CN102698262A - 鸡新城疫、产蛋下降综合征、病毒性关节炎三联灭活疫苗的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鸡新城疫、产蛋下降综合征和病毒性关节炎三联灭活疫苗的生产方法。本发明采用新城疫病毒、产蛋下降综合征病毒和病毒性关节炎病毒作为生产菌毒种，超强浓缩工艺和优质佐剂制备成灭活疫苗，免疫动物后抗体产生快，效价高，保护期长，降低了疫病的发生及蔓延。

Description

鸡新城疫、产蛋下降综合征、病毒性关节炎三联灭活疫苗的生产方法

技术领域

本发明是一种用于预防鸡的新城疫、产蛋下降综合征、病毒性关节炎三种疫病油乳剂疫苗的制备方法，属于兽用生物制品领域。

背景技术

鸡新城疫（newcastle disease,ND）具有很高的发病率和病死率，世界各地多有发生，且一旦爆发将给禽养殖业带来毁灭性打击，是危害养禽业的一种主要传染病。OIE将其列为A类疫病。

鸡产蛋下降综合征(Egg drop syndrome,EDS76)是20世纪70年代后期发现的一种以商品蛋鸡和种母鸡产蛋率下降、蛋壳异常、蛋体畸形、蛋质低劣等症状为特征的病毒性传染病。鸡群感染病毒后不死亡，产蛋前不出现临床症状。母鸡产蛋后产蛋率达到50%时，表现出产蛋量突然下降，连续2～3周下降幅度达到30%～50%。造成很大经济损失。

鸡病毒性关节炎(Avian viral arthritis,AVA)是由禽正呼肠孤病毒（Avianorthoreovirus）鸡病毒性关节炎病毒(Avian viralarthritis virus,AVAV)引起的主要发生于肉用鸡的一种传染病,以侵害胫跖关节、趾关节及其肌腱为特征,故又称传染性腱鞘炎、腱裂综合症或腱滑膜炎等。目前本病分布广泛,世界各地均有发生。在急性发病鸡群中,特别是种鸡群,常因生长缓慢或停滞、体重减轻,饲养利用率低以及死淘率高等,给养鸡业带来巨大的经济损失。

国内外现在上市的商品化产品品种很多，但都是很单一的传统疫苗，多次使用疫苗尤其是灭活疫苗，不仅增加鸡场人力和物力负担，同时多次抓鸡的注射应激,还会影响生产性能，致使鸡群对疾病的易感性增大。加之近年来毒株的不断变异，使得虽然推出的多种选择的疫苗，但仍然出现控制不住疫情发展的局面。所以迫使我们在以往具有不散毒、抗体滴度高、免疫保护期长、受母源抗体影响小等优点的油乳剂灭活疫苗的基础上开发出更新更好更适合预防这三种流行性疾病的产品。

发明内容

本发明的目的是制备鸡新城疫、鸡产蛋下降综合征、病毒性关节炎的三种抗原，并进行合理复配制成鸡新城疫、鸡产蛋下降综合征、病毒性关节炎三种疫病油乳剂疫苗，可以有效预防鸡新城疫、鸡产蛋下降综合征、病毒性关节炎的发生，同时也可以大大减少人们的劳动强度，降低养禽业养殖户的风险，而且保证了公众健康。

该三联灭活疫苗苗技术的主要相关内容和所采用的技术手段：

（1）生产用菌毒种为CVCC AV1615株鸡新城疫病毒、NE4株蛋下降综合征和CAVCC V2311株病毒性关节炎病毒；

（2）分别按常规方法用鸡胚繁殖CVCC AV1615株鸡新城疫病毒、NE4株蛋下降综合征病毒和CVCC AV2311株病毒性关节炎病毒，收获病毒液后经浓缩和灭活工艺制备成灭活病毒液；

（3）将以上制备的三种灭活抗原混合后鸡新城疫病毒含量不低于10^8.0EID₅₀/0.1ml，产蛋下降综合征病毒含量不低于10^6.0EID₅₀/0.1ml；0.1ml病毒性关节炎病毒含量不低于10^5.0EID₅₀/0.1m；

（4）按常规方法制备灭活佐剂疫苗。

本发明的详细描述

1.疫苗生产用菌毒种的来源

（1）鸡新城疫病毒La Sota株(CVCC AV1615）和效检用鸡新城疫强毒北京株(CVCC AV1611株）均购于北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所（中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心.中国兽医菌种目录第二版,中国农业科学技术出版社，2002，p142-143）；

（2）产蛋下降综合征病毒（Egg drop syndrome virus）NE4株由农业部动物疫病诊断及免疫重点开放实验室引进（陈傅言教授惠赠），该毒株是从南京某鸡场患病的褐壳蛋鸡海赛克斯父母代种鸡中分离到的一株减蛋综合征病毒（李刚、郑明球.产蛋减少综合征（EDS76）病毒的分离与初步鉴定.《畜牧与兽医》.1992（1）10～12）。该毒株已经过严格的毒种鉴定，其成果已荣获江苏省科技进步二等奖（成果编号为（92）苏科鉴字523号）。我们对该毒株用敏感鸭胚进行增殖，梯度离心纯化，再经过血清学、分子生物学等试验对各子代作了系统鉴定。

（3）禽正呼肠孤病毒（Avian orthoreovirus,本发明又称鸡病毒性关节炎病毒）CVCCAV2311株购于北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所（中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心.中国兽医菌种目录第二版,中国农业科学技术出版社，2002，p151）。

2.生产用种毒的制备：

鸡新城疫病毒La Sota株（CVCC AV1615）生产用毒种制备将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释（如10^-4或10^-5），尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。选接种后72～120小时死亡且病痕明显的鸡胚，分别收获鸡胚液（尿囊液及羊水），装于灭菌容器内。将检验无菌、对1%鸡红细胞凝集价不低于1:512（微量法）的鸡胚液混合，定量分装于无菌安瓿中，冷冻保存。注明收获日期、毒种代次等。

产蛋下降综合征病毒（Egg drop syndrome virus）NE4株生产用毒种制备将毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释（如10^-2或10^-3），接种10日龄易SPF鸡胚，每胚0.1ml。接种后72～120小时死亡的鸡胚，分别收获尿囊液，装于灭菌容器内。将检验无菌、对1%鸡红细胞凝集价不低于1:20480的鸡胚液混合，定量分装于无菌安瓿中，冷冻保存。注明收获日期、毒种代次等。

鸡病毒性关节病毒AV2311株生产用毒种制备将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释（如10^-3或10^-4），尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。选择接种后48～72小时的活胚，分别收获鸡胚液（尿囊液及羊水），装于灭菌容器内。收获时应逐个检查胚体，应有皮下出血、水肿、发育小等特异性病痕。将检验无菌的鸡胚液混合，定量分装于安瓿中，冷冻保存。注明收获日期、毒种代次等。

3.制苗用病毒液的制备：

（1）鸡新城疫病毒液的制备

接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释（如10^-4或10^-5），接种10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。

孵育与观察鸡胚接种后，每日照胚1次，将60小时前死亡的鸡胚弃去。此后，每4～6小时照胚1次，死亡的胚随时取出，至96小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上，置于2～8℃冷却12～24小时。

收获将冷却的鸡胚取出，收获鸡胚尿囊液（先收活胚后收死胚）。吸取胚液放于50000ml灭菌容器内，抽样测定红细胞凝集价。凝集价低于1:256（微量法）者应弃去。同时按现行《中国兽药典》进行无菌检验（可不移植），应无菌生长。收获的胚液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。

浓缩将收获的胚液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，至少浓缩4倍，抽样测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:2048（微量法）时停止浓缩，按中华人民共和国兽药典（中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○一○年版三部.中国农业出版社，2011，本发明以下简称为《中国兽药典》）规定的方法进行无菌检验（可不移植），应无菌生长，并留样备测毒价。浓缩后的胚液随即进行灭活。

灭活将鸡新城疫病毒液导入灭活罐内，计量加入10%甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1%。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时（以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌）后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

（2）鸡产蛋下降综合征病毒液的制备

接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释（如10^-2或10^-3），接种9～10日龄易感鸭胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，

孵育和观察鸭胚接种后置37℃继续孵育，鸡胚接种后，每日照胚1次，将72小时前死亡的鸡胚弃去。此后，每4～6小时照胚1次，死亡的胚随时取出，至120小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上，置于2～8℃冷却12～24小时。

收获将冷却的鸡胚取出，收获鸡胚尿囊液（先收活胚后收死胚）。吸取胚液放于50000ml灭菌容器内，抽样按现行《中国兽药典》进行无菌检验，应无菌生长；HA价≥1∶10240。收获的胚液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。

灭活将产蛋下降综合征病毒液导入灭活罐内，计量加入10%甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1%。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时（以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌）后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

（3）鸡病毒性关节炎病毒液的制备

接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释（如10^-2或10^-3），接种9～10日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。

孵育和观察鸡胚接种后，每日照胚1次，将30小时前死亡的鸡胚弃去。此后，每4～6小时照胚1次，死亡鸡胚随时取出，直至96小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却12～24小时。

收获将冷却的鸡胚取出，收获鸡胚尿囊液（先收活胚后收死胚）。吸取胚液放于50000ml灭菌容器内，抽样测定病毒含量，应≥10^5.0EID₅₀/0.1ml。同时按《中国兽药典》的规定进行无菌检验(可不移植)，应无细菌生长。收获的胚液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。

浓缩将收获的鸡胚病毒液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，至少浓缩4倍，抽样测定病毒含量，病毒含量不低于10^5.7EID₅₀/0.1ml时停止浓缩。按《中国兽药典》的规定进行无菌检验（可不移植），应无细菌生长，并留样备测毒价。浓缩后的胚液随即进行灭活。

灭活将病毒性关节炎病毒液导入灭活罐内，计量加入10%甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1%。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时（以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌）后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

4.灭活疫苗的制备：

经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备。

油相制备取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80℃后，再加司本-806份，至温度达到125℃时维持30分钟，冷却后备用。

水相制备将检验合格的鸡新城疫病毒液、产蛋下降综合征病毒液、病毒性关节炎病毒液等量混合，混合后，鸡新城疫病毒含量不低于10^8.0EID₅₀/0.1ml，产蛋下降综合征病毒含量不低于10^6.0EID₅₀/0.1ml；0.1ml病毒性关节炎病毒含量不低于10^5.0EID₅₀/0.1m。取灭菌后的吐温-804份，加入配液罐中，同时加混合抗原液96份，充分振摇，开动搅拌电机搅拌20～30分钟，使吐温-80完全溶解。

乳化取油相2份放入乳化罐中，开动电机，慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份后，再以4000r/min搅拌30～40分钟，在终止搅拌前加入1%硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01%。乳化后，取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5ml。

5.成品检验

（1）性状

外观乳白色乳剂。

剂型油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均不扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相为0.1ml，符合规定。

黏度按现行《中国兽药典》附录进行，黏度值为46cP，符合规定。

（2）装量检查按《中国兽药典》规定方法进行，测定3瓶结果为251.8ml、252.2ml、252.5ml，符合规定。

（3）无菌检验按《中国兽药典》的规定进行，无菌生长。

（4）安全检验用7日龄SPF鸡10只，每只肌肉或颈部皮下注射疫苗1ml，观察14日，结果试验鸡均健活，无任何局部和全身不良反应。

（5）效力检验

1）鸡新城疫部分效力检验采用血清学方法进行检验，结果不符合规定时，可采用免疫攻毒法进行检验。

血清学方法用30日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20μl，另5只不免疫作对照。接种后21日，每只鸡分别采血，分离血清，按《中国兽药典》规定方法进行HI抗体效价测定。免疫组HI抗体效价的几何平均值应不低于1:16（微量法），未免疫对照组HI抗体效价的几何平均值应不高于1:4（微量法）。

免疫攻毒法用30日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20μl，另5只不免疫作对照。接种后21日，每只鸡各肌肉注射鸡新城疫病毒北京株强毒CVCC AV1611株)l0^5.0ELD₅₀，观察14日。对照组应全部死亡，免疫组应保护至少7只。

2）产蛋下降综合征部分效力检验

用3～6周龄SPF鸡10只，每只肌肉注射疫苗1羽份（0.5mL），21～35天后，联通条件相同的对照鸡5只一起采血，检测EDS₇₆HI抗体，计算几何平均滴度。对照鸡抗体效价应≤1∶4；免疫鸡抗体效价应≥1∶128。

3）病毒性关节炎部分效力检验以下方法任择其一。

血清学方法取21日龄SPF鸡15只，其中10各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另外5只不免疫作为对照，同群饲养。21日后，每只鸡分别采血、分离血清，做琼脂免疫扩散试验，免疫鸡抗体阳性数应不少于9只，对照鸡应全部阴性。

免疫攻毒法取21日龄SPF鸡15只，其中10各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另外5只不免疫作为对照，同群饲养。21日后，每只鸡经脚垫接种鸡病毒关节炎病毒CVCC AV2311株强毒，0.2ml（含2×10⁴ELD₅₀）/只，观察120小时，检查趾、跗关节病变。对照组应至少有8只鸡发病，免疫组应全部保护。

（6）甲醛、汞类防腐剂残留量测定按《中国兽药典》规定方法进行测定，结果应符合规定。

本发明的积极意义

本发明涉及一种鸡新城疫、产蛋下降综合征、病毒性关节炎三联灭活疫苗的生产方法。本发明采用新城疫病毒、产蛋下降综合征病毒和病毒性关节病毒作为生产菌毒种，超强浓缩工艺和优质佐剂制备成灭活疫苗，免疫动物后抗体产生快，效价高，保护期长，降低了疫病的发生及蔓延。

本发明涉及的微生物信息

（1）鸡新城疫病毒La Sota株(CVCC AV1615）和效检用鸡新城疫强毒北京株(CVCC AV1611株）均购于北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所（中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心.中国兽医菌种目录第二版,中国农业科学技术出版社，2002，p142-143）；

（2）产蛋下降综合征病毒（Egg drop syndrome virus）NE4株由农业部动物疫病诊断及免疫重点开放实验室引进（陈傅言教授惠赠），该毒株是从南京某鸡场患病的褐壳蛋鸡海赛克斯父母代种鸡中分离到的一株减蛋综合征病毒（李刚、郑明球.产蛋减少综合征（EDS₇₆）病毒的分离与初步鉴定.《畜牧与兽医》.1992（1）10～12）。

（3）禽正呼肠孤病毒（Avian orthoreovirus,本发明又称鸡病毒性关节炎病毒）CVCCAV2311株购于北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所（中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心.中国兽医菌种目录第二版,中国农业科学技术出版社，2002，p151）。

最佳实施方式：

实施例1

（一）抗原制备以及半成品检验：

1．鸡新城疫病毒液的制备

（1）接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作10^-4稀释，接种10日龄易感鸡胚200枚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置37℃继续孵育，不翻胚。

（2）孵育与观察鸡胚接种后，每日照胚1次，将60小时前死亡的鸡胚9枚弃去。此后，每4～6小时照胚1次，死亡的胚随时取出，至96小时，共死亡152枚，全部取出，气室向上，置于2～8℃冷却12小时。

（3）收获将冷却的鸡胚取出，收获鸡胚尿囊液（先收活胚后收死胚）。共收鸡胚191枚，约2450ml尿囊液，抽样测定红细胞凝集价。凝集价为1:256（微量法）。按现行《中国兽药典》进行无菌检验。收获的胚液灭活前在2～8℃保存。

（4）浓缩将收获的胚液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，浓缩至600ml，抽样测定红细胞凝集价，凝集价为1:2048（微量法），按《中国兽药典》进行无菌检验，并留样备测毒价。浓缩后的胚液随即进行灭活。

（5）灭活将鸡新城疫病毒液导入灭活罐内，加入10%甲醛溶液6ml，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1%。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时（以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌）后取出，放2～8℃保存。

2．鸡产蛋下降综合征病毒液的制备

接种取生产用毒种NE4株，用灭菌生理盐水作适当稀释（如10^-2或10^-3），接种9～10日龄易感鸭胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔。

孵育和观察鸭胚接种后置37℃继续孵育，鸡胚接种后，每日照胚1次，将72小时前死亡的鸡胚弃去。此后，每4～6小时照胚1次，死亡的胚随时取出，至120小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上，置于2～8℃冷却12～24小时。

收获将冷却的鸡胚取出，收获鸡胚尿囊液（先收活胚后收死胚）。吸取胚液放于50000ml灭菌容器内，抽样按现行《中国兽药典》进行无菌检验，应无菌生长；HA价≥1∶10240。收获的胚液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。

灭活将产蛋下降综合征病毒液导入灭活罐内，计量加入10%甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1%。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时（以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌）后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

3.鸡病毒性关节炎病毒液的制备

（1）接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作10^-3稀释，接种10日龄易感鸡胚200枚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置37℃继续孵育。

（2）孵育和观察鸡胚接种后，每日照胚1次，将30小时前死亡的鸡胚7枚弃去。此后，每4～6小时照胚1次，死亡鸡胚随时取出，直至96小时，死亡161枚，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却12小时。

（3）收获将冷却的鸡胚取出，收获193枚鸡胚的尿囊液（先收活胚后收死胚）共2500ml。抽样测定病毒含量。同时按《中国兽药典》的规定进行无菌检验，收获的胚液灭活前在2～8℃保存。

（4）浓缩将收获的鸡胚病毒液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩至600ml，抽样测定病毒含量。按《中国兽药典》的规定进行无菌检验。浓缩后的胚液随即进行灭活。

（5）灭活将病毒性关节炎病毒液导入灭活罐内，加入10%甲醛溶液6ml，开启搅拌机搅拌，使其充分混合。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时（以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌）后取出，放2～8℃保存。

5.半成品检验

（1）鸡新城疫病毒液

1）病毒含量测定将浓缩后灭活前取出的胚液进行10倍系列稀释，取10^-7、10^-8、10^-93个稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1m1，置37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，无论死胚、活胚均应测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:128（微量法）者，判为感染，计算EID₅₀，结果0.1ml病毒含量为10^8.9EID₅₀的胚液。

2）红细胞凝集价测定取浓缩后灭活前的胚液，按《中国兽药典》规定方法进行测定，其凝集价为1:2048（微量法）。

3）灭活检验取10日龄SPF鸡胚6个，尿囊腔内接种灭活病毒液，每个0.2ml，置37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日。鸡胚健活，对所有胚液分别测定红细胞凝集价，均不出现凝集，将胚液收获再盲传一代，仍无凝集价，灭活完全。

4）无菌检验取灭活的胚液按《中国兽药典》的规定进行检验，结果无菌生长。

（2）产蛋下降综合征病毒液

1）病毒HA价测定将灭活前胚液，按《中国兽药典》规定方法进行测定，其凝集价为1:10240。

2）无菌检验取灭活的病毒液，按《中国兽药典》的规定进行检验，结果无菌生长。

3）灭活检验取10日龄易感鸭胚6个，尿囊腔内接种灭活病毒液，每个0.2ml，置37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日。鸭胚健活，对所有胚液分别测定红细胞凝集价，均不出现凝集，将胚液收获再盲传一代，仍无凝集价，灭活完全。

（3）病毒性关节炎病毒液

1）无菌检验取灭活的胚液按《中国兽药典》的规定进行检验，结果无菌生长。

2）灭活检验取7日龄SPF鸡胚6个，卵黄囊接种灭活浓缩胚液，每胚0.2ml，置37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日。鸡胚均健活，收获胚液并逐个检查胎儿，没有任何病变。将阴性样品的胚液混合，再盲传一代，仍无特异性病痕，灭活完全。

3）病毒含量测定将浓缩后灭活前的病毒也用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-63个稀释度，分别卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，记录24～168小时内死亡且胎儿病变明显的鸡胚数，结果每0.1ml病毒含量为10^5.9EID₅₀，可用于制苗。

（二）疫苗制备：

（1）油相制备取优质注射用白油3760ml，硬脂酸铝80ml，在油相制备罐中混合均匀并加热至80℃后，再加司本-80240ml，至温度达到125℃时维持30分钟，冷却后备用。

（2）水相制备将检验合格的鸡新城疫病毒液、产蛋下降综合征病毒液和病毒性关节炎病毒液各500ml混合（混合后，鸡新城疫病毒含量不低于10^8.0EID₅₀/0.1ml，产蛋下降综合征病毒含量不低于10^6.0EID₅₀/0.1ml；0.1ml病毒性关节炎病毒含量不低于10^5.0EID₅₀/0.1m）。取灭菌后的吐温-8028ml，加入配液罐中，同时加混合抗原液2000ml，充分振摇，开动搅拌电机搅拌30分钟，使吐温-80完全溶解。

（3）乳化取油相4000ml放入乳化罐中，开动电机，慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份后，再以4000r/min搅拌30分钟，在终止搅拌前加入1%硫柳汞溶液60ml。乳化后，取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底无析出的水相。

（4）分装分装100ml/瓶，共60瓶，加盖密封。

实施例2

成品检验——实验室试制一批三联灭活疫苗约6000ml，批号为2011001。

1．性状

外观乳白色乳剂。

剂型油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均不扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相为0.1ml，符合规定。

黏度按现行《中国兽药典》附录进行，黏度值为46cP，符合规定。

2.装量检查按《中国兽药典》规定方法进行，测定3瓶结果为251.8ml、252.2ml、252.5ml，符合规定。

3.无菌检验按《中国兽药典》的规定进行，无菌生长。

4.安全检验用7日龄SPF鸡10只，每只肌肉或颈部皮下注射疫苗1ml，观察14日，结果试验鸡均健活，无任何局部和全身不良反应。

5.效力检验

（1）鸡新城疫部分效力检验采用血清学方法进行检验，结果不符合规定时，可采用免疫攻毒法进行检验。

1）血清学方法用30日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20μl，另5只不免疫作对照。接种后21日，每只鸡分别采血，分离血清，按《中国兽药典》规定方法进行HI抗体效价测定。免疫组HI抗体效价的几何平均值1:362（微量法），未免疫对照组HI抗体效价的几何平均值为0（微量法）。

2）免疫攻毒法用30日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20μl，另5只不免疫作对照。接种后21日，每只鸡各肌肉注射鸡新城疫病毒北京株强毒（CVCC AV1611株）10^5.0ELD₅₀，观察14日。对照组5只鸡应全部死亡，免疫组10只鸡全部保护。

（2）产蛋下降综合征部分效力检验

用3～6周龄SPF鸡10只，每只肌肉注射疫苗1羽份（0.5mL），21～35天后，联通条件相同的对照鸡5只一起采血，检测EDS₇₆HI抗体，计算几何平均滴度。对照鸡抗体效价为0；免疫鸡10只抗体效价为1∶181。

（3）病毒性关节炎部分效力检验以下方法任择其一。

1）血清学方法取21日龄SPF鸡15只，其中10各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另外5只不免疫作为对照，同群饲养。21日后，每只鸡分别采血、分离血清，做琼脂免疫扩散试验，免疫鸡10只抗体全部为阳性，对照鸡5只全部阴性。

2）免疫攻毒法取21日龄SPF鸡15只，其中10各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另外5只不免疫作为对照，同群饲养。21日后，每只鸡经脚垫接种鸡病毒关节炎病毒CVCCAV2311株强毒，0.2ml（含2×10⁴ELD₅₀）/只，观察120小时，检查趾、跗关节病变。对照组应至少有10只鸡发病，免疫组10只全部保护。

2011001批疫苗的效检结果为：

6.甲醛、汞类防腐剂残留量测定按《中国兽药典》规定方法进行测定，结果甲醛残留0.07%，汞类防腐剂残留0.008%，符合规定。

实施例3

我们进行了三联疫苗与各组分单苗的免疫效果对比试验，试验方法如下：

用21日龄SPF鸡60只，新城疫、产蛋下降综合征、病毒性关节炎三联苗和新城疫、产蛋下降综合征、病毒性关节炎单苗各免疫10只，皮下注射疫苗0.5ml/只，另10只不免疫作对照。同群饲养。各组鸡分别于免疫前及免疫后7、14、21、28、35日采血，分离血清，测血清抗体。结果比较见下表。

Claims (2)

1.一种鸡新城疫、产蛋下降综合征、病毒性关节炎三联灭活疫苗，其特征在于该疫苗主要成分是灭活的CVCC AV1615株鸡新城疫病毒、NE4株产蛋下降综合征病毒和CVCC AV2311株病毒性关节炎病毒和疫苗佐剂。

2.一种权利要求1所述鸡新城疫、产蛋下降综合征和病毒性关节炎三联灭活疫苗的生产方法，其特征在于：

（1）生产用菌毒种为CVCCAV1615株鸡新城疫病毒、NE4株蛋下降综合征和CAVCC V2311株病毒性关节炎病毒；

（2）分别按常规方法用鸡胚繁殖CVCC AV1615株鸡新城疫病毒、NE4株蛋下降综合征病毒和CVCC AV2311株病毒性关节炎病毒，收获病毒液后经浓缩和灭活工艺制备成灭活病毒液；

（3）将以上制备的三种灭活抗原混合后的水相中鸡新城疫病毒含量不低于10^8.0EID₅₀/0.1ml，产蛋下降综合征病毒含量不低于10^6.0EID₅₀/0.1ml；0.1ml病毒性关节炎病毒含量不低于10^5.0EID₅₀/0.1m；

（4）按常规方法制备灭活佐剂疫苗。