TWI782542B - 一種鞭毛蛋白的重組蛋白及其用途 - Google Patents

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秋容 段氏
柯冠銘
王祥宇
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Abstract

本發明提供一種鞭毛蛋白的重組蛋白及其用途。該重組蛋白為鼠傷寒沙氏桿菌（S. Typhimurium）鞭毛蛋白的N端片段，包含一與SEQ ID NO：1具有至少98%同源性之胺基酸序列。該重組蛋白，可用於製備促進免疫活性組成物，促進雞的促發炎細胞因子IL-1β、IL-6及IL-8以及細胞因子IFN-γ、IL12及IL4之表現量，或促進CD4+T細胞及CD8+T細胞之表現量。該重組蛋白與抗原結合作為嵌合蛋白用於疫苗時，可增強雞對抗原之體液免疫及細胞免疫，增加疫苗的保護效果。該重組蛋白片段小，且可容易地與次單位疫苗抗原結合，因此可作為佐劑理想應用於各種多價次單位疫苗。

Description

一種鞭毛蛋白的重組蛋白及其用途
本發明係關於生物科學領域，具體而言，是關於一種鞭毛蛋白的重組蛋白、該重組蛋白作為促進免疫活性組成物之用途、以及該重組蛋白作為疫苗佐劑之用途。
鞭毛蛋白是細菌鞭毛的主要結構蛋白，由於鞭毛為細菌的重要構造，宿主免疫系統通常會將鞭毛蛋白之辨識作為感染的信號。已知的辨識受體有類鐸受體（Toll-like receptor 5，TLR5）及類NOD受體蛋白4發炎體受體（NOD-like receptor protein 4 inflammasome receptor）NAIP5/6等。當鞭毛蛋白與哨細胞上的TLR5結合時，會誘導MyD88主導訊息傳遞，從而活化為促發炎轉錄因子之核因子-κB（NF-κB），進而啟動先天免疫及隨後的適應性免疫。
在鞭毛蛋白之免疫啟動機制的研究中，已發現鼠傷寒沙氏桿菌（S. Typhimurium）的鞭毛蛋白包含4個結構域：D0、D1、D2及D3，排列為呈迴力鏢狀結構。在鞭毛蛋白單體聚合為鞭毛時，D0及D1被嵌入鞭毛之核內，而D2及D3則從表面突出。對多種細菌之鞭毛蛋白的比較結果顯示，D0與D1保留性高，而D2及D3在序列或結構上表現出較大的差異。並且，大多數抗體會對為誘餌（decoy）之D3結構域有反應。突變分析指出，該D1中有一13殘基之區域為與TLR5相互作用部位。在D1的一具保留性精胺酸殘基之熱點，會與TLR5之富白胺酸之重複9（LRR9）之環結構相互作用。
對D0及D1結構域的進一步研究結果顯示，在蛋白質序列中，鞭毛蛋白的結構域從N端開始排列為：D0-D1-D2-D3-D2-D1-D0，完整重建D0及D1會需要鞭毛蛋白之N端及C端序列，從而使蛋白質設計工作複雜化。然而，刪除C端D0部分（殘基444-492）並不會消除TLR5對鞭毛蛋白的辨識，且N端部分（殘基79-117）可以刺激T H1 （IFN-γ）型與T H2 （IL-4）型細胞因子的產生，相對地C端部分（殘基477-508）則無法誘發T H2反應。因此，可推測鞭毛蛋白之N端與C端相比，在TLR5之活化中發揮更重要的作用。對於鞭毛蛋白之對TLR5活化域的進一步定位，也使其能設計為更靈巧的TLR5致效劑（agonist），從而減少副作用（參照非專利文獻1）。
在實際應用上，非專利文獻2揭露了一種具有完整D0及D1結構域的工程多肽藥物CBLB502，其完整保留了透過TLR5活化NF-κB訊息傳遞的能力。 ［先前技術文獻］ ［非專利文獻］
［非專利文獻1］Doan, Thu-Dung, et al. "N-terminus of Flagellin Fused to an Antigen Improves Vaccine Efficacy against Pasteurella multocida Infection in Chickens." Vaccines 8.2 （2020）: 283. ［非專利文獻2］Burdelya, Lyudmila G., et al. "An agonist of toll-like receptor 5 has radioprotective activity in mouse and primate models." Science 320.5873(2008)：226-230.
雖然先前技術中已揭露鼠傷寒沙氏桿菌之鞭毛蛋白之D2、D3對誘發TLR5活化係非必要，僅需域D0及D1即可活化免疫反應，且消除具有誘餌特性的D3可大幅降低不期望的免疫原性及毒性。然而，在作為疫苗的抗原-佐劑嵌合蛋白設計中要將僅D0/D1部分設計為佐劑時，仍存在許多問題。例如，要重建D0/D1時，必須對D1之N端及C端部分進行重新連結。在上述CBLB502的選殖中，此僅需一彈性連結子(flexible linker)序列，但插入抗原去重新連接D1，則可能會導致該重組蛋白無法發揮功能。非專利文獻1中係記載：重組時以疫苗病毒蛋白L1R替換鞭毛蛋白的高變異區，會導致抗體無法辨識原生L1R。亦即，在設計表現此種重組蛋白之載體時，成功的構築(construct)需要使抗原和佐劑兩者之蛋白皆正確折疊，因此在較複雜的設計中有難度。
因此，本發明所欲解決之課題，係提供一鼠傷寒沙氏桿菌之鞭毛蛋白之重組蛋白，使該重組蛋白可作為簡易鞭毛蛋白，同時，與先前技術所揭露者相比，更容易應用於為疫苗之抗原-佐劑嵌合蛋白的建構。
發明人深入研究探討該課題後，發現鼠傷寒沙氏桿菌(S. Typhimurium）之鞭毛蛋白全長雖為494個胺基酸，但其N端的前99個胺基酸即足以達成免疫活化以及疫苗保護增強之效果。具體而言，本發明人建構了一鞭毛蛋白之N端（nFlic）與截斷之多殺巴斯德氏菌脂蛋白（plpE，經截斷者簡稱tplpE）的重組蛋白，其中，該鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白之N端片段，為N段第1至99個殘基。發明人發現，該重組蛋白可達成雞對多殺巴斯德氏菌（Pasteurella multocida）脂蛋白plpE的免疫活化。且該重組蛋白作為多殺巴斯德氏菌引起之雞霍亂的疫苗，與僅包含多殺巴斯德氏菌脂蛋白作為疫苗抗原的疫苗相比，保護效果較強，可提高接種疫苗雞隻的生存率。
因此，本發明提供以下技術手段： （1）一種重組蛋白，其特徵係其包含鼠傷寒沙氏桿菌（S. Typhimurium）鞭毛蛋白重組蛋白，該鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白重組蛋白包含一與SEQ ID NO：1具有至少98%同源性之胺基酸序列。 （2）如第1項所述之重組蛋白，其中，該重組蛋白進一步包含一作為抗原之重組蛋白，且該作為抗原之重組蛋白與該鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白重組蛋白透過一胜肽連接子連接。 （3）如第2項所述之重組蛋白，其中，該作為抗原之重組蛋白為多殺巴斯德氏菌（Pasteurella multocida）脂蛋白E重組蛋白，包含一與SEQ ID NO：2具有至少98%同源性之胺基酸序列； 該胜肽連接子為甘胺酸－絲胺酸連接子； 該重組蛋白包含一與SEQ ID NO：3具有至少98%同源性之胺基酸序列。 （4）一種多核苷酸，其具有SEQ ID NO：6之核苷酸序列，可編碼第3項所述之重組蛋白之胺基酸序列。 （5）一種鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白用於製備疫苗佐劑的用途，其特徵係該鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白為重組蛋白，包含一與SEQ ID NO：1具有至少98%同源性之胺基酸序列。 （6）一種鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白用於製備促進雞免疫活性組成物的用途，其特徵係該重組鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白為重組蛋白，包含一與SEQ ID NO：1具有至少98%同源性之胺基酸序列。 （7）如第6項所述之鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白用於製備促進雞免疫活性組成物的用途，其中，該促進雞免疫活性組成物係用於提升：（a）促發炎細胞因子IL-1β、IL-6及IL-8之表現量；（b）CD4+T細胞及CD8+T細胞之表現量；（c），細胞因子IFN-γ、IL12及IL4之表現量。 （8）一種鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白用於製備疫苗的用途，該鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白為重組蛋白，包含一與SEQ ID NO：1具有至少98%同源性之胺基酸序列； 該疫苗包含一抗原物質，為多殺巴斯德氏菌脂蛋白E之重組蛋白，具有一與SEQ ID NO：2具有至少98%同源性之胺基酸序列； 該疫苗包含一甘胺酸－絲胺酸連接子，連接該鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白重組蛋白與該多殺巴斯德氏菌脂蛋白之重組蛋白。 （9）如第8項所述之用途，其中，該疫苗係用於提升雞感染多殺巴斯德氏菌後的生存率。 （10）一種鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白用於製備TLR5致效劑的用途，其特徵係該鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白為重組蛋白，包含一與SEQ ID NO：1具有至少98%同源性之胺基酸序列。
本發明提供的鞭毛蛋白之重組蛋白，可用於製備促進免疫活性組成物，促進雞的促發炎細胞因子IL-1β、IL-6及IL-8以及細胞因子IFN-γ、IL12及IL4之表現量，或促進CD4+T細胞及CD8+T細胞之表現量。該重組蛋白與抗原結合作為嵌合蛋白用於疫苗時，可增強雞對抗原之體液免疫及細胞免疫，增加疫苗的保護效果。該重組蛋白片段小，且可容易地與次單位疫苗抗原結合，因此可作為佐劑理想應用於各種多價次單位疫苗。
例如，將本發明之鞭毛蛋白重組蛋白作為佐劑，與作為抗原之多殺巴斯德氏菌脂蛋白E結合從而製備為疫苗後，可加速接種的雞對該抗原之抗體反應，並增強細胞性免疫力，接種該疫苗的雞，在感染多殺巴斯德氏菌後亦具有較高的存活率。
以下揭示本發明實施方式， 本發明並非限定於完全包含下述記載之構成的態樣，下述記載係用於闡釋本發明之詳細內容與實施之效果。
本發明之用語的定義，係結合目前生物技術領域所公認的定義，適用於整份說明書，除非說明書中另有基於特定情況的說明。
本發明中「蛋白」之用語係指由多個胺基酸單體及/或其類似物所組成之有機聚合物，包含例如全長蛋白或全長蛋白之片段。
本發明中「胺基酸」、「殘基」之用語，係指20種天然胺基酸中的任一種，包含具有非天然側鏈的合成胺基酸，亦包含右旋（D）與左旋（L）光學異構物。
本發明中「重組蛋白」之用語，係指全長蛋白中的功能性片段，或同時包含不同來源之功能性片段的嵌合蛋白。
本發明中「功能性片段」之用語，係指與目標蛋白全長胺基酸序列據同源性的一部份或局部胺基酸序列，該部分或局部保留其所屬蛋白或多肽的生物活性，此生物活性可與目標蛋白實質上相同或更高，或低於目標蛋白之生物活性。
本發明中「同源性百分比」之用語，係指最佳地比較兩個核苷酸或胺基酸序列時，在兩序列的最佳比對下，透過兩個序列中皆具有的相同核苷酸或胺基酸之位置數，得到匹配位置數，將此數值除以總位置數，得到序列相似程度的百分比，並透過所屬技術領域中公知的任一種序列比較演算法或演算程式評估同源性。例如，可透過Basic Loca l Alignment Search Tool（BLAST） 進行評估。
本發明中「連接」、「結合」、「連結」等用語，係指藉由鍵結或非鍵結的交互作用使兩個或多個蛋白相連或結合在一起，其包含直接或間接連接。在一些實施型態中，連接是透過例如連接子間接連接。
本發明中「鞭毛蛋白重組蛋白」的產生方法，只要是可使所產生重組蛋白奏效本發明之功效的方法，則無特別限制，可適宜選用各種已知的重組蛋白製備方法。
本發明中「專一引子對」，只要是可使增幅產物奏效本發明之功效的引子對，則無特別限制。可適宜地基於基因資料庫所提供之目標基因序列進行設計，例如，可基於美國國家生物技術資訊中心之GenGank資料庫所提供之目標基因序列，設計專一性引子對之序列。所設計之引子，可進一步包含用於選殖的限制酶切位。
在一實施態樣中，本發明的鞭毛蛋白重組蛋白，或該重組蛋白與抗原嵌合而成的重組蛋白，可藉由原核生物系統表現特定核苷酸序列而獲得。
在一實施型態中，本發明之鞭毛蛋白重組蛋白，包含一與SEQ ID NO：1具有至少98%同源性的胺基酸序列，可藉由原核生物系統表現與SEQ ID NO：4具有至少98%同源性之核苷酸序列而獲得。
在一實施型態中，可利用專一性引子對進行聚合酶鏈鎖反應（PCR）增幅而得到DNA序列SEQ ID NO：2。 該專一性引子對，可為例如上游引子SEQ ID NO：13及下游引子SEQ ID NO：14。
在一實施態樣中，為了進一步加強鞭毛蛋白重組蛋白與TLR5之結合，該鞭毛蛋白之重組蛋白，可進一步包含其他胺基酸序列，使該重組蛋白表現鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白D1結構域中的3個α螺旋連結結構。
在一實施態樣中，本發明之鞭毛蛋白重組蛋白，可作為TLR5致效劑使用，用於增強免疫反應，或增進疫苗之功效。
在一實施態樣中，本發明之鞭毛蛋白重組蛋白用於製備疫苗佐劑的用途，是指將可編碼本發明鞭毛蛋白重組蛋白之mRNA用於mRNA疫苗之製作。具體而言，可列舉例如：使mRNA疫苗包含一mRNA，該mRNA可編碼抗原蛋白及本發明之鞭毛蛋白重組蛋白。
以下記載的實施態樣中，選用大腸桿菌菌株BL21作為表現重組蛋白之原核生物系統，並選用多殺巴斯德氏菌脂蛋白E作為抗原，進一步例示說明本發明實施方式，但本發明並不限於此實施態樣。 質體建構及重組蛋白之表現：建構質體以表現以下重組蛋白：（1）重組蛋白nFliC-tplpE，為本發明之鞭毛蛋白重組蛋白，（鞭毛蛋白之N端部分1-99殘基，以下簡稱nFlic）與截斷之多殺巴斯德氏菌脂蛋白E（P. multocida lipoprotein E，以下簡稱plpE）的融合蛋白，其中，截斷之多殺巴斯德氏菌脂蛋白係作為疫苗抗原；（2） 重組蛋白tplpE，即經截斷之多殺巴斯德氏菌plpE。
質體建構中使用的引子，其引子序列、包含之限制酶切位、所增幅序列之長度、增幅使用之模板DNA等資訊，如表1所示。
〔表1〕
Figure 02_image001
註1：斜體字係代表限制酶切位。 註2：粗體標示序列，代表甘胺酸－絲胺酸連接子序列。
細菌菌株之培養：鼠傷寒沙氏桿菌（ATCC 14028）培養於37℃的胰蛋白大豆培養液中。多殺巴斯德氏菌菌株A3（ATCC 15742）及多殺巴斯德氏菌菌株之強毒分離株Chu01培養於37℃的腦心輸液培養液。以hyaD-hyaC基因對應引子進行PCR，確認Chu01屬於血清群A。
tplpE 之選殖：首先使用表1中列出的引子，從多殺巴斯德氏菌A3血清型（ATCC 15742）之DNA中選殖出plpE全長核苷酸片段（以下亦簡稱plpE）並接合至載體pET32a（Novagen，德國達母斯塔特）。隨後，使用ExPASy蛋白質分析伺服器，辨識出plpE中一具有高抗原性和親水性的保留性區域（殘基26-86）。藉由使用目標為此片段的引子（表1的tplpE引子對）進行亞選殖，獲得經截斷之脂蛋白E片段tplpE之核苷酸序列。
nFliC 之選殖：從鼠傷寒沙氏桿菌（S. Typhimurium）的DNA中選殖出表現全長鞭毛蛋白（FliC）的核苷酸片段，並接合至pET32a，再使用目標為表現nFlic之核苷酸序列的引子（表1）進行亞選殖。
nFliC-tplpE 建構體：以nFlic及tplpE之PCR產物為模板DNA，藉由nFliC-tplpE引子（表1）進行嵌合聚合酶鏈鎖反應，其中nFliC係連接至tplpE之N端。將此最終的建構體插入至pET32a中，並藉由定序進行再確認。
重組蛋白之表現：將（1）nFliC-tplpE及（2）tplpE質體構建體，根據製造廠商說明分別轉型大腸桿菌BL21（DE3）（益生生技，臺灣）。在37℃下添加1-mM的異丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG，Sigma，德國達母斯塔特）誘導蛋白質表現，4小時後收集細胞，以非變性裂解液（300-mM KCl，50-mM KH2PO4及5-mM咪唑）裂解並進行超音波處理。以可溶部分為組合蛋白，根據廠商說明藉由His-tag標籤與Bio-scale Mini Profinity IMAC卡夾（Bio-Rad，美國）進行純化。重組蛋白的表現量，以12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳結果圖（SDS-PAGE）分析，標準蛋白為BSA蛋白。同時，為了進一步確認重組蛋白，亦進行西方墨點轉漬分析。在分析中，凝膠電泳後，蛋白質被轉印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上（默克，德國達母斯塔特）。西方墨點轉漬分析中的第一抗體使用1:5000稀釋之6X-His Tag抗體溶液（Gentex，臺灣新竹），第二抗體則使用1:5000稀釋的與HRP結合之山羊抗小鼠抗體（Gentex，臺灣）。顯色使用Western Lightning PLUS試劑（PerkinElmer，美國）。並以ToxinSensorTM 終點顯色法內毒素檢測套組（GenScript，美國）確認經純化蛋白質的內毒素量。
nFliC-tplpE重組蛋白的預測結構如圖1B所示。重組蛋白純化前後的SDS-PAGE與西方墨點轉漬分析結果如圖1D、1E所示，其大小約為37kDa，包含pET32a載體所插入的20kDa大小之Trx-His-S-enterokinase標籤。在蛋白質的表現結果中，nFliC-tplpE係高度表現且為可溶，濃度約為800mg/L。上述內毒素量檢測結果，為低於0.125EU/mL。
SDS-PAGE與西方墨點轉漬分析結果如圖1所示。上述內毒素量檢測結果，為低於0.125EU/mL。後述實施例中，係使用此等重組蛋白。
疫苗之製備：下述實施例中，為了評估重組蛋白nFliC用於疫苗之效果，製備了包含重組蛋白nFliC-tplpE或tplpE的疫苗，以及作為對照組之僅含有PBS的疫苗。疫苗製備係將純化後的50微克/劑之各重組蛋白或PBS，分別與油包水型佐劑Montanide ISA71（Seppic，法國巴黎）按4:6（水：油）之比例配製，使每隻雞最終注射量為0.2毫升。後述實施例中的疫苗，係使用此等疫苗。
下述各實施例中，分析細胞因子表現之即時聚合酶鏈鎖反應（RT-PCR）中所使用的各種引子，其目標基因、引子序列、長度、反應溫度等資訊，如表2所示。表2中，IL代表介白素（interleukin），IFN-γ代表干擾素-γ。
〔表2〕
Figure 02_image003
下述各實施例的統計分析，係使用IBM SPSS統計軟體版本22進行。在抗體反應、細胞因子mRNA表現量以及CD4 +與CD8 +T細胞百分比的平均值比較中，採用單向變異述分析（ANOVA）和Tukey事後歸因分析。數據皆以平均值±標準誤差（SEM）表示，所有免疫分析的顯著水準（p）皆是設為0.05。 ［實施例］
實施例1 ：重組蛋白之免疫刺激效果
從未接種過疫苗的雞（n=3，來自一當地農場的五週齡來航雞）收集週邊血單核細胞（PBMCs），分別以FliC、nFliC-tplpE、tplpE刺激，並另以PBS處理者作為對照組。收集PBMCs方法如下：將血液樣本收集於含有乙二胺四乙酸（EDTA）的試管中，加入細胞分離液Ficoll-Paque（Amersham Biosciences，美國），並將混合液離心（252×g，40分鐘）。使用含5%胎牛血清（Gibco Invitrogen，美國）之RPMI-1640培養基（Gibco Invitrogen，美國），將細胞洗滌兩次並重新懸浮，使濃度為2×10 6細胞/毫升。將此新鮮製備的PBMCs加入含10μg/mL刺激用重組蛋白的24孔盤中，培養2小時（37℃，5%CO 2）。接著，使用Total RNA Extraction Miniprep System套組（Viogene，台灣）萃取總RNA，再以Reverse Transcriptase套組（Applied Biosystems，美國）合成互補DNA（cDNA）。使用表2所示引子，對促發炎細胞因子（IL-1β、IL-6和IL-8）及持家基因甘油醛3-磷酸脫氫酶（GAPDH）進行即時聚合酶連鎖反應，操作儀器使用SmartCycler I（Cepheid，美國）。將細胞因子基因之表現量與GAPDH基因表現量進行正規化，使其表示為相對於PBS對照組的n倍增加或遞減。
促發炎細胞因子表現結果如圖2所示，與重組蛋白tplpE相比，重組蛋白nFliC-tplpE明顯提高了IL-1β、IL-6和IL-8的表現量。雖然提高的效果亞於全長鞭毛蛋白（FliC），但此結果顯示重組蛋白nFliC作為較短片段卻仍保留了Flic的免疫刺激作用，確實可作為有效的輔助劑。
實施例2 ：重組蛋白之加速抗體反應效果
從24隻雞（來自當地農場的五週齡來航雞）隨機分配為3組，用於接種前述3種不同疫苗，每組8隻。每隻雞接種2次，隔兩週且為皮下注射接種。為了分析重組蛋白疫苗對抗體反應之影響，在接種後的第0、7、14及第28天，從各疫苗組的各3隻雞採集全血，以間接式酵素結合免疫吸附分析法（ELISA）測定經接種雞之血清抗體量。上述所有動物實驗程序（NPUST-106-055）皆經過國立屏東科技大學（NPUST）動物照護及使用委員會的核准。實驗是基於國立屏東科技大學倫理規則及法律進行。
具體而言，係先使採集的全血凝血，再離心收集血清（700×g，5分鐘）。間接式ELISA法中，先使披覆抗原plpE固著於盤上（每孔50ng），進行洗滌以及阻斷後，加入作為第一抗體的1:10000稀釋血清樣本。第二抗體使用1:5000稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）結合抗雞IgG（Sigma，美國）。顯色使用Peroxidase套組（KPL，USA）。以MultiskanTM FC微盤光度計讀取450nm阻光密度值。
結果如圖3所示，接種後第14天及第21天時，接種nFliC-tplpE疫苗之雞的抗體量明顯高於接種tplpE疫苗之雞，顯示疫苗添加NfliC後可加速抗體反應，亦即可增強體液免疫反應（Thermo Fisher Scientific, 芬蘭）。
實施例3 ：重組蛋白之增強細胞免疫反應效果
同樣從實施例2的經接種的雞收集PBMCs，收集步驟如實施例1所述，收集後將PBMCs洗滌並重新懸浮於含有抗CD4-PE抗體或抗CD8-FITC抗體（Arigo，台灣）的PBS中，在4℃下作用45分鐘。接著，使用BD AccuriTM C6流式細胞儀（BD Biosciences，美國）分析經標記的細胞。
結果如圖4所示，在接種後第14天，nFliC-tplpE接種組及tplpE接種組之PBMCs，與PBS接種組之PBMCs相比，CD4 +和CD8 +T群皆有擴增。其中，nFliC-tplpE接種組的CD8 +T細胞百分比更是顯著高於tplpE組（8.7%）。雖然到第28天時nFliC-tplpE接種組的CD8 +T群縮減，但上述結果仍顯示在疫苗中藉由nFlic的添加，可增強早期細胞免疫反應。
實施例4 ：重組蛋白所增強細胞因子類型之分析
將實施例2中接種後第28天雞的PBMCs，以10μg/mL之plpE刺激，觀察刺激後產生之細胞因子的類型。觀察目標為TH1型(IFN-γ及IL12)及TH2型(IL4及IL10)細胞因子，刺激試驗及即時聚合酶連鎖反應的步驟如實施例1所述。結果如圖5所示，TH1型(IFN-γ及IL12)及TH2型(IL4)細胞因子的mRNA表現量在nFliC-tplpE接種組皆有顯著的增強，此與使用其他鞭毛蛋白之建構體的研究結果一致(參照非專利文獻1)。結合上述實施例3之結果，可認為本發明中之nFlic重組蛋白所誘導的細胞因子表現情形，與全長鞭毛蛋白相似。
實施例5：重組蛋白提升生存率之效果
實施例2中經接種的雞，在接種後第28天，對其肌肉注射1.6×105CFU(10 LD50)的多殺巴斯德氏菌菌株之強毒分離株Chu01，進行攻毒試驗。監測此等雞的臨床症狀並記錄存活率。上述所有動物實驗程序(NPUST-106-055)皆經過國立屏東科技大學(NPUST)動物照護及使用委員會的核准。
結果如圖6所示，tplpE接種組中，存活率僅有25%。相對地，nFliC-tplpE接種組中，存活率增至75%。此結果顯示重組蛋白nFliC提升了疫苗的保護效果。
發明人推測，本發明中鞭毛蛋白重組蛋白達成功效的可能機制如下所述，但該記載並非用於限制本發明之範圍。
TLR5結合之鞭毛蛋白的晶體結構係證明D1結構域中的3個α螺旋連結而呈桿狀，其與TLR5的馬蹄形外部結構域相互作用，交互作用對與TLR5之結合係必要。其中，兩個α螺旋係位於鞭毛蛋白之N端，另一個位於C端。N端的兩個螺旋構造與C端的螺旋構造相比，係組合而成為結合面中較大的部分（約60%）。本發明的鞭毛蛋白重組蛋白nFliC，包含了鞭毛蛋白N端的其中一個螺旋構造，以及絕對保留殘基Arg91，從而可與TLR5結合。與其他兩個螺旋構造相比，本發明之鞭毛蛋白重組蛋白中的該螺旋構造，可能在TLR5之結合中，發揮了更關鍵的作用。
無
［圖1A〕表示全長鞭毛蛋白D0、D1、D2、D3各結構域的3D結構的圖，由EzMol分子建模伺服器所繪製。 ［圖1B〕 表示重組蛋白nFliC-tplpE 之預測3D結構的圖，由Phyre2分子建模伺服器所繪製，圖中GS連接子為甘胺酸－絲胺酸連接子。 ［圖1C〕表示nFliC-tplpE在pET32a表現載體中選殖位點的圖。 ［圖 1D〕 表示各重組蛋白表現情形的圖，圖之上側為十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳結果圖（SDS-PAGE），圖之下側為西方墨點轉漬結果圖。 ［圖 1E〕經純化之nFliC-tplpE及tplpE的SDS-PAGE 結果圖。 ［圖2〕 表示促發炎細胞因子基因（IL-1β、IL-6和IL-8）表現情形的圖。資料以平均值±SEM表示。不同的上標字母係表示不同處理組間是否具顯著差異（P ＜ 0.05）。 ［圖3〕表示經接種雞之抗原特異性抗體表現情形的圖。圖中數據為平均±SEM，不同的上標字母係表示同一時間點之不同處理組間是否具顯著差異（P ＜ 0.05）。 ［圖4〕表示經接種雞之週邊血單核細胞（PBMCs）中CD4+及CD8+ T細胞百分比的圖。圖中數據為平均值±SEM。不同的上標字母係表示同一時間點之不同處理組間的CD4+及CD8+ T細胞百分比是否具顯著差異（P ＜ 0.05）。 ［圖5〕表示經接種雞之細胞因子基因（IFN-γ、IL-12、IL-4及IL-10）表現情形的圖。圖中數據為平均值±SEM。不同的上標字母係表示不同處理組間的每種細胞因子表現量是否具顯著差異（P ＜ 0.05）。 ［圖6〕表示經多殺巴斯德氏菌攻毒後之經接種雞的生存率的圖。 
                         序列表
          <![CDATA[<110>  國立屏東科技大學]]>
          <![CDATA[<120>  一種鞭毛蛋白的重組蛋白及其用途]]>
          <![CDATA[<130>  P00001-P21]]>
          <![CDATA[<160>  32    ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn version 3.5]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  99]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  Artificial Sequence]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  S. Typhimurium鞭毛蛋白重組蛋白]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn 
          1               5                   10                  15      
          Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala Leu Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu 
                      20                  25                  30          
          Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln 
                  35                  40                  45              
          Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala 
              50                  55                  60                  
          Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala 
                          85                  90                  95      
          Val Gln Ser 
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          <![CDATA[<223>  Pasteurella multocida脂蛋白E重組蛋白]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          Gly Ser Ala Gly Asn Arg Ala Asp Arg Val Glu Gln Lys Ala Gln Pro 
          1               5                   10                  15      
          Val Gln Ser Asn Ser Glu Pro Ser Ser Ala Pro Ile Lys Asn Pro Thr 
                      20                  25                  30          
          Asn Thr Ala Thr Asn Asp Ser Leu His Asp Lys Leu Ser Met Ser Ser 
                  35                  40                  45              
          His Asp Thr Ser Lys Glu Asn Ser Gln Gln Ser Ser Phe 
              50                  55                  60      
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  165]]>
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          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  鞭毛蛋白與經截斷Pasteurella multocida脂蛋白E之嵌合蛋白]]&gt;
          <br/>
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          1               5                   10                  15      
          Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala Leu Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu 
                      20                  25                  30          
          Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln 
                  35                  40                  45              
          Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala 
              50                  55                  60                  
          Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala 
                          85                  90                  95      
          Val Gln Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Ala Gly Asn Arg Ala Asp 
                      100                 105                 110         
          Arg Val Glu Gln Lys Ala Gln Pro Val Gln Ser Asn Ser Glu Pro Ser 
                  115                 120                 125             
          Ser Ala Pro Ile Lys Asn Pro Thr Asn Thr Ala Thr Asn Asp Ser Leu 
              130                 135                 140                 
          His Asp Lys Leu Ser Met Ser Ser His Asp Thr Ser Lys Glu Asn Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Gln Ser Ser Phe 
                          165 
          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<211>  297]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  Artificial Sequence]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  表現S. Typhimurium鞭毛蛋白重組蛋白之核酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          atggcacaag tcattaatac aaacagcctg tcgctgttga cccagaataa cctgaacaaa       60
          tcccagtccg ctctgggcac cgctatcgag cgtctgtctt ccggtctgcg tatcaacagc      120
          gcgaaagacg atgcggcagg tcaggcgatt gctaaccgtt ttaccgcgaa catcaaaggt      180
          ctgactcagg cttcccgtaa cgctaacgac ggtatctcca ttgcgcagac cactgaaggc      240
          gcgctgaacg aaatcaacaa caacctgcag cgtgtgcgtg aactggcggt tcagtct         297
          <![CDATA[<210>  5]]>
          <![CDATA[<211>  183]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  Artificial Sequence]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  表現經截斷Pasteurella multocida脂蛋白E之核酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          ggtagcgctg gaaatcgtgc tgaccgtgta gagcaaaaag cacaaccggt tcaatcaaat       60
          agtgagcctt cttccgctcc aatcaaaaat cctactaata ccgccacgaa tgattctctt      120
          catgacaaac tttcaatgtc ttcccatgac acatccaaag aaaatagtca acaatcctcc      180
          ttt                                                                    183
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  495]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  Artificial Sequence]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  表現S. Typhimurium鞭毛蛋白與經截斷Pasteurella ]]>
                 multocida脂蛋白E之嵌合蛋白的核酸序列
          <![CDATA[<400>  6]]>
          atggcacaag tcattaatac aaacagcctg tcgctgttga cccagaataa cctgaacaaa       60
          tcccagtccg ctctgggcac cgctatcgag cgtctgtctt ccggtctgcg tatcaacagc      120
          gcgaaagacg atgcggcagg tcaggcgatt gctaaccgtt ttaccgcgaa catcaaaggt      180
          ctgactcagg cttcccgtaa cgctaacgac ggtatctcca ttgcgcagac cactgaaggc      240
          gcgctgaacg aaatcaacaa caacctgcag cgtgtgcgtg aactggcggt tcagtctggc      300
          gggggcggca gcggtagcgc tggaaatcgt gctgaccgtg tagagcaaaa agcacaaccg      360
          gttcaatcaa atagtgagcc ttcttccgct ccaatcaaaa atcctactaa taccgccacg      420
          aatgattctc ttcatgacaa actttcaatg tcttcccatg acacatccaa agaaaatagt      480
          caacaatcct ccttt                                                       495
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  29]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  Artificial Sequence]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  增幅Pasteurella multocida脂蛋白E基因的正向引子]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          ggatccatga aacaaatcgt tttaaaaac                                         29
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  30]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  Artificial Sequence]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  增幅Pasteurella multocida脂蛋白E基因的反向引子]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          gaattcttat tgtgcttggt gacttttttc                                        30
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          ggatccatga aaaagacaat cgtagc                                            26
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
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          <![CDATA[<400>  10]]>
          gtcgacttag aagtgtacgc gtaaac                                            26
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  32]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<223>  增幅經截斷Pasteurella multocida脂蛋白E核酸序列的正向引子]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          ggcgggggcg gcagcggtag cgctggaaat cg                                     32
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  28]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<400>  12]]>
          ctcgagaaag gaggattgtt gactattt                                          28
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  30]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<223>  增幅S. Typhimurium鞭毛蛋白重組蛋白核酸序列的正向引子]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          ggatccatgg cacaagtcat taatacaaac                                        30
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  33]]>
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          <![CDATA[<223>  增幅S. Typhimurium鞭毛蛋白重組蛋白核酸序列的反向引子]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          gctgccgccc ccgccagact gaaccgccag ttc                                    33
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  30]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  增幅S. Typhimurium鞭毛蛋白與經截斷Pasteurella ]]>
                 multocida脂蛋白E之嵌合蛋白之核酸序列的正向引子
          <![CDATA[<400>  15]]>
          ggatccatgg cacaagtcat taatacaaac                                        30
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          <![CDATA[<213>  A]]>rtificial Sequence
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  增幅S. Typhimurium鞭毛蛋白與經截斷Pasteurella ]]>
                 multocida脂蛋白E之嵌合蛋白之核酸序列的反向引子
          <![CDATA[<400>  16]]>
          ctcgagaaag gaggattgtt gactattt                                          28
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  Artificial Sequence]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IL 1 beta基因RT-PCR分析用正向引子]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          tgggcatcaa gggctaca                                                     18
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
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          <![CDATA[<223>  IL 1 beta基因RT-PCR分析用反向引子]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          tcgggttggt tggtgatg                                                     18
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  Artificial Sequence]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IL6基因RT-PCR分析用正向引子]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          caaggtgacg gaggaggac                                                    19
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  Artificial Sequence]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IL6基因RT-PCR分析用反向引子]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          tggcgaggag ggatttct                                                     18
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          <![CDATA[<211>  20]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IL8基因RT-PCR分析用正向引子]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          catcatgaag cattccatct                                                   20
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  Artificial Sequence]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IL8基因RT-PCR分析用反向引子]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          cttccaaggg atcttcattt                                                   20
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          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IFN gamma基因RT-PCR分析用正向引子]]>
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          gacggtggac ctattatt                                                     18
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  Artificial Sequence]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IFN gamma基因RT-PCR分析用反向引子]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          ggctttgcgc tggattc                                                      17
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  Artificial Sequence]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  I]]>L12基因RT-PCR分析用正向引子
          <![CDATA[<400>  25]]>
          ccaagacctg gagcacaccg aag                                               23
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  Artificial Sequence]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IL12基因RT-PCR分析用反向引子]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          gatccctggc ctgcacagag a                                                 21
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IL4基因RT-PCR分析用正向引子]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          tgtgcccacg ctgtgcttac a                                                 21
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  Artificial Sequence]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  28]]>
          cttgtggcag tgctggctct cc                                                22
          <![CDATA[<210>  29]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  Artificial Sequence]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IL10基因RT]]>-PCR分析用正向引子
          <![CDATA[<400>  29]]>
          ctgcgcttct acacagatg                                                    19
          <![CDATA[<210>  30]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  Artificial Sequence]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IL10基因RT-PCR分析用反向引子]]>
          <![CDATA[<400>  30]]>
          ccgttctcat ccatctgc                                                     18
          <![CDATA[<210>  31]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  Artificial Sequence]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  甘胺酸－絲胺酸連接子的核酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  31]]>
          ggcgggggcg gcagc                                                        15
          <![CDATA[<210>  32]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  Artificial Sequence]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  甘胺酸－絲胺酸連接子的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  32]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5

Claims (7)

  1. 一種用於疫苗之重組蛋白，其特徵係其包含：鼠傷寒沙氏桿菌(S.Typhimurium)鞭毛蛋白重組蛋白，該鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白重組蛋白為SEQ ID NO：1之胺基酸序列；及一作為抗原之多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)脂蛋白E重組蛋白，其係為SEQ ID NO：2之胺基酸序列，且該多殺巴斯德氏菌脂蛋白E重組蛋白之N端與該鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白重組蛋白之C端透過一甘胺酸-絲胺酸連接子連接；或該用於疫苗之重組蛋白為SEQ ID NO：3之胺基酸序列；該疫苗不包含癌症疫苗。
  2. 一種多核苷酸，其具有SEQ ID NO：6之核苷酸序列，可編碼請求項1所述之重組蛋白之胺基酸序列。
  3. 一種鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白用於製備疫苗佐劑的用途，其特徵係該鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白為重組蛋白，其係為SEQ ID NO：1之胺基酸序列，且該疫苗佐劑不包含癌症之疫苗佐劑。
  4. 一種鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白用於製備促進雞免疫活性組成物的用途，其特徵係該重組鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白為重組蛋白，其係為SEQ ID NO：1之胺基酸序列。
  5. 如請求項4所述之鼠傷寒沙氏桿菌鞭毛蛋白用於製備促進雞免疫活性組成物的用途，其中，該促進雞免疫活性組成物係用於提升：(a)促發炎細胞因子IL-1β、IL-6及IL-8之表現量；(b)CD4+T細胞及CD8+T細胞之表現量；(c)，細胞因子IFN-γ、IL12及IL4之表現量。
  6. 一種請求項1所述重組蛋白用於製備疫苗的用途，該疫苗不包含癌症之疫苗。
  7. 如請求項6所述之用途，其中，該疫苗係用於提升雞感染多殺巴斯德氏菌後的生存率。
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