CN102985107A - 免疫性流感成分 - Google Patents

Abstract

本文公开了提供了为流感免疫原提供新成分的方法。这些成分能使宿主应答其通常不识别的免疫原位点。新免疫原可以用作疫苗或研制抗体。

Description

免疫性流感成分

技术领域

本发明涉及免疫性流感成分。

背景技术

人、畜领域的现有获批准疫苗一般能有效应对所谓的“一类（Class One）病原体”。一般来说，一类病原体（如麻疹、流行性腮腺炎和风疹病毒）指的是这样一类病原体：（1）在婴儿、幼儿、儿童和青少年中会感染或造成严重疾病；（2）携带一种相对稳定的微生物基因组；（3）具有会导致自发性恢复的自然病史；和（4）诱发与多克隆（polyclonal）和多表位抗原识别有关的长期记忆。

相反，二类病原体，如流感病毒、HIV-1、疟原虫、支原体（如那些会造成肺结核的支原体）、锥体虫、血吸虫、利什曼原虫、边虫（Anaplasma）、肠道病毒、星形病毒、鼻病毒、诺瓦克病毒、毒性/病原性大肠杆菌、淋球菌（Neisseria，奈瑟氏菌属）、链霉菌、不可分型嗜血杆菌流感病毒、C型肝炎病毒、癌细胞等的特点刚好相反。例如二类病原体：（1）倾向于在相当大的宿主年龄范围中感染和传播，从儿童到老年阶段都会发生感染和复发；（2）在其基因组的指定区域中表现出微生物遗传不稳定性（这类病原体成功进化的标志）；（3）有些情况下，包括疾病的自发性恢复，仍然会频繁使宿主容易每年反复多次地感染和/或确诊为慢性/活动性或慢性/潜伏性的感染状态；（4）诱发寡克隆早期免疫反应，该反应会直接导致一组十分有限的、会提供狭窄的种特异性保护、无保护和/或增强感染的免疫优势表位；和（5）感染或接种疫苗后造成免疫失调，如表位阻断抗体（epitope-blocking antibody）、Ig子类非典型初次免疫反应、记忆交叉反应性回忆（anamnestic cross-reactive recall）和不恰当的T_H1和/或T_H2细胞因子代谢。

在免疫学水平上，相差很大的病原体会产生不同的发病机理和疾病结果，比如HIV-1与人类鼻病毒。高度成功的免疫系统逃避策略，如已经演化出“假性印记”（Deceptive Imprinting）并在跨宿主和微生物类群上被选择和维持。因此，脊椎动物免疫系统（例如因病原体假性印记）运转失效，基本上与60年中平均每年是否感染2-6次HIV-1或常见感冒病毒是相同的。

尽管对于抗原输送和表达方面取得的一些进步提高了某些二类病原微生物的免疫原性，现有疫苗技术尚未很快转化为在人体中使用的广泛有效的新型安全许可疫苗。这在很大程度上或许是因为对掌控脊椎动物素质防御系统起源、谱发展（repertoire development）、维持、激活、衰老和在相似及不相似环境中的共同演化的基本原理认识不足。

人体流感疫苗开发中目前缺乏的是这样一种能诱发免疫和保护的成分，其同型和亚型依赖性较弱，并且因此不需要每年在目前基于鸡蛋的技术生产方案中混合和生产多种亚型。一种适当的新产品是流感重组HA或NA亚单位疫苗，它可以诱发能交叉中和亚型内抗原变体和不同亚型流感病毒的免疫反应。

流感是一种NIAID C类病原体，每年在美国造成36,000人死亡和220,000人住院。作为一种呼吸系统疾病，流感通过来自感染者咳嗽或打喷嚏产生的飞沫和/或受到污染的传染体传播。高风险人群包括儿童和老年人，患上流感普遍会导致流感相关肺炎的次生并发症、上呼吸道并发症（儿童中耳炎）和其他系统疾病（如心血管疾病等）。流感是历史上最大规模的流行病的根源；1918年的西班牙流感造成全世界4000多万人死亡。在美国，每年流感引起的直接医疗成本（住院、就诊和药物等）预计高达46亿美元。此外，美国每年因流感损失的工作日达1.11亿，因病假和生产力损失而给美国商业带来的相关成本超过每年70亿美元。一场严重流感疫情的总直接成本和间接成本（工作日损失、上学日损失等）每年至少有120亿美元。

流感病毒，并且当伴随二次细菌感染时，很久以来都被视为大量发病率和死亡率的原因。并发症包括肺炎、支气管炎、充血性心力衰竭、心肌炎、脑膜炎、脑炎和肌炎。一些并发症高危人群是那些患有慢性肺病或心血管疾病的人群、慢性（病）疗养设施（包括疗养院）的住院者，以及85岁及以上的老人。（流感预防与控制免疫实践顾问委员会（ACIP）的建议。MMWR，1996年，第45卷；以及Thompson et al.,JAMA 2003；289:179-186）。美国老年人口数量在1976年到1999年间翻了一番，随着二战后一代生育高峰的到来，预计往后几年还会增加。这个年龄段的人因流感相关疾病而死亡的概率是65-69年龄段人群的16倍。1990年代流感相关死亡数量增加的另一个重要因素是A型（H3N2）流感病毒的猖獗，这是一种致病性更强的近期的流行流感病毒。

流感是一种单链核糖核酸（RNA）病毒，它会迅速变异而成为新的强毒菌。这种菌株分为三类，即流感A、B和C。该病毒根据两种表面糖蛋白，即血球凝集素（HA）和神经氨酸酶（NA），又被进一步分为至少16个HA和至少9个NA亚型。最近由NIAID/NIH发起的人类流感病毒全基因组（1996-2004年从纽约州收集）分析表明，尽管HA相同，多个持续性种系发育不同的谱系在同一人群中共同传播（co-circulate），导致抗原新进化枝的重配和产生。虽然HA的抗原变异仍然是人类流感A病毒进化上的主要选择性压力，但是抗原新进化枝是通过持续性病毒谱系之间重配而不是通过抗原漂移而出现，这一发现对于目前、以往流感疫苗株选择和生产的年度方法意义重大（Holmes et al.,PLoS Biol.20053（9）:e300）。流感可以从猪、禽、马、狗和其他哺乳动物上得到。

年度全球病毒跟踪项目和后续的“反应性（reactionary）”疫苗生产中的核心问题是抗原变异。抗原变异是一种保证特定病原体基因快速序列变异的进化机制，该病原体基因对单个蛋白质抗原的同源染色体进行编码，通常涉及多个相关的基因复本，导致该病原体表面上的一个抗原的结构发生变化。这样，宿主免疫系统在感染或再次感染期间识别该病原体的能力会下降，在宿主能够继续对抗这种疾病前必须制造出新的抗体来识别已经发生变化的抗原。结果，宿主对这种病毒性疾病不能保持完整的免疫力。这一现象代表了现代疫苗发展所面临的最大困难之一，或者说是最大的困难。

不出所料，感染或接种所有受批准疫苗后产生的免疫反应与亚型和菌株是高度特异的。实际上，这意味着自然、实验感染和接种疫苗中诱发的抗体只能中和同型病毒。特定亚型/菌株的体液免疫反应似乎与血球凝集素分子球状头部上发现的各种抗原位点的相对免疫优势有关（Wiley et al.,Nature,1981年；289:373-378）。特别是，抗体反应已经映射到HA球状头部内的五个主要抗原位点上。在这五个HA表位中（A-E），A和B这两个位点最具有免疫优势并与最高数量的氨基酸超突变性（hypervariability）有关，部分原因是反复出现基因点变异、删除以及偶尔引入N联糖基化位点，统称为病毒的“抗原漂移”（Cox & Bender,Semin.Virol.1995；6:359-70；Busch et al.,Sci.286:1921,1999；Plotkin & Dushoff，PNAS 100:7152,2003；和Munoz & Deem,Vaccine,23,1144,2005）。

1953年由Francis（Ann.Int.Med.,1953,399:203）首次描述的原始抗原痕迹（originalantigenic sin）是一种初次免疫反应，当不是通过同源，而是通过交叉反应疫苗或输入病毒亚型/菌株增强时，这种效应会导致刚刚形成的抗体与先前的抗原反应比与输入抗原的反应更理想。

由侥幸回忆（aleatory recall）指导的免疫特异性丧失给宿主免疫系统带来一个针对感染期间和感染之间的病毒变化产生（mount）平衡的有效的体液反应现实问题。因此，自然感染和疫苗接种无法产生更有效的初次和记忆免疫交叉反应就不足为怪了，因为谱系发展抵抗那些在抗原层次上较低的弱免疫性表位（less immunogenic epitopes）（可能是最保守的并能产生交叉应变（cross-strain）免疫力）。免疫优势表位误导免疫反应远离一个抗原上更保守的和更弱的免疫区域，这一免疫学现象最初被称为“克隆优势”（Kohler et al.,J Acquir.Immune Defic.Syndr.1992;5:1158-68），后来更名为“假性印记”（Kohler et al.,Immunol.Today，1994（10）:475-8）。

假性印记背后的免疫优势的免疫学机理还未完全搞清楚，尚未有一个机理能够充分解释某些表位如何和为什么演变成免疫调节和免疫优势。在这一现象中观察到的免疫反应范围包括诱发能在实验室动物模型-病毒挑战系统（experimental animal model-viral challenge systems）中引起被动保护的高度菌株/分离菌特异性的中和抗体，一直到诱发一种结合非保护/非中和的、阻断甚至病原体增强的抗体，有些情况下这种抗体能阻止宿主免疫系统识别附近的表位，以便干扰CD4 T细胞辅助。同样观察到通过免疫优势诱发的免疫反应，导致一组聚焦更狭窄的表位，以及宿主辅助者的T细胞和细胞毒素细胞媒介免疫性（Gzyl et al.,Virology 2004；318（2）:493-506;Kiszka et al.,J.Virol.200276（9）:4222-32；和Goulder et al.,J.Virol.2000；74（12）:5679-90）。

疫苗接种是预防疾病的最佳方式，每年都要根据全世界范围对活性病毒株的流行病学监测来研发当前的三价灭活病毒疫苗和弱毒活（减毒）流感疫苗。两种疫苗都包含流感A和流感B亚型。获批准的流感疫苗由来自两个流感A亚型（H1N1和H3N2）和一个流感B亚型的灭活完整的或化学分裂的亚单位制备组成。流感疫苗的生产涉及所选变体通过连续传代或与其他高产菌株重配以适应蛋中高产。所选流感病毒在鸡蛋中生长，而流感病毒颗粒从尿囊液中提纯。然后通过用灭活剂（如福尔马林）处理灭活完整的或分裂的病毒制备。美国疫苗市场90%以上的份额被两家公司占据，即Aventis Pasteur（市场份额50%以上）和Chiron（PowderJect）（英国）。一种鼻内疫苗

经过了批准并于2003年首次面市。

现有流感疫苗的局限包括：

（1）老年人群中的功效降低。在老年人中，防病率较低，特别是那些已经形成生活习惯的老年人（Gorse et al.,Infec.Dis,190:11-19,2004）。在65或65岁以上的老年人群中，不到30%的人群身上观察到对三价亚病毒颗粒流感疫苗的明显抗体反应（Powers & Belshe,J.Infec.Dis,167:584-592,1993）；

（2）用鸡蛋生产。现有制造工艺依靠鸡蛋。流感病毒菌株必须在鸡蛋中复制完好，因此每年需要大量的鸡蛋供应。由于需要寻找适当的病毒组合，生产每年都处境堪忧；

（3）不能对付最近出现的菌株和漂移菌株，如90年代末的A/Sydney/5/97，或对付潜在的大流行菌株，如1997年出现的香港H5N1病毒；

（4）用现有完整或分裂流感疫苗保护的寿命短，并且效果会随着因抗原变异而在流感流行株中出现遗传改变而减弱。理想情况下，疫苗菌株与造成疾病的流感病毒配对。当与来自感染个体的原始分离菌相比时，改变可能发生在鸡蛋培养的流感病毒的血球凝集素中（Oxfordet al.,J.Gen.Virol.72:185-189,1989；和Rocha et al.,J.Gen.Virol.74:2513-2518,1993），减弱了这种疫苗的潜在效果；

（5）那些对鸡蛋敏感的人使用在鸡蛋中生产的疫苗有副作用；和

（6）现有受批准的生产系统每个用流感病毒感染的鸡蛋生产一个疫苗，生产时间约为24周。

因此，现有的受批准的流感疫苗：（1）不会诱发能中和常见抗原变体（每年在一个流行病期间重复发生）以及亚型病毒和重配病毒的抗体；（2）不会在老年人群中产生强烈的免疫反应；以及（3）由于存在副作用（比如有些疫苗无法给儿童服用）而找不到更广泛的适用性。

发明内容

本披露部分涉及具有增强或最新免疫原性的新型流感抗原。一种值得关注的流感成分可以作为一种改性得到的改进疫苗，提供了具有不同排列和/或最新可识别表位的病毒或病毒亚单位抗原。

更加有效和快速地使用重组体技术结合最新免疫再聚焦（immune refocusing）技术，免疫再聚焦技术导致亚单位HA、NA（或两者）和/或含有HA、NA（或两者）的成分通过产生一种具有改进的交叉菌株效果的流感疫苗而极大地改变了目前的疫苗开发实践，从而摆脱了对全球每年跟踪病毒这一当前做法的需要，节省了大笔资金，分流医疗资源，包括每年为了用鸡蛋生产和制造疫苗而不断增加的时间和劳动力，以及人命。

其他特点和优势在此描述，并将从以下图纸和详细描述中显现出来。

附图说明

提供以下图纸的目的是为了解释本披露的各个方面，决不能理解为限制本发明的范围。

图1表示与免疫再聚焦HA抗原试验结果有关的表1；

图2表示与特定突变及其序列有关的表2；

图3表示H1N1 HA上一组免疫再聚焦突变实例的近似位置。组A表示包含三个HA-1和HA-2链的HA三聚物的结构。组B、C和D表示HA单体，显示在所选突变的近似位置中的氨基酸。这些图是根据流感的H1N1 HA的结构文件lRU7.pdb修改的（A/PR8/1934,Gamblin et al.,Science,303:1838-1842,2004），也可以从RCSB蛋白质数据库中找到；

图4表示提供表位2和3中组合突变的表3；

图5表示提供表位5中组合突变的表4。

具体实施方式

流感在这里定义为包含A、B、C三种类型的病毒。这种病毒存在于禽类和各种哺乳动物中，如猫、狗、马、猪等。A型在人体中是致病性最强的，既会导致季节性流行病，也会偶尔且极为罕见地导致更为致命的全国性传染病疫情。这些类型是通过若干血清类型定义的，其反映了宿主对病毒颗粒表面上表达的抗原的免疫反应。病毒携带大部分与疫苗保护有关的表位的表面上的两种结构是血球凝集素（HA或H）和神经氨酸酶（NA或N）。至少存在16种已知的H亚型和至少9中已知的N亚型。HA介导病毒的吸附和融合。NA具有唾液酸酶活性。

“野生型”是指天然存在的有机体或其中的部分。该提法也涉及由自然过程产生的天然存在在人群的天然有机体中存在的核酸和蛋白质，正如因自然突变产生并通过基因漂移、自然选择等维持的多态性中所看到的那样，而不包括具有（比如）通过重配手段得到的序列的核酸或蛋白质。

“免疫原”和“抗原”在这里可以互换使用，表示诱发抗体（以体液作为媒介的）和/或T细胞起源（以细胞作为媒介的）的特定免疫反应的分子，例如，包含一种与这个分子或一个CD₄ ⁺或CD₈ ⁺T细胞结合的抗体，其中，CD₄ ⁺或CD₈ ⁺T细胞能识别表达这个分子（如受到病毒感染的细胞）的细胞。这个分子可以包含一个或几个特定抗体或T细胞结合的部位。众所周知，这种部位称为表位或决定基（determinants）。抗原可以是多肽、多核苷酸、多糖、脂类等，及其组合，如糖蛋白或脂蛋白。免疫原性化合物或产品，或抗原化合物或产品是指能诱发特定免疫反应（可以是体液的、细胞的或二者兼具）的化合物或产品。

疫苗是用于产生免疫保护反应的免疫原或抗原，即这种反应，如抗体，减轻了宿主中免疫原或抗原或表达它们的实体的负面影响。众所周知，用量是根据临床前研究和临床研究得出、推断和/或确定的。需要时可以服用多倍剂量，从而保证延长预防性状态或无反应性状态。出于本披露的目的，使用疫苗的成功端点（successful endpoint）是在宿主中存在诱发的免疫反应（如体液的和/或T细胞为媒介的），这种免疫反应导致（比如）产生血清抗体，或由该宿主在任何组织或器官中制造的、与该抗原或关注免疫原结合的抗体。在一些实施例中，诱发的抗体以某种方式与一种携带同源抗原或免疫原的化合物、分子等结合，或者引导该宿主中和、减少、防范和/或排除感染和/或造成临床疾病的病原体。这种免疫反应可以用业内已知的方法（如酶联免疫吸咐测定（ELISA）、蛋白质印迹（Western blot）等）监视。出于本披露的目的，免疫保护作用是在暴露宿主中存在这种抗病原体、抗免疫原、抗病毒等免疫反应（如结合免疫原或感染细胞的抗体和/或T细胞）。这可以使用任何已知的免疫测定法（如ELISA和/或血球凝集素抑制测定法）确定。另外，人们也可以选择使用病毒中和测定法确定（比如）是否存在循环中和抗病毒抗体。出于本披露的目的，在宿主中观察到免疫保护作用，即存在循环抗流感抗体，至少七天、至少十四天、至少二十一天、至少三十天或更长时间，是一种关注疫苗具有功效的证据。此外，在一般情况下，对曾用于制作疫苗的同源性单一流感病毒株产生约1:40的血凝抑制（HI）滴度可作为终点，标志着获得一个候选疫苗。出于发明公开的目的，在动物模型中，暴露之后有任何的死亡推迟均可作为产生保护的证据。因此，在小鼠暴露于致病性流感病毒株的情况下，通常第一只小鼠死于暴露后10天左右。因而，出于本发明公开的目的，若暴露小鼠死亡首日推迟至少一天、至少两天、至少三天或更多可认为产生了保护。免疫保护的时间可为至少14天、至少21天、至少28天、至少35天、至少45天、至少60天、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少1年、至少2年或更长。免疫保护首选的观察群体为远交种群，观察病原体不同的种类、亚型、病毒株、变异株、等位基因等。值得关注的组成成分可以包括病毒颗粒、灭活或减毒（弱毒活）的病毒，或病毒亚基，如NA或HA。其组成成分还可包括病毒样颗粒（VLP），在本领域中已知为表达病毒蛋白和抗原的结构，其可见于完整复制的病毒粒子，但在本发明公开的内容中，表达的是一种免疫性减弱（immunodampened）的免疫优势表位。正常情况下，病毒样颗粒缺乏病毒核酸或使其核酸复制的部分，因此病毒样颗粒无传染性。

在另一实施例中，抗原、决定基或其部分可被克隆进入野生型病毒的基因组中，取代其同源野生型基因。重组病毒便可与野生型病毒一样保存免疫性减弱分子。其病毒可以是流感病毒或另一种病毒载体。因此，例如，对一种可在鸡蛋中能良好增殖的流感病毒株进行操作，以表达免疫性减弱分子，且该重组病毒可利用生产疫苗（用鸡蛋产生免疫性减弱疫苗）的现有材料和方法进行增殖。可对疫苗进行定制，使其对一种、两种或更多种抗原产生免疫反应；对一种病毒，对两种或更多种单独的病毒系（lines）、病毒株、分化枝（clades）等产生免疫反应；对一种、两种或更多种表位产生免疫反应；对一种、两种或更多种血清型产生免疫反应；等等。这可以通过包含多个组分、成分、病毒、病毒样颗粒等获得，其中上述组分、复合物、病毒、病毒样颗粒等中的一种表达值得关注的免疫性减弱抗原，其对多个HA型、NA型（或两者混合）产生反应。此外，多个成分可参与到单个多功能合成物（composition）中。

“免疫优势表位”是指位于一抗原的可选择性激发宿主免疫反应的表位，并能有效或功能性排除该抗原上或的其他表位，这种排除可以是部分性或完全性的。

“表位免疫性减弱”是指对表位进行修饰，以显著抑制宿主的免疫系统产生针对该表位的抗体、辅助性或细胞毒性T细胞。但是，免疫性减弱不一定导致上述表位或对该表位反应的完全清除。

免疫再聚焦（IR）或免疫再聚焦技术（IRT）可用于制造针对表达免疫优势表位的病原体的有效疫苗。该技术最适用的有机体的特征是：该种有机体进化出了一种被称为“假性印迹”的策略以逃避宿主的免疫应答，如通过露出高水平的抗原漂移的免疫优势表位。这种免疫优势表位通常表现为多个氨基酸的形式，其可在不影响病原微生物生存力的条件下发生改变。免疫再聚焦与免疫性减弱是同义的。

抗原免疫优势表位的免疫性减弱可导致宿主有机体产生高滴度的抗体或T细胞，以针对该抗原上非优势表位的应答，和/或新的针对其他相对性免疫沉默表位的抗体滴度或T细胞应答。这种免疫性减弱的抗原可作为有效疫苗，针对有中度或高度变异和/或保守免疫优势表位抗原的微生物。该免疫优势表位或抗原诱发的抗体可作为针对同源微生物的有效疫苗。

通过检查感染病原微生物的宿主有机体内的血清或T细胞反应性，可鉴定免疫优势表位。血清用于评估结合到鉴定抗原的抗体含量，该抗原可能引起宿主有机体内的免疫应答。若存在免疫优势表位，则血清中有大量抗体将结合免疫优势表位，而对存在于抗原表面或内部的其他表位，则极少结合或不结合。

确定免疫优势表位后，将免疫优势表位按照这里所述的材料与方法进行免疫性减弱，并且作为本领域中的一项设计选择。这种操作可在核酸水平、蛋白质水平、碳水化合物水平等进行，或在各水平组合进行，操作方法参照本文并为本领域所知。

举例来说，N-联糖（CHO）的存在可由多肽的一级氨基酸序列确定。三联氨基酸序列的组成是天冬酰胺，其后为任意氨基酸，最后为丝氨酸或苏氨酸（N-X-S/T），其中X为除脯氨酸和天冬氨酸以外的任意氨基酸，该三联氨基酸序列为添加N-连接CHO的靶标。在表位上可添加或移除N-连接糖基化位点，操作方法及材料为本领域已知。

例如，HIV的重组gpl20表现为分子水平导入N-联序列子（NXT/S），这可导致免疫优势V3区域中N-联多聚糖的过度添加，显示出新的抗原特性，如不能结合抗体，该抗体可识别野生型V3表位，同时诱导针对先前沉默或免疫源性较弱的其他表位的抗体应答。存在过多的糖基部分（carbohydrate moiety）不会影响HIV-1重组病毒的感染能力。以重组糖蛋白进行免疫的实验动物表现出中到高滴度的抗体，其在体外可中和感染同源性和异源性野生型HIV-1。因此，对gp 120/160 V3区域内的免疫优势表位进行免疫性减弱，可引起免疫应答再聚焦于同一抗原上的其他中和表位上，参见美国专利US 5,585,250和美国专利US 5,853,724。

此外，可替代、替换或删除免疫优势表位上的一个特定的氨基酸以减弱其免疫原性。免疫性减弱的发生可通过替代、替换或删除免疫优势表位上的一个、两个、三个或更多个氨基酸，例如，通过定点诱变编码抗原的核酸。本文提供了改变核酸/多肽的方法，并且为本领域所知。

多种技术均可影响免疫性减弱，如改变、替换或删除表位的特定氨基酸，或者，例如在表位或其附近添加糖基化位点。如本文所述，其改变可在多肽水平或多核苷酸水平生效，操作方法为本领域所知的。因此，多肽可通过添加、删除或替换表位上或内靶位点的一个或多个分子、基团、化合物等而发生变化。例如，可将一个特定的氨基酸进行化学衍生化，或进行修饰以携带一个额外基团，如多糖，如聚乙二醇。

随着免疫原性结构的操作完成后，对突变蛋白（即值得关注的操作抗原（manipulatedantigen），亦即值得关注的免疫性减弱的抗原）与确定的已知抗体的结合进行筛选分析，可以用于确定是否发生了免疫性减弱；该抗体可结合流感病毒的一个或多个免疫优势表位。举例来说，合成的一条多肽可在其免疫优势表位的一级氨基酸序列中含有一处或多处改变。或者，免疫优势表位的核酸序列进行修饰，以表达免疫性减弱表位。例如，其核酸序列因此可通过定点诱变进行修饰，表达氨基酸替换、插入、删除等，其中有些可在免疫优势表位或其附近引入更进一步的修饰，如引入一个糖基化位点，如引入使免疫优势表位或其附近N-糖基化或O-糖基化的突变，等等。

因此，可将值得关注的一条多肽中编码一个或多个免疫性减弱表位的值得关注的核酸置于克隆和/或表达载体中，操作材料及方法为本领域所知，并且通常可作为一种设计选择而从市场购买。例如，可使用质粒、粘粒、病毒和复制子，很多都有销售。病毒载体的来源包括腺病毒、腺相关病毒、α病毒、噬菌体等。也可使用流感病毒。已知的用于增殖值得关注的载体的合适宿主细胞包括原核细胞、真核细胞、细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。可将细胞构造以分泌值得关注的重组蛋白。这样该多肽可被纯化并用作免疫原。

作为替代，可将此多肽插入于包含流感病毒基因组的载体或流感病毒中，一般情况下，会替换产生该多肽的同源编码序列，使免疫再聚焦多肽能够在所述流感病毒、病毒样颗粒或结构、病毒表面结构成分、亚基等中表达。

因此，免疫再聚焦技术不依赖于载体技术，并可应用于多重表达系统。因而，可将免疫再聚焦抗原纳入到当前使用的众多新型疫苗载体中，其包括但不限于：1）利用目前可以接受的技术（如在哺乳动物细胞或鸡胚中培养）而生产的重组流感病毒；2）重组的温度敏感性流感病毒，如Flu-Mist；3）裂解疫苗；4）表达在昆虫、哺乳动物、酵母菌、细菌或其他细胞中的亚单位疫苗；5）DNA表达质粒；以及6）异源性病毒表达系统，如重组牛痘病毒、腺病毒、慢病毒等。

含有免疫再聚焦HA抗原的免疫原多种提纯方法为本领域所知的。整合入免疫再聚焦HA抗原的重组病毒利用已建立的并当前被批准的，用于制备许可疫苗的技术进行提纯。

在昆虫、哺乳动物或其他体外表达系统中生产的亚单位疫苗可用常规的色谱分析法进行提纯，分离和纯化可用离子交换、凝集素结合树脂、大小分级（size fractionations）、抗体亲和等方法。此外，还可设计将免疫原表达为含有融合区域以方便纯化。例如，HA抗原可以多组氨酸融合的方式表达，使其在金属活化树脂上能够快速而简单地进行纯化。如果需要的话，这种融合伴侣可利用本领域已知的方法，通过特定的蛋白水解而切除。

获得表位突变蛋白（不同于野生型的突变表位）的一个步骤及其类似方法为“丙氨酸扫描突变”（Cunningham & Wells,Science 244:1081-1085（1989）;以及Cunningham & Wells,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:6434-6437（1991））。一个或多个残基被丙氨酸（Ala）或多聚丙氨酸（polyalanine）残基替换。表现出对其替换的功能敏感性的这些残基随后可通过在替换位点引入进一步的或其他的突变进行提炼。因此，当预先指定引入氨基酸序列变异位点时，突变本身的性质是不需要预先指定的。对其他氨基酸可尝试类似的替换，取决于所期望的扫描残基特性。此外，替代的氨基酸的选择可根据，例如，被取代氨基酸的大小、形状或其他参数。例如，谷氨酰胺可替换谷氨酸以降低表位的电荷，而其大小和形状的改变程度非常之轻微。

一种更系统化地鉴定需要修饰的氨基酸残基的方法包括，鉴定参与免疫系统刺激或免疫优势抗体识别的残基，以及很少参与或不参与免疫系统刺激或免疫优势抗体识别的那些残基。对所涉及的残基进行丙氨酸扫描，每个丙氨酸突变均应检验对免疫优势表位的免疫系统刺激或免疫优势抗体识别是否降低。在另一实施例中，选择很少涉及或不涉及免疫系统刺激的残基进行修饰。修饰可涉及到一个或多个残基的删除，一个残基的替换，或相邻于值得关注的残基插入一个或多个残基。在一个实施例中，修饰涉及的是该残基被另一个氨基酸替换。最先替换的可以是保守性置换。若这种置换可诱导免疫系统刺激或与已知免疫优势抗体的反应性升高，则可进行另一种保守性置换，以确定是否可获得更显著的变化。

通过选择在特性上与正常情况下位于该位点的残基差异更大的氨基酸，在远离免疫优势表位处可以实现在改变免疫系统应答能力方面更为明显的改变。因此，进行这种替换的同时还能保持：（a）替换区域多肽链的骨架结构，如折叠（sheet）或螺旋状（helical）构象；（b）靶位点分子的电荷或疏水性，或者（c）侧链的大小。

例如，基于一般侧链的特性，天然存在的氨基酸可分成：

（1）疏水性：蛋氨酸（M或Met），丙氨酸（A或Ala），缬氨酸（V或Val），亮氨酸（L或Leu）和异亮氨酸（I或lie）;

（2）中性，亲水性：半胱氨酸（C或Cys），丝氨酸（S或Ser），苏氨酸（T或Thr），天冬酰胺（N或Asn）和谷氨酰胺（Q或Gin）；

（3）酸性：天冬氨酸（D或Asp）和谷氨酸（E或Glu）；

（4）碱性：组氨酸（H或His），赖氨酸（K或Lys）和精氨酸（R和Arg）；

（5）影响侧链方向的残基：甘氨酸（G或Gly）和脯氨酸（P或Pro），以及

（6）芳香类:色氨酸（W或Trp），酪氨酸（Y或Tyr）和苯丙氨酸（F或Phe）。

非保守性置换是指一种氨基酸与另一类中的一种氨基酸进行交换。保守性置换是指一种氨基酸与同类中的另一种氨基酸进行交换。

优选的氨基酸置换为可减弱免疫优势表位的那些，但也可包括如下的，如：（1）降低对蛋白水解的易感性，（2）降低对氧化的易感性，（3）改变免疫系统刺激活性，和/或（4）赋予或修饰这些类似物的其他理化或功能特性。类似物可包括不同于天然存在的肽链序列的，该序列的多种突变蛋白。例如，在天然存在的或突变蛋白的序列中，可发生单个或多个氨基酸替换（如保守性氨基酸置换）。通常，保守性氨基酸置换不会明显改变母体序列（parentsequence）的结构特征（如替换氨基酸不应有打破在母体或突变蛋白序列中的螺旋，或破坏母体序列中其他类型的特征性二级结构的趋势），除非R基或侧链的大小或构象发生了改变（蛋白质、结构与分子原理（Creighton,ed.,W.H.Freeman and Company，New York（1984）;蛋白质结构简介,Branden & Tooze,eds,Garland Publishing,New York,NY（1991））;以及Thornton etal.,Nature 354:105（1991））。

通常，生物学特性改变的表位突变，其氨基酸序列至少有75%的氨基酸序列与母体分子的氨基酸序列相同或相似，至少80%、85%和90%，通常至少95%相同。在这里，与母体氨基酸序列相同或相似的定义为候选序列中氨基酸残基的比例，所述候选序列在必要时，对齐或填补空隙后，与母体分子残基相同（即相同残基）或相似（即基于共同的侧链特性，来自同一类的氨基酸残基，前述），实现最大的序列比例统一性。

对值得关注的分子的共价修饰包括在发明公开的范围内，例如，对分子进行免疫性减弱，或获得功能等价物，其可携带或不携带除免疫性减弱外的其他增强的、额外的或不同的功能或特征。如果适用的话，这可以通过化学合成或对分子进行酶解或化学裂解制备。通过有机衍生试剂与分子的靶向氨基酸残基反应，可引入该分子的其他类型共价修饰，这种衍生试剂能选择与侧链、N-端残基或C-端残基反应。

同时，多种有机化学材料与方法可用于修饰表位的组分。例如，WO 05/35726教授了多种在生物分子上引入、修饰、改变、替换等取代基的方法。

例如，半胱氨酰残基可与α卤代乙酸酯（及其相应的胺）反应，如氯乙酸或氯乙酰胺，生成羧甲基或脲甲基衍生物。半胱氨酰残基也可通过与溴三氟丙酮（bromotrifluoroacetone）、α-溴-β-（5-咪唑基）丙酸、氯乙酰磷酸盐、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物（3-nitro-2-pyridyl disulfide）、甲基2-吡啶基二硫化物（methyl 2-pyridyl disulfide）、对-氯汞基苯甲酸盐、2-氯汞基-4-硝基苯酚和氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑等反应而衍生化。

在pH 5.5-7.0时，组氨酰残基可通过与焦碳酸二乙酯反应而衍生化。也可使用对溴基溴化苯乙酮，其反应优选在pH 6.0，0.1M的二甲胂酸钠中进行。

赖氨酰和α氨基末端残基可与琥珀酸或其他羧酸酐反应，使残基所带电荷相反。其他用于衍化含α氨基残基的合适试剂包括亚氨酸酯如甲基吡啶亚胺甲酯、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯硼氢（chloroborohydride）、三硝基苯磺酸、O-甲基异脲和2,4-戊二酮，以及可与乙醛酸被转氨酶催化的氨基酸。

精氨酰残基的修饰可通过与一种或几种常规试剂的反应进行，如苯甲酰甲醛、2,3-丁二酮、1,2-环己二酮和茚三酮。精氨酸残基的衍生化通常需要碱性反应条件。此外，这些试剂也可与赖氨酸以及精氨酸的ε氨基反应。

酪氨酰残基的特定修饰可通过芳香族重氮化合物或四硝基甲烷进行。例如，1-乙酰咪唑和四硝基甲烷可分别用于生成O-乙酰酪氨酰类（O-acetyl tyrosyl species）和3-硝基衍生物。

羧基侧链基团（天冬氨酰基或谷氨酰基）可通过与碳化二亚胺（R-N=C=C-R'）的反应进行修饰，其中R和R'可以是不同的烷基，如1-环己基-3-（2-吗啉基-4-乙基）碳化二亚胺或1-乙基-3-（4-氮鎓-4,4-二甲基戊基）碳化二亚胺（1-ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)carbodiimide）。此外，通过与铵离子的反应，可将天冬氨酰和谷氨酰残基转化为天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰。

通常将谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基在中性或碱性条件下去酰胺化，分别生成相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。这些残基的去酰胺形式在该发明公开范围内。

其他修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟化，丝胺酰或苏氨酰残基上羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸α氨基的甲基化（Creighton,蛋白质：结构与分子特性,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,pp.79-86（1983）），以及N末端氨基的乙酰化和任意C末端羧基的酰胺化。

另一类共价修饰涉及到通过化学或酶促反应，将糖苷、糖、糖类等偶联到值得关注的分子上。根据所使用的偶联方式，可将糖连接于：（a）精氨酸和组氨酸；（b）游离羧基；（c）游离巯基，如半胱氨酸的巯基；（d）游离羟基，如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的羟基；（e）芳香族残基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的残基；或者（f）谷氨酰胺的酰胺基。这些方法参见WO 87/05330和Aplin & Wriston,CRC Crit.Rev.Biochem.,pp.259-306（1981）。还可使用酶促方法添加糖基，如葡萄糖基转移酶、唾液酸转移酶、半乳糖基转移酶等。

通过化学或酶促方法，可以实现将存在于值得关注的分子上的糖基部分去除。举例来说，化学去糖基化需要将该分子暴露于三氟甲磺酸或其等效化合物中，导致除连接糖（linkingsugar）（N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺）外的大部分或全部糖基解离，而保持分子其他部分的完整性。化学去糖基化参见，如Hakimuddin et al.,Arch.Biochem.Biophys.259:52（1987）和Edge etal.,Anal.Biochem.118:131（1981）。通过各种任何的内切糖苷酶和外切糖苷酶，可以实现用酶促法将分子上的糖基部分切割，参见Thotakura etal.,Meth.Enzymol.138:350（1987）。从而，可以使用甘露糖苷酶、岩藻糖苷酶、氨基葡萄糖苷酶、半乳糖甘酶等。

利用常规方法（例如，利用能够特异性结合相关基因的寡核苷酸探针，Innis等，参见PCR手册：方法与应用指导，Academic（1990）和Sanger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.74:5463（1977）），可轻松分离编码流感病毒HA、NA等的RNA或DNA，并测序。分离后，可将DNA置于表达载体中，然后将载体置入宿主细胞，如大肠杆菌细胞、NS0细胞、COS细胞、中国仓鼠卵巢（CHO）细胞或骨髓瘤细胞，在重组的宿主细胞中获得合成的值得关注的蛋白质。RNA或DNA也可进行修饰，例如，通过碱基替换以优化特定宿主细胞内的密码子使用，或者通过共价连接异源多肽的编码序列。

因此，如本文所述，编码和表达一个或多个免疫性减弱表位的值得关注的多核苷酸可参照分子生物学和本领域所知的重组材料与方法进行表达，以获得值得关注的重组多肽的来源。

在另一个实施例中，编码一个或多个免疫性减弱表位的值得关注的多核苷酸可替换流感病毒基因组中的同源野生型序列，得到表达一个或多个免疫性减弱表位的病毒、病毒样结构或亚单位。因而，可利用标准技术对该病毒株进行增殖，如目前使用的基于鸡蛋的技术，产生免疫原，其可作为疫苗单独使用，或与其他活性制剂，如未修饰的病毒或多个病毒（如模拟目前的二价与三价疫苗）联合使用。

流感病毒、抗原、组分、亚单位、HA、NA等的“功能性片段、部分、变体、衍生物或类似物”等及其组合的这些词组术语及组合与某个元素相关，该元素的生物学活性在定性上与野生型、母体元素或原始非免疫性减弱的抗原一样，这些是变体、衍生物、类似物等的来源。例如，HA的功能性部分、片段或类似物可与天然HA一样刺激免疫应答，尽管其应答可能针对的是HA上的不同表位。

因此，包含在该发明公开范围内的是病毒的功能性等效物，或值得关注的部分或衍生物。术语“功能性等效物”包括病毒和能够刺激针对流感病毒的免疫应答的部分。

因此，一旦确定了候选的免疫性减弱多肽后，本领域技术人员就能很好地对该氨基酸序列进行修饰，同时使其保持免疫性减弱的目的，以及暴露原先沉默的表位。因此，例如，可将编码核酸进行修饰，使其在不对这两个目的产生不利影响的条件下编码氨基酸插入、删除或替换。在另一个实施例中，只要不对这两个目的产生不利影响，可参照本领域所知操作材料与方法将氨基酸进行修饰、衍生化、替换等。如本文所述，认为对原始免疫性减弱多肽的这些改变与修饰是功能等效的。免疫性减弱的程度可按照本文所述或本领域所知的在体外或动物试验中进行定量。类似地，对原先沉默表位产生应答的程度可按照本文所述或本领域所知的在体外或动物试验中进行定量。当对原始免疫性减弱序列进行修饰时，本文所述两个目的中的一个在程度上可以接受的下降程度是一种设计选择。一般来说，反应性不超过25%的降低是可以容忍的，因为正常情况下，要求是对免疫优势表位的反应尽可能低。因此，如果对原始免疫性减弱序列的修饰显示，与在原始免疫性减弱表位中无反应性相比，例如通过使用免疫优势表位抗体的ELISA确定，例如恢复了25%的反应性，则认为对于功能性等效物来说其反应性降低是可以接受的。对免疫性减弱抗原的功能性等效物，可以认为降低不超过20%、15%、10%、5%或者不降低是可以接受的。类似地，对于现在针对原先沉默表位的反应性，降低不超过25%是可以耐受的，因为正常情况下，要求是对原先沉默表位的反应尽可能高。因此，如果对原始免疫性减弱序列的修饰显示，与在原始免疫性减弱表位中最大反应性相比，例如通过使用针对原先沉默表位抗体的ELISA确定，例如丧失了25%的反应性，则认为对于功能性等效物来说其反应性降低是可以接受的。对于原先表达沉默表位的抗原能性等效物，可以认为降低不超过20%、15%、10%、5%或者不降低是可以接受的。

流感病毒值得关注的部分，如携带HA、NA、M2及其组合的包膜或非包膜制剂，以及任何其他流感病毒抗原制剂，均可通过本领域所知的方法获取。当去除或减弱一个或多个非保护性的免疫优势表位（IDNPEs，其包括刺激产生病毒株特异性的、但范围较窄的免疫力的表位）时，例如，通过分子内修饰（如删除、电荷改变、添加一个或多个N-联序列子等）并作为抗原注入未免疫动物，对IDNPE的改变可在B细胞和/或T细胞水平诱导新层次的针对亚优势或原先沉默表位的免疫应答（Garrity et al.,J.Immunol.（1997）159（1）:279-89）。这里所描述的技术被称为“免疫再聚焦”。

一旦进行了改变，不管其改变是否，例如降低了目前已修饰的免疫优势表位的反应性，减弱的表位、抗原等参照本文或本领域所知的进行确定。通过确定减弱抗原和与优势表位反应的抗毒血清的反应性，例如利用ELISA或Western blot，可对其进行体外试验。显示反应性降低的候选者与明确的抗毒血清被选择用于体内试验，以确定这些减弱抗原是否有免疫原性，以及宿主是否对其产生免疫应答。因此，例如，如本领域所知将小鼠进行免疫以减弱抗原，收获血清并立即在体外检测其反应性。然后用野生型病毒测试抗毒血清，确定抗体是否仍可识别野生型表位或野生型抗原。这可以通过例如ELISA或Western blot进行。后者的信息众多，可显示是否结合了特定的免疫优势表位，以及抗毒血清是否仍可与流感病毒反应，携带与小鼠抗毒血清反应表位分子的大小，以及有可能明确其身份。

免疫再聚焦疫苗候选设计成准确折叠，并采用类似天然的构象表位，用于刺激合适的免疫应答。抗原测试前，通常要先评估纯化HA抗原结合到构象依赖性抗体和细胞表面的病毒受体的能力。评估该相互作用的方法是本领域所熟知的，并被广泛采用。

将免疫再聚焦抗原发展为商业化疫苗前，通常需要进行非临床试验。一种方法是用免疫再聚焦候选疫苗注射或免疫动物，如小鼠、豚鼠、兔、鸡、大鼠、雪貂等。免疫接种后，对这板免疫血清的多种活性进行评估，包括对纯化抗原或病毒的反应性（结合活性），血凝抑制（病毒-受体作用的抑制，HI）和病毒中和（培养细胞感染的抑制和/或培养细胞内复制的抑制，VN）。评估血清反应性的方法是本领域所熟知的。

将以免疫再聚焦抗原接种动物的血清与以未突变抗原接种动物血清的异源性HI和VN活性进行比较，用于评估保护性免疫的展宽（broadening）和改善。因此，用抗原性研究中生成的多种免疫血清对流感病毒H1N1或其他血清型的异源性病毒株的HI和VN进行检测。相对于未修饰抗原接种产生的血清，测试血清中HI或VN滴度上升表明用于产生上述测试血清的抗原可刺激免疫力的拓宽和提高。

为进一步举例说明对值得关注的候选疫苗选择的分析范例，图1中的表1提供了假设的数据集。检测来自于A/California/04/2009病毒株的免疫再聚焦HA抗原（Mut HI，Mut H2，Mut H3和Mut H4）并检测其对同源性和异源性病毒的抗病毒活性。异源性病毒（病毒株2-4）按来自亲代California/04/2009（Cal/04/09）病毒株的抗原趋异（antigenic divergence）增加d顺序进行描述。所有免疫原刺激的HI和VN滴度均等效于由未修饰抗原（WT-HA）诱导的滴度。通过两者的检测确定，在统计学上，来自Mut-Hl的血清所包含的对病毒株2-4的抗病毒活性水平高于WT-HA的滴度。来源于Mut-H2和Mut-H3的血清对病毒株2有2倍的HI和VN活性滴度，但是如果血清以2倍梯度稀释进行稀释，则可能无统计学意义。不过，来源于Mut-H2和Mut-H3的血清，其针对更趋异的病毒株3和4的HI和VN滴度明显更高。表1中对这些数据的分析表明，Mut-Hl或Mut-H2可刺激最高水平的抗病毒活性，正常情况下，在流感临床前试验中，其作为相关性而测量。

为进一步评估免疫再聚焦候选抗原的保护性免疫，可进行更多的动物模型研究。在一个这种试验例子中，雪貂组分别用未修饰的抗原或首选的免疫再聚焦候选进行免疫（如列于表1的Mut-H2）。免疫后，将两组雪貂分成亚组，并且每一亚组用流感的同源性或异源性病毒株进行接种（激发），如表1所示。在激发后的两周内，收集发病、发病机制和病毒复制的测量值。对测量值的分析显示，相比以WT-HA免疫的组，以Mut-H2免疫和以异源性病毒株激发的雪貂，其发病和病毒复制下降，表明Mut-H2可刺激产生更广的免疫力，可作为一种改进的候选疫苗。

与已知的结合到母体免疫优势抗原的抗毒血清很少或不再与候选免疫性减弱抗原反应，但在宿主内仍保留免疫原性的候选免疫性减弱抗原，被选择作为用于进一步测试的候选疫苗。候选疫苗在针对免疫再聚焦表位用于免疫识别的同时，也可刺激强化对母体免疫优势抗原的反应性。例如，在标准化的基于抗病毒检测中，可用多种流感病毒株测试小鼠抗毒血清对其的反应性，确定该抗体反应的通用性，即减弱抗原上新识别的表位是否通用于更大范围的流感病毒株，以及该抗体是否有广谱的抗病毒活性。

因此，重组HA（rHA）亚单位蛋白疫苗足以防护流感病毒同源性病毒株的激发。rHA也可用作老年人的免疫原。如本文所述，第二代免疫再聚焦HA亚单位疫苗也可诱导针对异源性病毒株的保护性免疫（Treanor et al.,J.Infectious Diseases 2006;193:1223-8）。因此，例如，一种值得关注的候选疫苗不仅可对同源抗原产生保护，如H1，也可对HI的不同系或分离株，如H2，H3，H4等产生保护。

在一个实施例中，流感病毒的HA和NA被选择作为宿主免疫应答HA和NA上的其他非优势位点的再聚焦靶位，作为新的免疫保护性应答的靶位，优选是大范围和广谱的应答中的一个，对各种病毒株等均有活性。

例如，HA有5个免疫优势位点或表位，称为A-E。位点A包括HA型病毒株140-146位的氨基酸，序列为KRRSNKS（SEQ ID NO:l）。与香港病毒株相比，怀俄明病毒株（Wyomingstrain）在该位点已有3个糖基化位点与之相关。因此，一种方法是去除位点A所确定的环状结构，例如，将KRRSNKS（SEQ ID NO:1）序列替换为GG。

位点B包括HA的189-197位氨基酸，序列为SDQISLYAQ（SEQ ID NO:2）。其形成螺旋状，与158-161位序列为KYKY（SEQ ID NO:3）的氨基酸相互作用。B位点可进行许多可能的变化，如用NAS替代QIS；用NIT替代SLY；在158位用NST替代KYK；以及在159位用NAS替代YKY，在这4个位点的所有这些变化均引入了一个N-糖基化。

位点C包括276-278位的氨基酸，序列为KCN。NCT可替代KCN。

位点D包括201-220位氨基酸的一个大的反向平行环。整个环可被删除。而且，糖基化位点NIT可替代201-203位的RIT。

位点E包括79-82位的氨基酸，序列为FQNK（SEQ ID NO:4）。糖基化位点NET可替代QNK。

上述变化可进行联合，例如，B位点NST和NTS的变化均可与所建议的C和/或E位点的示范性变化进行联合。

如本文所述，并如本领域所知，上述免疫优势位点的变化可通过克隆、定点诱变、基因合成扩增等获得。

因此，上述A位点变化可由定点诱变获得，使用的引物为：A顶部：GGAACAAGCTCTGCTTGCggcggtTTCTTTAGTAGATTGAATTGG（SEQ ID NO:5）以及A底部：CCAATTCAATCTACTAAAGAAaccgccGCAAGCAGAGCTTGTTCC（SEQ ID NO:6），用来获取包含上述删除的序列GTSSACGGFFSRLN（SEQ ID NO:7）和在删除位点插入GG二肽。

B位点的变化可利用以下引物获得，B1顶部：CAAATCAGCCTATATGCTaatGCATCAGGAAGAATCAC（SEQ ID NO:8）以及B1底部：GTGATTCTTCCTGATGCattAGCATATAGGCTGATTTG（SEQ ID NO:9），产生的序列为QISLYANASGRI（SEQ ID N0:10）；引物B2顶部：CACCACCCGGTTACGGACaatGACacAATCAGCCTATATGCTCAAGC（SEQ ID NO:11）以及B2底部：GCTTGAGCATATAGGCTGATTgtGTCattGTCCGTAACCGGGTGGTG（SEQ IDNO:12），产生的序列为HHPVTDNDTISLYAQ（SEQ ID NO:13）；引物B3顶部：CGGACAGTGACCAAATCAatCTAtcTGCTCAAGCATCAGGAAG（SEQ ID NO:14）以及B3底部：CTTCCTGATGCTTGAGCAgaTAGatTGATTTGGTCACTGTCCG（SEQ ID N0:15），产生的序列为DSDQINLSAQASG（SEQ ID NO:16）；引物B4顶部：GAATTGGTTGACCCACTTAAAtTACAcATACCCAGCATTGAACGTGAC（SEQ ID NO:17）以及B4底部：GTCACGTTCAATGCTGGGTATgTGTAaTTTAAGTGGGTCAACCAATTC（SEQ ID NO:18），产生的序列为NWLTHLNYTYPALNV（SEQ ID NO:19）；引物B5顶部：GAATTGGTTGACCCACTTAAAAaACAAAacCCCAGCATTGAACGTGACTATG（SEQ IDN0:20）以及B5底部：CATAGTCACGTTCAATGCTGGGgtTTTGTtTTTTAAGTGGGTCAACCAATTC（SEQ IDNO:21），产生的序列为NWLTHLKNKTPALNVTM（SEQ ID NO:22）。

C位点的变化可利用以下引物获得，C1顶部：GATCAGATGCACCCATTGGCAAtTGCAgTTCTGAATGCATCACTCC（SEQ ID NO:23）以及C1底部：GGAGTGATGCATTCAGAAcTGCAaTTGCCAATGGGTGCATCTGATC（SEQ IDNO:24），产生的序列为SDAPIGNCSSECIT（SEQ ID NO:25）。

D位点的变化可利用以下引物获得，D1顶部：CTATATGCTCAAGCATCAGGAAatATCACAGTCTCTACCAAAAG（SEQ ID NO:26）以及D1底部：CTTTTGGTAGAGACTGTGATatTTCCTGATGCTTGAGCATATAG（SEQ IDNO:27），产生的序列为LYAQASGNITVSTKRS（SEQ ID NO:28）。

E位点的变化可利用以下引物获得，E1顶部：GATGGCTTCCAAAATAAGAcATGGGACCTTTTTGTTGAAC（SEQ ID NO:29）以及E1底部：GTTCAACAAAAAGGTCCCATgTCTTATTTTGGAAGCCATC（SEQ ID N0:30），产生的序列为DGFQNKTWDLFVE（SEQ ID NO:31）。

HAS 1:CAGTCCTCATCAGATCCTTG（SEQ ID NO:32）和HAS2:GGTAAGGGATATCTCCAGCAG（SEQ ID NO:33）引物可用于测序，HAS3:cgcgattgcgccaaatatgcc（SEQ ID NO:34）作为阴性对照。

多个抗原性位点有丰富的带电荷氨基酸残基。另一种方法是用丙氨酸残基替代那些带电荷的残基。这种变化的例子包括A位点用AGA替代KRR；B位点用AYKY（SEQ ID NO:35）替代KYKY（SEQ ID NO:3）以及用SAQI（SEQ ID NO:36）替代SDQI；C位点用ACN替代KCN；D位点用AIT替代RIT。

此外，在B位点用来评估疏水性酪氨酸残基功能的突变可由SLT替换SLY获得。

除B细胞表位外，T细胞表位也可进行免疫性减弱。177-199位残基区域的主要CD₄表位包括已靶定B位点外的一个MHC II类结合表位。使T细胞应答减弱的LYIWGVHHP（SEQID NO:37）残基突变包括VYIW（SEQ ID NO:38）或VTIW（SEQ ID NO:39）替代LYIW；以及IHAG（SEQ ID N0:40）替代VHHP。

在另一个实施例中，包含一个或多个免疫性减弱表位的值得关注的重组多肽，或者包含相同表位的载体，如病毒样颗粒、病毒的亚单位组分，可用作获得特异性抗体或抗毒血清的免疫原，该抗体或抗毒血清可识别表位，这些表位因免疫优势表位的免疫性减弱而变得不正常，但有免疫原性。利用本领域已知的材料与方法可制备该抗体，因此其可为多克隆性的，通过免疫动物并收集血清获得，或者从暴露于相同病毒的人体中获得，类似于目前使用的免疫球蛋白，或可为单克隆性的，按照已知的材料与方法获得。获取人源性或人类抗体的操作方法，以及改造上述抗体以尽可能减小免疫原性是有益的，如添加糖基（如PEG分子和其他取代基）以掩盖该流感抗体上非正常免疫优势表位的免疫原位点，如本领域所知，参照例如美国专利US 5,821,337和WO 09/32661。可作为被动疫苗（passive vaccine）收集和管理该抗体。

测试时，例如将值得关注的免疫原注入非人类哺乳动物，以获取临床前数据。典型的非人类哺乳动物包括非人类灵长类、犬类、猫类、啮齿类和其他哺乳动物。这些哺乳动物可以是已经建立的动物模型，用于以配方治疗某一疾病的的动物模型，或者用于研究值得关注的免疫原的毒性。这些实施例中，均可在哺乳动物中进行剂量递增研究。

为获得如美国食品药品管理局或欧洲药品局等监管机构对人类制品的批准，生物制药必须符合有关监管机构规定的纯度、安全性和效能标准。为生产符合这些标准的疫苗，可将重组微生物保存于培养介质中，如认证的无传染性海绵状脑病（以下称为“TSE”）的介质。

例如，包含疫苗编码序列的质粒可携带非抗生素的选择标记，因为并不总能理想地利用抗生素抗性标记来选择和维持细菌内的质粒，该细菌被设计用于人体，尽管优选的实施例与重组亚单位疫苗的使用有关。因而，在一个实施例中，本发明公开提供了一个选择策略，其中例如，利用一种分解酶作为选择标记，使细菌能够在含有上述分解代谢酶底物作为碳源的培养基上生长。这种分解酶的例子包括但不限于编码乳糖摄取和β-半乳糖甘酶的lacYZ（GenBank Nos.J01636,J01637,K01483or K01793）。其他在确定成分的培养基中提供代谢优势的选择标记包括但不限于利用半乳糖的galTK（GenBank No.X02306），利用蔗糖的sacPA（GenBankNo.J03006），利用海藻糖的trePAR（GenBankNo.Z54245），利用木糖的xy1AB（GenBank No.CAB 13644 and AAB41094）等。或者，其选择还可涉及反义mRNA的使用，以抑制毒性等位基因，如sacB等位基因（GenBank No.NP 391325）。

用于配制新型疫苗和上述制剂的具体方法对于本发明公开并不是关键性的，可以从下面选择或可以包括：一种生理缓冲液（Feigner et al.,U.S.Pat.No.5,589,466（1996））；磷酸铝或羟基磷酸铝（如Ulmer et al.,Vaccine,18:18（2000））；单磷酰脂A（也称为MPL或MPLA；Schneerson et al.,J.Immunol.,147:2136-2140（1991）；如Sasaki et al.,Inf.Immunol.,65:3520-3528（1997）；以及Lodmell et al.,Vaccine,18:1059-1066（2000））；QS-21皂苷（如Sasaki et al.,J.Virol.,72:4931（1998））；地塞米松（如Malone et al.,J.Biol.Chem.269:29903（1994））；CpG DNA序列（Davis et al.,J.Immunol.,15:870（1998））；干扰素-α（Mohanty etal.,J.Chemother.14（2）:194-197,（2002））；脂多糖（LPS）拮抗剂（Hone et al.,J.HumanVirol.,1:251-256（1998））等。使用商业化的佐剂也是一个设计选择，如本领域所知。

由于值得关注的免疫再聚焦技术不依赖于佐剂和免疫调节剂，通过本文所述方法产生的抗原或可与其反应的抗体与下列佐剂是相容的，如铝胶和Novartis 与GlaxoSmithKline等公司开发的新型合成物（如MF59和AS03），以及调节剂和增强剂，如CpG和细胞因子。

此处的制剂还可能包含超过一种的活性化合物，其为处理特定的适应症（indication）所必需，优选是那些具有互补活性而不对彼此造成不利影响的化合物。例如，理想的是还可进一步提供佐剂。这些分子可适当地以达到预期目的的数量联合呈现。在给予抗原之前或之后，可依次施用佐剂。

值得关注的免疫原可与第二组分一起使用，如治疗部分与同一分子连接或混合，作为治疗剂以缀合物（conjugate）施用、作为治疗剂两组分分开一起施用、作为治疗剂在施用前混合等等，例如见Levine等主编的《新一代疫苗》，2nd Marcel Dekker,Inc.,New York,NY，1997。其他治疗性制剂可为用于实现预期目的的任何药物、疫苗等。因此，其治疗性制剂可为生物小分子等。值得关注的免疫原可与第二流感免疫原成分、第三种第二流感免疫原成分等同时施用或依次施用，如可减弱其免疫性或不减弱。因此，值得关注的免疫性减弱抗原可与存在的疫苗进行联合，形成二价疫苗、三价疫苗，等等，但是当存在的疫苗是在鸡蛋中生产时，应避免使用这种方法。或者，值得关注的免疫性减弱抗原可与多种其他抗原、亚单位、组分、病毒样颗粒等进行联合，形成多价疫苗。

术语“小分子”及类似术语包括但不限于肽、模拟肽（peptidomimetics）、氨基酸、氨基酸类似物、多核苷酸、多核苷酸类似物、碳水化合物、脂质、核苷酸、核苷类似物、分子量低于10,000g/mol的有机或无机化合物（即包括杂原子有机化合物（heterorganic）和/或金属有机化合物）、分子量低于5,000g/mol的有机或无机化合物、分子量低于1,000g/mol的有机或无机化合物、分子量低于500g/mol的有机或无机化合物、盐类、酯类及其组合以及这些化合物在药物学上可接受的其他形式，其可以刺激免疫应答或有免疫原性，或具有所期望的药理活性。

因此，该发明公开中的免疫原可单独施用，或联合其他类型的治疗施用，包括第二次免疫或治疗该疾病的处理。其第二组分可以是一种免疫刺激剂。

此外，本发明公开中的免疫原可与多种效应分子进行连接，效应分子如异源多肽、药物等，见WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；U.S.Pat.No.5,314,995；以及EPO 396,387。免疫原也可连接到一治疗部分，如抗生素（一种治疗制剂）或佐剂。

该发明公开中的治疗性化合物至少可减轻一种流感相关症状。该发明公开中的产品可以药物学上可接受的成分来提供，如本工艺或本文所述。术语“生理上可接受的”、“药物学上可接受的”等的意思是由联邦或州政府监管机构批准用于人体，或者列于美国药典或其他公认的药典中。

可以任何可接受的方式，将值得关注的产品施用到哺乳动物。导入的方式包括但不限于胃肠外、皮下、经皮、腹膜内、肺内、鼻内、硬膜外、吸入和口服路径，如果需要免疫抑制治疗，也可病灶内给药。胃肠外输注包括肌内、皮内、静脉内、动脉内或腹膜内给药。其产品或成分可通过任意方便的路径给药，如输注或静脉团注（bolus injection），可通过上皮或皮肤黏膜内层（如口腔黏膜、直肠与小肠黏膜等）吸收，还可与其他生物活性制剂共同给药。可以全身给药，也可局部给药。此外，通过任意合适的路径向中枢神经系统导入本发明公开中的治疗性产品或成分也是可取的，路径包括脑室内和鞘内注射；例如脑室内注射可通过连接于贮存器的脑室内导管协助，如Ommaya贮存器。此外，该产品还可适当地通过脉冲输注进行给药，特别是值得关注的产品的剂量下降时。优选的给药方法是注射，优选是静脉内或皮下注射，其部分取决于给药是短暂的还是长期的。

在当前的发明公开中，已知其他多种输送系统可用于产品的给药，包括封装于脂质体、微粒或微胶囊内（见Langer,Science 249:1527（1990）；Liposomes in the Therapy of InfectiousDisease and Cancer,Lopez-Berestein et al.,（1989））。

通过凝聚技术（coascervation techniques）或界面聚合制备微胶囊，如羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚甲基丙烯酸酯微胶囊，将活性成分包裹其内，分别用于胶状药物输送系统（如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊）或粗乳液。这些技术发表于Remington'sPharmaceutical Sciences,16th edition,A.Osal,Ed.（1980）。

也可采用肺部给药，如通过使用吸入器或雾化器，并与雾化剂进行配制。值得关注的成分也可以干性粉末状成分的形式给入患者的肺部，见美国专利US 6,514,496。

对需要治疗的区域，局部施用本发明公开中的治疗性产品或成分是可取的。这可通过例如，局部注入、局部施用、利用注射，利用导管、栓剂或植入物实现，但并不局限于此，上述植入物可为有孔、无孔或凝胶状材料（包括水凝胶或薄膜，如硅橡胶薄膜或纤维）。优选地，当施用本发明公开中的产品时，需要特别关注哪些材料是蛋白质吸收的，哪些是无法吸收的。

在又一实施例中，该产品可通过控制释放系统输送。一个实施例中，可使用泵（见Langer，Science 249:1527（1990）；Sefton,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201（1987）；Buchwald et al.,Surgery 88:507（1980）；以及Saudek et al.,NEJM 321:574（1989））。在另一实施例中，可使用聚合材料（见Medical Applications of Controlled Release,Langer et al.,eds.,CRC Press（1974）；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance,Smolen et al.,eds.,Wiley（1984）；Ranger et al.,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61（1983）；也可见于Levy et al.,Science 228:190（1985）；During et al.,Ann.Neurol.25:351（1989）；以及Howard et al.,J.Neurosurg.71:105（1989））。在又一实施例中，控制释放系统可置于治疗目标附近。

缓释制剂是为与值得关注的产品一起使用而准备的。缓释制剂的合适实例包括含有免疫原的固态疏水性聚合物的半透性基质，其中基质为成形的制品，如薄膜或基质。这种缓释制剂基质的合适实例包括聚酯、水凝胶（如聚（2－羟乙基丙烯酸甲酯）、聚乙烯醇）、聚乳酸（美国专利US 3,773,919）、L-谷氨酸与乙基-L-谷氨酸（ethyl-L-glutamate）共聚物、不可降解性乙烯-乙酸乙烯酯、降解性乳酸-乙醇酸共聚物（如乳酸-乙醇酸共聚物组成的可注射微球）和聚-D-（-）-3-羟基丁酸。虽然乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸等聚合物可使分子的释放时间超过100天，但某些水凝胶可在较短的时间内释放出细胞、蛋白质和产品。根据所涉及的机制，可为稳定性设计出合理的策略。

成分（compositions）的形式可以是溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂、长效药剂（depots）等。该成分可与传统的粘合剂（binder）与载体如甘油三酯共同配制成栓剂。口服制剂可包括标准载体，如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的载体的实例如Martin的Remington's Pharmaceutical Sciences所述。这些成分含有有效量的免疫原，优选的是纯的形式与适当量的载体组合，以为患者提供适当的给药形式。如本领域所知，该制剂将按照合适的给药模式而构造。

可通过将具有理想纯度的产品与任选药物学上可接受的的载体、稀释剂、赋形剂或稳定剂进行混合，制备该产品的治疗性制剂，以作为冻干制剂和水溶液用于储存。本工艺通常采用缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂（isotonifiers）、非离子型洗涤剂、抗氧化剂及其他各种添加剂，见Osal主编的《Remington制药科学》16版（1980）。这些添加剂使用的剂量和浓度通常对接受者是无毒的，因此赋形剂、稀释剂、载体等的是药物学上可接受的，或被普遍认为是安全的。

得到或制造的免疫再聚焦多肽（其包括抗原、抗原一部分、表位、决定基等，可以以亚单位进行生产，基本上不含污染蛋白（其包括其他流感蛋白，联合其他病毒或非病毒多肽）；作为值得关注的IR多肽，其可在重组病毒中、病毒样颗粒中，或者联合病毒或细胞来源的一种或多种蛋白质表达或制造；作为IR多肽，可作为一孤立分子表达或制造，然后与病毒或细胞来源的一种或多种蛋白质联合；等等，或者其抗体）基本上是纯化的形式。“孤立的”或“纯化的”免疫原或疫苗基本上没有来自培养基的污染蛋白，其培养基为免疫原或疫苗获得的来源，或者基本上在培养基中没有化学前体和其他化学物质，其包含化学合成的组分。术语“基本上无亚细胞物质”包括细胞制剂，其中细胞被破坏，形成可从细胞的亚细胞组分中分离的组分，包括死细胞及细胞部分，如细胞膜、形骸细胞等，其内可分离免疫原或疫苗，或进行重组生产。因此，基本上无亚细胞物质的免疫原或疫苗包括亚细胞污染物或任意其他不同于值得关注的产品的要素（element）低于30%，25%，20%，15%，10%，5%，2.5%或1%（干重）的免疫原或疫苗。

本文中，在含有免疫原或疫苗的液体制剂的背景下使用的术语“稳定性”和“稳定”是指制剂中的免疫原或疫苗在给定的生产、制备、运输和储存条件下，如1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更长时间对热量和化学聚集、降解或碎裂的抵抗力。该发明公开中，“稳定”的制剂在给定的生产、制备、运输和储存条件下，保持的生物活性等于或大于80%，85%，90%，95%，98%，99%或99.5%。上述免疫原或疫苗制剂的稳定性可通过本领域技术人员所知的方法对聚集度、降解度或碎裂度进行评估，包括物理观察对比参照物，如通过显微镜、颗粒大小与计数测定等，但并不局限于此。

术语“载体”是指与治疗药物共同施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或运载剂。这种生理学载体可为无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药用成分通过静脉内给药时，水是一种合适的载体。盐溶液、葡萄糖溶液和甘油溶液也可用作液态载体，特别是用于注射溶液。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、乙醇等。如果有需要，其成分也可包含少量润湿剂或乳化剂，或者pH缓冲剂。载体可包括一种盐和/或缓冲剂。

缓冲剂有助于维持pH在接近生理条件的范围内。缓冲最佳的浓度范围大约为2mM-50mM。本发明公开中使用的合适缓冲剂包括有机酸和无机酸及其盐，如柠檬酸盐缓冲液（如柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等）、琥珀酸盐缓冲液（如琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等）、酒石酸盐缓冲液（如酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等）、延胡索酸盐缓冲液（如延胡索酸-延胡索酸单钠混合物、延胡索酸-延胡索酸二钠混合物、延胡索酸单钠-延胡索酸二钠混合物等）、葡萄糖酸盐缓冲液（如葡萄糖酸-葡萄糖酸钠混合物、葡萄糖酸-氢氧化钠混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸钾混合物等）、草酸盐缓冲液（如草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等）、乳酸盐缓冲液（如乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等）以及乙酸盐缓冲液（如乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等）。也可使用磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液、三甲胺盐缓冲液如Tris、HEPES和其他已知缓冲液。

添加防腐剂可延缓微生物生长，其添加量的范围为0.2%-1%（w/v）。本发明公开中使用的合适防腐剂包括苯酚、苄醇、间甲酚、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苯扎卤化铵（benzyaconium halides）（如氯化物、溴化物和碘化物）、氯化六烃季铵、对羟基苯甲酸烷酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。

等渗剂可确保本发明公开中的液体成分的生理等渗性（physiological isotonicity），其包括多元糖醇，特别是三元或更多元的糖醇，如甘油、赤藓醇、阿糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。多元醇可以占大约0.1%-25%重量存在，优选考虑大约1%-5%其他成分的相对量。

稳定剂是指一大类赋形剂，其功能范围可从填充剂至溶解治疗剂，或者帮助防止变性或附着于容器壁的添加剂。典型的稳定剂可为多元糖醇；氨基酸，如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖类或糖醇，如乳糖、海藻糖、水苏糖、阿拉伯糖醇、赤藓醇、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、内消旋肌醇（myoinisitol），半乳糖醇、甘油及其类似物，包括环多醇如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽（即<10个残基）；蛋白质，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯基吡咯烷酮、糖类、单糖，如木糖、甘露糖、果糖或葡萄糖；二糖，如乳糖、麦芽糖和蔗糖；三糖，如棉子糖；多糖，如葡聚糖等。稳定剂存在的范围为每部分免疫原0.1-10,000w/w。

其他多种赋形剂包括填充剂（如淀粉）、螯合剂（如EDTA）、抗氧化剂（如抗坏血酸、甲硫氨酸或维生素E）和助溶剂。

如本文所用的，术语“表面活性剂”是指具有两亲结构的有机物质，即由相反溶解性趋势（opposing solubilitytendencies）的基团组成，通常为油溶性碳氢链和水溶性离子基团。根据表面活性基团的电荷，可将表面活性剂分为阴离子型、阳离子型和非离子型表面活性剂。表面活性剂通常被作为多种药用成分和生物材料制剂的润湿剂、乳化剂、增溶剂和分散剂。

添加非离子型表面活性剂或洗涤剂（亦被称为“润湿剂”）有助于治疗药物的溶解，以及对治疗性蛋白质的搅拌诱导性聚集（agitation-induced aggregation）产生保护，也可使该制剂暴露于剪切面压力的同时，不引起蛋白质的变性。合适的非离子型表面活性剂包括聚山梨醇酯（20、80等）、泊咯沙姆（polyoxamers）（184、188等）、

多元醇和聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚（

等）。非离子型表面活性剂的存在范围大约为0.05mg/ml-1.0mg/ml，优选为0.07mg/ml-0.2mg/ml。

如本文所用的，术语“无机盐”是指不含碳的任意化合物，其来自于酸或酸部分或全部氢原子被金属或类似金属作用的基团取代，在药用成分和生物材料制剂中通常作为渗透压调节化合物。最常用的无机盐为NaCl、KCl、NaH₂PO₄等。

本发明公开可提供pH范围大约为5.0-7.0、5.5-6.5、5.8-6.2、6.0、6.0-7.5或6.5-7.0的免疫原或疫苗液态制剂。

本发明公开涵盖的制剂，如液态制剂，在商业冰箱和医生办公室或实验室内冰柜中，在-20℃至5℃的温度下较为稳定。为了储存的目的，通过显微镜分析评估上述稳定性，达到60天、120天、180天、1年、2年或更长。通过颗粒分析，本发明公开中的液态制剂也表现出稳定性，在室温下至少为几个小时，如使用前1个小时、2个小时或大约3个小时。

稀释剂的实例包括磷酸盐缓冲盐、在膀胱（bladder）内缓冲胃酸的缓冲液，如含蔗糖的柠檬酸盐缓冲液（pH 7.4）、单独的碳酸氢盐缓冲液（pH 7.4）或者含抗坏血酸、乳糖或糖精的碳酸氢盐缓冲液（pH 7.4）。载体的实例包括蛋白质，如脱脂牛奶中的蛋白质，糖，如蔗糖，或者聚乙烯基吡咯烷酮。这些载体使用的浓度通常为0.1-90%（w/v），但优选范围为1-10%（w/v）。

用于体内给药的制剂必须是无菌的。这可通过无菌过滤膜的过滤实现。例如，本发明公开中的亚细胞制剂可通过过滤灭菌。

如果是口服制品，值得关注的制剂可包括一种或多种食用香料、增香剂、香味剂、着色剂、表面活性剂、粘合剂等，为摄入提供一种更可口的形式。

免疫原或疫苗成分的配方、分配剂量和给药形式应与良好的医学实践一致。考虑的因素包括疾病严重度、正在治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床情况、疾病原因、药物输送部位、给药方法、给药清单（the scheduling of administration）以及其他医生已知的因素。免疫原或疫苗的“治疗有效量”的施用量将由这些考虑因素指导，并可以是，以防止、改善或治疗目标疾病、病症或紊乱所必需的最小剂量。

抗原或疫苗的量为足以诱导所需要的体液和/或细胞介导性免疫应答或在目标宿主内产生保护性的量。本发明公开中给予免疫原或疫苗的量将取决于对象种类、宿主身体特征如年龄、体重等，优选的输送方式等。一般来说，采用的剂量大致为每剂10-1500μg。相比较而言，目前的亚单位制剂含有来自三种病毒亚型的元素。其三价疫苗通常含有约7-25μg的来自三种组成病毒株每种的HA。这可作为滴定值得关注的疫苗成分的起始点。

如本文所用的，术语“有效量”是指足以降低目标疾病严重度和/或持续时间、改善其一种或多种症状、防止目标疾病进展或使目标疾病消退的治疗量，或足以预防目标疾病或其一种或数种症状发展、复发、发作或进展的治疗量。例如，基于基线或正常水平，值得关注的治疗可以增加宿主的生存能力或降低疾病严重度至少5%，优选是至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。在另一实施例中，治疗或预防药物的有效量可减少目标疾病的症状，如减少流感症状或疾病持续时间至少5%，优选是至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。本文还使用了它的等价术语“治疗有效量”。

在必要的情况下，该成分还可以包括增溶剂和局部麻醉剂，如利多卡因或其他“卡因”结尾的麻醉剂，以减轻注射部位的疼痛。

一般情况下，其成分都是以单位剂量的形式分别提供或混合提供，例如安瓿或小药囊等密封容器中的冻干粉末或无水浓缩物，标明其活性药物的量。成分进行输注给药的情况下，可用含药用级灭菌水或盐水的输液瓶进行分散。成分进行注射给药的情况下，例如可在试剂盒中提供含注射用灭菌水或盐水的安瓿，使其成分可在给药之前进行混合。或者，安瓿还可有含值得关注的活性药物的液体，例如，作为使用前稀释的浓缩物，或以预备好施用的形式存在。在另一实施例中，按照易于单次使用，提供合适剂量与体积的值得关注的配方。

提供的是含有有利于对上述疾病治疗的有用材料的生产制品。其生产制品可包括容器和标签。合适的容器包括瓶子、药水瓶、注射器和试管。容器可由多种材料制造，如玻璃或塑料。该容器可容纳值得关注的复合物，并可有一个无菌的接入口（例如，该容器可为静脉内注射溶液袋或含有塞子的药水瓶，塞子可用皮下注射针刺穿）。容器上或与其相关的标签表明该成分用于治疗流感。其生产制品可进一步包括一个二级容器，其内含有可接受药用的缓冲液，如磷酸盐缓冲盐、林格氏液或葡萄糖溶液。其可进一步包括从商业和用户角度看来需要的其他材料，包括缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器和插入使用说明的包装。

本发明公开还包括试剂盒，比如含有值得关注的免疫原性的或疫苗成分及其同系物、衍生物等，例如可作为主动或被动（active or passive）疫苗，使用说明的用处相同等。其说明可包括配备成分、衍生物等的指导。该成分可为液体形式，也可为固体形式，一般情况下，为干燥的或冻干的。其试剂盒可含有合适的其他试剂，如缓冲液、重悬液（reconstitutingsolution）和其他预期用途的必需成分。预定量的试剂组合可以考虑连同其使用说明一起包装，如用于治疗。此外，还可包括其他添加剂，如稳定剂、缓冲液等。各种试剂的相对量可以变化，所提供的是试剂溶液的浓缩物，为用户提供灵活，节省空间与试剂等。试剂盒可包含输送装置，如含针头的器械，如注射器，当需要时，可任选地预装值得关注的成分用于输送。

上面讨论的任何参考文献的引用均不应解释为认可这些参考文献是本公开发明的的先有技术。本文引用的所有参考文献均通过参考全文而引入本文。

现在通过下列非限制性例子举例说明本发明公开。

例1

来自怀俄明株（H3N2）的8个免疫减弱和再聚焦血凝素基因如上述进行设计和处理。例如，通过定点诱变替换核苷酸，导入N-联序列子，引起复杂的糖基修饰，和/或在5个含病毒株特异性表位的主要免疫原性的和高度变异的位点处，删除氨基酸和/或改变氨基酸的电荷。

通过每个变化，N-联序列子的导入用于最大化免疫性减弱的尺度，特别在较大的抗原位点，减少所需减弱的野生型氨基酸变化的数量的同时，最小化对糖蛋白和受体结合区域构象复杂性的任何影响。在某些情况下，只需要3个氨基酸的变化。抗原位点B（187-196）同时针对B细胞和CD4辅助性T细胞IDNPEs。

为加快研究，同时设计了DNA和蛋白质亚单位疫苗。对于DNA免疫接种，将全长的血凝素基因克隆入巨细胞病毒（CMV）启动子后的pTriEx载体（Invitrogen）。pTriEx-HA构造体（constructs）对哺乳动物细胞的瞬时转染显示类似于天然病毒蛋白的全长血凝素基因表达为三聚体，且可溶解在质膜提取物中。

用含8种突变和1种未修饰全长野生型HA糖蛋白的DNA构造体对9组远交小鼠进行免疫。第10组以空pTriEx载体免疫，作为阴性对照。

除DNA表达载体外，还应制造重组蛋白用于免疫。HA胞外域含有三聚体糖蛋白峰组配的区域和结合宿主细胞受体的区域。此外，除去其跨膜和胞浆域可引起重组HA三聚体释放进入培养上清液。因此，每一种突变HA基因均在胞外域的末端切去末端，并克隆进入含有噬菌体T7启动子的载体。胞外域载体转染进入感染了重组痘苗病毒的细胞，该病毒可表达噬菌体T7RNA聚合酶，引起HA三聚体的产生，该HA三聚体分泌进入培养基。提纯胞外域三聚体作为蛋白免疫原。

对小鼠进行预先采血。一组小鼠作为阴性对照，另一组以未修饰（野生型）抗原进行免疫。

在另一组实验中，主要组（principal groups）的小鼠在每个股四头肌注射10微克突变HA糖蛋白DNA（在0.1mL的无菌水中）进行免疫。小鼠休养5周后，推注进行二次DNA免疫。再过4-5周后，再次对小鼠推注提纯的胞外域糖蛋白，进行两处皮下免疫，每处10微克。第一次蛋白质免疫在弗氏完全佐剂中配制，第二次在弗氏不完全佐剂中配制。最终免疫后两周，小鼠被安乐死，并采血析出血清。

对血清的以下性质进行检测：1）利用Western blot和ELISA的形式，测定其对突变和野生型HA蛋白的反应性，2）通过肽链ELISA，测定其对线性表位的识别，3）通过蛋白酶，测定其对构象表位降解的保护，以及4）通过同源和异源流感病毒株的血凝素抑制和病毒中和，进行功能测定。

通过HA特异性ELISA的测量，以免疫再聚焦HA亚单位工程抗原来免疫的小鼠血清导致产生高滴度的抗毒血清。各组小鼠均显示，对野生型HA的滴度在1:100-300,000的范围内。根据标准HI检测中抗毒血清显示出的交叉亚型HI抗体的能力，对多种突变HA糖蛋白进行向下选择。

H3N2A/Wyoming/03/2003的突变体A2、B1、B2、B3、CE、CEB4、CEB5和D1对检测中使用的一组异源病毒亚型的交叉亚型HI和/或病毒中和滴度相等或较高。因此，如标准化和接受的代理（surrogate）HI和病毒中和检测的体外测量，免疫减弱和再聚焦引起HA糖蛋白亚单位候选疫苗的产生，能够诱导显著提升的交叉亚型抗病毒保护。

突变体A2是在HA的A表位发生的突变，此处KRRSNKS（SEQ ID NO:1）被GG替换。B1是在HA的B表位发生的突变，在其197位氨基酸处导入一个糖基化位点（QIS替换为NAS）。B2是在HA的B表位发生的突变，在其189位氨基酸处导入一个糖基化位点（SDQ替换为NYT）。B3是在HA的B表位发生的突变，在其193位氨基酸处导入一个糖基化位点（SLY替换为NIT）。CE包含两处突变，在276位向C表位导入一个糖基化位点（KCN替换为NCT），以及在83位向E表位导入一个糖基化位点（NKK替换为NKT）。CEB4为CE的B表位的一个额外突变，在158位添加一个糖基化位点（KYK替换为NST）。CEB5为CE的B表位的一个额外突变，在159位添加一个糖基化位点。D1是在HA的D表位发生的突变，在其201位氨基酸处导入一个糖基化位点（RIT替换为NIT）。

在另一组实验中，与不同的H3N2病毒株相比，检测再聚焦多肽抗原的血凝素抑制滴度和血清的中和滴度。其突变体来源于A/Wyoming/2003病毒株。M3有B2表位；M5有CE表位；M6有B4CE表位，如上所述。将小鼠暴露于多种突变蛋白，A/Wyoming/2003株病毒作为野生型阳性对照，而单独的载体作为阴性对照。然后检测小鼠血清对同源Wyoming株、Panama/1999株和Wellington/2004株这三株病毒的血凝素抑制滴度。其他小鼠血清用于检测针对同源Wyoming株、Korea/2003株、Korea/2002株、Fujian/2002株、Brisbane/09/2006株和Brisbane/10/2007株的血清中和滴度。暴露于单独载体的小鼠对照血清不产生可与Wyoming株、Panama株和Wellington株反应的特异性血凝素抑制抗体（滴度=10）。

暴露于野生型Wyoming病毒的小鼠产生可与Wyoming株和Wellington株反应的抗毒血清（滴度=1280），但与Panama株的反应轻微（滴度=226）。M5突变体产生的抗毒血清与Wyoming和Wellington株的反应剧烈程度是野生型的2倍（滴度=2560），但只是略低于Panama株（滴度=1920）。M6突变体产生的抗毒血清与毒M5突变体跟Panama和Wyoming株的反应水平相等（滴度分别为2560和1280）。但当M6突变体暴露于Wellington时，其产生的抑制性抗毒血清滴度较高，高于其他滴度的4倍（滴度=10240）。

因此，免疫再聚焦导致其对除同源株外的其他两株产生扩大（broadened）的应答，以及当使用三联修饰突变蛋白时，伴随着针对Wellington株产生极高的应答。在中和的研究中，暴露于载体的小鼠不产生特异性抗体。暴露于Wyoming的小鼠产生可与Wyoming强烈反应的抗毒血清（滴度=640）；Korea和Brisbane 2006的滴度为Wyoming的四分之一（滴度=160）；与Brisbane 2007几乎无反应（滴度=20）。小鼠抗毒血清中产生的M3突变蛋白对Wyoming、Brisbane 2006和Brisbane 2007的反应性为野生型的4倍（滴度=2560）。该抗毒血清与Korea不反应（滴度=3）。暴露于M5的小鼠产生的抗毒血清与Wyoming的反应性（滴度=80）为Brisbane 2006（滴度=160）的2倍，为Korea（滴度=2560）的30倍。该抗毒血清基本上与Brisbane 2007不反应（滴度=20）。因此，对另外3株的扩大应答从值得关注的免疫再聚焦抗原中获得。

因此，值得关注的成分可刺激针对存在于后续相关的亲本株中的病毒的保护性免疫，以及针对过去的更常见的病毒的保护性免疫。因而，基于Brisbane/07的免疫再聚焦H3N2疫苗将会刺激针对尚未进化的病毒的保护性应答，从而避免在接下来几年中重新配方的必要性。可开发基于Wyoming或Brisbane的免疫再聚焦疫苗用于针对过去和后续所有的H3N2株的保护。

例2

基于多种考虑，包括免疫优势表位、进化、序列多样性和结构数据的分析，设计了类猪HINlvA/California/04/2009株的免疫再聚焦血凝素抗原。设计下列突变以重新聚焦远离高度变异的免疫优势位点的免疫应答，并趋向更大范围的保护性表位。

如本文所述，免疫再聚焦突变可采用多种形式，包括删除、添加或减少糖基化位点，以及替换表位的影响电荷、疏水性或某些其他化学特性。添加糖基化有屏蔽相对较大部分表位的优势，而电荷改变可集中于抗体抗原相互作用的特定位点。由于多种流感株与血清型HA蛋白质结构的高度相似性，相关A/PR8/34的3-D结构分析可用于确定HA序列中推定的环和其他活性位点。将A/California/04/2009的HA与A/PR8/34的HA对齐，向Cal/04/09转移PR8的确定残基。

图2中的表2表示旨在重新聚焦免疫力，使其产生更广泛保护性应答的单位点突变。最初提出的突变大部分由氨基酸替换组成，其影响的是糖基化模式和/或局部电荷元素。突变的选择基于用来确认免疫优势表位的可用序列和结构数据，该表位可促进病毒株特异性应答。

沿着HA糖蛋白，以N-末端为起点的表位位点相关的序列与突变列于表2。包含D位点的C-末端部分（从214位开始）及融合区域（从314位开始）的残基已被消去，以节省表的空间。

突变的设计如下：

（i）表位C的M1与M3突变和表位E的M6与M7突变被选择作为涉及到结合单克隆抗体的位点或其紧邻位点。由于其位于高度灵活的环和序列变异性高的区域内，我们可以预测，其有助于病毒株特异性免疫力；

（ii）突变M1、M2、M5、M6、M8、M9、M10、M14、M16、M18、M20、M22、M23、M25在病毒株特异性免疫优势位点导入糖基化位点时实现双重目的，同时改变表位内相关氨基酸的电荷；

（iii）突变M3、M4、M7、M11、M12、M13、M15、M17、Ml9、M21、M24和M26以不带电荷的氨基酸残基代替带电荷的残基；

（iv）突变M5实现了在E位点添加糖基化的特殊目的，使其重新聚焦免疫力趋向于融合区域或HA-1HA-2融合位点内的保守元素（如C和E突变）；以及

（v）突变M25和M26的靶定位置为位于HA1-HA2裂解位点和融合区域（在表1中表示为位点″f″）附近的免疫优势位点，重新聚焦免疫力使其趋向于这些高度保守的基因座。

图3确定了重叠于A/PR8/34HA结构上单点突变的亚集。图1表示大部分突变被插入到高度灵活的环状部位，以在掩盖表位的同时不破坏重组蛋白的类天然（native-like）折叠。突变插入多变的环部，确保可以形成大多数构象表位。

例3

利用已知的方法，如定位点特异性诱变（快变（quick-change））或基因合成，可改造HA突变。一般情况下，快变突变可用于诱导单个或双重突变，而基因合成可用于更复杂的组合。

单点突变在评估指向每一表位的特定残基的免疫再聚焦技术时最有帮助。不过，由于病原体利用一个以上的免疫优势可变表位（迷惑性表位）以逃避长期的免疫压力，改进的免疫再聚焦抗原可将突变合并入多抗原位点。在2或3个表位中包含突变的免疫再聚焦HA抗原的例子如图4所示，其在表3列出。在所有5个表位中包含突变的免疫再聚焦HA抗原的例子如图5所示，其在表4列出。在表3和表4中，突变由图2中表所示的单点突变的组合构成。如图3所示的结构分析在组合突变的设计中非常有用，使选择的突变能降低彼此间在电荷、空间位阻或其他不利作用方面的干扰可能性。

为评估候选免疫再聚焦HA，有必要检测突变的组合，其中某些组合由糖基化插入构成，而其他大部分组合由仅仅降低表位中静电荷的替换构成。

突变列表是为了本领域培训举例的需要，一旦开始培训，可按照本文提供的材料与方法，在相似位点或为达成类似的目标设计其他突变。

例3描述的基于H1N1 HA序列的抗原可作为疫苗刺激针对所有H1N1变体的广泛免疫力。按本文所述制备其他突变，使基于H1N1的抗原能刺激产生针对其他血清型的流感病毒株的保护性免疫力，如H2、H5等。

本文所述的抗原设计方法可用于制造基于其他流感血清型的疫苗或抗体，如H2N2、H5N1、H7、H9等。

这些突变被用来刺激免疫力，以产生有广泛反应性的抗体，其可用于治疗、诊断或其他用途。

这些突变与佐剂联合使用可引起交叉反应性免疫宽度的额外改进。

例4

根据21CFR 610的指南，对重组免疫原的安全性、毒性和效能进行评估，包括：（i）一般安全性测试，以及急性与慢性毒性测试。

免疫原性数据来源于公认的能良好应答人类流感疫苗的动物模型（如豚鼠、小鼠、雪貂或棉鼠）。其调查包括根据剂量和给药间隔，利用含最终产品预期病毒株的疫苗，对免疫应答进行评估。相关动物模型的免疫原性研究用于记录产品的一致性，特别在为新型流感病毒疫苗生产过程的验证阶段。为动物研究选择的恰当非临床终点包括死亡、体重下降、病毒排泄（excretion）率、临床征象如发热、眼-鼻分泌物等。

对各组雪貂或其他合适动物腹膜内接种含300μg值得关注的免疫原的100μl免疫原。使用合适的阴性与阳性对照。

注射后14天内，监测动物的一般健康状况和体重。接受安慰剂和接受免疫原的动物均保持健康，且在观察期间没有体重下降和明显的疾病征象。

为进行更严格的安全性测试，对各组动物注射300μg的免疫原。

接种后第一天，对每组中的3只动物进行安乐死，脾、肺及肝匀浆进行免疫原分析。在注射后第4、8、12和16周，分别将每组中的3只动物行安乐死，收取脾、肺及肝匀浆进行分析，以评估免疫原是否存在。

如果没有观察到不良的健康反应，且相比作为内控的接种安慰剂的动物，其体重以正常速率增长，则认为该免疫原是安全的。

为评估免疫原的急性与慢性毒性，在各组雪貂的皮内按照分级剂量（graded doses）或盐水接种300μg免疫原。

接种后3天，将每组中的8只动物安乐死，以获取免疫原对动物的急性效应。接种后28天，对每组中剩余的8只动物安乐死，以评估对动物的任何慢性效应。在这两个时间点，均获取每只动物的体重。此外，还应检查注射部位的大体病理和外观。在每个时间点，抽取血液用于血液化学检查，并进行内脏和注射部位的组织病理学检查。

其他动物在第0、14和60天共给予3剂疫苗，并且利用每10天从动物中收集的血清，通过ELISA测量其对血凝素的免疫应答。例如，在首次接种后80天，测量所收集血清中的流感病毒中和率。

应当理解，对本文所描述的优选实施例作出的变化和修改对本领域的技术人员是显而易见的。这些变化和修改可在不脱离当前主题的指导思想与范围情况下，且不降低其预期优势的条件下进行。因此，将这些变化与修饰包括在所附的权利要求内。

本文引用的所有参考文献均通过参考全文而引入本文。

参考文献

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Claims (11)

1.一种分离的成分包含一流感免疫原性表位，所述流感免疫原性表位在野生型病毒中无免疫优势。

2.根据权利要求1所述的成分，其中包含一血球凝集素。

3.根据权利要求1所述的成分，其中包含一神经氨酸苷酶。

4.根据权利要求1所述的成分，其中包含一流感病毒颗粒。

5.根据权利要求4所述的成分，其中所述颗粒是灭活的、减毒的或非传染性的。

6.根据权利要求1所述的成分，其中所述成分包含糖基化位点的添加或去除。

7.根据权利要求1所述的成分，其中所述成分包含氨基酸的增加、替换或删除。

8.根据权利要求1所述的成分，其中包含一病毒样颗粒。

9.根据权利要求1所述的成分，其中所述成分在流感病毒表面表达。

10.根据权利要求1所述的成分，进一步包含一药物学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

11.根据权利要求1所述的成分，其中所述流感为人流感、禽流感、猪流感、犬流感或马流感。

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