降低了脑水肿的严重程度和血脑屏障的破坏程度，减小损伤面积。然而大剂量、多次注射红细胞生成素会产生一系列不可避免的潜在风险事件，包括红细胞生成以及红细胞比容增大带来的血液黏滞、血小板激活带来的血栓生成、可能的血压升高、促肿瘤生长、诱发抗促红细胞生成素抗体生成等诸多副作用限制了促红细胞生成素在许多情况下的使用。

近期研究表明，促红细胞生成素的组织保护作用及其对炎症和免疫的调节作用的实现是通过一种新型受体实现的，该受体是一种异源二聚体，由促红细胞生成素受体EPO-R和CD131分子构成。而促红细胞生成素的促造血功能，由促红细胞生成素受体EPO-R的同源二聚体介导。因此开发出只能和该种新型受体结合而不与介导造血功能的受体结合的药物，成为扩大促红细胞生成素临床使用的关键。

脂质体是由一层或多层的同心的脂质双分子层包裹而形成的球状体，可以包裹多种药物例如疫苗、抗肿瘤药、蛋白质、核酸等，其特点是延长药物的作用时间、增加其脂溶性、稳定性、减少毒副作用。因此，相比单独使用小分子多肽，使用脂质体包裹小分子多肽后可以使其延长半衰期、增加其稳定性、脂溶性，增加其给药途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小分子多肽，其具有治疗脑损伤的作用，并且其治疗脑损伤的作用要优于单独使用其所含的小分子多肽治疗脑损伤的作用。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

小分子多肽，小分子多肽为含有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的多肽。

本发明的目的之二在于提供一种小分子多肽的脂质体，其具有治疗脑损伤的作用，并且其治疗脑损伤的作用要优于单独使用其所含的小分子多肽治疗脑损伤的作用。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

含有所述的小分子多肽的脂质体。

进一步，所述小分子多肽的脂质体中软磷脂、胆固醇及小分子多肽的质量比为50∶50∶1；

进一步，所述小分子多肽脂质体为溶液剂、凝胶剂、喷雾剂、混悬剂、乳剂或粉剂。

本发明的目的之三在于提供所述小分子多肽或小分子多肽脂质体的运用，该运用为治疗脑损伤提供了新的思路。

所述的小分子多肽或所述的小分子多肽的脂质体在制备治疗脑损伤药物中的运用。

进一步，所述小分子多肽或小分子多肽脂质体在制备脑损伤的运功功能恢复的促进剂中的运用；

进一步，所述小分子多肽或小分子多肽脂质体在制备脑损伤的感觉功能恢复的促进剂中的运用；

进一步，所述小分子多肽或小分子多肽脂质体在制备巨噬细胞激活的抑制剂中的运用；

进一步，所述小分子多肽或小分子多肽脂质体在制备神经细胞凋亡的抑制剂中的运用；

进一步，所述小分子多肽或小分子多肽脂质体在制备脑损伤中炎症因子表达抑制剂中的运用。

上述目的的实现过程是通过：对促红细胞生成素的改造与合成，制得如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的小分子多肽；而后将该多肽采用逆向蒸发法与脂质体混合；同时建立创伤性脑损伤大鼠模型，将合成的小分子多肽脂质体作为大鼠脑损伤的治疗药物，以PBS为空白对照，以小分子多肽及小分子多肽脂质体分别作为治疗治疗组，通过治疗脑损伤，发现小分子多肽脂质体或小分子多肽治疗后创伤性脑损伤大鼠的运动能力恢复，肢体反射能力得到明显提高，巨噬细胞的激活数量及炎症因子的表达量得到明显抑制，凋亡神经组织细胞的数量降低，更重要的是，小分子多肽脂质体的作用优于单独使用小分子多肽，且给药频率可以明显减少。其中小分子多肽脂质体治疗脑损伤的作用优于小分子多肽。并且制备的小分子多肽脂质体连续注射不诱导大鼠造血功能。

有益效果：通过如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列小分子多肽脂质体和小分子多肽的治疗，与PBS空白对照治疗组比较：创伤性脑损伤大鼠的运动功能和感觉功能得到明显改善；创伤性脑损伤大鼠脑组织凋亡神经细胞数目显著降低、存活神经细胞数目显著增加；创伤性脑损伤大鼠损伤部位脑组织炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素1β(IL-1β)的mRNA水平明显减低。而且以上结果中，小分子多肽脂质体产生的有益效果要优于小分子多肽。同时如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列小分子多肽及小分子多肽脂质体在体外细胞实验，可以抑制神经细胞的凋亡和抑制巨噬细胞的炎症激活。并且如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列小分子多肽以及小分子多肽脂质体与促红细胞生成素比较，连续注射不诱导大鼠造血功能。

附图说明

图1为创伤性脑损伤大鼠治疗行为学评分结果分析图；

图2为血红蛋白含量分析图；

图3为激活的巨噬细胞数量分析图；

图4为死亡神经元数量分析图；

图5为神经元细胞数量分析图；

图6为炎症因子表达量的分析图；

图7为双氧水损伤模型中PC-12细胞生存量分析图；

图8为巨噬细胞在LPS诱导的炎症模型中肿瘤坏死因子和诱导性一氧化氮合酶的分泌抑制的分析图；

图9为巨噬细胞在LPS诱导的炎症在加入不同浓度本发明小分子多肽脂质体的作用下肿瘤坏死因子(TNF)和诱导性一氧化氮合酶(iNOS)的基因表达量分析图。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。

部分氨基酸相应的缩写如下：

谷酰胺gln Q；甘氨酸gly G；丝氨酸ser S；丙氨酸ala A；苏氨酸thr T；缬氨酸val V；异亮氨酸i le I；亮氨酸leu L；酪氨酸tyr Y；苯丙氨酸pheF；组氨酸hi s H；脯氨酸pro P；天冬酰胺asn N；甲硫氨酸met M；谷氨酸glu E；色氨酸trp W；赖氨酸lys K；半胱氨酸cys C；精氨酸arg R。

实施例1：小分子多肽的制备

小分子多肽的氨基酸序列如下：Gln Glu Gln Leu Glu Arg Ala Leu Asn Ser Ser(，该段多肽依次来源于促红细胞生成素的第58位(谷氨酰胺)、第62位(谷氨酸)、第65位(谷氨酰胺)、第69位(亮氨酸)、第72位(谷氨酸)、第76位(精氨酸)、第79位(丙氨酸)、第80位(亮氨酸)、第83位(天冬酰胺)、 第84位(丝氨酸)、第85位(丝氨酸)。

小分子多肽合成在ABI 431A型固相多肽合成仪(美国PE公司)上进行。方法采用标准芴甲氧羰基(Fmoc)方案，精氨酸采用两次偶联。起始选用0.125mmol对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂(HMP树脂)，按照多肽序列使肽链从羧基端逐个向氨基端延伸，每种氨基酸的用量为0.5mmol，与树脂的摩尔比为4∶1.各种氨基酸的α-氨基酸为Fmoc保护，其余侧链保护基团为：Ser(tBu)、Glu(OtBu)、Arg(Pmc)。第一个氨基酸连接到树脂上用4-二甲基吡啶，氨基酸活化用1-羟基苯并三唑和二环乙基碳，偶联后用体积分数为20％的哌啶水溶液去除Fmoc保护基。多肽粗品合成后，将树脂-粗肽在冰冷浴条件下混合于10ml切割液A(由结晶苯酚0.75g、1，2-乙二硫醇0.25ml、苯甲硫醚0.5ml、去离子水0.25ml和三氟乙酸10ml组成)中，待切割液温度上升至室温后，搅拌2小时，使肽链从树脂上裂解下来，同时去除多种保护基团，将反应混合液经G4玻砂漏斗过滤后以除去树脂，先后用1ml三氟乙酸，10ml二氯甲烷反复冲洗反应瓶，树脂和漏斗。将滤液在常温低压下蒸发至1-2ml，加入50ml预冷乙醚蒸发小分子多肽粗品，-20°保存备用。

将小分子多肽粗品用二甲基亚砜溶解成浓度为20mg/ml的溶液，经孔径为0.45um的绿孔滤膜过滤后，在AKTA explorer 100型中压液相色谱仪(瑞典amerssam bioscience)上用SOURCE凝胶柱上纯化。流动相A有体积百分比为10％的乙醇和体积百分含量为0.1％三氟乙酸组成，流动相B由体积百分含量为90％的乙醇和体积百分含量为0.1％三氟乙酸组成。先用流动相A 1.5个柱体积洗脱，再用流动相A和流动相B的混合液。(流动相B占混合液的体积分数在8个柱体积内由0％逐渐增加至80％)洗脱，再用流动相A和流动相B的混合液(流动相B占混合液的体积分数在0.5个柱体积内由0％逐渐增加至80％)洗脱，在主峰处收集多肽溶液，冷却干燥，即得小分子多肽纯品，用二甲基亚砜溶解，-20°保存备用。将小分子多肽纯品用Delta 600型高压液相色谱仪(美国waters公司)鉴定纯度，采用symmetry shield C18柱，流动相由体积百分含量为10％ 到60％的乙和体积百分含量为0.1％的三氟乙酸组成，梯度洗脱，流速为1ml/min。结果显示，合成多肽的纯度达到90％以上。同时，将小分子多肽纯品用API2000LC/MS型电喷雾离子化质谱仪测定分子量。结果显示，合成的小分子多肽的分子量与理论值相符。

实施例2小分子多肽脂质体的制备

采用逆向蒸发法制备小分子多肽脂质体。将软磷脂和胆固醇(质量比1∶1)适量溶于乙醚中，减压蒸馏除去其中的有机溶剂，超声水浴5分钟使其形成为均匀的W/O型乳液，再加入适量的如SEQ ID NO：1所示的小分子多肽(肽∶软磷脂∶胆固醇质量比为1∶50∶50)，在42°水浴和干冰中反复冻融，并且连续数次通过孔径为100nm的薄膜挤出器。利用如SEQ ID NO：1所示的小分子多肽与脂质体结合后体积变大，用琼脂糖凝胶CL-4B柱分离未与脂质体结合的小分子多肽。然后用透射电镜观察所得小分子多肽脂质体的形态结构：将小分子多肽脂质体混合物用浓度为3g/L的磷钨酸溶液负染后，滴至专用铜网并风干，用透射电镜观察小分子多肽脂质体的形态结构，结果所得到的小分子多肽脂质体为球形囊泡，粒径范围为50-110nm，平均粒径为70nm。使用液相质谱测定小分子多肽脂质体的包封率：取0.5ml的小分子多肽脂质体溶液，加入等体积生理盐水混匀，600g离心10分钟，除去上清液，沉淀部分用10％的tritonX-100破膜并且稀释至10ml，采用液相质谱法测定，得到药物包封部分的浓度和相同体积不含小分子多肽的脂质体的总浓度，两者之比为小分子多肽脂质体的包封率，为80％。

实施例3小分子多肽及小分支多肽脂质体在用于治疗大鼠创伤性脑损伤中的运用

1、动物：

雄性SD大鼠，体重250-300克，购于第三军医大学动物实验室，正常饲养于清洁动物房。

2、药物：

小分子多肽脂质体治疗组：给予多肽小分子多肽脂质体20nmol/kg体重进行腹腔注射，共计6只；

小分子多肽治疗组：给予如SEQ ID NO：1所示的小分子多肽20nmol/kg体重进行腹腔注射，共计6只；

空白组：给予与治疗组等体积的PBS进行腹腔注射，共计6只。

3、实验方法：

自由落体打击法是创伤性脑损伤常用动物建模方法，本实验用于验证多肽小分子对创伤性脑损伤的治疗作用。脑外伤模型制作参照Feeney(高燕，孙骏谟，田志雄，吴光耀。大鼠自由落体脑外伤模型的制作。浙江创伤外科，20049(5)283-285.)自由落体撞击法造模，具体为：大鼠用体积分数为10％水合氯醛腹腔注射麻醉；俯卧位固定，消毒后于矢状正中线切开头皮，分离软组织及骨膜；在左顶叶上方作一直径约4mm的骨窗(中心位置：前囱后2mm，中线左2mm)保持硬膜完整。10克打击棒(打击面直径为3mm)在距离脑表面50mm的高度自由落体，造成脑组织打击性挫伤。术后及时止血，加强保暖、预防感染等护理。

手术后立即经腹腔给大鼠分别给空白组大鼠注射PBS，小分子多肽组大鼠注射小分子多肽，随后每24小时注射一次，共注射7次。小分子多肽脂质体组大鼠注射小分子多肽脂质体，随后每48小时注射一次，共注射4次

神经行为学评分

大鼠分别在损伤前进行一次神经行为学评分，然后在损伤的第7天评分一次，每组大鼠数量为6只。采用双盲法，评分者经过培训，以保证对标准的正确把握，评分者对实验分组情况未知。评分内容涵盖运动、感觉和反射，最高分为10分，正常大鼠接近0分。8一10分为严重损伤，4一7分为中度损伤，1一3分为轻度损伤。评分标准如下：

神经行为学评分的运动试验：

提起大鼠尾巴，前肢屈曲，1分；后肢屈曲，1分；头向健侧屈曲＞10度，持续30秒，1分。

将大鼠放于地板上(最低＝0，最高＝3)

正常行走，0分；不能走直线，1分；向手术侧转圈，2分；向手术侧倾倒，3分。

肢体反射与不自主运动

耳廓反射，1分；角膜反射，1分；惊跳反射，1分；癫痈，肌阵挛或肌张力障碍，1分。

创伤性脑损伤大鼠治疗行为学评分结果如图1所示，可见经小分子多肽脂质体治疗和如SEQ ID NO：1所示的小分子多肽治疗的脑外伤大鼠神经行为学评分明显低于PBS对照治疗的在脑外伤大鼠，表明小分子多肽脂质体治疗和如SEQ IDNO：1所示的小分子多肽均能显著改善创伤性脑损伤后大鼠的运动和感觉功能，具有治疗保护作用(*表示P小于0.05)；而且更重要的是，结果显示小分子多肽脂质体治疗效果要优于未制备成脂质体的小分子多肽治疗的效果，而且前者的给药频率较后者减少。

对造血功能影响

促红细胞生成素由193个氨基酸组成，不同氨基酸序列能够和促红细胞生成素受体或CD131结合。只具组织保护功能，而不具促造血功能的促红细胞生成素来源小分子肽需要，只能激活促红细胞生成素受体和CD 131异源二聚体受体，而不激活促红细胞生成素同源二聚体受体的序列。本发明涉及的如SEQ ID NO：1所示的小分子多肽序列为促红细胞生成素来源，为通过对促红细胞生成素结构分析选取不同位点组合，并结合实验得到的如SEQ ID NO：1所示的小分子多肽。该多肽不能与介导红细胞生成的促红细胞生成素受体结合，但是可以和介导组织保护及炎症调节的新型受体结合。该小分子多肽及其小分子多肽脂质体对机体造促红细胞生成功能的影响，需要进一步实验来验证。研究小分子多肽以及小分子多肽脂质体是否无促红细胞生成功能，是通过对动物造血功能影响的试验来证实的。

为研究小分子多肽和小分子多肽脂质体的促造血功能，以雄性SD大鼠为研 究对象，分别设立空白对照组(PBS)，小分子多肽脂质体的治疗组(20nmol/kg，每天)、如SEQ ID NO：1所示的小分子多肽的治疗组(20nmol/kg，每天)，阳性对照组(促红细胞生成素，20nmol/kg，每天)，每天注射一次，连续7天，每组大鼠5只。实验第8天取空白组、小分子多肽脂质体的治疗组、如SEQ ID NO：1所示的小分子多肽的治疗组、阳性对照组大鼠作外周血按常规方法作血象分析。结果如图2所示：小分子多肽脂质体的治疗组和如SEQ ID NO：1所示的小分子多肽的治疗组相对于空白组并无明显差异，而阳性对照组的血红蛋白量明显升高、红细胞数明显升高、红细胞压积增大；说明如SEQ ID NO：1所示的小分子多肽和小分子多肽脂质体均无促红细胞生成作用。

免疫组化染色，显示激活的巨噬细胞

为了考察损伤脑组织的炎症细胞浸润情况，取大鼠脑组织做免疫组化染色。用乙醚深度麻醉大鼠后心内灌注4℃遇冷，体积分数为4％的多聚甲醛的磷酸盐缓冲液。脑迅速拆除，后在体积分数为4％多聚甲醛固定过夜，石蜡包埋，连续切片(3微米)、经过脱蜡，坐骨神经切片在柠檬酸缓冲液中煮沸15分钟以灭活内源性过氧化物酶。体积分数为1％的甲醇15分钟抑制过氧化氢酶，孵育于体积分数为10％的正常猪血清(Biochrom，柏林，德国)，以阻止非特异性免疫球蛋白的结合。使用的单克隆抗体为：ED1(1∶100；Serotec，牛津，英国)标记激活的巨噬细胞。使用stereologer软件进行细胞计数。

结果：如图3所示，小分子多肽脂质体治疗组巨噬细胞的激活数量约为100个/mm²，小分子多肽治疗组的巨噬细胞的激活数量约为130个/mm²而空白组则高达240个/mm²，空白组被激活的巨噬细胞数量明显高于治疗组，小分子多肽对损伤脑组织的炎症细胞浸润得到明显改善，而且小分子多肽脂质体的效果要好于未制备成脂质体的如SEQ ID NO：1所示的小分子多肽。

Fluoro-JadeB染色，检测凋亡神经细胞

Fluoro-JadeB是一种多阴离子荧光素衍生物，对变性神经元具有很高的亲 和力，可以选择性地标记变性死亡的神经元。取前白后3.SOmm和4.3Om的切片，在0.05M磷酸缓冲液(Phosphatebuffer，PB)中铺于1％明胶化的载玻片上，空气中风干过夜。系列酒精脱水，0.06％高锰酸钾溶液中浸泡15分钟，双蒸水中漂洗2分钟，在0.0006％Fluoro一Jade B染色液(含0.1％醋酸)中孵育30分钟，双蒸水中漂洗3分钟，空气风干，二甲苯透明，DPX封固剂封片。在紫外下使用异硫氰酸荧光素滤片(fluoreseini sothioeyanate，FITC)观察Fluoro-JadeB染色细胞。变性神经元在背景的衬托下发亮荧光。使用stereologer软件进行细胞计数。

结果：如图4所示，小分子多肽脂质体治疗组死亡神经元数量约为90个/mm²，小分子多肽治疗组死亡神经元数量约为120个/mm²，而空白组则高达300个/mm²，空白组被激活的巨噬细胞数量明显高于治疗组，小分子多肽使死亡神经元数量明显减少，而且小分子多肽脂质体的效果要好于未制备成脂质体的如SEQ ID NO：1所示的小分子多肽。

结晶紫染色(Cresyl violetacetatestain)检测存活神经细胞数目

在TBI后第15天，收集组织并切片。取前自后2.80mm至前囱后4.80mm的切片(Figurell)经脱水、脱脂、再水化、染色、分化及脱水，最后封片。简言之，将组织切片在0.05M PB中铺于1％明胶化的载玻片上，空气中风干过夜。系列酒精脱水-50％酒精(2min)，70％酒精(2min)，95％酒精一I(2min)，95％酒精一II(2min)，100％酒精一I(2min)，100％酒精一II(2min)。脱脂-二甲苯一I(smin)，二甲苯一II(10min)，二甲苯一I  (1min)。再水化-100％酒精一II(1min)，100％酒精一I(1min)，95％酒精一II(1min)，95％酒精一I(1min)，70％酒精(1min)。双蒸水漂洗1min，在结晶紫染液中孵育5min，双蒸水漂洗30秒。分化-95％酒精(含醋酸)(6min)。脱水-95％酒精一I(30秒)，95％酒精一II(30秒)，100％酒精一I(30秒)，100％酒精一II(30秒)。上述酒精浓度均以体积浓度计。二甲苯透明，中性树胶封片。在光镜下使用stereologer 软件进行细胞计数。

结果：由图5可知，空白组的存活神经元细胞数量为4000/平方毫米，小分子多肽治疗组的存活神经元细胞数量为90000/平方毫米，小分子多肽脂质体治疗组的存活神经元细胞数量更是达到11000/平方毫米，可见治小分子多肽脂质明显增加了存活的神经元数量。

炎症因子的表达分析

TBI大鼠在麻醉状态下4℃心内灌注PBS，然后快速取出损伤部位脑组织，放入液氮中保存时。用Trizol LS试剂(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)分离出总RNA，然后使用QuantiTect Reverse Transcription试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)逆转录成为cDNA。根据操作指南(BioRad)使用SYBR green qPCR master mix转录所得的cDNA来测量基因表达量的多少。使用iCycler热循环系统和iQ5光学系统软件(BioRad)对基因的表达进行实时检测。RT-PCR的实验采用常规方法进行用来检测基因表达的引物有：

IIL-1βF：5’-tgctgatgtaccagttgggg-3’，IL-1βR：5’-ctccatgagctttgtacaag-3’；

TNF-αF：5’-tgatcggtcccaacaagga-3’，TNF-αR：5’-tgcttggtggtttgctacga-3’。

结果：由图6可知，在创伤性脑损伤模型中，经过治疗脑损伤的小分子肽和治疗脑损伤的小分子肽脂质体的治疗，脑损伤部位的炎症因子表达水平明显降低。而且治疗脑损伤的小分子肽脂质体的治疗组的炎症因子降低程度比治疗脑损伤的小分子肽治疗组的降低程度要明显。

为了进一步利用体外实验验证本发明对神经细胞的保护以及对巨噬细胞的验证抑制作用，采用PC-12细胞(大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞系)体外损伤模型以及LPS诱导的巨噬细胞炎症模型验证。

P12细胞损伤模型实验

PC12细胞系为神经细胞系，购自上海细胞生物学研究所。细胞置于RPMI1640培养液中，内含体积分数为10％胎牛血清、常规细胞培养。实验时PC12细胞接种于96孔培养板，接种密度2×105/mL，每孔200μL。本试验共分为7 组，分别为空白细胞对照组、浓度为40nM的小分子多肽脂质体组(简称40nM)、双氧水组(1微克/毫升)、浓度为10nM的小分子多肽脂质体与双氧水(1微克/毫升)混合液组(简称双氧水+10nM)、浓度为20nM的小分子多肽脂质体与双氧水(1微克/毫升)混合液组(简称双氧水+20nM)、浓度为30nM的小分子多肽脂质体与双氧水(1微克/毫升)混合液组(简称双氧水+30nM)、浓度为40nM的小分子多肽与双氧水(1微克/毫升)混合液组(简称双氧水+40nM)，共计7组，每组3孔，试验重复3次。

预处理时加入不同浓度小分子多肽脂质体，使在培养液中的终浓度分别为10nM，20nM，30nM或40nM和细胞共孵育2h，预处理结束后加入100μmol/LH2O2作用24小时。实验采用CCK-8试剂盒(日本同仁)检测存活细胞，由酶标仪检测，结果用每孔OD值表示。观察不同浓度的EPO-肽对H2O2损伤的P12细胞生存的影响，结果用Prism5统计分析。

结果：由图7可知，单独含H2O2组的细胞数明显底于对照组细胞密度，说明H2O2可导致细胞死亡。而加入不同浓度的的本实验所用小分子多肽脂质体，可剂量依赖性地显著提高细胞的密度，说明本研究所用小分子多肽脂质体可抑制双氧水导致的神经细胞损伤。本实验在体外的条件下验证了，本研究中的小分子多肽脂质体，对细胞双氧水损伤模型的抑制作用。

脂多糖诱导的巨噬细胞验证模型

本试验共分为7组，分别为空白细胞对照组、浓度为40nM的小分子多肽脂质体组(简称40nM)、脂多糖组(1微克/毫升)(简称LPS)、浓度为10nM的小分子多肽脂质体与脂多糖(1微克/毫升)混合液组(简称10nM+LPS)、浓度为20nM的小分子多肽脂质体与脂多糖(1微克/毫升)混合液组(简称20nM+LPS)、浓度为30nM的小分子多肽脂质体与脂多糖(1微克/毫升)混合液组(简称30nM+LPS)、浓度为40nM的小分子多肽与脂多糖(1微克/毫升)混合液组(简称40nM+LPS)，共计7组，每组3孔，试验重复3次。

实验用小鼠巨噬细胞RAW细胞系购自上海细胞生物学研究所。细胞置于DMEM 培养液中，内含10％胎牛血清、常规细胞培养。实验时细胞接种于6孔培养板，接种密度2×10-6/mL。预处理时按划分的7个组别分别加入小分子多肽脂质体和/或脂多糖，与细胞共孵育2小时，预处理结束后加入1ug/ml的LPS作用4小时。使用Trizol试剂(invitrogen公司)提取总RNA，然后使用QuantiTect Reverse Transcription试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)逆转录成为cDNA。根据操作指南(BioRad)使用SYBR green qPCR master mix转录所得的cDNA来测量基因表达量的多少。使用iCycler热循环系统和iQ5光学系统软件(BioRad)对基因的表达进行实时检测。

结果：如图8所见，在本实验条件下，单独加入LPS可显著诱导巨噬细胞表达肿瘤坏死因子和诱导性一氧化氮合酶，说明单独LPS诱导了巨噬细胞的激活，呈现炎症状态。如图9所见，在加入不同浓度的本研究所用小分子多肽脂质体后，可以剂量依赖性地，显著抑制巨噬细胞肿瘤坏死因子和诱导性一氧化氮合酶的水平，说明小分子多肽脂质体可在体外抑制巨噬细胞的炎症激活。

本实验在体外条件下验证了本发明对巨噬细胞在脂多糖诱导的炎症模型中肿瘤坏死因子和诱导性一氧化氮合酶的分泌抑制作用。

通过上述实验，验证了本发明的小分子多肽脂质体在创伤性脑损伤模型中的良好效果，包括对动物行为的改善、对神经细胞凋亡的抑制、对炎症细胞的抑制、对炎症因子分泌的抑制，且小分子多肽脂质体的以上治疗效果要优于未制备成脂质体的如SEQ ID NO：1所示的小分子多肽的效果。我们还在体外培养的条件下本发明的验证了小分子多肽脂质体可剂量依赖性地产生神经细胞保护功能和炎症抑制功能。并且该小分子多肽脂质体连续注射不诱导机体促造血功能。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (10)

1.小分子多肽，其特征在于：小分子多肽为含有如SEQ ID N0：1所示的氨基酸序列的多肽。

2.含有权利要求1所述的小分子多肽的脂质体。

3.根据权利要求2所述的小分子多肽的脂质体，其特征在于：所述小分子多肽的脂质体中软磷脂、胆固醇及小分子多肽的质量比为50∶50∶1。

4.根据权利要求2所述的小分子多肽的脂质体，其特征在于：所述小分子多肽脂质体为溶液剂、凝胶剂、喷雾剂、混悬剂、乳剂或粉剂。

5.权利要求1所述的小分子多肽或权利要求2-4中任一项所述的小分子多肽的脂质体在制备治疗脑损伤药物中的运用。

6.根据权利要求5所述的运用，其特征在于：所述小分子多肽或小分子多肽脂质体在制备脑损伤的运功功能恢复的促进剂中的运用。

7.根据权利要求5所述的运用，其特征在于：所述小分子多肽或小分子多肽脂质体在制备脑损伤的感觉功能恢复的促进剂中的运用。

8.根据权利要求5所述的运用，其特征在于：所述小分子多肽或小分子多肽脂质体在制备巨噬细胞激活的抑制剂中的运用。

9.根据权利要求5所述的运用，其特征在于：所述小分子多肽或小分子多肽脂质体在制备神经细胞凋亡的抑制剂中的运用。

10.根据权利要求5所述的运用，其特征在于：所述小分子多肽或小分子多肽脂质体在制备脑损伤中炎症因子表达抑制剂中的运用。

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