CN103265631B

CN103265631B - 一种抗人crt单克隆抗体的重链和轻链可变区

Info

Publication number: CN103265631B
Application number: CN201310163559.1A
Authority: CN
Inventors: 陈丽华; 刘蓉蓉; 龚玖瑜; 金伯泉; 宋朝君
Original assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Current assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Priority date: 2013-05-07
Filing date: 2013-05-07
Publication date: 2015-07-08
Anticipated expiration: 2033-05-07
Also published as: CN103265631A

Abstract

本发明公开了一种抗人CRT单克隆抗体，用重组人CRT分子免疫BALB/c小鼠，制备一组小鼠抗人CRT单克隆抗体，并筛选出具有高亲和力的抗人CRT单克隆抗体FMMU-CRT-10。克隆该单克隆抗体轻链和重链可变区基因，获得该单克隆抗体轻链和重链可变区基因序列和氨基酸序列，确认这些基因序列与蛋白序列的惟一性。可变区的氨基酸序列以及编码这些可变区的基因序列在构建针对人CRT为靶点的对恶性肿瘤有治疗作用的单链抗体、嵌合抗体、人源化抗体或疫苗方面有重要的潜在应用价值。

Description

一种抗人CRT单克隆抗体的重链和轻链可变区

技术领域

本发明属于抗肿瘤技术领域，涉及一种抗人CRT单克隆抗体，特别涉及一种抗人CRT单克隆抗体（FMMU-CRT-10）的重链和轻链可变区。

背景技术

恶性肿瘤是危害人类健康的重大疾病，针对其的治疗手段目前仍处于研究和探索阶段。继传统的手术治疗、放疗、化疗和免疫治疗之后，以结合基因工程和蛋白质工程技术为代表的靶向抗体药物治疗正成为治疗肿瘤的新兴研究领域，受到基础医学和临床医学研究领域科研工作者的广泛关注。

CRT（钙网蛋白）是一种分子量为46kDa的内质网分子伴侣，它不仅存在于内质网中，还分布于细胞胞质区、胞膜表面以及细胞外基质等非内质网结构中，作为一个重要的调节分子参与机体伤口愈合、免疫反应、组织纤维化和肿瘤的发生、发展等生理和病理过程。CRT在白血病、非霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、脑癌、卵巢癌、胃癌、肝癌和肺癌等多种肿瘤细胞中广泛表达，且与肿瘤的侵袭性呈正相关（CRT表达水平越高，肿瘤的侵袭性越高）。作为一个促吞噬的信号，CRT可与吞噬细胞表面的受体低密度脂蛋白（LRP）相结合，促使靶细胞被吞噬。CRT能有效地提呈抗原，与抗原肽结合形成抗原提呈复合物。

有关CRT的抗肿瘤免疫研究表明，pcDNA3-CRT/E7真核表达质粒联合咪喹莫特治疗TC-1肿瘤鼠，可以有效地增强药物的抗肿瘤作用，并延长荷瘤小鼠的生存期；CRT疫苗可以有效地促进巨噬细胞和NK细胞的抗肿瘤作用。

目前针对CRT的抗体，国内商品化CRT抗体只有多抗，没有单抗。尽管国外公司有针对CRT分子的单抗，如Abcam公司的CRT单抗（货号ab83200），但其只能用于流式细胞术(1:100稀释)检测。

抗体单体分子是由两条相同的重链（H链）和两条相同的轻链（L链），通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。H链和L链包括氨基端（N）和羧基端（C），靠近N端的可变区（V区）由高变区/互补决定区（HVR/CDR）和骨架区（FR）组成；靠近C端为恒定区（C区）。重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）形成的蛋白质折叠是抗原结合部位，其中的CDR/HVR是抗体与抗原决定基互补结合的部位，C区引发抗原抗体识别后的反应。抗体根据FR/C区不同可分为人源、鼠源等，鼠源性抗体在人体内使用时具有免疫原性，易引起人体的免疫反应，这些免疫反应可引起对鼠源性抗体的清除以及免疫复合物介导的超敏反应。为了克服鼠源性抗体的缺陷，需要构建高亲和力的特异性的嵌合抗体、单链抗体或人源化抗体。

在构建人源化抗体过程中，采用噬菌体抗体库等技术获得的人源化抗体在使用过程中常常会出现亲和力不高、使用剂量大等问题。为获得具有较高亲和力的人源化抗体，常常需要改造具有良好特异性和亲和力的鼠源性亲本抗体。其常规策略为：克隆鼠源性抗体轻链和重链可变区基因，将可变区基因克隆入相应载体构建相应的基因工程抗体重组DNA，表达基因工程抗体来制备人源化抗体。因此，筛选出特异性分泌高亲和力鼠源性单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆，从中克隆出高亲和力抗体的重链和轻链可变区基因，分析其核苷酸和氨基酸序列对进一步构建高亲和力和特异性的人源化基因工程抗体具有决定性的意义。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种抗人CRT单克隆抗体，包括其核苷酸和氨基酸序列，为构建高亲和力的抗人CRT嵌合或人源化基因工程抗体提供支持。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种抗人CRT单克隆抗体，包括重链和轻链，所述轻链的可变区的3个互补决定区（CDR）序列为：

CDR1:Met-Thr-Cys-Ser-Ala-Arg-Ser-Ser-Val-Ile-Tyr；

CDR2：Ser-Ile-Ser；

CDR3:Gln-Gln-Trp-Ser-Ser-Ser-Pro-Pro-Arg-Arg；

所述重链的可变区的3个互补决定区（CDR）序列为：

CDR1:Gly-Tyr-Asn-Phe-Thr-Lys-Tyr-Gly；

CDR2:Ile-Asn-Thr-Asn-Thr-Gly-Glu-Pro；

CDR3:Thr-Arg-Leu-Gly-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp。

所述的单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

编码单克隆抗体轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.3所示，编码单克隆抗体重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

人CRT单克隆抗体在制备以人CRT为靶点的基因工程抗体或疫苗的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1、本发明所述的抗人CRT单克隆抗体被命名为FMMU-CRT-10，该抗体是具有高度特异性的抗人CRT单克隆抗体；经过间接ELISA和流式细胞术等检测证实单克隆抗体FMMU-CRT-10具有高效价，与人CRT分子具有很高的亲和力；而且与T细胞白血病细胞系Jurkat表面表达的CRT分子能够特异性的结合。

2、本发明克隆了单克隆抗体FMMU-CRT-10的轻链、重链可变区基因和氨基酸序列，序列分析证实了该抗体序列的惟一性。

3、与Abcam公司的CRT单抗（货号ab83200）相比，其只能用于流式细胞术(1:100稀释)检测，且检测结果显示其抗体亲和力没有本发明提供的CRT单抗FMMU-CRT-10高。而且本发明提供的单抗FMMU-CRT-10不仅可用于流式细胞术，还可以用于免疫组织化学和免疫印迹，具有更好的特异性、亲和力和更广泛的应用范围。

4、分别分析并获得了轻链和重链可变区的CDR，为构建高亲和力的抗人CRT嵌合或人源化基因工程抗体打下基础。

附图说明

图1为抗人CRT单克隆抗体FMMU-CRT-10与T细胞白血病细胞系Jurkat表面的CRT结合的流式细胞术检测结果图（FITC:异硫氰酸荧光素，横轴为细胞数，纵轴为荧光强度）；其中灰色填充图为抗葡萄球菌肠毒素D（SED）单克隆抗体对照图，黑色线图为FMMU-CRT-10单抗结果图。

图2为用免疫印迹法检测抗人CRT单克隆抗体FMMU-CRT-10结合抗原的能力。

图3-1为抗人CRT单克隆抗体FMMU-CRT-10检测T细胞白血病细胞系Jurkat石蜡切片中人CRT表达的免疫组织化学染色图；

图3-2为重组人CRT39-292分子组成示意图；

图4为FMMU-CRT-10单抗轻链可变区基因的同源性分析结果；

图5为FMMU-CRT-10单抗重链可变区基因的同源性分析结果；

图6为FMMU-CRT-10单抗轻链可变区氨基酸序列的同源性分析结果；

图7为FMMU-CRT-10单抗重链可变区氨基酸序列的同源性分析结果。

具体实施方式

本发明提供一种抗人CRT单克隆抗体，用重组CRT免疫Balb/c小鼠，制备了一组小鼠抗SEB的单克隆抗体，从中筛选出能稳定分泌高亲和力抗CRT的杂交瘤细胞株，制备腹水获得高亲和力抗CRTmAb；并确认该基因序列和相应蛋白序列的惟一性及其CDR序列；为抗CRT嵌合或人源化基因工程抗体提供支持。下面结合具体单克隆抗体的制备方法、抗体活性检测，以及序列的检测和唯一性的确定对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1小鼠抗人CRT高亲和力抗体的制备

1.1、单克隆抗体的制备、纯化重组人CRT39-292分子包含天然人CRT分子N端结构域39到197位氨基酸和部分P端结构域198-272位氨基酸，其氨基酸序列与天然人CRT分子39到272位氨基酸一致，结构如图3-2所示，序列：39-tc gttttaaagg gcccgcgcgttgccgccccc tcggcccgcc atgctgctat ccgtgccgct gctgctcggc ctcctcggcc tggccgtcgccgagcctgcc gtctacttca aggagcagtt tctggacgga gacgggtgga cttcccgctg gatcgaatccaaacacaagt cagattttgg caaattcgtt ctcagttccg gcaagttcta cggtgacgag gagaaagataaa-272

具体的该抗原来自苏州大学生物医学研究院。

按单克隆抗体制备方法（细胞和分子免疫学实验技术第一版，P9-P17），用重组人CRT免疫BALB/c小鼠（购自第四军医大学实验动物中心），初次免疫，使用福氏完全佐剂，后续免疫使用福氏不完全佐剂，每次间隔3周，均为皮下多点注射，共免疫4次。末次免疫7～10天后采血测其效价，检测免疫效果。间隔2～3周后，经腹腔注射抗原再加强免疫，3天后处死动物取脾进行细胞融合。

取对数生长的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0计数，同时制备免疫脾细胞悬液。将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10比例混合进行细胞融合。融合后细胞悬液加入含有饲养细胞（正常Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞）的96孔板，37℃、5%CO₂孵箱培养。待克隆出现后，间接ELISA检测，挑选阳性克隆。对含有阳性克隆孔的细胞采用有限稀释法进行克隆化，直至获得能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系（体外连续培养超过6个月）。

从杂交瘤细胞株FMMU-CRT-1～10中选择能分泌高亲和力的抗人CRT单克隆抗体，发现FMMU-CRT-10杂交瘤细胞株分泌的抗体具有较高的亲和力和与细胞表面天然表达的人CRT分子结合的能力。

在获得能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株后，按小鼠腹水制备方法制备包含单克隆抗体的腹水（细胞和分子免疫学实验技术第一版，P9-P17）。腹水经45%饱和硫酸铵沉淀后，采用QFF阴离子交换层析法纯化。用SDS-PAGE鉴定纯化抗体的纯度，纯化的FMMU-CRT-10纯度达到95%。

1.2、抗人CRT单克隆抗体效价测定实验

用IgG亚类检测试剂盒（美国Sigma公司）分别检测制备的FMMU-CRT-1～10单克隆抗体的IgG亚类，间接ELISA法（细胞和分子免疫学实验技术，第一版，P44-46）检测FMMU-CRT-1～10杂交瘤细胞株的腹水效价。

以重组人CRT为抗原，检测FMMU-CRT-1～10单克隆抗体在免疫印迹法（分子克隆实验指南，第二版，P888-P897）中结合抗原的能力。用流式细胞术（细胞和分子免疫学实验技术，第一版，P78-P89）检测FMMU-CRT-1～10单克隆抗体识别高表达人CRT的T细胞白血病细胞系Jurkat上天然CRT的能力。

腹水效价实验结果如表1所示，第1、2、6、8、10杂交瘤细胞株产生的腹水效价较高，分别为10^-6、10^-7、10^-6、10^-6和10^-6，表明其与抗原亲和力很高；将上述5株单克隆抗体用于免疫印迹实验均得到阳性结果；但仅第10株杂交瘤细胞株在流式细胞术检测中获得阳性结果，表明其能够识别细胞表面的天然CRT分子，利用其可变区制备的基因工程抗体更有可能与细胞表面的天然CRT结合并进一步发挥生物学作用。

表1人CRT单抗的效价鉴定

克隆号	亚类	腹水效价	流式细胞术	免疫印迹	免疫组化
						FMU-CRT.1	IgG1/k	10^-6	-	+	+
FMU-CRT.2	IgG1/k	10^-7	-	+	++
						FMU-CRT.3	IgG3/k	10^-5	-	-	-
FMU-CRT.4	IgG3/k	10^-5	+	-	+
						FMU-CRT.5	IgG1/k	10^-4	-	-	-
FMU-CRT.6	IgG1/k	10^-6	-	+	+
						FMU-CRT.7	IgG3/k	10^-4	-	-	-
FMU-CRT.8	IgG1/k	10^-6	-	+	-
						FMU-CRT.9	IgG1/k	10^-5	-	+	+
FMU-CRT.10	IgG1/k	10^-6	+	+	+

1.3、人CRT单克隆抗体FMMU-CRT-10与T细胞白血病细胞系Jurkat表面人CRT结合

采用间接免疫荧光染色法结合流式细胞术检测FMMU-CRT-10单抗与T细胞白血病细胞系Jurkat表面天然CRT分子的结合能力（细胞和分子免疫学实验技术，第一版，P78-80），以FMMU-CRT-10为一抗，FITC标记羊抗小鼠抗体为二抗，流式细胞仪分析。

检测结果如图1所示，与SED对照相比，FMMU-CRT-10单抗与高表达人CRT的T细胞白血病细胞系Jurkat结合能力明显增强，说明FMMU-CRT-10单抗特异性识别T细胞白血病细胞系Jurkat表面的CRT分子。

1.4、人CRT单克隆抗体FMMU-CRT-10与T细胞白血病细胞系Jurkat细胞裂解液中的CRT结合。

采用免疫印迹方法检测FMMU-CRT-10单抗与T细胞白血病细胞系Jurkat细胞裂解物中的CRT结合能力（细胞和分子免疫学实验技术，第一版，P53-55），以FMMU-CRT-10为一抗，HRP标记羊抗小鼠抗体为二抗，AlphaInnotech FluorChem FC2成像系统(Alpha Innotech,USA)分析。

检测结果如图2所示，与SED对照相比，FMMU-CRT-10单抗与高表达人CRT的T细胞白血病细胞系Jurkat结合能力明显增强，说明FMMU-CRT-10单抗特异性识别T细胞白血病细胞系Jurkat裂解液中的CRT分子。

1.5、抗人CRT单克隆抗体FMMU-CRT-10检测T细胞白血病细胞系Jurkat细胞系切片中人CRT的表达

以FMMU-CRT-10单克隆抗体为一抗，用免疫组织化学方法（病理学技术，第一版，P367-372）检测FMMU-CRT-10识别T细胞白血病细胞系Jurkat细胞系石蜡切片中人CRT的能力。

检测结果图3-1所示，细胞系石蜡切片由仓鼠卵巢细胞CHO和T细胞白血病细胞系Jurkat组成。图中CHO细胞不表达CRT作为阴性对照，胞浆胞膜未着色；FMMU-CRT-10识别Jurkat细胞表面的CRT分子，胞浆胞膜棕黄色为阳性。可见FMMU-CRT-10单克隆抗体可特异性识别T细胞白血病细胞系Jurkat表面的人CRT分子。

综上所述，FMMU-CRT-10单克隆抗体不仅能够特异性地与细胞表面的CRT分子结合，与组织中的CRT分子结合，还能识别细胞裂解液中的CRT分子，具有特异性。

2、人CRT mAb轻链和重链可变区基因的克隆

2.1FMMU-CRT-10杂交瘤细胞的培养

按常规方法复苏（细胞培养，第一版，P88）FMMU-CRT-10细胞，用含20%小牛血清的RPMI1640培养基于37℃，5%CO₂孵箱中培养。

2.2总RNA的提取和cDNA第一链的合成

用TRIZOL(购自美国invitrogen公司)试剂按说明书提取总RNA，cDNA第一链合成试剂盒购自Takara公司(日本)，按产品说明书进行反转录合成cDNA第一链。

2.3 PCR法扩增FMMU-CRT-10V _L和FMMU-CRT-10V _H基因

PCR法扩增试剂盒购自Takara公司，以cDNA第一链为模板进行PCR。反应体积50μl，反应条件为：95℃45s，55℃45s，72℃1min，循环35次；V_L、V_H的正、反向引物核苷酸序列分别为：

V_L F:gggga tatcc accat ggatt ttcaa gtgca gattt tcag

V_L B:gcgcc gtcta gaatt aacac tcatt cctgt tgaa

V_H F：tgagg agacg gtgac cgtgg tccct tggcc ccag

V_H B：aggts marct gcags agtcw gg

2.4 PCR扩增产物的克隆和筛选

PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，用小量胶回收试剂盒（购自美国Axygen公司）回收抗体重链和轻链可变区片段，用pMD19T试剂盒（购自日本Takara公司）将该片段按说明书插入pMD19T载体中。转化E.coliXL-10(购自北京中国普通微生物菌种保藏中心)，用EcoR Ⅰ和Hind III限制性核酸内切酶（购自Takara公司）消化法筛选重组阳性克隆（酶切得到750bp片段）。用双脱氧核酸末端终止法测定基因序列，由北京奥科生物技术有限责任公司完成，测定结果如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

3 FMMU-CRT-10轻链和重链可变区的氨基酸序列及同源性分析

3.1确定测序无误后，在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库中，进行核苷酸序列同源性分析（Blastn）。分析结果表明，FMMU-CRT-10单抗轻链可变区基因与小鼠免疫球蛋白κ链复合体6号染色体同源性最高，同源性为301/304，同源性百分比为99%，（如图4所示的BLASTN1）；FMMU-CRT-10单抗重链可变区基因与小鼠免疫球蛋白恒定区和部分可变区（strain129S1）同源性最高，同源性为264/270，同源性百分比为98%，(如图5所示的BLASTN2)。

3.2将可变区基因翻译成氨基酸序列，如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

在non-redundant Genbank CDS translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF蛋白质数据库中,进行氨基酸序列同源性分析（Blastp）。

分析结果表明，FMMU-CRT-10单抗轻链氨基酸序列与免疫球蛋白κ链可变区同源性最高，同源性为85/101，同源性百分比为84%，(如图6所示的BLASTN3)；FMMU-CRT-10单抗重链氨基酸序列与免疫球蛋白重链同源性最高，同源性为85/97，同源性百分比为88%(如图7所示的BLASTN4)。

编码FMMU-CRT-10单抗的轻链和重链可变区基因的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分析结果表明未发现与本发明相同的基因和蛋白质序列。

3.3利用IMGT/V-QUEST分析可变区结构，确定CDR区。

将测序所得FMMU-CRT-10抗体轻链和重链可变区序列，在IMGT/V-QUEST网站（http://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest）分析，得出其CDR区。

FMMU-CRT-10抗体轻链CDR区：

CDR1：Met-Thr-Cys-Ser-Ala-Arg-Ser-Ser-Val-Ile-Tyr

CDR2：Ser-Ile-Ser

CDR3：Gln-Gln-Trp-Ser-Ser-Ser-Pro-Pro-Arg-Arg

FMMU-CRT-10抗体重链CDR区：

CDR1：Gly-Tyr-Asn-Phe-Thr-Lys-Tyr-Gly

CDR2：Ile-Asn-Thr-Asn-Thr-Gly-Glu-Pro

CDR3：Thr-Arg-Leu-Gly-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp

4、基因工程抗体设计

基于抗人CRT单克隆抗体FMMU-CRT-10的表达、纯化以及序列分析，设计构建以下生物制品

（1）抗人FMMU-CRT-10单链抗体的构建

将本发明的单克隆抗体FMMU-CRT-10的轻链和重链可变区基因插入表达载体pCONTAB5E中，获得的单链抗体基因转化表达菌株，通过诱导该基因的表达，制备对恶性肿瘤有潜在治疗作用的单链抗体。

（2）人源化抗体的构建

将本发明的单克隆抗体FMMU-CRT-10轻链和重链可变区的CDR区移植到人源可变区的FR中，形成CDR移植抗体（CDR-grafted antibody）也称重构抗体（reshaping antibody）或人源化抗体（humanized antibody）。利用CDR移植技术改造抗体，可以获得保持鼠源性亲本mAb的特异性，同时更加接近人抗体的新型抗体，用于制备对恶性肿瘤有潜在治疗作用的人源化抗体。

（3）根据本发明的基因序列及其编码的氨基酸序列，制备针对人CRT功能表位的人鼠嵌合抗体、Fab抗体、疫苗或其他生物制品。

Claims

1.一种抗人CRT单克隆抗体，包括重链和轻链，其特征在于，所述轻链的可变区的3个互补决定区(CDR)序列为：

CDR1:Met-Thr-Cys-Ser-Ala-Arg-Ser-Ser-Val-Ile-Tyr；

CDR2：Ser-Ile-Ser；

CDR3:Gln-Gln-Trp-Ser-Ser-Ser-Pro-Pro-Arg-Arg；

所述重链的可变区的3个互补决定区(CDR)序列为：

CDR1:Gly-Tyr-Asn-Phe-Thr-Lys-Tyr-Gly；

CDR2:Ile-Asn-Thr-Asn-Thr-Gly-Glu-Pro；

CDR3:Thr-Arg-Leu-Gly-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp；

所述的单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

2.权利要求1所述的抗人CRT单克隆抗体在制备以人CRT为靶点的基因工程抗体或疫苗的应用。