CN108640993A - 一种抗重组人碱性成纤维细胞生长因子纳米抗体及其应用 - Google Patents

一种抗重组人碱性成纤维细胞生长因子纳米抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗重组人碱性成纤维细胞生长因子纳米抗体及其应用。所述的抗重组人碱性成纤维细胞生长因子纳米抗体具有分子质量小、特异性强、亲和力高、稳定性高、易表达、细胞/血管穿透性强、抗原结合能力强、可在原核表达系统中进行表达等特点，克服了传统抗体的开发周期长、稳定性较低、保存条件苛刻等缺陷，可有效中和肿瘤和纤维化患者体内过度表达的bFGF，能有效抑制血管的生成、肿瘤的生长和转移，还可用于抑制肝、肺或肾等纤维化的形成。同时，该纳米抗体在大肠杆菌中可实现高效表达，在治疗肿瘤抗体药物或癌症诊断试剂盒或试剂中具有良好的应用前景。

Description

一种抗重组人碱性成纤维细胞生长因子纳米抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种抗重组人碱性成纤维细胞生长因子纳米抗体及其应用。
背景技术
抗体(Antibody)，也叫免疫球蛋白(Immunoglobulin)，是一种能特异性结合抗原的糖蛋白。传统抗体以一个或者多个“Y”字形单体存在，每个“Y”字形单体由4条多肽链组成，包含两条相同的重链和两条相同的轻链。传统抗体分子量大，结构复杂，造成其稳定性和穿透性差，而且其研发和生产成本高，导致其使用费用高，限制了它的进一步的应用。因此，一些新型小分子抗体的研发成为了研究重点，如：Fab抗体、F(ab)2抗体、单链抗体(scFv)、纳米抗体等。
1993年，Hamers Casterman等首次报道了骆驼血中存在着天然缺失轻链的奇特抗体，即重链抗体(Heavy-Chain Antibody,HCAb)。通过基因工程技术克隆其可变区，可得到只含有重链可变区组成的抗体片段，即重链单域抗体VHH(Variable Domain of HeavyChain of Heavy-Chain Antibody)。由于其分子量只有传统抗体的十分之一，而长度更是在几个纳米的级别，因此也被称作纳米抗体(Nanobody，Nb)。它具有分子质量小、稳定性高、易表达、细胞/血管穿透性强、抗原结合能力强、可在原核表达系统中进行表达等特点，兼具了传统抗体与小分子药物的优势。比之传统的大分子抗体，纳米抗体几乎完美克服了开发周期长、稳定性较低、保存条件苛刻等缺陷，而且小分子物质不易引起免疫原性；相对于同为小分子抗体Fab，scFv等分子，纳米抗体只有一个重链，表达更为容易，而且也不像单链抗体(scFv)等小分子抗体那样易互相沾粘，甚至聚集成块，因此成为抗体药物和试剂研究领域的新型抗体分子，具有良好的发展前景。目前，纳米抗体已逐步应用于疾病治疗、疾病诊断、放射性成像等领域，它在疾病治疗领域的应用为当前的研究热点。纳米抗体治疗疾病，如：抗肿瘤机制主要表现为其阻止抗原和受体的结合反应，如Coppieters等利用抗TNF-α的纳米抗体可拮抗TNF-α与其受体的特点来治疗关节炎、Roovers等采用EGF-EGFR纳米抗体来阻止EGF与EGFR结合从而治疗癌症。
碱性成纤维细胞生长因子(basic Fibroblast Growth Factor，bFGF)，又称为成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor 2，FGF-2)，是1974年由Gospodarowiz等从牛脑垂体和脑组织的提取物中纯化得到的成纤维细胞的有丝分裂原，它由146个氨基酸组成，因其等电点为9.6，故称为碱性成纤维细胞生长因子。bFGF的生物学作用极其广泛，它在血管形成、促进创伤愈合与组织修复、促进组织再生和神经组织生长发育过程中起着十分重要的作用。
在一些肿瘤疾病中，bFGF的异常表达与肿瘤发生发展、肿瘤转移、血管生成及预后密切相关，这主要是因为bFGF不仅通过旁分泌和自分泌等途径促局部血管生成，还能直接作用肿瘤细胞促进其增殖和加速肿瘤浸润和转移。而且体内外试验表明，bFGF能促进多种生长因子分泌，与其他促血管新生因子VEGF、PDGF等具有协同作用，共同促进肿瘤发生。此外，多种肿瘤可通过调节bFGF过表达，改变bFGF/FGFR信号通路，达到促进肿瘤生长。bFGF参与多种肿瘤(如神经胶质瘤、横纹肌瘤、白血病、肾癌、肺细胞癌、黑色素瘤、肺癌)的生长，有相当部分的肿瘤出现bFGF和bFGF受体的高表达。Wang等在人类黑色素瘤移植瘤首先发现，bFGF/FGFR1自分泌信号传导途径循环可促进黑色素瘤发展。Coldren等从一系列非小细胞肺癌细胞株的基因表达数据中发现，bFGF/FGFRs有明显的上升，提示FGFR依赖性自分泌信号通路在非小细胞肺癌中起着重要的作用。Casanovas等在对VEGFR进行抑制的胰腺癌小鼠抗性模型治疗中发现，bFGF的增加会再次引发血管生成和肿瘤细胞生长，提示bFGF/FGFR信号可能会避开VEGF通路抑制来促进血管生成。因此，抑制bFGF/FGFR通路可通过减缓信号传导抑制肿瘤血管生长，抑制肿瘤生长、分化、浸润和转移。所以，bFGF/FGFR系统成为抗肿瘤治疗的新靶点。因此针对这一靶点的检测和治疗至关重要。目前bFGF单克隆抗体的研究都是传统的IgG抗体。1989年Reilly等首次制备出具有中和活性的bFGF单抗，之后的研究确认了bFGF单抗抑制肿瘤和血管生长的作用。国内bFGF单抗的研究始于1998年，向军俭等制备的为鼠源性bFGF单抗以及人源性bFGF单抗，二者都具有抑制血管新生的作用。虽然目前已有抗bFGF传统抗体和Fab抗体等小分子抗体的相关研究文献和专利报道，但这些报道中所制备的抗体均来自小鼠或兔，为经典的含有重链和轻链的IgG类抗体及其衍生物，同样目前市售的bFGF含量检测试剂盒(ELISA法)多为传统IgG类抗体。传统IgG类抗体生产依赖免疫动物或培养哺乳动物细胞，生产周期长，成本高，价格昂贵，需低温保存，这些特点限制了其在治疗和检测试剂盒上的应用。从骆驼科动物中发现的重链抗体即纳米抗体，因其结构特殊性，具有特异性强、亲和力高、稳定性好、耐高温、易保存等特点，而且由于其可用细菌或酵母表达很大程度降低了生产成本，若成功研发，在应用上将有望克服传统IgG类抗体存在的以上不足。目前的bFGF抗体均为经典的含有重链和轻链的IgG类抗体及其衍生物，没有来自骆驼科动物、只有重链的新型抗体(也就是纳米抗体)的相关研究报道。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种抗重组人碱性成纤维细胞生长因子纳米抗体，该纳米抗体能特异性中和人bFGF(即FGF-2)。
本发明的另一个目的在于提供上述抗重组人碱性成纤维细胞生长因子纳米抗体的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种抗重组人碱性成纤维细胞生长因子纳米抗体，包含由框架区FR(frameworkregion)和互补决定区CDR(complementarity-determining regions)组成的可变区结构域，所述的可变区结构域包含选自以下的CDR1、CDR2和CDR3：
(1)SEQ ID No.1～4任一氨基酸序列所示的CDR1，
(2)SEQ ID No.5～8任一氨基酸序列所示的CDR2；
(3)SEQ ID No.9～12任一氨基酸序列所示的CDR3。
所述的可变区结构域包含选自以下任一项的CDR1、CDR2和CDR3：
(1)SEQ ID No.1所示的CDR1，SEQ ID No.5所示的CDR2，和SEQ ID No.9所示的CDR3；
(2)SEQ ID No.2所示的CDR1，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示的CDR2，和SEQ IDNo.9或SEQ ID No.10所示的CDR3；
(3)SEQ ID No.3所示的CDR1，SEQ ID No.7所示的CDR2，和SEQ ID No.11所示的CDR3；
(4)SEQ ID No.4所示的CDR1，SEQ ID No.8所示的CDR2，和SEQ ID No.12所示的CDR3。
所述的框架区FR选自下组的FR1、FR2、FR3和FR4：
(1)SEQ ID No.13～15任一氨基酸序列所示的FR1；
(2)SEQ ID No.16～19任一氨基酸序列所示的FR2；
(3)SEQ ID No.20～24任一氨基酸序列所示的FR3；
(4)SEQ ID No.25～27任一氨基酸序列所示的FR4。
所述的抗重组人碱性成纤维细胞生长因子纳米抗体，其氨基酸序列选自如SEQ IDNO.28～33所示的氨基酸序列中的任意一种；具体如下：
或
或
或
或
或
所述的抗重组人碱性成纤维细胞生长因子纳米抗体包含与SEQ ID NO.28～33所示的任一氨基酸序列具有至少90％，优选至少95％，更优选地至少99％序列相同性的氨基酸序列。
如SEQ ID NO.28～33所示的任一氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸的氨基酸序列。
所述的取代优选为与SEQ ID NO.28～33所示的任一氨基酸序列相比包含一个或多个氨基酸取代，优选保守氨基酸取代。例如，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代。
编码所述的抗重组人碱性成纤维细胞生长因子纳米抗体的核苷酸序列优选如下：
编码如SEQ ID NO.28～33所示的氨基酸序列的核苷酸序列分别依次如SEQ IDNO.34～39所示。
所述的纳米抗体由342个碱基、336个碱基或369个碱基组成，编码114个氨基酸、112个氨基酸或123个氨基酸，由抗体4个框架区(FR)和3个互补决定区(CDR)组成：纳米抗体的CDR1编码10个氨基酸，CDR2编码7个氨基酸，CDR3编码11个氨基酸；或CDR1编码10个氨基酸，CDR2编码7个氨基酸，CDR3编码9个氨基酸；或CDR1编码10个氨基酸，CDR2编码8个氨基酸，CDR3编码19个氨基酸；3个CDR区为特异性序列。
所述的纳米抗体的功能是由抗体抗原决定簇CDR1、CDR2、CDR3(是本发明的功能活性区)中特异性核苷酸序列决定的，其相应的氨基酸序列构成了抗体特异性bFGF抗原结合区。
所述的抗重组人碱性成纤维细胞生长因子纳米抗体的用途：该特异性结合bFGF的功能性中和抗体基因，是由存在于抗体中的互补决定区CDR特异性的基因序列决定的，基于上述互补决定区基因，可采用基因工程的方法，通过构建和表达，得到多种形式的小分子基因工程抗体，如Fab抗体、F(ab)2抗体、单链抗体(scFv)、抗体融合蛋白和IgG全抗体。
一种重组表达载体，含有所述的抗重组人碱性成纤维细胞生长因子纳米抗体的核苷酸序列。
一种重组工程细胞，含有上述重组表达载体；该重组工程细胞，可以表达所述的抗重组人碱性成纤维细胞生长因子纳米抗体。
所述的纳米抗体基因或以此基因为基础改建后的含有该纳米抗体基因互补决定区的任何基因可在原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞和真核细胞中表达，获得具有中和人bFGF的抗体产物，可应用于：(1)用于肿瘤的诊断，(2)抑制肿瘤血管新生和抑制肿瘤的生长和转移，(3)抑制肝、肺、肾纤维化的进程。
所述的抗重组人碱性成纤维细胞生长因子纳米抗体在制备用于治疗肿瘤抗体药物或癌症诊断试剂盒或试剂中的应用。
所述的肿瘤优选为黑色素瘤。
所述的癌症诊断试剂盒或试剂优选为检测人bFGF的癌症诊断试剂盒或试剂。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
1、本发明将人bFGF(即FGF-2)免疫羊驼，随后利用该羊驼外周血淋巴细胞建立了针对于人bFGF的纳米抗体基因库，试验中将人bFGF偶联在酶标板上，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，从而获得了针对人bFGF特异性的纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。
2、抗人bFGF纳米抗体具有分子量小、特异性强、亲和力高、稳定性高、易表达、细胞/血管穿透性强、抗原结合能力强、可在原核表达系统中进行表达等特点，克服了传统抗体的开发周期长、稳定性较低、保存条件苛刻等缺陷，而且所表达的纳米抗体可有效中和肿瘤和纤维化患者体内过度表达的bFGF，能有效抑制血管的生成、肿瘤的生长和转移，还可用于抑制肝、肺或肾等纤维化的形成。
附图说明
图1是bFGF纳米抗体的基因电泳图；其中泳道1是DNA Marker，泳道2～7是PCR扩增纳米抗体基因片段，依次为Nb1～Nb6。
图2是bFGF纳米抗体噬菌体文库3轮淘洗结果图。
图3是不同噬菌体抗体克隆的ELISA结果图；其中1为阳性对照，2为阴性对照，3～86分别为不同的噬菌体抗体克隆。
图4是bFGF纳米抗体纯化后的SDS-PAGE的电泳图；其中泳道1是蛋白Marker，泳道2～7是300毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱得到的纳米抗体，依次为Nb1～Nb6。
图5是bFGF纳米抗体与bFGF特异性结合结果分析图；其中1为阳性对照，2～7表示不同的纳米抗体克隆株，依次为Nb1～Nb6。
图6是bFGF纳米抗体热稳定实验结果分析图；其中bFGF单抗为阳性对照，Nb1～Nb6表示不同的纳米抗体克隆株。
图7是bFGF2纳米抗体与FGFR2的结合位点比较分析图；其中Nb1～Nb6表示不同的纳米抗体克隆株。
图8是bFGF纳米抗体与bFGF单抗结合位点比较分析图；其中Nb1～Nb6表示不同的纳米抗体克隆株。
图9是bFGF纳米抗体治疗黑色素瘤瘤体照片图；其中1为阴性对照组，2为抗bFGF纳米抗体组。
图10是bFGF纳米抗体配对实验结果分析图；其中，图A～F依次为浓度为2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL、0.0625μg/mL的NbbFGF 4(His-Flag tag)与其余bFGF纳米抗体的配对实验结果。
图11是建立的双夹心ELISA法的抗原bFGF浓度检测范围结果分析图。
图12是建立的双夹心ELISA法检测抗原bFGF浓度标准曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1抗重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)纳米抗体的构建
1、纳米抗体文库基因的构建
(1)用浓度为0.2mg/mL的重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，购自北京义翘神州生物技术有限公司)免疫羊驼(美国Allele Biotechnology & Pharmaceuticals Co.)，每次免疫将0.2mg的bFGF与弗氏佐剂等体积混合，每两周一次，共免疫4次，除第一次使用完全的弗氏佐剂(购自Sigma公司)，剩余几次全部使用弗式不全佐剂(购自Sigma公司)。免疫过程中刺激B细胞表达抗原特异性的单链抗体。(2)4次免疫结束后，提取羊驼外周血淋巴细胞100mL，用Trizol试剂(购自Invitrogen公司)提取总RNA，采用AMV First Strand cDNASynthesis试剂盒(详见NEB公司试剂盒产品说明书)反转录合成cDNA。(3)设计引物对重链抗体的可变区进行PCR扩增(反应体系见表1，PCR条件见表2)。PCR产物经QIA quick PCRPurification试剂盒(购自QIAGEN公司)回收纯化，获得330～370bp左右的羊驼重链可变区PCR产物。
表1羊驼单链抗体可变区的PCR扩增反应体系
表2羊驼单链抗体可变区的PCR扩增条件(盖温设置为105℃)
2、纳米抗体噬菌体抗体库的构建
(1)使用限制性的内切酶SfiⅠ(购自NEB公司)酶切20μg pComb3X(购自AlleleBiotechnology and Pharmaceuticals公司)噬菌体展示载体及10μg羊驼重链可变区PCR产物，并用T4DNA连接酶(购自NEB公司)连接两个片段。将连接产物电转化至电转感受态细胞XL1-Blue(购自Allele Biotechnology and Pharmaceuticals公司)中，后分别五次加入1mL SOC培养基(购自NEB公司)至电转杯重悬杯内的菌液，并将5mL培养菌液于37℃摇床中，250rpm培养1h。(2)向5mL培养菌液加入10mL SB培养基(配制方法：称取8g MOPs，24g蛋白胨，16g酵母提取物，定容至800mL，于121℃灭菌20min灭菌；培养基中含10mg/L四环素)和3μL氨苄青霉素储存液(100g/L氨苄青霉素)，混匀后取1μL培养液稀释100倍，均匀涂布于LB平板(含100mg/L氨苄青霉素)，检测库容。将余下培养液于37℃，275rpm培养1h。向培养液中加入4.5μL氨苄青霉素储存液(100g/L氨苄青霉素)，继续培养1h。向培养液中加入2mL辅助噬菌体VCSM13(购自Allele Biotechnology and Pharmaceuticals公司；滴度为1012～1013pfu/mL)、添加SB培养基(含10mg/L四环素)至200mL，并加入92.5μL氨苄青霉素储存液(100g/L氨苄青霉素)，于37℃，275rpm培养2h。向培养液中加入400μL卡那霉素储存液(35g/L卡那霉素)，培养过夜。(3)次日，将过夜培养的菌液于4℃，3000g离心15min。将上清转移至含有4％(w/v)PEG-8000和3％(w/v)NaCl的50mL离心管中，涡旋混匀，并于4℃孵育30min，用于沉淀噬菌体。于4℃，15 000g条件下离心15min。弃上清，用2mL TBS重悬噬菌体沉淀。4℃条件下，将上清最大转速离心5min，并用0.22μm滤器过滤上清至无菌EP管中，此即为抗bFGF纳米抗体的噬菌体原始库。
3、噬菌体抗体库的筛选
(1)将bFGF抗原(购自北京义翘神州生物技术有限公司)稀释至2μg/孔，包被于96孔酶标版，4℃过夜包被。次日，用5％脱脂牛奶(2.5g的脱脂牛奶完全溶解于50mL0.05％PBST溶液中)于37℃封闭1小时后，将噬菌体文库制备液(即步骤2得到的噬菌体原始库)(1014pfu/mL)加入包被有抗原的孔中，37℃孵育2小时。加入XL1-blue菌液(OD＝0.8～1)，100μL/孔，室温孵育15min。该步骤重复多次，至获得被感染菌液达到2mL。将2mL被感染的菌液加入6mL SB培养基(含10mg/L四环素)中，并添加入1.6μL氨苄青霉素储存液(100g/L氨苄青霉素)。取被感染的菌液1μL，稀释100倍，涂抹于LB平板(含10mg/L四环素)，于37℃过夜培养，测定抗体库滴度。将8mL培养液于37℃，275rpm培养1h，后加入2.4μL氨苄青霉素储存液(100g/L氨苄青霉素)，再培养1h。向培养液中加入1mL辅助噬菌体VCSM13，并添加SB培养基(含10mg/L四环素)至终体积100mL，添加92μL氨苄青霉素储存液(100g/L氨苄青霉素)。将100mL培养液于37℃，275rpm培养1.5～2h。加入200μL卡那霉素储存液(35g/L卡那霉素)，于37℃，275rpm过夜培养。次日，纯化噬菌体用于下一轮的淘洗，相同淘洗过程重复3轮。结果如图2显示，在不断地筛选的过程中，阳性克隆不断的富集，从而达到了利用噬菌体展示技术筛取抗体库中抗bFGF特异抗体的目的。
(2)从第3轮淘洗的培养皿中挑选84个阳性克隆，接种于含有1mL SB培养基(含10mg/L四环素，100mg/L氨苄青霉素)，以辅助噬菌体作为本实验的阴性对照，将培养液置于37℃摇床培养5h。后加入10μL/孔的VCSM13辅助噬菌体，再培养1.5～2h。加入2μL卡那霉素储存液(35g/L卡那霉素)，于37℃摇床过夜培养。次日，将培养液于4℃，3000g离心15min。取800μL上清并添加200μL的5倍浓度的4％PEG-8000和3％NaCl混合溶液，于4℃孵育30min。将培养液于4℃，15 000g离心15min。弃上清，加入200μL TBS，并轻轻震荡均匀。将50μL悬液加入包被有200ng/孔bFGF抗原的96孔板中。以任意3孔样品的混合液作为阳性对照，以辅助噬菌体为本实验的阴性对照，PBS作为本实验的空白对照。将96孔板于37℃孵育1h。后以100ng/孔的量孵育Anti-M13抗体(购自Sigma公司)1小时。加入100μL/孔的TMB显色液(购自NEB公司)，并孵育15mins。测定450nm处吸光值，将实验组OD值为辅助噬菌体组OD值3倍以上的克隆株定义为阳性克隆株。结果如图3，共有69个克隆株为阳性克隆株，阳性比例达到82％。对阳性克隆株进行质粒抽提，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将DNA测序结果用Bioedit进行分析，把氨基酸序列相同的克隆株视为同一克隆株，而氨基酸序列不同的株视为不同克隆株，最终共有6株氨基酸序列不同的纳米抗体。
编码纳米抗体的基因序列为如SEQ ID NO.34～39任一基因序列所示；6株bFGF纳米抗体的基因电泳图如图1所示。
4、bFGF纳米抗体的表达和纯化
(1)用一组特异性引物(见表3)对pComb 3x载体上的纳米抗体目的基因进行PCR扩增(反应体系见表4，PCR条件见表5)。
表3纳米抗体目的基因扩增引物
(划线标注为添加的Hind III和Nde I酶切位点)
表4纳米抗体目的基因PCR扩增体系
表5纳米抗体目的基因PCR扩增反应时间
上述PCR产物经QIA quick PCR Purification试剂盒(购自QIAGEN公司)回收纯化，获得330～370bp左右的纳米抗体PCR产物。使用限制性的内切酶Hind III(购自Thermo公司)和Nde I(购自Thermo公司)酶切表达载体pET22b(购自Novagen公司)和纳米抗体目的基因，并用T4DNA连接酶连接两个片段。将连接产物转化表达型宿主菌BL21(DE3)(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)中，涂布在含有LB固体培养基(含有100mg/L氨苄青霉素)的板上，37℃过夜。
(2)挑选单个菌落接种在5mL LB培养液(含有100mg/L氨苄青霉素)中，37℃摇床培养过夜。后接种1mL过夜菌种至400mL LB培养基(含有100mg/L氨苄青霉素)中，37℃摇床培养，当OD＝0.6～1时，加入IPTG(终浓度为0.5mmol/L)，18℃摇床培养20h。第二天，4℃，6000rpm离心15min收菌。将菌体用PBS重悬，超声破碎10min。8000rpm离心30min，上清即为表达产物粗提液。将粗提液经镍柱离子亲和层析纯化抗体蛋白。为获得高纯度的抗体，采用咪唑梯度洗脱法，低浓度咪唑洗脱液(100mmol/L)用于洗去杂带，高浓度咪唑洗脱液(300mmol/L)用于洗脱目的蛋白，最终可制备纯度达90％以上的蛋白。结果见图4，从左到右分别是：泳道1为标准蛋白分子，泳道2～7为300mmol/L咪唑的洗脱液洗脱的蛋白样品(依次为Nb1～6)。结果显示，纳米抗体经过该纯化后，其纯度可达到90％以上。
实施例2抗bFGF纳米抗体理化性质及生物活性试验
1、抗bFGF纳米抗体的特异性分析
向96孔酶标板内加入50ng/孔的bFGF、aFGF、KGF、EGF、TNFα、VEGF(均购自北京义翘神州生物技术有限公司)、BSA、牛奶，于4℃包被过夜。次日，用5％脱脂牛奶封闭酶标板2h后，分别加入浓度为100ng/孔的阳性对照bFGF mAb(购自Sigma公司)、空白对照PBS以及实施例1制得的抗bFGF纳米抗体，37℃孵育1h。后加入100ng/孔的抗Flag标签抗体(购自Sigma公司)，孵育1h。加入100μL/孔的TMB显色液，孵育10min。最后用2.29％硫酸终止反应，测定450nm处吸光值。以抗bFGF纳米抗体与对应抗原bFGF的吸光度值为与其他对照抗原吸光值3倍以上的抗体克隆定义为阳性。
结果如图5表示，6株抗bFGF纳米抗体与bFGF存在特异性结合能力强，和其他7个对照抗原的结合能力较弱。
2、抗bFGF纳米抗体的亲和力测定
采用表面等离子体谐振生物传感器测定抗bFGF纳米抗体的亲和力。将0.4mol N-乙基-N’-(二甲氨基丙基)碳二亚胺和0.1mol N-羟基琥珀酰亚胺等体积混合后以20μL/min的流速通入仪器中对芯片表面进行活化。bFGF蛋白用pH 4.2的0.2mol醋酸缓冲液稀释至2mg/mL后，流过芯片表面。固定量达到所需量后通入PBS缓冲液。通入1mol乙醇胺(pH 8.5)溶液7min灭活剩余的酯键。将不同浓度(3.125，6.25，12.5，25，50，100，200nM)的抗bFGF纳米抗体以20μL/min的流速通入仪器中。通过仪器软件计算抗bFGF纳米抗体的亲和力。结果如表6所示，抗bFGF纳米抗体具有高亲和力，最高亲和力达到0.69nM。其余抗bFGF纳米抗体亲和力常数分别为11.32nM、317.60nM、5.37nM、12.37nM和10.32nM。
表6抗bFGF纳米抗体亲和力常数
Nb1 Nb2 Nb3 Nb4 Nb5 Nb6
KD(nM) 11.32 317.60 5.37 0.69 12.37 10.32
3、热稳定性的测定
将筛选得到的纳米抗体(即Nb1～6)分别置于25℃，37℃，60℃，90℃四种不同温度下各10min、30min、60min、120min以及180min；同时以bFGF单克隆抗体(购自Sigma，鼠源抗体)作为阳性对照。收集不同温度、不同时间处理后的样品，用ELISA法检测它们与bFGF结合性，即在不同温度不同时间处理后，抗体是否还具有与bFGF结合的能力。检测结果图6表明，与未处理的纳米抗体相比，经过25℃和37℃处理后，纳米抗体相对活性均保持在90％以上，而经过60℃处理后，纳米抗体相对活性均有所下降，但仍保持在80％以上。但经过90℃处理后，纳米抗体相对活性均显著下降，其中Nb5处理60min时相对活性已降至0％，而Nb6处理180min后相对活性才降至0％，其他几组纳米抗体相对活性均在120min时下降至0％。这与作为阳性对照的bFGF单克隆抗体相比具有明显优势，虽然bFGF单克隆抗体在25℃，37℃，60℃三种不同温度下的相对活性均在90％以上，但在经过90℃处理后，它的相对活性在10min内就已经降至0％。因此，说明纳米抗体相对通常的鼠单克隆抗体，在高温处理时的稳定性更加好。
4、竞争结合实验
(1)采用竞争ELISA法检测本发明的纳米抗体(NbbFGF)与FGFR2(购自北京义翘神州生物技术有限公司)竞争结合bFGF(购自北京义翘神州生物技术有限公司)的能力。本实验将定量100ng的纳米抗体与变量(0～1μg)的FGFR2同时加入包被50ng bFGF的平板中孵育，若随着FGFR2浓度的升高，纳米抗体检测出来的含量会越来越少，说明纳米抗体与FGFR2同bFGF的结合表位一致或者相近，或者纳米抗体与bFGF的亲和力不及FGFR2同bFGF的亲和力；若FGFR2浓度逐渐升高，纳米抗体的含量不发生改变，则说明纳米抗体与FGFR2与同bFGF的结合表位不一致，或者纳米抗体与bFGF结合的紧密程度高于FGFR2同bFGF结合的紧密程度。结果如图7，随着FGFR2含量的增加，Nb2和Nb4含量一直保持平稳，可以推测它们与bFGF的结合表位与FGFR2与bFGF的结合表位不一致，或者它们与bFGF的亲和力高于FGFR2与bFGF的亲和力。Nb1、Nb3、Nb5和Nb6四株纳米抗体与bFGF的结合力随着FGFR2浓度的增加而呈现出递减的趋势，说明该四株纳米抗体与bFGF的结合表位与FGFR2与bFGF的结合表位一致或接近，或者它们与bFGF的亲和力低于FGFR2与bFGF的亲和力。
(2)采用竞争ELISA法检测NbbFGF与商业鼠单克隆抗体bFGF mAb(FB-8)(购自Sigma公司)竞争结合bFGF的能力。图8表明，Nb4随着bFGF mAb含量的增加，含量一直保持平稳，可以推测它与bFGF的结合表位与bFGF mAb与bFGF的结合表位不一致，或者Nb4与bFGF的亲和力高于bFGF mAb与bFGF的亲和力。Nb1、Nb2、Nb3、Nb5和Nb6五株纳米抗体与bFGF的结合力随着bFGF mAb浓度的增加而呈现出递减的趋势，说明该五株纳米抗体与bFGF的结合表位与bFGF mAb与bFGF的结合表位一致或接近，或者它们与bFGF的亲和力低于bFGF mAb与bFGF的亲和力。
实施例3抗bFGF纳米抗体治疗小鼠黑色素瘤的应用
于18只C57BL/6J小鼠(购自广东省医学实验动物中心，SPF级，6～7周龄，雌性)右后肢大腿外侧皮肤松软处接种密度为5×106个/mL的小鼠黑色素瘤B16细胞(购自中科院上海细胞库)，0.1mL/只。待肿瘤平均最长直径为1～3mm时，淘汰未见肿瘤生长的及最长直径大于5mm的小鼠。然后将小鼠随机分为阴性对照组，抗bFGF纳米抗体组，每组6只。采用瘤体周围皮下给药的方式对小鼠进行给药。PBS对照组给予1×PBS 0.1mL/只/天，抗bFGF纳米抗体组给予bFGF纳米抗体(Nb6)20mg/kg/天。连续给药14次。末次给药24h后处死小鼠，解剖取瘤块进行拍照，结果如图9所示。结果发现，阴性对照组和抗bFGF纳米抗体组的小鼠瘤体体重分别为(3.45±1.73)g和(0.96±0.81)g，与阴性对照组相比，抗bFGF纳米抗体组的抑瘤率为72.24％。说明本发明的抗bFGF纳米抗体可显著抑制小鼠体内黑色素瘤的增殖。
实施例4抗bFGF纳米抗体作为诊断试剂检测bFGF的应用
1.抗bFGF纳米抗体的配对实验
为构建可以检测抗原bFGF浓度的双夹心ELISA方法，对bFGF纳米抗体进行配对，以浓度为5μg/mL的Nb1(His-HA tag)、Nb2(His-HA tag)、Nb3(His-HA tag)、Nb5(His-HAtag)、Nb6(His-HA tag)包板，加完2μg/mL的抗原FGF-2后，孵育上浓度为2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL的Nb4(His-Flag tag)，然后以Anti-Flag tag-HRP(购自Sigma公司，货号A8592-.2MG)作为检测抗体，最终用TMB显色，于450nm波长处测量吸光度值。
结果如图10所示，不同浓度的Nb4(His-Flag tag)与其余bFGF纳米抗体的配对实验的吸光度值均大于对照组1X PBS的吸光度值的3倍以上，而其中吸光度值最高的是Nb4(His-Flag tag)与NbFGF-2 6(His-HA tag)的配对。因此我们确定，将Nb6(His-HA tag)作为检测抗原bFGF浓度的双夹心ELISA方法中的捕获抗体，Nb4(His-Flag tag)作为抗原的检测抗体。
2.双夹心ELISA法检测抗原bFGF浓度范围的确定
确定检测抗原bFGF浓度的双夹心ELISA方法中所需的两株纳米抗体后，通过添加不同浓度的抗原，测定该方法对抗原bFGF的检测范围。以浓度为5μg/mL的Nb6(His-HA tag)包板，加上浓度为2000ng/mL、1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.63ng/mL、7.81ng/mL、3.91ng/mL、1.95ng/mL、0.98ng/mL、0.49ng/mL的抗原bFGF后，孵育上浓度为2μg/mL的NbbFGF 4(His-Flag tag)，然后以Anti-Flag tag-HRP作为检测抗体，最终用TMB显色，于450nm波长处测量吸光度值。
结果如图11所示，表明在该检测方法下，能检测到浓度大于等于7.81ng/mL的抗原(图11A)；将结果以抗原浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制成散点图，发现当抗原浓度介于7.81ng/mL到500ng/mL之间时，吸光度值变化明显(图11B)。
调整抗原浓度使其落在10ng/mL到400ng/mL区间，然后进行再一次的双夹心ELISA实验，以浓度为5μg/mL的Nb6(His-HA tag)包板，加上浓度为400ng/mL、300ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、80ng/mL、40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL的抗原bFGF后，孵育上浓度为2μg/mL的Nb4(His-Flag tag)，然后以Anti-Flag tag-HRP作为检测抗体，最终用TMB显色，于450nm波长处测量吸光度值。
将结果以抗原浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制成散点图并求解其直线方程和相关系数：方程为Y＝0.0045X-0.005，相关系数R2＝0.98977。以上实验结果表明，在以浓度为5μg/mL的Nb 6(His-HA tag)作为捕获抗体，以浓度为2μg/mL的Nb4(His-Flag tag)作为抗原的检测抗体的双夹心ELISA方法下，可以将抗原bFGF稀释为400ng/mL、300ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、80ng/mL、40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL等八个浓度，并以抗原浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制成样品检测的标准曲线(图12)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 一种抗重组人碱性成纤维细胞生长因子纳米抗体及其应用
<160> 42
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Ser Asn Phe Ser Asn Asn Asp Met Gly
1 5 10
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Ser Asn Phe Ser Ile Asn Asp Met Gly
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 9
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
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Leu Ser Cys Glu Val Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
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Leu Ser Cys Lys Ala Ser
20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Leu Ser Cys Ala Ala Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
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1 5 10 15
Ala Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Ala Lys Asp
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Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
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1 5 10 15
Ala Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<210> 22
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Asn Tyr Ala Asn Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn
1 5 10 15
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20 25 30
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<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
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<210> 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Met Tyr Gly Asp Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Ser Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Thr
1 5 10
<210> 27
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 28
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Leu Gln Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
1 5 10 15
Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Ser Asn Phe Ser Asn Asn Asp Met Gly
20 25 30
Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Val Val Ala Gly Ile
35 40 45
Ser Ser Val Gly Arg Thr Met Tyr Gly Asp Pro Val Lys Gly Arg Phe
50 55 60
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln Met Asn
65 70 75 80
Arg Leu Lys Ala Lys Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His Leu Tyr Gly
85 90 95
Asp Tyr Arg Gly Thr Gly Phe Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 29
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Leu Gln Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
1 5 10 15
Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Ser Asn Phe Ser Ile Asn Asp Met Gly
20 25 30
Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Glu Val Val Ala Gly Ile
35 40 45
Ser Ser Val Gly Arg Ala Met Tyr Ala Asp Pro Val Lys Gly Arg Phe
50 55 60
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln Met Asn
65 70 75 80
Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Leu Tyr Gly
85 90 95
Asp Tyr Arg Gly Thr Gly Phe Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 30
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Leu Gln Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
1 5 10 15
Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Ser Asn Phe Ser Ile Asn Asp Met Gly
20 25 30
Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Glu Val Val Ala Gly Ile
35 40 45
Ser Ser Val Gly Arg Thr Met Tyr Ala Asp Pro Val Lys Gly Arg Phe
50 55 60
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln Met Asn
65 70 75 80
Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His Leu Tyr Gly
85 90 95
Asp Tyr Arg Gly Thr Gly Phe Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 31
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
1 5 10 15
Leu Ser Cys Lys Ala Ser Arg Asn Ile Phe Ser Val Asn His Met Gly
20 25 30
Tyr Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala Leu Ile
35 40 45
Thr Pro Gly Gly Thr Arg Asn Tyr Ala Asn Ser Val Lys Gly Arg Phe
50 55 60
Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Thr Trp Pro
85 90 95
Tyr Glu Ser Ala Tyr Ser Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Thr
100 105 110
<210> 32
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Gly Ala Met Gly
20 25 30
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Phe Val Ala Thr Ile
35 40 45
Thr Trp Asp Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
50 55 60
Tyr Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met
65 70 75 80
Asn Asp Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys Ala Ala Arg
85 90 95
Ser Tyr Ser Glu Ala Tyr Tyr Leu Ile Gly Ser Ser Asp Tyr Asn Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 33
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Leu Gln Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
1 5 10 15
Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Ser Asn Phe Ser Ile Asn Asp Met Gly
20 25 30
Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Glu Val Val Ala Gly Ile
35 40 45
Ser Ser Val Gly Arg Thr Met Tyr Gly Asp Pro Val Lys Gly Arg Phe
50 55 60
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln Met Asn
65 70 75 80
Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His Leu Tyr Gly
85 90 95
Asp Tyr Arg Gly Thr Gly Phe Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 34
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ctgcaggagt ctgggggaga cttggtgcag cctggggggt ctctgagact ctcctgtgaa 60
gtttctggaa gcaacttcag taacaatgac atgggctggt accgccaggc tccagggaag 120
cagcgcgagg tggtcgcagg tattagtagt gttggacgta caatgtatgg agaccccgtg 180
aagggccgat tcaccatctc cagagacaac gccaagaaca tggtgtatct gcaaatgaac 240
agactgaaag ctaaagacac ggccgtctat tactgtcacc tttatggtga ctataggggg 300
actggtttct ggggcaaggg gacccaggtc accgtctcgt cg 342
<210> 35
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ctgcaggagt ctgggggaga cttggtgcag cctggggggt ctctgagact ctcctgtgaa 60
gtttctggaa gcaacttcag tatcaatgac atgggctggt accgccaggc tccggggaag 120
cggcgcgagg tggtcgcagg tattagtagt gttggacgcg caatgtatgc agaccccgtg 180
aagggccgat tcaccatctc cagagacaac gccaagaaca tggtgtactt gcaaatgaac 240
agactgaaac ctgaggacac ggccgtttat tactgttacc tttatggtga ttataggggg 300
actggtttct ggggcaaggg gacccaggtc accgtctcgt cg 342
<210> 36
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ctgcaggagt ctgggggaga cttggtgcag cctggggggt ctctgagact ctcctgtgaa 60
gtttccggaa gcaacttcag tatcaatgac atgggctggt accgccaggc tccagggaag 120
cggcgcgagg tggtcgcagg tattagtagt gttggacgca caatgtatgc agaccccgtg 180
aagggccgat tcaccatctc cagagacaac gccaagaaca tggtgtatct gcaaatgaac 240
agactgaaac ctgaggacac ggccgtctat tactgtcacc tttatggtga ctataggggg 300
actggtttct ggggcaaggg gacccaggtc accgtctcgt cg 342
<210> 37
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ctgcagcagt ctgggggagg cttggtgcag cctggggggt ctctgagact ctcctgtaaa 60
gcctctagaa acatcttcag tgtcaatcac atgggctatt accgccaggc tccagggaag 120
gagcgcgagc tggtcgcgct tattactccc ggtggtacca gaaactatgc aaactccgtg 180
aagggccgat tcaccatctc caaagacaac gccaagaaca cggtgtatct gcagatgaac 240
agcctgcaac ctgaggacac ggccgtctat tactgtaata cctggccata tgagtctgcc 300
tattcgggcc aggggaccca ggtcaccgtc tccaca 336
<210> 38
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ctgcaggagt ctgggggagg attggtgcag gctgggggct ctctgagact ctcctgtgca 60
gcctctggac gcaccttcag tagcggtgcc atgggctggt tccgccaggc tccagggaag 120
gagcctgagt ttgtggcaac tattacgtgg gatgggggta cgacatacta tgcagactcc 180
gtgaagggcc gatacaccat ctccagagac aacgccaaga atacggtata tctgcaaatg 240
aacgacctga aacctgagga cacggccgtt tattcctgtg cagcgagatc ttatagtgag 300
gcttactact taatcggctc gtccgattat aactactggg gtcaggggac ccaggtcacc 360
gtctcctca 369
<210> 39
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ctgcaggagt ctgggggaga cttggtgcag cctggggggt ctctgagact ctcctgtgaa 60
gtttctggaa gcaacttcag tatcaatgac atgggctggt accgccaggc tccagggaag 120
cgacgcgagg tggtcgcagg tattagtagt gttggacgca caatgtatgg agaccccgtg 180
aagggccgat tcaccatctc cagagacaac gccaagaaca tggtgtatct gcaaatgaac 240
agactgaaac ctgaggacac ggccgtctat tactgtcacc tttatggtga ctataggggg 300
actggtttct ggggcaaggg gacccaggtc accgtctcgt cg 342
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ataaaacata tgctgcagga gtctggggga 30
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ataaaacata tgctgcagca gtctggggga 30
<210> 42
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ataaaaaagc ttcttatcgt cgtcatcttt ata 33

Claims (10)

1.一种抗重组人碱性成纤维细胞生长因子纳米抗体，包含由框架区FR和互补决定区CDR组成的可变区结构域，其特征在于，所述的可变区结构域包含选自以下的CDR1、CDR2和CDR3：
(1)SEQ ID No.1～4任一氨基酸序列所示的CDR1，
(2)SEQ ID No.5～8任一氨基酸序列所示的CDR2；
(3)SEQ ID No.9～12任一氨基酸序列所示的CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗重组人碱性成纤维细胞生长因子纳米抗体，其特征在于，所述的可变区结构域包含选自以下任一项的CDR1、CDR2和CDR3：
(1)SEQ ID No.1所示的CDR1，SEQ ID No.5所示的CDR2，和SEQ ID No.9所示的CDR3；
(2)SEQ ID No.2所示的CDR1，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示的CDR2，和SEQ ID No.9或SEQ ID No.10所示的CDR3；
(3)SEQ ID No.3所示的CDR1，SEQ ID No.7所示的CDR2，和SEQ ID No.11所示的CDR3；
(4)SEQ ID No.4所示的CDR1，SEQ ID No.8所示的CDR2，和SEQ ID No.12所示的CDR3。
3.根据权利要求1所述的抗重组人碱性成纤维细胞生长因子纳米抗体，其特征在于，所述的框架区FR选自下组的FR1、FR2、FR3和FR4：
(1)SEQ ID No.13～15任一氨基酸序列所示的FR1；
(2)SEQ ID No.16～19任一氨基酸序列所示的FR2；
(3)SEQ ID No.20～24任一氨基酸序列所示的FR3；
(4)SEQ ID No.25～27任一氨基酸序列所示的FR4。
4.根据权利要求1所述的抗重组人碱性成纤维细胞生长因子纳米抗体，其特征在于：
其氨基酸序列选自如SEQ ID NO.28～33所示的任一氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的抗重组人碱性成纤维细胞生长因子纳米抗体，其特征在于：
所述的抗重组人碱性成纤维细胞生长因子纳米抗体包含与SEQ ID NO.28～33所示的任一氨基酸序列具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。
6.根据权利要求4所述的抗重组人碱性成纤维细胞生长因子纳米抗体，其特征在于：
其氨基酸序列为如SEQ ID NO.28～33所示的任一氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸的氨基酸序列。
7.根据权利要求4所述的抗重组人碱性成纤维细胞生长因子纳米抗体，其特征在于：
编码所述的抗重组人碱性成纤维细胞生长因子纳米抗体的核苷酸序列如SEQ IDNO.34～39所示的任一核苷酸序列。
8.一种重组表达载体，其特征在于：
含有编码权利要求1～7任一项所述的抗重组人碱性成纤维细胞生长因子纳米抗体的核苷酸序列。
9.一种重组工程细胞，其特征在于：
含有权利要求8所述的重组表达载体。
10.权利要求1～7任一项所述的抗重组人碱性成纤维细胞生长因子纳米抗体在制备用于治疗肿瘤抗体药物或癌症诊断试剂盒或试剂中的应用。
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