RU2720978C2 - Профилактическая вакцина против синдрома падения яйценоскости (eds) - Google Patents
Профилактическая вакцина против синдрома падения яйценоскости (eds) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2720978C2 RU2720978C2 RU2016145061A RU2016145061A RU2720978C2 RU 2720978 C2 RU2720978 C2 RU 2720978C2 RU 2016145061 A RU2016145061 A RU 2016145061A RU 2016145061 A RU2016145061 A RU 2016145061A RU 2720978 C2 RU2720978 C2 RU 2720978C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fusion protein
- head
- seq
- eds
- multimer
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 42
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 title claims abstract description 9
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 title 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 81
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 81
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 80
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 79
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 71
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 50
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 42
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 12
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 95
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 95
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 38
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 claims description 38
- 108010072582 Matrilin Proteins Proteins 0.000 claims description 32
- 102000055008 Matrilin Proteins Human genes 0.000 claims description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 29
- 101100107610 Arabidopsis thaliana ABCF4 gene Proteins 0.000 claims description 20
- 101100068078 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GCN4 gene Proteins 0.000 claims description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 17
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 11
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 9
- 239000013638 trimer Substances 0.000 claims description 6
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 62
- 101001109518 Homo sapiens N-acetylneuraminate lyase Proteins 0.000 description 44
- 102100022686 N-acetylneuraminate lyase Human genes 0.000 description 44
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 38
- 208000002197 Ehlers-Danlos syndrome Diseases 0.000 description 33
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 30
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 23
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 22
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 22
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 22
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 19
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 18
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 13
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 12
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 11
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 11
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 10
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 8
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 8
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 6
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical class [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 6
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 6
- ZORQXIQZAOLNGE-UHFFFAOYSA-N 1,1-difluorocyclohexane Chemical compound FC1(F)CCCCC1 ZORQXIQZAOLNGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 5
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 5
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 5
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 5
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 5
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 5
- 235000011069 sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 5
- 239000001593 sorbitan monooleate Substances 0.000 description 5
- 229940035049 sorbitan monooleate Drugs 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 5
- 108700026758 Adenovirus hexon capsid Proteins 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 3,3-bis(chloromethyl)oxetane Chemical compound ClCC1(CCl)COC1 CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 3
- 101710145505 Fiber protein Proteins 0.000 description 3
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 3
- 208000027954 Poultry disease Diseases 0.000 description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 3
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- -1 for example Substances 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 3
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 3
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 3
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 2
- 241000886677 Duck adenovirus 1 Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 2
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 2
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000003067 hemagglutinative effect Effects 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 241000701802 Aviadenovirus Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 229920001342 Bakelite® Polymers 0.000 description 1
- 208000027312 Bursal disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000005956 Cosmos caudatus Nutrition 0.000 description 1
- ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N D-alpha-tocopherylacetate Chemical compound CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- LLQPHQFNMLZJMP-UHFFFAOYSA-N Fentrazamide Chemical compound N1=NN(C=2C(=CC=CC=2)Cl)C(=O)N1C(=O)N(CC)C1CCCCC1 LLQPHQFNMLZJMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163305 Fibril protein Proteins 0.000 description 1
- 101710189104 Fibritin Proteins 0.000 description 1
- 101100183090 Gallus gallus MATN1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000604027 Homo sapiens Nuclear protein localization protein 4 homolog Proteins 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000701244 Mastadenovirus Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 208000010359 Newcastle Disease Diseases 0.000 description 1
- 102100038438 Nuclear protein localization protein 4 homolog Human genes 0.000 description 1
- 241000237502 Ostreidae Species 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 101100094105 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) NPL6 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical group C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001643 allantois Anatomy 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 102000034240 fibrous proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005899 fibrous proteins Proteins 0.000 description 1
- 244000144992 flock Species 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000009878 intermolecular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- UOEFDXYUEPHESS-QMGXLNLGSA-N isopropyl beta-D-galactopyranoside Chemical compound CC(C)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UOEFDXYUEPHESS-QMGXLNLGSA-N 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 108700041430 link Proteins 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 235000020636 oyster Nutrition 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- NRNCYVBFPDDJNE-UHFFFAOYSA-N pemoline Chemical compound O1C(N)=NC(=O)C1C1=CC=CC=C1 NRNCYVBFPDDJNE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000011946 reduction process Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-N sodium;5-ethyl-5-pentan-2-yl-1,3-diazinane-2,4,6-trione Chemical compound [Na+].CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 229940042585 tocopherol acetate Drugs 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/235—Adenoviridae
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/01—DNA viruses
- C07K14/075—Adenoviridae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
- A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/70—Multivalent vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/73—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing coiled-coiled motif (leucine zippers)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10111—Atadenovirus, e.g. ovine adenovirus D
- C12N2710/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10111—Atadenovirus, e.g. ovine adenovirus D
- C12N2710/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/01—DNA viruses
- G01N2333/075—Adenoviridae
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Описан слитый белок для профилактики синдрома падения яйценоскости (EDS), в котором полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу, связан с областью головки фибриллярного белка вируса EDS (EDSV), причем головка содержит полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 11, или полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11 с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот; за исключением слитого белка, в котором одна или несколько аминокислот в аминокислотной последовательности нативной области стебля были добавлены на N-концевой стороне SEQ ID NO: 11, и за исключением полипептида, в котором одна или несколько аминокислот из аминокислот с первой по девятую в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11 были делетированы или заменены. Также представлена вакцина против EDS, содержащая в качестве активного ингредиента эффективное количество описанного слитого белка. Кроме того, представлен набор, предназначенный для измерения уровня антител к области головки EDSV в тестируемом образце, содержащий мультимер слитого белка, отличающийся тем, что он содержит мультимер слитого белка. Изобретение расширяет арсенал средств для профилактики синдрома падения яйценоскости (EDS). 8 н. и 8 з.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл., 4 пр.
Description
Область техники
[0001] Настоящее изобретение относится к вакцинам для профилактики EDS домашней птицы. Более конкретно, изобретение относится к вакцине, содержащей активный ингредиент, рекомбинантный белок и/или его мультимер, в котором "область головки" в фибриллярном белке вызывающего EDS вируса EDS (EDSV) слита с "полипептидом, содержащим формирующую суперспираль единицу". Инокуляция слитого белка и/или его мультимера курам индуцирует высокий титр подавляющих гемагглютинацию (HI) антител и обеспечивает профилактику возникновения EDS.
Предшествующий уровень техники
[0002] EDS представляет собой заболевание домашней птицы, преимущественно характеризуемое низкой яйценоскостью и продукцией аномальных яиц у инфицированных EDSV кур (NPL1 и NPL 2). EDSV классифицируют как представителя группы III аденовирусов птиц, и он обладает гемагглютинирующей активностью. Вирус характеризуется пролиферацией в маточных трубах кур. EDS обнаруживает только незначительные клинические симптомы, такие как умеренная диарея, если они вообще присутствуют. Заболевание часто происходит в возрасте от 30 до 40 недель, когда яйценоскость находится на пике, и вызывает в инфицированной стае продукцию яиц с аномальными оболочками или низкую яйценоскость в течение периода от 3 до 8 недель. Это приводит к серьезному экономическому ущербу. Для профилактики EDS эффективны вакцины (NPL 3), и инактивированные вакцины включены в широкий диапазон программ вакцинации для яйценоских птиц.
[0003] В настоящее время основным направлением являются инактивированные вакцины против EDS, получаемые из инактивируемых вирусов, размножающихся в оплодотворенных яйца домашних уток, и посредством смешивания инактивированных вирусов с адъювантов. Хотя амплификация EDSV в оплодотворенных яйцах домашней утки желательна (NPL4 и NPL 5), появление птичьего гриппа и других инфекций поставило под вопрос о том, что будущие поставки оплодотворенных яиц домашней утки могут столкнуться со сложностями. Таким образом, существует необходимость в средствах для поставки вакцинных антигенов, которые не зависят от яиц домашней утки.
[0004] EDSV обладает двухцепочечной геномной ДНК длиной приблизительно 33 т.п.н. (NPL6), и ввиду одного и того же серотипа почти не существует различий антигенности между штаммами (NPL 7). Вирусные частицы состоят из различных структурных белков, включая коровый белок, белок, составляющий гексоны капсида, белок тримерных фибрилл, выступающих из капсида в виде нитчатых стержней, и белок базальной части, такой как основа пентона, обеспечивающая основу для фибриллы (NPL 1 и NPL 6). Нейтрализующий эпитоп находится в гексоне (NPL 8), фибрилле и в основе пентона (NPL 9). В частности, фибриллу изучали во многих исследованиях (NPL 11), так как она вовлечена в проникновение в клетки-хозяева (NPL 10). Фибриллярный белок по функциям разделен на три области (NPL 12). N-концевую часть, участвующую в связывании с основой пентона (NPL 13), называют хвост, а область в середине называют стебель. Опубликовано, что головка на C-конце обладает гемагглютинирующей активностью и участвует в связывании с клеточным рецептором (NPL 11). У аденовируса человека 5 нейтрализующий эпитоп находится в головке, одной из трех областей фибриллярного белка. Существует публикация о том, что для осуществления функции важна конформация, и что активность связывания рецептора наблюдали при экспрессии с частью прилежащей области стебля (NPL 14).
[0005] Область стебля, составляющая стебель фибриллярного белка, обладает повторяющейся структурой с рядом из нескольких β-спиральных структур (1 повтор), включающих гидрофобные области, разделенные пролином или глицином (NPL 12, и NPL 15), и три молекулы собраны вместе с формированием тройной β-спиральной структуры (NPL 15 и NPL 16). Головка, следующая за стеблем, также обладает тримерной структурой (NPL 17). Как правило, стеблевой повтор состоит из 15 аминокислот (NPL 12). Однако в EDSV большинство повторов состоят из большего количества аминокислот (NPL 6). Опубликовано, что у аденовируса человека уменьшенная длина стебля приводит к более слабому связыванию с рецептором и сниженной инфективности для культур клеток (NPL 18).
[0006] В отношении EDSV, существуют публикации о том, что у кур, которым в виде масляной вакцины после экспрессии в Escherichia coli вводили 34 аминокислоты из C-концевой части области стебля, прилежащей к головке, получены нейтрализующие антитела (NPL 19 и NPL 20 и PTL 1).
Список цитируемых документов
Патентная литература
[0007] PTL 1: WO2004/078977
Непатентная литература
[0008] NPL 1: Adair, B.M. & Fitzgerald, S.D.: Egg Drop Syndrome. In Diseases of Poultry, 12th ed. (Saif, YM et al. ed.), p266-276, Blackwell Publishing, Ames. 2008
NPL 2: Shigeo Yamaguchi: Egg Drop Syndrome, Disease of Birds, 7th Edition, Edited by The Japanese Society on Poultry Diseases, p50-53, The Japanese Society on Poultry Diseases, Tokyo, 2010
NPL 3: Baxendale, W., Lutticken, D., Hein, R. & McPherson, I.: The results of field trials conducted with an inactivated vaccine against the egg drop syndrome 76 (EDS 76). Avian Pathol., 9: 77-91, 1980
NPL 4: Fujio Nonaka, Kazuo Matsuo, Shinji Yamada: Proliferation and Pathogenicity of Egg Drop Syndrome-1976 (EDS-76) Virus in Cultured Cells and Embryonated Chicken Eggs, Japan Veterinary Medical Association Journal, 37:510-515, 1984
NPL 5: Minoru Higashihara, Shinji Takai, Atsuko Hidaka, Tsutomu Houdatsu, Masami Hiruma, Yoshikazu Watanabe, Minoru Matsumoto: Isolation of the Virus of Egg Drop Syndrome 1976 (EDS-76), Jpn. J. Vet. Sci.,45: 603-612, 1983
NPL 6: Hess, M., Blocker, H. & Brandt, P.: The complete nucleotide sequence of egg drop syndrome virus: an intermediate between mastadenoviruses and aviadenoviruses. Virology, 238: 145-156, 1997
NPL 7: Tsukamoto, K., Kuwabara, M., Kaneko, M., Mase, M. & Imai, K.: No evidence for adaptation of current egg drop syndrome 1976 viruses to chickens. Avian Dis., 48: 220-223, 2004
NPL 8: Toogood, C.I., Crompton, J. & Hay, R.T.: Antipeptide antisera define neutralizing epitopes on the adenovirus hexon. J. Gen. Virol., 73: 1429-1435, 1992
NPL 9: Gahery-Segard, H., Farace, F., Godfrin, D., Gaston, J., Lengagne, R., Tursz, T., Boulanger, P. & Guillet, J.G.: Immune response to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing activity. J. Virol., 72: 2388-2397, 1998
NPL 10: Louis, N., Fender, P., Barge, A., Kitts, P. & Chroboczek, J.: Cell-binding domain of adenovirus serotype 2 fiber. J. Virol., 68: 4104-4106. 1994
NPL 11: Horwitz, M.S.: Adenovirus. In Fields Virology, 4th ed., (Knipe DM et al. ed) p2301-2326, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia. 2001
NPL 12: Green, N.M., Wrigley, N.G., Russell, W.C., Martin, S.R. & McLachlan, A.D.: Evidence for a repeating cross-beta sheet structure in the adenovirus fibre. EMBO J., 2: 1357-1365, 1983
NPL 13: Hong, S.S. & Boulanger, P.: Protein ligands of the human adenovirus type 2 outer capsid identified by biopanning of a phage-displayed peptide library on separate domains of wild-type and mutant penton capsomers. EMBO J., 14: 4714-4727, 1995
NPL 14: Henry, L.J., Xia, D., Wilke, M.E., Deisenhofer, J. & Gerard, R.D.: Characterization of the knob domain of the adenovirus type 5 fiber protein expressed in Escherichia coli. J. Virol., 68: 5239-5246, 1994
NPL 15: van Raaij, M.J., Mitraki, A., Lavigne, G. & Cusack, S.: A triple beta-spiral in the adenovirus fibre shaft reveals a new structural motif for a fibrous protein. Nature, 401: 935-938, 1999
NPL 16: Stouten, P.F., Sander, C., Ruigrok, R.W. & Cusack, S.: New triple-helical model for the shaft of the adenovirus fibre. J. Mol. Biol., 226: 1073-1084, 1992
NPL 17: Xia, D., Henry, L., Gerard, R.D. & Deisenhofer, J.: Structure of the receptor binding domain of adenovirus type 5 fiber protein. Curr. Top Microbiol. Immunol., 199: 39-46, 1995
NPL 18: Shayakhmetov, D.M. & Lieber, A.: Dependence of adenovirus infectivity on length of the fiber shaft domain. J. Virol., 74: 10274-10286, 2000
NPL 19: Gutter, B., Fingerut, E., Gallili, G., Eliahu, D., Perelman, B., Finger, A. & Pitcovski, J.: Recombinant egg drop syndrome subunit vaccine offers an alternative to virus propagation in duck eggs. Avian Pathol., 37: 33-37, 2008
NPL 20: Fingerut, E., Gutter, B., Gallili, G., Michael, A. & Pitcovski, J.: A subunit vaccine against the adenovirus egg-drop syndrome using part of its fiber protein. Vaccine, 21: 2761-2766, 2003
NPL 21: Adv. Protein Chem. 2005, 70, 37-78
Сущность изобретения
Техническая задача
[0009] Настоящее изобретение относится к рекомбинантной вакцине против EDS, способной эффективно предотвращать EDS, предназначенной для ферм с потенциальным риском EDS.
Решение задачи
[0010] В поисках решения указанных выше задач авторы настоящего изобретения исследовали структуру фибриллярного белка EDSV с использованием модели прогнозирования структуры и выявили, что граница между областью головки и областью стебля находится ближе к N-концу, чем традиционно полагают. Также выявлено, что рекомбинантный белок и/или его мультимер, в котором область головки с установленной границей так, чтобы не содержать область стебля, сливали с полипептидом, содержащим формирующую суперспираль единицу, при инокуляции курам в качестве вакцины индуцировал высокий титр HI антител. Настоящее изобретение осуществлено на основании этих изысканий.
[0011] В частности, настоящее изобретение относится к приведенному ниже.
Слитый белок, в котором с областью головки фибриллярного белка EDSV связан полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу.
[0012] Слитый белок, в котором полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу, представляет собой GCN4 или белок матрикса хряща (CMP).
[0013] Слитый белковый мультимер слитого белка.
[0014] Фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность ДНК, кодирующую слитый белок.
[0015] Рекомбинантный экспрессирующий вектор, содержащий фрагмент нуклеиновой кислоты.
[0016] Трансформант, содержащий введенный в него фрагмент нуклеиновой кислоты.
[0017] Трансформант, содержащий введенный в него рекомбинантный экспрессирующий вектор.
[0018] Антитело, связывающееся со слитым белком или с его мультимером.
[0019] Вакцина против EDS, содержащая в качестве активного ингредиента слитый белок.
[0020] Терапевтическое средство против EDS, содержащее в качестве активного ингредиента антитело.
[0021] ДНК-вакцина против EDS, содержащая в качестве активного ингредиента фрагмент нуклеиновой кислоты или рекомбинантный экспрессирующий вектор.
[0022] Набор, содержащий слитый белок или его мультимер, где набор предназначен для измерения уровня антител в зависимости от содержания области головки EDSV в тестируемом образце.
[0023] Набор, содержащий антитело, где набор предназначен для измерения содержания области головки EDSV в тестируемом образце.
[0024] Способ профилактики EDS, где способ включает введение курам слитого белка, его мультимера, фрагмента нуклеиновой кислоты или рекомбинантного экспрессирующего вектора.
[0025] Способ лечения EDS, где способ включает введение курам антител.
Полезные эффекты изобретения
[0026] Вакцина по настоящему изобретению, содержащая рекомбинантный белок и/или его мультимер, содержащийся в качестве активных ингредиентов и в котором область головки EDSV слита с полипептидом, содержащим формирующую суперспираль единицу, при инокуляции курам индуцирует высокий титр HI антител и может предотвращать заболевание EDS у домашней птицы.
Краткое описание чертежей
[0027] Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение слитых белков, получаемых в примерах 1 до 4 и сравнительном примере 1.
Фиг. 2 представляет собой диаграмму, представляющую анализ SDS-PAGE, подтверждающий формирование мультимеров слитых белков, получаемых в примерах 1-4 и в сравнительном примере 1.
Фиг. 3 представляет собой диаграмму, представляющую анализ молекулярно-массового распределения слитых белков, получаемых в примерах 1-4 и в сравнительном примере 1, посредством гель-фильтрации.
Фиг. 4 представляет собой диаграмму, представляющую результаты тестирования HI сыворотки кур, иммунизированных слитыми белками, получаемыми в примерах 1-4 и в сравнительном примере 1 в примере тестирования 3.
Фиг. 5 представляет собой диаграмму, представляющую результаты тестирования для подтверждения эффективных уровней антигена головки-GCN4 в примере тестирования 4.
Фиг. 6 представляет собой диаграмму, представляющую результаты тестирования для подтверждения эффективных уровней антигена CMP-головки в примере тестирования 4.
Фиг. 7 представляет собой диаграмму, представляющую изменения титров HI антител к EDSV после иммунизации (средние значения) в примере тестирования 5.
Фиг. 8 представляет собой диаграмму, представляющую изменения количества нормальных яиц после летальной инфекции EDSV в примере тестирования 5.
Описание вариантов осуществления
[0028] Настоящее изобретение относится к слитому белку, в котором полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу, связан с областью головки фибриллярного белка EDSV кур.
[0029] Фибриллярный белок EDSV, начиная от N-конца, функционально делится на три области: хвост, стебель и головка. Предпочтительно, область головки EDSV, являющаяся составляющей слитого белка по настоящему изобретению, не содержит область стебля, так как при этом существует риск снижения растворимости. С другой стороны, предпочтительно, чтобы область головки содержалась полностью во избежание риска потери нативной высокоуровневой структуры области головки. Примеры такой области головки EDSV включают полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 11. Эта аминокислотная последовательность включает часть с девятью N-концевыми аминокислотами, которые, как полагали, содержатся в области стебля (NPL 20). Однако исследования авторов настоящего изобретения на основе модели прогнозирования структуры позволили теоретически определить, что область головки продолжается до этого положения. Область головки EDSV, являющаяся составляющей слитого белка по настоящему изобретению, относится к полипептиду, состоящему из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 11, и к полипептиду, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11 с делециями, заменами или добавлением одной или нескольких аминокислот. Как используют в настоящем документе, "несколько аминокислот", как правило, означает от 2 до 9, предпочтительно от 2 до 5, более предпочтительно от 2 до 3 аминокислот. Область головки также включает полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологична указанной выше аминокислотной последовательности.
[0030] Ген, кодирующий область головки EDSV, содержит последовательность ДНК SEQ ID NO: 12, последовательность ДНК, у которой кодоны оптимизированы для экспрессии в Escherichia coli или дрожжах, последовательность ДНК, получаемую посредством добавления в эти последовательности ДНК подходящего участка расщепления рестрикционного фермента, и последовательность ДНК, получаемую после делеции, замены или добавления в указанные выше последовательности ДНК одного или нескольких оснований. Как используют в настоящем документе, "несколько оснований", как правило, означает от 2 до 9, предпочтительно от 2 до 5, более предпочтительно от 2 до 3 оснований. Кодирующий ген также включает последовательность ДНК, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологична указанным выше последовательностям ДНК.
[0031] Полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу, который связан с головкой, составляя слитый белок по настоящему изобретению, конкретно не ограничен, при условии, что он способен формировать структуру суперспирали. Предпочтительно, полипептид представляет собой полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу, происходящий из белка, формирующего природный мультимер (формирующий мультимеры белок). Примерами таких белков являются формирующие мультимеры белки, описанные в NPL 21 (Adv. Protein Chem. 2005, 70, 37-78). Предпочтительно, полипептид представляет собой полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу, например, происходящий из GCN4, получаемого у кур CMP или получаемого у бактериофага T4 фибритина, более предпочтительно GCN4 и CMP, особенно предпочтительно CMP, так как слитый белок головки с такими полипептидами можно получать в виде растворимого белка с большим выходом, и он обладает желаемым действием индукции антител, блокирующих.
[0032] Полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу GCN4, включает димерный полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27, тримерный полипептид, состоящий из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 28-30, и полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, получаемой после делеции, замены или добавления в этих аминокислотных последовательностях одной или нескольких аминокислот. Полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу GCN4, также включает полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологична указанным выше аминокислотным последовательностям. Предпочтительна тримерная форма, а особенно предпочтителен полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30.
[0033] Полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу CMP, включает полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31, и полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31 с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот. Полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу CMP, также включает полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологична указанным выше аминокислотным последовательностям.
[0034] Последовательность ДНК, кодирующая полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу CMP, включает последовательность ДНК SEQ ID NO: 32, последовательность ДНК, например, SEQ ID NO: 33, у которой кодоны оптимизированы для экспрессии в Escherichia coli, последовательность ДНК, получаемую посредством добавления в эти последовательности ДНК подходящего участка расщепления рестрикционного фермента, и последовательность ДНК, получаемую после делеции, замены или добавления в указанные выше последовательности ДНК одного или нескольких оснований. Последовательность ДНК, кодирующая полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу CMP, также включает последовательность ДНК, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологична указанным выше последовательностям ДНК.
[0035] В слитом белке по настоящему изобретению полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу, например, GCN4 и CMP, может быть связан или с N-концом, или с C-концом головки. Например, когда формирующая суперспираль единица представляет собой CMP, индуцирующего HI антитело действия можно добиваться вне зависимости от того связан ли полипептид с N-коном или с C-концом головки. С другой стороны, когда используют GCN4, более активного индуцирующего HI антитело действия добиваются, когда полипептид связан с N-концом головки. Пептид, содержащий формирующую суперспираль единицу, и головка можно связывать непосредственно друг с другом. Однако между ними можно встраивать спейсер, такой как линкерная последовательность, с такими целями, как уменьшение межмолекулярного взаимодействие между этими областями. Такая линкерная последовательность конкретно не ограничена, и можно использовать, например, комбинацию последовательностей GPGP(GP)2 или GGGGS(G4S). Также в качестве линкерной последовательности можно использовать последовательность с одним-четырьмя повторами (G4S) (от (G4S)1 до (G4S)4), необязательно в комбинации с (GP)2. Последовательность может представлять собой последовательность-метку Hisx6 (H6). Предпочтительные примеры линкерной последовательности или комбинации последовательность-метка и линкерная последовательность, включают (G4S)1, (G4S)2, (G4S)2H6(G4S)2 и (G4S)2H6(G4S)1(G3S)1. Последовательность-метку можно добавлять на N-конец или на C-конец слитого белка.
[0036] Примером слитого белка по настоящему изобретению является слитый белок головка-GCN4 (например, SEQ ID NO: 13 (аминокислотная последовательность), SEQ ID NO: 14 (последовательность ДНК)), в котором на C-конец головки добавляют полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу GCN4, с линкерной последовательностью ((G4S)2), встраиваемой между ними, и последовательностью-меткой (H6), присоединенной к C-концу. Другим примером является слитый белок GCN4-головкаа (например, SEQ ID NO: 21 (аминокислотная последовательность), SEQ ID NO: 22 (последовательность ДНК)), в котором полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу GCN4, расположен на N-конце головки с линкерной последовательностью ((G4S)1), встраиваемой между ними, и последовательностью-меткой (H6), связанной с C-концом. Слитый белок по настоящему изобретению относится не только к белку, представляемому аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 13 или 21, но и к полипептиду, состоящему из аминокислотной последовательности, получаемой после делеции, замены или добавления в эти аминокислотные последовательности одной или нескольких аминокислот. Слитый белок также включает полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологична указанным выше аминокислотным последовательностям.
[0037] Другие примеры слитого белка по настоящему изобретению включают слитый белок (например, SEQ ID NO: 23 (аминокислотная последовательность), SEQ ID NO: 24 (последовательность ДНК)), в котором полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу CMP, связан с C-концом головки с последовательностью-меткой (H6) и линкерной последовательностью ((G4S)2), встраиваемой между ними, и слитый белок (например, SEQ ID NO: 25 (аминокислотная последовательность), SEQ ID NO: 26 (последовательность ДНК)), в котором полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу CMP, связан с N-концом головки с последовательностью-меткой и комбинацией линкерных последовательностей ((G4S)2H6(G4S)1(G3S)1), встраиваемой между ними. Слитый белок по настоящему изобретению относится не только к белку, представляемому аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 23 или 25, но и к полипептиду, состоящему из аминокислотной последовательности, получаемой после делеции, замены или добавления в эти аминокислотные последовательности одной или нескольких аминокислот. Слитый белок по настоящему изобретению также относится к полипептиду, состоящему из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологична указанным выше аминокислотным последовательностям.
[0038] Для связывания полипептида, содержащего формирующую суперспираль единицу, и головки их можно экспрессировать после связывания друг с другом посредством генетической инженерии. В иллюстративном способе получают экспрессирующий вектор, в котором последовательности ДНК формирующей суперспираль единицы и последовательность ДНК головки помещают рядом друг с другом и экспрессирующий вектор вводят подходящему хозяину с экспрессией слитого белка. Последовательность ДНК формирующей суперспираль единицы может находиться на 5'-конце или на 3'-конце последовательности ДНК головки. При получении экспрессирующего вектора последовательности ДНК линкерной последовательности и/или последовательности-метка можно встраивать между последовательностью ДНК формирующей суперспираль единицы и последовательностью ДНК головки или можно добавлять на 5'-конец или 3'-конец последовательности ДНК. В иллюстративном способе можно получать экспрессирующий вектор, в котором, начиная 5'-конца, расположены последовательность ДНК головки, последовательности ДНК последовательности-метки и/или линкерной последовательности и последовательность ДНК формирующей суперспираль единицы.
[0039] Последовательности ДНК можно получать посредством химического синтеза и можно использовать в качестве матриц для амплификации известными способами амплификации генов. Затем последовательности ДНК можно встраивать в экспрессирующий вектор с использованием различных рестрикционных ферментов с получением рекомбинантного экспрессирующего вектора. Предпочтительно, олигонуклеотид, используемый для амплификации гена, конструируют так, чтобы он гибридизовался на 5'-конце или 3'-конце последовательности матричной ДНК, и чтобы происходило добавление участков расщепления рестрикционных ферментов. Матричную ДНК можно амплифицировать известными способами амплификации генов с использованием, например, олигонуклеотидов, матричной ДНК и ДНК-полимеразы. После обработки амплифицированной последовательности ДНК и экспрессирующего вектора рестрикционными ферментами их можно лигировать друг с другом подходящей ДНК-лигазой с конструированием рекомбинантного экспрессирующего вектора, в который встроена последовательность ДНК-мишени. Настоящее изобретение также относится к такому рекомбинантному экспрессирующему вектору.
[0040] Примеры экспрессирующего вектора включают плазмидные векторы, фаговые векторы, вирусные векторы и векторы в виде искусственных хромосом. С точки зрения простоты обработки и стоимости предпочтительны плазмидные векторы. Например, когда хозяином является Escherichia coli, экспрессирующий вектор может представлять собой, например, вектор Flexi pFN6A (HQ) (Promega), вектор Flexi (HQ) (Promega), вектор Flexi pFN2A (GST) (Promega), pET-15b (MERCK), pET-21d (MERCK), pUC57 (GenScript), pET-22b (MERCK), pET-21d (MERCK) или вектор pCold (Takara Bio). В случае млекопитающих экспрессирующий вектор может представлять собой, например, вектор Flexi pF4A CMV (Promega), вектор Flexi pF5A CMV-neo (Promega), вектор Flexi pF9A CMV hRluc-neo (Promega) или экспрессирующий вектор млекопитающих pCI-neo (Promega). Экспрессирующий вектор может содержать участок начала репликации, последовательность промотора, играющую регуляторную роль в экспрессии гена, регуляторную последовательность, такую как энхансерная последовательность и последовательность селективного маркера.
[0041] Примеры последовательностей промоторов включают промоторы бактерий, включая промоторы lacI и lacZ E. coli, промоторы T3 и T7, промотор gpt, промоторы PR и PL, промотор tac и промоторы trp и trc. В отношении последовательности промотора, примеры известных подходящих для эукариотических клеток промоторов включают немедленный промотор цитомегаловируса (CMV), промотор тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV), ранний и поздний промоторы вируса обезьяны (SV) 40 и промотор длинных концевых повторов (LTR) ретровирусов, включая, например, промотор вируса саркомы Рауса (RoSV) и промоторы металлотионеинов, такие как промотор металлотионеина-I.
[0042] Для экспрессии слитого белка с использованием клеток высших эукариот в качестве хозяев, в экспрессирующий вектор для увеличения транскрипционной активности можно встраивать энхансерную последовательность. Энхансерная последовательность действует, увеличивая транскрипционную активность промотора в предопределенном типе клеток-хозяев. Примеры энхансеров включают энхансер SV40, энхансер раннего промотора CMV, энхансер полиомы в поздней части участка начала репликации, энхансер β-актина и энхансер аденовирусов.
[0043] Примеры селективных маркеров включают ген устойчивости к ампициллину Escherichia coli, ген trp1 Saccharomyces cerevisiae и ген устойчивости к неомицину клеток млекопитающих.
[0044] Настоящее изобретение относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который содержит последовательность ДНК формирующей суперспираль единицы и последовательность ДНК головки и кодирует слитый белок по настоящему изобретению. Фрагмент нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, в котором последовательность ДНК формирующей суперспираль единицы и последовательность ДНК головки расположены рядом друг с другом, и к фрагменту нуклеиновой кислоты, в котором между последовательностью ДНК формирующей суперспираль единицы и последовательностью ДНК головки встроены последовательности ДНК последовательности-метки и/или линкерной последовательности. Например, фрагмент нуклеиновой кислоты содержит фрагменты нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 14, 24, 26 или 28.
[0045] Полные последовательности фрагментов нуклеиновых кислот по настоящему изобретению можно получать посредством химического синтеза. Фрагмент нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению также можно получать, объединяя фрагмент части нуклеиновой кислоты и фрагмент остатка нуклеиновой кислоты известным способом рекомбинации генов после получения этих частичных фрагментов нуклеиновой кислоты посредством химического синтеза. Например, после химического синтеза последовательностей ДНК головки или формирующей суперспираль единицы их амплифицируют известным способом амплификации генов и встраивают в отдельные клонирующие векторы. Затем последовательность ДНК головки или последовательность ДНК формирующей суперспираль единицы выщепляют из клонирующего вектора рестрикционным ферментом и встраивают в экспрессирующий вектор, который таким же образом обрабатывают рестрикционным ферментом с получением рекомбинантного экспрессирующего вектора. Вектор конструируют так, чтобы эти фрагменты после встраивания располагались рядом друг с другом. Затем рекомбинантный экспрессирующий вектор можно расщеплять рестрикционным ферментом или т.п. с получением фрагмента нуклеиновой кислоты, содержащего объединенную последовательность ДНК формирующей суперспираль единицы и головки. Для получения фрагмента нуклеиновой кислоты этим способом между последовательностями ДНК формирующей суперспираль единицы и головки можно встраивать последовательности ДНК последовательности-метки или линкерной последовательности с получением экспрессирующего вектора и получать фрагмент нуклеиновой кислоты.
[0046] Экспрессирующий вектор, получаемый описанным выше способом, можно использовать для трансформации хозяина и получения трансформанта, содержащего экспрессирующий вектор. Настоящее изобретение относится к таким трансформантам. Хозяин может представлять собой известного хозяина, например, такого как Escherichia coli, дрожжи, линии клеток млекопитающих, клетки насекомых и растений. Примеры Escherichia coli включают штаммы BL21 и DH5α. Примеры дрожжей включают Pichia pastoris и Saccharomyces cerevisiae. Примеры клеток млекопитающих включают клетки CHO, клетки HEK293 и клетки COS-1/-7.
[0047] Экспрессирующий вектор можно вводить хозяину известным способом, который можно выбирать в соответствии с хозяином. Примеры таких способов включают способ с использованием фосфата кальция, электропорацию и липофекцию. После трансфекции хозяина можно культивировать в среде, содержащей селективный маркер, с отбором трансформантов, у которых в клетку-хозяина встроен экспрессирующий вектор.
[0048] После пролиферации трансформантов в подходящих условиях можно в подходящих условиях (pH, температура, добавление соединений) индуцировать выбранный промотор с получением слитого белка. Экспрессированный слитый белок накапливается в клетках или клетки его секретируют.
Для экспрессии с использованием хозяина Escherichia coli слитый белок можно экспрессировать во фракцию телец включения. Тельца включения можно получать из Escherichia coli таким способом, как, например, разрушение ультразвуком, гомогенизация под высоким давлением, и способом с использованием BugBuster (Merck).
[0049] Слитый белок по настоящему изобретению, получаемый описываемым выше способом, можно использовать в виде мономера. Однако более предпочтительно использовать слитый белок по настоящему изобретению в виде мультимера, так как это обеспечивает индукцию высоких титров HI антител. Такие мультимеры слитого белка представляют собой, например, димеры, тримеры и мультимеры более высоких порядков, и включают смесь таких мультимеров. Например, слитый белок получают в виде мультимера, когда слитый белок экспрессируют, например, с использованием в качестве полипептида, содержащего формирующую суперспираль единицу, GCN4 или CMP. Однако, при необходимости, мультимер можно подвергать известным способам рефолдинга.
[0050] Слитый белок по настоящему изобретению представляет собой белок, в котором полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу, связан с головкой. Они могут быть связаны друг с другом химически. В качестве примера такого способа, полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу, и головка могут быть связаны друг с другом с использованием кросслинкера после раздельной экспрессии.
[0051] При раздельной экспрессии полипептида, содержащего формирующую суперспираль единицу и головку, последовательности ДНК этих областей можно получать посредством химического синтеза, и последовательности можно амплифицировать известным способом амплификации генов с использованием ДНК в качестве матрицы с конструированием каждой из экспрессирующих плазмид описанным выше способом. Затем экспрессирующие плазмиды можно встраивать хозяину с получением представляющего интерес белка, как описано выше.
[0052] Для связывания с использованием кросслинкера можно использовать, например, аминогруппу или тиольную группу (группу SH), присутствующую в белке, или альдегидную группу сахарной цепи, присутствующей в белке. Однако используемые функциональные группы конкретно не ограничены. Например, можно использовать способ, в котором группу SH полипептида, содержащего формирующую суперспираль единицу, подвергают реакции с аминогруппой головки. Конкретно, полипептид и головку можно связывать друг с другом посредством инкубации после подвергания полипептида восстановительному процессу с восстановителем, таким как дитиотреитол (DTT), и после введения пиридилдисульфидной группы в головку с использованием N-сукцинил-3-(2-пиридилдитио)пропионата (SPDP). Также полипептид и головку можно химически связывать, используя связывание на основе взаимодействия биомолекул, таких как биотин и авидин.
[0053] Слитый белок и его мультимер, полученный описанным выше способом, можно выделять и очищать стандартными способами очистки. Примеры таких способов очистки включают различные способы очистки, включая аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию, хроматографии на основе гидрофобных взаимодействий и гельфильтрационную хроматографию.
[0054] Настоящее изобретение относится к вакцине против EDS, в которой в качестве активных ингредиентов содержатся слитый белок по настоящему изобретению и/или мультимер этого слитого белка. Предпочтительно, вакцина по настоящему изобретению содержит мультимер этого слитого белка. Предпочтительно, мультимер представляет собой димер, тример или мультимер более высокого порядка или смесь таких мультимеров.
[0055] Предпочтительно, вакцина против EDS содержит слитый белок и/или мультимер этого слитого белка в количестве от 0,3 до 10 мкг на дозу.
[0056] Вакцина по настоящему изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель. Примеры таких носителей включают насыщенный солевой раствор, забуференный насыщенный солевой раствор, декстрозу, воду, глицерин, изотонический водный буфер и их комбинации. Их можно соответствующим образом смешивать с добавками, например, такими как адъюванты, эмульгаторы, консерванты, средства придания тоничности и регуляторы pH.
[0057] Примеры адъювантов включают масляные адъюванты, ацетат токоферола, квасцы, сапонины (QS21, ISCOM) и олиго-CpG.
[0058] В дополнение к содержащемуся слитому белу вакцину по настоящему изобретению можно смешивать с антигеном для профилактики инфекций кур. Примеры таких инфекций включают болезнь Ньюкасла, инфекционный бронхит кур, инфекционный ринит, инфекционную бурсальную болезнь кур, реофирусную инфекцию, микоплазмозная инфекция и сальмонеллезную инфекцию.
[0059] Вакцина по настоящему изобретению можно вводить любым способом введения, включая трансдермальное введение, сублингвальное введение, глазное введение, интрадермальное введение, внутримышечное введение, пероральное введение, энтеральное введение, трансназальное введение, внутривенное введение, подкожное введение, интраперитонеальное введение и посредством ингаляции изо рта в легкие.
[0060] В отношении связи между титром антител и защитой в общепринятых вакцинах против EDS полагают, что защита возможна, когда титр ингибирующих гемагглютинацию антител (титр HI антител) является по меньшей мере 16-кратным. Однако подтверждено, что вакцина по настоящему изобретению при введении курам может значимо больше увеличивать титр HI антител по сравнению с этим значением и эффективно предотвращать возникновение EDS.
[0061] Настоящее изобретение относится к набору, содержащему слитый белок и/или мультимер этого слитого белка и предназначенному для определения уровня антител к области головки EDSV в тестируемом образце. Набор, содержащий слитый белок по настоящему изобретению может представлять собой планшет с иммобилизованным на нем слитым белком. Тестируемый образец наносят на планшет, и слитый белок на планшете реагирует с антителами, содержащимися в тестируемом образце. Добавляют вторичные антитела, меченные ферментом или флуоресцентным веществом, и они реагируют с первичными антителами. При необходимости можно добавлять субстрат фермента и можно детектировать продукт ферментативной реакции или количество флуоресценции с определением количества антител содержащихся в тестируемом образце. Набор по настоящему изобретению можно использовать для оценки эффективности вакцины при иммунизации кур, где вакцина в качестве активных ингредиентов содержит слитый белок и/или мультимер этого слитого белка, и для детекции наличия или отсутствия антител, индуцируемых вакциной.
[0062] Настоящее изобретение относится к ДНК-вакцине против EDS, содержащей в качестве активного ингредиента фрагмент нуклеиновой кислоты или рекомбинантный экспрессирующий вектор, как указано выше. В ДНК-вакцине по настоящему изобретению фрагмент нуклеиновой кислоты или рекомбинантный экспрессирующий вектор предпочтительно содержат промоторную последовательность для экспрессии слитого белка после иммунизации кур.
[0063] После тестового инфицирования кур, проводимого у птиц с использованием EDSV, до и после инокуляции ДНК-вакцины по настоящему изобретению, фрагмент нуклеиновой кислоты или рекомбинантный экспрессирующий вектор, которые значимо снижали симптомы, ассоциированные с EDS, можно подвергать скринингу на активный ингредиент терапевтическое средство против EDS, и на основе дозы можно точно определять количество активного ингредиента.
[0064] ДНК-вакцина по настоящему изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель. Примеры таких носителей включают насыщенный солевой раствор, забуференный насыщенный солевой раствор, декстрозу, воду, глицерин, изотонический водный буфер и их комбинации. Их можно соответствующим образом смешивать с добавками, например, такими как адъюванты, эмульгаторы, консерванты, средства придания тоничности и регуляторы pH.
[0065] ДНК-вакцину по настоящему изобретению можно вводить любым способом введения, включая трансдермальное введение, сублингвальное введение, глазное введение, интрадермальное введение, внутримышечное введение, пероральное введение, энтеральное введение, трансназальное введение, внутривенное введение, подкожное введение, интраперитонеальное введение и посредством ингаляции изо рта в легкие.
[0066] Настоящее изобретение относится к антителу, которое связывается со слитым белком и/или мультимером этого слитого белка. Продукция антител, включая моноклональные антитела и поликлональные антитела или их аналогов у человека, становится возможной, когда слитый белок по настоящему изобретению и/или мультимер этого слитого белка используют в качестве антигенов в соответствии со стандартным способом иммунизации (Current Protocols in Molecular Biology, Antibody Engineering: A Practical Approach, Edited by J. McCafferty et al., or Antibody Engineering, Second Edition, Edited by Carl A.K. Borrebaeck). Антитела, связывающиеся со слитым белком и/или с его мультимером, также можно получать способом продукции антител на основе способа фагового дисплея (Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Edited by Brian K. Kay et al., Antibody Engineering: A Practical Approach, Edited by J. McCafferty et al., or Antibody Engineering, Second Edition, Edited by Carl A. K. Borrebaeck). Антитело по настоящему изобретению потенциально можно применять в качестве терапевтического средства против EDS, набора или носителя для аффинной хроматографии, как описано ниже.
[0067] Настоящее изобретение относится к терапевтическому средству против EDS, содержащему в качестве активного ингредиента антитело. Терапевтическое средство против EDS по настоящему изобретению, содержащее в качестве активного ингредиента антитело, может содержать фармацевтически приемлемый носитель. Примеры таких носителей включают насыщенный солевой раствор, забуференный насыщенный солевой раствор, декстрозу, воду, глицерин, изотонический водный буфер и их комбинации. Их можно соответствующим образом смешивать с добавками, например, такими как адъюванты, эмульгаторы, консерванты, средства придания тоничности и регуляторы pH.
[0068] Терапевтическое средство против EDS по настоящему изобретению можно вводить любым способом введения, включая трансдермальное введение, сублингвальное введение, глазное введение, интрадермальное введение, внутримышечное введение, пероральное введение, энтеральное введение, трансназальное введение, внутривенное введение, подкожное введение, интраперитонеальное введение и посредством ингаляции изо рта в легкие.
[0069] Настоящее изобретение относится к набору, содержащему антитело, которое связывается со слитым белком и/или с мультимером этого слитого белка и предназначенному для определения содержания области головки EDSV в тестируемом образце. Набор включает набор, в котором антитело, которое связывается со слитым белком иммобилизовано, например, на планшете. Набор, содержащий антитело по настоящему изобретению, можно использовать для оценки наличия или отсутствия инфекции EDSV с использованием содержания головки в качестве показателя. Например, тестируемый образец вносят в планшет, содержащий иммобилизованное на нем антитело, и добавляют антитела, меченные ферментом или флуоресцентным красителем. После инкубации, планшет отмывают и добавляют хромогенный субстрат, как необходимо. Затем определяют количество флуоресценции с оценкой содержания головки в тестируемом образце.
[0070] Примеры планшета включают иммунопланшет Nunc MaxiSorp (Thermo Scientific), планшет для ELISA (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), ELISPOT (MERCK), иммунопланшет (Cosmo Bio Co., Ltd.), планшет для ELISA (IWAKI) и планшет для ELISA (ExtraGene). Антитело можно связывать с планшетом любыми способами, как правило практикуемыми специалистами в данной области.
Примеры способов, используемых для мечения антитела ферментом или флуоресцентным красителем, включают наборы для конъюгации антител EasyLink (Abcam), систему быстрой конъюгации Lightning-Link (Innova Biosciences Ltd), набор для мечения антител Oyster (Luminartis GmbH), набор для ферментного мечения EZ-Link (PIERCE Biotechnology), набор для мечения белков Platinum Link Protein Labeling Kit (Kreatech Biotechnology BV) и набор для мечения антител DyLight (PIERCE Biotechnology).
[0071] Настоящее изобретение относится к носителю для аффинной хроматографии, в котором с этим носителем связано антитело к слитому белку и/или мультимеру этого слитого белка. Слитый белок по настоящему изобретению и/или мультимер этого слитого белка экспрессируют в хозяине и вне хозяина. При экспрессии в хозяине слитый белок и/или мультимер этого слитого белка собирают посредством разрушения хозяина. При экспрессии вне хозяина слитый белок и/или мультимер этого слитого белка собирают из окружающей культуру среды. Носитель по настоящему изобретению можно потенциально использовать, например, для получения слитого белка и/или мультимера этого слитого белка из таких смешанных фракций.
[0072] Примеры носителя включают активированный NHS HP HiTrap (GE Healthcare), активированную NHS сефарозу 4 Fast Flow (GE Healthcare), активированную CNBr сефарозу 4B (GE Healthcare), активированную CNBr сефарозу 4 Fast Flow (GE Healthcare), сефарозу 4B EAH (GE Healthcare), сефарозу 4B ECH (GE Healthcare), эпоксидную смолу Profinity (BIORAD), гидразидный гель Affi-Gel Hz (BIORAD). Антитело можно связывать любыми способами, как правило практикуемыми специалистами в данной области.
Примеры
[0073] Приведенные ниже разделы описывают настоящее изобретение более подробно, со ссылкой на примеры. Однако настоящее изобретение никаким способом не ограничено приводимым ниже описанием.
[0074] Пример 1
Получение белка головки-GCN4 и его мультимера
(1) Конструирование экспрессирующего вектора головка-GCN4
Из штамма EDSV KE-80 экстрагировали геномную ДНК как указано далее. После инокуляции вируса в полость аллантоиса оплодотворенного яйца утки со сроком 9 суток, аллантоисную жидкость, собранную на сутки 6 после инокуляции, добавляли в раствор проназы, в который добавляли протеиназу K (1 мг/мл). Затем смесь перемешивали при 50°C в течение 1 часа, а затем перемешивали в течение ночи при 37°C. Затем после удаления белка посредством фенола/хлороформа, осаждения этанолом и обработкой РНКазой A (Qiagen) экстрагировали геномную ДНК вируса.
Используя экстрагированную геномную ДНК вируса в качестве матрицы, посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) амплифицировали фрагмент ДНК (SEQ ID NO: 6), кодирующий область головки фибриллярного белка, и часть из 8 повторов области стебля (SEQ ID NO: 5), с использованием праймера для смысловой цепи с последовательностью распознавания NcoI (SEQ ID NO: 3) и праймера для антисмысловой цепи с последовательностью распознавания XhoI (SEQ ID NO: 4). Амплифицированный фрагмент ДНК и плазмиду pET-15b (Merck) расщепляли рестрикционными ферментами NcoI и XhoI и лигировали друг с другом посредством ДНК-лигазы. Затем лигированный продукт вносили в DH5α Escherichia coli и образующую плазмиду получали в качестве промежуточного вектора 1.
Для экспрессии полипептида с линкерной последовательностью (G4S)2, добавляемой к трехвалентной формирующей суперспираль единице (далее в настоящем документе "GCN4") модифицированного белка GCN4 (NCBI#: 1CZQ_A) (далее в настоящем документе полипептида, обозначаемого как "(G4S)2-GCN4)"; SEQ ID NO: 7) в Escherichia coli, кодоны последовательности ДНК, кодирующей полипептид, оптимизировали и искусственным способом синтезировали последовательность ДНК (SEQ ID NO: 8), которую конструировали так, чтобы она содержала последовательность распознавания NcoI на 5'-конце и последовательность распознавания XhoI на 3'-конце для клонирования в экспрессирующий вектор. Синтезированную ДНК и плазмиду pET-21d (Merck) расщепляли рестрикционными ферментами NcoI и XhoI, и лигировали друг с другом посредством ДНК-лигазы. Затем лигированный продукт вносили в DH5α Escherichia coli и образующуюся плазмиду получали в качестве промежуточного вектора 2.
Используя промежуточный вектор 1 в качестве матрицы, посредством ПЦР амплифицировали фрагмент ДНК (SEQ ID NO: 12), кодирующий головку (SEQ ID NO: 11), с использованием праймера для смысловой цепи с последовательностью распознавания NcoI (SEQ ID NO: 9) и праймера для антисмысловой цепи с последовательностью распознавания NcoI (SEQ ID NO: 10). Амплифицированный фрагмент ДНК и промежуточный вектор 2 расщепляли рестрикционным ферментом NcoI и лигировали друг с другом посредством ДНК-лигазы. Затем лигированный продукт вносили в DH5α Escherichia coli и образующуюся плазмиду получали в виде pKNOB2. pKNOB2 содержит последовательность ДНК (SEQ ID NO: 14), кодирующую полипептид (далее в настоящем документе "головка-GCN4"; SEQ ID NO: 13; фиг. 1), состоящий из головки, линкерной последовательности (G4S)2 и GCN4 и последовательности-метки Hisx6 (H6). pKNOB2 вносили в Escherichia coli BL21 (DE3) (Merck) с получением штамма E. coli KNOB2, экспрессирующего головку-GCN4.
[0075] (2) Культивирование рекомбинантной Escherichia coli и очистка экспрессируемого белка
В 200 мл колбу Эрленмейера добавляли 10 мл среды LB и раствора ампициллина (конечная концентрация 100 мкг/мл), и инокулировали экспрессирующий головку-GCN4 штамм E. coli KNOB2, и культивировали с перемешиванием при 37°C в течение приблизительно 14 часов (предварительная культура). В 2 л колбу Эрленмейера добавляли 250 мл среды LB и раствора ампициллина (конечная концентрация 100 мкг/мл), и инокулировали 5 мл раствора предварительной культуры бактерий, и культивировали с перемешиванием при 37°C до превышения OD590 0,6. После превышения OD590 основной культуры 0,6, добавляли изопропил-β-D-галактопиранозид (IPTG) с получением конечной концентрации 1 мМ, и клетки культивировали с перемешиванием при 37°C в течение 4 часов. Раствор основной культуры переносили в центрифужную пробирку и центрифугировали при 8000 об./мин. при 4°C в течение 30 минут. Затем собирали полученный бактериальный осадок.
В 50 мл готовой смеси BugBuster (Novagen) добавляли две таблетки полной смеси ингибиторов протеаз (Roche) с получением разрушающего клетки раствора. Бактериальный осадок суспендировали в разрушающем клетки растворе, инкубировали при комнатной температуре в течение 60 минут и разрушали посредством ультразвука (на льду, выход 4, мощность 70%, 10 минут × 3 раза). Раствор разрушенных клеток центрифугировали (15000 об./мин., 4°C, 30 минут) и собирали супернатант (растворимую фракцию).
Рекомбинантный антигенный белок, содержащийся в растворимой фракции, очищали с использованием 5 мл колонки HisTrap HP, (GE Healthcare) по протоколу производителя, прилагаемому к колонке. После добавления к раствору 20 мМ (конечная концентрация) имидазола растворимую фракцию вносили в колонку и колонку после отмывки колонки буфером, содержащим 20 мМ (конечная концентрация) имидазола элюировали буфером, содержащим 500 мМ (конечная концентрация) имидазола. Полученную элюированную фракцию концентрировали с использованием Amicon Ultra-15 10K (Millipore) и компонент буфера замещали PBS посредством диализа с получением антигенов головка-GCN4.
[0076] Пример 2
Получение белка GCN4-головка и его мультимера
(1) Конструирование экспрессирующего вектора GCN4-головка
Используя промежуточный вектор 2 в качестве матрицы, посредством ПЦР амплифицировали фрагмент ДНК (SEQ ID NO: 18), кодирующий полипептид, содержащий GCN4 и добавленную к нему линкерную последовательность (G4S)1 (далее в настоящем документе полипептид обозначен как "GCN4-(G4S)1"; SEQ ID NO: 17), с использованием праймера для смысловой цепи с последовательностью распознавания NcoI (SEQ ID NO: 15) и праймера для антисмысловой цепи с последовательностью распознавания XhoI (SEQ ID NO: 16). Амплифицированный фрагмент ДНК и плазмиду pET-21d (Merck) расщепляли рестрикционными ферментами NcoI и XhoI и лигировали друг с другом посредством ДНК-лигазы. Затем лигированный продукт вносили в DH5α Escherichia coli и образующуюся плазмиду получали в качестве промежуточного вектора 3.
Используя промежуточный вектор 1 в качестве матрицы, посредством ПЦР амплифицировали фрагмент ДНК (SEQ ID NO: 12), кодирующий головку (SEQ ID NO: 11), с использованием праймера для смысловой цепи с последовательностью распознавания XhoI (SEQ ID NO: 19) и праймера для антисмысловой цепи с последовательностью распознавания XhoI (SEQ ID NO: 20). Амплифицированный фрагмент ДНК и промежуточный вектор 3 расщепляли рестрикционным ферментом XhoI и лигировали друг с другом посредством ДНК-лигазы. Лигированный продукт вносили в DH5α Escherichia coli и образующуюся плазмиду получали в виде pKNOB3. pKNOB3 содержит последовательность ДНК (SEQ ID NO: 22), кодирующую полипептид, состоящий из GCN4, линкерной последовательности (G4S)1, головки и последовательности-метки гистидинового гексамера (полипептид, обозначаемый как "GCN4-головка"; SEQ ID NO: 21; фиг. 1). pKNOB3 вносили в BL21 Escherichia coli (DE3) (Merck) с получением экспрессирующего GCN4-головку штамм E. coli KNOB3.
(2) Рекомбинантную Escherichia coli культивировали и экспрессируемый белок очищали таким же образом, как в пример 1 с получением антигена GCN4-головка.
[0077] Пример 3
Получение белка головки-CMP и его мультимера
(1) Конструирование экспрессирующего вектора головки-CMP
Для экспрессии полипептида, содержащего головку, линкерную последовательность (G4S)2H6(G4S)2 и трехвалентную формирующую суперспираль единицу белка CMP (NCBI#: NP_001025546) (далее в настоящем документе полипептида, обозначаемого как "головка-CMP"; SEQ ID NO: 23; фиг. 1), в Escherichia coli кодоны последовательности ДНК, кодирующей полипептид, оптимизировали и искусственным способом синтезировали последовательность ДНК (SEQ ID NO: 24), которую конструировали так, чтобы она содержала последовательность распознавания NdeI на 5'-конце, последовательность распознавания BamHI на 3'-конце и 5'- и 3'-защитные основания для клонирования в экспрессирующий вектор. Синтезированную ДНК и плазмиду pUC57 (GenScript Inc.) расщепляли рестрикционным ферментом EcoRV лигировали друг с другом посредством ДНК-лигазы. Затем лигированный продукт вносили в DH5α Escherichia coli и образующуюся плазмиду получали в качестве промежуточного вектора 4.
Промежуточный вектор 4 расщепляли рестрикционными ферментами NdeI и BamHI с получением фрагмента ДНК, кодирующего головку-CMP. Фрагмент ДНК и плазмиду pET-11a (Merck), расщепленные рестрикционными ферментами NdeI и BamHI, лигировали друг с другом посредством ДНК-лигазы. Лигированный продукт вносили в DH5α Escherichia coli и образующуюся плазмиду получали в виде pKNOB4. Затем pKNOB4 вносили в BL21 (DE3) Escherichia coli (Merck) с получением экспрессирующего головку-CMP штамма E. coli KNOB4.
(2) Рекомбинантную Escherichia coli культивировали и экспрессируемый белок очищали таким же образом, как в пример 1 с получением антигенов головки-CMP.
[0078] Пример 4
Получение белка MP-головки и его мультимера
(1) Конструирование экспрессирующего вектора CMP-Knob9
Для экспрессии полипептида, состоящего из CMP, линкерной последовательности (G4S)2H6(G4S)1(G3S)1 и головки (далее в настоящем документе, полипептида, обозначаемого как "CMP-головка "; SEQ ID NO: 25; фиг. 1) в Escherichia coli, кодоны последовательности ДНК, кодирующей полипептид, оптимизировали и искусственным способом синтезировали последовательность ДНК (SEQ ID NO: 26), которую конструировали так, чтобы она содержала последовательность распознавания NdeI на 5'-конце, последовательность распознавания BamHI на 3'-конце и 5'- и 3'-защитные основания для клонирования в экспрессирующий вектор. Синтезированную ДНК и плазмиду pUC57 (GenScript Inc.), расщепленные рестрикционным ферментом EcoRV, лигировали друг с другом посредством ДНК-лигазы. Затем лигированный продукт вносили в DH5α Escherichia coli и образующуюся плазмиду получали в качестве промежуточного вектора 5.
Промежуточный вектор 5 расщепляли рестрикционными ферментами NdeI и BamHI с получением фрагмента ДНК, кодирующего CMP-головку. Фрагмент ДНК и плазмиду pET-11a(Merck), расщепленные рестрикционными ферментами NdeI и BamHI, лигировали друг с другом посредством ДНК-лигазы. Лигированный продукт вносили в DH5α Escherichia coli и образующуюся плазмиду получали в виде pKNOB5. Затем pKNOB5 вносили в BL21 (DE3) Escherichia coli (Merck) с получением экспрессирующего CMP-головку штамма E. coli KNOB5.
(2) Рекомбинантную Escherichia coli культивировали и экспрессируемый белок очищали таким же образом, как в пример 1, с получением антигенов CMP-головки.
[0079] Сравнительный пример 1
Получение белка головки и его мультимера
(1) Конструирование экспрессирующего вектора головки
Для экспрессии полипептида (SEQ ID NO: 1; фиг. 1), содержащего последовательность-метку гистидинового гексамера, добавленного к области головки фибриллярного белка EDSV, в Escherichia coli, кодоны последовательности ДНК, кодирующей полипептид, оптимизировали и искусственным способом синтезировали последовательность ДНК (SEQ ID NO: 2), которую конструировали так, чтобы она содержала последовательность распознавания NdeI на 5'-конце и последовательность распознавания BamHI BamHI на 3'-конце для клонирования в экспрессирующий вектор. Синтезированную ДНК и плазмиду pET-11a (Merck) расщепляли рестрикционными ферментами NdeI и BamHI и лигировали друг с другом посредством ДНК-лигазы. Лигированный продукт вносили в DH5α Escherichia coli и образующуюся плазмиду получали в виде pKNOB1. Затем pKNOB1 вносили в BL21 (DE3) Escherichia coli (Merck) с получением экспрессирующего головку штамма E. coli KNOB1.
(2) Рекомбинантную Escherichia coli культивировали и экспрессируемый белок очищали таким же образом, как в пример 1 с получением антигенов головки.
[0080] Пример тестирования 1
Пять рекомбинантных антигенных белков (головка, GCN4-головка, головка-GCN4, CMP-головка и головка-CMP), очищенных в примерах 1-4 и в сравнительном примере 1, количественно определяли с использованием набора анализа белков BCA (Pierce). Результаты предоставлены в таблице 1.
[0081] [Таблица 1]
| Антигенный белок | Количество, собранное на литр культуры E. coli |
| Головка | 77 мг |
| Головка-GCN4 | 21 мг |
| GCN4-головка | 37 мг |
| Головка-CMP | 15 мг |
| CMP-головка | 44 мг |
[0082] Пример тестирования 2
Анализ свойств рекомбинантных белков
Пять рекомбинантных антигенных белков (головка, GCN4-головка, головка-GCN4, CMP-головка и головка-CMP), очищенных в примерах 1-4 и в сравнительном примере 1, анализировали посредством SDS-PAGE. Каждый из рекомбинантных антигенных белков смешивали с буфером для образца, не содержащем восстановителя, и образцы белков подвергали тепловой денатурации при 100°C в течение 5 мин, и образцы белков без тепловой денатурации вносили в трис-глициновый гель с равномерной концентрацией 12,5% (Atto, E-R12,5 л) по 2 мкг/полосу, и подвергали электрофорезу при 10 мА в течение 130 мин. Проводили окрашивание CBB с Ez Stain Aqua (Atto, AE-1340). Для вестерн-блоттинга образцы белков переносили на PVDF мембрану обычным способом. Реакцию с первичным антителом проводили с разведением антисыворотки курицы к белку головки 1:100. Реакцию со вторичным антителом проводили с разведением конъюгата антитела к IgG курицы с HRP (антитело к тяжелым и легким цепям IgG курицы (IgY), Bethyl Laboratories) 1:4000. После реакции со вторичным антителом проводили реакцию хемилюминесценции с использованием Western Lightning Plus-ECL (Perkin Elmer Life и Analytical Science) и получаемое люминесцентное изображение регистрировали с использованием Image Quant LAS4000 mini (GE Healthcare). Подтверждено, что все пять рекомбинантных антигенных белков формировали молекулы, которые, полагают, представляют собой тримеры (фиг. 2).
Анализ посредством гель-фильтрации проводили с использованием колонки HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade (GE Healthcare), присоединенной к AKTA Prime Plus (GE Healthcare). Скорость потока устанавливали на 0,8 мл/мин и использовали PBS буфер. В качестве маркеров молекулярных масс использовали наборы для калибровки гель-фильтрации LMW и HMW (GE Healthcare). Анализ подтвердил, что все пять рекомбинантных антигенных белков формировали молекулы, которые, полагают, представляют собой тримеры (фиг. 3).
[0083] Пример тестирования 3
Оценка иммуногенности рекомбинантных антигенов (тест подавления гемагглютинации (тест HI))
Пять рекомбинантных антигенных белков (головка, GCN4-головка, головка-GCN4, CMP-головка и головка-CMP), очищенных в примерах 1-4 и в сравнительном примере 1, использовали для иммунизации кур и измеряли индуцированные HI антитела. Вакцины получали, смешивая рекомбинантные антигенные белки с масляным адъювантом (смесь легкого парафинового масла, сорбитанмоноолеата и полисорбата 80) в количестве 10 мкг/0,5 мл относительно головки. В качестве контрольной вакцины использовали коммерчески доступный антиген EDSV из вакцины против EDS (EB66), поставляемый Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute. Для получения вакцины EDSV, культивируемый в клетках EB66, смешивали с масляным адъювантом (смесь легкого парафинового масла, сорбитанмоноолеата и полисорбата 80) при 106,7 TCID50/0,5 мл или более. Вакцины вводили курам SPF, в возрасте 29 суток посредством внутримышечной инъекции 0,5 мл вакцины в бедренную мышцу птиц. Через 7 недель после иммунизации, у кур собирали кровь и собранную сыворотку подвергали тесту HI. В тесте HI тестируемую сыворотку смешивали с 25% каолином, используемым в объеме в 3 раза большем, чем сыворотка (= разведение 4×) и смесь обрабатывали в течение 20 мин при комнатной температуре с перемешиванием каждые 5 мин. Образец, получаемый после центрифугирования, проводимого при 2000 об./мин. в течение 5 мин, использовали в качестве образца для измерения. Образец для измерения серийно разводили два раза PBS(-) и к 0,025 мл разведенного образца добавляли 0,025 мл HA антигенов, получаемых в концентрации 4 единицы/0,025 мл. Образец сенсибилизировали при комнатной температуре в течение периода от 10 до 20 мин. Затем добавляли 0,05 мл 0,5% эритроцитов курицы, суспендированных в PBS, и смесь выдерживали для реакции при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем определяли титр HI антител на основании изображения гемагглютинации. Тест подтвердил, что при использовании рекомбинантных антигенных белков с формирующей мультимеры единицей, в частности таких 3 типов рекомбинантных антигенных белков, как GCN4-головка, CMP-головка и головка-CMP, титр индуцируемых HI антител был выше (фиг. 4).
[0084] Пример тестирования 4
Тест для подтверждения эффективного уровня антигенов
Рекомбинантные антигенные белки (головка-GCN4 и CMP-головка), очищенные в примерах 1 и 4, тестировали для подтверждения эффективных уровней антигенов у кур. Вакцины получали, смешивая рекомбинантные антигенные белки (головка-GCN4 и CMP-головка) с масляным адъювантом (смесь легкого парафинового масла, сорбитанмоноолеата и полисорбата 80) в количествах 10 мкг/0,5 мл, 3 мкг/0,5 мл, 1 мкг/0,5 мл и 0,3 мкг/0,5 мл относительно головки и вводили курам SPF, в возрасте 29 суток посредством внутримышечной инъекции 0,5 мл вакцин в бедренную мышцу птиц. Через 7 недель после иммунизации у кур собирали кровь и собранную сыворотку подвергали тесту HI. В тесте HI тестируемую сыворотку смешивали с 25% каолином, используемым в объеме в 3 раза большем, чем сыворотка (= разведение 4×) и смесь обрабатывали в течение 20 мин при комнатной температуре с перемешиванием каждые 5 мин. Образец, получаемый после центрифугирования, проводимого при 2000 об./мин. в течение 5 мин, использовали в качестве образца для измерения. Образец для измерения серийно разводили два раза PBS(-) и к 0,025 мл разведенного образца добавляли 0,025 мл HA антигенов, получаемых в концентрации 4 единицы/0,025 мл. Образец сенсибилизировали при комнатной температуре в течение периода от 10 до 20 мин. Затем добавляли 0,05 мл 0,5% эритроцитов курицы, суспендированных в PBS, и смесь выдерживали для реакции при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем определяли титр HI антител на основании изображения гемагглютинации. Тест подтвердил, что рекомбинантные антигенные белки головка-GCN4 и CMP-головка демонстрируют желаемое индуцирующее HI антитело действие при использовании в концентрациях 1 мкг/0,5 мл или более и 0,3 мкг/0,5 мл или более, соответственно (фиг. 5 и 6).
[0085] Пример тестирования 5
Тест для подтверждения защитного действия против летальной инфекции EDSV
Рекомбинантный антигенный белок (CMP-головка), очищенный в примере 4, тестировали для подтверждения его действия для защиты против начала летальной инфекции EDSV у кур, иммунизированных белком. Вакцину получали, смешивая рекомбинантный антигенный белок (CMP-головка) с масляным адъювантом (смесь легкого парафинового масла, сорбитанмоноолеата и полисорбата 80) в количестве 10 мкг/0,5 мл относительно головки. В качестве контрольной вакцины использовали коммерчески доступный антиген EDSV из вакцины против EDS (EB66), поставляемый Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute. Для получения вакцины EDSV, культивируемый в клетках EB66, смешивали с масляным адъювантом (смесь легкого парафинового масла, сорбитанмоноолеата и полисорбата 80) при 106,7 TCID50/0,5 мл или более. Вакцины вводили коммерчески доступным курам (яйценоские птицы) в возрасте приблизительно 210 суток посредством внутримышечной инъекции 0,5 мл вакцины в бедро птиц. Кровь собирали через 4, 6, 9, 12 и 16 недель после иммунизации, и собранную сыворотку подвергали тесту HI. В тесте HI тестируемую сыворотку смешивали с 25% каолином, используемым в объеме в 3 раза большем, чем сыворотка (= разведение 4×) и смесь обрабатывали в течение 20 мин при комнатной температуре с перемешиванием каждые 5 мин. Образец, получаемый после центрифугирования, проводимого при 2000 об./мин. в течение 5 мин, использовали в качестве образца для измерения. Образец для измерения серийно разводили два раза PBS(-) и к 0,025 мл разведенного образца добавляли 0,025 мл HA антигенов, получаемых в концентрации 4 единицы/0,025 мл. Образец сенсибилизировали при комнатной температуре в течение периода от 10 до 20 мин. Затем добавляли 0,05 мл 0,5% эритроцитов курицы, суспендированных в PBS, и смесь выдерживали для реакции при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем определяли титр HI антител на основании изображения гемагглютинации. Через 16 недель после иммунизации кур инфицировали посредством перорального введения летального штамма EDSV KE-80 при 106,5 TCID50/птицу. В течение 4 недель после инфицирования у кур контролировали яйценоскость. Тест подтвердил, что при использовании в концентрации 10 мкг/0,5 мл рекомбинантный антигенный белок (CMP-головка) через 16 недель после иммунизации поддерживал высокий титр подавляющих HI антител (фиг. 7). Также подтверждено, что у кур, иммунизированных рекомбинантным антигенным белком (CMP-головка), через 16 недель после иммунизации можно сильно снижать клинические симптомы, такие как потеря яйценоскости и продукция аномальных яиц, даже когда курам инъецировали летальный EDSV (фиг. 8).
Промышленная применимость
[0086] Вакцина по настоящему изобретению, которая в качестве активного ингредиента содержит рекомбинантный белок и/или его мультимер, содержащий область головки EDSV, слитую с полипептидом, содержащим формирующую суперспираль единицу, после инокуляции курам может индуцировать высокий титр HI антител и может предотвращать возникновение EDS кур. Изобретение обеспечивает профилактику возникновение EDS на фермах с потенциальным риском EDS. Вакцину по настоящему изобретению можно получать без использования яиц домашних уток и можно стабильно поставлять.
Claims (18)
1. Слитый белок для профилактики синдрома падения яйценоскости (EDS), в котором полипептид, содержащий формирующую суперспираль единицу, связан с областью головки фибриллярного белка вируса EDS (EDSV), причем головка содержит полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 11, или полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11 с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот;
за исключением слитого белка, в котором одна или несколько аминокислот в аминокислотной последовательности нативной области стебля были добавлены на N-концевой стороне SEQ ID NO: 11, и
за исключением полипептида, в котором одна или несколько аминокислот из аминокислот с первой по девятую в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11 были делетированы или заменены.
2. Слитый белок по п.1, содержащий между полипептидом и головкой линкерную последовательность и/или последовательность-метку.
3. Слитый белок по п.1 или 2, где формирующая суперспираль единица получена из природного белка, формирующего мультимеры.
4. Слитый белок по п.3, где природный формирующий мультимеры белок представляет собой GCN4 или белок матрикса хряща (CMP).
5. Слитый белок по п.1, где CMP связан с C-концом головки.
6. Слитый белок по п.5, который содержит полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 23, или полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23 с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот.
7. Слитый белок по п.1, где CMP связан с N-концом головки.
8. Слитый белок по п.7, который содержит полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 25, или полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25 с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот.
9. Слитый белковый мультимер слитого белка по любому из пп.1-8 для профилактики EDS, причем мультимер представляет собой димер, тример или мультимер более высокого порядка или смесь таких мультимеров.
10. Слитый белковый мультимер по п.9, представляющий собой тример.
11. Вакцина против EDS, содержащая в качестве активного ингредиента эффективное количество слитого белка по любому из пп.1-8.
12. Вакцина против EDS, содержащая в качестве активного ингредиента эффективное количество мультимера слитого белка по п.9.
13. Набор, предназначенный для измерения уровня антител к области головки EDSV в тестируемом образце, содержащий слитый белок, отличающийся тем, что он содержит слитый белок по любому из пп.1-8.
14. Набор, предназначенный для измерения уровня антител к области головки EDSV в тестируемом образце, содержащий мультимер слитого белка, отличающийся тем, что он содержит мультимер слитого белка по п.9.
15. Способ профилактики EDS, включающий введение курам слитого белка по любому из пп.1-8.
16. Способ профилактики EDS, включающий введение курам мультимера слитого белка по п.9.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2014087620 | 2014-04-21 | ||
| JP2014-087620 | 2014-04-21 | ||
| PCT/JP2015/057657 WO2015163037A1 (ja) | 2014-04-21 | 2015-03-16 | 産卵低下症候群（ｅｄｓ）予防ワクチン |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016145061A RU2016145061A (ru) | 2018-05-21 |
| RU2016145061A3 RU2016145061A3 (ru) | 2019-02-15 |
| RU2720978C2 true RU2720978C2 (ru) | 2020-05-15 |
Family
ID=54332208
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016145061A RU2720978C2 (ru) | 2014-04-21 | 2015-03-16 | Профилактическая вакцина против синдрома падения яйценоскости (eds) |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10253072B2 (ru) |
| EP (1) | EP3135764B1 (ru) |
| JP (1) | JP6620386B2 (ru) |
| CN (1) | CN106232813B (ru) |
| BR (1) | BR112016024419B1 (ru) |
| MX (1) | MX370079B (ru) |
| RU (1) | RU2720978C2 (ru) |
| WO (1) | WO2015163037A1 (ru) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6620386B2 (ja) * | 2014-04-21 | 2019-12-18 | Ｋｍバイオロジクス株式会社 | 産卵低下症候群（ｅｄｓ）予防ワクチン |
| WO2017104796A1 (ja) * | 2015-12-16 | 2017-06-22 | 国立大学法人 岡山大学 | 人工ｒｎａ制限酵素 |
| CN108567976A (zh) * | 2017-03-10 | 2018-09-25 | 成都贝爱特生物科技有限公司 | 鸡新城疫、减蛋综合征二联基因工程亚单位疫苗的制备方法和应用 |
| CN108653724B (zh) * | 2017-04-01 | 2020-11-27 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 一种用于预防禽减蛋综合征的疫苗组合物、及其制备方法和应用 |
| CN110092840B (zh) * | 2019-05-15 | 2023-01-17 | 青岛明勤生物科技有限公司 | 一种鸡传染性喉气管炎、减蛋综合征二联多表位疫苗 |
| CN112679585B (zh) * | 2019-10-17 | 2023-06-30 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 包含禽减蛋综合征病毒基因工程亚单位疫苗的疫苗组合物及其制备方法和应用 |
| CN112708637B (zh) * | 2019-10-25 | 2022-06-24 | 苏州世诺生物技术有限公司 | 禽减蛋综合症病毒新型基因工程疫苗、其制备方法与应用 |
| CN110981968B (zh) * | 2019-12-17 | 2022-05-27 | 天康制药(苏州)有限公司 | 含有狂犬病病毒g蛋白的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗 |
| CN114573708B (zh) * | 2020-11-30 | 2024-05-17 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 副鸡禽杆菌ha融合蛋白及其三聚体、制备的疫苗组合物、制备方法和应用 |
| CN115960179A (zh) * | 2022-10-19 | 2023-04-14 | 扬州优邦生物药品有限公司 | 血清4型禽腺病毒elisa抗体检测试剂盒 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004078977A1 (en) * | 2003-03-04 | 2004-09-16 | Abic Ltd. | Subunits of the adenovirus fiber protein and uses thereof as vaccines |
| US20050137156A1 (en) * | 2003-08-09 | 2005-06-23 | Johnston Stephen A. | Methods and compositions for generating an immune response |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5557254B2 (ja) | 2009-02-10 | 2014-07-23 | 国立大学法人 琉球大学 | 薬物運搬体並びにこれを利用したアジュバントおよびワクチン |
| DK2910634T3 (en) | 2012-10-22 | 2019-01-21 | Km Biologics Co Ltd | Vaccine for the prevention of edema in pigs |
| JP6620386B2 (ja) * | 2014-04-21 | 2019-12-18 | Ｋｍバイオロジクス株式会社 | 産卵低下症候群（ｅｄｓ）予防ワクチン |
-
2015
- 2015-03-16 JP JP2016514810A patent/JP6620386B2/ja active Active
- 2015-03-16 RU RU2016145061A patent/RU2720978C2/ru active
- 2015-03-16 US US15/305,127 patent/US10253072B2/en active Active
- 2015-03-16 CN CN201580020982.3A patent/CN106232813B/zh active Active
- 2015-03-16 BR BR112016024419-2A patent/BR112016024419B1/pt active IP Right Grant
- 2015-03-16 EP EP15783019.1A patent/EP3135764B1/en active Active
- 2015-03-16 MX MX2016013819A patent/MX370079B/es active IP Right Grant
- 2015-03-16 WO PCT/JP2015/057657 patent/WO2015163037A1/ja active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004078977A1 (en) * | 2003-03-04 | 2004-09-16 | Abic Ltd. | Subunits of the adenovirus fiber protein and uses thereof as vaccines |
| US20050137156A1 (en) * | 2003-08-09 | 2005-06-23 | Johnston Stephen A. | Methods and compositions for generating an immune response |
Non-Patent Citations (6)
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR112016024419A8 (pt) | 2023-01-31 |
| CN106232813B (zh) | 2021-01-22 |
| BR112016024419B1 (pt) | 2023-09-26 |
| MX2016013819A (es) | 2017-03-09 |
| US10253072B2 (en) | 2019-04-09 |
| MX370079B (es) | 2019-11-29 |
| EP3135764A1 (en) | 2017-03-01 |
| WO2015163037A1 (ja) | 2015-10-29 |
| JP6620386B2 (ja) | 2019-12-18 |
| CN106232813A (zh) | 2016-12-14 |
| EP3135764B1 (en) | 2024-09-11 |
| JPWO2015163037A1 (ja) | 2017-04-13 |
| RU2016145061A3 (ru) | 2019-02-15 |
| RU2016145061A (ru) | 2018-05-21 |
| EP3135764A4 (en) | 2017-12-27 |
| US20170044217A1 (en) | 2017-02-16 |
| BR112016024419A2 (pt) | 2017-11-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2720978C2 (ru) | Профилактическая вакцина против синдрома падения яйценоскости (eds) | |
| JP2021078505A (ja) | インフルエンザウイルスワクチン及びその使用 | |
| US9803189B2 (en) | Virus-like platform for rapid vaccine discovery | |
| CN111592602A (zh) | 一种β冠状病毒抗原、其制备方法和应用 | |
| JP6735269B2 (ja) | インフルエンザウイルスワクチンおよびその使用 | |
| DK1893228T3 (en) | CHIMERIC POLYPEPTIDES AND THEIR THERAPEUTIC APPLICATIONS TOWARDS A Flaviviridae INFECTION | |
| KR20080052509A (ko) | 유행성 독감 바이러스에 대한 백신 | |
| JP2009528305A (ja) | 鳥インフルエンザウイルスに対するキメラワクチン抗原 | |
| US20230346916A1 (en) | Immunogenic compositions against severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 | |
| JP2008505050A (ja) | Ｓａｒｓコロナウイルスｓタンパク質およびその使用 | |
| WO2022071513A1 (ja) | ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する改良型ＤＮＡワクチン | |
| DK2910634T3 (en) | Vaccine for the prevention of edema in pigs | |
| US10117923B2 (en) | Production of an immunogen using a plant virus | |
| CN101475641B (zh) | 腺病毒载体禽流感重组疫苗 | |
| RU2691302C1 (ru) | Иммуногенная композиция на основе рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, а также на основе белковых антигенов и способ получения иммуногенной композиции | |
| Liu et al. | Construction and evaluation of DNA vaccine encoding Ebola virus glycoprotein fused with lysosome-associated membrane protein | |
| Shah et al. | Overexpression and characterization of the 100K protein of Fowl adenovirus-4 as an antiviral target | |
| AU2022279442A1 (en) | Optimized polypeptide for a subunit vaccine against avian reovirus | |
| JP2024532763A (ja) | 切断型インフルエンザノイラミニダーゼおよびこれを使用する方法 | |
| CN116507361A (zh) | 疫苗 | |
| KR20010040618A (ko) | 사람 면역결핍 바이러스용 생 백신 | |
| Zajac | Identification of African Swine Fever Virus antigens for development of an efficacious subunit vaccine | |
| PL231230B1 (pl) | Czynnik zwiększający efektywność szczepionki DNA skierowanej przeciw wirusowi, preparat plazmidowy DNA, szczepionka DNA, sposób otrzymywania zmodyfikowanego wektora ekspresyjnego oraz zastosowanie sekwencji nukleotydowej rozpoznawanej przez czynnik NF kappa B | |
| WO2024068265A2 (en) | Virus-like particles displaying sars-cov-2 antigens as booster vaccines and uses thereof | |
| TWI324160B (ru) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HZ9A | Changing address for correspondence with an applicant |