CN104341502B - 低免疫原性抗TNF-α全人源单抗及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种低免疫原性的抗TNF-α全人源单抗及其应用。通过对阿达木(adalimumab)单抗氨基酸序列分析,对其中免疫原性高的非抗原结合序列进行改进,构建并筛选出多个免疫原性有效降低的抗TNF-α全人源单抗,其与人TNF-α结合的亲和力和原始adalimumab抗体相近,可特异性地阻断TNF-α与细胞表面TNF受体p55和p75的结合。本发明为针对TNF-α靶标的抗肿瘤及其他疾病如炎症及自身免疫性疾病的预防和治疗提供了免疫原性更低、半衰期更长的抗体药物,该抗体药有望减少其在病人体内产生免疫原性的风险,延长抗体药的半衰期,提高疗效,具有优异的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及治疗用人源基因工程抗体的制备及应用,主要是涉及特异性针对人TNF-α的抗体及其应用。
背景技术
TNF-α是一种在炎症和免疫应答中自然出现的细胞因子。研究发现在类风湿性关节炎(RA)患者的滑膜液中,TNF-α水平升高,并在病理性炎症和关节破坏方面起重要作用。目前一般采用单克隆IgG抗体或者可溶性的TNF-α受体来中和体内的TNF-α。市售的单抗有如下:英夫利昔是人源化的TNF-α鼠单克隆抗体,依那西普是由两条人TNF-α受体(p75)偶联到Fc端的融合蛋白。利用放射性标记的TNF-α进行结合能力测定,结果显示英夫利昔能结合单体(无活性)及三聚体(有活性)类型的可溶TNF;依那西普更倾向于结合有活性的聚体形式的TNF-α及TNF-β。阿达木(adalimumab)单抗是美国雅培公司研制的一个全人的TNF-α单克隆抗体,其可特异性地与TNF结合并阻断其与p55和p75细胞表面TNF受体的相互作用。但adalimumab单抗在宿主体内免疫原性较强,高达26%以上的患者使用该单抗会发生免疫反应,这给临床患者的使用带来了风险和不便,同时药物半衰期也相对较短,使用的过程中也需要增大药物剂量来弥补该方面的缺陷。基于此,若能够在不影响抗体亲和力和特异性的前提下,通过将抗体中高免疫原性的非抗原结合位点换成低免疫原性的同源序列来降低抗体药的免疫原性,则一方面可使单抗的安全性得到提高;另一方面可增加药物半衰期,在减少其用剂量同时也能起到提高疗效的作用。目前未见低免疫原性TNF-α的抗体的报道。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种低免疫原性的全人源抗TNF-α的单克隆抗体。
本发明的另一个目的在于提供一种制备低免疫原性全人源抗TNF-α的单克隆抗体的方法。
本发明利用商业化的DNAStarTM软件对阿达木单抗(购自美国雅培公司)的原始序列进行评价,结果显示,阿达木免疫原性系数为16。利用上述软件对抗体的可变区里面的非抗原结合片段(FR)进行免疫原性评价,找到免疫原性强的相关序列。随后,查找人抗体基因库中所有涉及轻重链的FR区段,通过比较后选择出一些免疫原性相对较低的区段。将区段中相应变动的部分分别得同阿达木单抗中对应的区段进行替换,随后用Pymol蛋白分子模拟软件进行3D建模,选择保持了原有的抗原结合位点的序列进行基因合成,测序,选择测序正确的序列。
本发明的低免疫原性抗TNF-α全人源单克隆抗体,即是在原始阿达木序列的轻链可变区和重链可变区的FR区进行氨基酸改造,降低其免疫原性,所述原始阿达木序列的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.23、24所示。
进一步地,本发明提供的低免疫原性抗TNF-α全人源单克隆抗体,其轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.11~15或SEQIDNO.23任一所示,其重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.16~20任一所示。
更进一步地,本发明提供的低免疫原性抗TNF-α全人源单克隆抗体,其轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.13所示,其重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.19所示。编码其的核苷酸序列分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.9所示。
本发明提供的全人源的抗人TNF-α单克隆抗体,其轻链可变区具有L1至L5(SEQIDNO1~5所示)这五条碱基序列所示的任一个轻链可变区序列,重链可变区具有h1至h5(SEQIDNO.6~10所示)这五条碱基序列所示的任一个重链可变区序列。
具备上述轻链可变区和重链可变区的组合中,本发明共筛选得到10个单抗序列,它们既保持了原有抗原结合位点、又与人TNF-α结合的亲和力和原始adalimumab抗体相近,可特异性地阻断TNF-α与细胞表面TNF受体p55和p75的结合。
这10个单克隆抗体都具有相同的CDR区域且具有同样的功能,但对这10个抗体FR区域中某些氨基酸进行了不同的调整,这可使它们的免疫原性得到有效的降低。
本发明的提供编码上述10个单克隆抗体轻链可变区和重链可变区的基因。
本发明得到的10个低免疫原性的全人源抗TNF-α的单克隆抗体,分别为L3h2、L3h4、L5h2、L4h1、L4h2、L4h4、L1h3、L2h1、L0h4、L2h5、
其中L3h2单抗的轻链的核苷酸序列分别如SEQIDNO.3所述,重链的核苷酸序列分别如SEQIDNO.7所述,其轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNO.13所述,重链的氨基酸序列分别如SEQIDNO.17所述。
其中L3h4单抗的轻链的核苷酸序列分别如SEQIDNO.3所述,重链的核苷酸序列分别如SEQIDNO.9所述,其轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNO.13所述,重链的氨基酸序列分别如SEQIDNO.19所述。
其中L5h2单抗的轻链的核苷酸序列分别如SEQIDNO.5所述,重链的核苷酸序列分别如SEQIDNO.7所述,其轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNO.15所述,重链的氨基酸序列分别如SEQIDNO.17所述。
其中L4h1单抗的轻链的核苷酸序列分别如SEQIDNO.4所述,重链的核苷酸序列分别如SEQIDNO.6所述,其轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNO.14所述,重链的氨基酸序列分别如SEQIDNO.16所述。
其中L4h2单抗的轻链的核苷酸序列分别如SEQIDNO.4所述,重链的核苷酸序列分别如SEQIDNO.7所述,其轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNO.14所述,重链的氨基酸序列分别如SEQIDNO.17所述。
其中L4h4单抗的轻链的核苷酸序列分别如SEQIDNO.4所述,重链的核苷酸序列分别如SEQIDNO.9所述,其轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNO.14所述,重链的氨基酸序列分别如SEQIDNO.19所述。
其中L1h3单抗的轻链的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1所述,重链的核苷酸序列分别如SEQIDNO.8所述,其轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNO.11所述,重链的氨基酸序列分别如SEQIDNO.18所述。
其中L2h1单抗的轻链的核苷酸序列分别如SEQIDNO.2所述,重链的核苷酸序列分别如SEQIDNO.6所述,其轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNO.12所述,重链的氨基酸序列分别如SEQIDNO.16所述。
其中L2h5单抗的轻链的核苷酸序列分别如SEQIDNO.2所述,重链的核苷酸序列分别如SEQIDNO.10所述,其轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNO.12所述,重链的氨基酸序列分别如SEQIDNO.20所述。
其中L0h4单抗的轻链的核苷酸序列分别如SEQIDNO.21所述,重链的核苷酸序列分别如SEQIDNO.9所述,其轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNO.23所述,重链的氨基酸序列分别如SEQIDNO.19所述。
本发明提供了含有上述10个中任一个低免疫原性的全人源抗TNF-α的单克隆抗体轻链可变区和重链可变区基因的表达载体。含有所述表达载体的宿主菌、宿主细胞或表达盒也在本发明的保护范围内。
本发明提供上述10个低免疫原性的全人源抗TNF-α的单克隆抗体在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。
所述的疾病为风湿性关节炎,红斑狼疮。
本发明提供了上述全人源抗TNF-α单克隆抗体在制备以TNF-α为靶标的疾病治疗药物中的应用。
所述的药物为抗肿瘤药、抗炎药物或治疗自身免疫性疾病的药物。
本发明提供了含有上述全人源抗TNF-α单克隆抗体的药物或检测试剂。
本发明提供了制备上述全人源抗TNF-α单克隆抗体的方法,包括以下步骤:
(1)对NCBI数据库里的人源抗体的FR序列进行分析(详见图2、3),根据上述结果同时利用商业化的DNAstar软件对抗体的可变区里面的4个非抗原结合片段(FR)进行免疫原性评价,找到免疫原性强的片段。然后通过对已知的人抗体基因库里面找出所有重链的FR3段,挑选出一些免疫原性低的相应区段。将阿达木单抗上相应的重链及轻链区段进行替换,随后用Pymol蛋白分子模拟软件进行3D建模,结果发现大部分替换排列组合导致抗体的抗原结合位点构象变动很大,但是也有部分基本保持了原有的抗原结合位点;
(2)根据以上信息,本发明对相应修改后的序列进行全基因合成,对合成的基因进行测序同时选择测序正确的序列进行下一步操作,将轻链可变区设计酶切位点为KpnI+BamHI,重链可变区设计酶切位点为KpnI+AgeI,分别与表达载体pJH16载体连接,同时转化大肠杆菌DH5α,得到重链、轻链嵌合抗体表达载体,结果详见图1。同时对构建的抗体进行测序和序列对比;
(3)对上述表达的载体进行质粒大提工作,选取Qiagen的无内毒素质粒大提试剂盒(详见该质粒试剂盒说明书);
(4)对选取的质粒进行优化组合,同时利用293F细胞进行瞬时转染表达,对表达的抗体进行亲和力和EC50检测(详见图4)根据检测结果来选定哪些组合进行稳定转染;
(5)根据上述检测结果,本发明选取相应的组合利用电转染方式构建稳定株,同时利用MTX进行抗体表达程度的筛选,对于加压后的稳定株进行单克隆筛选,最终挑选出抗体产量较高的稳定株,用于后续实验所用;
(6)本发明生产的单克隆抗体在小鼠体内的免疫反应比adalimumab低,同时半衰期明显延长。
本发明提供的全人源抗TNF-α抗体和adalimumab针对的是TNF-α相同位点,但其免疫原性和抗体构象同adalimumab不同,同adalimumab相比其药物半衰期延长,有望成为非常理想的生物靶向治疗抗体。本发明通过对adalimumab单抗进行免疫原性改造,使抗体中部分氨基酸序列改变,将显著降低该抗体药在病人体内产生免疫原性的风险。本发明实施例显示本发明的改进型adalimumab抗体与TNF-α结合的亲和力和原始adalimumab相近,并延长抗体药的半衰期,提高疗效。
附图说明:
图1为质粒及合成基因酶切结果;其中a图为pJH16质粒双酶切结果(kpnⅠ和AgeⅠ),1:质粒双酶切结果。b图为pJH16质粒双酶切结果(kpnⅠ和BamHⅠ),1:质粒双酶切结果。c图为阿达木原始重链(kpnⅠ和AgeⅠ)及轻链(KpnI+BamHI)基因双酶切结果,1:重链双酶切结果,2:轻链双酶切结果;其中M为DL15000marker。
图2人源化轻链氨基酸序列BLAST比对结果;其中,图2a、图2b、图2c三个图均为该BLAST比对结果。
图3人源化重链氨基酸序列BLAST比对结果;其中,图3a、图3b、图3c三个图均为该BLAST比对结果。
图4改进型阿达木亲和力EC50。
图5改进型阿达木抑制TNF-α诱导L929细胞毒性实验。其中,图5a代表TNF-α诱导L929细胞毒性实验,作为实验的阳性对照;图5b代表改进型阿达木抗体抑制TNF-α诱导L929细胞毒性。
图6改进型阿达木抗体药代动力学检测。
具体实施方式
以下实施实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1降低免疫原性阿达木序列的分析及设计
利用商业化DNAStarTM软件对阿达木原始序列进行评价,评价结果显示,阿达木免疫原性系数为16,针对此本发明需要进行下一步免疫原性的降低工作。
通过利用上述软件对抗体的可变区里面的非抗原结合片段(FR)进行免疫原性评价,找到免疫原性强的相关序列。随后,查找人抗体基因库中所有涉及轻重链的FR区段,通过比较后选择出一些免疫原性相对较低的区段。基于上述信息,将区段中相应变动的部分分别得同阿达木单抗中对应的区段进行替换,初步得到的全人源的抗人TNF-α单克隆抗体,其轻链可变区选自L1~L5、L0(SEQIDNO.1~5、所示SEQIDNO.21)任一个碱基序列组成的轻链可变区序列,重链可变区选自h1~h5(SEQIDNO.6~10)所示任一个碱基序列组成的重链可变区序列。
随后用Pymol蛋白分子模拟软件进行3D建模,结果发现大部分替换排列组合导致抗体的抗原结合位点构象变动很大,但是也有部分基本保持了原有的抗原结合位点;因此对保持原有抗原结合位点的修改后的所有序列进行全基因合成(委托金唯智公司合成),对合成的基因进行测序(委托金唯智公司进行测序工作),根据测序比对结果选择正确的序列。
实施例2阿达木单抗表达载体的构建
根据实施例1测序得到的改进型阿达木重链、轻链可变区碱基序列,设计轻链序列两侧的酶切位点为KpnI+BamHI,设计重链序列两侧的酶切位点为KpnI+AgeI,以上序列送交金唯智公司合成全基因序列,合成所用的连接载体为pUC57。以pJH16为表达载体,合成基因返回后,将它们分别与金唯智公司合成的序列进行酶切后(见图1),16℃过夜连接。将酶切后得到的目的基因和表达载体(pJH16)进行琼脂糖凝胶电泳分离,随后切下目的条带并用QiagenGelExtractionKit回收,按T4DNA连接体系连接过夜,然后转化大肠杆菌DH5α,对相应的菌株进行质粒提取和序列测定工作,测序结果表明二者序列完全一致,这表明抗体表达载体构建成功。
实施例3改进型阿达木单抗的瞬时表达与纯化
用实施例2构建的pJH16重链、轻链表达载体转染大肠杆菌DH5a。接种于100m1LB培养基中,按照常规方法进行培养。收获培养物,用Qiagen公司的UltraPure质粒DNA纯合试剂盒抽提纯化质粒DNA。将上述纯化的质粒DNA采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒转染293F细胞,操作参照厂家的说明书进行。
首先对293F细胞进行不同轻、重链质粒组合的转染,组合见表1,共31组293F瞬时表达,需要从这31组中筛选出免疫原性降低的组合。培养3天后,取培养上清液,进行抗体表达量检测,结果如下表1所示:
表1:原始及改进型阿达木抗体表达量检测结果(ng/ml)
(注:表中组合是不同轻重链的组合,L0h1即指原始阿达木轻链可变区与本发明改进型阿达木重链可变区h1的组合,以此类推。Adh0l0是原始阿达木的组合)
对上述表达后的抗体分别进行预包TNF-α实验,从中筛选出较好的组别,实验结果如下:
加入预包有TNF-α的96孔板中,采用ELISA间接法,初步评价分泌抗体结合TNF-α的活性。上述31组的检测结果如下表2所示。NC为以抗体稀释液作为阴性对照。
表2:筛选的不同重链、轻链组合的抗体活性评价结果
实施例4改进型阿达木单抗的稳定表达与纯化
根据上述检测结果,选取质检结果较优的10个组合进行稳定转染。
采用电转染方法转染CHO(购自美国英俊公司)细胞,并利用选择性培养基Opti-CHO(美国英俊-opti-chomedium)进行MTX加压筛选(MTX购自sigma公司),分别以50、100、200、400、800nM这五个梯度进行加压,对于每轮加压后的细胞进行7d滴度测定,测定方法采用ELISA-双抗夹心法确定每步加压后工程细胞株的抗体产量。该过程完成后,利用有限稀释法进行单克隆筛选,该方法主要是通过对细胞进行稀释铺板(96孔板),在37℃5%CO2条件下培养大约14天后取50微升进行抗体产量初筛(采用ELISA-双抗夹心发测定)对于筛选结果较好的进行克隆挑取并扩大培养。
部分结果如表3:结果显示,不同轻重链的组合均得到表达,工程细胞株产生了相应的抗体(ELISA评价结果数据)。
表3:不同重链、轻链组合的抗体表达浓度评价
抗体纯化部分工作利用GE公司的ProteinA进行纯化,选取200nM加压组进行抗体稳定株生产工作,利用ProteinA亲和层析柱对上述11个稳定细胞系的培养上清直接分离纯化进而得到本发明的人源单克隆抗体(注:其中10个为改进型,1个为原始adalimumab)。实验过程详见GE公司说明书,纯化后产品利用紫外分光光度计进行定量检测,计算公式如下:
浓度计算:将收集的洗脱峰读OD280后,计算浓度。抗体浓度=OD280/1.4。
抗体纯化下来后进行SDS-PAGE电泳验证。
实施例5改进型阿达木单抗的生物活性测定
1、亲和力评价
本部分利用ELISA间接法测抗体EC50评价抗体亲和力。
实验方法如下:用PBS将TNF-a稀释抗原到0.3ug/ml;将稀释好的抗原按100ul/孔加到96孔板中,加盖,4℃过夜;甩去孔内液体,用PBS洗三次,200ul/孔,拍干;用5%牛乳-PBS200ul/孔封闭1h,每15min轻拍;甩去孔内液体,用PBS洗一次,200ul/孔,拍干;分梯度加入纯化抗体(0-10ug/ml),抗体名称见表4,5%牛乳-PBS稀释,100ul/孔,孵育1h,每15min轻拍;甩去孔内液体,用PBS洗三次,200ul/孔,拍干;加二抗,5%牛乳-PBS稀释,100ul/孔,孵育1h,每15min轻拍;预热TMB底物于室温,同时开启酶标仪预热;PBS洗5次,250ul/well,前三次5min,后两次10min,拍干;TMB底物AB各加50ul/孔,室温显色20min;使用扫描仪将图片扫描记录,加入终止液50ul/孔,使用酶标仪读取OD450。实验结果见图4。实验数据见下表4。
表4:优选的改进型阿达木轻重链可变区组合的EC50结果
组合名称 | l0h4 | l2h1 | l3h2 | l3h4 | l4h1 | l4h2 | l4h4 | adh0l0 |
EC50(nM) | 0.37 | 0.43 | 0.40 | 0.34 | 0.47 | 0.60 | 0.69 | 0.49 |
以上结果表明:改进型阿达木亲和力与原始阿达木亲和力基本一致,有的甚至比原始阿达木要高。
2、特异性评价
该过程验证所表达的抗体是否有针对rhTNFα具有特异性,利用不同的因子包板并采用间接法测定。
具体实验过程如下:用PBS将rhTNFα、rhTNFβ、rIFNγ(重组人干扰素γ),IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4和IL-8,稀释抗原到1ug/ml;将稀释好的抗原100ul/孔加到96孔板中,并加盖,4℃过夜;甩去孔内液体,用PBS洗三次,200ul/孔,手动拍干;用5%牛乳200ul/孔封闭,封闭1h,每15min轻拍酶标板边以促进反应;甩去孔内液体,用PBS洗一次,200ul/孔,手动拍干;加不同轻链重链组合的抗体,5%牛乳稀释,100ul/孔,孵育1h,每15min轻拍酶标板边以促进反应;甩去孔内液体,用PBS洗三次,200ul/孔,手动拍干;加入羊抗人二抗,5%牛乳稀释,100ul/孔;孵育1h,每15min轻拍酶标板边以促进反应;预热TMB底物于室温,同时开启酶标仪预热;PBS洗5次,250ul/孔,前三次5min,后两次10min,手动拍干;TMB底物AB各加50ul/孔,室温显色20min;使用扫描仪将图片扫描记录,加入终止液50ul/孔,使用酶标仪读取OD450,存档。实验结果如表5。
表5:全人源阿达木改进型单抗特异性检测
以上结果表明:改进型阿达木单抗针对rhTNFα具有特异性
3、细胞毒作用实验
本部分使用CCK-8试剂盒进行相应的实验,本实验主要利用小鼠成纤维细胞株L929进行细胞凋亡的检测。具体操作步骤如下:
在96孔板中加入100ul三倍梯度稀释的改进型阿达木单抗(RPMI-1640培养基含10%FBS稀释)(改进型阿达木单抗加入浓度依照FDA中提及阿达木此实验IC50分别上下3-5个梯度浓度),随后加入50ul终浓度为500pg/ml的rhTNF-α(RPMI-1640培养基含10%FBS稀释),室温孵育30min。向每孔加入50ulL929细胞5×104/孔,包含终浓度为1ug/ml的放线菌素-D。37℃培养箱孵育过夜培养(18-24h)。对照包括阴性对照和阳性对照,阴性对照只加入RPMI-1640及细胞,阳性对照只加入rhTNFα及细胞,rhTNFα浓度从2ng/ml到8.2pg/ml梯度。向每孔加入20μLCCK8溶液(注意不要在孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数)。将培养板在37℃培养箱内孵育1-4h。用酶标仪测定在470nm处的吸光度。若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10μL0.1M的HCL溶液或者1%w/vSDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定,吸光度不会发生变化。
计算抗体在不同浓度下的细胞杀伤率和IC50(阿达木的细胞毒性IC50值:1.25±0.01e-10M)
计算公式:改进阿达木处理细胞—TNF-α处理细胞/TNF-α细胞×100%
结果显示,本发明的改进型阿达木单抗与原始阿达木单抗相比,抑制TNF-α诱导的细胞毒作用相当(图5b)。
实施例6改进型阿达木单抗免疫原性评价
1.小鼠免疫实验
1)基础免疫:将抗原与福氏完全佐剂等体积混合并充分乳化,分点皮下注射,每只Balb/c小鼠每次注射量为100μg。
2)加强免疫:加强免疫采用抗原与福氏不完全佐剂的乳化液。
上述实验完成后进行ELISA检测试验,结果见表6。
表6:小鼠免疫原性评价实验
上述结果表明,本发明的10个改进型阿达木单抗同原始阿达木单抗相比,免疫原性得到了有效的降低。
2.抗体生物分布和药代试验
分别对原始阿达木及改进型阿达木进行抗体生物分布实验及药代试验,基本过程如下:
抗体生物分布:选取16只荷瘤裸鼠随机分为4组,每组4只。每只由尾静脉注射563.5kBq(100μL,2.5μg)125I-抗体,并于注射后2、4、8和24h,按组将实验裸鼠断颈处死,取血液及主要脏器和组织,称重并量放射性计数,计算各器官或组织的百分注射剂量率(%ID/g)。
表7:改进型阿达木抗体分布检测
药代分布试验:取5只BALB/c小白鼠,每只经尾静脉注射100μL125I-抗体(370kBq,2μg),分别于注射后不同时间点(5、12、30min,1、2、4、8、11、22、34、48、72h)眼眶取血,称重并用γ计数仪测量其放射性计数,计算每克血液百分注射剂量率(%ID/g)。采用GraphPrism软件进行分析,计算药代动力学参数。结果发现本发明的10个改进型阿达木单抗比原始阿达木单抗的半衰期长(图6)。
Claims (9)
1.一种低免疫原性抗TNF-α全人源单克隆抗体,其特征在于,在原始阿达木序列的轻链可变区和重链可变区的FR区进行氨基酸改造,降低其免疫原性,所述原始阿达木序列的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.23、24所示;
所述低免疫原性抗TNF-α全人源单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.11~15或SEQIDNO.23任一所示,重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.16~20任一所示。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体,其特征在于,其轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.13所示,其重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.19所示。
3.编码权利要求1~2任一所述单克隆抗体的基因。
4.含有权利要求3所述的基因的表达载体。
5.权利要求3所述的基因或权利要求4所述的表达载体在制备治疗以人TNF-α为靶标的疾病药物中的应用。
6.权利要求1~2任一所述单克隆抗体在制备治疗以人TNF-α为靶标的疾病药物中的应用。
7.权利要求1~2任一所述单克隆抗体在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于,所述的疾病为风湿性关节炎、红斑狼疮。
9.含有权利要求1~2任一所述单克隆抗体的药物或检测试剂。
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