CN101837122A - 一种抑制肿瘤血管新生的基因工程复合肽疫苗及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抑制肿瘤血管新生的基因工程复合肽疫苗及其应用。本发明所述的抑制肿瘤血管新生的基因工程复合肽疫苗全长为276个氨基酸，其中第1～165位来源于载体pET32a的序列，第166～177位和第183～195位分别源于VEGF蛋白的第125～136位和第105～117位；第201～212位源于噬菌体多肽库，其具有与VEGF抗原结合的能力；第224～235位、第241～254位和第260～276位分别源于bFGF蛋白的第75～86位、第34～47位和第97～113位。本发明抑瘤率为70.2％，可应用于制备预防和治疗恶性肿瘤的药物。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域和医学领域，特别涉及一种抑制肿瘤血管新生的基因工程复合肽疫苗及其应用。
背景技术
肿瘤是一类严重威胁人类健康并且死亡率非常高的疾病，据中国肿瘤防治数据库统计，在我国恶性肿瘤已成为仅次于呼吸系统疾病的居民第二大死因，每年约有130万人死于癌症，并且恶性肿瘤死亡率有明显的上升趋势，对国民经济、人民健康等产生严重影响。因此研究抑制肿瘤发生的疫苗对于预防和治疗肿瘤具有重大意义。
肿瘤生长依赖于血管新生，bFGF和VEGF是促进肿瘤血管生长作用最强的两种关键因子，是诱导血管生成的主要调节因素。在纤维组织瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、神经细胞瘤、垂体肿瘤、脑膜瘤等的研究均证明了bFGF和VEGF二者对肿瘤的生长和高密度血管化有促进作用。
VEGF和bFGF在新血管发生中具有协同作用，同时针对VEGF和bFGF的抑制剂和受体阻断剂在肿瘤的治疗中将具有重要作用。Goto(Goto F，Goto K，Weindel K，et al.Synergistic effects of vascular endothelial growth-factor and basicfibroblast growth-factor on the proliferation and cord formation of bovine capillaryendothelial-cells within collagen gels[J].Laboratory Investigation.1993，69(5)：508-517.)等研究发现在体外胶原胶模型中bFGF和VEGF协同作用促进牛毛细血管内皮细胞增长和结节形成；Asahara(Asahara T，Bauters C，Zheng L P，et al.Synergistic effect of vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growthfactor on angiogenesis in vivo[J].Circulation.1995，92(9SUPPL.)：I365-I371.)等在动物后肢缺血模型中发现bFGF和VEGF具有协同促进血管新生的作用。Kano等就bFGF和VEGF在血管新生中的协同机制进行研究，发现VEGF具有促进内皮细胞增殖的作用，bFGF可以促进壁细胞增殖，VEGF促进内皮细胞分泌细胞因子PDGF-BB增加，而bFGF促进壁细胞分泌PDGFRβ受体增加，VEGF和bFGF协同作用，启动PDGF-BB-PDGFRβ信号通路，使增殖的血管形成成熟的血管系统，促进肿瘤的生长和转移。因此，抑制bFGF或者VEGF信号通路，或者用其抗体阻断bFGF、VEGF与其受体的结合均可抑制肿瘤血管新生。因此，开发同时抑制VEGF、bFGF作用的抑制剂或者受体阻断剂是一个更为完善和全面的抗肿瘤策略。
在国外，围绕抑制VEGF和bFGF开发肿瘤治疗药物的研究广泛开展，其中有些已经进入临床应用，例如VEGF抗体、内皮细胞抑素等，但由于肿瘤的生长常受到VEGF和bFGF的双重作用，bFGF和VEGF二者在新血管发生中具有协同作用，bFGF可通过胞内及胞外机制上调VEGF的表达，少量的bFGF能够使VEGF的作用增加2～3倍。此外，bFGF还通过VEGF以外的其它机制起作用，因此，用抗体不能完全中和这些因子的作用。由于肿瘤生长形成的血管内皮细胞大量表达VEGF和bFGF受体，因此，阻断VEGF、bFGF与相应的受体结合，可更有效抑制肿瘤血管新生，从而有效抑制肿瘤生长和转移。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种有效的抑制肿瘤血管新生的基因工程复合肽疫苗。该基因工程复合肽疫苗由具有免疫原性的bFGF和VEGF表位肽段通过柔性Linker串联。
本发明的另一目的在于提供所述基因工程复合肽疫苗的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种有效的抑制肿瘤血管新生的基因工程复合肽疫苗，其氨基酸序列如下所示：
MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDD
其中，第1～165位来源于载体pET32a的序列；
第166～177位为肽段I，来自VEGF蛋白的第125～136位；
第183～195位为肽段II，来自VEGF蛋白的第105～117位；
第201～212位为肽段III，来源于噬菌体多肽库，其具有与VEGF抗原结合的能力；
第224～235位为肽段IV，来自bFGF蛋白的第75～86位；
第241～254位为肽段V，来自bFGF蛋白的第34～47位；
第260～276位为肽段VI，来自bFGF蛋白的第97～113位；
肽段I、II和III之间分别通过氨基酸序列GGGGS依次连接，肽段IV、V和VI之间分别通过氨基酸序列GGGGS依次连接，即GGGGS分别位于第178～182位、第196～200位、第236～240位和第255～259位；
肽段III和肽段IV之间通过氨基酸序列GGGGSCGGGGS连接，即其位于第213～223位；
所述基因工程复合肽疫苗的编码核苷酸序列如下所示：
ATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCGGACGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCCCCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCGGTTCTGGTTCTGGCCATATGCACCATCATCATCATCATTCTTCTGGTCTGGTGCCACGCGGTTCTGGTATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGATCTGGGTACCGACGACGACGACAAGGCCATGGCTGATATCGGATCCCAGAAACGTAAACGTAAGAAATCCCGTTACAAATCCGGTGGCGGTGGCTCGCGTCCGAAGAAAGACCGTGCTCGTCAGGAAAAGAAATCCGGTGGCGGTGGCTCGGTTGCTTCCGCTGTTTTCTACTCCGCTCTGGTTGAAGGTGGCGGTGGCTCGTGCGGCGGTGGTGGTTCTGCTATGAAAGAAGACGGTCGTCTGCTGGCTTCCAAAGGTGGCGGTGGCTCGATCCACCCGGACGGTCGTGTTGACGGTGTTCGTGAAAAATCCGGTGGCGGTGGCTCGCGTCTGGAATCCAACAACTACAACACCTACCGTTCCCGTAAATACACCTCC
所述的基因工程复合肽疫苗应用于肿瘤生物药物领域，用于制备预防和治疗恶性肿瘤的药物。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：现有的抑制血管生成的药物多为单一的抑制一种细胞因子的作用，如贝伐单抗等，而本发明的基因工程复合多肽具有同时抑制bFGF和VEGF两种细胞因子的作用，能有效抑制肿瘤的生长，抑瘤率为70.2％。
附图说明
图1是本发明的制备流程图。
图2是通过重叠延伸PCR制备本发明VBP3序列的示意图。
图3是pMD-18T-VBP3的酶切鉴定电泳图和PCR鉴定电泳图，其中：
泳道M为Marker3000，泳道1和2为阳性对照，泳道3为PMD-18-VBP3质粒，泳道4为PMD18-T-VBP3的PCR产物，泳道5为PMD18-T-VBP3质粒的BamH I、HindIII双酶切产物。
图4是pET32a-VBP3的酶切鉴定电泳图和PCR鉴定电泳图，其中：
泳道M为Marker3000，泳道1为pET32a-VBP3质粒，泳道2为pET32a-VBP3质粒的BamH I和HindIII酶切产物，泳道3为pET32a-VBP3的PCR产物。
图5是将pET32a-VBP3转化ER2566大肠杆菌后的表达产物的SDS-PAGE图，其中：
泳道M为低分子量蛋白Marker，泳道1为空质粒pET32a转化菌诱导后的表达产物，泳道2为pET32a-VBP3转化菌未进行诱导的表达产物，泳道3为pET32a-VBP3转化菌诱导后的表达产物。
图6是将pET32a-VBP3转化ER2566大肠杆菌后的表达产物的Western Blot图，其中：
泳道1为pET32a转化菌诱导后的表达产物，泳道2为pET32a-VBP3转化菌诱导后的表达产物。
图7是pET32a-VBP3-ER2566工程菌在发酵条件下的生长曲线图。
图8是pET32a-VBP3-ER2566工程菌在不同诱导时间的表达产物的SDS-PAGE图，其中：
泳道M为低分子量蛋白标准，泳道1为诱导前的取样，泳道2～9为用IPTG分别诱导0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h和4h的取样。
图9是pET32a-VBP3-ER2566工程菌发酵产物纯化后的SDS-PAGE图，其中：
泳道M为低分子量蛋白标准，泳道1为pET32a-VBP3-ER2566工程菌的培养上清，泳道2为纯化后得到的基因工程复合肽疫苗。
图10是本发明的基因工程复合肽疫苗免疫小鼠血清的抗bFGF抗体的滴度曲线图。
图11是本发明的基因工程复合肽疫苗免疫小鼠血清的抗VEGF抗体的滴度曲线图。
图12是本发明的基因工程复合肽疫苗的抑制肿瘤曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本发明制备的基因工程复合肽疫苗的制备过程如图1所示：
(1)制备含有具有VFGF免疫源性表位和bFGF免疫源性表位的肽段核苷酸序列
①根据计算机模拟、生物信息学方法等对VFGF免疫源性表位和bFGF免疫源性表位进行选择和排序，设计的肽段的核苷酸序列如下：
CAGAAACGTAAACGTAAGAAATCCCGTTACAAATCCGGTGGCGGTGGCTCGCGTCCGAAGAAAGACCGTGCTCGTCAGGAAAAGAAATCCGGTGGCGGTGGCTCGGTTGCTTCCGCTGTTTTCTACTCCGCTCTGGTTGAAGGTGGCGGTGGCTCGTGCGGCGGTGGTGGTTCTGCTATGAAAGAAGACGGTCGTCTGCTGGCTTCCAAAGGTGGCGGTGGCTCGATCCACCCGGACGGTCGTGTTGACGGTGTTCGTGAAAAATCCGGTGGCGGTGGCTCGCGTCTGGAATCCAACAACTACAACACCTACCGTTCCCGTAAATACACCTCC
根据此核苷酸序列设计10条寡核苷酸链如表1所示
表1：引物序列表(均为5’端到3’端)
| 引物A | GGATCCCAGAAACGTAAACGTAAGAAATCCCGTTACAAATCCGG下划线部分为BamH I位点 |
| 引物B | CCCGTTACAAATCCGGTGGCGGTGGCTCGCGTCCGAAGAAAGACCGTGCTCGTCAGGAA |
| 引物C | ACAGCGGAAGCAACCGAGCCACCGCCACCGGATTTCTTTTCCTGACGAGCACGGT |
| 引物D | TCGGTTGCTTCCGCTGTTTTCTACTCCGCTCTGGTTGAAGGTGGC |
| 引物E | GCTCTGGTTGAAGGTGGCGGTGGCTCGTGCGGCGGTGGTGGTTCTGCTATGAAAGAAGA |
| 引物F | ACCTTTGGAAGCCAGCAGACGACCGTCTTCTTTCATAGCAGA |
| 引物G | TGCTGGCTTCCAAAGGTGGCGGTGGCTCGATCCACCCGGACGGTCGTGTTGACGGTGTT |
| 引物H | GTCGTGTTGACGGTGTTCGTGAAAAATCCGGTGGCGGTGGCTCGCGTCTGGAATCCAAC |
| 引物I | GGAGGTGTATTTACGGGAACGGTAGGTGTTGTAGTTGTTGGATTCCAGACGCGA |
| 引物A | GGATCCCAGAAACGTAAACGTAAGAAATCCCGTTACAAATCCGG下划线部分为BamH I位点 |
| 引物J | CCAAGCTTAGGAGGTGTATTTACGGGAA阴影部分为HindIII位点 |
②通过重叠延伸PCR得到步骤①所述的核苷酸序列
步骤①所述核苷酸序列的合成如照图2所示：
第一轮SOE PCR，PCR反应体系如下：
PCR条件为：94℃ 5min，55℃ 5min，72℃ 5min，7个循环；72℃ 10min。第一轮PCR得到的序列K、L和M。
第二轮SOE PCR，反应体系如下：
反应条件为：94℃ 5min；94℃ 40s，53℃ 35s，72℃ 40s，30个循环；72℃ 10min。扩增获得的片段命名为N。
第三轮SOE PCR，PCR体系如下：
PCR条件为：94℃ 5min；94℃ 40s，53℃ 35s，72℃ 40s，30个循环；72℃ 10min。PCR扩增得到O：
第四轮SOE PCR，PCR体系如下：
PCR扩增条件为：94℃ 5min；94℃ 40s，53℃ 35s，72℃ 40s，30个循环；72℃ 10min。扩增得到多肽寡核苷酸序列，命名为VBP3。
(2)多肽寡核苷酸序列的正确性鉴定
①将PCR得到的多肽寡核苷酸序列VBP3克隆入pMD-18T载体(购自Takara公司)，进行酶切和PCR鉴定。
酶切按照下表的程序进行：
| 试剂 | 体积 |
| pMD-18T-VBP3质粒 | 2μl |
| BamH I | 1μl |
| HindIII | 1μl |
| Buffer K | 2μl |
| BSA | 2μl |
| H2O | 10μl |
37℃酶切过夜后，2％琼脂糖电泳鉴定酶切情况。
PCR鉴定按照下面程序进行：
| 试剂 | 体移 |
| pMD-18T-VBP3质粒 | 1μl |
| Tag酶 | 0.3μ |
| 10×PCR buffer | 5μl |
| 试剂 | 体移 |
| dNTP | 4μl |
| 引物A | 2μl |
| 引物J | 2μl |
| ddH2O | 36μl |
反应条件为：94℃ 5min；94℃ 40s，55℃ 35s，72℃ 40s，30个循环；72℃ 10min。PCR后，电泳鉴定酶切情况。酶切和PCR鉴定的电泳结果如图3所示。
②测序鉴定的正确性
将酶切和PCR鉴定正确的含有多肽寡核苷酸序列pMD-18T-VBP3质粒送北京奥科生物有限公司测序。测序结果表明得到的VBP3序列是正确的。
(3)表达系统的建立
①pET32a-VBP3原核表达载体的构建
将测序正确的pMD-18T-VBP3质粒以及pET32a原核表达载体(购自Novagen公司)分别进行BamH I、HindIII双酶切，胶回收目的片段，并进行连接，连接方法按照下面程序进行：
| 质粒BamH I、HindIII双酶切产物 | 10μl |
| PET32a质粒BamH I、HindIII双酶切产物 | 5ul |
| Ligase buffer | 2.5μ |
| Ligase | 1μl |
| H2O | 7μl |
25℃连接过夜。
②PCR、酶切鉴定pET32a-VBP3质粒
将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布氨卞培养基平板，长出单菌落后，挑取单菌落，提取质粒，酶切和PCR鉴定。PCR体系如下：
| 试剂 | 体积 |
| VBP3质粒 | 1μl |
| 试剂 | 体积 |
| A | 1μl |
| J | 1μl |
| rTag酶 | 0.5μl |
| dNTP | 4μl |
| 10×PCR buffe | 5μl |
| ddH2O | 38μ |
PCR条件为：
94℃ 5min【94℃ 40s 56℃ 35s 72℃ 40s】30循环72℃ 10min。
酶切鉴定pET32a-VBP3质粒，酶切体系如下：
37℃酶切过夜1％琼脂糖电泳鉴定，结果如图4所示。
(4)表达产物的表达与发酵
①表达产物的有效表达
将鉴定正确的质粒转化ER2566大肠杆菌表达菌株(购自NEB公司)，鉴定正确后进行表达，表达菌按照1％的量接种5mL LB培养基，37℃培养2h，1mM/LIPTG诱导4小时，取菌液1mL，离心收集菌体，加入60μl ddH2O，60μl 2×上样缓冲液，沸水浴10min，离心取上清进行以SDS-PAGE电泳，空载体对照菌的菌液和未加IPTG诱导的菌液作为对照，SDS-PAGE电泳方法鉴定基因工程复合肽疫苗的表达，电泳图如图5所示。将电泳结果进行western blot鉴定，其结果如图6所示。得到pET32a-VBP3-ER2566工程菌。
②M9培养基发酵pET32a-VBP3-ER2566工程菌
pET32a-VBP3-ER2566工程菌在活化后加入5L发酵罐中发酵，其中所使用的M9培养基可参考《突变型人肿瘤坏死因子2α工程菌发酵培养的实验研究》西安交通大学学报(医学版)，2003，24(3)：211-214；37℃扩增菌体3h，OD600达到1.7，温度降低到28℃，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导，控制pH7.0，溶氧量大于30％，连续发酵4.5小时，菌体生长曲线见图7，SDS-PAGE电泳图如图8所示。
(5)抑制肿瘤血管新生的基因工程复合肽疫苗的纯化
①pET32a-VBP3-ER2566工程菌菌体的收集
将发酵菌液5000rpm离心5min收集菌体沉淀，0.1M PBS洗涤两次称量湿菌菌重，并于-20℃冻存。
②bpET32a-VBP3-ER2566工程菌菌体超声破碎
设置MISONIX超声乳化仪的振幅为50，超声时间为5S，间隔时间为10s，总共超声时间为20min，超声温度上限为30℃。冰浴超声。
③pET32a-VBP3-ER2566工程菌菌体破碎上清的纯化
将pET32a-VBP3-ER2566工程菌发酵产物破碎上清最大离心力离心30min，0.45μm滤膜过滤，上清上样于80mM咪唑PBS缓冲液平衡的Ni-NTA亲和层析柱，上样速度为0.5mL/min，以80mM咪唑PBS缓冲液洗涤至基线，再用130mM咪唑PBS缓冲液洗涤杂蛋白峰，洗涤至OD280值不再降低，洗涤速度为1.5mL/min，最后用500mM咪唑PBS缓冲液洗脱目的蛋白，脱盐，就是纯化的抑制肿瘤血管新生的基因工程复合肽疫苗，SDS-PAGE图如图9所示。
(6)抑制肿瘤血管新生的基因工程复合肽疫苗的效果检测
①抑制肿瘤血管新生的基因工程复合肽疫苗免疫C57BL/6J小鼠
将纯化的bFGF、VEGF复合肽免疫小鼠，初次免疫按照100ug/只/次，将复合肽与弗氏完全佐剂1∶1比例完全乳化后，皮下多点注射，间隔三周后，第二次免疫，100ug/只，将复合肽与弗氏不完全佐剂混合乳化后免疫小鼠，皮下多点注射，间隔三周后第三次免疫，方法同第二次免疫，第三次免疫后七天，小鼠断尾取血，测定抗bFGF、抗VEGF抗体的滴度。
A、ELISA法测定抗bFGF抗体的滴度
bFGF包被ELISA板，50ng/孔，4℃包被过夜，质量分数5％的脱脂乳37℃封闭2h，加系列稀释的小鼠抗血清，37℃孵育1h，用PBS-T洗涤3次，加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗(1∶6000)孵育30min。用PBS-T洗涤5次，TMB避光显色10min，2mol/L硫酸终止显色，酶标仪490nm测定A值，结果如图10所示，这说明了本发明的基因工程复合肽疫苗bFGF表位具有免疫原性，可在体内引起抗体反应，中和bFGF的促血管生成作用。
B、ELISA法测定抗VEGF抗体的滴度
VEGF包被ELISA板，50ng/孔，4℃包被过夜，质量分数5％的脱脂乳37℃封闭2h，加系列稀释的小鼠抗血清，37℃孵育1h，用PBS-T洗涤3次，加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗(1∶6000)孵育30min。用PBS-T洗涤5次，TMB避光显色10min，2mol/L硫酸终止显色，酶标仪490nm测定A值，结果如图11所示，这说明了本发明的基因工程复合肽疫苗VEGF表位具有免疫原性，在体内引起抗VEGF反应，中和VEGF的促进肿瘤生长的作用。
C、B16黑色素瘤细胞接种免疫小鼠
第三次免疫后10天，将处于指数增长期的B16黑色素瘤细胞，每只1×105皮下接种于有后肢外侧，10天后PBS组有可触及肿瘤，隔天测量肿瘤体积，计算公式为V＝π/6(a×b2)作出肿瘤生长曲线，计算抑瘤率为70.2％，结果如图12所示，这说明了本发明的基因工程复合肽疫苗可以显著抑制肿瘤的生长。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110>暨南大学
<120>一种抑制肿瘤血管新生的基因工程复合肽疫苗及其应用
<130>1
<160>13
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>276
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>基因工程复合肽疫苗的氨基酸序列
<400>1
Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp
1 5 10 15
Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp
20 25 30
Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp
35 40 45
Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn
50 55 60
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu
65 70 75 80
Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser
85 90 95
Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly
100 105 110
Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
115 120 125
Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln
130 135 140
His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met
145 150 155 160
Ala Asp Ile Gly Ser Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr Lys
165 170 175
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu
180 185 190
Lys Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Ala Ser Ala Val Phe Tyr Ser
195 200 205
Ala Leu Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Ala
210 215 220
Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg
260 265 270
Lys Tyr Thr Ser
275
<210>2
<211>828
<212>DNA
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<220>
<223>基因工程复合肽疫苗的核苷酸序列
<400>2
atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60
gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120
ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180
atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240
ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300
aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360
catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420
ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg 480
gctgatatcg gatcccagaa acgtaaacgt aagaaatccc gttacaaatc cggtggcggt 540
ggctcgcgtc cgaagaaaga ccgtgctcgt caggaaaaga aatccggtgg cggtggctcg 600
gttgcttccg ctgttttcta ctccgctctg gttgaaggtg gcggtggctc gtgcggcggt 660
ggtggttctg ctatgaaaga agacggtcgt ctgctggctt ccaaaggtgg cggtggctcg 720
atccacccgg acggtcgtgt tgacggtgtt cgtgaaaaat ccggtggcgg tggctcgcgt 780
ctggaatcca acaactacaa cacctaccgt tcccgtaaat acacctcc 828
<210>3
<211>333
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>设计的肽段的核苷酸序列
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cagaaacgta aacgtaagaa atcccgttac aaatccggtg gcggtggctc gcgtccgaag 60
aaagaccgtg ctcgtcagga aaagaaatcc ggtggcggtg gctcggttgc ttccgctgtt 120
ttctactccg ctctggttga aggtggcggt ggctcgtgcg gcggtggtgg ttctgctatg 180
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tacaacacct accgttcccg taaatacacc tcc 333
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<211>44
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物A
<400>4
ggatcccaga aacgtaaacg taagaaatcc cgttacaaat ccgg 44
<210>5
<211>59
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物B
<400>5
cccgttacaa atccggtggc ggtggctcgc gtccgaagaa agaccgtgct cgtcaggaa 59
<210>6
<211>55
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物C
<400>6
acagcggaag caaccgagcc accgccaccg gatttctttt cctgacgagc acggt 55
<210>7
<211>45
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物D
<400>7
tcggttgctt ccgctgtttt ctactccgct ctggttgaag gtggc 45
<210>8
<211>59
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物E
<400>8
gctctggttg aaggtggcgg tggctcgtgc ggcggtggtg gttctgctat gaaagaaga 59
<210>9
<211>42
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物F
<400>9
acctttggaa gccagcagac gaccgtcttc tttcatagca ga 42
<210>10
<211>59
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物G
<400>10
tgctggcttc caaaggtggc ggtggctcga tccacccgga cggtcgtgtt gacggtgtt 59
<210>11
<211>59
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物H
<400>11
gtcgtgttga cggtgttcgt gaaaaatccg gtggcggtgg ctcgcgtctg gaatccaac 59
<210>12
<211>54
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物I
<400>12
ggaggtgtat ttacgggaac ggtaggtgtt gtagttgttg gattccagac gcga 54
<210>13
<211>28
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物J
<400>13
ccaagcttag gaggtgtatt tacgggaa 28
Claims (3)
1.一种有效的抑制肿瘤血管新生的基因工程复合肽疫苗，其特征在于：所述基因工程复合肽疫苗的氨基酸序列如下所示：
MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMADIGSQKRKRKKSRYKSGGGGSRPKKDRARQEKKSGGGGSVASAVFYSALVEGGGGSCGGGGSAMKEDGRLLASKGGGGSIHPDGRVDGVREKSGGGGSRLESNNYNTYRSRKYTS。
2.根据权利要求1所述的基因工程复合肽疫苗，其特征在于：所述基因工程复合肽疫苗的编码核苷酸序列如下所示：
ATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCGGACGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCCCCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCGGTTCTGGTTCTGGCCATATGCACCATCATCATCATCATTCTTCTGGTCTGGTGCCACGCGGTTCTGGTATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGATCTGGGTACCGACGACGACGACAAGGCCATGGCTGATATCGGATCCCAGAAACGTAAACGTAAGAAATCCCGTTACAAATCCGGTGGCGGTGGCTCGCGTCCGAAGAAAGACCGTGCTCGTCAGGAAAAGAAATCCGGTGGCGGTGGCTCGGTTGCTTCCGCTGTTTTCTACTCCGCTCTGGTTGAAGGTGGCGGTGGCTCGTGCGGCGGTGGTGGTTCTGCTATGAAAGAAGACGGTCGTCTGCTGGCTTCCAAAGGTGGCGGTGGCTCGATCCACCCGGACGGTCGTGTTGACGGTGTTCGTGAAAAATCCGGTGGCGGTGGCTCGCGTCTGGAATCCAACAACTACAACACCTACCGTTCCCGTAAATACACCTCC。
3.权利要求1或2所述的基因工程复合肽疫苗应用于制备预防和/或治疗恶性肿瘤的药物。
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2010
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