CN114957471B - 特异性结合人质膜膜泡关联蛋白pv-1的人源化抗体及其应用 - Google Patents

特异性结合人质膜膜泡关联蛋白pv-1的人源化抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了特异性结合人质膜膜泡关联蛋白PV‑1的人源化抗体及其应用。具体地公开了轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.16、18、20、22或24，和重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.15、17、19、21或23的人源化抗体。本发明通过对鼠源单抗的结构和序列信息进行生物信息学分析，PTMs风险评估，3D同源建模，种系选择，CDR移植，回复突变，改造获得人源化抗体。本发明的人源化抗体非特性吸附能力弱且胶体稳定性强、具有较高的人源化程度、不易引发免疫原性反应、亲和力高，可制成临床上用于治疗PV‑1过表达相关疾病的抗体药物，在药物应用等领域具有十分广阔的前景和重要的生物医学意义。

Description

特异性结合人质膜膜泡关联蛋白PV-1的人源化抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及特异性结合人质膜膜泡关联蛋白PV-1的人源化抗体及其应用。
背景技术
生物机体内代谢旺盛的组织或器官如内分泌腺体、肝血窦、肾小球、骨髓、脾脏、胃肠道上皮等区域，血液-组织间物质交换频繁，血管内皮并非是完全相连。这些区域的血管内皮表面或血管管壁上还往往带有具有众多直径60-80nm的微孔或凹洞，微孔或凹洞具有树枝状隔膜结构。血管-组织间的物质交换及细胞迁移一般有两种途径：1)通过血管内皮细胞之间的空隙；2)通过血管内皮上/血管管壁上的微孔或凹洞。
目前，质膜膜泡关联蛋白(Plasmalemma vesicle-associated protein，即PLVAP，简称PV-1)是唯一已知的构成内皮血管微孔隔膜或质膜凹洞隔膜的蛋白。PV-1是一种特异表达在内皮血管上的II型跨膜糖蛋白，分子量在55-60KD左右。在正常生理状态下，PV-1基因除在一些内分泌腺体如脑垂体、肾上腺及肺组织中表达较高之外，在体内其他组织中表达水平都较低或无表达。但在发生肿瘤、缺氧/外伤及炎症等伴有血管新生的病理变化时，PV-1基因的表达则有明显上调(Madden SL,Cook BP,Nacht M,Weber WD,Callahan MR,Jiang Y,Dufault MR,Zhang X,Zhang W,Walter-Yohrling J,et al:Vascular geneexpression in nonneoplastic and malignant brain.Am J Pathol.2004,165(2):601-608.；Carson-Walter EB,Hampton J,Shue E,Geynisman DM,Pillai PK,Sathanoori R,Madden SL,Hamilton RL,Walter KA:Plasmalemmal vesicle associated protein-1is anovel marker implicated in brain tumor angiogenesis.Clin Cancer Res.2005,11(21):7643-7650.)。
在正常生理状态下，体内存在血管-组织屏障保护的区域如血管-脑组织屏障(blood-brain barrier)和血管-视网膜屏障(blood-retinal barrier)，其内皮血管管壁上一般无质膜微孔，也不表达PV-1蛋白。但病理状态下，如缺血性脑中风(ischemicstroke)、脑水肿、脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)、脑部原发性或转移性肿瘤、糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)等情况下，这些区域的血管-组织屏障结构往往遭到破坏，其内皮血管管壁表现有微孔并伴有PV-1抗原上调表达(Shue,E.H.,Carson-Walter,E.B.,Liu,Y.et al.Plasmalemmal Vesicle Associated Protein-1(PV-1)isamarker of blood-brain barrier disruption in rodent models.BMC Neurosci.2008，9(29):1-9.)。
因此，开发特异性结合PV-1的抗体产品预期可治疗缺血性脑卒中、脑水肿、年龄相关性黄斑变性(Age-related Macular Degeneration，AMD)、糖尿病黄斑水肿(DiabeticMacular Edema，DME)和成年患者视网膜静脉阻塞引起的黄斑水肿等疾病。目前，市场上有特异性结合PV-1鼠源相关单抗，但鼠源单抗临床应用可能出现免疫原性问题，在临床治疗时会引起人抗鼠抗体反应(human anti-mouse antibody，HAMA)，并且鼠源单抗在人血循环中的半衰期短，发挥ADCC与CDC作用的时间较短，严重限制了鼠单克隆抗体的进一步应用。
人源化抗体是鼠源单克隆抗体通过基因克隆及DNA重组技术等进行改造，重新表达的抗体，其可变区部分或抗体全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。开发人质膜膜泡关联蛋白PV-1鼠源单抗的人源化抗体，可提高抗体在临床应用的安全性，对PV-1抗体的进一步临床推广具有重要意义，为新药的开发和相关疾病的治疗开辟了新的路径。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性结合PV-1蛋白的人源化抗体或其抗原结合片段，以解决目前PV-1靶点的鼠源抗体出现的免疫原性问题。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为了实现上述目的，本发明首先提供了特异性结合PV-1蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可为SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20、SEQ ID No.22或SEQ ID No.24。
所述特异性结合PV-1蛋白的抗体为人源化抗体，所述人源化抗体是在特异性结合PV-1蛋白的鼠源单抗的基础上进行人源化改造，获得的人源化抗体分子。其中作为人源化改造基础的鼠源单抗包含重链可变区和轻链可变区，其中：
所述鼠源单抗的重链可变区包含氨基酸序列分别是SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3；
所述鼠源单抗的轻链可变区包含氨基酸序列分别是SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和SEQ ID No.10的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3。
H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3为重链可变区中的三个互补决定区(CDR)，L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3为轻链可变区中的三个互补决定区(CDR)。互补决定区的序列(SEQ ID No.5-10)根据组合的Kabat和Chothia编号系统定义。
所述鼠源单抗的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.1，所述鼠源单抗的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.2。SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为根据Kabat编号系统定义的序列。
所述PV-1蛋白为质膜膜泡关联蛋白(Plasmalemma vesicle-associatedprotein，即PLVAP，简称PV-1)，是唯一已知的构成内皮血管微孔隔膜或质膜凹洞隔膜的蛋白。
进一步地，所述抗体可为全长抗体，所述抗原结合片段可为Fab片段、Fv片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、单链抗体(ScFv)、纳米抗体(单域抗体)、双特异性抗体或最小识别单位(MRU)。
本发明所述人源化抗体可包含来源于人抗体的框架区或框架区变体。
进一步地，本发明所述人源化抗体的框架区可来源于人生殖系IGHV1-46*01(SEQID No.3)和IGKV1-17*01(SEQ ID No.4)。
进一步地，所述人源化抗体的重链可变区的框架区采用生殖系IGHV1-46*01(SEQID No.3)作为抗体重链可变区的框架；所述人源化抗体的轻链可变区的框架区采用生殖系IGKV1-17*01(SEQ ID No.4)作为抗体轻链可变区的框架。
进一步地，上述抗体或其抗原结合片段中，所述重链可变区的氨基酸序列可为SEQID No.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19、SEQ ID No.21或SEQ ID No.23。
不同的重链可变区(SEQ ID No.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19、SEQ ID No.21或SEQ ID No.23)和轻链可变区(SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20、SEQ IDNo.22或SEQ ID No.24)进行自由组合，共计包含25个抗体分子，分别命名为HLPV-01～25，25个抗体重链可变区与轻链可变区的组合关系参见表4。
进一步地，所述抗体或其抗原结合片段包括下述任一重链可变区和轻链可变区：
A1)氨基酸序列为SEQ ID No.19的重链可变区和氨基酸序列为SEQ ID No.18的轻链可变区；
A2)氨基酸序列为SEQ ID No.19的重链可变区和氨基酸序列为SEQ ID No.24的轻链可变区；
A3)氨基酸序列为SEQ ID No.21的重链可变区和氨基酸序列为SEQ ID No.24的轻链可变区；
A4)氨基酸序列为SEQ ID No.23的重链可变区和氨基酸序列为SEQ ID No.22的轻链可变区；
A5)氨基酸序列为SEQ ID No.23的重链可变区和氨基酸序列为SEQ ID No.24的轻链可变区；
A6)氨基酸序列为SEQ ID No.19的重链可变区和氨基酸序列为SEQ ID No.22的轻链可变区；
A7)氨基酸序列为SEQ ID No.21的重链可变区和氨基酸序列为SEQ ID No.20的轻链可变区；
A8)氨基酸序列为SEQ ID No.21的重链可变区和氨基酸序列为SEQ ID No.22的轻链可变区。
在本发明的一个实验方案中，所述人源化抗体为HLPV-12、HLPV-15、HLPV-20、HLPV-24和HLPV-25，其中：
HLPV-12的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ ID No.19和SEQ IDNo.18；重链可变区H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7；轻链可变区L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNo.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10。
HLPV-15的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ ID No.19和SEQ IDNo.24；重链可变区H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7；轻链可变区L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNo.12、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10；其中L-CDR1(SEQ ID No.12)是在SEQ ID No.8的基础上进行了突变改造，具体为将SEQ ID No.8的第9位的Asn(N)突变为Gln(Q)。
HLPV-20的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ ID No.21和SEQ IDNo.24；重链可变区H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7；轻链可变区L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNo.12、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10；其中L-CDR1(SEQ ID No.12)是在SEQ ID No.8的基础上进行了突变改造，具体为将SEQ ID No.8的第9位的Asn(N)突变为Gln(Q)。
HLPV-24的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ ID No.23和SEQ IDNo.22；重链可变区H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID No.5、SEQ IDNo.11、SEQ ID No.7；轻链可变区L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNo.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10；其中H-CDR2(SEQ ID No.11)是在SEQ ID No.6的基础上进行了突变改造，具体为将SEQ ID No.6的第6位的Asn(N)突变为Gln(Q)。
HLPV-25的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ ID No.23和SEQ IDNo.24；重链可变区H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID No.5、SEQ IDNo.11、SEQ ID No.7；轻链可变区L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNo.12、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10；其中H-CDR2(SEQ ID No.11)是在SEQ ID No.6的基础上进行了突变改造，具体为将SEQ ID No.6的第6位的Asn(N)突变为Gln(Q)；其中L-CDR1(SEQ ID No.12)是在SEQ ID No.8的基础上进行了突变改造，具体为将SEQ ID No.8的第9位的Asn(N)突变为Gln(Q)。
在本发明的一个实验方案中，所述人源化抗体为HLPV-14、HLPV-18和HLPV-19。
HLPV-14的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ ID No.19和SEQ IDNo.22；重链可变区H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7；轻链可变区L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNo.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10。
HLPV-18的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ ID No.21和SEQ IDNo.20；重链可变区H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7；轻链可变区L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNo.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10。
HLPV-19的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ ID No.21和SEQ IDNo.22；重链可变区H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7；轻链可变区L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNo.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10。
进一步地，上述抗体或其抗原结合片段中，所述抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区可为人IgG1或其变体的重链恒定区和/或所述轻链恒定区可为人Kappa(κ)或其变体的轻链恒定区。
本发明所述人源化抗体重链可变区碳端(C端)融合IgG1-Fc，轻链可变区碳端(C端)融合κ恒定区。
本发明所述人源化抗体还可包括选自IgG4或其变体的重链恒定区和/或选自Lambda亚型的轻链恒定区。
所述人IgG1恒定区重链基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.25、SEQ ID No.26或SEQ ID No.27的第409-1398位。
所述人Kappa恒定区(κ恒定区)轻链基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.28、SEQ IDNo.29或SEQ ID No.30的第394-714位。
本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为下述B1)至B7)中的任一种：
B1)编码任一所述抗体或其抗原结合片段的核酸分子；
B2)编码任一所述抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链的核酸分子；
B3)编码任一所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区和/或轻链可变区的核酸分子；
B4)含有B1)-B3)任一所述核酸分子的表达盒；
B5)含有B1)-B3)任一所述核酸分子的重组载体、或含有B4)所述表达盒的重组载体；
B6)含有B1)-B3)任一所述核酸分子的重组微生物、或含有B4)所述表达盒的重组微生物、或含有B5)所述重组载体的重组微生物；
B7)含有B1)-B3)任一所述核酸分子的细胞系、或含有B4)所述表达盒的细胞系、或含有B5)所述重组载体的细胞系。
其中，B6)所述的重组微生物和B7)所述的细胞系可表达本发明所述抗体或其抗原结合片段。
上述生物材料中，所述核酸分子可为下述任一种：
C1)基因序列是SEQ ID No.25、SEQ ID No.26或SEQ ID No.27的重链DNA分子；
C2)基因序列是SEQ ID No.28、SEQ ID No.29或SEQ ID No.30的轻链DNA分子；
C3)基因序列是SEQ ID No.25、SEQ ID No.26或SEQ ID No.27的第73-408位的重链可变区DNA分子；
C4)基因序列是SEQ ID No.28、SEQ ID No.29或SEQ ID No.30的第73-393位的轻链可变区DNA分子；
C5)编码序列是SEQ ID No.25、SEQ ID No.26或SEQ ID No.27的第16-408位的DNA分子；
C6)编码序列是SEQ ID No.28、SEQ ID No.29或SEQ ID No.30的第16-393位的轻链可变区DNA分子。
在本发明的一个实验方案中，所述人源化抗体HLPV-12、HLPV-15、HLPV-20、HLPV-24和HLPV-25的基因如下所示：
HLPV-12重链基因的核苷酸序列为SEQ ID No.25；轻链基因的核苷酸序列为SEQID No.28；
HLPV-15重链基因的核苷酸序列为SEQ ID No.25；轻链基因的核苷酸序列为SEQID No.30；
HLPV-20重链基因的核苷酸序列为SEQ ID No.26；轻链基因的核苷酸序列为SEQID No.30；
HLPV-24重链基因的核苷酸序列为SEQ ID No.27；轻链基因的核苷酸序列为SEQID No.29；
HLPV-25重链基因的核苷酸序列为SEQ ID No.27；轻链基因的核苷酸序列为SEQID No.30。
上述基因的核苷酸序列中：
重链基因1-6位为BstBI酶切位点，7-15为Kozak序列，16-72为信号肽基因，73-1398重链基因序列，1399-1401为终止密码子，1402-1409为PacI识别位点，其中第73-408位核苷酸序列为重链可变区基因序列，409-1398为恒定区基因序列；
轻链基因的核苷酸序列其中1-6位为HindIII酶切位点，7-15为Kozak序列，16-72为信号肽基因，73-714轻链基因序列，715-717为终止密码子，718-723为XhoI识别位点，其中第73-393位核苷酸为轻链可变区基因序列，394-714为恒定区基因序列。
本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、病毒载体(如杆状病毒载体、逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒或疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)等)。在本发明的一个实施例中，载体具体可为pUC57或pCGS3。
本文所述微生物可为酵母、细菌或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产碱菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽胞杆菌属(Bacillus)等；酵母可为毕赤酵母(P.pastoris)。
所述细胞系(宿主细胞)是指可用于导入载体的细胞，其包括但不限于：真核细胞(如酵母细胞、曲霉菌)、动物细胞(如哺乳动物细胞、昆虫细胞)或原核细胞。在本发明的一个实施例中，所述细胞系具体可为ExpiCHO-S细胞。
术语“细胞”和“细胞系”可互换使用，并且所有这类名称都包括其后代。
在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体可为pCGS3-HLPV-01～25重组表达质粒。
所述pCGS3-HLPV-01～25重组表达质粒分别表达人源化抗体HLPV-01～25的重链和轻链基因。
本发明还提供了制备所述抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养所述重组细胞，和从培养的重组细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了特异性结合PV-1蛋白的人源化抗体分子的制备方法，所述方法具体包括：将所述特异性结合PV-1蛋白的人源化抗体分子的编码基因通过含有所述编码基因的重组表达载体导入宿主细胞中，得重组细胞，培养所述重组细胞上清，通过亲和层析纯化获得目的蛋白。
上述方法中，所述宿主细胞可为真核细胞，如CHO细胞，HEK293细胞，酵母细胞或昆虫细胞等。在本发明的一个实施例中，所述动物细胞为CHO细胞。
本发明还提供了改善、预防或治疗PV-1过表达相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包含本发明任一所述抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体可为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂但不限于此。
其中，所述药物组合物用于改善、预防或治疗PV-1过表达相关疾病(如年龄相关性黄斑变性、糖尿病黄斑水肿、成年患者视网膜静脉阻塞引起的黄斑水肿、肝癌、缺血性脑中风或脑水肿等)。
进一步地，本发明的药物组合物可包含第一抗体和第二抗体或其抗原结合片段，其中第一抗体为本发明的人源化抗体，而第二抗体可为具有治疗活性(如具有改善、预防或治疗PV-1过表达相关疾病的功能)的其他任何抗体。
本发明还提供了用于检测PV-1的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒含有本发明任一所述的抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了缀合物(conjugate)，所述缀合物包含本发明所述的抗体或其抗原结合片段，以及与所述抗体或其抗原结合片段连接的可检测的标记；具体地，所述可检测的标记可选自酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。
本发明还提供了本发明任一所述抗体或其抗原结合片段，和/或，所述生物材料的下述任一种应用：
D1)在制备用于改善、预防或治疗PV-1过表达相关疾病的药物中的应用；
D2)在制备用于诊断或筛查PV-1过表达相关疾病的产品中的应用；
D3)在检测PV-1中的应用；
D4)在制备用于检测PV-1的产品中的应用；
D5)在制备用于结合PV-1蛋白的产品中的应用。
上述应用中，所述PV-1过表达相关疾病可包括年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病黄斑水肿(DME)、成年患者视网膜静脉阻塞引起的黄斑水肿、肝癌、缺血性脑中风或脑水肿但不限于此。
所述用于检测PV-1的产品包括利用酶联免疫吸附法、免疫荧光检测法、放射免疫法、发光免疫测定法、胶体金免疫层析法、凝集法或免疫比浊法等检测抗原抗体结合的产品。
进一步地，所述产品可为试剂、试剂盒或芯片。
本发明所述药物、试剂、试剂盒或芯片含有本文任一所述抗体或其抗原结合片段或其组合。所述试剂盒可为化学发光免疫试剂盒、酶联免疫检测试剂盒、胶体金免疫试剂盒、或荧光免疫试剂盒，但不限于此。
本发明还提供了鼠源抗体人源化改造的方法，包括如下步骤：
(1)基于鼠源抗体的可变区序列和结构信息的人源抗体模板的选择：将需人源化的鼠源抗体轻、重链可变区的序列通过序列相似性搜索，筛选出与轻、重链同源性最高的人源抗体可变区作为候选的人源化模板；
(2)抗原结合区的移植(CDR移植)：将鼠源抗体的CDR移植到人源化模板抗体相应位置上，构建CDR移植人源化抗体；
(3)对起关键作用的残基进行改变(如蛋白质翻译后修饰位点，即PTMs位点的突变)，进一步优化人源化抗体。
进一步地，筛选出同源性最高的人源抗体可变区生殖系序列分别为IGHV1-46*01(SEQ ID No.3)和IGKV1-17*01(SEQ ID No.4)。
进一步地，可对潜在的天冬酰胺脱酰胺(NG，H:55-56)和糖基化位点(NLS，L:32-34)进行突变改造。
进一步地，CDR移植以及与生殖系不同的且与CDR距离5埃以内的氨基酸回复突变。
进一步地，所述改造方法包括：
将生殖系抗体框架(SEQ ID No.3)与鼠源单抗重链可变区(SEQ ID No.1)不同且与CDR距离5埃以内的氨基酸进行回复突变，包括无突变(SEQ ID No.15)，1个突变(SEQ IDNo.17)，2个突变(SEQ ID No.19)，3个突变(SEQ ID No.21)或4个突变(CDR1区PTMs突变，SEQ ID No.23)不同突变。分别进行CDR移植，其中抗原互补决定区CDR1，CDR2和CDR3分别为SEQ ID No.5，SEQ ID No.6(SEQ ID No.11)及SEQ ID No.7所示的氨基酸序列；
将生殖系抗体框架(SEQ ID No.4)与鼠源单抗轻链可变区(SEQ ID No.2)不同且与CDR距离5埃以内的氨基酸进行回复突变，包括无突变(SEQ ID No.16)，1个突变(SEQ IDNo.18)，2个突变(SEQ ID No.20)，3个突变(SEQ ID No.22)或4个突变(CDR1区PTMs突变，SEQ ID No.24)不同突变。分别进行CDR移植，其中抗原互补决定区CDR1，CDR2和CDR3分别为SEQ ID No.8(SEQ ID No.12)，SEQ ID No.9及SEQ ID No.10所示的氨基酸序列。
具有改善的亲和力和/或效价的本发明所述抗体的变体可通过采用在本领域已知的方法来获得，并包括在本发明的范围内。例如，氨基酸置换可用于获得具有进一步改善的亲合力的抗体。或者，核苷酸序列的密码子优化也可用来改善用于产生抗体的表达系统中的翻译效率。此外，包含通过对本发明的任何核酸序列应用定向进化法而优化抗体特异性或中和活性的序列的多核苷酸也属于本发明的范围内。
术语“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。所述抗原结合片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。通常，当基于摩尔来表示活性时，所述抗原结合片段保留至少10％的母体结合活性。具体地，所述抗原结合片段保留至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。
术语“Fab片段”是由重链Fd和完整轻链通过二硫键结合而成的异二聚体，仅含一个抗原结合位点。将重链Fd和完整轻链的编码基因连接，融合细菌蛋白信号肽基因后可在大肠杆菌内分泌表达Fab抗体(Fab片段)，并有完整的立体折叠和链内、链间二硫键。所述重链Fd指Fab中约1/2的H链部分(约含225个氨基酸残基，包括VH、CH1和部分铰链区)。
术语“Fv片段”是指可分别构建含有VH和VL基因的载体，共转染细胞，使之分别表达，再组装成功能性Fv抗体；也可在载体中的VH和VL之间设置终止密码，分别表达两个小分子蛋白片段，再通过非共价键结合而形成Fv抗体(Fv片段)。
术语“Fab′片段”含有一条轻链和包含VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间区域的一条重链的部分，由此可在两个Fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab′)2分子。
术语“F(ab′)2片段”含有两条轻链和两条包含CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab′)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段组成。
术语“单链抗体(ScFv)”是指用适当的寡核苷酸接头(linker)连接轻链和重链可变区基因，使之表达单一的多肽链，称为单链抗体(ScFv)。多肽链能自发折叠成天然构象，保持Fv的特异性和亲和力。
术语“纳米抗体(单域抗体)”是指将抗体重链V区通过基因工程方法表达，获得仅含VH片段的抗体。单域抗体与抗原结合的能力及其稳定性，与完全抗体基本一致。
术语“双特异性抗体”是指将两套轻链、重链基因导入骨髓瘤细胞中，选择合适的抗体恒定区及Ig类型，可获得产量大、均一性和纯度高的双特异性抗体。另外，以化学交联技术或杂交-杂交瘤技术也可获得双特异性抗体。
术语“最小识别单位(MRU)”是指仅含可变区中单一CDR结构，分子质量仅为完整抗体的1％左右，可结合相应抗原。
本发明的抗体可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明抗体的重链和轻链基因的DNA分子。将所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体。本领域技术人员可根据需要选择本领域常规的宿主细胞、表达载体、将表达载体导入宿主细胞的方法以及抗体的分离纯化方法。
本领域技术人员熟知，所述抗原结合片段可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。
本发明在特异性结合PV-1蛋白的鼠源单抗的基础上进行人源化改造，即对鼠源单抗的结构和序列信息进行生物信息学分析，PTMs风险评估，3D同源建模，种系选择，CDR移植，回复突变，最终改造出一组特异性结合PV-1抗原(PV-1蛋白)的人源化抗体。通过实验验证，最终获得特异结合PV-1抗原、非特性吸附能力弱且胶体稳定性强的一组人源化抗体HLPV-12、HLPV-15、HLPV-20、HLPV-24和HLPV-25，本发明人源化抗体具有较高的人源化程度，不易引发免疫原性反应，亲和力高，克服了鼠单抗在临床应用的局限性，优于Adalimumab和Ipilimumab两个上市产品，预期可更有效地治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性黄斑水肿(DME)和成年患者视网膜静脉阻塞引起的黄斑水肿，肝癌、缺血性脑中风或脑水肿等疾病，可制成临床上用于预防和治疗相关疾病的特异性抗体药物，或制成诊断试剂或试剂盒等，在药物应用和临床诊断等领域具有十分广阔的前景和重要的生物学及医学意义。
附图说明
图1为人源化抗体重组表达质粒轻链构建核酸电泳鉴定图。轻链采用HindIII和XhoI酶切鉴定，酶切后理论获得载体片段9535bp和轻链723bp，其中泳道编号1为pCGS3-01L、2为pCGS3-03L、3为pCGS3-04L、4为pCGS3-05L、5为pCGS3-06L、6为pCGS3-07L和7为pCGS3-08L。
图2为人源化抗体重组表达质粒重链构建核酸电泳鉴定图。重链采用BstBI和PacI酶切鉴定，酶切后理论获得载体片段10200bp和轻链1409bp，其中泳道编号1为pCGS3-01(对照1)重组表达质粒、2为pCGS3-02(对照2)重组表达质粒、3至27依次为pCGS3-HLPV-01～25共计25个人源化抗体重组表达质粒。
图3为人源化抗体SDS-PAGE蛋白鉴定图。其中泳道编号1为鼠源嵌合抗体(对照1)抗体、2为PTMs突变的鼠源嵌合抗体(对照2)、3至27依次为HLPV-01～25共计25个人源化抗体。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的主要试剂及其厂家信息如下：
ExpiCHO-STM Cells：Thermo公司；
ExpiCHOTM Expression Medium：Thermo公司；
ExpiFectamineTM CHO Transfection Kit：Thermo公司；
pCGS3表达载体：Merck公司；
重组人PLVAP/PV-1蛋白：Abcam公司；
Protein A预装色谱柱：生工生物工程(上海)股份有限公司；
Centrifugal FiltersR-10K：Millipore公司；
Centrifugal Filters 0.5ml 10K-10K：Millipore公司；
PBS pH7.4(1×)：Thermo公司；
Sure PAGETM，Bis-Tris，10x8，4-12％，12wells：南京金斯瑞生物科技有限公司。
下述实施例中的关键仪器及其厂家信息如下：
电穿孔仪：Bio-Rad公司；
凝胶成像系统：Protein Simple公司；
eStainTML1蛋白染色仪：南京金斯瑞生物科技有限公司；
Biacore T200分子间相互作用分析系统：GE公司；
UltiMate3000高效液相色谱仪：Thermo公司。
实施例1、鼠源单抗人源化改造
本实施例针对特异性结合人质膜膜泡关联蛋白PV-1的鼠源单抗进行人源化改造，其中：鼠源单抗的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，鼠源抗体结构分析重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)包含的互补决定区(CDR)参见表1。
表1、鼠源单抗重、轻链CDR序列统计表
Kabat Chothia Kabat+Chothia 序列表
H-CDR1 DYYMY GYTFTDY GYTFTDYYMY SEQ ID No.5
H-CDR2 EINPTNGDVNFNEMFKS NPTNGD EINPTNGDVNFNEMFKS SEQ ID No.6
H-CDR3 TSIH IHY TSIHY SEQ ID No.7
L-CDR1 KASQDIKTNLS KASQDIKTNLS KASQDIKTNLS SEQ ID No.8
L-CDR2 YATDLAD YATDLAD YATDLAD SEQ ID No.9
L-CDR3 LQHDDRPFT LQHDDRPFT LQHDDRPFT SEQ ID No.10
其中H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3为重链可变区中的三个互补决定区(CDR)；L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3为轻链可变区中的三个互补决定区(CDR)。Kabat表示根据Kabat编号系统定义的序列；Chothia表示根据Chothia编号系统定义的序列；Kabat+Chothia表示根据组合的Kabat和Chothia编号系统定义的序列。SEQ ID No.5-10为根据组合的Kabat和Chothia编号系统定义的序列。SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为根据Kabat编号系统定义的序列。
药物发现早期阶段通常采用计算机虚拟计算的方式对蛋白序列进行初步的评估，寻找潜在的蛋白质翻译后修饰(Protein translational modifications，PTMs)位点如脱酰胺(Deamidation)、天冬氨酸异构化(Aspartic Acid Isomerization)、糖基化(Glycosylation)、氧化(Oxidation)等。
为了优化抗体分子的成药性，避免潜在翻译后修饰位点对蛋白质折叠、活性以及功能的影响，本发明人对鼠源单抗进行了成药性改造设计。针对鼠源单抗翻译后修饰位点进行改造，可以改善抗体的成药性，使抗体具有更大的治疗优势。
表2列出鼠源单抗潜在的PTMs位点，其中潜在的天冬酰胺脱酰胺(NG，H:55-56)和糖基化位点(NLS，L:32-34)经评估后有较高的风险。
表2 鼠源单抗重轻、链可变区潜在翻译后修饰预测
将鼠源抗体的重链可变区(SEQ ID No.1)和轻链可变区(SEQ ID No.2)的序列分别与人抗体种系数据库(Vbase)比对，筛选出同源性最高的生殖系序列分别为IGHV1-46*01(SEQ ID No.3)和IGKV1-17*01(SEQ ID No.4)作为人源化的基础，用于抗体的CDR移植。去除抗体CDR区域较高的风险PTMs，获得对照抗体(PTMs突变抗体)重链可变区(SEQ IDNo.13)和轻链可变区(SEQ ID No.14)。CDR移植以及与生殖系不同的且与CDR距离5埃以内的氨基酸回复突变，设计不同重链可变区与轻链可变区的抗体序列见表3。
表3 鼠源单抗重、轻链可变区人源化设计统计表
根据表3设计的重链可变区和轻链可变区序列，重链可变区碳端融合IgG1-Fc，轻链可变区碳端融合κ恒定区，组装全抗分子，人源化设计抗体表达组合如表4所示：
表4 人源化抗体的重链可变区和轻链可变区设计组合统计表
01L 03L 04L 05L 06L 07L 08L
01H 对照1
03H 对照2
04H HLPV-01 HLPV-02 HLPV-03 HLPV-04 HLPV-05
05H HLPV-06 HLPV-07 HLPV-08 HLPV-09 HLPV-10
06H HLPV-11 HLPV-12 HLPV-13 HLPV-14 HLPV-15
07H HLPV-16 HLPV-17 HLPV-18 HLPV-19 HLPV-20
08H HLPV-21 HLPV-22 HLPV-23 HLPV-24 HLPV-25
备注：对照1为鼠源嵌合抗体、对照2为PTMs突变的鼠源嵌合抗体。
实施例2、重组表达质粒构建工作
根据表3鼠源单抗重轻、链可变区人源化设计序列和表4人源化设计全抗表达组合(重链可变区碳端融合IgG1-Fc，轻链可变区碳端融合κ恒定区)，委托生工生物进行人源化设计序列密码子优化，合成全抗体重链基因序列至pUC57克隆载体的限制性核酸内切酶SmaI单酶切位点之间，合成全抗体轻链基因序列至pUC57克隆载体的限制性核酸内切酶SmaI和HindIII的酶切位点之间，对应合成质粒名称如表5。
表5 全抗表达组合重、轻链质粒统计表
序号 重链可变区 重链质粒 序号 轻链可变区 轻链质粒
01H SEQ ID No.1 pUC57-01H 01L SEQ ID No.2 pUC57-01L
03H SEQ ID No.13 pUC57-03H 03L SEQ ID No.14 pUC57-03L
04H SEQ ID No.15 pUC57-04H 04L SEQ ID No.16 pUC57-04L
05H SEQ ID No.17 pUC57-05H 05L SEQ ID No.18 pUC57-05L
06H SEQ ID No.19 pUC57-06H 06L SEQ ID No.20 pUC57-06L
07H SEQ ID No.21 pUC57-07H 07L SEQ ID No.22 pUC57-07L
08H SEQ ID No.23 pUC57-08H 08L SEQ ID No.24 pUC57-08L
其中pUC57-01H、pUC57-03H、pUC57-04H、pUC57-05H、pUC57-06H、pUC57-07H、pUC57-08H为重链克隆载体，其含有完整的重链基因，该重链基因是分别将重链可变区基因(SEQ ID No.1、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19、SEQ ID No.21和SEQ ID No.23的编码基因)的3’端与人IgG1恒定区重链基因(IgG1-Fc)连接得到的融合基因。其中人IgG1恒定区重链基因的核苷酸序列为SEQ ID No.25、SEQ ID No.26或SEQ IDNo.27的第409-1398位。
其中pUC57-01L、pUC57-03L、pUC57-04L、pUC57-05L、pUC57-06L、pUC57-07L、pUC57-08L为轻链克隆载体，其含有完整的轻链基因，该轻链基因是分别将轻链可变区基因(SEQ ID No.2、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20、SEQ ID No.22和SEQ ID No.24的编码基因)的3’端与人Kappa恒定区(κ恒定区)轻链基因连接得到的融合基因。其中人Kappa恒定区(κ恒定区)轻链基因的核苷酸序列为SEQ ID No.28、SEQ IDNo.29或SEQ ID No.30的第394-714位。
上述重组表达质粒的构建策略为先构建轻链，轻链构建完成后，按照表4不同组合方式构建重链，共计构建7个轻链中间质粒和27个全抗分子，具体步骤如下：
第一步构建抗体轻链中间质粒，操作步骤为：采用HindIII(NEB)和XhoI(NEB)分别双酶切pCGS3载体(Merck)、pUC57-01L、pUC57-03L、pUC57-04L、pUC57-05L、pUC57-06L、pUC57-07L和pUC57-08L轻链克隆载体，获得9535bp载体片段和7条723bp轻链基因片段，分别采用T4连接酶(TAKARA)连接载体片段和轻链基因片段，转化，涂板，提取质粒，HindIII和XhoI双酶切鉴定，酶切条带符合预期(图1)，最终得到7个轻链中间质粒，分别命名为pCGS3-01L、pCGS3-03L、pCGS3-04L、pCGS3-05L、pCGS3-06L、pCGS3-07L和pCGS3-08L。
第二步构建抗体重链和轻链表达载体，操作步骤为：采用BstBI(NEB)和PacI(NEB)双酶切pCGS3-01L、pCGS3-03L、pCGS3-04L、pCGS3-05L、pCGS3-06L、pCGS3-07L和pCGS3-08L轻链中间质粒和pUC57-01H、pUC57-03H、pUC57-04H、pUC57-05H、pUC57-06H、pUC57-07H和pUC57-08H重链克隆载体，获得7条10200bp载体片段和7条1409bp重链基因片段，分别采用T4连接酶(TAKARA)连接载体片段和重链基因片段(按照表4的组合连接)，转化，涂板，提取质粒，BstBI和PacI双酶切鉴定，酶切条带符合预期(图2)，最终得到27个重链和轻链表达载体，分别命名为pCGS3-01(对照1)、pCGS3-02(对照2)、pCGS3-HLPV-01～25重组表达质粒。
pCGS3-01(对照1)重组表达质粒表达氨基酸序列是SEQ ID No.1的鼠源嵌合抗体重链可变区和氨基酸序列是SEQ ID No.2的鼠源嵌合抗体轻链可变区。鼠源嵌合抗体的重链可变区碳端(C端)融合IgG1-Fc，轻链可变区碳端(C端)融合κ恒定区。
pCGS3-02(对照2)重组表达质粒表达氨基酸序列是SEQ ID No.13的PTMs突变的鼠源嵌合抗体重链可变区和氨基酸序列是SEQ ID No.14的PTMs突变的鼠源嵌合抗体轻链可变区。PTMs突变的鼠源嵌合抗体的重链可变区碳端(C端)融合IgG1-Fc，轻链可变区碳端(C端)融合κ恒定区。
pCGS3-HLPV-01～25重组表达质粒这25个重组表达质粒中每一个重组表达质粒均含有1409bp重链基因片段和723bp轻链基因片段，pCGS3-HLPV-01～25重组表达质粒这25个重组表达质粒的重链基因片段和轻链基因片段编码的氨基酸序列中，只有重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列不同，其它氨基酸序列均相同。
上述重链基因片段中，核苷酸序列的第1-6位BstBI识别位点，第7-15位为Kozak序列，第16-72位为信号肽基因，第73-1398位重链基因序列，第1399-1401位为终止密码子，第1402-1409位为PacI识别位点，其中第73-408位核苷酸序列为重链可变区基因序列，409-1398为恒定区基因序列；
上述轻链基因片段中，核苷酸序列的第1-6位HindIII酶切位点，第7-15位为Kozak序列，第16-72位为信号肽基因，第73-714位轻链基因，第715-717位为终止密码子，第718-723位为XhoI识别位点，其中第73-393位核苷酸为轻链可变区基因序列，第394-714为恒定区序列。
上述25个重组表达质粒的重链可变区基因和轻链可变区基因的核苷酸序列如表4和表3。pCGS3-HLPV-01～25重组表达质粒分别表达名称为HLPV-01～25的人源化抗体。
pCGS3-HLPV-12所含的HLPV-12重链基因的核苷酸序列为SEQ ID No.25；pCGS3-HLPV-12所含的HLPV-12轻链基因的核苷酸序列为SEQ ID No.28；
pCGS3-HLPV-15所含的HLPV-15重链基因的核苷酸序列为SEQ ID No.25；pCGS3-HLPV-15所含的HLPV-15轻链基因的核苷酸序列为SEQ ID No.30；
pCGS3-HLPV-20所含的HLPV-20重链基因的核苷酸序列为SEQ ID No.26；pCGS3-HLPV-20所含的HLPV-20轻链基因的核苷酸序列为SEQ ID No.30；
pCGS3-HLPV-24所含的HLPV-24重链基因的核苷酸序列为SEQ ID No.27；pCGS3-HLPV-24所含的HLPV-24轻链基因的核苷酸序列为SEQ ID No.29；
pCGS3-HLPV-25所含的HLPV-25重链基因的核苷酸序列为SEQ ID No.27；pCGS3-HLPV-25所含的HLPV-25轻链基因的核苷酸序列为SEQ ID No.30。
实施例3、细胞转染及蛋白纯化
瞬转表达：按照每mL细胞培养物转染0.8μg质粒的量及质粒原始浓度，计算转染50mL细胞所需原始质粒的体积。将实施例2构建的27个上述重组表达质粒(pCGS3-01、pCGS3-02、pCGS3-HLPV-01～25)分别与转染试剂ExpiFectamineTM CHO Transfection Kit(Thermo公司)复合物缓慢滴入含有ExpiCHO-S(Thermo公司)细胞的细胞培养基ExpiCHOTMExpression Medium(Thermo公司)中培养，转染ExpiCHO-S细胞以表达27个抗体分子，边加边摇晃细胞培养物，使DNA与转染试剂复合物分散均匀。按照最大滴度在转染后18～22h添加试剂盒(ExpiFectamineTM CHO Transfection Kit)中提供的补料和增强剂，同时将培养条件37℃降至32℃、CO2浓度由8％降至5％；转染后第5天再次添加补料。当活率降至65％-75％时终止培养得到培养物。鼠源嵌合抗体(对照1)的培养物命名为CHO-S/pCGS3-01培养物，PTMs突变的鼠源嵌合抗体(对照2)的培养物命名为CHO-S/pCGS3-02培养物，25个人源化设计的抗体的培养物依次命名为CHO-S/pCGS3-HLPV-01～25培养物。
蛋白纯化：将上述培养物于6000g离心30min，收集上清并采用超滤管CentrifugalFilters -10K(Millipore公司)进行超滤浓缩，上清和结合/洗涤缓冲液(生工生物Protein A预装色谱柱的试剂盒成分)按照体积比1：1混匀，静置20min充分孵育，得到超滤浓缩上清和结合/洗涤缓冲液混匀液。五倍柱体积的结合/洗涤缓冲液平衡柱子(生工生物Protein A预装色谱柱的试剂盒成分)，将超滤浓缩上清和结合/洗涤缓冲液混匀液加入柱子依靠重力流穿预装柱。用10-15倍柱体积的结合/洗涤缓冲液清洗柱子并收集流穿液。使用一个新的收集管重复该步骤，直到流穿液的吸光度280nm接近基线；用5-10倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱柱上的重组蛋白，Centrifugal Filters 0.5ml 10K />-10K(Millipore公司)超滤浓缩置换到PBS(pH7.4)缓冲液。使用还原SDS-PAGE鉴定纯化后的单克隆抗体，检测结果显示单克隆抗体条带符合预期(图3，CHO-S/pCGS3-HLPV-01～05，07，13纯化未获得蛋白)。其中，鼠源嵌合抗体(对照1)，PTMs突变的鼠源嵌合抗体(对照2)和HLPV-01～25抗体分别来自CHO-S/pCGS3-01培养物，CHO-S/pCGS3-02培养物和CHO-S/pCGS3-HLPV-01～25培养物。
实施例4、亲和力检测
表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)是一种光学物理现象。当一束偏振光在一定的角度范围内入射到棱镜端面，在棱镜与金属薄膜的界面将产生表面等离子波。当入射光波的传播常数与表面等离子波的传播常数相匹配时，引起金属膜内自由电子产生共振，即表面等离子共振。运用SPR技术，可以免标记实时得到分子间互相作用。
本实施例采用表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)技术检测人源化设计HLPV-01～25共计25个抗体与PV-1蛋白结合亲和力。将偶联物重组人PLVAP/PV-1蛋白(Abcam公司)偶联到Series S Sensor Chip CM5芯片(GE公司)上，BiacoreT200分子间相互作用分析系统(GE公司)上机，将分析物人源化设计抗体流过芯片表面(温度25℃，流速度30μl/min)，若偶联物与分析物有结合活性，则会引起金膜表面折射率变化，最终导致SPR角变化。通过检测SPR角度变化，Biacore T200 Evaluation Software程序软件输出原始数据，并进行1:1结合模式进行动力学拟合分析，获得检测人源化抗体与PV-1蛋白的亲和力常数(KD)(表6)。
表6 人源化抗体亲和力常数(KD)统计表
01L 03L 04L 05L 06L 07L 08L
01H 4.70×10-8
03H 2.71×10-8
04H / / / / /
05H ∞ / 1.37×10-7 1.42×10-7 1.06×10-7
06H ∞ 6.80×10-8 / 6.50×10-8 3.36×10-8
07H ∞ 1.44×10-7 8.26×10-8 9.73×10-8 5.65×10-8
08H ∞ 1.33×10-7 1.17×10-7 9.70×10-8 8.65×10-8
备注：/表示表达量低，纯化未获得蛋白；∞表示检测抗体和PV-1蛋白无亲和力。亲和力常数KD单位为M。表6中各个组合对应的抗体名称可参见表4。
由表6结果可知：此次人源化的HLPV-12(KD＝6.80×10-8)、HLPV-14(KD＝6.50×10-8)、HLPV-15(KD＝3.36×10-8)、HLPV-18(KD＝8.26×10-8)、HLPV-19(KD＝9.73×10-8)、HLPV-20(KD＝5.65×10-8)、HLPV-24(KD＝9.70×10-8)和HLPV-25(KD＝8.65×10-8)抗体分子与为鼠源嵌合抗体(对照1，KD＝4.70×10-8)、PTMs突变的鼠源嵌合抗体(对照2，KD＝2.71×10-8)相比，亲和力均为10-8级，人源化改造符合预期。此外，鼠源抗体CDR区的PTMs风险可控，突变后亲和力差异不显著。
实施例5、成药性评估
为验证上述分子成药可行性，选择HLPV-12、HLPV-15、HLPV-20、HLPV-24和HLPV-25五个分子初步评价，检测包括非特异性吸附、胶体稳定性两个理化指标。非特异性吸附采用交叉相互作用色谱法(CIC-HPLC)进行分析鉴定，对照品为Adalimumab(阳性对照)和Ipilimumab(阴性对照)。判断标准：样品的保留时间小于阴性对照品表明候选分子的非特异性吸附能力较低。非特异性吸附检测用Ultimate3000HPLC(Thermo公司)仪器，色谱柱为人血清IgG偶联Hitrap-NHS色谱柱，流动相为PBS pH 7.4(Thermo公司)，流速0.1ml/min，采集时间20min，进样量5μl，柱温25℃，检测波长280nm，进样器温度10℃。
胶体稳定性采用直立单层吸附色谱法(SMAC)进行检测，对照品为Adalimumab(阳性对照)和Ipilimumab(阴性对照)，判断标准：样品的保留时间小于阴性对照品表明候选分子的胶体稳定性良好。胶体稳定性检测采用Ultimate 3000 HPLC(Thermo公司)，色谱柱为ZENIX色谱柱(Sepax)，流动相为PBS pH 7.4(Thermo公司)，流速0.35ml/min，采集时间20min，进样量10μl，柱温25℃，检测波长214nm，进样器温度10℃。
表7 人源化抗体成药性评价结果统计表
样品 SMAC保留时间(min) CIC保留时间(min)
HLPV-12 7.352 7.807
HLPV-15 7.387 7.797
HLPV-20 7.387 7.722
HLPV-24 7.352 7.985
HLPV-25 7.383 7.712
Adalimumab(阳性对照) 7.595 8.443
Ipilimumab(阴性对照) 10.435 10.137
结果由表7可知：HLPV-12、HLPV-15、HLPV-20、HLPV-24和HLPV-25五个分子的CIC保留时间均早于对照，表明候选分子的非特异性吸附能力很弱，表现均优于两种对照品；上述五个候选分子的SMAC保留时间均早于对照，表明候选分子的胶体稳定性较好，表现均优于两种对照品。
综合以上各实施例的结果可知，本发明通过对鼠源抗体进行人源化改造和实验验证，获得亲和力与鼠源单抗亲和力保持一致的HLPV-12、HLPV-15、HLPV-20、HLPV-24和HLPV-25五个抗体分子，人源化改造符合预期。进一步研究可知上述分子在非特异性吸附和胶体稳定性两个生化指标上，优于Adalimumab和Ipilimumab两个上市产品，可用于进一步的药物开发实验。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 华兰基因工程有限公司
<120> 特异性结合人质膜膜泡关联蛋白PV-1的人源化抗体及其应用
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 112
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Leu Ile
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Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly Asp Val Asn Phe Asn Glu Met Phe
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Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Arg Thr Ala Tyr
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<212> PRT
<213> Mus musculus
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ile Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Thr Asn
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Trp Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Thr Asp Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Gln Tyr Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asp Asp Arg Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
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Ser
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<213> Mus musculus
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Cys
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<212> PRT
<213> Mus musculus
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Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly Asp Val Asn Phe Asn Glu Met Phe Lys
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Ser
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<212> PRT
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 12
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 13
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 14
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Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Trp Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
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Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asp Asp Arg Pro Phe
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly Asp Val Asn Phe Asn Glu Met Phe
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ser Ile His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 20
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Thr Asn
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Thr Asp Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asp Asp Arg Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 21
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly Asp Val Asn Phe Asn Glu Met Phe
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ser Ile His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 22
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 22
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Thr Asn
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Thr Asp Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asp Asp Arg Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 23
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Thr Gln Gly Asp Val Asn Phe Asn Glu Met Phe
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ser Ile His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 24
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Thr Gln
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Thr Asp Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asp Asp Arg Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 25
<211> 1409
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 25
ttcgaagccg ccaccatggc cctgcctgtg tggctgctgg tgctgatgtt ctggatccct 60
gccgccagat ctcaggtgca gctggtgcag agcggagctg aggtgaagaa gcctggcgct 120
tctgtgaagg tgtcttgtaa ggcctctgga tacacattca ctgattatta catgtactgg 180
gtgagacagg cccctggaca gggcctggag tggatgggcg agattaatcc tactaacggc 240
gatgtgaact ttaatgagat gtttaagtct agagtgacaa tgacagtgga tacatctaca 300
tctacagcct atatggagct gagcagcctg agatctgagg atacagccgt gtactactgt 360
acatctatcc actattgggg tcagggcaca ctggtgacag tgagctctgc tagcaccaag 420
ggaccttctg tgtttcctct ggctcctagc tctaagtcta caagcggcgg aacagccgct 480
ctgggatgtc tggtgaagga ttatttccct gagcccgtga ccgtgagctg gaatagcgga 540
gcactgacat ctggcgtgca cacatttcct gctgtgctgc agtctagcgg cctgtattct 600
ctgagtagcg tggtgaccgt gccttctagt agcctgggaa cacagacata tatttgcaat 660
gtgaatcaca agccttctaa tacaaaggtg gataagagag tggagcctaa gagctgtgat 720
aagacccaca cctgtcctcc ttgtcctgcc cctgagctgc tcggaggccc ttctgtgttt 780
ctgtttcctc ctaagcctaa ggatacactg atgatctcta gaaccccaga ggtgacatgt 840
gtggtggtgg atgtgagtca cgaggatcct gaggtgaagt ttaattggta tgtggatggc 900
gtggaggtgc acaatgcaaa gactaagcct agagaggagc agtataattc tacatataga 960
gtggtgtctg tgctgacagt gctgcaccag gattggctga atggtaaaga gtataagtgt 1020
aaagtgtcta ataaggctct gccagctcca attgaaaaga caattagcaa ggctaagggc 1080
cagcctagag agcctcaggt gtatacactg cctccaagta gagatgagct gacaaagaat 1140
caggtgagcc tgacctgttt ggtgaaggga ttttatcctt ctgatattgc tgtggagtgg 1200
gagtctaatg gacagcctga gaataattat aaaacaacac cgccagtgct tgatagtgac 1260
ggctccttct tcctttatag taagctgacc gttgataagt ctagatggca acaaggtaac 1320
gtgtttagct gtagcgtgat gcatgaagcc ctgcataacc actacacaca gaaaagcctg 1380
agcttgagcc ccggcaagtg attaattaa 1409
<210> 26
<211> 1409
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 26
ttcgaagccg ccaccatggc tctgcctgtg tggctgctgg tgctgatgtt ttggattcct 60
gccgccagat ctcaggtgca gctggtgcag tctggagctg aagtgaagaa gcctggagct 120
tctgtgaagg tgtcttgtaa ggcttccgga tataccttca ctgattacta tatgtattgg 180
gtgagacagg ctcctggtca gggtctggag tggatcggag agattaatcc tacaaacgga 240
gatgtgaatt ttaatgagat gtttaagtcc agagtgacca tgaccgtgga taccagcact 300
agcactgcat atatggagct gtccagcctg agaagcgagg atacagccgt gtattattgt 360
acatctatcc attactgggg acagggcact ctggtgaccg tgagcagtgc ttctacaaag 420
ggacctagcg tgtttcctct ggcaccttct tctaagtcta cctctggcgg aactgccgct 480
ctgggatgtc tggttaagga ttattttcca gaaccagtga cagtgtcttg gaattctggc 540
gctctgacta gcggagtgca cacctttcct gccgtgctgc agtccagtgg actgtatagc 600
ctgagcagcg tggtgacagt tcctagttct tctttgggaa cacagacata catttgtaat 660
gtgaatcaca agccttctaa cacaaaggtg gataagcggg tggaacctaa gtcttgtgat 720
aagactcata catgtccacc ctgcccagct cctgagctgc tgggcggacc ctctgtgttt 780
ctgttcccac caaagcctaa agataccctg atgatcagca gaaccccaga agtgacatgt 840
gtggtggtgg atgtgtccca tgaggaccct gaggtgaaat tcaattggta cgtggatgga 900
gtggaggtgc acaacgctaa gactaaacct agagaagagc agtacaactc cacatataga 960
gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcatcag gactggctga atggcaagga gtataagtgc 1020
aaggtgtcta ataaggctct gcctgcccct atcgaaaaaa ctattagcaa ggccaagggc 1080
cagcctaggg aacctcaggt gtacactttg ccaccttcta gagatgaact tactaagaac 1140
caggtgagcc tgacctgtct ggtgaaggga ttttaccctt ctgacattgc tgttgaatgg 1200
gagtctaacg gtcagcctga gaataactat aagaccaccc ctcctgtgct ggattctgat 1260
gggtcctttt tcctgtatag taagctgacc gtggataagt ctagatggca gcagggaaat 1320
gtgttttctt gttctgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacacaca gaagtctctg 1380
agcctgagcc ctggcaagtg attaattaa 1409
<210> 27
<211> 1409
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 27
ttcgaagccg ccaccatggc cctgcctgtg tggctgctgg tgctgatgtt ttggatccct 60
gccgccagat ctcaggtgca gctggtgcag tctggagccg aggtgaagaa gcctggcgct 120
tctgtgaagg tgtcttgtaa ggccagcggc tacaccttca cagattacta catgtactgg 180
gtgaggcagg ctcctggaca gggcctggaa tggatcggcg agatcaaccc aacacagggc 240
gatgtgaact tcaacgagat gtttaagagc agagtgacca tgacagtgga tacctctaca 300
agcacagcct acatggagct gagctctctg agatctgaag atactgctgt gtactactgt 360
acatctatcc actactgggg ccagggcacc ctggtgaccg tgagcagcgc ctctaccaag 420
ggaccatctg tgtttcctct ggccccttct agcaagagca catctggcgg aaccgctgcc 480
ctgggctgtc tggtgaagga ctactttccc gagcctgtga ccgtgagttg gaatagcggc 540
gctctgacat ctggagtgca cacctttcct gccgtgctgc agagctctgg cctgtactcc 600
ctgagcagcg tggtgaccgt gccttctagc tctctgggca cccagaccta catctgtaac 660
gtgaatcaca agccttctaa cacaaaggtg gacaagagag tggaaccaaa gtcttgtgat 720
aagacacaca cctgtccacc ttgtccagcc cctgagctgc tgggaggccc ttctgtgttt 780
ctgttccctc ctaagcctaa ggataccctg atgatctcta ggaccccaga ggtgacctgt 840
gtggtggtgg atgtgagcca cgaggacccc gaggtgaagt ttaactggta cgtggatgga 900
gtggaggtgc acaacgctaa gactaagcct agagaggagc agtacaactc tacctataga 960
gtggtgtctg tgctgaccgt gctgcaccag gattggctga acggaaagga gtacaagtgt 1020
aaggtgtcca acaaggccct gccagcccct atcgagaaaa ctatctctaa ggctaagggc 1080
cagccaagag agcctcaggt gtacacactg cctcctagca gagatgagct gacaaagaac 1140
caggtgtctc tgacctgtct ggtgaagggc ttttacccta gcgatatcgc tgtggagtgg 1200
gagtctaacg gccagcctga gaacaactac aagaccacac ctcctgtgct ggattctgat 1260
ggcagcttct tcctgtactc taagctgaca gtggataagt ctaggtggca gcagggaaac 1320
gtgtttagct gtagcgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagtctctg 1380
tctctgtctc ctggcaagtg attaattaa 1409
<210> 28
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 28
aagcttgccg ccaccatggc cctgcctgtg tggctgctgg tgctgatgtt ttggatccct 60
gctgctagat ctgatattca gatgacccag tctcctagct ctctgtctgc ttctgtgggc 120
gatagagtga caatcacctg taaggcctct caggatatca agacaaatct gtcttggtat 180
cagcagaagc ctggaaaggc tcctaagacc ctgatctact atgccacaga tctggccgat 240
ggcgtgcctt ctaggtttag cggcagcggc tctggaacag agtttacact gactatctct 300
tctctgcagc cagaggattt tgctacatat tactgcctgc agcacgatga tagacctttt 360
acctttggcc agggcacaaa gctggagatc aagagaactg tggccgcccc ttctgtgttc 420
atttttcctc cttctgatga gcagctgaag tctggaactg cttctgtggt gtgtctgctg 480
aacaatttct accctagaga ggctaaggtg cagtggaagg tggataatgc tctgcagagc 540
ggcaactctc aggaatctgt gacagagcag gattctaagg attctacata ctctctgagc 600
tctacactga cactgtctaa ggctgattat gagaagcata aggtgtacgc ctgtgaggtg 660
acccatcagg gcctgagctc tcctgtgaca aagtctttta acagaggcga gtgctgactc 720
gag 723
<210> 29
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 29
aagcttgccg ccaccatggc tctgcctgtg tggctgctgg tgctgatgtt ctggatccct 60
gccgccagat ctgatatcgt gatgacccag tctccttcta gcctgtctgc ctctgtgggc 120
gatagagtga ccatcacatg taaggcctct caggatatca agacaaacct gtcttggtac 180
cagcagaagc ctggaaaggc ccctaagaca ctgatctact acgctacaga tctggccgat 240
ggagtgccta gcaggttttc tggctctgga tctggacagg agtttacact gacaatctct 300
tctctgcagc ctgaggattt tgctacatac tactgtctgc agcacgatga tagacctttt 360
acatttggac agggaaccaa gctggagatc aagagaaccg tggccgcccc tagcgtgttt 420
atctttcctc cttctgatga gcagctgaag tctggcaccg cttctgtggt gtgtctgctg 480
aataactttt atcctagaga ggctaaggtg cagtggaagg tggataatgc cctgcagtct 540
ggcaatagtc aggagtctgt gacagaacag gattctaagg atagcacata ctctctgagc 600
tctacactga cactgagtaa ggctgattat gaaaagcaca aggtgtacgc ctgtgaggtg 660
acacatcagg gactgtctag ccctgtgaca aagtctttta atagaggcga gtgttgactc 720
gag 723
<210> 30
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 30
aagcttgccg ccaccatggc cctgcctgtg tggctgctgg tgctgatgtt ttggatccct 60
gccgccagat ctgatatcgt gatgacccag tctccttctt ctctgtctgc ctctgtgggc 120
gatagagtga ccatcacatg taaggcctct caggatatca agacccagct gtcttggtac 180
cagcagaagc ctggcaaggc ccctaagacc ctgatctact acgccaccga tctggccgat 240
ggcgtgcctt ctaggtttag cggcagcggc tctggccagg agttcaccct gaccatctct 300
tctctgcagc ctgaggattt cgccacctac tactgtctgc agcacgatga cagacctttc 360
accttcggcc agggcaccaa gctggagatc aagagaaccg tggccgcccc ttctgtgttt 420
atcttccctc cttctgatga gcagctgaag tctggcaccg cctctgtggt gtgtctgctg 480
aacaacttct accctagaga ggccaaggtg cagtggaagg tggataacgc cctgcagtct 540
ggcaactctc aggagtctgt gaccgagcag gattctaagg attctaccta ctctctgtct 600
agcaccctga ccctgtctaa ggccgattac gagaagcaca aggtgtacgc ctgtgaggtg 660
acccaccagg gcctgagctc tcctgtgacc aagtctttta acagaggcga gtgttgactc 720
gag 723

Claims (9)

1.特异性结合PV-1蛋白的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.24，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.23。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区为人IgG1的重链恒定区和/或所述轻链恒定区为人Kappa的轻链恒定区。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，编码权利要求1或2所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的核酸分子为C1）或C2）：
C1）基因序列是SEQ ID No.27的第73-408位的重链可变区DNA分子；
C2）基因序列是SEQ ID No.27的第16-408位的DNA分子；
编码权利要求1或2所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的核酸分子为D1）或D2）：
D1）基因序列是SEQ ID No.30的第73-393位的轻链可变区DNA分子；
D2）基因序列是SEQ ID No.30的第16-393位的轻链可变区DNA分子。
4. 根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，编码权利要求1或2所述抗体或其抗原结合片段的重链的核酸分子为基因序列是SEQ ID No.27的重链DNA分子；
编码权利要求1或2所述抗体或其抗原结合片段的轻链的核酸分子为基因序列是SEQID No.30的轻链DNA分子。
5.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述B1）至B7）中的任一种：
B1）编码权利要求1或2所述抗体或其抗原结合片段的核酸分子；
B2）编码权利要求1或2所述抗体或其抗原结合片段的重链和轻链的核酸分子；
B3）编码权利要求1或2所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区的核酸分子；
B4）含有B1）-B3）任一所述核酸分子的表达盒；
B5）含有B1）-B3）任一所述核酸分子的重组载体、或含有B4）所述表达盒的重组载体；
B6）含有B1）-B3）任一所述核酸分子的重组微生物、或含有B4）所述表达盒的重组微生物、或含有B5）所述重组载体的重组微生物；
B7）含有B1）-B3）任一所述核酸分子的细胞系、或含有B4）所述表达盒的细胞系、或含有B5）所述重组载体的细胞系。
6.改善、预防或治疗PV-1过表达相关疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1或2所述抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的载体。
7.用于检测PV-1的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒含有权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段。
8.权利要求1或2所述抗体或其抗原结合片段，和/或，权利要求5所述的生物材料的下述任一种应用：
D1）在制备用于改善、预防或治疗PV-1过表达相关疾病的药物中的应用；
D2）在制备用于诊断或筛查PV-1过表达相关疾病的产品中的应用；
D3）在制备用于检测PV-1的产品中的应用；
D4）在制备用于结合PV-1蛋白的产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述PV-1过表达相关疾病包括年龄相关性黄斑变性、糖尿病黄斑水肿、成年患者视网膜静脉阻塞引起的黄斑水肿、肝癌、缺血性脑中风或脑水肿。
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Applicant after: Hualan Gene Engineering (Henan) Co.,Ltd.

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Applicant before: HUALAN GENETIC ENGINEERING Co.,Ltd.

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