CN117903299A - 一种特异性识别aav-dj的纳米抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种特异性识别AAV‑DJ的纳米抗体及其应用，属于生物技术领域。本发明通过构建免疫文库和体外筛选的方法，提供了一系列与目前的AAV‑DJ抗体差异化显著、且具有更好临床应用前景的抗AAV‑DJ抗体，该抗体具有良好的亲和力、特异性和稳定性，更重要地，本发明的抗体为纳米抗体，不仅降低了成本，且由于其小尺寸和良好的可渗透性，可以更容易地穿过组织屏障，在体内触发免疫反应的风险相对较低，对环境的耐受性良好，构象稳定且容易合成。该纳米抗体为AAV的广泛应用提供了良好的检测、鉴定、质控、纯化工具，为AAV在基因治疗中的进一步发展提供了可能。
Description
技术领域
本发明涉及一种特异性识别AAV-DJ的纳米抗体及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)是目前发现结构最简单的、无包膜的单链DNA病毒。AAV属于细小病毒家族，病毒基因组长约4.7Kb。天然病毒基因组两端为约145bp长的反向末端重复序列(inverted terminal repeat,ITR),ITR序列之间为AAV病毒的编码区，含有两个开放阅读框(ORF)，左侧ORF编码4种序列相互重叠的基因，分别编码Rep78、Rep68、Rep52、Rep40等四种参与病毒基因复制的蛋白，右侧ORF编码3种Cap蛋白，分别是VP1、VP2、VP3三种组成病毒衣壳的蛋白，其中嵌入部分编码1种AAP蛋白。AAV自身不能复制，必须依赖于其它病毒复制，比如腺病毒、疱疹病毒、杆状病毒等。目前未发现AAV与任何疾病相关。
重组腺相关病毒(Recombinant AAV，rAAV)是经工程改造的AAV载体，它剔除了AAV基因组中编码病毒蛋白Rep或Cap的基因序列，只在两端保留作为包装信号的ITR。rAAV与慢病毒/逆转录病毒相比，由于rAAV基因组不含Rep基因，其感染细胞后不会与宿主基因组整合重组，从而完全避免产生癌症的风险。此外，重组AAV具有感染宿主范围广、感染扩散能力强、免疫原性低、产生中和抗体受限、体内表达时间长等特点，是基因治疗的理想选择。近年来，6种已获批准的体内疗法以及250多项进行中临床试验充分展示了rAAV在人类基因治疗方面的潜力。
目前已在自然界发现数十种不同衣壳蛋白的AAV，不同的AAV具有不同的衣壳蛋白空间结构、序列和组织特异性，因而其识别与结合的细胞表面受体也相应有很大差别，它们在体内会产生不同的抗血清类型。AAV血清型即AAV的抗血清类型，不同血清型转染的组织类型、细胞类型和感染效率也各不相同。在实际应用过程中，不同的AAV血清型具有不同的功能用途，为开发与疾病组织有特异性的体内基因疗法创造了条件。
除了自然界产生的一系列AAV血清型外，科学家还通过理性设计或者定向进化的方法，人为构造了一些具有高转染活性或者组织特异性的新型重组AAV。AAV-DJ是最有代表性的人为产生的AAV血清型之一，它由AAV2/AAV8/AAV9等不同的野生型AAV的编码基因通过同源重组的方式获得。研究表明，AAV-DJ载体被用来敲除猪成纤维细胞中的一个基因，其靶向频率高于其他天然血清型；AAV-DJ在人类角质细胞中的转导效率，也大大优于所有其他血清型；此外人们还发现，AAV-DJ在体内对所有类型的视网膜细胞都有很高的基因转移效率。由于AAV-DJ对多种组织和细胞类型的感染效率高于多数天然AAV血清型，目前已被广泛用于基因递送的研究。
尽管AAV-DJ拥有优良的转染性能，并且被学术界的实验室广泛使用，但其在基因治疗药物的临床研究中的应用仍然非常有限。原因之一在于这种血清型非常新，目前市场上针对AAV-DJ的相关试剂都不完善，特别是缺乏可以高特异性识别AAV-DJ血清型的抗体，使其检测、鉴定、质控和纯化等药物开发的关键环节无法顺利进行，市场迫切需要能够高亲和力、高特异性地识别AAV-DJ的抗体。
另外，目前市场上可见的AAV抗体均为IgG类的单克隆抗体，此类抗体往往通过小鼠免疫和基于杂交瘤技术的抗体发现方法获得。常规的IgG抗体的研发流程较长，抗体表达纯化成本偏高；由于IgG是较为复杂的四聚体分子，抗体本身的稳定性和应用范围都受到限制。
1993年Hamers等报道，骆驼体内存在这天然缺失轻链和重链恒定区1
(CH1)的重链抗体，克隆其可变区得到只由一个重链可变区组成的单域抗体，被称为VHH(variabledomain of heavy chain of heavy-chain antibody)，现已被命名为“纳米抗体“(nanobody,Nb)。纳米抗体的分子量在15kD左右，是具有完整结合功能的最小的抗原结合片段；纳米抗体结构成椭圆形，直径2.5nm，长4nm，特别适合作为蛋白的一个结构域，用于构建功能复杂的多特异性抗体或者融合蛋白；相对于常规的IgG抗体，纳米抗体具有亲和力高、结构稳定、耐热性强等一系列特点；更重要的是，由于纳米抗体可以通过原核生物表达系统大量表达，特别适合工业化的大规模生产，从而用于制备消耗量较大的一些纯化工具。但目前还没有可以特异性识别AAV-DJ血清型的纳米抗体面世。
发明内容
为解决上述问题，本发明采用纯化的AAV-DJ免疫骆驼，通过构建免疫文库和体外筛选的方法，得到可以特异性、高亲和力的识别AAV-DJ的纳米抗体，为AAV-DJ的研究、改造、应用以及临床实验提供了重要的工具。
本发明的第一个目的是提供一种特异性识别AAV-DJ的纳米抗体，所述纳米抗体的重链可变区包括互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，互补决定区包括以下任一组合或与其同源性不低于90％的序列：
1)SEQ ID NO.1所示的CDR1、SEQ ID NO.2所示的CDR2、SEQ ID NO.3所示的CDR3；
2)SEQ ID NO.8所示的CDR1、SEQ ID NO.9所示的CDR2、SEQ ID NO.10所示的CDR3；
3)SEQ ID NO.15所示的CDR1、SEQ ID NO.16所示的CDR2、SEQ ID NO.17所示的CDR3。
进一步地，所述纳米抗体的重链可变区包括框架区FR1、FR2、FR3、FR4，相邻两个框架区之间设置互补决定区，即CDR1、CDR2、CDR3被框架区FR1、FR2、FR3、FR4所隔开。因此纳米抗体上依次设置有FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
进一步地，所述框架区包括以下任一组合或与其同源性不低于90％的序列：
1)SEQ ID NO.4所示的FR1、SEQ ID NO.5所示的FR2、SEQ ID NO.6所示的FR3、SEQID NO.7所示的FR4；
2)SEQ ID NO.11所示的FR1、SEQ ID NO.12所示的FR2、SEQ ID NO.13所示的FR3、SEQ ID NO.14所示的FR4；
3)SEQ ID NO.18所示的FR1、SEQ ID NO.19所示的FR2、SEQ ID NO.20所示的FR3、SEQ ID NO.21所示的FR4。
进一步地，所述纳米抗体含有如SEQ ID NO.22-24任一所示的序列。
本发明的第二个目的是提供编码上述纳米抗体的多核苷酸。
本发明的第三个目的是提供含有上述多核苷酸的表达载体。
进一步地，所述的表达载体选自DNA、RNA、病毒载体(如慢病毒、腺病毒、AAV病毒、逆转录病毒或其组合)、质粒、转座子、其他基因转移系统、脂质体纳米颗粒(LNP，其中包裹的编码AAV-DJ纳米抗体的DNA或mRNA)，或其组合。
进一步地，所述表达载体上含有至少一种控制序列。所述控制序列包括但不限于启动子、终止子、信号肽、RBS等。
本发明的第四个目的是提供含有上述纳米抗体的重组多肽。
本发明的第五个目的是提供含有上述纳米抗体的宿主细胞。
进一步地，所述宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，如植物细胞、动物细胞、微生物等。当被用于制备药物或其他入体材料时，宿主细胞选择对机体具有安全性的宿主。
本发明的第六个目的是提供含有上述纳米抗体的单价抗体、二价抗体或多价抗体。
进一步地，如通过将AAV的抗体与其他识别细胞表面受体的抗体融合，可以设计增加AAV侵染特异性的双特意性抗体。
本发明的第七个目的是提供含有上述纳米抗体的重组蛋白或免疫偶联物。
进一步地，所述重组蛋白含有
(a)抗AAV-DJ纳米抗体，或上述二价或多价抗体；
(b)协助表达和/或纯化的标签序列。
进一步地，所述的标签序列包括但不限于Fc标签、HA标签或6His标签等。如与Fc片段形成的融合蛋白，融合蛋白从N端到C端的结构如式Ia或Ib所示：
A-L-B(Ia)，
B-L-A(Ib)，
其中A为上述抗AAV-DJ纳米抗体，B为IgG的Fc片段，L为无或柔性接头。作为优选，柔性接头为肽接头，更优选地，肽接头具有1-20个氨基酸。IgG的Fc片段包括热的IgG的Fc片段，IgG的Fc片段选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc片段或其组合。
进一步地，所述免疫偶联物含有
(a)抗AAV-DJ纳米抗体，或上述重组蛋白、二价或多价抗体；
(b)选自以下一种或几种的偶联部分：可检测标记物、细胞因子、放射性核素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP，或其组合。
优选地，所述偶联部分选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂，或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶或任何形式的纳米颗粒。
本发明的第八个目的是提供上述纳米抗体、多核苷酸、表达载体、重组多肽、宿主细胞、单价抗体、二价抗体、多价抗体、重组蛋白或免疫偶联物在制备检测、纯化、诊断、预防或治疗产品中的应用。所述产品的形式包括但不限于药剂、试剂、检测板、试剂盒等。
进一步地，制备检测产品时，本发明的抗体抗体可以对AAV的衣壳进行定量(即为AAV检测产品)；制备纯化产品时，可以用带有本发明纳米抗体的亲和柱对AAV进行纯化(即为AAV纯化产品)；制备诊断产品时，可以用本发明纳米抗体检测患者体内AAV的含量变化；制备预防或治疗产品(如基因治疗药物)时，可以用本发明纳米抗体测定AAV含量从而协助指定合适的药物计量，或辅助AAV-DJ试剂的检测、鉴定、质控或纯化等(即辅助制备AAV药物)。
本发明的纳米抗体具有以下有益效果：
(1)特异性：AAV-DJ血清型在实验室的常规研究中运用广泛，因此对AAV-DJ特异性的抗体有较大需求。目前市场上唯一可以结合AAV-DJ的抗体是金斯瑞研发的AAVX，但AAVX识别的是多种AAV血清型共有的抗原表位，无法特异性识别AAV-DJ，也无法在多种AAV血清型中确定AAV-DJ。本发明中的AAV-DJ纳米抗体具有极高的特异性，其只结合AAV-DJ一种血清型，可以容易地将其于其他AAV血清型区分开。
(2)亲和力：从下述记载可以看出，本发明研究的AAV-DJ纳米抗体的亲和力均达到pM级甚至更高。高亲和力是免疫试验成功的前提，也是衡量一个优质单抗的基础指标，高亲和力对于制备优质的抗体药物、诊断试剂、纯化工具等都非常重要。
(3)稳定性：DSF结果显示，本发明公布的AAV-DJ纳米抗体的Tm值都在65℃以上，具有良好的热稳定性，这一特点决定了其更广的运用范围，比如用于AAV-DJ相关基因治疗药物的生产纯化。
附图说明
图1为pAV-CAG质粒图谱。
图2为pAdDeltaF6质粒图谱。
图3为pAAV-DJ质粒图谱。
图4为AAV-DJ银染结果。
图5为ELISA验证富集后的单克隆PPE与AAV-DJ的结合结果。
图6为AAVX、Nb-2B4、Nb-2C4、Nb-2D4和Nb-2A6对5种不同血清型AAV识别结果。
图7为Nb-2B4，Nb-2C4，Nb-2D4对AAV-DJ结合的亲和力分析结果。
图8-10分别为Nb-2B4，Nb-2C4，Nb-2D4的DSF热稳定性分析结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
术语定义
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明的抗体”、“本发明的AAV-DJ纳米抗体”、、“AAV-DJ纳米抗体”具有相同的含义，可互换使用，均指特异性识别和结合于AAV-DJ血清型的抗体。
在本发明中，术语“单域抗体”、“VHH”、“纳米抗体(nanobody)”、“单域抗体”(single domain antibody,sdAb，或纳米抗体nanobody)具有相同的含义并可互换使用，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)。
在本发明中，“多价”是指包含多个重复的AAV-DJ纳米抗体VHH链、AAV-DJ纳米抗体，或含AAV-DJ纳米抗体的融合蛋白。
在本发明中，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(complementaritydeterminingregion，CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈beta-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分beta折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIHPub1.No.91-3242,卷I,647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
在本发明中，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与本发明的抗体或其片段结合而形成的偶联物。
在本发明中，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
在本发明中，术语“可变区”与“互补决定区”可互换使用。
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合AAV-DJ的多肽，例如具有重链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是:(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)或多肽(比如延长半衰期的多肽，如抗血清白蛋白的纳米抗体，或者工程化改造的抗体Fc结构域)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有AAV-DJ结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽，如包含抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据上文所述的氨基酸替换而产生。
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少90％，较佳地至少95％，更佳地至少98％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaC12法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgC12。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.前药激活酶等。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于):腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％，较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约100毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
典型的，所述AAV-DJ纳米抗体可包括至少两条VHH链，且VHH链之间通过连接子进行连接。
在本发明中，所述连接子选自以下序列：(GaSb)x—(GmSn)y，其中a，b，m，n，x，y＝0或1或2或3或4或5或6或7或8或9或10(较佳地，a＝4而b＝1，m＝3而n＝1)，即所述连接子选自下组：GGGGSGGGS。
标记的抗体
在本发明中，所述抗体带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：同位素、胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。
胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，AAV-DJ的抗体用胶体金标记，得到胶体金标记的抗体。
本发明的AAV-DJ纳米抗体能够有效结合细胞表面的受体蛋白。
实施例1AAV-DJ腺相关病毒包被和纯化
使用传统的3质粒包装体系进行AAV-DJ的包装。简而言之，我们混合了三个质粒：一个腺病毒助剂质粒pADdeltaF6，一个编码EGFP报告基因并带有AAV-IRT序列的转运质粒pAV-CAG，以及一个编码AAV-DJ的REP基因和CAP衣壳壳蛋白的质粒pAAV-DJ，比例为1:1:1。将这个混合物转染到293-AAV细胞系中进行AAV的生产。质粒图谱见图1-3。将3种质粒转染进入293T细胞，72小时后收集上清和细胞沉淀，收集所有的细胞用液氮反复冻融三次收集上清液，然后使用Benonase酶消化，所得上清用Biomiga品牌纯化柱纯化，所得病毒分装后于-80℃保存。AAV滴度测定采用国际标准对ITR进行qPCR绝对定量。AAV-DJ的银染结果如图4所示，VP1、VP2、VP3的条带清晰可见。
实施例2骆驼免疫文库构建以及AAV-DJ腺相关病毒纳米抗体的筛选和表达纯化
将纯化的AAV-DJ腺相关病毒与弗氏佐剂1：1等比例混合，采用多点皮下注射的方法对一只健康的羊驼进行四轮免疫，期间抽取少量的血液分离血清，进行血清效价的检测。在最后一次免疫结束7-10天后采集100mL的外周血，并使用Ficoll淋巴细胞分离液(GEHealthcare 17-1440-03FICOLL PAQUE PLUS)进行单个核细胞(PBMC)的分离。
采用酚氯仿抽提PBMC的总mRNA，采用SuperScriptTMIV First-Strand cDNASynthesis Reaction试剂盒(Thermo，18091200)将RNA逆转率为cDNA。用cDNA为模板，用巢式PCR扩增得到重链可变区片段(Q5 High-Fidelity 2X Master NEB,M0492L)。两轮PCR所用的引物如下表1所示：
表1巢式PCR扩增VHH基因所用引物
用Not1和Bstx1限制性内切酶，将第二轮PCR的胶回收的抗体片段和噬菌体载体pADL分别酶切，将酶切产物进行琼脂糖电泳并纯化，之后进行酶连反应。将酶连产物电转化进入TG1感受态细胞(唯地生物,DE1055M)，构建含有纳米抗体片段的大肠杆菌文库。克隆计数表明，文库的库容在2E8；随机挑选40个单克隆进行测序，测序结果显示纳米抗体基因的插入率在95％左右。
将获得的AAV-DJ腺相关病毒免疫文库扩增后，在对数生长期加入VCSM13辅助噬菌体，37℃侵染细菌1小时；离心细菌培养液后，弃去上清并用带有抗生素和0.5％葡萄糖的2xYT培养基重悬细菌，在恒温摇床30℃、225rpm过夜包装噬菌体。次日用聚乙二醇/氯化钠沉淀噬菌体颗粒。并利用噬菌体展示技术进行文库筛选，使用AAV-DJ进行3轮“吸附-洗涤-富集”的筛选过程，富集表达结合AAV-DJ的纳米抗体噬菌体群。从以上富集的噬菌群中分别随机挑选的96个单克隆进行扩增、IPTG诱导表达后，用低渗溶液PPB(磷酸盐蛋白胨缓冲液)涨破细菌外壁获得周质蛋白抽提物(PPE)，采用ELISA鉴定PPE与AAV-DJ的结合。结果显示，96个随机克隆中有7个与AAV-DJ腺相关病毒结合(图5，ELISA读数超过背景5倍以上的克隆被定义为阳性克隆)。
为了鉴定这些克隆对AAV-DJ腺相关病毒的结合是否具有特异性，用选中的7个克隆与胰岛素包被ELISA平板相互作用，结果显示，7个克隆均不与胰岛素发生作用，暗示这些克隆与AAV-DJ腺相关病毒的结合是特异性结合。
将获得的7个与AAV-DJ腺相关病毒特异性结合的克隆全部进行测序鉴定，将测序获得的4个非重复VHH编码序列(分别命名为Nb-2B4、Nb-2C4、Nb-2D4、Nb-2A6)克隆到带有人Fc结构域编码基因的pcDNA3.1-VHH-hFc质粒，转染Expi-293F细胞表达VHH-hFc融合蛋白，经过Protein-A磁珠亲和结合和甘氨酸溶液洗脱等步骤，获得纯化的纳米抗体-Fc融合蛋白。
实施例3抗腺相关病毒纳米抗体与不同血清型腺相关病毒结合的ELISA实验
用50μL 2.5E7vg/μL的不同血清型腺相关病毒包被ELISA板4℃过夜；用0.1％PBST(磷酸盐吐温缓冲液)洗涤3次，加入5％BSA(牛血清白蛋白)150μL，室温1小时；用0.1％PBST洗涤3次，1μg/mL MonoRabTMAAVX VP1/VP2/VP3 Antibody(5G4),mAb,Rabbit(阳性对照)，1μg/mL 4种不同的AAV纳米抗体，室温1小时；用0.1％PBST洗涤3次，加入50μL Goat anti-Rabbit IgG Fc Secondary Antibody,HRP(1:5000)(使用5％BSA稀释)或抗人IgG(Fc特异性)-过氧化物酶抗体，山羊抗，室温1小时；用0.1％PBST洗涤3次，加入50μLTMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)显色8-10分钟，用50μL终止液终止反应；波长450nm处读取每个孔的吸光度。如果纳米抗体与某种血清型结合，相应血清型的读数会增大。
4个候选抗体对不同血清型腺相关病毒的结合见图6。结果表明，4个候选抗体中，Nb-2B4,Nb2C4和Nb2D4等3个抗体在ELISA实验中与AAV-DJ特异性结合，这三个抗体相关的序列信息如下表所示。
表2纳米抗体序列列表
表3纳米抗体序列全长列表
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实施例4采用生物膜干涉技术(BLI)测定纳米抗体与AAV-DJ结合的亲和力
使用Gator Prime系统(Gator Bio)v2.7.3.0728(https://www.gatorbio.com/)，进行了生物层干涉法测定，评估以上三个纳米抗体与AAV-DJ的结合动力学。
将玻璃抗hFc探针(Gator Bio)首先浸入Q缓冲液(Gator Bio)约30秒，得到基线信号。然后，将探针浸入带有300nM纯化的纳米抗体-hFc融合蛋白的Q缓冲液中，持续180秒以装载纳米抗体，然后将探针转入Q缓冲液进行30秒的洗涤步骤。接下来，将结合纳米抗体的探针与浓度为2.0E11 vg/ml的AAV-DJ样品结合180秒，然后浸入Q缓冲液中进行120秒的解离步骤。结合和解离曲线通过GatorPrime(Gator Bio)软件绘制，结果见图7；据此计算出结合动力学值(解离速率常数koff、结合速率常数Kon和结合常数KD)，结果见表4。
表4Gator测定各纳米抗体(VHH-Fc)与AAV-DJ的亲和力数据
实施例5差示扫描荧光法(DSF)检测抗腺相关病毒纳米抗体的溶解温度
使用荧光定量PCR仪Quantstudio5(Thermo Scintific，货号：A28575)进行了纳米抗体Tm值测定，评估纳米抗体热稳定性。
实验开始前，先将荧光定量PCR仪Quantstudio5预热20min。
首先，待测样品的制备：将所有待测样品用ddH2O稀释到0.6mg/ml，50ul，加入50ul用ddH2O稀释到10X的SYPRO orange(Invitrogen，cat.no.S6650)，使SYPRO orange终浓度为5X，混匀，4℃染色30-60min。然后将制备好的样品加入PCR板中，每孔20ul，以蛋白质缓冲液作为空白对照组，并设3组重复。每个检测组同样设3组重复。然后旋转PCR板(200g，室温，1分钟)清除溶液中的气泡。将PCR板放入PCR仪，运行温度扫描从25℃到95℃，1℃/min，选择程序类型“SYBR green”。实验数据如图8-10所示。最后，导出实验数据通过QuantStudioTMDesign&Analysis Software软件分析，从而测定出样品蛋白质的Tm值(表5)。
表5DSF测定各纳米抗体(VHH-Fc)溶解温度(TM)数据
| 抗体 | 溶解温度(℃) |
| Nb-2B4 | 74.2 |
| Nb-2C4 | 79.6 |
| Nb-2D4 | 76.9 |
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种特异性识别AAV-DJ的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的重链可变区包括互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，互补决定区包括以下任一组合或与其同源性不低于90％的序列：
1)SEQ ID NO.1所示的CDR1、SEQ ID NO.2所示的CDR2、SEQ ID NO.3所示的CDR3；
2)SEQ ID NO.8所示的CDR1、SEQ ID NO.9所示的CDR2、SEQ ID NO.10所示的CDR3；
3)SEQ ID NO.15所示的CDR1、SEQ ID NO.16所示的CDR2、SEQ ID NO.17所示的CDR3。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的重链可变区包括框架区FR1、FR2、FR3、FR4，所述框架区包括以下任一组合或与其同源性不低于90％的序列：
1)SEQ ID NO.4所示的FR1、SEQ ID NO.5所示的FR2、SEQ ID NO.6所示的FR3、SEQ IDNO.7所示的FR4；
2)SEQ ID NO.11所示的FR1、SEQ ID NO.12所示的FR2、SEQ ID NO.13所示的FR3、SEQID NO.14所示的FR4；
3)SEQ ID NO.18所示的FR1、SEQ ID NO.19所示的FR2、SEQ ID NO.20所示的FR3、SEQID NO.21所示的FR4。
3.编码权利要求1或2所述的纳米抗体的多核苷酸。
4.含有权利要求3所述的多核苷酸的表达载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体上含有至少一种控制序列。
6.含有权利要求1或2所述的纳米抗体的重组多肽。
7.含有权利要求1或2所述的纳米抗体的宿主细胞。
8.含有权利要求1或2所述的纳米抗体的单价抗体、二价抗体、多价抗体、重组蛋白或免疫偶联物。
9.权利要求1或2所述的纳米抗体、权利要求3所述的多核苷酸、权利要求4或5所述的表达载体、权利要求6所述的重组多肽、权利要求7所述的宿主细胞或权利要求8所述的单价抗体、二价抗体、多价抗体、重组蛋白或免疫偶联物在制备检测、纯化、诊断、预防或治疗产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述检测产品为AAV检测产品；所述纯化产品为AAV纯化产品；所述诊断产品用于对AAV含量进行检测；所述预防或治疗产品为AAV基因治疗药物。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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