CN108567976A - 鸡新城疫、减蛋综合征二联基因工程亚单位疫苗的制备方法和应用 - Google Patents

鸡新城疫、减蛋综合征二联基因工程亚单位疫苗的制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种鸡新城疫、减蛋综合征二联基因工程亚单位疫苗及其用途。本发明还提供了鸡新城疫、减蛋综合征二联基因工程亚单位疫苗的制备方法，包含由鸡新城疫病毒HN部分片段与减蛋综合征病毒knob片段经连接肽融合的载体和在哺乳动物细胞中的表达方法。本发明获得的基因工程亚单位疫苗与佐剂配合使用对鸡制成。本发明的鸡新城疫、减蛋综合征二联基因亚单位疫苗具有良好免疫原性，可安全的施用于家禽并能够达到良好的预防效果。

Description

鸡新城疫、减蛋综合征二联基因工程亚单位疫苗的制备方法 和应用
技术领域
本发明属于基因工程兽用疫苗技术领域，具体涉及一种鸡新城疫、鸡减蛋综合征二联基因工程亚单位疫苗及其制备方法。
背景技术
鸡新城疫(newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(newcastle virus，NDS)引起的主要感染家禽和野生禽类的接触性传染病，一旦爆发将给禽养殖业带来毁灭性打击，国际兽医局(OIE)已将其列为必报的A类疫病。我国ND的发病率很高，且死亡率高达90％以上，严重危害我国鸡养殖业的健康发展。
鸡减蛋综合症(egg drop syndrome,EDS)是由减蛋综合症病毒(eggdropsyndrome virus,EDSV)引起的一种传染性疾病，虽无特殊症状，但产蛋率下降、蛋体畸形等是感染鸡群的主要表现，且持续较长时间，给蛋鸡养殖业带来巨大的经济损失。
鸡新城疫和鸡减蛋综合症的防控仍以免疫预防为主，传统疫苗如灭活或减毒活疫苗仍是主要的手段，由于其保持了完整的病毒颗粒性状和病毒表面蛋白，且减毒活疫苗能在体内复制，可有效诱导中和抗体产生，因此，对禽类疾病的预防和控制大规模流行取得了较好的效果。尽管传统疫苗目前仍在广泛应用，但由于灭活不完全和毒力返强的安全性问题性不容忽视，如新城疫在免疫鸡群中仍时有发生，养殖环境以及免疫低下鸡群仍可感染EDSV，或同时感染NDS。因此，发展安全、高效的疫苗，是鸡新城疫和鸡减蛋综合症综合防控的重要研究方向。
基因工程亚单位疫苗是应用重组DNA技术发展的不含病毒基因组，而是将病毒保护性抗原基因通过载体形式在宿主细胞表达、纯化并配以佐剂制成的安全性极高且免疫原性很强的疫苗。亚单位疫苗是近年来鸡新城疫和鸡减蛋综合症疫苗发展的重要方向，采用NDS的保护抗原片段制成的亚单位疫苗(见中国专利：201210491591.8)，或分别与其它疾病如传染性支气管炎和传染性法氏囊病相关病毒的保护性抗原组成的二联疫苗(见中国专利：201210506662.7)、三联亚单位疫苗(见中国专利：201210506647.2)或四联亚单位疫苗(见中国专利：201210506637.9)，对鸡新城疫以及其它疾病具有安全和稳定的预防效果。但目前尚未见鸡新城疫和鸡减蛋综合症病毒保护性抗原组成的联合亚单位疫苗。
发明内容
本发明的目的是提供一种可同时预防鸡新城疫和鸡减蛋综合症的二联基因工程亚单位疫苗。
为达到上述目的，本发明的技术方案提供一种用于预防鸡疾病的二联基因工程亚单位疫苗，由鸡新城疫病毒HN部分基因和减蛋综合征knob部分基因和减蛋综合征knob基因与真核表达载体BP0001组成，转染细胞表达蛋白，纯化获得基因工程亚单位疫苗后，再与佐剂配合制成。
所述鸡新城疫病毒HN部分基因和减蛋综合征knob基因亚单位疫苗的制备方法，其包括如下步骤：
1)通过全基因合成获得具有免疫原性的鸡新城疫病毒HN部分基因和减蛋综合征knob基因融合片段；
2)将上述基因引入合适的表达系统，从而进行融合蛋白的表达。优选真核表达载体，构建重组载体质粒；
3)将重组质粒转染哺乳动物细胞，表达所述的鸡新城疫和减蛋综合征病毒二联基因亚单位疫苗；
4)从细胞培养上清中收获目的蛋白，经纯化获得亚单位疫苗；
5)收获目的蛋白，配合佐剂免疫动物检测目的蛋白的免疫原性。
所述的鸡新城疫病毒HN部分基因和减蛋综合征knob基因是以全基因合成方式获得。
本发明的研究内容主要包括：利用真核表达载体，筛选具有良好免疫原性的鸡新城疫病毒HN部分基因和减蛋综合征knob基因融合片段作为靶基因，并对HN部分基因和knob基因融合片段进行克隆、鉴定；构建能高效表达HN部分基因和knob基因融合片段的真核表达载体，通过转染哺乳动物细胞并进行加压筛选，表达产生大量目的蛋白，SDS-PAGE电泳检测目的基因的蛋白表达量，利用蛋白纯化技术对目的蛋白质进行纯化，获得纯度较高的目的蛋白，配合佐剂免疫动物检测目的蛋白的免疫原性。
本发明通过采用基因工程等先进技术，研发鸡新城疫病毒HN部分基因和减蛋综合征knob基因融合片段基因亚单位疫苗，利用BP0001作基因表达载体，与具有良好免疫原性的鸡新城疫病毒HN部分基因和减蛋综合征knob基因融合片段连接构建重组载体质粒。该疫苗的生产技术具有安全、稳定、可规模化等优点，疫苗能够达到良好的预防效果。本疫苗的研制和应用，开拓了生物医药研发的新方向，使新一代动物生物制品更加安全、廉价、使用方便，有利于促进我国家禽养殖业的发展，造福广大人民，对促进社会和经济进步意义重大，具有很好的社会和经济效益。
附图说明
图1基因工程亚单位疫苗真核表达载体质粒图谱
图2重组质粒酶切鉴定图谱
具体实施方式
提供以下实施例对本发明作进一步阐释。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所作的任何变动都将落在权利要求书的范围内。
实施例1融合蛋白的制备
1、HN-knob蛋白质粒构建
1.1基因和引物合成
表达序列通过下述合成的基因重组至表达载体。基因和引物由金唯智公司合成，合成基因序列重组至质粒载体pUC19中，获得包含目的基因的质粒分别为pUC-Hk；以下为合成基因片段序列。
合成基因片段Hk:
CCTAGGGCCACCATGGCCTGGATGATGCTTCTCCTCGGACTCCTTGCTTATGGATCAGGAGTCGACTCTACCCCTCTCACCAGGATCATCTCCATGGGCAACAACCTCTTCGACAGCGGCTACGAAATTTTTGCCAGCTGCCCCCAGAACAAGGCCGCCAAGGTGGCTGGCTACGTGTACCTGACATCCGTGGGAGGCCTGGTCCACGGCACCATCCAAATCAAGGCCACCGCCGGCTACTGGTTTACCGGCGGCAACAGCGTGCAGGAGTCCATCAGGTTCGGCCTGGTGCTGTGTCCCTTCAGCGCCCGGGACCCTACAGCTAATCTGAGCGGCTGGCCCGCTCCTGTGGTGTGGAGCGGAGACTCCAACACCCCCCTGTACTTCGCCGCCAACGCCATCAGCTACACCAACAACCGGGTGAACCTGGCTGTGACCGGCAACTTCTACAAGGAGGAGACCGAGCTGCCTGGCTACACCCGGCATAGCTTCTGCCCTACCGGCACCACCGGCATGAACTTCACCGGCGGAAACCTCTATGTGTGCCCCTGCACAGTGAACACCGGCGCCACCACCCTGAATGCCATTTACATGGTGTTCGTGATCACCCAGTCCGCCCTGGGAACAAACTTCTTTGCCAGCAACACCCCCCCTAACACCTTCTTCCTGACCCCCCCTATCCCCTTCACATACGTGGGCGCCCAGACCATGGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGAGGAGGATCCCGGATGAAGCAGATCGAGGACAAGATCGAGGAGATCGAGTCCAAGCAGAAGAAGATCGAGAACGAGATCGCCCGGATCAAGAAGCTGGAGGGCGGCGGAGGCTCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCTCCTGCACCAGGATCCCTAGCTTTGACATGTCCGCCACCCACTACTGCTACACCCACAACGTGATCCTGTCCGGCTGCCGGGACCACTCCCATTCCTACCAGTACCTGGCTCTGGGCGTGCTGAGGACCAGCGCTACCGGCAGGGTGTTCTTCAGCACCCTGAGGTCCATCAATCTGGACGACACCCAGAACCGGAAGTCCTGCTCCGTGAGCGCTACACCCCTGGGCTGTGACATGCTGTGCTGCCCCGATGAGCAGGACTACCAGATCAGGATGGCCAAGTCCTCCTACAAGCCCGGCCGGTTTGGAGGAAAAAGGATCCAGCAGGCCATCCTGTCCATCAAGGTGAGCACCTCCCTGGGCGAAGATCCCGTCCTGACCGTGCCTCCCAATACCGTGACCCTGATGGGCGCTGAGGGCCGGATTCTGACCGTGGGCACATCCCATTTCCTGTACCAGAGGGGCAGCTCCTACTTTAGCCCCGCCCTGCTGTACCCCATGACCGTGAGCAATAAGACCGCTACCCTGCACTCCCCCTACACCTTTAACGCTTTCACCAGGCCCGGATCCATCCCTTGTCAGGCCAGCGCCAGGTGCCCCAATTCCTGCGTGACCGGCGTCTACACCGACCCCTACCCCCTCATCTTCTACCGGAACCACACACTCCGGGGCGTCTTCGGCACCATGCTGGATGGCGAACAGGCCCGGCTGAACCCTGCTTCCGCCGTGTTTGACTCCACCAGCAGGTCCCGGATCACCAGGGTCAGCTCCAGCAGCATCAAAGCCGCCTACACCACCTCCACCTGCTTCAAGGTGGTGAAGACCAACAAGACATACTGCCTGAGCATCGCCGAGATCAGCAACACCCTGTTCGGCGAGTTCCGGATTGTGCCCCTGCTCGTGGAAATCCTGAAGGACGACGGCCACCACCACCACCACCACTGATTAATTAA
引物合成
P1：5’-GAGCTCGGTACCCGGGGATCCTC-3’
P2：5’-GTGGTATGGCTGATTATGATC-3’
1.2基因片段的获得
对表达载体BP0001质粒以及包含目的基因的质粒pUC-Hk分别进行双酶切处理，酶切体系的建立：在1.5ml EP管中加入如下成分：酶切体系的建立：在2个不同的1.5ml EP管中加入如下成分：BP0001质粒或pUC-Hk质粒分别40μl(加入2个不同EP管中)，CutSmartBuffer 10μl，AvrⅡ和PacI各5μl，灭菌水45μl，混匀后在37℃下反应5h，琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，切胶回收目的基因片段，QIAGEN胶回收纯化试剂盒进行胶体回收处理，获得线性化处理的载体片段BP0001(A/P)以及含粘性末端的基因片段为命名为Hk(A/P)。
1.3重组质粒的连接转化
在T4连接酶的作用下，将已用相同酶切后回收获得的载体片段BP0001(A/P)与基因片段Hk(A/P)进行连接反应。连接反应体系如下：在1.5ml EP管中加入如下成分BP0001(A/P)2μl，基因片段Hk(A/P)6μl，10×T4Buffer 1μl，T4DNA ligase 1μl，混匀后在室温(20℃左右)下反应4h以上，连接产物转化至Top10大肠杆菌感受态细胞中，涂布于2YT(Amp)平板培养基上37℃静止过夜，平板命名pHk。
1.4重组质粒的鉴定
从pHk平板中各挑取数个重组单菌落经过培养后做为PCR模板，分别进行PCR筛选鉴定。菌液PCR扩增反应体系(总体积20μL):2×Taq HS 10μL、菌液模板2μL、上下游引物(P1和P2)各1μL(终浓度0.3μmol/L)，最后用双蒸水补至20μL；反应条件：95℃2min，一个循环；94℃60s、53℃60s、72℃120s，30个循环；最后72℃5min。琼脂糖凝胶电泳分析结果，筛选获得阳性克隆。通过菌落PCR鉴定正确的菌落接种后提取再进行酶切鉴定。首先进行重组菌的质粒提取，然后进行酶切分析，酶切体系：在1.5ml EP管中加入如下成分：质粒2μl，CutSmart Buffer 1μl，AvrⅡ和PacI各1μl，补灭菌水至10μl，混匀后在37℃下反应4h。琼脂糖凝胶电泳分析，鉴定获得阳性克隆。
1.5重组质粒的测序鉴定
将通过菌落PCR和酶切鉴定正确的菌落随机接种数个菌落再进行测序鉴定。提供菌液样品重组质粒送至公司进行测序鉴定。测序鉴定正确的表达质粒进行质粒大量提取，命名为pHk，保存备用。
2、质粒转染及细胞筛选
采用宿主细胞CHO-S或DG44或经过基因工程改造的CHO细胞系，按照电转染试剂盒说明书分别进行质粒转染。转入质粒的细胞分别置于摇瓶培养(37℃、8％CO2、110rpm/min)至48h，细胞计数仪检测细胞活率和细胞数。
转染48h后进行加压筛选：即MTX浓度从100nM起逐渐加至200nM、500nM、700nM、和1000nM，并获得初筛细胞，再经有限稀释法进行单克隆细胞筛选，获得单克隆细胞系获得初筛细胞。通过检测蛋白表达量以及纯度从中优选克隆逐级扩大培养。
3、蛋白表达和纯化
筛选高产克隆细胞从96孔板扩至24孔板生长，然后扩至6孔板生长，之后扩至50mL摇瓶生长。收集培养7天细胞培养上清液，离心除去细胞碎片，上清液以0.45μm滤膜过滤，调节pH至7.4，用HisTrap HP 1ml色谱柱纯化融合蛋白，5倍柱床体积的去离子水冲洗柱子，再用5倍柱床体积的PBS缓冲液(20mM磷酸盐，pH 7.4)平衡柱子，上样，用20倍体积咪唑缓冲液(125mM/L)将目的蛋白从柱上洗脱，以SDS-PAGE检测蛋白纯度在90％以上，获得融合蛋白HN-knob。
实施例2免疫效力检测
1.重组二联抗原蛋白的免疫效力试验
将实施例1所获得的二联抗原蛋白HN-knob与佐剂(壳聚糖)1∶1混合制成亚单位疫苗，进行免疫效力试验。将21日龄SPF鸡80羽随机分成4组：即空白对照组、二联抗原蛋白HN-knob疫苗组(0.5mg/羽)。分别于接种后第2、4、6周后翅静脉采血，分离血清用HI(血凝酶抑制试验方法)测定抗体滴度。具体方法是：取试验血清用PBS连续倍比稀释后，各取0.025ml加入等体积4个单位HA(Hemagglutinin，红细胞凝聚素)抗原中，另设HA抗原和PBS阴性对照，室温静置10～20min，再分别加如0.05ml 0.5％鸡红细胞悬液并混合，室温孵育1小时后，根据血凝图像判定HI抗体滴度。试验结果显示如表1所示，重组二联抗原蛋白HN-knob免疫后具有良好的HI抗体滴度。
表1重组抗原免疫后的HI抗体滴度水平
取上述免疫试验第4、6、8周血清，用间接ELISA(酶联免疫试验方法)测定HN和knob蛋白抗体的滴度。试验结果如表2,3所示，本发明提供的二联抗原蛋白HN-knob免疫后可同时产生抗HN和knob抗体，抗体滴度效果较好。
表2重组二联抗原蛋白免疫后的HN抗体滴度
表3重组二联抗原蛋白免疫后的knob抗体滴度
2.新城疫攻毒保护作用
将21日龄SPF鸡60羽随机分为3组：空白对照组，二联抗原蛋白HN-knob疫苗组(0.5mg/羽)，新城疫油乳灭活苗组(0.3ml/羽，含新城疫病毒量不低于108.0EID50)。首次免疫后，分别于第3周进行第二次免疫，第5周进行第三次免疫。于第三次免后10天用新城疫标准强毒株F48E8株以滴鼻方式进行攻毒，攻毒剂量为106.0ELD50。攻毒后每天观察鸡群的反应，连续观察14天，记录各组鸡的存活数，计算免疫保护率。测试结果如表4所示，本发明提供的二联抗原蛋白亚单位疫苗免疫后能针对新城疫强毒攻击提供良好的免疫保护作用。
表4重组亚单位疫苗对新城疫攻毒的免疫保护作用
3.强毒EDSV感染免疫保护试验
将重组二联抗原蛋白HN-knob与佐剂混合制备疫苗，取正常蛋鸡60羽随机分成3组：即空白对照组，亚单位疫苗组(0.5mg/羽)，减蛋综合征油乳减毒苗组(0.5ml/羽，含EDSV病毒量不低于106.7EID50)，肌内注射接种到鸡爪的肌肉内。于免疫后16周，口服给药感染强毒EDSV KE-80株，攻毒后4周观察产蛋情况。试验结果表5所示，本发明提供的重组二联抗原蛋白HN-knob免疫的蛋鸡，即使在免疫后16周感染强毒EDSV，也可以大幅度减轻停止产蛋、产畸形蛋等症状，效果与减蛋综合征油乳减毒苗组相当。
表5重组亚单位疫苗对减蛋综合征强毒EDSV攻毒的免疫保护作用
SEQUENCE LISTING
<110> 成都贝爱特生物科技有限公司
<120> 鸡新城疫、减蛋综合征二联基因工程亚单位疫苗的制备方法和应用
<130> 0
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 307
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Cys Thr Arg Ile Pro Ser Phe Asp Met Ser Ala Thr His Tyr Cys Tyr
1 5 10 15
Thr His Asn Val Ile Leu Ser Gly Cys Arg Asp His Ser His Ser Tyr
20 25 30
Gln Tyr Leu Ala Leu Gly Val Leu Arg Thr Ser Ala Thr Gly Arg Val
35 40 45
Phe Phe Ser Thr Leu Arg Ser Ile Asn Leu Asp Asp Thr Gln Asn Arg
50 55 60
Lys Ser Cys Ser Val Ser Ala Thr Pro Leu Gly Cys Asp Met Leu Cys
65 70 75 80
Cys Pro Asp Glu Gln Asp Tyr Gln Ile Arg Met Ala Lys Ser Ser Tyr
85 90 95
Lys Pro Gly Arg Phe Gly Gly Lys Arg Ile Gln Gln Ala Ile Leu Ser
100 105 110
Ile Lys Val Ser Thr Ser Leu Gly Glu Asp Pro Val Leu Thr Val Pro
115 120 125
Pro Asn Thr Val Thr Leu Met Gly Ala Glu Gly Arg Ile Leu Thr Val
130 135 140
Gly Thr Ser His Phe Leu Tyr Gln Arg Gly Ser Ser Tyr Phe Ser Pro
145 150 155 160
Ala Leu Leu Tyr Pro Met Thr Val Ser Asn Lys Thr Ala Thr Leu His
165 170 175
Ser Pro Tyr Thr Phe Asn Ala Phe Thr Arg Pro Gly Ser Ile Pro Cys
180 185 190
Gln Ala Ser Ala Arg Cys Pro Asn Ser Cys Val Thr Gly Val Tyr Thr
195 200 205
Asp Pro Tyr Pro Leu Ile Phe Tyr Arg Asn His Thr Leu Arg Gly Val
210 215 220
Phe Gly Thr Met Leu Asp Gly Glu Gln Ala Arg Leu Asn Pro Ala Ser
225 230 235 240
Ala Val Phe Asp Ser Thr Ser Arg Ser Arg Ile Thr Arg Val Ser Ser
245 250 255
Ser Ser Ile Lys Ala Ala Tyr Thr Thr Ser Thr Cys Phe Lys Val Val
260 265 270
Lys Thr Asn Lys Thr Tyr Cys Leu Ser Ile Ala Glu Ile Ser Asn Thr
275 280 285
Leu Phe Gly Glu Phe Arg Ile Val Pro Leu Leu Val Glu Ile Leu Lys
290 295 300
Asp Asp Gly
305
<210> 2
<211> 921
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgcaccagga tccctagctt tgacatgtcc gccacccact actgctacac ccacaacgtg 60
atcctgtccg gctgccggga ccactcccat tcctaccagt acctggctct gggcgtgctg 120
aggaccagcg ctaccggcag ggtgttcttc agcaccctga ggtccatcaa tctggacgac 180
acccagaacc ggaagtcctg ctccgtgagc gctacacccc tgggctgtga catgctgtgc 240
tgccccgatg agcaggacta ccagatcagg atggccaagt cctcctacaa gcccggccgg 300
tttggaggaa aaaggatcca gcaggccatc ctgtccatca aggtgagcac ctccctgggc 360
gaagatcccg tcctgaccgt gcctcccaat accgtgaccc tgatgggcgc tgagggccgg 420
attctgaccg tgggcacatc ccatttcctg taccagaggg gcagctccta ctttagcccc 480
gccctgctgt accccatgac cgtgagcaat aagaccgcta ccctgcactc cccctacacc 540
tttaacgctt tcaccaggcc cggatccatc ccttgtcagg ccagcgccag gtgccccaat 600
tcctgcgtga ccggcgtcta caccgacccc taccccctca tcttctaccg gaaccacaca 660
ctccggggcg tcttcggcac catgctggat ggcgaacagg cccggctgaa ccctgcttcc 720
gccgtgtttg actccaccag caggtcccgg atcaccaggg tcagctccag cagcatcaaa 780
gccgcctaca ccacctccac ctgcttcaag gtggtgaaga ccaacaagac atactgcctg 840
agcatcgccg agatcagcaa caccctgttc ggcgagttcc ggattgtgcc cctgctcgtg 900
gaaatcctga aggacgacgg c 921
<210> 3
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Thr Pro Leu Thr Arg Ile Ile Ser Met Gly Asn Asn Leu Phe Asp Ser
1 5 10 15
Gly Tyr Glu Ile Phe Ala Ser Cys Pro Gln Asn Lys Ala Ala Lys Val
20 25 30
Ala Gly Tyr Val Tyr Leu Thr Ser Val Gly Gly Leu Val His Gly Thr
35 40 45
Ile Gln Ile Lys Ala Thr Ala Gly Tyr Trp Phe Thr Gly Gly Asn Ser
50 55 60
Val Gln Glu Ser Ile Arg Phe Gly Leu Val Leu Cys Pro Phe Ser Ala
65 70 75 80
Arg Asp Pro Thr Ala Asn Leu Ser Gly Trp Pro Ala Pro Val Val Trp
85 90 95
Ser Gly Asp Ser Asn Thr Pro Leu Tyr Phe Ala Ala Asn Ala Ile Ser
100 105 110
Tyr Thr Asn Asn Arg Val Asn Leu Ala Val Thr Gly Asn Phe Tyr Lys
115 120 125
Glu Glu Thr Glu Leu Pro Gly Tyr Thr Arg His Ser Phe Cys Pro Thr
130 135 140
Gly Thr Thr Gly Met Asn Phe Thr Gly Gly Asn Leu Tyr Val Cys Pro
145 150 155 160
Cys Thr Val Asn Thr Gly Ala Thr Thr Leu Asn Ala Ile Tyr Met Val
165 170 175
Phe Val Ile Thr Gln Ser Ala Leu Gly Thr Asn Phe Phe Ala Ser Asn
180 185 190
Thr Pro Pro Asn Thr Phe Phe Leu Thr Pro Pro Ile Pro Phe Thr Tyr
195 200 205
Val Gly Ala Gln Thr Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Glu Ser Lys Gln
225 230 235 240
Lys Lys Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Glu
245 250
<210> 4
<211> 762
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
acccctctca ccaggatcat ctccatgggc aacaacctct tcgacagcgg ctacgaaatt 60
tttgccagct gcccccagaa caaggccgcc aaggtggctg gctacgtgta cctgacatcc 120
gtgggaggcc tggtccacgg caccatccaa atcaaggcca ccgccggcta ctggtttacc 180
ggcggcaaca gcgtgcagga gtccatcagg ttcggcctgg tgctgtgtcc cttcagcgcc 240
cgggacccta cagctaatct gagcggctgg cccgctcctg tggtgtggag cggagactcc 300
aacacccccc tgtacttcgc cgccaacgcc atcagctaca ccaacaaccg ggtgaacctg 360
gctgtgaccg gcaacttcta caaggaggag accgagctgc ctggctacac ccggcatagc 420
ttctgcccta ccggcaccac cggcatgaac ttcaccggcg gaaacctcta tgtgtgcccc 480
tgcacagtga acaccggcgc caccaccctg aatgccattt acatggtgtt cgtgatcacc 540
cagtccgccc tgggaacaaa cttctttgcc agcaacaccc cccctaacac cttcttcctg 600
acccccccta tccccttcac atacgtgggc gcccagacca tgggcggcgg cggctccggc 660
ggaggaggat cccggatgaa gcagatcgag gacaagatcg aggagatcga gtccaagcag 720
aagaagatcg agaacgagat cgcccggatc aagaagctgg ag 762

Claims (8)

1.一种鸡新城疫和减蛋综合征病毒二联基因工程亚单位疫苗，其特征在于，所述的二联基因工程亚单位疫苗由鸡新城疫病毒HN片段与减蛋综合征病毒knob片段经连接肽融合组成。
2.权利要求1所述的鸡新城疫和减蛋综合征病毒二联基因工程亚单位疫苗，其特征在于，所述的鸡新城疫病毒包含如SEQ ID NO：1所示的HN部分的氨基酸序列，或由在所述HN氨基酸序列中的任何一个或几个氨基酸被删除，添加和/或取代的氨基酸序列；所述的减蛋综合征病毒包含如SEQ ID NO：3所示的knob氨基酸序列，或由在所述knob氨基酸序列中的任何一个或几个氨基酸被删除，添加和/或取代的氨基酸序列。
3.权利要求1所述的鸡新城疫病毒和减蛋综合征病毒二联基因亚单位疫苗，其特征在于，所述的鸡新城疫病毒HN部分包含如SEQ ID NO：2所示的的核苷酸序列；所述的减蛋综合征病毒knob包含如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
4.一种真核表达载体，其包含权利要求3所述的鸡新城疫病毒HN和减蛋综合征病毒knob的核苷酸序列(SEQ ID NO：2，4)。
5.权利要求1所述的鸡新城疫和减蛋综合征病毒二联基因亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)通过全基因合成获得鸡新城疫病毒HN部分基因和减蛋综合征knob基因融合片段；
(2)将基因插入真核表达载体BP0001，构建重组载体质粒；
(3)将重组质粒转染哺乳动物细胞，表达所述的鸡新城疫和减蛋综合征病毒二联基因亚单位疫苗；
(4)从细胞培养上清中收获目的蛋白，经纯化获得亚单位疫苗。
6.一种用于预防鸡新城疫和减蛋综合征的疫苗组合物，所述的疫苗组合物包含权利要求5(4)所述的纯化获得的亚单位疫苗和免疫佐剂，或其它提高免疫原性的疫苗用载体。
7.权利要求6所述的疫苗组合物，其可通过静脉注射、肌肉注射、腹膜注射以及喷雾或气雾等方式施用。
8.权利要求1所述的鸡新城疫和减蛋综合征病毒二联基因亚单位疫苗在制备预防禽类如鸡新城疫和减蛋综合征疫苗的用途。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110092840A (zh) * 2019-05-15 2019-08-06 青岛明勤生物科技有限公司 一种鸡传染性喉气管炎、减蛋综合征二联多表位疫苗

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110159024A1 (en) * 2003-03-04 2011-06-30 Abic Biological Laboratories Teva Ltd. Subunits of the adenovirus fiber protein and uses thereof as vaccines
CN102698262A (zh) * 2012-06-18 2012-10-03 青岛易邦生物工程有限公司 鸡新城疫、产蛋下降综合征、病毒性关节炎三联灭活疫苗的生产方法
CN103495182A (zh) * 2013-09-29 2014-01-08 河南亚卫动物药业有限公司 一种鸡新城疫二联体疫苗及其制备方法
CN106232813A (zh) * 2014-04-21 2016-12-14 般财团法人化学及血清疗法研究所 预防减蛋综合征(eds)的疫苗

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110159024A1 (en) * 2003-03-04 2011-06-30 Abic Biological Laboratories Teva Ltd. Subunits of the adenovirus fiber protein and uses thereof as vaccines
CN102698262A (zh) * 2012-06-18 2012-10-03 青岛易邦生物工程有限公司 鸡新城疫、产蛋下降综合征、病毒性关节炎三联灭活疫苗的生产方法
CN103495182A (zh) * 2013-09-29 2014-01-08 河南亚卫动物药业有限公司 一种鸡新城疫二联体疫苗及其制备方法
CN106232813A (zh) * 2014-04-21 2016-12-14 般财团法人化学及血清疗法研究所 预防减蛋综合征(eds)的疫苗

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NCBI: ""RecName: Full=Hemagglutinin-neuraminidase，accession number：Q91UL0.1"", 《GENBANK》 *
张继乐等: ""新城疫病毒Roakin 株HN 基因的克隆及真核表达载体的构建"", 《西北农业学报》 *
陈亚波等: ""新城疫病毒HN 蛋白抗原表位分析及结构域基因原核表达"", 《中国预防兽医学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110092840A (zh) * 2019-05-15 2019-08-06 青岛明勤生物科技有限公司 一种鸡传染性喉气管炎、减蛋综合征二联多表位疫苗
CN110092840B (zh) * 2019-05-15 2023-01-17 青岛明勤生物科技有限公司 一种鸡传染性喉气管炎、减蛋综合征二联多表位疫苗

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