CN101401939A - 预防和/或治疗免疫相关疾病的抗活化态t细胞抗体疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种预防和/或治疗免疫相关疾病的抗活化态T细胞抗体疫苗。它的活性成分是抗活化态T淋巴细胞和/或下述蛋白质或多肽中的至少一种的多克隆抗体或单克隆抗体：1)至少含有自GenBank Accession Number AAH03453的氨基末端的第21位－253位氨基酸残基的由calreticulin蛋白缺失得到的多肽；2)至少含有自GenBank Accession NumberP27773的氨基末端的第27位－250位氨基酸残基的由ERp57蛋白缺失得到的多肽；3)vimentin蛋白；4)calreticulin蛋白；5)ERp57蛋白。该疫苗可用于预防和/或治疗I型糖尿病、和/或系统性红斑狼疮、和/或多发性硬化症、和/或慢性乙型肝炎、和/或类风湿关节炎、和/或实验性脑脊髓炎和/或超敏反应性疾病等免疫相关疾病。

Description

预防和/或治疗免疫相关疾病的抗活化态T细胞抗体疫苗

技术领域

本发明涉及一种预防和/或治疗免疫相关疾病的抗活化态T细胞抗体疫苗。

背景技术

免疫系统通过多条渠道的正、负反馈调节将免疫应答控制在适当强度之内。这其中包括抗原、神经系统和内分泌系统的调节，但受到关注最多的而且也是至关重要的是调节性T细胞的调节。这种多渠道调节作用的有效整合确保实现免疫系统的自稳平衡。

T细胞是适应性免疫应答的核心，也是免疫调节的主要靶点。许多免疫性疾病源自T细胞活化或者调控的异常。这些疾病包括自身免疫疾病、过敏性疾病等。自身免疫病是一类多发的严重危害人体健康的疾病，已经发现的人类自身免疫病共有80余种。在许多自身免疫病的形成过程中，T细胞都扮演重要角色，以T细胞为靶点的免疫治疗是现代免疫治疗的重要发展方向。常见自身免疫病发生和治疗以及相应动物模型的建立都与T细胞在体内对免疫调节的影响密切相关。

系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)是典型的抗体介导的自身免疫病。东方人和黑人育龄妇女发病率最高，约为0.1％。在我国，这一疾病近年来呈明显的上升趋势，几乎已经成为育龄妇女的常见病。SLE的主要特点是多克隆淋巴细胞的非特异性活化。患者在活动期的主要临床表现为关节疼痛，发烧，面部红斑，血尿、蛋白尿，白细胞贫血，血沉加快，高丙种球蛋白血症等。DNA、核蛋白、红细胞、白细胞、血小板等均成为自身免疫反应的靶抗原。血液中含有大量的核蛋白、DNA以及其它自身抗原(如红细胞表面抗原等)的抗体以及抗原-抗体复合物。免疫病理以抗DNA抗体在皮下、关节和肾小球基底膜等处沉积造成炎症反应为主。也有学说认为抗DNA抗体能够与肾小球基底膜等处的胶原蛋白发生交叉反应。对于红斑狼疮的发病来说，自身抗体的产生是导致疾病发生的主要原因，而在自身抗体产生的过程中，除了B细胞以外，T细胞同样发挥着重要的作用。红斑狼疮T细胞存在着非常复杂的严重缺陷，其中包括T细胞共刺激分子异常、T细胞信号传导异常、T细胞凋亡异常、细胞因子产生异常以及自身反应性T细胞的产生。每种异常对于T细胞的活化、功能发挥以及消亡都起着非常重要的作用，同时也严重地影响了自身抗体的产生。

为研究红斑狼疮的发病机制所建立的BXSB小鼠动物模型中，成年雄性动物80％发病，雌性动物则较少发病，其自身免疫现象与人SLE十分相似。发病动物血清中有高水平的抗核抗体和抗双链DNA抗体并伴有自身免疫性贫血现象，晚期出现肾小球肾炎。

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是以另一种常见的自身免疫性病，该病以慢性进行性关节滑膜以及关节软骨坏损为特征，影响了全世界人口的1％。发病年龄一般在40-50岁，女性的发病率是男性的3-4倍；绝大多数病人的血液中都有高水平的RF因子(针对自体IgG的IgM抗体)。患病早期，关节肿胀、疼痛并伴有功能障碍。关节滑膜炎症使其变得肥厚、皱褶，并有淋巴细胞浸润，关节软骨遭到破坏。重症者晚期的慢性进行性炎症导致关节软骨坏损和关节畸形。

用完全佛氏佐剂(CFA)皮下免疫LEWS大鼠可诱导全身关节的炎症性病变。其特征与人的RA非常类似，包括关节滑膜的中性粒细胞和单核细胞浸润，关节软骨的损伤造成关节变形以至完全失去功能。用病鼠的Th细胞过继转移可以造成受体鼠引发同样的病变，而血清过继转移则无此作用，这也是T细胞调节作用影响自身免疫病进程的又一个证明。

治疗自身免疫病的最佳方案当然是帮助机体恢复应有的自身免疫耐受状态，但晚期自身免疫病多涉及多个自身抗原，而且诱导免疫耐受的方法尚不成熟，这一目标目前尚难以实现。现行治疗方案主要着眼于控制患者的炎症反应，比较常用的有非特异性阿司匹林类药物(NSAIDs)和糖皮质激素。去除血清中的自身抗体或者免疫复合物、置换血浆也有一定的短期疗效。细胞毒性抗癌药或者淋巴器官放射线照射(清除自身免疫性T和B淋巴细胞)对某些晚期重症自身免疫病患者有一定疗效。用环孢素A能够较特异地抑制T细胞，用抗T和B细胞单克隆抗体有可能达到抑制T和B细胞活性的目的，但是这类治疗有时会造成继发性免疫缺陷。

自身免疫病是免疫应答失调而对自身抗原产生过度反应以至导致造成机体损伤的现象，超敏反应是宿主对外来或者自身抗原的过度免疫应答而引起炎症反应的现象。在本质上两者的发病机制是一致的。超敏反应分为四型，I型超敏反应是个别宿主对某些环境抗原(变应原)发生正性反应的结果，通常由IgE和肥大细胞介导，以黏膜下肥大细胞的迅速激发为主要特征。II型和III型超敏反应由IgM和/或IgG介导，前者导致细胞及结缔组织的损伤，而后者以免疫复合物沉积为主。虽然这些超敏反应的免疫损伤是由抗体介导的，但超敏状态的形成和维持却依赖于Th细胞。与依赖于抗体介导的超敏反应不同，IV型超敏反应由T淋巴细胞介导，由于此型超敏反应在抗原攻击后48小时才出现反应，又称为迟发型超敏反应。其核心是CD4和/或CD8阳性效应T细胞在识别靶抗原后所造成的以淋巴细胞浸润为主要病理特征的炎症损伤，这类疾病至少有下列几种表现形式：接触性皮炎、结核菌素反应、肉芽肿。慢性自身免疫性肝炎的本质也是IV型超敏反应。

目前的观点认为，正常机体内本身就存在微弱的调节性的抗T细胞免疫应答，T细胞免疫只是大增强了已有的免疫应答的水平。其中调节性T细胞的作用已得到较为全面的论述，但有关T细胞疫苗(TCV)诱导调节性体液免疫应答的研究较少。

国内外研究均证明，TCV诱导了抗T细胞的体液免疫反应。TCV免疫动物后，可明显抑制T细胞增生，阻止自身免疫疾病或诱导同种移植物的存活期延长；在动物血清中检测到抗TCV抗体(IgG)存在。体外实验证明，TCV免疫后血清对同一克隆T细胞具有强烈的抑制作用。吸收实验结果表明，这些抗体具有TCV特异性，能差异性识别活化T细胞和正常淋巴细胞。用针对人II型胶原的特异性T细胞系给DBA/IJ小鼠接种，能诱发小鼠对关节炎的抵抗力，并发现在小鼠血清中还存在一种抗独特型抗体，能与针对人II型胶原的自身抗体起反应。在Lewis大鼠中，T细胞疫苗也诱导出了几种同基因型T细胞起反应的自身抗体。T细胞疫苗免疫后，体内自然存在的体液网络的反应得到加强。研究还表明，Lewis大鼠从EAE疾病恢复的过程也与抗T细胞抗体的产生有关。在体外，患实验性变态反应性脑脊髓膜炎(EAE)后和疫苗注射后的血清都可强烈抑制同基因T细胞克隆的增殖，其抑制作用由抗体介导并呈现部分补体依赖性；在体内，两种血清均可改善EAE的症状。从Epstein-Barr Virus(EBV)转染TCV免疫多发性硬化症(MS)病人的B细胞克隆得到抗T细胞抗体。

关于TCV免疫后抗体的作用研究较少，但目前研究已证明活化T细胞免疫后宿主可产生抗细胞表面活化分子抗体，用针对人II型胶原的特异性T细胞系给BDA/IJ小鼠接种，能诱发小鼠对关节炎的抵抗力，并发现在小鼠血清中还存在一种抗独特型抗体，能与针对人II型胶原的自身抗体起反应。在Lewis大鼠中，T细胞疫苗也诱导出了与几种同基因型T细胞蛋白起反应的自身抗体。T细胞免疫后，体内自然存在的体液网络的反应得到加强。研究还表明，Lewis大鼠从EAE疾病恢复的过程也与抗T细胞抗体的产生有关。在体外，患EAE后和疫苗注射后的血清都可强烈抑制同基因T细胞克隆的增殖。这一抑制作用由抗体介导并呈现部分补依赖性，在体内，两种血清均可改善EAE的症状。

确定这些抗活化态T细胞抗体所识别的靶蛋白并对其功能加以研究，有助于加深对TCV的免疫调节机制的认识。免疫蛋白组学的出现，使系统分析TCV诱发的体液免疫应答成为可能。

Western blotting是鉴定免疫原性蛋白的经典方法，而通常所用的Western blotting和免疫共沉淀技术很难确认靶分子的本质；但二者结合产生一门新的技术-免疫蛋白组学，应用此项技术能够鉴定出所有的免疫原性蛋白，讫今为止已成功应用于微生物苗的筛选及鉴定肿瘤抗原等，这种技术特别适用于复杂生物样品的分析。

发明内容

本发明的目的是提供一种预防和/或治疗免疫相关疾病的疫苗。

本发明所提供的预防和/或治疗免疫相关疾病的疫苗，它的活性成分是由活化态T细胞和/或下述蛋白质或多肽中的至少一种作为免疫原得到的多克隆抗体或单克隆抗体：

本发明所提供的预防和/或治疗免疫相关疾病的疫苗，它的活性成分是下述a)和/或b)的多克隆抗体或单克隆抗体；

所述a)为抗活化态T细胞的多克隆抗体或单克隆抗体；

所述b)为抗下述1)-7)中的蛋白质或多肽中的至少一种的多克隆抗体或单克隆抗体：

1)氨基酸序列是自GenBank Accession Number AAH03453的氨基末端的第21位-253位氨基酸残基的calreticulin多肽；

2)是将由自GenBank Accession Number AAH03453的氨基末端的第1至416位氨基酸残基组成的calreticulin蛋白自氨基末端的第416位氨基酸残基开始，向氨基末端连续缺失0至163中任意整数个氨基酸残基得到的164个多肽或蛋白质之一；

3)是将由自GenBank Accession Number AAH03453的氨基末端的第1至416位氨基酸残基组成的calreticulin蛋白自氨基末端的第1位氨基酸残基开始，向羧基末端连续缺失1至20中任意整数个氨基酸残基得到的20个多肽或蛋白质之一；

4)氨基酸序列是自GenBank Accession Number P27773的氨基末端的第27位-250位氨基酸残基的ERp57多肽；

5)是将由自GenBank Accession Number P27773的氨基末端的第1至505位氨基酸残基组成的ERp57蛋白自氨基末端的第505位氨基酸残基开始，向氨基末端连续缺失0至255中任意整数个氨基酸残基得到的256个多肽或蛋白质之一；

6)是将由自GenBank Accession Number P27773的氨基末端的第1至505位氨基酸残基组成的ERp57蛋白自氨基末端的第1位氨基酸残基开始，向羧基末端连续缺失1至26中任意整数个氨基酸残基得到的26个多肽或蛋白质之一；

7)氨基酸序列是自GenBank Accession Number P20152氨基末端的第1位-466位氨基酸残基的vimentin蛋白。

上述a)和/或b)的多克隆抗体或单克隆抗体均可按照现有的方法制备，其中的单克隆抗体可用培养杂交瘤细胞的方法获得。

本发明预防和/或治疗免疫相关疾病的疫苗的作用机理是这些抗体可抑制T细胞活化，这些抗体对T细胞有抑制作用，实验表明这种作用可能是通过抗体识别靶分子，影响T细胞表面免疫突触等微观结构形成，从而干扰相应下游信号转导来实现的。主动免疫该疫苗，其活性成分可以激活免疫调节系统，发挥预防和/或治疗免疫相关疾病的作用。

实验证明抗氨基酸序列是自GenBank Accession Number AAH03453的氨基末端的第21位-253位氨基酸残基的calreticulin多肽(名称为calreticulin-1)的抗体、抗氨基酸序列是自GenBank Accession Number P27773的氨基末端的第27位-250位氨基酸残基的ERp57多肽(名称为ERp57-1)的抗体和抗vimentin全长蛋白的抗体以及抗活化态T细胞的抗体都可抑制T细胞活化。用这四种抗体中的任一种或其任意组合免疫机体，可抑制迟发型超敏反应，可预防和/或治疗I型糖尿病、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、慢性乙型肝炎、类风湿关节炎、实验性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalitis，EAE)和超敏反应性疾病等免疫相关疾病。

因为上述2)的164个多肽或蛋白质免疫动物后，都会产生针对氨基酸序列是自GenBankAccession Number AAH03453的氨基末端的第21位-253位氨基酸残基的calreticulin多肽的抗体；上述3)的20个多肽或蛋白质免疫动物后，都会产生针对氨基酸序列是自GenBankAccession Number AAH03453的氨基末端的第21位-253位氨基酸残基的calreticulin多肽的抗体；上述5)的256个多肽或蛋白质免疫动物后，都会产生针对氨基酸序列是自GenBank Accession Number P27773的氨基末端的第27位-250位氨基酸残基的ERp57多肽的抗体；上述6)的26个多肽或蛋白质免疫动物后，都会产生针对氨基酸序列是自GenBankAccession Number P27773的氨基末端的第27位-250位氨基酸残基的ERp57多肽的抗体；所以上述2)、3)、5)、6)的蛋白质或多肽作为免疫原得到的抗体可预防和/或治疗上述免疫相关疾病。

所述活化态T细胞是用特异抗原或有丝分裂原或抗原呈递细胞(APC)活化T细胞获得的。

现有的能使静止的T淋巴细胞转化成T淋巴母细胞的有丝分裂原均可用于活化T细胞，如刀豆蛋白A(ConA)、植物凝集素(PHA)等。

为了提高免疫效果，该疫苗中还可含有常规的免疫佐剂，如铝佐剂(Al(OH)₃)、蜂胶、壳聚糖。

本发明的疫苗可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

本发明以活化T细胞作为疫苗诱导BALB/c小鼠产生抗活化态T细胞抗体。结合二维电泳、Western blot及蛋白质组学，找到抗活化态T细胞特异性识别的靶分子，用流式细胞术、ELISA、Western blot对上述抗体、蛋白进行鉴定。用细胞ELISA证实抗活化态T细胞抗体靶分子在活化态T细胞表面的表达。并通过抗T细胞抗体过继转移，观察其对小鼠迟发性超敏反应的影响。实验结果表明通过T细胞免疫可以在小鼠体内诱导相应的抗T细胞抗体。抗活化态T细胞血清识别的活化态T细胞靶分子是钙网蛋白(calreticulin)，ERp57，波形蛋白(vimentin)等。以上述分子的重组蛋白作为抗原免疫小鼠，可以诱导产生高水平的特异性抗体。体内实验中，过继抗活化态T细胞抗体的小鼠迟发性超敏反应受到抑制，应用这一方法可通过对免疫调节功能的影响实现预防/治疗超敏反应或自身免疫性疾病。

附图说明

图1为人外周血中的CD4+CD25+T细胞的流式细胞数分析结果

图2为活化的OVA-T细胞的流式细胞术纯度鉴定结果

图3为活化态OVA-T细胞免疫小鼠血清的ELISA测定结果

图4A为流式细胞术分析活化态OVA-T细胞与活化态OVA-T细胞免疫小鼠血清以及静息态OVA-T细胞免疫小鼠血清结合情况的结果

图4B为流式细胞术分析静息态OVA-T细胞与活化态OVA-T细胞免疫小鼠血清以及静息态OVA-T细胞免疫小鼠血清结合情况的结果

图4C为流式细胞术分析用ConA活化的小鼠脾细胞与活化态OVA-T细胞免疫小鼠血清以及静息态OVA-T细胞免疫小鼠血清结合情况的结果

图4D为流式细胞术分析用抗CD3抗体活化的小鼠脾细胞与活化态OVA-T细胞免疫小鼠血清以及静息态OVA-T细胞免疫小鼠血清结合情况的结果

图5A为活化态OVA-T细胞与活化态OVA-T细胞免疫小鼠血清结合情况的激光共聚焦显微镜照片

图5B为活化态OVA-T细胞与静息态OVA-T细胞免疫小鼠血清结合情况的激光共聚焦显微镜照片

图5C为静息态OVA-T细胞与活化态OVA-T细胞免疫小鼠血清结合情况的激光共聚焦显微镜照片

图5D为静息态OVA-T细胞与静息态OVA-T细胞免疫小鼠血清结合情况的激光共聚焦显微镜照片

图6为Western blot检测免疫小鼠血清识别靶的抗原

图7为活化态OVA-T细胞的总蛋白的双向电泳图谱

图8为ATV-S血清与活化态OVA-T细胞蛋白的Western blot结果

图9为RTV-S血清与活化态OVA-T细胞蛋白的Western blot结果

图10为用ESI-MS/MS鉴定出的CRT蛋白的部分肽段氨基酸序列图

图11为ATV-S血清对重组calreticulin-1、Vimentin和ERp57-1的识别

图12为细胞ELISA检测活化态T细胞表面Calreticulin、Vimentin和ERp57的表达结果

图13A为用ERp57-1通过ELISA检测正常人血清中抗ERp57-1抗体的结果

图13B为用ERp57-1通过ELISA检测慢性乙型肝炎患者血清中抗ERp57-1抗体的结果

图14A为用calreticulin-1通过ELISA检测正常人血清中抗calreticulin-1抗体的结果

图14B为用calreticulin-1通过ELISA检测慢性乙型肝炎患者血清中抗calreticulin-1抗体的结果

图15A为用Vimentin通过ELISA检测正常人血清中抗Vimentin抗体的结果

图15B为用Vimentin通过ELISA检测慢性乙型肝炎患者血清中抗Vimentin抗体的结果

图16A为用ERp57-1通过ELISA检测RA或SLE患者血清中抗ERp57-1抗体的结果

图16B为用calreticulin-1通过ELISA检测RA或SLE患者血清中抗calreticulin-1抗体的结果

图16C为用Vimentin通过ELISA检测RA或SLE患者血清中抗Vimentin抗体的结果

图17A为用calreticulin-1通过ELISA检测BXSB小鼠血清中抗calreticulin-1抗体的结果

图17B为用ERp57-1通过ELISA检测BXSB小鼠血清中抗ERp57-1抗体的结果

图17C为用Vimentin通过ELISA检测BXSB小鼠血清中抗Vimentin抗体的结果

图18为ATV-S血清对T细胞的抑制作用

图19为anti-Erp57、anti-CRT或anti-Vimentin抑制T细胞增殖结果

图20A为OVA免疫小鼠产生的抗OVA抗体的水平

图20B为calreticulin-1单独免疫或calreticulin-1、ERp57-1和Vimentin混合免疫小鼠产生的抗calreticulin-1抗体的水平

图20C为ERp57-1单独免疫或calreticulin-1、ERp57-1和Vimentin混合免疫小鼠产生的抗ERp57-1抗体的水平

图20D为Vimentin单独免疫或calreticulin-1、ERp57-1和Vimentin混合免疫小鼠产生的抗Vimentin抗体的水平

图21为calreticulin-1、ERp57-1和Vimentin免疫造成BALB/c小鼠的免疫抑制

图22为过继转移抗T细胞抗血清抑制迟发型超敏反应

图23为抗T细胞抗血清过继转移对大鼠关节炎的预防作用

具体实施方式

现代免疫学理论认为，免疫调节主要是由具有调节功能的T细胞及其所分泌的细胞因子来完成的。本发明的发明人在研究T细胞疫苗(TCV)的免疫原性过程中发现，体内存在着能够特异识别活化态T细胞的抗体，而且这些针对活化态T细胞的自身抗体具有重要的免疫调节功能。通过TCV可以有效地诱导(激发)调节性抗T细胞抗体的应答，起到干预免疫应答过程的效果。

首先建立了针对小鼠卵清蛋白特异的T细胞系，活化后作为疫苗免疫BALB/c小鼠，诱导针对活化态T细胞的体液免疫应答，并在不同的时间点取血，制备抗血清。通过细胞ELISA、流式细胞仪、激光扫描共聚焦显微术及SDS-PAGE、Western blot等方法证实被免疫动物血清中含有抗活化态T细胞抗体，并能在体外实验中抑制T细胞的增殖，其识别靶抗原主要集中在45-93KD范围。接着运用二维电泳分离活化态T细胞蛋白，作Western blot分析，标出抗活化态T细胞血清所识别的蛋白位置，与经考马斯亮染色2-D胶比对，将胶上对应的点取下，胰酶消化，质谱分析并经数据库搜索，确定了抗活化态T细胞抗体所识别的靶蛋白为calreticulin(CRT)、ERp57和vimentin，分析TCV诱导的体液免疫反应，确定抗活化态T细胞抗体所识别的靶蛋白是什么，并如何与之相互作用调控T细胞活化。用重组表达的CRT、vimentin和ERp57作为抗原，经Western blot检测证明了以上结果的正确性。体外细胞增殖抑制实验表明CRT、ERp57、vimentin的特异性抗体可以抑制T细胞的活化。用重组CRT、ERp57和vimentin免疫小鼠不仅诱导出了相应的抗体产生，而且观察到了被免疫小鼠免疫功能的显著改变。本发明研究结果显示，针对活化态T细胞的自身抗体构成免疫调节的重要组成部分，发挥重要的免疫调节作用。通过TCV或者用重组蛋白进行主动免疫可以激活这一调节系统，发挥预防和/或治疗免疫相关疾病的作用。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的实验材料：OVA为来源于BALB/c小鼠的卵清蛋白(III级，购自Sigma)。

实施例1、本发明的预防和/或治疗免疫相关疾病的疫苗的作用机理

一、抗活化态T细胞抗体所识别的靶蛋白为calreticulin(CRT)、ERp57和vimentin

在研究TCV诱导的免疫调节机制的过程中，人们对TCV诱导的调节性T细胞应答有了较为深入的了解，但对TCV诱导的特异性体液应答(即抗体)知之甚少。在本发明中，用来源于BALB/c小鼠的卵清蛋白(OVA)特异性T细胞系作为疫苗免疫同品系小鼠，发现TCV能够诱导针对活化态T细胞的体液免疫应答。这一结果揭示了抗T细胞调节性抗体的存在，为今后对调节性抗T细胞抗体(regulatory anti-T-cell Abs)的研究奠定了基础，也为通过这一途径治疗免疫相关疾病提出了新的策略和方法。

1、OVA特异性T细胞系的建立

用来源于BALB/c小鼠的卵清蛋白皮下免疫BALB/c小鼠，取引流淋巴结细胞，在体外用OVA反复刺激，建立了H-2^d限制的OVA特异性T细胞系(OVA-T)。所获得的抗原特异性T细胞经活化后可作为TCV用来免疫小鼠，进行TCV诱导免疫应答的研究。具体方法如下：

浓度为2mg/mL的来源于BALB/c小鼠的卵清蛋白(OVA，III级，购自Sigma)溶液与完全弗氏佐剂(CFA，购自(Sigma))按1∶1的体积比充分混合后，免疫6-8周雌性BALB/c(H-2^d)小鼠，100μg OVA/每只，于小鼠尾根部皮下免疫，免疫7-10天后杀鼠，取腹股沟和主动脉旁淋巴结，不锈钢筛网上研磨，并用PBS洗二次，然后计数并重悬于完全RMP1 1640培养基(Hyclone)中，得到淋巴细胞悬液。每孔2×10⁶个淋巴细胞置于24孔板(每孔2ml)，并加入OVA，终浓度至100μg/ml，37℃，5％CO₂培养，进行第一轮刺激。培养7-10天后，进行第二轮刺激，第二轮刺激7-10天后，再进行第三轮刺激，依此类推，进行新一轮的刺激，并测定细胞对OVA的特异性反应。第一轮刺激不加饲养细胞，以后每轮刺激时，每孔加3×10⁶个经2000radγ射线照射后的同系小鼠脾细胞作为作为饲养细胞，同时加入OVA(100μg/ml)及rIL2(北京瑞得合通药业有限公司)(20U/ml)，刺激抗原特异性T细胞活化增殖。

按照如下方法测定每轮OVA刺激细胞对OVA的特异性反应：将新一轮刺激前的T细胞，加入96孔平底培养板，2.5×10⁴个/孔，同时加入4×10⁵个经2000radγ射线照射后的同系小鼠脾细胞作为饲养细胞及OVA(100μg/ml)，以不加抗原作为阴性对照，37℃，5％CO₂培养72小时，终止培养前8小时掺入H³-TdR，0.2μCi/孔；用96孔道收集器将细胞收集到玻璃纤维滤纸，WALLACβ2counter测定放射活性结果表明第3~8轮OVA刺激的淋巴细胞对OVA的特异性最佳。

为保证用于免疫的T细胞的质量，结合淋巴细胞分层液分层及磁珠分选的办法，得到高纯度的T细胞，具体方法如下：第3-8轮OVA刺激的淋巴细胞在刺激三天后，收集细胞于15ml EP管内，2000rpm，离心3min；弃上清，加5mlPBS，平铺于5ml小鼠淋巴细胞分层液上，2000rpm，室温，20min，吸取白色云雾层狭窄带，PBS洗二次，末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640(Hyclone)，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞，计算出活细胞百分率。

结果表明活细胞百分率在95％以上。

对得到的T细胞用PE-抗CD25抗体(美国BD公司)，抗CD3抗体进行检测，结果表明其中活细胞接近99％(图2)，获得了H-2^d限制的OVA特异性T细胞系(OVA-T)。高纯度的T细胞确保了小鼠内的免疫反应是由T细胞所诱导产生，保证了所构建的2-D图谱中没有来自其他细胞蛋白的污染。

2、TCV诱导抗活化态T细胞抗体的动力学

在上述步骤1的OVA特异性T细胞系过程中，由加入饲养细胞及抗原刺激开始第三天后T细胞作为活化态OVA-T细胞，之后半量换液，并半量补充IL-2维持至第5-7天作为静息态OVA-T细胞。

将雌性、6-8周龄的BALB/c小鼠随机分成三组，试验组、对照组和正常组，每组10只。实验组用活化态OVA-T细胞尾根部皮下免疫(2×10⁶个细胞/每只，该2×10⁶个细胞用200μlPBS重悬)，对照组用同等数量的静息态OVA-T细胞免疫。正常组小鼠不进行免疫。每两周加强免疫一次，共加强免疫5次，分别于第一次免疫后2、4、6、8、10周取血，收集血清，通过T细胞-ELISA方法检测其中抗T细胞抗体的滴度。具体方法如下：收集活化态OVA-T细胞，调细胞浓度为2×10⁵个/ml，100μl/孔，即2×10⁴/孔，加入96孔酶标板中，离心，1500rpm，2min，弃上清；1∶200稀释待检血清及对照血清，100μl/孔加于酶标板中，每个稀释度做三个重复孔，4℃60min每孔加200μl PBS-T(含0.5％吐温的磷酸盐缓冲液(0.5M pH7.2))，震荡后，静置30s，离心，1500rpm，2min，弃上清控干。洗涤后每孔加入1∶3000稀释的酶标兔抗小鼠IgG-HRP(北京中杉)100μl，4℃，60min。洗涤后，各孔加入OPD显色液100μl，混匀，室温反应5-10min。50μl/孔1M H₂SO₄，终止反应，492nm酶标仪读数。结果如图3所示，实验组(活化态OVA-T细胞免疫)在初次免疫2周后开始产生抗活化态T细胞IgG抗体，加强免疫后该抗体滴度进一步增高，至第6周达到平台，具有典型的再次应答的特征。静息态T细胞免疫组小鼠的血清与活化态T细胞以及静息态T细胞均没有明显的结合。图3中，ATV-S为活化态OVA-T细胞免疫小鼠血清，RTV-S为静息态OVA-T细胞免疫小鼠血清，NMS为正常鼠血清。在下面的描述中，将用活化态OVA-T细胞免疫雌性、6-8周龄的BALB/c小鼠获得的抗血清简称为ATV-S，静息态OVA-T细胞免疫雌性、6-8周龄的BALB/c小鼠获得的抗血清简称为RTV-S。

3、流式和免疫荧光法分析抗T细胞抗体与T细胞的结合

为了进一步确认TCV诱导抗体与T细胞的特异性结合，用间接免疫荧光法结合流式细胞记数仪(FACS)对抗血清与T细胞的结合情况做了进一步的分析。

取小鼠脾细胞终浓度2*10⁶个/mL，加入ConA终浓度5μg/ml或抗CD3抗体5μg/ml，37℃，5％CO₂，培养48小时，得到ConA活化的小鼠脾细胞、抗CD3抗体活化的小鼠脾细胞。

用PBS将活化态OVA-T细胞、静息态OVA-T细胞、ConA活化小鼠脾细胞和抗CD3抗体活化小鼠脾细胞的细胞浓度调整为1×10⁶个/ml；分别取1ml细胞悬液加入15ml EP管中，1500rpm，5min；加入1∶20(PBS稀释)一抗(ATV-S或RTV-S)，4℃30min；用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右，1500rpm，5min；弃上清，加入50μl工作浓度的FITC标记一抗(ATV-S或RTV-S)，4℃，30min；用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1500rpm，5min；加适量固定液，FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存(5～7天)。双标记检测细胞表型时，加入FITC标记抗体的同时加入针对另一靶抗原的PE标记的抗体。FCM结果如图4A-4D所示，ATV-S与活化态T细胞的结合明显地强于RTV-S。激光共聚焦显微镜观察结果(图5A-5B)与FACS分析一致，ATV-S与活化态OVA-T细胞的样品中可看见绿色荧光，而RTV-S与活化态OVA-T细胞的样品中看不见绿色荧光；ATV-S与静息态OVA-T细胞的样品中看不见绿色荧光，RTV-S与静息态OVA-T细胞的样品中也看不见绿色荧光。为了排除TCV免疫血清只能识别OVA-T细胞的可能性，用ConA及抗CD3抗体活化的小鼠脾细胞作为靶细胞重复上述实验，得到了同样的结果，说明OVA-T诱导产生的抗体并非只针对OVA-T细胞，而是具有广泛的代表性。

4、抗活化态T细胞抗体识别靶点的鉴定

T细胞的活化伴随着表面分子的变化，例如，开始出现CD25、CD26、CD30、CD69、CD70、胰岛素受体和转铁蛋白受体等新的分子，CD2、CD27及CD44等分子的表达也会明显升高。这些分子是否会成为抗T细胞抗体的靶分子？抗T细胞抗体是否会通过这些分子来调节T细胞的功能？对这些问题的答案有重要的理论和应用意义。在下面的实验中，通过WesternBlot、免疫共沉淀和免疫蛋白质组学等方法对抗T细胞抗体所识别的靶抗原进行鉴定和分析。

(1)Western blot鉴定ATV-S血清识别的靶抗原

首先用Western blot法检测ATV-S和RTV-S血清识别T细胞抗原的情况，具体方法如下：取5×10⁷个上述活化态OVA-T细胞，PBS洗三遍，去上清，加入1ml蛋白提取液，超声破碎细胞，2mw/5s/次，共3次，15000g离心，30分钟，收集上清即为总蛋白。上述活化态OVA-T细胞的总蛋白，进行凝胶浓度T为12％、交联度C为％的SDS-PAGE，分别以正常雌性、6-8周龄的BALB/c小鼠血清、活化态OVA-T细胞免疫雌性、6-8周龄的BALB/c小鼠获得的抗血清(ATV-S)，静息态OVA-T细胞免疫雌性、6-8周龄的BALB/c小鼠获得的抗血清(RTV-S)和OVA免疫雌性、6-8周龄的BALB/c小鼠获得的抗血清(OVA-S)为一抗，进行Western blot。结果表明ATV-S与活化态T细胞的分子量为45-93kD的蛋白有明显的结合，而RTV-S血清则基本无反应(图6)。图6中，M为蛋白质分子量标准，1为正常雌性、6-8周龄的BALB/c小鼠血清，2为RTV-S，3为ATV-S，4为OVA-S。

(2)鉴定抗T细胞抗体所识别的靶分子

上述的Western blot结果并不能确认抗血清所识别的靶分子。为实现这一目的，有必要通过免疫蛋白质组学的手段加以分析。其主要流程是先用二维电泳将T细胞蛋白进行分离，随后通过Wester blot来鉴定抗血清所能够特异识别的蛋白质斑点，再配以质谱测序，鉴定出抗体所识别的靶分子。

提取上述活化态OVA-T细胞的总蛋白，进行双向电泳。其中，第一向等电聚焦电泳采用的是pH3-10，分离范围7cm的IPG胶条，上样量1mg/胶条；第二向SDS-PAGE电泳使用的是凝胶浓度T为12％、交联度C为2.9％的SDS-PAGE，每次三块胶，其中一块用于考马斯亮兰染色，另二块作用于转膜，作Western blotting检测。该活化态OVA-T细胞的总蛋白的双向电泳图谱如图7所示，图7中，1为Calreticulin，5为Vimentin，7为ERp57。

用ATV-S及RTV-S血清与转至NC膜上的活化态OVA-T细胞蛋白反应，作Western blot检测确定其中的免疫原性蛋白，作blot之前膜先用丽春红染色，标出具有特征性的点(如边界、染色较深的点)当坐标，以辅助定位。由于本法是用2-D blot与胶比对，与传统的两块2-D胶比对不同，且膜上的点较少、清听，所以并未用专门的匹配软件。而是用考马斯亮兰染色的2-D胶作母板，将丽春红染色及2-D blot结果在图形处理软件Photoshop上叠加，同时参考1-D blot结果(靶蛋白分子量大小)，确定2-D blot有反应的点在胶上的定位，并标以数字。图8和图9代表了四次独立实验的结果。

将图8和图9中所鉴定的特异性蛋白斑点从胶上取下，进行电喷雾电离串联质谱(ESI-MS/MS)分析，所有测定均在正离子方式下进行，雾化气体为氮气，碰撞气体为氩气，源温80℃，锥孔电压50V，TOF加速电压为0.2kV，MCP检测器电压为2.7kV，当进行LC-ESI-MS/MS自动分析时，毛细管电压为3000V。测定结果仪器以peaklist文件形式给出，通过Mascot软件(http://www.matrixscience.com)检索NCBI数据库鉴定蛋白质点，并得到部分肽片段序列。结果列于表1。图10为用ESI-MS/MS鉴定出的CRT蛋白的部分肽段氨基酸序列图。

为保证结果的可靠性，对Calreticulin、Vimentin和ERp57蛋白点进行了MALDI-TOF-MS肽指纹图分析。MALDI-TOF-MS分析采用反射模式，正离子谱测定，离子源加速电压20KV，飞行管长2.5m，反射电压比1.12，N2激光波长337nm，脉冲宽度3ns，离子延迟提取100ns，真空度4×10^-7Torr，质谱信号单次扫描累加50次，使用胰蛋白酶自降解峰m/z842.50和m/z 2211.10作为内校正，获得肽质量指纹图谱(PMF)。Mascot软件检索NCBI数据库鉴定蛋白质。

表1ATV-S识别靶蛋白

由表1中的结果来看，抗T细胞抗体所识别的靶分子并不包括已知的“T细胞活化分子”，如CD2、CD27、CD44、CD25、CD26、CD30、CD69、CD70、胰岛素受体和转铁蛋白受体等。Calreticulin、Vimentin和ERp57并非T细胞特异蛋白，它们的表达谱广泛。这一发现揭示了T细胞活化与调节的新的规律。

(3)质谱结果的进一步确认

为确认上述质谱分析结果的可靠性，表达了氨基酸序列是自GenBank Accession NumberAAH03453的氨基末端的第21位-253位氨基酸残基CRT N端片段(名称为calreticulin-1)，氨基酸序列是自GenBank Accession Number P27773的氨基末端的第27位-250位氨基酸残基的ERp57片段(名称为ERp57-1)及全长的Vimentin重组蛋白(自GenBankAccession Number P20152的氨基末端的第1位-466位氨基酸残基)。

获取calreticulin、ERp57、vimentin蛋白质序列和mRNA序列，再使用DNAstar或Vector NTI Advance等生物学软件进行引物设计，并对其引物参数进行评估，加上酶切位点和保护碱基，合成上游引物和下游引物。其中，用于扩增calreticulin-1的引物为：5’-cgc ggatcc atc tat ttc aaa gag cag ttc ttg-3’和5’-ccc aagctt

cca gtcctc agg ctt ctt agc atc-3’，用于扩增ERp57-1的引物为：5’-cgc ggatcc gtg ttg gaactg acg gac gaa aac ttc-3’和5’-ccc aagctt

atc ttc cgt cat atg agg aca gag-3’，用于扩增Vimentin的引物为：5’-cgc ggatcc atg tct acc agg tct gtg tcc tcgtct tcc t-3’和5’-ccc aagctt

tta ttc aag gtc atc gtg atg ctg aga agt c-3’(上述引物中带下划线的碱基为酶切位点，斜体字为附加的终止密码子)。从蛋白表达较高的C57小鼠T细胞系EL4细胞中提取总RNA，分别利用上述引物进行RT-PCR获取目的片段，将目的片段的PCR产物与分别与pGEM-T载体连接，测序结果表明calreticulin-1的PCR产物具有自GenBank Accession Number BC003453.1的5′末端的第97位-795位核苷酸序列，ERp57-1的PCR产物具有自GenBank Accession Number NM_007952.2的5′末端的第216位-887位核苷酸序列，全长的Vimentin的PCR产物具有自GenBank Accession NumberNM_011701.3的5′末端的第481位-1881位核苷酸序列，将calreticulin-1的PCR产物、ERp57-1的PCR产物和全长的Vimentin的PCR产物分别插入pET28a载体的BamH I和HindIII位点间，得到重组表达载体pET28a-calreticulin-1、pET28a-ERp57-1和pET28a-Vimentin。pET28a-calreticulin-1、pET28a-ERp57-1和pET28a-Vimentin分别转化BL21(DE3)大肠杆菌，挑单克隆，IPIG诱导表达；Ni-NTA柱阳离子亲和层析纯化，Pd10Sephadex G25脱盐柱脱盐；测定浓度，纯度鉴定，分装并于-80℃保存备用。经过上述过程，获得90％以上纯度的重组蛋白，其浓度经测定最高可达5mg/mL，产量每升菌可达10-20mg。表达的蛋白经N末端氨基酸序列测定，证实它们分别为重组表达calreticulin-1(自GenBank Accession Number AAH03453的氨基末端的第21位-253位氨基酸残基)、全长的Vimentin重组蛋白(自GenBank Accession Number P20152的氨基末端的第1位-466位氨基酸残基)和ERp57-1(自GenBank Accession Number P27773的氨基末端的第27位-250位氨基酸残基)。

将重组表达的calreticulin-1、全长的Vimentin重组蛋白和ERp57-1经SDS-PAGE电泳后转到NC膜上，以ATV-S抗血清为第一抗体进行Western Blotting，结果在预期的分子量位置上出现了特异的条带(图11)，ATV-S抗血清与重组表达的calreticulin-1在30kD得到杂交条带，ATV-S抗血清与全长的Vimentin重组蛋白在57kD得到杂交条带，ATV-S抗血清与ERp57-1在27kD得到杂交条带；RTV-S血清与calreticulin-1、全长的Vimentin重组蛋白和ERp57-1均无杂交条带。图11中，泳道2、6、9为Vimentin，3、5、8为calreticulin-1重组蛋白，1、4、7为无关对照蛋白。这一结果证明了ATV-S血清中确实含有calreticulin-1、Vimentin特异性抗体。

5、Calreticulin，Vimentin，Erp57在活化T细胞膜表面的表达

由于calreticulin，Erp57和vimentin等均是胞内蛋白。CRT和ERp57在内质网中作为分子伴侣起作用，ERp57与CRT形成复合物参与T细胞的活化。而Vimentin是细胞骨架蛋白。这些蛋白是否真的会出现在活化态T细胞的表面？运用了高灵敏度的细胞-ELISA法确认了这些蛋白在活化态T细胞膜表面的表达。具体方法如下：将细胞作为抗原(4×105个/孔)离心包被在ELISA板上，2％牛血清白蛋白37℃封闭2小时，以抗全长calreticulin抗体(Anti-CRT)(Santa Crutz)，抗全长ERp57抗体(Anti-ERp57)(Santa Crutz)，抗全长vimentin抗体(anti-vimentin)(Santa Crutz)为一抗，37℃孵育1小时，HRP偶联抗IgG作为二抗，37℃孵育1小时，加入显色液显色并适时终止。

结果如图12所示，与对照anti-goat IgG(图中以goat IgG表示)相比，抗全长calreticulin抗体，抗全长ERp57抗体，抗全长vimentin抗体对活化态T细胞有较明显的识别，表明calreticulin，Erp57和vimentin在活化态T细胞膜表面表达。

综上所述，TCV主动免疫诱导产生了针对CRT、ERp57及Vimentin的特异性IgG抗体。这些抗体与T细胞膜上相应的靶分子相互作用，通过影响自身反应性T细胞膜的流动性、膜受体的重新分布、免疫突触的形成、细胞活化信号的传导、穿过血管内皮细胞进入靶器官的能力等方面发挥免疫调节作用，同时还可能间接增强了调节性T细胞的功能。

二、血清抗T细胞抗体滴度与T细胞相关疾病的关系

如果抗T细胞抗体是免疫调节机制的重要组成部分，在发生T细胞过度活化以及T细胞相关疾病的情况下，应该能够发现抗T细胞抗体滴度的变化。本着这一设想，本发明开发了CRT、ERp57和Vimentin特异性抗体检测ELISA试剂盒，并用其测定了慢性乙型肝炎患者、类风湿关节炎患者和SLE患者的血清抗体。

1、试剂盒的组成

试剂盒的组成以calreticulin-1、ERp57-1或vimentin包被的酶标板为主，还含有抗HRP标记的人或者小鼠IgG、常规ELISA检测用的各种试剂溶液：洗涤液、底物溶液和终止液。

其中，calreticulin-1，ERp57-1或vimentin重组蛋白按照如下方法包被酶标板：用包被液(0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液)将calreticulin-1，ERp57-1或vimentin重组蛋白分别稀释成0.1-1μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育2h，4℃过夜，倾去包被缓冲液，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入含5％脱脂牛奶的0.05M磷酸盐缓冲液250μl，37℃温育1-2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

底物液：OPD 0.6mg/mL。

洗涤液：含0.05％吐温的磷酸盐缓冲液(0.05M pH7.2)。

显色液：0.2M Na2HPO4 25.7mL，0.1M柠檬酸24.3mL，混合用超纯水稀释一倍。

终止液：1mol/L硫酸。

检测时，在酶标板小孔中加入50μl待测血清(用洗涤液稀释)，覆上盖板膜于18℃-30℃放置1h，用洗涤液洗酶标板3次，用吸水纸拍干，之后用洗涤液稀释配置酶标抗体溶液(0.1mg/L)并加入酶标板小孔中，30℃放置30min，再用洗涤液洗酶标板3次，拍干，取100μl底物液加入酶标板小孔后混匀，避光显色约15min，最后每孔加入终止液(1mol/L硫酸)100μl，用酶标仪测定492nm处的OD值。

2、检测慢性乙型肝炎患者血清

用含有ERp57-1包被的酶标板的试剂盒对44名健康献血员以及95位HBV慢性感染者的血清中针对ERp57-1的IgG抗体进行了比较。其中，以44例健康献血员血清的OD492nm的平均值±2SD为参考值，该参考值为0.283±0.016(平均值±2SD)，小于该参考值的血清为阴性血清，大于该参考值的血清为阳性。结果表明健康人血清中抗ERp57-1抗体均为阴性(少数为临界)(图13A)，而HBV患者80％为阳性(图13B)。图13B中，每一个柱为一个HBV患者血清。

用含有calreticulin-1包被的酶标板、vimentin包被的酶标板的试剂盒对44名健康献血员以及95位HBV慢性感染者的血清中针对calreticulin-1和vimentin的抗体也进行了比较。其中，以44例健康献血员血清的OD492nm的平均值±2SD为参考值，calreticulin-1包被的酶标板检测中，该参考值为0.279±0.019，小于该参考值的血清为阴性血清，大于该参考值的血清为阳性；vimentin包被的酶标板检测中，该参考值为0.281±0.017，小于该参考值的血清为阴性血清，大于该参考值的血清为阳性。结果表明健康人血清中抗calreticulin-1和抗vimentin抗体阳性者约为10％，而HBV患者70％为阳性(图14A、14B、15A和15B)。图14B和图15B中，每一个柱为一个HBV患者血清。

3、检测类风湿关节炎(RA)患者和系统性红斑狼疮(SLE)患者的血清抗体

又比较了RA和SLE患者血清中针对calreticulin-1，ERp57-1和vimentin抗体的水平，每种抗原各检测20名患者。结果如图16A、16B和16C所示，表明RA患者中抗ERp571抗体、抗calreticulin-1抗体和抗vimentin抗体阳性率分别为100％、65％、45％；SLE患者中抗ERp57-1抗体、抗calreticulin-1抗体和抗vimentin抗体阳性率分别为85％、40％、80％。图16A、16B和16C中，左侧20例为SLE患者血清，右侧20例为RA患者血清，N10为十位健康人混合血清。

4、与自身免疫小鼠的相关性

BXSB小鼠是人SLE的模型动物，雄性动物成年(4月龄)后开始发病，6月龄时80％以上发病。利用上述试剂盒按照上述方法比较了不同性别、不同年龄BXSB小鼠的抗calreticulin-1、ERp57-1和vimentin血清抗体。其中，试剂盒中包被的calreticulin-1、ERp57-1和vimentin的浓度均为2μg/ml。每种抗体检测实验中，每种性别每种月龄的小鼠各10只。如图17A、17B和17C所示，2月龄小鼠血清中针对三种蛋白的自身抗体水平均偏低，而6月龄小鼠血清中针对三种蛋白的自身抗体水平均有明显升高，而且雄性小鼠的抗ERp57-1和抗vimentin抗体水平明显高于雌性动物，与自身免疫病的发生呈正相关。图17A、17B和17C中，2m为2月龄小鼠，6m为6月龄小鼠，抗体的滴度1/100、1/200、1/400、1/800分别表示待测血清稀释100倍、200倍、400倍和800倍。

三、抗T细胞抗体免疫调节作用的体外和体内实验

用TCV诱导抗T细胞抗体的实验已如前述。这些抗体是否具有免疫调节功能？通过体外(T细胞增殖抑制实验)和体内实验来检测针对T细胞、CRT、ERp57、vinmentin等抗体发挥免疫调节作用的能力。

1、TCV抗血清抑制T细胞活化

在T细胞增殖实验中，将RTV-S和ATV-S抗血清加入新一轮刺激的BALB/c小鼠OVA-T细胞培养液中，用³H掺入法观察OVA-T细胞的增殖情况。具体方法如下：OVA-T细胞以4×10⁵/孔加入96孔细胞培养板，分成5组，每组3个平行孔，每组加入OVA作为抗原进行刺激，同时分别加入PBS、RTV-S、ATV-S、ATV-S+IL-2和正常小鼠IgG等于37℃培养箱培养72小时。培养结束前6小时每孔掺入0.2μCi³H-TdR，以β-counter液闪仪检测³H-TdR掺入值。结果如图18所示，ATV-S血清对OVA-T的活化有显著的抑制作用，在稀释度为1∶100时可达60％左右。如先用Protein A/G-Sepharose与血清反应去除其中的IgG，则抑制作用明显下降，说明在其中起作用的是抗体而不是细胞因子等。如在培养体系中加入IL-2(50U)则可逆转血清对T细胞增殖的抑制作用。图18中，RTV-S表示抗静息T细胞血清与细胞共孵育，PBS表示PBS免疫血清与细胞共孵育，ATV-S表示抗活化T细胞血清与细胞共孵育，IgG表示抗小鼠IgG作为对照抗体与细胞共孵育，ATV-S+IL-2表示抗活化T细胞血清与细胞共孵育的同时加入IL-2。

2、CRT，Vimentin和ERp57特异性抗体的免疫抑制作用

为了检测抗全长calreticulin抗体(Anti-CRT)，抗全长Erp57抗体(anti-ERp57)和抗全长vimentin抗体(anti-vimentin)是否具有调节T细胞功能，在使用抗原刺激BALB/c小鼠T细胞增殖的同时，加入不同稀释度的anti-ERp57(Santa Crutz)、anti-CRT(SantaCrutz)或anti-Vimentin(Santa Crutz)，后用³H掺入法检测T细胞增殖以观察相应抗体对T细胞活性的影响。具体方法如下：OVA-T细胞以4×10⁵/孔加入96孔细胞培养板，分成5组，每组3个平行孔，每组加入OVA作为抗原进行刺激，同时分别加入不同浓度的上述抗体和对照抗体于37℃培养箱培养72小时。培养结束前6小时每孔掺入0.2μCi³H-TdR，以β-counter液闪仪检测³H-TdR掺入值。结果显示，这三种抗体在5μg/ml时对T细胞均有明显的抑制作用(图19)，抑制能力大小依次为anti-CRT，anti-ERp57，anti-vimentin。这些抗体对于CD3及ConA诱导的BALB/c小鼠脾细胞增殖亦有明显的抑制作用。

3、calreticulin-1、ERp57-1和全长vimentin的免疫原性

既然用TCV可以诱导针对CRT、ERp57和vimentin的抗体，用相应分子的重组蛋白进行主动免疫是否也可以诱导特异性(自身)抗体的产生？如此诱导产生的抗体是否具有免疫调节作用？

浓度为2mg/mL的来源于BALB/c小鼠的卵清蛋白(OVA，III级，购自Sigma)溶液与完全弗氏佐剂(CFA，购自(Sigma))按1∶1的体积比充分混合后，免疫10只6-8周雌性BALB/c(H-2^d)小鼠，于小鼠尾根部皮下免疫，第一次免疫后第14天和第28天各加强免疫一次，每次免疫的剂量均为100μg OVA/每只。

将40只6-8周雌性BALB/c(H-2^d)小鼠均分为4组，每组10只，第一组免疫calreticulin-1SDS-PAGE胶，第二组免疫ERp57-1SDS-PAGE胶，第三组单独免疫全长vimentinSDS-PAGE胶，第四组免疫按等质量混合的calreticulin-1SDS-PAGE胶、ERp57-1SDS-PAGE胶和全长vimentin SDS-PAGE胶。将含有重组蛋白calreticulin-1、ERp57-1和全长vimentin的SDS-PAGE胶磨碎后分别与CFA按1∶1的体积比充分混合后，尾根部皮下免疫6-8周雌性BALB/c(H-2^d)小鼠，第一次免疫后第14天和第28天各加强免疫一次，第一、二、三组免疫小鼠的每次免疫的剂量均为100μg SDS-PAGE胶/每只，第四组免疫小鼠的每次免疫的剂量均为100μg SDS-PAGE胶/每只。

分别取第一次免疫后0、7、14、21、28、35、42、49、56、110、114、118天的抗血清用上述试剂盒按照上述ELISA方法测定OD492nm。

结果如图20A、20B、20C和20D所示，表明calreticulin-1、ERp57-1和全长vimentin等三种重组蛋白或者其片段重复免疫BALB/c小鼠，成功诱导出了针对这三种蛋白的自身抗体。从三种蛋白免疫原性的比较来看，calreticulin-1最强，ERp57-1次之，vimentin最差。后者在第二次加强免疫后2周才出现较强的IgG应答。观察至初次免疫118天后，血清抗体水平仍维持在较高的平台期，各组动物均无任何明显的不健康的表现或者症状。图20A、20B、20C和20D中，CEV表示calreticulin-1、ERp57-1和全长vimentin混合免疫小鼠血清；图20A中，OVA表示OVA免疫小鼠血清；图20B中，C表示calreticulin-1免疫小鼠血清；图20C中，E表示ERp57-1免疫小鼠血清；图20D中，V表示vimentin免疫小鼠血清。

4、calreticulin-1、ERp57-1和全长vimentin主动免疫所诱导的免疫调节效应

如上所述，用靶抗原进行主动免疫同样可以诱导出针对活化态T细胞表面抗原的抗体(图20B、20C和20D)。这些抗体的存在是否会对动物的免疫状态产生影响？是否会在一定程度上抑制宿主的细胞免疫应答？

BALB/c小鼠经calreticulin-1、ERp57-1和全长vimentin三次免疫后产生高滴度的血清抗体，然后再用外来抗原-钥孔戚血蓝素(Keyhold limpet Hemocyanin，KLH)进行皮下致敏，7天后足底皮下KLH攻击，12-48小时后测量足底的肿胀程度以衡量其迟发型超敏反应(细胞免疫)的情况。结果表明三种抗原的免疫均使动物的细胞免疫应答能力受到了一定的抑制，再一次证明针对这些抗原的抗体分子具有重要的免疫调节作用(图21)。图21中，CK表示calreticulin-1免疫小鼠再经KLH攻击，EK表示ERp57-1免疫小鼠再经KLH攻击，VK表示vimentin免疫小鼠再经KLH攻击，3K表示上述三种蛋白混合免疫小鼠再经KLH攻击，OK表示OVA免疫小鼠再经KLH攻击，PK表示PBS免疫小鼠再经KLH攻击，NK表示未经免疫小鼠再经KLH攻击，PBS表示阴性对照，即未经KLH激发；纵坐标标题中“左-右”表示左右足底肿胀差异。

5、抗T细胞抗体免疫调节作用的体内实验

图21所示的实验虽然证明了用三种蛋白进行主动免疫可以影响机体的细胞免疫状态，但是并不能排除这是通过T细胞介导的可能性。在此基础上完成了抗血清过继转移实验。即首先将ATV-S、RTV-S以及三种蛋白免疫所获得的抗血清过继转移给健康BALB/c小鼠，然后用KLH致敏并攻击，以观察抗T细胞抗体在体内实验中的免疫调节功能。图22的结果证明了这些抗体的免疫治疗作用。图22中，KC表示经KLH初次免疫后过继抗calreticulin-1血清，KE表示经KLH初次免疫后过继抗ERp57-1血清，KV表示经KLH初次免疫后过继抗vimentin血清，K3表示经KLH初次免疫后过继抗上述三种蛋白混合血清，KAT表示经KLH初次免疫后过继抗活化T血清，KRT表示经KLH初次免疫后过继抗静息T血清，KO表示经KLH初次免疫后过继抗OVA血清，KN表示经KLH初次免疫后过继正常小鼠血清，KLH表示阳性对照，即试验中未过继任何血清，PBS表示阴性对照，即未经KLH激发；纵坐标标题中“左-右”表示左右足底肿胀差异。

实施例2、本发明疫苗的免疫预防和免疫治疗作用

1、对CIA的治疗

用CFA在Lews大鼠诱导关节炎(AIA)，三次免疫之后过继转移OVA免疫大鼠血清(OVA)(以OVA为免疫原，常规方法免疫Lews大鼠得到的抗血清)、vimentin免疫大鼠血清(以全长vimentin为免疫原，常规方法免疫Lews大鼠得到的抗血清)、ERp57-1免疫大鼠血清(以ERp57-1为免疫原，常规方法免疫Lews大鼠得到的抗血清)、calreticulin-1免疫大鼠血清(以calreticulin-1为免疫原，常规方法免疫Lews大鼠得到的抗血清)、RTV-S大鼠血清(除免疫动物为Lews大鼠外，其制备方法同RTV-S BALB/c小鼠血清)和ATV-S大鼠血清(除免疫动物为Lews大鼠外，其制备方法同ATV-S BALB/c小鼠血清)，随后足底攻击，此后15天内观察膝关节炎的表现并打分，打分标准为：正常为零分，出现红斑为1分，同时有红斑和关节肿大为2分，丧失功能/病情蔓延为3分，总分为四肢总和(Soluble IL-15 Receptora-Chain Administration Prevents Murine Collagen-Induced Arthritis：A Role forIL-15in Development of Antigen-Induced Immunopathology.The Journal of Immunology，1998，160：5654-5660.)结果如图23所示，calreticulin-1免疫血清、ERp57-1免疫血清、全长vimentin免疫血清和OVA免疫血清比较，calreticulin-1免疫血清、ERp57-1免疫血清、全长vimentin免疫血清具有明显的治疗作用。图23中，A为calreticulin-1免疫血清和OVA免疫血清结果；B为ERp57-1免疫血清和OVA免疫血清结果；C为全长vimentin免疫血清和OVA免疫血清结果。

2、对EAE的预防

取35只C57BL/6雌性2月龄小鼠(18-22克)，随机分配到5个组，每组7只。第1-4组分别静脉注射抗血清，包括正常鼠血清(NMS)、vimentin免疫血清(以全长vimentin为免疫原，常规方法免疫C57BL/6小鼠得到的抗血清)、ERp57-1免疫血清(以ERp57-1为免疫原，常规方法免疫C57BL/6小鼠得到的抗血清)、calreticulin-1免疫血清(以calreticulin-1为免疫原，常规方法免疫C57BL/6小鼠得到的抗血清)、RTV-S血清(除免疫动物为C57BL/6小鼠外，其制备方法同RTV-S BALB/c小鼠血清)和ATV-S血清(除免疫动物为C57BL/6小鼠外，其制备方法同ATV-S BALB/c小鼠血清)；剂量为150μL/每只。第5组为阴性对照组，即没有转移血清，也没有进行EAE的诱导。第1-4组用包括百日咳毒素处理和MOG肽/CFA免疫的方法诱导EAE。诱导后16天观察症状并记分。其中0分为无症状，1分为尾部无力，2分为中度前肢或后肢无力，3分为重度前肢或后肢无力，4分为肢体麻痹、人为翻转不能恢复，5分为重症发病或者死亡。由表2的结果可以看出，除了NMS和RTV-S没有明显的预防作用之外，其他4种抗T细胞抗体均有明显的预防EAE发生的作用。

表2抗血清过继转移治疗EAE

Claims (6)

1、一种预防和/或治疗免疫相关疾病的疫苗，它的活性成分是下述a)和/或b)的多克隆抗体或单克隆抗体；

所述a)为抗活化态T细胞的多克隆抗体或单克隆抗体；

所述b)为抗下述1)-7)中的蛋白质或多肽中的至少一种的多克隆抗体或单克隆抗体：

1)氨基酸序列是自GenBank Accession Number AAH03453的氨基末端的第21位-253位氨基酸残基的calreticulin多肽；

2)是将由自GenBank Accession Number AAH03453的氨基末端的第1至416位氨基酸残基组成的calreticulin蛋白自氨基末端的第416位氨基酸残基开始，向氨基末端连续缺失0至163中任意整数个氨基酸残基得到的164个多肽或蛋白质之一；

3)是将由自GenBank Accession Number AAH03453的氨基末端的第1至416位氨基酸残基组成的calreticulin蛋白自氨基末端的第1位氨基酸残基开始，向羧基末端连续缺失1至20中任意整数个氨基酸残基得到的20个多肽或蛋白质之一；

4)氨基酸序列是自GenBank Accession Number P27773的氨基末端的第27位-250位氨基酸残基的ERp57多肽；

5)是将由自GenBank Accession Number P27773的氨基末端的第1至505位氨基酸残基组成的ERp57蛋白自氨基末端的第505位氨基酸残基开始，向氨基末端连续缺失0至255中任意整数个氨基酸残基得到的256个多肽或蛋白质之一；

6)是将由自GenBank Accession Number P27773的氨基末端的第1至505位氨基酸残基组成的ERp57蛋白自氨基末端的第1位氨基酸残基开始，向羧基末端连续缺失1至26中任意整数个氨基酸残基得到的26个多肽或蛋白质之一；

7)氨基酸序列是自GenBank Accession Number P20152氨基末端的第1位-466位氨基酸残基的vimentin蛋白。

2、根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述多克隆抗体或单克隆抗体为下述A)、B)和C)三种抗体中的至少一种：

A)抗氨基酸序列是自GenBank Accession Number P20152氨基末端的第1位-466位氨基酸残基的vimentin蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体；

B)抗氨基酸序列是自GenBank Accession Number AAH03453的氨基末端的第1至416位氨基酸残基的calreticulin蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体；

C)抗氨基酸序列是自GenBank Accession Number P27773的氨基末端的第1至505位氨基酸残基的ERp57蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体。

3、根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述多克隆抗体或单克隆抗体为下述D)和E)两种抗体中的至少一种：

D)抗氨基酸序列是自GenBank Accession Number AAH03453的氨基末端的第21位-253位氨基酸残基的calreticulin多肽的多克隆抗体或单克隆抗体；

E)抗氨基酸序列是自GenBank Accession Number P27773的氨基末端的第27位-250位氨基酸残基的ERp57多肽的多克隆抗体或单克隆抗体。

4、根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述活化态T淋巴细胞通过特异抗原或有丝分裂原或抗原呈递细胞活化T淋巴细胞获得。

5、根据权利要求1或2或3或4所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗中还含有佐剂。

6、根据权利要求1或2或3或4所述的疫苗，其特征在于：所述免疫相关疾病为I型糖尿病、和/或系统性红斑狼疮、和/或多发性硬化症、和/或慢性乙型肝炎、和/或类风湿关节炎、和/或实验性脑脊髓炎和/或超敏反应性疾病。

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