CN105999228B

CN105999228B - 抑制神经元凋亡的小分子多肽的应用

Info

Publication number: CN105999228B
Application number: CN201610514235.1A
Authority: CN
Inventors: 柯开富; 沈爱国; 谢丽丽; 沈加兵
Original assignee: Nantong University
Current assignee: Nantong University
Priority date: 2016-06-30
Filing date: 2016-06-30
Publication date: 2019-05-21
Anticipated expiration: 2036-06-30
Also published as: CN105999228A

Abstract

本发明公开了抑制神经元凋亡的小分子多肽的应用。本发明通过对Glis2结构的改造与合成，制得如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的小分子多肽；同时建立脑出血大鼠模型，将合成的小分子多肽作为大鼠脑出血的治疗药物，以PBS为空白对照，以小分子多肽作为治疗治疗组，通过治疗脑出血，发现小分子多肽治疗后脑出血大鼠的运动能力恢复，肢体反射能力得到明显提高，巨噬细胞的激活数量及炎症因子的表达量得到明显抑制，凋亡神经组织细胞的数量降低。

Description

抑制神经元凋亡的小分子多肽的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体是抑制神经元凋亡的小分子多肽及的应用。

背景技术

脑出血(intracerebralhemorrhage，ICH)又称脑溢血，是指原发性非外伤性脑实质内出血，发病率为每年60-80/10万，在我国约占全部脑卒中的20％-30％，急性期病死率为30-40％。ICH病例中大约60％是因高血压合并小动脉硬化所致，约30％由动脉瘤或动-静脉血管畸形破裂所致，其他病因包括脑动脉粥样硬化、血液病、脑淀粉样血管病变、抗凝或溶栓治疗等。ICH在我国死亡率约为10.8％，成植物人状态的约为2.6％，严重致残率约为2.2％，中度致残率约为7.2％，严重危害人类生命和健康，也给家庭和社会带来沉重的经济负担。

目前对脑出血的治疗主要是内科保守治疗为主，主要采用甘露醇、利尿剂、甘油果糖等改善脑代谢，改善脑出血，积极防治并发症等措施，尚无突破性进展，尚无针对神经元凋亡的特效药物。然在实验研究中疗效明显，但在临床上还没有一种药物获得认可。因此急需研究开发脑出血治疗药物。

p75NTR是75kDa的一种单链跨膜糖蛋白，由1个信号肽、4个半胱氨酸富集区的胞外域、疏水的穿膜区以及1个富含碱性氨基酸的胞内域组成。早期认为，p75NTR可以与所有神经营养因子(NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5)结合参与神经细胞的生长、分化及存活过程。p75NTR也可以介导雪旺氏细胞、小脑浦肯野细胞、感觉神经元、运动神经元、交感神经元及海马神经元的凋亡过程。除了神经营养因子外，pro-NGF、Aβ、PrPs、RVG、NOGOR等都可以作为p75NTR的凋亡信号引发凋亡。在寡树突状细胞中，p75可以NADE(p75-associated cell deathexecutor)相互作用，引起胱天蛋白酶3的活化及核DNA的断裂，从而引起细胞凋亡。

近期研究表明，p75也可以与Krüpple-like锌指蛋白转录因子(Glis2)相互结合形成复合物，从而介导神经元的凋亡。Glis2是55.7kDa大小的Krüpple-like锌指蛋白转录因子家族成员，主要定位于16p13.3染色体。它包含5个串联的C2-H2锌指结构，也包含有一个转录激活区和两个转录抑制区。Glis2在机体的脑、肾、输尿管、肝脏、心等多种组织器官中表达。在结肠癌细胞中，Glis2的第一个Cys2-His2结构可以和β-catenin结合，结合的复合物入核后，通过Glis2的转录调控可以限制细胞周期蛋白Cyclin D1的活性。Glis2的缺失可以导致Bfar、Bcl2、Bok、Bbc3、Cidec、Casp11等大量凋亡相关基因表达的明显改变，最终导致肾脏的萎缩和纤维化的发生。ICH后，Glis2表达增高并参与caspase-3途径引起的神经元凋亡过程。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种抑制神经元凋亡的小分子多肽的应用，具有抑制神经元凋亡的作用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

小分子多肽在制备治疗脑出血药物中的应用；所述的小分子多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

小分子多肽在制备脑出血运动功能恢复的促进剂中的应用；所述的小分子多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

小分子多肽在制备脑出血的感觉功能恢复的促进剂中的应用；所述的小分子多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

小分子多肽在制备神经细胞凋亡的抑制剂中的应用；所述的小分子多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

小分子多肽在制备脑损伤中炎症因子表达抑制剂中的应用；所述的小分子多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明通过对Glis2结构的改造与合成，制得如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的小分子多肽；同时建立脑出血大鼠模型，将合成的小分子多肽作为大鼠脑出血的治疗药物，以PBS为空白对照，以小分子多肽作为治疗治疗组，通过治疗脑出血，发现小分子多肽治疗后脑出血大鼠的运动能力恢复，肢体反射能力得到明显提高，巨噬细胞的激活数量及炎症因子的表达量得到明显抑制，凋亡神经组织细胞的数量降低。

有益效果：与现有技术相比，本发明通过如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列小分子多肽的治疗，与PBS空白对照治疗组比较：脑出血大鼠的运动功能和感觉功能得到明显改善；脑出血大鼠脑组织凋亡神经细胞数目显著降低、存活神经细胞数目显著增加；同时如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列小分子多肽在体外细胞实验，可以抑制神经细胞的凋亡和抑制巨噬细胞的炎症激活。

附图说明

图1是脑出血治疗行为学评分结果分析图；

图2是神经元细胞数量分析图；A.Control，B.转染Flag，C.转染Flag-p75death，D.转染Flag-p75ICD，E.转染Flag-p75；

图3是血红素损伤模型中PC-12细胞生存量分析图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。

实施例1小分子多肽的制备

小分子多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。小分子多肽合成在ABI 431A型固相多肽合成仪(美国PE公司)上进行。方法采用标准芴甲氧羰基(Fmoc)方案，精氨酸采用两次偶联。起始选用0.125mmol对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂(HMP树脂)，按照多肽序列使肽链从羧基端逐个向氨基端延伸，每种氨基酸的用量为0.5mmol，与树脂的摩尔比为4∶1.各种氨基酸的α-氨基酸为Fmoc保护，其余侧链保护基团为：Ser(tBu)、Glu(OtBu)、Arg(Pmc)。第一个氨基酸连接到树脂上用4-二甲基吡啶，氨基酸活化用1-羟基苯并三唑和二环乙基碳，偶联后用体积分数为20％的哌啶水溶液去除Fmoc保护基。多肽粗品合成后，将树脂-粗肽在冰冷浴条件下混合于10ml切割液A(由结晶苯酚0.75g、1，2-乙二硫醇0.25mL、苯甲硫醚0.5mL、去离子水0.25mL和三氟乙酸10mL组成)中，待切割液温度上升至室温后，搅拌2小时，使肽链从树脂上裂解下来，同时去除多种保护基团，将反应混合液经G4玻砂漏斗过滤后以除去树脂，先后用1mL三氟乙酸，10mL二氯甲烷反复冲洗反应瓶，树脂和漏斗。将滤液在常温低压下蒸发至1-2mL，加入50mL预冷乙醚蒸发小分子多肽粗品，-20°保存备用。

将小分子多肽粗品用二甲基亚砜溶解成浓度为20mg/mL的溶液，经孔径为0.45um的绿孔滤膜过滤后，在AKTA explorer 100型中压液相色谱仪(瑞典amerssambioscience)上用SOURCE凝胶柱上纯化。流动相A有体积百分比为10％的乙醇和体积百分含量为0.1％三氟乙酸组成，流动相B由体积百分含量为90％的乙醇和体积百分含量为0.1％三氟乙酸组成。先用流动相A 1.5个柱体积洗脱，再用流动相A和流动相B的混合液。(流动相B占混合液的体积分数在8个柱体积内由0％逐渐增加至80％)洗脱，再用流动相A和流动相B的混合液(流动相B占混合液的体积分数在0.5个柱体积内由0％逐渐增加至80％)洗脱，在主峰处收集多肽溶液，冷却干燥，即得小分子多肽纯品，用二甲基亚砜溶解，-20°保存备用。将小分子多肽纯品用Delta 600型高压液相色谱仪(美国waters公司)鉴定纯度，采用symmetryshield C18柱，流动相由体积百分含量为10％到60％的乙和体积百分含量为0.1％的三氟乙酸组成，梯度洗脱，流速为1ml/min。结果显示，合成多肽的纯度达到90％以上。同时，将小分子多肽纯品用API2000LC/MS型电喷雾离子化质谱仪测定分子量。结果显示，合成的小分子多肽的分子量与理论值相符。

实施例2小分子多肽在用于治疗大鼠脑出血中的运用

1、动物：雄性SD大鼠，体重250-300克，购于南通大学动物实验室，正常饲养于清洁动物房。

2、药物：小分子多肽治疗组：给予如SEQ ID NO.1所示的小分子多肽20nmol/kg体重进行腹腔注射，共计6只；空白组：给予与治疗组等体积的PBS进行腹腔注射，共计6只。

3、实验方法：脑内注入自体血是脑出血常用动物建模方法，本实验用于验证多肽小分子对脑出血的治疗作用。脑内注入自体血方法，具体为：①给予大鼠(240-260g)10％水合氯醛进行腹腔麻醉(3ml/Kg)；②立体定位仪固定老鼠，用75％酒精对头部进行消毒，暴露颅骨；③用立体定位仪定位老鼠右侧尾状核(以前囟门为正中点，向前0.2mm，旁开3.5mm，进针深度5.5mm)以10μL/min的速度注入50μL自体血或等量生理盐水。④留针10min后缝合伤口，酒精消毒术后及时止血，加强保暖、预防感染等护理。

手术后立即经腹腔给大鼠分别给空白组大鼠注射PBS，小分子多肽组大鼠注射小分子多肽，随后每24小时注射一次，共注射7次。

神经行为学评分：大鼠分别在损伤前进行一次神经行为学评分，然后在损伤的第7天评分一次，每组大鼠数量为6只。采用双盲法，评分者经过培训，以保证对标准的正确把握，评分者对实验分组情况未知。评分内容涵盖运动、感觉和反射，最高分为10分，正常大鼠接近0分。8～10分为严重损伤，4～7分为中度损伤，1～3分为轻度损伤。评分标准如下：

神经行为学评分的运动试验：

提起大鼠尾巴：前肢屈曲，1分；后肢屈曲，1分；头向健侧屈曲＞10度，持续30秒，1分。

将大鼠放于地板上(最低＝0，最高＝3)：正常行走，0分；不能走直线，1分；向手术侧转圈，2分；向手术侧倾倒，3分。

肢体反射与不自主运动：耳廓反射，1分；角膜反射，1分；惊跳反射，1分；癫痈，肌阵挛或肌张力障碍，1分。

脑出血大鼠治疗行为学评分结果如图1所示，可见经小分子多肽脂质体治SEQ IDNO.1所示的小分子多肽治疗的脑出血大鼠神经行为学评分明显低于PBS对照治疗的在脑外伤大鼠，表明如SEQ IDNO：1所示的小分子多肽均能显著改善创伤性脑损伤后大鼠的运动和感觉功能，具有治疗保护作用(*表示P小于0.05)。

4、Fluoro-JadeB染色，检测凋亡神经细胞

Fluoro-JadeB是一种多阴离子荧光素衍生物，对变性神经元具有很高的亲和力，可以选择性地标记变性死亡的神经元。取前白后3.SOmm和4.3Om的切片，在0.05M磷酸缓冲液(Phosphatebuffer，PB)中铺于1％明胶化的载玻片上，空气中风干过夜。系列酒精脱水，0.06％高锰酸钾溶液中浸泡15分钟，双蒸水中漂洗2分钟，在0.0006％Fluoro一JadeB染色液(含0.1％醋酸)中孵育30分钟，双蒸水中漂洗3分钟，空气风干，二甲苯透明，DPX封固剂封片。在紫外下使用异硫氰酸荧光素滤片(fluoreseinisothioeyanate，FITC)观察Fluoro-JadeB染色细胞。变性神经元在背景的衬托下发亮荧光。使用stereologer软件进行细胞计数。

结果如图2所示，小分子多肽脂质体治疗组死亡神经元数量约为90个/mm²，小分子多肽治疗组死亡神经元数量约为120个/mm²，而空白组则高达300个/mm²，空白组被激活的巨噬细胞数量明显高于治疗组，小分子多肽使死亡神经元数量明显减少。

5、结晶紫染色(Cresylvioletacetatestain)检测存活神经细胞数目

在ICH后第15天，收集组织并切片。取前自后2.80mm至前囱后4.80mm的切片(Figurell)经脱水、脱脂、再水化、染色、分化及脱水，最后封片。简言之，将组织切片在0.05M PB中铺于1％明胶化的载玻片上，空气中风干过夜。系列酒精脱水-50％酒精(2min)，70％酒精(2min)，95％酒精一I(2min)，95％酒精一II(2min)，100％酒精一I(2min)，100％酒精一II(2min)。脱脂-二甲苯一I(smin)，二甲苯一II(10min)，二甲苯一I(1min)。再水化-100％酒精一II(1min)，100％酒精一I(1min)，95％酒精一II(1min)，95％酒精一I(1min)，70％酒精(1min)。双蒸水漂洗1min，在结晶紫染液中孵育5min，双蒸水漂洗30秒。分化-95％酒精(含醋酸)(6min)。脱水-95％酒精一I(30秒)，95％酒精一II(30秒)，100％酒精一I(30秒)，100％酒精一II(30秒)。上述酒精浓度均以体积浓度计。二甲苯透明，中性树胶封片。在光镜下使用stereologer软件进行细胞计数。

结果由图2可知，空白组的存活神经元细胞数量为4000/mm²，小分子多肽治疗组的存活神经元细胞数量为90000/mm²，可见治小分子多肽明显增加了存活的神经元数量。

实施例3

为了进一步利用体外实验验证本发明对神经细胞的保护以及对巨噬细胞的验证抑制作用，采用PC-12细胞(大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞系)体外损伤模型以及LPS诱导的巨噬细胞炎症模型验证。

P12细胞损伤模型实验：PC12细胞系为神经细胞系，购自上海细胞生物学研究所。细胞置于RPMI1640培养液中，内含体积分数为10％胎牛血清、常规细胞培养。实验时PC12细胞接种于96孔培养板，接种密度2×10⁵/mL，每孔200μL。本试验共分为7组，分别为空白细胞对照组、浓度为40nM的小分子多肽脂质体组(简称40nM)、双氧水组(1μg/mL)、浓度为10nM的小分子多肽脂质体与双氧水(1μg/mL)混合液组(简称双氧水+10nM)、浓度为20nM的小分子多肽脂质体与双氧水(1μg/mL)混合液组(简称双氧水+20nM)、浓度为30nM的小分子多肽脂质体与双氧水(1μg/mL)混合液组(简称双氧水+30nM)、浓度为40nM的小分子多肽与双氧水(1μg/mL)混合液组(简称双氧水+40nM)，共计7组，每组3孔，试验重复3次。

预处理时加入不同浓度小分子多肽脂质体，使在培养液中的终浓度分别为10nM，20nM，30nM或40nM和细胞共孵育2h，预处理结束后加入100μmol/L血红素作用24小时。实验采用CCK-8试剂盒(日本同仁)检测存活细胞，由酶标仪检测，结果用每孔OD值表示。观察不同浓度的EPO-肽对血红素刺激后的P12细胞生存的影响，结果用Prism5统计分析。

结果由图3可知，单独含血红素组的细胞数明显底于对照组细胞密度，说明血红素刺激可导致细胞死亡。而加入不同浓度的的本实验所用小分子多肽脂质体，可剂量依赖性地显著提高细胞的密度，说明本研究所用小分子多肽脂质体可抑制血红素导致的神经细胞损伤。本实验在体外的条件下验证了，本研究中的小分子多肽脂质体，对细胞血红素损伤模型的抑制作用。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其做出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims

1.小分子多肽在制备治疗脑出血药物中的应用；所述的小分子多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.小分子多肽在制备脑出血运动功能恢复的促进剂中的应用；所述的小分子多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.小分子多肽在制备脑出血的感觉功能恢复的促进剂中的应用；所述的小分子多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.小分子多肽在制备神经细胞凋亡的抑制剂中的应用；所述的小分子多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。