JPWO2015163037A1 - 産卵低下症候群(eds)予防ワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドとEDSVのファイバータンパク質中のknob領域を結合させた融合タンパク質。
大腸菌を宿主にして発現させる場合には、封入体画分に融合タンパク質を発現させてもよい。大腸菌から封入体を回収する方法としては、例えば、超音波破砕法、高圧ホモジナイザー法、BugBuster(メルク株式会社)を用いた方法が例示される。
抗体を酵素や蛍光色素で標識する方法としては、EasyLink antibody conjugation kits(abcam)、Lightning-Link Rapid Conjugation System(Innova Biosciences Ltd)、Oyster Antibody Labeling Kit(Luminartis GmbH)、酵素標識キットEZ-Link(PIERCE Biotechnology)、PlatinumLink Protein Labeling Kit(Kreatech Biotechnology BV)、DyLight Antibody Labeling Kit(PIERCE Biotechnology)が例示される。
Knob-GCN4タンパク質及びその多量体の調製
(1)Knob-GCN4発現ベクターの構築
EDSV KE-80株から下記の方法によりゲノムDNAを抽出した。9日齢の発育家鴨卵尿膜腔内にウイルスを接種後、6日目に採取した尿膜腔液をプロテイナーゼK(1 mg/ml)を添加したプロナーゼ溶液中に加え、50℃で1時間、更に37℃で1晩振盪した。その後、フェノール/クロロホルムによる除タンパク質、エタノール沈殿、RNase A(Qiagen)処理を行い、ウイルスゲノムDNAを抽出した。
抽出したウイルスゲノムDNAを鋳型として、NcoI認識配列を有するセンス鎖プライマー(配列番号3)及びXhoI認識配列を有するアンチセンス鎖プライマー(配列番号4)を用いて、ファイバータンパク質のknob領域及び8リピート分のシャフト領域の一部(配列番号5)をコードするDNA断片(配列番号6)をPolymerase Chain Reaction(PCR)によって増幅した。この増幅DNA断片及びプラスミドpET-15b(メルク株式会社)を制限酵素NcoI及び制限酵素XhoIで切断処理し、その後、DNAリガーゼで両者を結合した。結合産物を大腸菌DH5αへ導入し、得られたプラスミドを中間ベクター1とした。
改変型GCN4タンパク質(NCBI#: 1CZQ_A)の3価コイルドコイル形成ユニット(以下、GCN4)に(G4S)2リンカー配列を付加したポリペプチド(以下、(G4S)2-GCN4)(配列番号7)を大腸菌で発現させるため、それをコードするDNA配列のコドンを最適化し、発現ベクターにクローニングするための5'末端へのNcoI認識配列並びに3'末端へのXhoI認識配列を付加したDNA配列(配列番号8)を設計し、これを人工合成した。この合成DNA及びプラスミドpET-21d(メルク株式会社)を制限酵素NcoI及び制限酵素XhoIで切断処理し、その後、DNAリガーゼで両者を結合した。結合産物を大腸菌DH5αへ導入し、得られたプラスミドを中間ベクター2とした。
中間ベクター1を鋳型として、NcoI認識配列を有するセンス鎖プライマー(配列番号9)及びNcoI認識配列を有するアンチセンス鎖プライマー(配列番号10)を用いて、Knob(配列番号11)をコードするDNA断片(配列番号12)をPCRによって増幅した。この増幅DNA断片及び中間ベクター2を制限酵素NcoIで切断処理し、その後、DNAリガーゼで両者を結合した。結合産物を大腸菌DH5αへ導入し、得られたプラスミドをpKNOB2とした。pKNOB2はKnob、(G4S)2リンカー配列、GCN4及びHisx6(H6)タグ配列で構成されるポリペプチド(以下、Knob-GCN4)(配列番号13)(図1)をコードするDNA配列(配列番号14)を含む。pKNOB2を大腸菌BL21(DE3)(メルク株式会社)に導入し、Knob-GCN4発現大腸菌KNOB2株を得た。
200 mLサイズの三角フラスコに10 mlのLB培地とアンピシリン溶液(終濃度100 μg/ml)を分注し、Knob-GCN4発現大腸菌KNOB2株を接種して、37℃で14時間程度振盪培養した(前培養)。2 Lサイズの三角フラスコに250 mLのLB培地とアンピシリン溶液(終濃度100 μg/ml)を分注し、これに5 mlの前培養菌液を植菌して、OD590が0.6を超えるまで37℃で振盪培養した。本培養のOD590が0.6を超えたところで、終濃度が1 mMとなるようイソプロピル‐β‐D‐ガラクトピラノシド(IPTG)を添加し、37℃で4時間、振盪培養した。本培養液を遠心管に移し、8,000 rpm・4℃・30分間の遠心分離によって菌体ペレットを回収した。
50 mL のBugBuster Master Mix(Novagen社)にComplete プロテアーゼインヒビターカクテル錠(Roche)を2錠加え、これを菌体破砕液とした。菌体ペレットを菌体破砕液に懸濁して室温で60分間インキュベーションし、その後、超音波破砕(氷上、Output 4、Duty 70%、10分間を3回)した。破砕液を遠心分離(15,000 rpm, 4℃・30分間)し、上清(可溶性画分)を回収した。
可溶性画分に含まれる組換え抗原タンパク質を、HisTrap HP, 5mlカラム(GEヘルスケア社)を用い、カラムに付属する説明書に従って精製した。20 mM(終濃度)のイミダゾールを添加した可溶性画分をカラムにアプライし、20 mM(終濃度)のイミダゾールを含むバッファーでカラム洗浄した後、500 mM(終濃度)のイミダゾールを含むバッファーでカラム溶出を行った。得られた溶出画分をAmicon Ultra-15 10K(Millipore社)によって濃縮し、透析によってバッファー成分をPBSへ置換しKnob-GCN4抗原を得た。
GCN4-Knobタンパク質及びその多量体の調製
(1)GCN4-Knob発現ベクターの構築
中間ベクター2を鋳型として、NcoI認識配列を有するセンス鎖プライマー(配列番号15)及びXhoI認識配列を有するアンチセンス鎖プライマー(配列番号16)を用いて、GCN4に(G4S)1リンカー配列を付加したポリペプチド(以下、GCN4-(G4S)1)(配列番号17)をコードするDNA断片(配列番号18)をPCRによって増幅した。この増幅DNA断片及びプラスミドpET-21d(メルク株式会社)を制限酵素NcoI及び制限酵素XhoIで切断処理し、その後、DNAリガーゼで両者を結合した。結合産物を大腸菌DH5αへ導入し、得られたプラスミドを中間ベクター3とした。
中間ベクター1を鋳型として、XhoI認識配列を有するセンス鎖プライマー(配列番号19)及びXhoI認識配列を有するアンチセンス鎖プライマー(配列番号20)を用いて、Knob(配列番号11)をコードするDNA断片(配列番号12)をPCRによって増幅した。この増幅DNA断片及び中間ベクター3を制限酵素XhoIで切断処理し、その後、DNAリガーゼで両者を結合した。結合産物を大腸菌DH5αへ導入し、得られたプラスミドをpKNOB3とした。pKNOB3はGCN4、(G4S)1リンカー配列、Knob及びヒスチジンヘキサマータグ配列で構成されるポリペプチド(以下、GCN4-Knob)(配列番号21)(図1)をコードするDNA配列(配列番号22)を含む。pKNOB3を大腸菌BL21(DE3)(メルク株式会社)に導入し、GCN4-Knob発現大腸菌KNOB3株を得た。
(2)実施例1と同様にして組換え大腸菌の培養及び発現タンパク質の精製を行い、GCN4-Knob抗原を得た。
Knob-CMPタンパク質及びその多量体の調製
(1)Knob-CMP発現ベクターの構築
Knob、(G4S)2H6(G4S)2リンカー配列、及びCMPタンパク質(NCBI#: NP_001025546)の3価コイルドコイル形成ユニットで構成されるポリペプチド(以下、Knob-CMP)(配列番号23)(図1)を大腸菌で発現させるため、それをコードするDNA配列のコドンを最適化し、発現ベクターにクローニングするための5'末端へのNdeI認識配列並びに3'末端へのBamHI認識配列を付加し、更に5'末端並びに3'末端への保護塩基を付加したDNA配列(配列番号24)を設計し、人工合成した。この合成DNAと制限酵素EcoRVによって切断処理したプラスミドpUC57(ジェンスクリプト株式会社)をDNAリガーゼによって結合した。結合産物を大腸菌DH5αへ導入し、得られたプラスミドを中間ベクター4とした。
中間ベクター4を制限酵素NdeI及び制限酵素BamHIで切断処理し、Knob-CMPをコードするDNA断片を得た。このDNA断片と制限酵素NdeI及び制限酵素BamHIで切断処理したプラスミドpET-11a(メルク株式会社)をDNAリガーゼで結合した。結合産物を大腸菌DH5αへ導入し、得られたプラスミドをpKNOB4とした。さらに、pKNOB4を大腸菌BL21(DE3)(メルク株式会社)に導入し、Knob-CMP発現大腸菌KNOB4株を得た。
(2)実施例1と同様にして組換え大腸菌の培養及び発現タンパク質の精製を行い、Knob-CMP抗原を得た。
CMP-Knobタンパク質及びその多量体の調製
(1)CMP-Knob9発現ベクターの構築
CMP、(G4S)2H6(G4S)1(G3S)1リンカー配列、及びKnobで構成されるポリペプチド(以下、CMP-Knob)(配列番号25)(図1)を大腸菌で発現させるため、それをコードするDNA配列のコドンを最適化し、発現ベクターにクローニングするための5'末端へのNdeI認識配列並びに3'末端へのBamHI認識配列を付加し、更に5'末端並びに3'末端への保護塩基を付加したDNA配列(配列番号26)を設計し、人工合成した。この合成DNAと制限酵素EcoRVによって切断処理したプラスミドpUC57(ジェンスクリプト株式会社)をDNAリガーゼによって結合した。結合産物を大腸菌DH5αへ導入し、得られたプラスミドを中間ベクター5とした。
中間ベクター5を制限酵素NdeI及び制限酵素BamHIで切断処理し、CMP-KnobをコードするDNA断片を得た。このDNA断片と制限酵素NdeI及び制限酵素BamHIで切断処理したプラスミドpET-11a(メルク株式会社)をDNAリガーゼで結合した。結合産物を大腸菌DH5αへ導入し、得られたプラスミドをpKNOB5とした。さらに、pKNOB5を大腸菌BL21(DE3)(メルク株式会社)に導入し、CMP-Knob発現大腸菌KNOB5株を得た。
(2)実施例1と同様にして組換え大腸菌の培養及び発現タンパク質の精製を行い、CMP-Knob抗原を得た。
Knobタンパク及びその多量体の調製
(1)Knob発現ベクターの構築
EDSVファイバータンパク質のknob領域にヒスチジンヘキサマータグ配列を付加したポリペプチド(配列番号1)(図1)を大腸菌で発現させるため、それをコードするDNA配列のコドンを最適化し、発現ベクターにクローニングするための5'末端へのNdeI認識配列並びに3'末端へのBamHI認識配列を付加したDNA配列(配列番号2)を設計し、これを人工合成した。この合成DNA及びプラスミドpET-11a(メルク株式会社)を制限酵素NdeI及び制限酵素BamHIで切断処理し、その後、DNAリガーゼで両者を結合した。結合産物を大腸菌DH5αへ導入し、得られたプラスミドをpKNOB1とした。さらに、pKNOB1を大腸菌BL21(DE3)(メルク株式会社)に導入し、Knob発現大腸菌KNOB1株を得た。
(2)実施例1と同様にして組換え大腸菌の培養及び発現タンパク質の精製を行い、Knob抗原を得た。
実施例1〜4及び比較例1において精製した5種類の組換え抗原タンパク質(Knob、GCN4-Knob、Knob-GCN4、CMP-Knob、Knob-CMP)についてBCA Protein Assay Kit (Pierce社) を用いて定量を行った。結果を表1に示す。
組換えタンパク質の性状解析:
実施例1〜4及び比較例1において精製した5種類の組換え抗原タンパク質(Knob、GCN4-Knob、Knob-GCN4、CMP-Knob、Knob-CMP)についてSDS-PAGE解析を行った。組換え抗原タンパク質を還元剤を含まないサンプルバッファーと混合し、100℃・5分間の熱変性処理を行ったタンパク質サンプルおよび熱変性処理を行わなかったタンパク質サンプルを2μg/レーンで12.5%均一濃度トリス−グリシン系ゲル(Atto, E-R12.5L)にアプライして10 mAで130分間通電した。CBB染色はEz Stain Aqua(Atto, AE-1340)を用いて行った。ウェスタンブロット解析は、一般的な方法でPVDF膜転写を行った後、100倍希釈した抗Knobタンパク質ニワトリ血清で一次抗体反応を行い、4,000倍希釈した抗ニワトリIgG-HRPコンジュゲート抗体(Chicken IgG(IgY)-heavy and light chain Antibody、BETHYL LABORATORIES社)で二次抗体反応を行った。二次抗体反応後、Western Lightning Plus-ECL(Perkin Elmer Life and Analytical Science社)を用いて化学発光反応を行い、Image Quant LAS4000 mini(GEヘルスケア社)で発光像を記録した。その結果、5種類の組換え抗原タンパク質がいずれも3量体と推定される分子を形成していることを確認した(図2)。
ゲル濾過解析はAKTA Prime Plus (GEヘルスケア社)に接続したHiLoad 16/60 Superdex 200 prepgradeカラム (GEヘルスケア)を用いて行った。流速は0.8 ml/minに設定し、バッファーはPBSを用いた。分子量マーカーはGel Filtration Calibration Kits LMWおよびHMW (GEヘルスケア社) を用いた。解析の結果、5種類の組換え抗原タンパク質がいずれも3量体と推定される分子を形成していることを確認した(図3)。
組換え抗原の免疫原性評価(赤血球凝集抑制試験(HI試験)):
実施例1〜4及び比較例1において精製した5種類の組換え抗原タンパク質(Knob、GCN4-Knob、Knob-GCN4、CMP-Knob、Knob-CMP)について、鶏へ免疫を行い誘導されるHI抗体価を測定した。組換え抗原タンパク質がKnob換算で10μg/0.5mLとなるよう油性アジュバント(軽質流動パラフィン, モノオレイン酸ソルビタン, ポリソルベート80を混合したもの)と混合・調製した。対照ワクチンとして、化血研から市販されているEDSワクチンの抗原であるEDSV(EB66)を使用した。EB66細胞で培養したEDSVを106.7 TCID50/0.5mL以上となるよう油性アジュバント(軽質流動パラフィン, モノオレイン酸ソルビタン, ポリソルベート80を混合したもの)と混合・調製した。調製したワクチンを29日齢のSPF鶏の下腿脚部筋肉内に0.5mL筋肉注射により接種した。免疫7週後に鶏から採血を行い、採取された血清についてHI試験を実施した。HI試験は試験血清を3倍量の25%カオリンと混合(=4倍希釈)して室温で5分毎に振とうしながら20分間処理し、2,000rpmで5分間遠心した検体を測定用試料とした。測定試料をPBS(-)で2倍段階希釈したのち、希釈した試料0.025mLに4単位/0.025mLに調製したHA抗原0.025mLを添加して室温で10〜20分間感作させ、さらにPBSに浮遊させた0.5%鶏赤血球0.05mLを添加、混合して室温で1時間反応させた後の赤血球凝集像よりHI抗体価を判定した。試験の結果、組換え抗原タンパク質の中でも多量体形成ユニットを付加したもの、特にGCN4-Knob、CMP-Knob、Knob-CMPの3種類の組換えタンパク質抗原で誘導されるHI抗体価が向上することを確認した(図4)。
有効抗原量確認試験:
実施例1及び4において精製した組換え抗原タンパク質(Knob-GCN4及びCMP-Knob)について、鶏への有効抗原量確認試験を実施した。組換え抗原タンパク質(Knob-GCN4及びCMP-Knob)がKnob換算で10μg/0.5mL、3μg/0.5mL、1μg/0.5mL、0.3μg/0.5mLとなるよう油性アジュバント(軽質流動パラフィン, モノオレイン酸ソルビタン, ポリソルベート80を混合したもの)と混合・調製し、29日齢のSPF鶏の下腿脚部筋肉内に0.5mL筋肉注射により接種した。免疫7週後に鶏から採血を行い、採取された血清についてHI試験を実施した。HI試験は試験血清を3倍量の25%カオリンと混合(=4倍希釈)して室温で5分毎に振とうしながら20分間処理し、2,000rpmで5分間遠心した検体を測定用試料とした。測定試料をPBS(-)で2倍段階希釈したのち、希釈した試料0.025mLに4単位/0.025mLに調製したHA抗原0.025mLを添加して室温で10〜20分間感作させ、さらにPBSに浮遊させた0.5%鶏赤血球0.05mLを添加、混合して室温で1時間反応させた後の赤血球凝集像よりHI抗体価を判定した。試験の結果、組換え抗原タンパク質(Knob-GCN4)は1μg/0.5mL以上で、組換え抗原タンパク質(CMP-Knob)は0.3μg/0.5mL以上で良好なHI抗体誘導効果を示すことが確認された(図5及び図6)。
強毒EDSVの感染に対する防御効果確認試験:
実施例4において精製した組換え抗原タンパク質(CMP-Knob)について、当該タンパク質を免疫した鶏における強毒EDSV感染に対する発症防御効果確認試験を実施した。組換え抗原タンパク質(CMP-Knob)がKnob換算で10 μg/0.5mLとなるよう油性アジュバント(軽質流動パラフィン, モノオレイン酸ソルビタン, ポリソルベート80を混合したもの)と混合・調製した。対照ワクチンとして、化血研から市販されているEDSワクチンの抗原であるEDSV(EB66)を使用した。EB66細胞で培養したEDSVを106.7 TCID50/0.5mL以上となるよう油性アジュバント(軽質流動パラフィン, モノオレイン酸ソルビタン, ポリソルベート80を混合したもの)と混合・調製した。調製したワクチンを約210日齢の市販鶏(レイヤー)の下腿脚部筋肉内に0.5mL筋肉注射により接種した。免疫4、6、9、12及び16週目に採血を行い、採取された血清についてHI試験を実施した。HI試験は試験血清を3倍量の25%カオリンと混合(=4倍希釈)して室温で5分毎に振とうしながら20分間処理し、2,000rpmで5分間遠心した検体を測定用試料とした。測定試料をPBS(-)で2倍段階希釈したのち、希釈した試料0.025mLに4単位/0.025mLに調製したHA抗原0.025mLを添加して室温で10〜20分間感作させ、さらにPBSに浮遊させた0.5%鶏赤血球0.05mLを添加、混合して室温で1時間反応させた後の赤血球凝集像よりHI抗体価を判定した。免疫16週後に強毒EDSV KE-80株を106.5 TCID50/羽となるように経口投与により感染させ、攻撃後4週間産卵状況を観察した。試験の結果、組換え抗原タンパク質(CMP-Knob)は10 μg/0.5mL免疫することで免疫後16週間にわたり高いHI抗体価を維持することが確認された(図7)。また、組換え抗原タンパク質(CMP-Knob)を免疫した鶏は免疫16週後の時点で強毒EDSVを感染させても、産卵停止・異常卵産出などの臨床症状を大幅に軽減可能であることが確認された(図8)。
Claims (35)
- コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドと産卵低下症候群(EDS)ウイルス(EDSV)のファイバータンパク質中のノブ領域(Knob)を結合させた融合タンパク質。
- 前記ポリペプチドとKnobとの間にリンカー配列及び/又はタグ配列を有する請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記コイルドコイル形成ユニットが、天然の多量体形成タンパク質に由来するものである請求項1又は2に記載の融合タンパク質。
- 前記天然の多量体形成タンパク質が、GCN4又はcartilage matrix protein(CMP)である請求項3に記載の融合タンパク質。
- GCN4又はCMPがKnobのC末端側に結合したものである請求項4に記載の融合タンパク質。
- GCN4がKnobのC末端側に結合したものである請求項5に記載の融合タンパク質。
- 配列番号13で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである請求項6に記載の融合タンパク質。
- CMPがKnobのC末端側に結合したものである請求項5に記載の融合タンパク質。
- 配列番号23で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれらのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである請求項8に記載の融合タンパク質。
- GCN4又はCMPがKnobのN末端側に結合したものである請求項4に記載の融合タンパク質。
- GCN4がKnobのN末端側に結合したものである請求項10に記載の融合タンパク質。
- 配列番号21で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである請求項11に記載の融合タンパク質。
- CMPがKnobのN末端側に結合したものである請求項10記載の融合タンパク質。
- 配列番号25で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである請求項13に記載の融合タンパク質。
- Knobが、配列番号11で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれらのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである請求項1ないし14のいずれかの項に記載の融合タンパク質。
- 請求項1ないし15のいずれかの項に記載の融合タンパク質を多量体化した融合タンパク質多量体。
- 請求項1ないし15のいずれかの項に記載の融合タンパク質をコードするDNA配列からなる核酸断片。
- 請求項17に記載の核酸断片を含む組換え発現ベクター。
- 請求項17に記載の核酸断片が導入された形質転換体。
- 請求項18に記載の組換え発現ベクターが導入された形質転換体。
- 請求項1ないし15のいずれかの項に記載の融合タンパク質と結合することができる抗体。
- 請求項16に記載の融合タンパク質多量体と結合することができる抗体。
- 請求項1ないし15のいずれかの項に記載の融合タンパク質を有効成分として含有するEDS用ワクチン。
- 請求項16に記載の融合タンパク質多量体を有効成分として含有するEDS用ワクチン。
- 請求項21又は22に記載の抗体を有効成分として含有するEDS用治療剤。
- 請求項17に記載の核酸断片を有効成分として含有するEDS用DNAワクチン。
- 請求項18に記載の組換え発現ベクターを有効成分として含有するEDS用DNAワクチン。
- 請求項1ないし15のいずれかの項に記載の融合タンパク質を含む、被検試料中のEDSVのノブ領域(Knob)に対する抗体量を測定するためのキット。
- 請求項16に記載の融合タンパク質多量体を含む、被検試料中のEDSVのノブ領域(Knob)に対する抗体量を測定するためのキット。
- 請求項21又は22に記載の抗体を含む被検試料中のEDSVのノブ領域(Knob)の含有量を測定するためのキット。
- 請求項1ないし15のいずれかの項に記載の融合タンパク質を鶏に投与するEDSの予防方法。
- 請求項16に記載の融合タンパク質多量体を鶏に投与するEDSの予防方法。
- 請求項21又は22に記載の抗体を鶏に投与するEDS治療方法。
- 請求項17に記載の核酸断片を鶏に投与するEDSの予防方法。
- 請求項18に記載の組換え発現ベクターを鶏に投与するEDSの予防方法。
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