CN106232813B - 预防减蛋综合征(eds)的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明的问题在于提供能够有效预防减蛋综合征(EDS)，且可以稳定供应的EDS疫苗。解决该问题的EDS疫苗以融合蛋白为有效成分，该融合蛋白是将具有卷曲螺旋形成单元的多肽和EDS病毒(EDSV)的纤维蛋白中的knob区域结合而成的。

Description

预防减蛋综合征(EDS)的疫苗
技术领域
本发明涉及预防鸡EDS的疫苗。更具体而言，该疫苗以重组蛋白和/或其多聚体为有效成分，上述重组蛋白由EDS的病因即EDS病毒(EDSV)的纤维蛋白中的“顶端球(knob)区域”和“具有卷曲螺旋形成单元的多肽”融合而成。通过给鸡接种该融合蛋白和/或其多聚体，可以诱导高血凝抑制(HI)抗体，从而预防EDS发病。
背景技术
EDS作为一种鸡疾病，其主要症状为EDSV感染鸡的产蛋下降及产下畸形蛋(非专利文献1及非专利文献2)。EDSV归类为禽III群腺病毒，其特征在于，具有血凝活性，在鸡输卵管增殖。EDS无临床症状，或可见轻微程度腹泻，多发生于产卵高峰期的30～40周龄，会引起被感染鸡群持续3～8周产下蛋壳畸形蛋或产蛋量下降，因此，经济损失巨大。疫苗对预防非常有效(非专利文献3)，因此，灭活疫苗广泛用于蛋鸡的疫苗接种计划。
EDS灭活疫苗以对发育鸭蛋中增殖的病毒灭活后与佐剂混合而成的疫苗为主。虽然EDSV在发育鸭蛋中可以良好地增殖(非专利文献4及非专利文献5)，但是，可能由于禽流感等传染病的发生，导致发育鸭蛋供应困难，因此，需要不依赖鸭蛋的疫苗抗原供应手段。
EDSV具有约33kb的双链基因组DNA(非专利文献6)，血清型单一，菌株之间几乎不存在抗原性差异(非专利文献7)。病毒颗粒由结构蛋白构成(非专利文献1及非专利文献6)，该结构蛋白包括核心蛋白、构成衣壳的六邻体、以纤维状突起从衣壳突出的三聚体纤维及作为其基部的五邻体基座等。其中，六邻体(非专利文献8)、纤维及五邻体基座(非专利文献9)存在中和表位，其中的纤维与入侵宿主细胞有关(非专利文献10)，因此关于其的研究较多(非专利文献11)。纤维蛋白根据功能被分为三个区域(非专利文献12)。参与与五邻体基座连接的(非专利文献13)N端侧称为尾(Tail)，中间区域称为柄(Shaft)。根据报道，存在于C端的Knob具有血凝活性，参与与细胞受体的结合(非专利文献11)。根据报道，就人腺病毒5型而言，在纤维蛋白的三个区域中，knob存在中和表位，但立体结构对于发挥功能非常重要，通过与相邻柄区域的一部分共同表达而显示与受体的结合活性(非专利文献14)。
构成纤维蛋白柄的柄区域具有重复结构(非专利文献12及非专利文献15)，且三个分子组装形成三重β螺旋结构(非专利文献15及非专利文献16)，其中，该重复结构由多个包含间隔有脯氨酸或甘氨酸的疏水区域的β螺旋结构(一个重复)连接而成。邻接柄的knob同样采取三聚体结构(非专利文献17)。通常，柄的一个重复由15个氨基酸构成(非专利文献12)，但EDSV几乎所有的重复均由更多的氨基酸构成(非专利文献6)。根据报道，在人腺病毒中，如剪短柄长，则与受体的结合性及对培养细胞的感染性降低(非专利文献18)。
根据报道，在大肠杆菌中表达EDSV与knob相邻的柄区域的C端部位的34个氨基酸，并作为油性疫苗给鸡接种，在接种后的鸡中，中和抗体得到诱导(非专利文献19～20、专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2004/078977号
非专利文献
非专利文献1：Adair,B.M.&Fitzgerald,S.D.:Egg Drop Syndrome.In Diseasesof Poultry,12th ed.(Saif,YM et al.ed.),p266-276,Blackwell Publishing,Ames.2008
非专利文献2：山口成夫：産卵低下症候群.「鳥の病気第7版」(鶏病研究会編)，p50-53，鶏病研究会，東京，2010(山口成夫：减蛋综合征.“鸟类疾病第7版”(鸡病研究会编著)，p50-53，鸡病研究会，东京，2010)
非专利文献3：Baxendale,W.,Lutticken,D.,Hein,R.&McPherson,I.:Theresults of field trials conducted with an inactivated vaccine against the eggdrop syndrome 76(EDS 76).Avian Pathol.,9:77-91,1980
非专利文献4：野中富士男，松尾和夫，山田進二：産卵低下症候群-1976(EDS-76)ウイルスの培養細胞および発育鶏卵での増殖性ならびに病原性.日本獣医師会雜誌，37：510-515，1984(野中富士男、松尾和夫、山田进二：减蛋综合征-1976(EDS-76)病毒的培养细胞及发育鸡蛋中的增殖性以及病原性.日本兽医协会杂志，37：510-515，1984)
非专利文献5：東原稔，高井伸二，日高温子，宝達勉，蛭间正巳，渡辺義計，松本稔：産卵低下症候群1976(EDS-76)ウイルスの分離.日本獸醫學雜誌，45：603-612，1983(东原稔、高井伸二、日高温子、宝达勉、蛭间正巳、渡边义计、松本稔：减蛋综合征1976(EDS-76)病毒的分类.日本兽医学杂志，45：603-612，1983)
非专利文献6：Hess,M.,Blocker,H.&Brandt,P.:The complete nucleotidesequence of egg drop syndrome virus:an intermediate between mastadenovirusesand aviadenoviruses.Virology,238:145-156,1997
非专利文献7：Tsukamoto,K.,Kuwabara,M.,Kaneko,M.,Mase,M.&Imai,K.:Noevidence for adaptation of current egg drop syndrome 1976 viruses tochickens.Avian Dis.,48:220-223,2004
非专利文献8：Toogood,C.I.,Crompton,J.&Hay,R.T.:Antipeptide antiseradefine neutralizing epitopes on the adenovirus hexon.J.Gen.Virol.,73:1429-1435,1992
非专利文献9：Gahery-Segard,H.,Farace,F.,Godfrin,D.,Gaston,J.,Lengagne,R.,Tursz,T.,Boulanger,P.&Guillet,J.G.:Immune response to recombinant capsidproteins of adenovirus in humans:antifiber and anti-penton base antibodieshave a synergistic effect on neutralizing activity.J.Virol.,72:2388-2397,1998
非专利文献10：Louis,N.,Fender,P.,Barge,A.,Kitts,P.&Chroboczek,J.:Cell-binding domain of adenovirus serotype 2fiber.J.Virol.,68:4104-4106.1994
非专利文献11：Horwitz,M.S.:Adenovirus.In Fields Virology,4th ed.,(Knipe DM et al.ed)p2301-2326,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia.2001
非专利文献12：Green,N.M.,Wrigley,N.G.,Russell,W.C.,Martin,S.R.&McLachlan,A.D.:Evidence for a repeating cross-beta sheet structure in theadenovirus fibre.EMBO J.,2:1357-1365,1983
非专利文献13：Hong,S.S.&Boulanger,P.:Protein ligands of the humanadenovirus type 2outer capsid identified by biopanning of a phage-displayedpeptide library on separate domains of wild-type and mutant pentoncapsomers.EMBO J.,14:4714-4727,1995
非专利文献14：Henry,L.J.,Xia,D.,Wilke,M.E.,Deisenhofer,J.&Gerard,R.D.:Characterization of the knob domain of the adenovirus type 5 fiber proteinexpressed in Escherichia coli.J.Virol.,68:5239-5246,1994
非专利文献15：van Raaij,M.J.,Mitraki,A.,Lavigne,G.&Cusack,S.:A triplebeta-spiral in the adenovirus fibre shaft reveals a new structural motif fora fibrous protein.Nature,401:935-938,1999
非专利文献16：Stouten,P.F.,Sander,C.,Ruigrok,R.W.&Cusack,S.:Newtriple-helical model for the shaft of the adenovirus fibre.J.Mol.Biol.,226:1073-1084,1992
非专利文献17：Xia,D.,Henry,L.,Gerard,R.D.&Deisenhofer,J.:Structure ofthe receptor binding domain of adenovirus type 5 fiber protein.Curr.TopMicrobiol.Immunol.,199:39-46,1995
非专利文献18：Shayakhmetov,D.M.&Lieber,A.:Dependence of adenovirusinfectivity on length of the fiber shaft domain.J.Virol.,74:10274-10286,2000
非专利文献19：Gutter,B.,Fingerut,E.,Gallili,G.,Eliahu,D.,Perelman,B.,Finger,A.&Pitcovski,J.:Recombinant egg drop syndrome subunit vaccine offersan alternative to virus propagation in duck eggs.Avian Pathol.,37:33-37,2008
非专利文献20：Fingerut,E.,Gutter,B.,Gallili,G.,Michael,A.&Pitcovski,J.:A subunit vaccine against the adenovirus egg-drop syndrome using part ofits fiber protein.Vaccine,21:2761-2766,2003
非专利文献21：Adv.Protein Chem.2005,70,37-78
发明内容
发明要解决的问题
本发明要解决的问题在于向预测会发生EDS的农场提供可以有效预防EDS的重组EDS疫苗。
用于解决问题的手段
为了解决所述问题，本发明人等首先使用结构预测模型对EDSV的纤维蛋白的结构进行了探讨，结果发现，knob区域和柄区域的边界比之前认为的位置更加靠近N端侧。而且还发现，将knob区域与具有卷曲螺旋形成单元的多肽融合，形成重组蛋白和/或其多聚体，并将重组蛋白和/或其多聚体作为疫苗接种鸡，可以诱导高HI抗体，其中，knob区域限定为不包含柄区域，从而完成了本发明。
即，本发明如下。
融合蛋白，其是由具有卷曲螺旋形成单元的多肽和EDSV的纤维蛋白中的顶端球(knob)区域结合而成的。
融合蛋白，所述具有卷曲螺旋形成单元的多肽为GCN4或软骨基质蛋白(cartilagematrix protein，CMP)。
融合蛋白多聚体，其是由所述融合蛋白多聚化而成的。
核酸片段，其包括编码所述融合蛋白的DNA序列。
重组表达载体，其包含所述核酸片段。
转化体，其导入有所述核酸片段。
转化体，其导入有所述重组表达载体。
抗体，其可以与所述融合蛋白或其多聚体结合。
EDS疫苗，其包含所述融合蛋白作为有效成分。
EDS治疗剂，其包含所述抗体作为有效成分。
EDS的DNA疫苗，其包含所述核酸片段或重组表达载体作为有效成分。
试剂盒，其包含所述融合蛋白或其多聚体，用于测定测试样品中针对EDSV的knob区域的抗体量。
试剂盒，其包含所述抗体，用于测定测试样品中EDSV的knob区域的含量。
预防EDS的方法，其包括将向鸡给予所述融合蛋白、其多聚体、核酸片段或重组表达载体。
治疗EDS的方法，其包括向鸡给予所述抗体。
发明效果
本发明的疫苗以EDSV的knob区域和具有卷曲螺旋形成单元的多肽融合而成的重组蛋白和/或其多聚体为有效成分，将其接种给鸡可以诱导高HI抗体，从而防止鸡EDS的发病。
附图说明
图1为实施例1～4及比较例1所制备的融合蛋白的示意图。
图2为确认实施例1～4及比较例1所制备的融合蛋白形成多聚体的SDS-PAGE分析图。
图3为利用凝胶过滤对实施例1～4及比较例1所制备的融合蛋白进行分子量分布分析而得到的图。
图4为表示试验例3中的利用实施例1～4及比较例1所制备的融合蛋白免疫的鸡血清的HI试验结果的图。
图5为表示试验例4中的Knob-GCN4的有效抗原量确认试验结果的图。
图6为表示试验例4中的CMP-Knob的有效抗原量确认试验结果的图。
图7为表示试验例5中免疫后的抗EDSV HI抗体滴度的变化(平均值)的图。
图8为表示试验例5中感染强毒EDSV后的通常产卵数的变化的图。
具体实施方式
本发明包括具有卷曲螺旋形成单元的多肽和鸡EDSV的纤维蛋白中的knob区域结合而成的融合蛋白。
EDSV的纤维蛋白根据其功能从N端侧开始，被分为尾(Tail)、柄(Shaft)、顶端球(Knob)这三个区域。为了防止溶解性降低，优选构成本发明的融合蛋白的EDSV的knob区域中不包含柄区域。另一方面，由于knob区域的天然高级结构存在被损坏的危险，因此优选完全包围knob区域。作为这样的EDSV的knob区域，示例有：由序列编号11所示氨基酸序列构成的多肽。该氨基酸序列含有以往包含在柄区域中的N端侧的9个氨基酸(非专利文献20)，但本发明人等根据结构预测模型进行探讨后，预测knob区域延伸至该位置。构成本发明的融合蛋白的EDSV的knob区域中包含由序列编号11所示氨基酸序列构成的多肽，及序列编号11所示氨基酸序列删除、取代或者添加1个或者多个氨基酸而成的氨基酸序列构成的多肽。在本说明书中，多个氨基酸通常为2～9个氨基酸，优选2～5个氨基酸，更优选2～3个氨基酸。而且，也包括由与以上氨基酸序列具有同源性的氨基酸序列构成的多肽，其中，该同源性为80％以上、优选90％以上、更优选95％以上。
另外，作为编码EDSV的knob区域的基因，也包含：序列编号12的DNA序列、为在大肠杆菌或酵母中表达而进行密码子优化的DNA序列、在以上DNA序列上添加适当的限制性内切酶酶切位点而成的DNA序列及这些DNA序列中删除、取代或者添加1个或者多个碱基而成的DNA序列。在本说明书中，多个碱基通常为2～9个碱基，优选2～5个碱基，更优选2～3个碱基。而且，也包括与这些DNA序列具有同源性的DNA序列，其中，同源性为80％以上，优选90％以上，更优选95％以上。
另一方面，作为与Knob结合并构成本发明的融合蛋白的具有卷曲螺旋形成单元的多肽没有特别限定，只要为具有形成卷曲螺旋结构的能力的多肽即可，优选具有来自天然多聚体形成蛋白(多聚体形成蛋白)的卷曲螺旋形成单元的物质。例如，示例有：非专利文献21(Adv.Protein Chem.2005,70,37-78)中记载的多聚体形成蛋白，其中，优选具有来自GCN4、源自鸡的CMP、源自噬菌体T4的fibritin等的卷曲螺旋形成单元的多肽，更优选GCN4、CMP，特别优选CMP，因为Knob与这些多肽制备的融合蛋白可以作为可溶性蛋白以高收率获得，且HI抗体诱导效果优异。
作为具有GCN4的卷曲螺旋形成单元的多肽，也包含由序列编号27的氨基酸序列构成的二聚体型多肽，由序列编号28～30的氨基酸序列构成的三聚体型多肽或在以上氨基酸序列中删除、取代或者添加1个或者多个氨基酸而成的氨基酸序列构成的三聚体型多肽。而且，也包括由与这些氨基酸序列具有同源性的氨基酸序列构成的多肽，其中，同源性为80％以上，优选90％以上，更优选95％以上。其中，优选三聚体型，特别优选由序列编号30的氨基酸序列构成的多肽。
作为具有CMP的卷曲螺旋形成单元的多肽，包括由序列编号31所示氨基酸序列构成的多肽及该氨基酸序列中删除、取代或者添加1个或者多个氨基酸而成的氨基酸序列构成的多肽。而且，也包括由与这些氨基酸序列具有同源性的氨基酸序列构成的多肽，其中，同源性为80％以上，优选90％以上，更优选95％以上。
作为编码具有CMP的卷曲螺旋形成单元的多肽的DNA序列，包括：序列编号32的DNA序列、为在大肠杆菌中表达而进行密码子优化的序列编号33等的DNA序列、在这些DNA序列上添加适当的限制性内切酶酶切位点而成的DNA序列及在这些DNA序列中删除、取代或者添加1个或者多个碱基而成的DNA序列。而且，也包括与这些DNA序列具有同源性的DNA序列，其中，同源性为80％以上，优选90％以上，更优选95％以上。
在本发明的融合蛋白中，上述具有GCN4、CMP等的卷曲螺旋形成单元的多肽可以与Knob的N端侧及C端侧的任意之一结合。例如，使用CMP作为卷曲螺旋形成单元的情况下，与Knob的N端侧及C端侧中的任意一者结合均可显示很高的HI抗体诱导效果。另一方面，在使用GCN4的情况下，与Knob的N端侧结合时显示更高的HI抗体诱导效果。另外，具有卷曲螺旋形成单元的肽与Knob可以相邻结合，但为了达到降低两者的分子间相互作用等目的，也可以在两者之间插入连接物序列等间隔物。作为连接物序列，没有特别限定，例如，可以使用由GPGP(GP)2或者GGGGS(G4S)组合形成的序列。另外，也可以使用(G4S)重复1～4次而成的序列((G4S)1～(G4S)4)作为连接物序列，而且，也可以在其中组合(GP)2。另外，也可以为His×6(H6)标签序列。作为优选的连接物序列或标签序列和连接物序列的组合，可以示例：(G4S)1、(G4S)2、(G4S)2H6(G4S)2、(G4S)2H6(G4S)1(G3S)1等。标签序列也可以添加于融合蛋白的N端或C端。
作为本发明的融合蛋白，例如，示例有：融合蛋白Knob-GCN4(例如序列编号13(氨基酸序列)、序列编号14(DNA序列))，该蛋白中，在Knob的C端侧添加具有GCN4的卷曲螺旋形成单元的多肽，在其间插入连接物序列((G4S)2)，在C端结合有标签序列(H6)。另外，示例有：融合蛋白GCN4-Knob(例如序列编号21(氨基酸序列)，序列编号22(DNA序列))，该蛋白中，在Knob的N端侧配置具有GCN4的卷曲螺旋形成单元的多肽，在其间插入连接物序列((G4S)1)，在C端结合有标签序列(H6)。在本发明的融合蛋白中，除序列编号13或21的氨基酸序列所表示的蛋白之外，还包括由这些氨基酸序列删除、取代或者添加1个或者多个氨基酸而成的氨基酸序列构成的多肽。另外，也包括由与这些氨基酸序列具有同源性的氨基酸序列构成的多肽，其中，同源性为80％以上，优选90％以上，更优选95％以上。
进而，作为本发明的融合蛋白，还示例有：融合蛋白(例如序列编号23(氨基酸序列)、序列编号24(DNA序列))，该蛋白中，在Knob的C端侧结合具有CMP的卷曲螺旋形成单元的多肽，在其间插入标签序列(H6)和连接物序列((G4S)2)；融合蛋白(例如序列编号25(氨基酸序列)、序列编号26(DNA序列))，在该蛋白中，在Knob的N端结合具有CMP的卷曲螺旋形成单元的多肽，在其间插入标签序列和连接物序列的组合((G4S)2H6(G4S)1(G3S)1)。在本发明的融合蛋白中，除序列编号23或25的氨基酸序列所表示的蛋白之外，还包括由这些氨基酸序列删除、取代或者添加1个或者多个氨基酸而成的氨基酸序列构成的多肽。另外，也包括由与这些氨基酸序列具有同源性的氨基酸序列构成的多肽，其中，同源性为80％以上，优选90％以上，更优选95％以上。
将具有卷曲螺旋形成单元的多肽和Knob进行结合时，可以通过基因工程学手段将两者结合并表达。例如，示例如下方法：以卷曲螺旋形成单元的DNA序列和Knob的DNA序列相邻的方式制作表达载体，然后导入适当的宿主，并表达融合蛋白。卷曲螺旋形成单元的DNA序列可以配置于Knob的DNA序列的5’侧，也可以配置于3’侧。在制作所述表达载体时，连接物序列和/或标签序列的DNA序列可以插入卷曲螺旋形成单元的DNA序列和Knob的DNA序列之间，也可以添加于上述DNA序列的5’侧或3’侧。例如，可以示例如下方法：从5’侧依次配置Knob的DNA序列、标签序列和/或连接物序列的DNA序列、卷曲螺旋形成单元的DNA序列从而制作表达载体。
上述DNA序列可以通过化学合成获得，可以将其作为模板，通过公知的基因扩增方法进行扩增，使用各种限制性内切酶并入表达载体中，从而制成重组表达载体。优选用于基因扩增的寡核苷酸以杂交于模板DNA序列的5’侧或3’侧的方式设计，并添加有限制性内切酶的酶切部位。可以使用上述寡核苷酸、模板DNA、DNA聚合酶等，通过公知的基因扩增方法，扩增模板DNA。利用限制性内切酶对扩增后的DNA序列和表达载体进行处理，然后使用适当的DNA连接酶将其连接，由此可以构建插入有目标DNA序列的重组表达载体。本发明也包括如上重组表达载体。
作为表达载体，可以举出：质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、人工染色体载体等，从操作简便性及成本的观点考虑，优选质粒载体。例如，当宿主为大肠杆菌时，可以举出：pFN6A(HQ)Flexi载体(Promega)、pFN7A(HQ)Flexi载体(Promega)、pFN2A(GST)Flexi载体(Promega)、pET-15b(MERCK)、pET-21d(MERCK)、pUC57(GenScript)、pET-22b(MERCK)、pET-21d(MERCK)、pCold载体(TAKARA BIO公司)等，当宿主为哺乳动物时，可以举出：pF4A CMVFlexi载体(Promega)、pF5A CMV-neo Flexi载体(Promega)、pF9A CMV hRluc-neo Flexi载体(Promega)、pCI-neo哺乳动物表达载体(Promega)。表达载体中也可以包含复制起点、对基因表达具有调节作用的启动子序列、增强子序列等调节序列、选择标志物序列。
作为启动子序列的例子，细菌启动子为大肠杆菌lacI及lacZ启动子、T3及T7启动子、gpt启动子、λPR、PL启动子、tac启动子、及trp、trc启动子。其中，关于这一点，作为适当的公知真核细胞启动子，可以举出：巨细胞病毒(“CMV”)即刻启动子、单纯疱疹病毒(“HSV”)胸苷激酶启动子、早期及晚期猿猴病毒(SV)40启动子、逆转录病毒长末端重复(LTR)启动子，例如劳斯肉瘤病毒(“RoSV”)的启动子，及金属硫蛋白-I启动子等金属硫蛋白启动子。
在以高等真核细胞为宿主表达融合蛋白时，可以通过将增强子序列插入表达载体中来增加转录活性。增强子序列以在规定宿主细胞类型中增加启动子的转录活性的方式起作用。增强子的例子包含SV40增强子、CMV早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤增强子、β肌动蛋白增强子及腺病毒增强子等。
作为选择标志物的例子，示例有：大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因、酿酒酵母(Saccharomyces serevisiae)的trp1基因、哺乳动物细胞的新霉素抗性基因。
本发明包括核酸片段，该核酸片段包含卷曲螺旋形成单元的DNA序列及Knob的DNA序列，以上DNA序列编码上述本发明的融合蛋白。本发明的核酸片段包含卷曲螺旋形成单元的DNA序列和Knob的DNA序列连续配置而成的核酸片段，或者，卷曲螺旋形成单元的DNA序列和Knob的DNA序列之间插入标签序列和/或连接物序列的DNA序列而成的核酸片段。例如，包含序列编号14、24、26、28的核酸片段。
本发明的核酸片段可以通过化学合成获得完整序列。另外，也可以通过化学合成获得一部分核酸片段及剩余部分的核酸片段，然后通过公知的基因重组技术，将这些序列连接。例如，通过化学合成获得Knob或卷曲螺旋形成单元的DNA之后，利用公知的基因扩增方法将其扩增，然后插入独立的克隆载体。利用限制性内切酶从每个克隆载体中切割Knob的DNA序列或卷曲螺旋形成单元的DNA序列，然后插入经过同样限制性内切酶处理的表达载体中，从而制得重组表达载体。插入时，以每个片段连续配置的方式进行设计。而且，通过使用限制性内切酶等从重组表达载体中切割核酸片段，可以获得卷曲螺旋形成单元和Knob的DNA序列连接在一起的核酸片段。利用上述方法制备核酸片段时，也可以将标签序列或连接物序列的DNA序列插入卷曲螺旋形成单元和Knob的DNA序列之间制成表达载体，进一步制得核酸片段。
通过利用如上制得的表达载体转化宿主，可以获得含有表达载体的转化体。本发明中也包含如上转化体。作为宿主，可以举出：大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞系、昆虫细胞、植物等公知的物质。作为大肠杆菌，可以示例：BL21株、DH5α等。作为酵母，可以举出：毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，作为哺乳动物细胞，可以举出：CHO细胞、HEK293细胞、COS-1/-7细胞等。
向宿主导入表达载体时，可以根据宿主的不同使用公知的方法进行，可以示例：磷酸钙法、电穿孔法、脂转染法等。导入后，可以使用包含选择标志物的培养基进行培养，从而选择宿主细胞中导入有所述表达载体的转化体。
可以在优选条件下使如上制得的转化体增殖，在特定条件下(pH、温度、化合物的添加)诱导所选择的启动子，从而产生融合蛋白。表达的融合蛋白在细胞内积蓄或者向细胞外分泌。
在以大肠杆菌为宿主进行表达的情况下，也可以在包涵体部分中表达融合蛋白。作为从大肠杆菌中回收包涵体的方法，例如，示例有：超声波破碎法、高压均质法、使用BugBuster(默克株式会社)的方法。
如上得到的本发明的融合蛋白也可以作为单体使用，但多聚体能够诱导高HI抗体，故优选作为多聚体使用。这些融合蛋白多聚体为例如，二聚体、三聚体、三聚体以上，也包括这些多聚体的混合物。例如，在使用GCN4、CMP等作为具有卷曲螺旋形成单元的多肽对融合蛋白进行表达时，可以获得多聚体，根据需要也可以进行公知的再折叠处理。
另外，本发明的融合蛋白为具有卷曲螺旋形成单元的多肽和Knob结合而成的，它们也可以为化学结合。此时，示例有如下方法：分别表达具有卷曲螺旋形成单元的多肽和Knob，并使用交联剂进行结合。
分别表达具有卷曲螺旋形成单元的多肽及Knob时，可以通过化学合成获得各自的DNA序列，将其作为模板并利用公知基因扩增方法进行扩增，利用上述方法构建各自的表达质粒。可以将表达质粒如上导入宿主，从而分别获得目标蛋白。
使用交联剂进行结合时，可以使用蛋白中存在的氨基或巯基(SH基)、蛋白中存在的糖链的醛基等进行结合，但所使用的官能团没有限定。例如，可以示例使具有卷曲螺旋形成单元的多肽的SH基和Knob的氨基进行反应的方法，更具体而言，可以通过孵育多肽和Knob进行结合，其中，多肽经二硫苏糖醇(DTT)等还原剂进行还原处理，Knob通过N-琥珀酰基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)导入有吡啶二硫基。另外，也可以通过利用生物素、抗生物素蛋白等生物分子彼此的相互作用的结合进行化学结合。
通过上述方法得到的融合蛋白及其多聚体可以利用通常纯化手段进一步分离并纯化。在此，作为纯化手段，可以举出：亲合色谱法、离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法、凝胶过滤色谱法等各种纯化法。
本发明包括以所述本发明的融合蛋白和/或融合蛋白多聚体为有效成分的EDS疫苗。本发明的疫苗优选包含融合蛋白多聚体。优选为二聚体、三聚体、三聚体以上、或这些多聚体的混合物。
优选1剂EDS疫苗中包含0.3～10μg所述融合蛋白和/或融合蛋白多聚体。
本发明的疫苗也可以包含药学上可接受的载体。例如，可以举出：盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、等渗含水缓冲液及它们的组合，另外，也可以在其中适当混合佐剂、乳化剂、防腐剂、等渗剂、pH调节剂等添加剂。
作为佐剂，包括油性佐剂、醋酸生育酚、氢氧化铝、皂苷(QS21，ISCOM)，CpG寡核苷酸等。
除所述融合蛋白以外，也可以在本发明的疫苗中混合用于防治鸡传染病的抗原。作为该传染病，示例有：鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、传染性鼻炎、鸡传染性法氏囊病、呼肠孤病毒感染、支原体感染、沙门氏菌感染等。
本发明的疫苗可以通过任意给药途径给药，如透皮给药、舌下给药、眼部给药、皮内给药、肌肉注射给药、口服给药、肠内给药、鼻腔给药、静脉内给药、皮下给药、腹腔给药、从口腔向肺部的吸入给药等。
关于现有的EDS疫苗的抗体滴度与防御性的关系，血凝抑制抗体滴度(HI抗体滴度)为16倍以上，则认为具有防御性，向鸡给予本发明的疫苗，其HI抗体滴度显著高于16倍以上，确认该疫苗可以有效预防EDS发生。
本发明包括用于测定测试样品中针对EDSV的knob区域的抗体量的试剂盒，该试剂盒包含所述融合蛋白和/或融合蛋白多聚体。包含本发明的融合蛋白的试剂盒可以为固定有融合蛋白的平板。将测试样品用于所述平板，使平板上的融合蛋白和测试样品中包含的抗体反应。使用经酶或荧光物质标记的二抗，与一抗进行反应。也可以根据需要，添加酶底物，检测酶反应的产物或荧光量，由此测定测试样品中包含的抗体量。本发明的试剂盒也可以将以融合蛋白和/或融合蛋白多聚体为有效成分的疫苗用于鸡免疫之后，检测是否由疫苗产生抗体，由此用于疫苗的有效性评价。
本发明包括以上述核酸片段或重组表达载体为有效成分的EDS的DNA疫苗。在本发明的DNA疫苗中，优选核酸片段或重组表达载体包含用于鸡免疫后表达融合蛋白的启动子序列。
可以在向鸡接种本发明的DNA疫苗前后，利用EDSV对鸡进行攻击试验，根据结果，选择能够大幅度减轻伴随EDS的症状的核酸片段或重组表达载体作为EDS治疗剂的有效成分，根据此时的给药量规定有效成分量。
本发明的DNA疫苗中也可以包含药学上可接受的载体。例如，可以举出：盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、等渗水性缓冲液及它们的组合。另外，可以向其中适当混合佐剂、乳化剂、防腐剂、等渗剂、pH调节剂等添加剂。
本发明的DNA疫苗可以通过任意给药途径给药，如透皮给药、舌下给药、眼部给药、皮内给药、肌肉注射给药、口服给药、肠内给药、鼻腔给药、静脉内给药、皮下给药、腹腔给药、从口腔向肺部的吸入给药等。
本发明包括与所述融合蛋白和/或融合蛋白多聚体结合的抗体。可以以本发明的融合蛋白和/或融合蛋白多聚体为抗原，利用通常的免疫方法(J.McCAFFERTY等人编辑的Current Protocols in Molecular Biology，Antibody Engineering:A PRACTICALAPPROACH或者Carl A.K.BORREBAECK编辑的ANTIBODY ENGINEERING第二版)制作单抗及多抗等或者这些的人抗体。或者，可以通过利用噬菌体展示技术的抗体制作技术(BrianK.Kay等人编辑的Phage Display of Peptides and Proteins:A Laboratory Manual，J.McCAFFERTY等人编辑的Antibody Engineering:APRACTICAL APPROACH或者CarlA.K.BORREBAECK编辑的ANTIBODY ENGINEERING第二版)制备与该融合蛋白和/或其多聚体结合的抗体。本发明的抗体可以用作后述EDS治疗剂、试剂盒、亲合色谱法用载体等用途。
本发明包括以上述抗体为有效成分的EDS治疗剂。本发明的EDS治疗剂以所述抗体为有效成分，可以包含药学上可接受的载体。例如，可以举出：盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、等渗水性缓冲液及它们的组合，另外，也可以向其中适当混合佐剂、乳化剂、防腐剂、等渗剂、pH调节剂等添加剂。
本发明的EDS治疗剂可以通过任意给药途径给药，如透皮给药、舌下给药、眼部给药、皮内给药、肌肉注射给药、口服给药、肠内给药、鼻腔给药、静脉内给药、皮下给药、腹腔给药、从口腔向肺部的吸入给药等。
本发明包括试剂盒，该试剂盒包含与融合蛋白和/或融合蛋白多聚体结合的抗体，用于测定测试样品中EDSV的knob区域的含量。作为这样的试剂盒，包括将与融合蛋白结合的抗体固定在平板等上而成的试剂盒。本发明的包含抗体的试剂盒也可以以Knob含量为指标，用于评价有无EDSV感染。例如，将测试样品应用于固定有所述抗体的平板，然后使用经酶或荧光色素标记的抗体。可以孵育平板并洗涤，然后根据需要加入发色底物，并测量荧光量，由此评价测试样品中的Knob的含量。
作为平板，示例有：Nunc免疫板MaxiSorp(Thermo scientific)、ELISA平板(住友Bakelite株式会社)、ELISPOT(MERCK)、免疫板(科兹莫生物株式会社)、酶联板(IWAKI)，ELISA平板(ExtraGene)，可以利用本领域技术人员常用的方法将抗体结合在平板上。
作为利用酶或荧光色素标记抗体的方法，示例有：EasyLink抗体偶联试剂盒(abcam)、Lightning-Link快速偶联系统(Innova Biosciences Ltd)、Oyster抗体标记试剂盒(Luminartis GmbH)、酶标记试剂盒EZ-Link(PIERCE Biotechnology)、PlatinumLink蛋白标记试剂盒(Kreatech Biotechnology BV)、DyLight抗体标记试剂盒(PIERCEBiotechnology)。
本发明包括亲合色谱法用载体，该载体将针对融合蛋白和/或融合蛋白多聚体的抗体结合在载体上。本发明的融合蛋白和/或融合蛋白多聚体在宿主内外表达，在宿主内表达时，破坏宿主从而回收融合蛋白和/或融合蛋白多聚体，在宿主外表达时，从培养环境中回收融合蛋白和/或融合蛋白多聚体。本发明的载体可以用于从如上混合部分中回收融合蛋白和/或融合蛋白多聚体等用途。
作为载体，示例有：HiTrap NHS-activated HP(GE医疗)、NHS-activatedSepharose 4 Fast Flow(GE医疗)、CNBr-activated Sepharose 4B(GE医疗)、CNBr-activated Sepharose 4 Fast Flow(GE医疗)、EAH Sepharose 4B(GE医疗)、ECHSepharose 4B(GE医疗)、Profinity环氧树脂(BIORAD)、Affi-Gel Hz Hydrazide凝胶(BIORAD)，可以利用本领域技术人员常用的方法结合抗体。
实施例
下面，例举实施例等对本发明进行更为详细说明，但本发明不受这些实施例等的限定。
实施例1
Knob-GCN4蛋白及其多聚体的制备
(1)Knob-GCN4表达载体的构建
通过下述方法从EDSV KE-80株提取基因组DNA。在9日龄的发育家鸭卵尿囊腔内接种病毒，然后，将接种后第6天采集的尿囊腔液加入链霉蛋白酶溶液中，该链霉蛋白酶溶液添加有蛋白酶K(1mg/ml)，在50℃下振荡1小时，再于37℃下振荡过夜。然后，利用苯酚/氯仿去除蛋白，利用乙醇沉淀，进行RNase A(Qiagen)处理，从而提取病毒基因组DNA。
以提取的病毒基因组DNA为模板，使用具有NcoI识别序列的正义链引物(序列编号3)及具有XhoI识别序列的反义链引物(序列编号4)，通过聚合酶链式反应(PCR)，对编码纤维蛋白的knob区域及8个重复的柄区域的一部分(序列编号5)的DNA片段(序列编号6)进行扩增。利用限制性内切酶NcoI及限制性内切酶XhoI对该扩增DNA片段及质粒pET-15b(默克株式会社)进行酶切处理，然后，利用DNA连接酶将两者连接。将连接产物导入大肠杆菌DH5α，并将得到的质粒作为中间载体1。
为在大肠杆菌中表达多肽(下面称为(G4S)2-GCN4)(序列编号7)，对编码该多肽的DNA序列进行密码子优化，设计并人工合成DNA序列(序列编号8)，该多肽是在修饰GCN4蛋白(NCBI#:1CZQ_A)的三股卷曲螺旋形成单元(下面称为GCN4)添加(G4S)2连接物序列而成的，该DNA序列在5'末端添加有用于克隆于表达载体的NcoI识别序列以及在3'末端添加有用于克隆于表达载体的XhoI识别序列。利用限制性内切酶NcoI及限制性内切酶XhoI对该合成DNA及质粒pET-21d(默克株式会社)进行酶切处理，然后，利用DNA连接酶将两者连接。将连接产物导入大肠杆菌DH5α，并将得到的质粒作为中间载体2。
以中间载体1为模板，使用具有NcoI识别序列的正义链引物(序列编号9)及具有NcoI识别序列的反义链引物(序列编号10)，通过PCR，对编码Knob(序列编号11)的DNA片段(序列编号12)进行扩增。利用限制性内切酶NcoI对该扩增DNA片段及中间载体2进行酶切处理，然后，利用DNA连接酶将两者连接。将连接产物导入大肠杆菌DH5α，并将得到的质粒作为pKNOB2。pKNOB2包含DNA序列(序列编号14)，该DNA序列编码由Knob、(G4S)2连接物序列、GCN4及His×6(H6)标签序列构成的多肽(下面称为Knob-GCN4)(序列编号13)(图1)。将pKNOB2导入大肠杆菌BL21(DE3)(默克株式会社)，得到表达Knob-GCN4的大肠杆菌KNOB2株。
(2)重组大肠杆菌的培养及表达的蛋白的纯化
向200mL大小的锥形烧瓶中分别注入10ml的LB培养基和氨苄青霉素溶液(终浓度100μg/ml)，接种表达Knob-GCN4的大肠杆菌KNOB2株，在37℃下振荡培养14小时左右(预培养)。向2L大小的锥形烧瓶中分别注入250mL的LB培养基和氨苄青霉素溶液(终浓度100μg/ml)，向其中接种5ml的预培养菌液，在37℃下振荡培养至OD590超过0.6。主培养的OD590超过0.6时，添加异丙基-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)使终浓度为1mM，在37℃下振荡培养4小时。将主培养液移至离心管中，在8,000rpm、4℃下离心30分钟，由此回收菌体团块。
向50mL的BugBuster Master Mix(Novagen公司)加入两片Complete蛋白酶抑制剂混合物片剂(Roche)，作为菌体破碎液。将菌体团块悬浮在菌体破碎液中，室温下孵育60分钟，然后，进行超声波破碎(冰上、输出4、占空比70％，3次各10分钟)。对破碎液进行离心(15,000rpm、4℃，30分钟)，回收上清液(可溶性部分)。
使用HisTrap HP,5ml色谱柱(GE医疗公司)，根据色谱柱附带说明书，对可溶性部分中包含的重组抗原蛋白进行纯化。将添加有20mM(终浓度)咪唑的可溶性部分上色谱柱，使用包含20mM(终浓度)咪唑的缓冲液清洗色谱柱，然后使用包含500mM(终浓度)咪唑的缓冲液进行色谱柱洗脱。得到的洗脱部分用Amicon Ultra-15 10K(Millipore公司)进行浓缩，通过透析将缓冲液成分取代为PBS，得到Knob-GCN4抗原。
实施例2
GCN4-Knob蛋白及其多聚体的制备
(1)GCN4-Knob表达载体的构建
以中间载体2为模板，使用具有NcoI识别序列的正义链引物(序列编号15)及具有XhoI识别序列的反义链引物(序列编号16)，通过PCR，对DNA片段(序列编号18)进行扩增，该DNA片段编码GCN4中添加(G4S)1连接物序列而成的多肽(下面称为GCN4-(G4S)1)(序列编号17)。利用限制性内切酶NcoI及限制性内切酶XhoI对该扩增DNA片段及质粒pET-21d(默克株式会社)进行酶切处理，然后，使用DNA连接酶将两者连接。将连接产物导入大肠杆菌DH5α，经将得到的质粒作为中间载体3。
以中间载体1为模板，使用具有XhoI识别序列的正义链引物(序列编号19)及具有XhoI识别序列的反义链引物(序列编号20)，通过PCR，对编码Knob(序列编号11)的DNA片段(序列编号12)进行扩增。利用限制性内切酶XhoI对该扩增DNA片段及中间载体3进行酶切处理，然后，使用DNA连接酶将两者连接。将连接产物导入大肠杆菌DH5α，并将得到的质粒作为pKNOB3。pKNOB3包含DNA序列(序列编号22)，该DNA序列编码由GCN4、(G4S)1连接物序列、Knob及组氨酸六聚体标签序列构成的多肽(下面称为GCN4-Knob)(序列编号21)(图1)。将pKNOB3导入大肠杆菌BL21(DE3)(默克株式会社)，得到表达GCN4-Knob的大肠杆菌KNOB3株。
(2)与实施例1同样地培养重组大肠杆菌及纯化表达的蛋白，得到GCN4-Knob抗原。
实施例3
Knob-CMP蛋白及其多聚体的制备
(1)Knob-CMP表达载体的构建
为了在大肠杆菌中表达由Knob、(G4S)2H6(G4S)2连接物序列、及CMP蛋白(NCBI#:NP_001025546)的三股卷曲螺旋形成单元构成的多肽(下面称为Knob-CMP)(序列编号23)(图1)，对编码该多肽的DNA序列进行密码子优化，设计并人工合成DNA序列(序列编号24)，该DNA序列在5'末端添加有用于克隆于表达载体的NdeI识别序列以及在3'末端添加有用于克隆于表达载体的BamHI识别序列，进而，向5'末端以及3'末端添加保护碱基。利用DNA连接酶将该合成DNA与经限制性内切酶EcoRV酶切处理的质粒pUC57(GENSCRIPT株式会社)连接。将连接产物导入大肠杆菌DH5α，并将得到的质粒作为中间载体4。
利用限制性内切酶NdeI及限制性内切酶BamHI对中间载体4进行酶切处理，得到编码Knob-CMP的DNA片段。利用DNA连接酶将该DNA片段与经限制性内切酶NdeI及限制性内切酶BamHI酶切处理的质粒pET-11a(默克株式会社)连接。将连接产物导入大肠杆菌DH5α，并将得到的质粒作为pKNOB4。再将pKNOB4导入大肠杆菌BL21(DE3)(默克株式会社)，得到表达Knob-CMP的大肠杆菌KNOB4株。
(2)与实施例1同样地培养重组大肠杆菌及纯化表达的蛋白，得到Knob-CMP抗原。
实施例4
CMP-Knob蛋白及其多聚体的制备
(1)CMP-Knob9表达载体的构建
为了在大肠杆菌中表达由CMP、(G4S)2H6(G4S)1(G3S)1连接物序列、及Knob构成的多肽(下面称为CMP-Knob)(序列编号25)(图1)，对编码该多肽的DNA序列进行密码子优化，设计并人工合成DNA序列(序列编号26)，该DNA序列在5'末端添加有用于克隆于表达载体的NdeI识别序列以及在3'末端添加有用于克隆于表达载体的BamHI识别序列，进而，向5'末端以及3'末端添加保护碱基。利用DNA连接酶将该合成DNA与经限制性内切酶EcoRV酶切处理的质粒pUC57(GENSCRIPT株式会社)连接。将连接产物导入大肠杆菌DH5α，并将得到的质粒作为中间载体5。
利用限制性内切酶NdeI及限制性内切酶BamHI对中间载体5进行酶切处理，得到编码CMP-Knob的DNA片段。利用DNA连接酶将该DNA片段与经限制性内切酶NdeI及限制性内切酶BamHI酶切处理的质粒pET-11a(默克株式会社)连接。将连接产物导入大肠杆菌DH5α，并将得到的质粒作为pKNOB5。再将pKNOB5导入大肠杆菌BL21(DE3)(默克株式会社)，得到表达CMP-Knob的大肠杆菌KNOB5株。
(2)与实施例1同样地培养重组大肠杆菌及纯化表达的蛋白，得到CMP-Knob抗原。
比较例1
Knob蛋白及其多聚体的制备
(1)Knob表达载体的构建
为了在大肠杆菌中表达多肽(序列编号1)(图1)，对编码该多肽的DNA序列进行密码子优化，设计并人工合成DNA序列(序列编号2)，该多肽是在EDSV纤维蛋白的knob区域添加组氨酸六聚体标签序列而成，该DNA序列在5'末端添加有用于克隆于表达载体的NdeI识别序列以及在3'末端添加有用于克隆于表达载体的BamHI识别序列。利用限制性内切酶NdeI及限制性内切酶BamHI对该合成DNA及质粒pET-11a(默克株式会社)进行酶切处理，然后，使用DNA连接酶将两者连接。将连接产物导入大肠杆菌DH5α，并将得到的质粒作为pKNOB1。再将pKNOB1导入大肠杆菌BL21(DE3)(默克株式会社)，得到表达Knob的大肠杆菌KNOB1株。
(2)与实施例1同样地培养重组大肠杆菌及纯化表达的蛋白，得到Knob抗原。
试验例1
使用BCA蛋白测定试剂盒(Pierce社)对实施例1～4及比较例1中制备的五种重组抗原蛋白(Knob、GCN4-Knob、Knob-GCN4、CMP-Knob、Knob-CMP)进行定量。将结果示于表1。
表1
抗原蛋白 每1L大肠杆菌培养物的回收量
Knob 77mg
Knob-GCN4 21mg
GCN4-Knob 37mg
Knob-CMP 15mg
CMP-Knob 44mg
试验例2
重组蛋白性质的分析：
对实施例1～4及比较例1中纯化的五种重组抗原蛋白(Knob、GCN4-Knob、Knob-GCN4、CMP-Knob、Knob-CMP)进行SDS-PAGE分析。将重组抗原蛋白与不含还原剂的样品缓冲液混合，按照2μg/泳道，将在100℃下进行热变性处理5分钟后的蛋白样品、以及未进行热变性处理的蛋白样品施加于12.5％的均一浓度Tris-甘氨酸凝胶(Atto,E-R12.5L)并在10mA下电泳130分钟。利用Ez Stain Aqua(Atto,AE-1340)进行CBB染色。作为免疫印迹分析，通过一般方法进行PVDF膜转移之后，使用稀释100倍的抗Knob蛋白鸡血清进行一抗反应，使用稀释4,000倍的抗鸡IgG-HRP偶联抗体(鸡IgG(IgY)-重链和轻链抗体，BETHYLLABORATORIES公司)进行二抗反应。二抗反应后，使用Western Lightning Plus-ECL(Perkin Elmer Life and Analytical Science公司)进行化学发光反应，利用ImageQuant LAS4000 mini(GE医疗公司)记录发光图像。结果确认，五种重组抗原蛋白均形成推测为三聚体的分子(图2)。
使用与AKTA Prime Plus(GE医疗公司)连接的HiLoad 16/60 Superdex 200制备级色谱柱(GE医疗公司)进行凝胶过滤分析。流速设定为0.8ml/min，缓冲液使用PBS。分子量标志物使用凝胶过滤标准试剂盒LMW及HMW(GE医疗公司)。分析后确认，五种重组抗原蛋白均形成推测为三聚体的分子(图3)。
试验例3
重组抗原的免疫原性评价(血凝抑制试验(HI试验))：
使用实施例1～4及比较例1中纯化的五种重组抗原蛋白(Knob、GCN4-Knob、Knob-GCN4、CMP-Knob、Knob-CMP)，对鸡进行免疫，并测定所诱导的HI抗体滴度。以按照Knob换算为10μg/0.5mL的方式，将重组抗原蛋白与油性佐剂(轻质液体石蜡、山梨醇酐单硬脂酸酯、聚山梨醇酯80的混合物)混合，从而制备疫苗。作为对照疫苗，使用化学及血清疗法研究所市售的EDS疫苗抗原EDSV(EB66)。将用EB66细胞培养的EDSV与油性佐剂(轻质液体石蜡、山梨醇酐单硬脂酸酯、聚山梨醇酯80的混合物)混合，从而制备疫苗，使得EDSV为106.7TCID50/0.5mL以上。通过肌内注射将制得的疫苗0.5mL接种到29日龄的SPF鸡的鸡爪的肌肉内。免疫后七周，从鸡采血，对所采集血清进行HI试验。将试验血清与3倍量的25％高岭土混合(＝稀释4倍)，室温下每5分钟振荡，处理20分钟之后，在2,000rpm下离心5分钟，得到样本并作为HI试验的测定试样。测定试样使用PBS(-)二倍连续稀释，然后将0.025mL稀释试样添加到0.025mL的4单位/0.025mL的HA抗原中，室温下致敏10～20分钟，再添加0.05mL悬浮在PBS中的0.5％鸡红细胞并混合，室温下反应1小时后，由血凝图像判定HI抗体滴度。试验结果确认，重组抗原蛋白中，添加有多聚体形成单元的蛋白，特别是GCN4-Knob、CMP-Knob、Knob-CMP这三种重组蛋白抗原所诱导的HI抗体滴度提高(图4)。
试验例4
有效抗原量确认试验：
针对实施例1及4中纯化的重组抗原蛋白(Knob-GCN4及CMP-Knob)，实施对鸡的有效抗原量的确认试验。以按照Knob换算为10μg/0.5mL、3μg/0.5mL、1μg/0.5mL、0.3μg/0.5mL的方式，将重组抗原蛋白(Knob-GCN4及CMP-Knob)与油性佐剂(轻质液体石蜡、山梨醇酐单硬脂酸酯、聚山梨醇酯80的混合物)混合，制备疫苗，并通过肌内注射向29日龄的SPF鸡的鸡爪的肌肉内接种0.5mL疫苗。免疫后7周，从鸡采血，对所采集血清进行HI试验。试验血清与3倍量的25％高岭土混合(＝稀释4倍)，室温下每5分钟振荡，处理20分钟之后，在2,000rpm下离心5分钟，得到样本并作为HI试验的测定试样。测定试样使用PBS(-)二倍连续稀释，然后将0.025mL稀释试样添加到0.025mL的4单位/0.025mL的HA抗原中，室温下致敏10～20分钟，再添加0.05mL悬浮在PBS中的0.5％鸡红细胞并混合，室温下反应1小时后，由血凝图像判定HI抗体滴度。试验结果确认，重组抗原蛋白(Knob-GCN4)为1μg/0.5mL以上，重组抗原蛋白(CMP-Knob)为0.3μg/0.5mL以上时，显示良好的HI抗体诱导效果(图5及图6)。
试验例5
强毒EDSV感染防御效果的确认试验：
针对实施例4中纯化的重组抗原蛋白(CMP-Knob)，实施发病防御效果确认试验，该效果是指利用该蛋白免疫后的鸡中针对强毒EDSV感染的效果。以按照Knob换算为10μg/0.5mL的方式，将重组抗原蛋白(CMP-Knob)与油性佐剂(轻质液体石蜡、山梨醇酐单硬脂酸酯、聚山梨醇酯80的混合物)混合，制备疫苗。作为对照疫苗，使用化学及血清疗法研究所市售的EDS疫苗抗原EDSV(EB66)。将EB66细胞培养的EDSV与油性佐剂(轻质液体石蜡、山梨醇酐单硬脂酸酯、聚山梨醇酯80的混合物)混合，制备疫苗，使得EDSV为106.7TCID50/0.5mL以上。通过肌内注射将0.5mL制得的疫苗接种到约210日龄的市售鸡(蛋鸡)的鸡爪的肌肉内。于免疫后的4、6、9、12及16周采血，对所采集血清进行HI试验。试验血清与3倍量的25％高岭土混合(＝稀释4倍)，室温下每5分钟振荡，处理20分钟之后，在2,000rpm下离心5分钟，得到样本并作为HI试验的测定试样。测定试样使用PBS(-)二倍连续稀释，然后将0.025mL稀释试样添加到0.025mL的4单位/0.025mL的HA抗原中，室温下致敏10～20分钟，再添加0.05mL悬浮在PBS中的0.5％鸡红细胞并混合，室温下反应1小时后，由血凝图像判定HI抗体滴度。免疫后16周，以106.5TCID50/只的方式，通过口服给药感染强毒EDSV KE-80株，攻击后4周观察产蛋情况。试验结果确认，如用于免疫的重组抗原蛋白(CMP-Knob)为10μg/0.5mL，则免疫后16周内可维持高HI抗体滴度(图7)。另外，确认到经重组抗原蛋白(CMP-Knob)免疫后的鸡即使在免疫后16周感染强毒EDSV，也可以大幅度减轻停止产蛋、产出畸形蛋等临床症状(图8)。
工业实用性
本发明的疫苗以重组蛋白和/或其多聚体为有效成分，该重组蛋白是EDSV的knob区域和具有卷曲螺旋形成单元的多肽融合而成的，通过接种鸡，可以诱导高HI抗体，从而预防鸡的EDS发病。因此，可以在预测可能发生EDS的农场进行EDS发病预防。另外，本发明疫苗的生产不依赖鸭蛋，因此可以稳定地供给。
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Claims (13)

1.融合蛋白，其是由具有卷曲螺旋形成单元的多肽与减蛋综合征病毒的纤维蛋白中的顶端球区域结合而成的，其中所述顶端球区域是由序列编号11所示氨基酸序列构成的多肽，其中，所述具有卷曲螺旋形成单元的多肽来自天然多聚体形成蛋白，并且其中所述天然多聚体形成蛋白为GCN4或软骨基质蛋白。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述天然多聚体形成蛋白为软骨基质蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白是由序列编号23所示氨基酸序列构成的多肽。
4.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白是由序列编号25所示氨基酸序列构成的多肽。
5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述天然多聚体形成蛋白为GCN4，其中GCN4结合于顶端球区域的C端侧。
6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白是由序列编号21所示氨基酸序列构成的多肽。
7.融合蛋白多聚体，所述融合蛋白多聚体由权利要求1至6中任意一项所述的融合蛋白多聚化而成。
8.核酸片段，其包括编码权利要求1至6中任意一项所述的融合蛋白的DNA序列。
9.重组表达载体，其包含权利要求8所述的核酸片段。
10.减蛋综合征疫苗，其包含权利要求1至6中任意一项所述的融合蛋白或权利要求7所述的融合蛋白多聚体作为有效成分。
11.减蛋综合征的DNA疫苗，其包含权利要求8所述的核酸片段或权利要求9所述的重组表达载体作为有效成分。
12.试剂盒，其包含权利要求1至6中任意一项所述的融合蛋白，或权利要求7所述的融合蛋白多聚体，其中所述试剂盒用于测定测试样品中针对减蛋综合征病毒的顶端球区域的抗体量。
13.权利要求1至6中任意一项所述的融合蛋白，或权利要求7所述的融合蛋白多聚体，或权利要求8所述的核酸片段或权利要求9所述的重组表达载体在制备用于预防减蛋综合征的试剂中的用途。
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