CN102617734B - 抗FGF-2抗体Dab-2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗FGF-2抗体Dab-2及其应用。该抗FGF-2抗体Dab-2的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。编码重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.3所示。编码轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.4所示。该抗FGF-2抗体Dab-2具有高亲和力和特异性。将编码该抗FGF-2抗体Dab-2的基因构建、表达，得到多种形式的小分子基因工程抗体，如Fab抗体、F(ab)₂、单链抗体、纳米抗体、抗体融合蛋白和IgG全抗体等，可用于制备诊断和治疗肿瘤和/或抑制内脏纤维化的抗体药物。

Description

抗FGF-2抗体Dab-2及其应用

技术领域

本发明涉及一种抗体，特别涉及一种抗FGF-2高特异性的鼠源抗体Dab-2及其应用。

背景技术

人成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2，FGF2)又名碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，是成纤维细胞生长因子家族中的一员，是一种广泛的有丝分裂原，可通过自分泌或旁分泌的方式促进多种细胞，包括肿瘤细胞的增殖、分化。FGF家族成员主要通过与其高亲和力受体的结合向细胞内传递信号，发挥其生物学活性。

FGF-2是一个多功能分子，分子表面具有多种结合表位，像受体结合位点，肝素结合位点，整合素结合位点等多个表位。针对不同表位的抗体具有不同的功能。而且，针对同一抗原的单克隆抗体具有非常大的多样性，可变区序列不同，也代表了单抗的亲和力的功能的差异。

黑色素瘤是一种恶性程度很高的肿瘤，恶性黑色素瘤仍然是世界范围内最为难治的肿瘤之一，美国每年有25000个恶性黑素瘤新增病例，死亡约6000人。随着污染的日益加剧，我国黑色素瘤患者日益增多。黑色素瘤细胞是FGF-2高分泌的细胞，这种自分泌或旁分泌的FGF-2可直接刺激肿瘤细胞的增值，促进肿瘤血管新生，加速肿瘤细胞的侵润和转移。

自从1975年单克隆抗体技术建立以来，各种单克隆抗体相继出现，这些单克隆抗体在疾病的诊断和治疗方面发挥重要作用。同时也为难治的肿瘤等疾病带来希望。目前美国FDA批准用于肿瘤治疗的抗体药物有十多种。其中，2011年首次批准了治疗黑色素瘤的单抗药物Yervoy，Yervoy是针对VEGFR的抗体药物，开创了抗体药物治疗黑色素瘤的先例。黑色素瘤存在FGF2的高表达，且有证据表面FGF2的活性增加与肿瘤血管新生密切相关，而且FGF-2本身具有促进细胞增殖和转移的作用。所以，针对FGF-2的抗体能够有效中和黑色素瘤患者体内高表达的FGF-2，抑制肿瘤血管生成，进而抑制肿瘤的生长。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种抗FGF-2抗体Dab-2。

本发明的另一目的在于提供所述的抗FGF-2抗体Dab-2的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种抗FGF-2抗体Dab-2，包括重链可变区和轻链可变区；

所述的重链可变区的氨基酸序列如下所示：

QVQLQQSGAELVRSGASVKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGDTVY

APKFQGKATMTADTSSNTAYLQLSRLTSEDTAVYYCTYDGYFDYWGQGTTLTVSS；

所述的轻链可变区的氨基酸序列如下所示：

DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVYRYGDTYLHWYLQKPGQSPNLLIYKVSNRFS

GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPRTFGGGTKLELKRTVAAP；

编码所述的重链可变区的基因序列如下所示：

CAGGTTCAGCTTCAGCAATCTGGGGCAGAGCTTGTGAGGTCAGGGGCCTCAGTCAAGT

TGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGCACTGGGTGAAGCAGA

GGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGAGAATGGTGATACTGTAT

ATGCCCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATGACTGCAGACACATCCTCCAATACAGCC

TATCTGCAGCTCAGCCGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTACCTATGAT

GGTTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA；

编码所述的轻链可变区的基因序列如下所示：

GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCC

ATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTATACCGTTATGGAGACACCTATTTACATTGGT

ACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAACCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTT

TCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGAT

CAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTC

CTCGGACGTTCGGTGGAGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGACTGTGGCTGCACCA；

编码所述的重链可变区的基因由345个碱基组成，编码115个氨基酸，可变区含有3个CDR(互补决定簇)区：CDR1编码5个氨基酸，CDR2编码17个氨基酸，CDR3编码7个氨基酸。

编码所述的轻链可变区的基因由354个碱基组成，编码118个氨基酸，可变区含有3个CDR(互补决定簇)区：CDR1编码16个氨基酸，CDR2编码7个氨基酸，CDR3编码7个氨基酸。

上述抗FGF-2抗体Dab-2的用途：由于抗体的生物活性是由抗体轻链和重链可变区中的高变区(CDRs)特异性的基因序列决定的，因此可采用基因工程方法，将编码所述的抗FGF-2抗体Dab-2的基因构建、表达，得到多种形式的小分子基因工程抗体(如Fab抗体、F(ab)2、单链抗体(scFv)、纳米抗体(Nanobody)、抗体融合蛋白)和IgG全抗体。

在原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞和真核细胞获得该抗体基因表达或以此基因为基础改建后的含有该抗体基因可变区的任何其他基因。

该抗FGF-2抗体Dab-2，可在临床上进行如下应用：(1)用于肿瘤的诊断，(2)抑制肿瘤血管新生和抑制肿瘤的生长和转移，(3)抑制肝、肺、肾纤维化的进程。

上述的抗FGF-2抗体Dab-2在制备用于诊断和治疗肿瘤(黑色素瘤)以及抑制内脏(如肾、肝或肺等)纤维化的抗体药物中的应用。

一种抗人FGF-2嵌合抗体，是将上述抗FGF-2抗体Dab-2的轻、重链可变区分别与人源抗体的恒定区融合得到。

一种抗人FGF-2抗体Dab-2嵌合抗体的表达载体，含有编码所述的抗人FGF-2嵌合抗体的基因序列；

所述的抗人FGF-2抗体Dab-2嵌合抗体的表达载体的制备方法，包括以下步骤：

(1)设计引物：

①轻链的上游引物(5’-3’)：

AAGCTTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGCCTACGGGGATGTTTTGATGACCCAAACTCCA；

②轻链的下游引物(5’-3’)：

GGGGCAGCCTTGGGCTGACTTGGTGCAGCCACAGTCCGTTTCAG；

③轻链恒定区上游引物：5’-AGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCT-3’

④轻链恒定区下游引物：5’-TCTAGAATCATTATGAACATTCTGTAGGGG-3’

⑤重链的上游引物：5’-GAGCTCACTCCCAGGTTCAGCTTCAGCAATC-3’；

⑥重链的下游引物：5’-GGGCCCTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGA-3’；

(2)轻链可变区基因片段的制备：以编码所述的轻链可变区的基因序列为模板，使用引物①和引物②扩增轻链可变区基因片段；

(3)人轻链恒定区基因片段的制备：以人B淋巴细胞cDNA为模板，使用引物③和引物④扩增得到人轻链恒定区基因片段；

(4)嵌合抗体轻链基因的制备：以步骤(2)得到的轻链可变区片段和步骤(3)得到的人轻链恒定区片段为模板，使用引物①和引物④扩增得到嵌合抗体轻链基因；

(5)重链可变区基因片段的制备：以编码所述的重链可变区的基因序列为模板，使用引物⑤和引物⑥扩增重链可变区基因片段；

(6)抗人FGF-2抗体Dab-2嵌合抗体表达载体的制备：将步骤(4)制备得到的嵌合抗体轻链基因通过Xba I和HindIII酶切位点克隆入真核表达载体pIgG，得到重组载体pIgG-L；将步骤(5)制备得到的重链可变区基因片段通过SacI和ApaI酶切位点克隆入真核表达载体pIgG-L，得到抗人FGF-2抗体Dab-2嵌合抗体表达载体pIgG-Dab-2。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明所述的抗FGF-2抗体Dab-2具有亲和力高、特异性高的优点。

附图说明

图1是通过ELISA筛选抗bFGF阳性的噬菌体克隆图。

图2是抗FGF-2抗体Dab-2的特异性检测结果图。

图3是抗FGF-2嵌合抗体表达目的蛋白的SDS-PAGE图；泳道1是分子量标准，泳道2～3是纯化样品。

图4是抗FGF-2嵌合抗体的ELISA结果图。

图5是抗FGF-2嵌合抗体抑制黑色素瘤细胞增殖效果图。

图6是抗FGF-2嵌合抗体诱导黑色素瘤的细胞凋亡图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(一)噬菌体抗体库的筛选：

首先将重组人bFGF(北京启维益成公司)用0.05mol/L、pH8.7的碳酸盐缓冲液稀释至50～100μg/mL，用1mL包被免疫管(Immunotube，NUNC公司)，4℃过夜，次日以质量体积比2.5％的脱脂奶粉加满免疫管37℃封闭2h，倒去封闭液，加入1mL噬菌体天然抗体库(约10¹³CFU，Enprobiotech公司，货号：EA001)，37℃孵育2h，吸去噬菌体抗体液，以含体积百分比0.05％吐温20的PBS(0.01M，pH7.2)洗2次(第二轮洗10次，以后洗涤20次以上)，蒸馏水洗涤1次。

然后用2种方法回收结合于固相的噬菌体抗体：①先加入1mL新鲜XL1-Blue菌(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)，37℃孵育15min后转入10mL含20μg/mLAmp(氨苄青霉素)、10μg/mL Tet(四环素)的SB培养基(每升培养基含细菌培养用胰化蛋白陈309g，酵母提取物209g，19gMoPs，pH7.0)；②再将细菌感染回收后的免疫管用蒸馏水洗涤2次，加入1mL洗脱液(0.1mL HCl、以甘氨酸调至pH＝2.2后加入BSA至质量体积比为0.1％)，于37℃静置15min，进行洗脱回收，将洗脱液吸出后，立即加入40μl 2mol/L Tris溶液中和，再加入10mL XL1-Blue细胞(OD600＝0.8)37℃静置15min，接着加入10mL含20μg/mLAmp、10μg/mL Tet的SB培养基。从2次回收的菌液分别取出适量铺盘测定CFU，其余细菌37℃培养3h，扩大体积到50mL，加入1.7×10¹²PFU辅助病毒VCSM13(广州英韦创津生物科技有限公司)，30℃振荡培养过夜。次日回收上清，常规PEG沉淀，所得的次级噬菌体抗体库可进行下一轮的筛选。按相同方法进行3轮淘选，得到阳性噬菌体Fab抗体克隆。

(二)噬菌体抗体的制备及抗bFGF特异性的检测

从筛选第4轮的培养盘随机挑取集落在含有50μg/mL Amp的2YT培养液中37℃过夜培养，第二天取30μl细菌到1mL LB培养基中，37℃培养至对数生长期，加入辅助病毒VCSM13，30℃培养过夜，收取上清。按以下程序进行ELISA检测：将抗原(即bFGF)稀释至10μg/mL，用50μl稀释后的抗原包被ELISA板，2h后弃去孔内液体，用质量体积比3％脱脂奶-PBS溶液(即用0.01M、pH7.2的PBS配制的脱脂奶溶液)封闭后加入噬菌体抗体液(即第三轮筛选获得的阳性噬菌体)，37℃孵育1h，用质量体积比0.05％Tween20-PBS溶液(即用0.01M pH7.2的PBS配制)洗涤3次，加入HRP-抗M13抗体(Promega公司)进行反应，洗涤后加入TMB底物显色，读取A450值。筛选到的具有与bFGF特异性结合的噬菌体抗体克隆的ELISA结果如图1所示，图1的结果表明，通过三轮噬菌体展示筛选，筛选到了抗bFGF阳性的噬菌体Fab抗体克隆，结果显示，Dan-2、Dab-11和Dab-E3均具有很好的bFGF亲和力，其中Dan-2抗体的bFGF亲和性最高。

将筛选获得的亲和力最高的抗bFGF阳性噬菌体抗体克隆Dan-2送上海生物工程有限公司测序，得到如下序列：

编码所述的重链可变区的基因序列如下所示：

CAGGTTCAGCTTCAGCAATCTGGGGCAGAGCTTGTGAGGTCAGGGGCCTCAGTCAAGT

TGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGCACTGGGTGAAGCAGA

GGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGAGAATGGTGATACTGTAT

ATGCCCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATGACTGCAGACACATCCTCCAATACAGCC

TATCTGCAGCTCAGCCGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTACCTATGAT

GGTTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA；

编码所述的轻链可变区的基因序列如下所示：

GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCC

ATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTATACCGTTATGGAGACACCTATTTACATTGGT

ACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAACCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTT

TCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGAT

CAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTC

CTCGGACGTTCGGTGGAGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGACTGTGGCTGCACCA。

分析表明抗FGF-2抗体Dab-2基因序列来自小鼠胚系基因，属于一种新的有功能的抗FGF-2抗体基因。

实施例2

抗人FGF-2抗体Dab-2Fab抗体的构建和表达：

将筛选得到的抗bFGF噬菌体抗体Dab-2通过PCR扩增出轻、重链可变区基因，连接到噬菌粒载体pComb3xTT载体(美国Scripts研究所)中，得到pComb3XTT-Fab-geneIII。再将pComb3XTT-Fab-geneIII中的GIII蛋白基因geneIII切除，命名为pComb3xTT-Fab，将其进行原核表达，通过ELISA检测表达产物中可溶性Fab抗体的活性，结果如图2所示，结果表明，表达的可溶性Fab小分子抗体可特异性的结合人FGF-2，而与VEGF，IL2等没有交叉反应。具体操作过程如下：

(1)以筛选的抗bFGF噬菌体抗体Dab-2的质粒为模板，通过如下引物扩增轻重链可变区基因片段：

重链上游引物A：5’-CTCGAG GAGCTCCAGGTTCAGCTTCAGC-3’；

重链下游引物B：5’-ACTAGT TCTAGATGAGGAGACTGTGAGA-3’；

轻链上游引物C；5’-GAGCTCCTCGAGGATGTTTTGATGA-3’；

轻链下游引物D：5’-TCTAGA ACTAGT TGGTGCAGCCACAGTCC-3’；

反应体系和条件为：实施例1的阳性噬菌体抗体克隆Dan-2的质粒模板1μL，dNTP混合物(浓度2mM)4μL，缓冲液5μL，1μL Blend Taq DNA聚合酶((2.5U/μl)Promega)0.5μl，上游引物和下游引物(10μmol/L)各1μL，添加去离子水至50μL。PCR反应条件为：94℃4min，50℃40Sec，72℃1min，29个循环，最后72℃延伸10min。分别得到重链片段和轻链片段。

(2)通过Sac I(Takara公司)和Xba I(Takara公司)分别双酶切(按说明书操作，37℃酶切6小时)pComb3XTT载体和步骤(1)扩增得到的轻链基因片段，通过酶切产物回收试剂盒回收载体片段和轻链基因片段，再通过T4DNA连接酶(Promega公司，按照说明书操作)连接构建轻链载体pComb3XTT-L。通过Xho I(Takara公司)和Spe I(Takara公司)分别双酶切(按说明书操作，37℃酶切6小时)pComb3XTT-L载体和步骤(1)扩增得到的重链基因片段，通过酶切产物回收试剂盒回收载体片段和重链基因片段，再通过T4DNA连接酶(Promega公司，按照说明书操作)连接构建抗bFGF的抗体表达载体Comb3XTT-Fab-geneIII。以上构建过程，阳性克隆筛选过程如下：连接产物转化大肠杆菌DH5α(Promega公司)，挑取单克隆，提取质粒酶切鉴定。将pComb3XTT-Fab-geneIII阳性克隆送上海生物工程公司测序，证实得到目的载体。

(3)基因III片段的切除：将pComb3XTT-Fab-geneIII的geneIII切除，连接构建成pComb3XTT-Fab。

切除反应过程：pComb3XTT-Fab-geneIII 10μL，Nhe I(TAKARA公司)2μL，Spe I(TAKARA公司)2μL，缓冲液M 3μL，补去离子水至30μL。37℃酶切12小时。通过琼脂糖电泳，按胶回收试剂盒(Qiagen公司)方法回收大片段用于连接反应。

连接反应：回收的酶切产物(0.1μg)10μL，T4DNA连接酶(Promega公司)0.5μL，T4连接酶缓冲液2.5μL，补水至25μL。16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5a(Invitrogen公司)感受态细胞。

(4)可溶性表达：将上述连接反应成功构建的pComb3xTT-Fab可溶性表达载体转化大肠杆菌HB2151菌株(Promega公司)。挑取阳性克隆进行原核表达，将鉴定正确的克隆接种2mL SB培养基(上海华壹生物科技有限公司)，37℃、200rpm的速度振荡培养8～9小时，接着将培养得到的1mL菌液接种至50mL含有浓度20μg/mLAmp的SB培养基振荡培养至OD600≈0.6，加入IPTG至终浓度1mmol/L，30℃诱导培养2～8小时，诱导表达之后将菌体离心，弃去上清，0.01M、pH7.2的PBS重悬菌体，超声破碎。12000g/min离心之后取上清。

(5)表达产物的ELISA鉴定：用0.05mol/L、pH8.7的碳酸盐缓冲液将FGF-2(北京启维益成公司)分别稀释重组VEGF(Sigma公司)、重组VEGF(Sigma公司)、重组白介素-2(IL-2，Sigma公司)和牛血清白蛋白(BSA，Sigma公司)成1000ng/mL包被液。在96孔板中分别加入100μL/孔的重组人FGF-2、100ng/孔重组VEGF、100ng/孔IL-2和BSA包被液，4℃包被过夜。用质量体积比5％的脱脂奶粉溶液室温封闭30分钟，加入100μL PBS(广州展晨生物科技有限公司GMS)洗涤2次，每次5分钟。加入上述制备得到的抗FGF-2Fab抗体的表达上清50μL，37℃孵育1小时，PBS洗涤3次，每次5分钟。加入HRP-羊抗鼠IgG酶标二抗(按体积比为1∶5000稀释，Promega公司)。洗涤5次，每次5分钟，加入TMB底物显色，读取A450值。结果显示，表达的抗FGF-2Fab抗体仅能与FGF-2结合，呈现较高的亲和力，二对其他的VEGF、Il-2、BSA等均没有反应。表面其能够特异性的结合FGF-2。

(三)抗人FGF-2抗体Dab-2轻、重链可变区基因及其编码的多肽产物在制备用于诊断或治疗肿瘤中的应用

以本发明所述的抗体Dab-2轻重链可变区基因出发，可以构建并表达多种形式的蛋白，如用来构建嵌合抗体。用所述抗Dab-2的抗体可变区与人抗体的恒定区通过基因拼接(嵌合PCR)构建成人-鼠嵌合抗体，从抗人FGF-2抗体Dab-2出发构建的人-鼠嵌合抗体抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡的作用见图。由于其完整保留了鼠源抗体的亲和力，同时又能够降低免疫原性，不容易在患者体内产生人抗鼠抗体(HAMA反应)，在肿瘤治疗中将能发挥良好的治疗效果。

以本发明所述的抗体Dab-2轻、重链可变区基因出发，还可以构建人源化抗体：针对可变区的人源化改造，包括CDR移植，表面氨基酸残基修饰，表位导向选择等。与嵌合抗体相比，人源化抗体主要保留了鼠源抗体可变区中的三个CDR区，其余的骨架区均更换成人源的氨基酸，从而进一步降低免疫原性。可更好的开发成抗体药物用于肿瘤等疾病的治疗。小分子抗体Fab，主要由重链的可变区CH1区以及完整的轻链组成；单链抗体ScFv，用一个连接肽(Gly4Ser)3连接重链可变区和轻链可变区构成；双链抗体Dabody，用一个小连接肽Gly4Ser连接重链可变区和轻链可变区构成双链抗体，是二价抗体，故亲和力比ScFv要高。双特异性或双功能抗体，与其他的抗体分子通过构建成双特异性或双功能的Diabody或者全抗体来实现。重组蛋白融合蛋白，通过与其他的效应蛋白融合构成抗体融合蛋白等。

示例：

(1)抗人FGF-2抗体Dab-2嵌合抗体的构建和表达

将所获的的抗FGF-2抗体Dab-2的轻重链可变区基因分别与人源抗体的恒定区通过嵌合PCR方法构建成嵌合抗体。具体过程如下：

①轻链的上游引物(5’-3’)：

AAGCTTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGCCTACGGGGATGTTTTGATGACCCAAACTCCA；

②轻链的下游引物(5’-3’)：

GGGGCAGCCTTGGGCTGACTTGGTGCAGCCACAGTCCGTTTCAG；

③轻链恒定区上游引物：5’-AGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCT-3’

④轻链恒定区下游引物：5’-TCTAGAATCATTATGAACATTCTGTAGGGG-3

⑤重链的上游引物：5’-GAGCTCACTCCCAGGTTCAGCTTCAGCAATC-3’；

⑥重链的下游引物：5’-GGGCCCTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGA-3’；

(2)以上述pComb3XTT-Fab-geneIII表达载体和人B淋巴细胞cDNA(为取外周血淋巴细胞，抽总RNA逆转录得到)为模板，通过嵌合PCR扩增将鼠源的轻链可变区与人源的轻链恒定区构建成嵌合轻链基因片段。其具体过程是：以pComb3XTT-Fab-geneIII表达载体为模板，引物①和引物②扩增轻链可变区，以人B淋巴细胞cDNA为模板，扩增人轻链恒定区。以这两种PCR产物为模板，引物①和引物④扩展全长的嵌合抗体轻链。

扩增轻链可变区基因片段反应体系和条件为：pComb3XTT-Fab-geneIII表达载体1μL，dNTP混合物(浓度2mM)4μL，10×缓冲液5μL，1μL Blend Taq DNA聚合酶(2.5U/μl，Promega)0.5μl，引物①和引物②(10μmol/L)各1μL，添加去离子水至50μL。PCR反应条件为：94℃4min，50℃45Sec，72℃1min，29个循环，最后72℃延伸10min。

扩增人轻链恒定区基因片段反应体系和条件为：人B淋巴细胞cDNA为模板3μL，dNTP混合物(浓度2mM)4μL，10×缓冲液5μL，1μL Blend Taq DNA聚合酶(2.5U/μl，Promega)0.5μl，引物③和引物④(10μmol/L)各1μL，添加去离子水至50μL。PCR反应条件为：94℃4min，50℃40Sec，72℃45Sec，26个循环，最后72℃延伸10min。

嵌合PCR扩增完整嵌合抗体轻链基因片段应体系和条件为：前两部扩增得到的轻链可变区基因片段和人轻链恒定区基因片段各1μL为模板，dNTP混合物(浓度2mM)4μL，缓冲液5μL，1μL Blend Taq DNA聚合酶(2.5U/μl，Promega)0.5μl，引物①和引物④(10μmol/L)各1μL，添加去离子水至50μL。PCR反应条件为：94℃4min，50℃50Sec，72℃1min，28个循环，最后72℃延伸10min。反应产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳，胶回收并纯化，得到PCR扩增的嵌合抗体轻链基因片段。

(3)以引物⑤和引物⑥扩展出鼠源重链可变区基因片段，与pIgG(美国Script研究所，该表达载体包含人的重链恒定区序列)载体上的人重链恒定区链接构成完整的嵌合抗体重链基因片段。

扩增人重链可变区基因片段反应体系和条件为：pComb3XTT-Fab-geneIII表达载体1μL，dNTP混合物(浓度2mM)4μL，缓冲液5μL，1μL Blend Taq DNA聚合酶(2.5U/μl，Promega)0.5μl，引物①和引物②(10μmol/L)各1μL，添加去离子水至50μL。PCR反应条件为：94℃4min，50℃50Sec，72℃1min，28个循环，最后72℃延伸10min。反应产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳，胶回收并纯化，得到PCR扩增的人重链可变区基因片段。

(4)将嵌合抗体的轻链基因片段和重链基因片段连接真核表达载体pIgG。

酶切反应：通过Xba I(Takara公司)和HindIII(Takara公司)分别双酶切(按说明书操作，37℃酶切6小时)pIgG载体和PCR扩增的嵌合抗体轻链基因片段片段，通过酶切产物回收试剂盒回收载体片段和轻链基因片段片段，T4DNA连接酶(Promega公司，按照说明书操作)连接，构建嵌合抗体载体pIgG-L。通过SacI(Takara公司)和ApaI(Takara公司)分别双酶切(按说明书操作，37℃酶切6小时)载体pIgG-L和PCR扩增的嵌合抗体重链基因片段，通过酶切产物回收试剂盒回收载体片段和重链基因片段片段，T4DNA连接酶(Promega公司，按照说明书操作)连接，构建嵌合抗体载体pIgG-Dab-2。以上构建过程，阳性克隆筛选过程如下：连接产物转化大肠杆菌DH5α(Promega公司)，挑取单克隆，提取质粒酶切鉴定。将pIgG-Dab-2阳性克隆送上海生物工程公司测序，证实得到目的载体。

(5)嵌合抗体的表达：将获得的重组pIgG-Dab-2嵌合抗体表达载体质粒通过Fugen 6试剂(Roche公司)，按照试剂说明书操作步骤瞬时转染人胚肾293细胞(中科院上海细胞所)表达。

(6)表达上清纯化过程：收集的细胞表达上清用50％的饱和硫酸铵沉淀，4℃放置过夜后，8500rpm离心20min，弃上清，于沉淀中加入8mL PB(20mM磷酸钠，0.5M NaCl，pH7.4)使之溶解，经PB透析后，用0.45μm滤膜过滤，然后用Ni SepharoseTM 6Fast Flow进行纯化：先用5倍柱体积的平衡缓冲液(20mM磷酸钠，0.5M NaCl，5mM咪唑，pH7.4)平衡，然后以250μl/min的流速上样，上样后用平衡缓冲液(20mM磷酸钠，0.5M NaCl，5mM咪唑，pH7.4)冲洗，然后用含有200mmol/L咪唑的PB洗脱杂蛋白，用含有300mmol/L咪唑的PB洗脱目的蛋白。最后将所收集的目的蛋白30KD超滤管超滤并用PBS(0.015mol/L、pH值7.4)置换，得到抗FGF-2嵌合抗体。用12％SDS-PAGE电泳鉴定纯化后的抗FGF-2嵌合抗体，结果(图3)显示在分子量70kD和40kD左右出现目的蛋白带，分别代表了嵌合抗体的完整重链和轻链。并且纯化后抗体的纯度达到了95％以上。

(7)用ELISA检测表达产物的生物学活性：将重组人FGF-2用0.05mol/L，pH值9.6的碳酸盐缓冲液稀释至0.5μg/mL，以100μL/孔包被ELISA板，37℃孵育3h后弃去孔内液体，PBST(含体积百分比0.05％Tween20和0.015mol/L、pH值7.4的PBS)洗涤3次。用质量百分比5％脱脂奶-PBST封闭后，以100μL/孔加入一定浓度步骤(6)制备的抗人FGF-2抗体Dab-2嵌合抗体，37℃孵育1h，用PBST洗涤3次后，100μL/孔加入按体积比1∶5万稀释的羊抗人IgG1-Fc-HRP多抗(santa cruz公司)，37℃孵育1h，PBS-T洗涤5次之后加入TMB显色，测A450值，实验以PBS为阴性对照。结果如图4所示，结果表明通过真核表达的抗FGF-2嵌合抗体同样具有结合FGF-2的活性。嵌合抗体稀释到60ng时ELISA的光吸收值仍在1.0以上，表面该嵌合抗体具有较好的FGF-2亲和力。

(8)检测该抗FGF-2嵌合抗体的抗肿瘤活性

取对数期黑色素瘤B16细胞(中科院上海细胞所)，转入96孔细胞培养板(1000个细胞/孔)，37℃孵育9h后，加入纯化的腹水型FGF2单抗(200μg/mL)。37℃孵育72h，加入CCK8试剂(CCK8试剂盒，上海生博医学生物工程科技有限公司，产品货号：SUNBIO08008)10μL，37℃孵育2h，酶标仪检测A450值。结果如图5所示，说明嵌合抗体可有效抑制黑色素瘤细胞的增殖，具有较好的抗肿瘤作用。

取对数生长期的黑色素瘤B16细胞，以1×10⁵/mL密度接种于6孔细胞培养板；8h后加入含体积百分比0.5％胎牛血清的DMEM培养基配制的各浓度的FGF2嵌合抗体(50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL)，空白对照组为不含抗体的0.5％血清浓度的DMEM，阴性对照组为与FGF2单抗相同浓度的非免疫IgG，继续培养96h后；根据AnnexinV-FITC/PI试剂盒(广州佰默生物科技有限公司)说明说处理细胞，上流式细胞仪检测。结果如图6所示，说明嵌合抗体可有效诱导黑色素瘤细胞凋亡，表明该抗bFGF嵌合抗体能够通过诱导黑色素瘤发生凋亡，并通过诱发凋亡来抑制黑色素瘤细胞的增殖，从而达到治疗肿瘤的作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种抗FGF-2抗体Dab-2，其特征在于：所述的抗FGF-2抗体Dab-2的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的抗FGF-2抗体Dab-2，其特征在于：编码所述的重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.3所示；编码所述的轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

3.权利要求1或2所述的抗FGF-2抗体Dab-2的应用，其特征在于：所述的抗人碱性成纤维细胞生长因子Dab-2抗体用于制备诊断和治疗黑色素瘤的抗体药物。

4.根据权利要求3所述的抗FGF-2抗体Dab-2的应用，其特征在于：所述的抗体药物为将编码所述的抗FGF-2抗体Dab-2的基因构建、表达，得到的多种形式的小分子基因工程抗体。

5.根据权利要求4所述的抗FGF-2抗体Dab-2的应用，其特征在于：所述的小分子基因工程抗体为Fab抗体、F(ab)₂、单链抗体、纳米抗体、抗体融合蛋白或IgG全抗体。

6.一种抗人FGF-2嵌合抗体，其特征在于：将权利要求1所述的抗FGF-2抗体Dab-2的重链可变区、权利要求1所述的抗FGF-2抗体Dab-2的轻链可变区分别与人源抗体的恒定区融合得到抗人FGF-2嵌合抗体。

7.一种抗人FGF-2抗体Dab-2嵌合抗体的表达载体，其特征在于：含有权利要求2所述的重链可变区的基因序列和所述的轻链可变区的基因序列；

通过包括以下步骤的方法制备得到：

（1）设计引物：

①轻链的上游引物如SEQ ID NO.5所示；

②轻链的下游引物如SEQ ID NO.6所示；

③轻链恒定区上游引物如SEQ ID NO.7所示；

④轻链恒定区下游引物如SEQ ID NO.8所示；

⑤重链的上游引物如SEQ ID NO.9所示；

⑥重链的下游引物如SEQ ID NO.10所示；

（2）轻链可变区基因片段的制备：以编码所述的轻链可变区的基因序列为模板，使用引物①和引物②扩增轻链可变区基因片段；

（3）人轻链恒定区基因片段的制备：以人B淋巴细胞cDNA为模板，使用引物③和引物④扩增得到人轻链恒定区基因片段；

（4）嵌合抗体轻链基因的制备：以步骤（2）得到的轻链可变区片段和步骤（3）得到的人轻链恒定区片段为模板，使用引物①和引物④扩增得到嵌合抗体轻链基因；

（5）重链可变区基因片段的制备：以编码所述的重链可变区的基因序列为模板，使用引物⑤和引物⑥扩增重链可变区基因片段；

（6）抗人FGF-2抗体Dab-2嵌合抗体表达载体的制备：将步骤（4）制备得到的嵌合抗体轻链基因通过XbaⅠ和HindIII酶切位点克隆入真核表达载体pIgG，得到重组载体pIgG-L；将步骤（5）制备得到的重链可变区基因片段通过SacІ和ApaІ酶切位点克隆入真核表达载体pIgG-L，得到抗人FGF-2抗体Dab-2嵌合抗体表达载体pIgG-Dab-2。

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