CN102558351A - 抗人碱性成纤维细胞生长因子人源性scFv抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗重组碱性成纤维细胞生长因子人源性scFv抗体及其应用。该人源性scFv抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。编码重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.3所示。编码轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.4所示。该人源性scFv抗体具有高亲和力和特异性，由于是全人源性的抗体，可以直接开发为人用的抗体药物。将编码该人源性scFv抗体的基因构建、表达，得到多种形式的小分子基因工程抗体，如Fab抗体、F(ab)₂、单链抗体、纳米抗体、抗体融合蛋白和IgG全抗体等，可用于制备诊断和治疗肿瘤和/或抑制内脏纤维化的抗体药物。

Description

抗人碱性成纤维细胞生长因子人源性scFv抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种抗重组碱性成纤维细胞生长因子(或称为成纤维细胞生长因子2，FGF-2)人源性scFv抗体及其应用。

背景技术

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，又名成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2，FGF-2)，是成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)家族目前已知的23个成员中发现最早、研究最多的因子。bFGF有多种生物学作用，包括促生长、分裂、分化功能；对成纤维细胞具有强烈的促增殖作用。bFGF是一个多功能分子，分子表面具有多种结合表位，像受体结合位点，肝素结合位点，整合素结合位点等多个表位。针对不同表位的抗体具有不同的功能。而且，针对同一抗原的单克隆抗体具有非常大的多样性，可变区序列不同，也代表了单抗的亲和力的功能的差异。

bFGF是继VEGF之后的最重要的刺激血管新生的细胞因子之一。与肿瘤的发生、发展关系密切，促进肿瘤的生长，有相当部分的肿瘤会出现bFGF和bFGF受体的高表达。bFGF能促进肿瘤血管的新生，因而增加肿瘤的血液供应、为肿瘤生长提供氧和营养物质；促进多种生长因子的分泌，如VEGF，TGF，aFGF等，这些因子相互调节，共同促进肿瘤的发生。

到目前为止，还没有见到国内外其他关于抗bFGF人源性单链抗体(ScFv)的报道。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种抗人碱性成纤维细胞生长因子人源性scFv抗体。该抗体能特异性中和人bFGF(或FGF-2)的生物学活性。

本发明的另一目的在于提供所述的抗人碱性成纤维细胞生长因子人源性scFv抗体的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种抗人碱性成纤维细胞生长因子人源性scFv抗体，包括重链可变区和轻链可变区；

所述的重链可变区的氨基酸序列如下所示：

Q    V    Q    L    Q    E    S    G    G    G    L    V    Q    P    G    G    S    L    R    L

S    C    A    A    S    G    F    T    F    S    S    Y    E    M    N    W    V    R    Q    A

                                              CDR1

P    G    K    G    L    E    W    V    S    Y    I    S    S    S    G    S    T    I    Y    Y

                                                                  CDR2

A    D    S    V    K    G    R    F    T    I    S    R    D    N    A    K    N    S    L    Y

L    Q    M    N    S    L    R    A    E    D    T    A    V    Y    Y    C    A    R    E    L

T    G    D    W    G    A    F    D    I    W    G    Q    G    T    M    V    T    V    S    S；

                   CDR3

所述的轻链可变区的氨基酸序列如下所示：

Q    S    V    L    T    Q    P    A    S    V    S    G    S    P    G    Q    S    I    T    I

S    C    T    G    T    S    S    D    V    G    G    Y    N    Y    V    S    W    Y    Q    Q

                                         CDR1

H    P    G    K    A    P    K    L    M    I    Y    D    V    S    N    R    P    S    G    V

                                                                      CDR2

S    N    R    F    S    G    S    K    S    G    N    T    A    S    L    T    I    S    G    L

Q    A    E    D    E    A    D    Y    Y    C    S    S    Y    T    S    S    S    T    V    V

                                                                       CDR3

F         G        G         G        T       K         L         T        V         L     G

编码所述的重链可变区的基因序列如下所示：

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGAAATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAGTGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGCTAACTGGGGATTGGGGTGCTTTTGATATCTGGGGCCAGGGGACAATGGTCACTGTCTCCTCA；

编码所述的轻链可变区的基因序列如下所示：

CAGTCTGTGTTGACGCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCAGTAATCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATACAAGCAGCAGCACTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGG；

编码所述的重链可变区的基因由360个碱基组成，编码120个氨基酸，可变区含有3个CDR(互补决定簇)区：CDR1编码10个氨基酸，CDR2编码8个氨基酸，CDR3编码13个氨基酸；可变区的框架区与其他人源性抗体的同源性高达94％，而3个CDR区则是特异性序列，与其他人源性抗体Fd链有较大差异。

编码所述的轻链可变区的基因由333个碱基组成，编码111个氨基酸，可变区含有3个CDR(互补决定簇)区：CDR1编码14个氨基酸，CDR2编码8个氨基酸，CDR3编码10个氨基酸；可变区的框架区与其他人源性抗体的同源性为98％，而3个CDR区则为特异性序列，与其他人源性抗体λ链有较大差异。

抗重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或成纤维细胞生长因子2(FGF-2)人源性scFv抗体蛋白的功能存在于抗体轻重链可变区抗原互补决定族(complementarity determing regions CDRs)CDR1、CDR2、CDR3(是本发明的功能活性区)中特异性核苷酸序列决定的，其相应的氨基酸序列构成了抗体特异性bFGF或(FGF-2)抗原结合区。

上述的抗重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或成纤维细胞生长因子2(FGF-2)人源性抗体的用途：由于抗体的生物活性是由抗体轻链和重链可变区中的高变区(CDRs)特异性的基因序列决定的，因此可采用基因工程方法，将编码所述的抗人碱性成纤维细胞生长因子人源性scFv抗体的基因构建、表达，得到多种形式的小分子基因工程抗体(如Fab抗体、F(ab)2、单链抗体(scFv)、纳米抗体(Nanobody)、抗体融合蛋白)和IgG全抗体。

在原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞和真核细胞获得该抗体基因表达或以此基因为基础改建后的含有该抗体基因可变区的任何其他基因。获得具有中和人bFGF的抗体产物，可在临床上进行如下应用：(1)用于肿瘤的诊断，(2)抑制肿瘤血管新生和抑制肿瘤的生长和转移，(3)抑制肝、肺、肾纤维化的进程。

上述的抗重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或成纤维细胞生长因子2(FGF-2)人源性scFv抗体在制备用于诊断和治疗肿瘤以及抑制内脏(如肾、肝或肺等)纤维化的抗体药物中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明获得的抗bFGF或FGF-2人源性scFv抗体，该抗体是全人源的，是从人噬菌体抗体库中筛选到的抗体，具有高亲和力和特异性，因为是全人源性的抗体，可以直接开发为人用的抗体药物。筛选到的人源性抗bFGF抗体具有特异性结合bFGF的特点，可有效中和肿瘤和纤维化患者体内过渡表达的bFGF，能有效抑制肿瘤的生长和转移，还可用于抑制肝、肺或肾等纤维化的形成。

附图说明

图1是不同scFv噬菌体抗体克隆的ELISA结果图。

图2是scFv抗体克隆表达产物的SDS-PAGE和Western blot检测结果图；

泳道1为分子量标准；泳道2～4分别为三个不同克隆44，49，85的表达上清的SDS-PAGE结果图；泳道5～7分别为对应的Western-blot结果图。

图3是纯化后的单链抗体scFv44对bFGF诱导的人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)增殖的抑制试验结果图。

图4是纯化后的单链抗体scFv44抑制人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)成管的抑制试验结果图。

图5是纯化的单链抗体scFv44抑制神经胶质瘤细胞细胞增殖作用的结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

抗重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或成纤维细胞生长因子2(FGF-2)人源性scFv抗体的筛选方法：

(1)噬菌体抗体库的筛选

首先将bFGF(北京启维益成公司)用0.05mol/L、pH8.7的碳酸盐缓冲液稀释至50～100μg/ml，用1ml包被免疫管(Immunotube，NUNC公司)，4℃过夜，次日以质量体积比2.5％的脱脂奶粉加满免疫管37℃封闭2h，倒去封闭液，加入1ml噬菌体抗体库(约10¹³CFU)(Enprobiotech公司)，37℃孵育2h，吸去噬菌体抗体液，以含体积百分比0.05％吐温20的PBS(0.01M、pH7.2)洗2次(第二轮洗10次，以后洗涤20次以上)，蒸馏水洗涤1次。

然后用2种方法回收结合于固相的噬菌体抗体：①先加入1ml新鲜XL1-Blue菌(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)，37℃孵育15min后转入10ml含20μg/mlAmp(氨苄青霉素)、10μg/ml Tet(四环素)的SB培养基(每升培养基含细菌培养用胰化蛋白陈309g，酵母提取物209g，19gMoPs，pH7.0)；②再将细菌感染回收后的免疫管用蒸馏水洗涤2次，加入1ml洗脱液(0.1ml HCl、以甘氨酸调至pH＝2.2后加入BSA至质量体积比为0.1％)，于37℃静置15min，进行洗脱回收，将洗脱液吸出后，立即加入40μl 2mol/L Tris溶液中和，再加入10mlXL1-Blue细胞(OD600＝0.8)37℃静置15min，接着加入10ml含20μg/ml Amp、10μg/ml Tet的SB培养基。从2次回收的菌液分别取出适量铺盘测定CFU，其余细菌37℃培养3h，扩大体积到50ml，加入1.7×10¹²PFU辅助病毒VCSM13(广州英韦创津生物科技有限公司)，30℃振荡培养过夜。次日回收上清，常规PEG沉淀，所得的次级噬菌体抗体库可进行下一轮的筛选。按相同方法进行3轮淘选，得到阳性噬菌体scFv抗体克隆。

(2)噬菌体抗体的制备及抗bFGF特异性的检测

从筛选第4轮的培养盘随机挑取集落在含有50μg/mL Amp的2YT培养液中37℃过夜培养，第二天取30μl细菌到1ml LB培养基中，37℃培养至对数生长期，加入辅助病毒VCSM13，30℃培养过夜，收取上清。按以下程序进行ELISA检测：将抗原(即bFGF)稀释至10μg/ml，用50μl稀释后的抗原包被ELISA板，2h后弃去孔内液体，用质量体积比3％脱脂奶-PBS溶液(即用0.01M、pH7.2的PBS配制的脱脂奶溶液)封闭后加入噬菌体抗体液(即第三轮筛选获得的阳性噬菌体)，37℃孵育1h，用质量体积比0.05％Tween20-PBS溶液(即用0.01M pH7.2的PBS配制的脱脂奶溶液)洗涤3次，加入HRP-抗M13鼠单抗(Promega公司)进行反应，洗涤后加入TMB底物显色，读取A450值。筛选到的具有与bFGF特异性结合的噬菌体抗体克隆的ELISA结果如图1所示，图1的结果表明，通过三轮噬菌体展示筛选，筛选到了抗bFGF阳性的噬菌体ScFV抗体克隆。用2号噬菌体测序，得到编码抗人碱性成纤维细胞生长因子人源性scFv抗体的基因。

编码重链可变区的基因序列如下所示：

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGAAATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAGTGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGCTAACTGGGGATTGGGGTGCTTTTGATATCTGGGGCCAGGGGACAATGGTCACTGTCTCCTCA；

编码轻链可变区的基因序列如下所示：

CAGTCTGTGTTGACGCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCAGTAATCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATACAAGCAGCAGCACTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGG。

实施例2

(1)单链抗体的原核表达

将测序正确的阳性克隆，通过下述引物扩增之后，连接到原核表达载体pET32a(Promega公司)中。

PCR的反应条件为：

反应体系为50μl：

扩增ScFv的上游引物5’-GGATCCCAGGTGCAGCTGCAGGA-3’；

下游引物：5’-AAGCTTGCTGACCGTCCTAGGG-3’

10×PCR Buffer(Mg²⁺)5μl，dNTP Mixture(2mM)5μl，上下游引物各1μl(10μmol/L)，Blendtaq-plus(Promega公司)0.5μl，阳性噬菌体抗体克隆1μl，灭菌去离子水补充至50μl。

PCR扩增程序为：

94℃预变性4min，94℃变性45s，54℃退火40s，72℃延伸60s，28个循环后，72℃延伸10min。反应产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳，胶回收并纯化，得到PCR扩增的ScFv片段。

酶切反应：通过BamHI(Takara公司)和HindIII(Takara公司)双酶切pET32a载体，通过酶切产物回收试剂盒回收载体；通过BamHI(Takara公司)和HindIII(Takara公司)双酶切PCR扩增的ScFv片段，通过酶切产物回收试剂盒回收ScFv片段。

连接反应体系(10μl)：pET32a酶切产物(50ng/μl)1μl，ScFv酶切产物5uL(50ng)，连接缓冲液2μl，T4DNA连接酶(Promega公司)1uL。加去离子水至终体积为20μl。16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌HB2151(Promega公司)，挑取单克隆，提取质粒酶切鉴定，将阳性克隆送生工测序，重组载体命名为pET32a-ScFv重组载体。将测序正确的2号克隆接种2mL SB培养基(上海华壹生物科技有限公司)，37℃、200rmp的速度振荡培养8～9小时，接着将培养得到的1ml菌液接种至50ml含有50μg/mL Amp的SB培养基振荡培养至OD600≈0.8，加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，30℃培养2～8小时，诱导表达之后将菌体离心，弃去上清，0.01M、pH7.2的PBS重悬菌体，超声破碎。12000g/min离心之后取上清，根据分子克隆操作，SDS-PAGE和Western-blot鉴定结果如图2所示，图2的结果表明，ScFv抗体在原核细胞中获得表达，并经Western-blot鉴定正确。

(2)ScFv抗体的纯化

①收集原核表达的菌液1L，5000rpm离心5min收集菌体沉淀，0.01M、pH7.2的PBS洗涤两次，重悬于200mL PBS中。

②设置MISONIX超声乳化仪的振幅为50，超声时间为5s，间隔时间为10s，总共超声时间为20min，超声温度上限为30℃，冰浴超声裂解菌体。

③将裂解上清最大离心力离心30min，0.45μm滤膜过滤，上清上样于含80mM咪唑的PBS缓冲液(0.01M、pH7.2)平衡的Ni-NTA亲和层析柱，上样速度为0.5mL/min、以含80mM咪唑的PBS缓冲液(0.01M、pH7.2)洗涤至基线，再用含130mM咪唑的PBS缓冲液(0.01M、pH7.2)洗涤杂蛋白峰，洗涤至A280值不再降低，洗涤速度为1.5mL/min，最后用含500mM咪唑的PBS缓冲液(0.01M、pH7.2)缓冲液洗脱目的蛋白，纯化的ScFv抗体的纯度达94％。

实施例3

(1)人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC)增殖抑制试验

用2×10³/孔的细胞胞密度接种HUVEC细胞(广州雅吉生物科技有限公司)到96孔板中，用M199培养基(广州雅吉生物科技有限公司)添加10％胎牛血清(FBS，Gibico公司)于37℃培养16小时。将培养基换为含0.5％FBS的M199培养基，加入20ng/mL bFGF和不同浓度的实施例1制备得到的人源性ScFV抗体，对照组同样换为含0.5％牛血清(FBS)的M199培养基，加入20ng/mL bFGF和与抗体等体积的0.01M、pH7.2的PBS)，37℃培养4天后，利用CCK-8试剂盒测定活细胞数量。结果见图3，图3的结果表明，抗bFGF ScFv抗体能够有效抑制血管内皮细胞HUVEC的增殖，说明ScFv能够中和培养体系中的bFGF的作用，进而抑制血管内皮细胞的增殖。

(2)HUVECs的成管实验

将基质胶(Metrigel)从-20℃取出，置冰上融化，将基质胶与置冰上预冷的M199培养基按体积比1∶1混匀。将稀释好的基质胶以50μL/孔加入到96孔孔板中。37℃孵育30min使基质胶凝固形成均一的胶层。用质量体积比为0.25％的胰酶溶液消化HUVECs细胞，用含体积百分比5％FBS的M199培养基重悬细胞调整细胞密度为1×10⁵细胞/mL，接着按150μL/孔的细胞到凝固的基质胶上，混匀细胞，37℃细胞培养箱孵育4小时。倒置显微镜下观察细胞成管情况，并计数成管数。结果见图4，图4的结果表明，抗bFGF ScFv抗体组的血管内皮细胞成管数明显少于对照组，说明抗bFGF ScFv抗体能够抑制血管内皮细胞的成管作用。

实施例4

肿瘤细胞增殖抑制试验

将对数生长期的神经胶质瘤细胞U87MG(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)用DMEM培养基调整细胞密度为10⁴/mL。在96孔板中，每孔加入1000个细胞，37℃培养过夜，使细胞贴壁。加入不同浓度的实施例2制备得到的人源性ScFv抗体，对照组加入0.01M、pH7.2的PBS，37℃培养4天。4天后加入10μL CCK-8，37℃孵育30min。酶标仪测定光吸收值OD405nm的读数。细胞增值抑制结果见图5，图5的结果表明，抗bFGF ScFv抗体能够抑制肿瘤细胞的增殖作用，其增殖抑制率达达到50％以上。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种抗人碱性成纤维细胞生长因子人源性scFv抗体，其特征在于：所述的抗人碱性成纤维细胞生长因子人源性scFv抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的抗人碱性成纤维细胞生长因子人源性scFv抗体，其特征在于：编码所述的重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求1所述的抗人碱性成纤维细胞生长因子人源性scFv抗体，其特征在于：编码所述的轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

4.权利要求1～3任一项所述的抗人碱性成纤维细胞生长因子人源性scFv抗体的应用，其特征在于：所述的抗人碱性成纤维细胞生长因子人源性scFv抗体用于制备诊断和治疗肿瘤和/或抑制内脏纤维化的抗体药物。

5.根据权利要求4所述的抗人碱性成纤维细胞生长因子人源性scFv抗体的应用，其特征在于：所述的内脏为肾、肝或肺。

6.根据权利要求4所述的抗人碱性成纤维细胞生长因子人源性scFv抗体的应用，其特征在于：所述的抗体药物为将编码所述的抗人碱性成纤维细胞生长因子人源性scFv抗体的基因构建、表达，得到多种形式的小分子基因工程抗体。

7.根据权利要求6所述的抗人碱性成纤维细胞生长因子人源性scFv抗体的应用，其特征在于：所述的小分子基因工程抗体为Fab抗体、F(ab)₂、单链抗体、纳米抗体、抗体融合蛋白或IgG全抗体。

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