CN114106188B - 靶向二硫化物异构酶a3的纳米抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体及其应用。靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体的氨基酸序列包括互补决定区。结合说明书具体实施例部分的数据，Biacore检测结果表明本发明的两种靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体与ERp57蛋白的亲和力均在纳摩尔水平，具有较高的亲和力。由此可以看出，本发明的靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体相对于传统的抗体具有更高的亲和力。

Description

靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体及其应用
技术领域
本发明涉及免疫学或分子生物学技术领域，尤其是涉及一种靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体及其应用。
背景技术
蛋白二硫化物异构酶A3(protein disulfide isomerase-associated 3，PDIA3)，又名ERp57、ERp60、GRP58 和 1,25D3-MARRS，由PDIA3基因编码，ERp57属于蛋白质二硫键异构酶 (protein disulfide isomerase，PDI)家族成员，具有氧化还原和蛋白质二硫化物异构酶活性，最早发现其为葡萄糖耗竭诱导的细胞应激后表达上调的应激反应蛋白，由于具有KDEL内质网（endoplasmic reticulum，ER)定位序列，起初被认为只定位于内质网。后来研究发现其可以是从活化的血小板中分泌或表达于血小板表面。在血小板聚集、致密颗粒分泌、纤维蛋白原结合、钙动员和血栓形成中也发挥着至关重要的作用。例如，抗ERp57抗体可以以浓度依赖的方式抑制CRP-XL（胶原蛋白受体GPVI的配体）引起的血小板聚集，同时减少致密颗粒的分泌。抗ERp57抗体可通过抑制粘附和整合素介导的信号通路来减少激光损伤诱导的血栓形成。此外，ERp57也存在于内皮细胞、心血管细胞的表面，与细胞的迁移、分化和氧化还原稳态相关。随着越来越多的证据揭示了PDI在心血管细胞中的作用，开发靶向PDI抑制剂用来治疗血栓形成相关的疾病研究也越来越多。尽管如此，临床上目前尚无具有真正特异性靶向硫醇异构酶的抑制剂。因此，可以通过调节血小板表面ERp57的功能来调控止血和血栓形成。通过筛选出靶向ERp57的高亲和力分子（携带激活或抑制分子，或本身具有激活或抑制功能的分子）来调控血栓的形成意义重大。
近年来，免疫疗法掀起了肿瘤治疗领域的重大革命，在抗肿瘤治疗上展示出了令人鼓舞的效果，但由于肿瘤细胞、基质细胞、浸润免疫细胞以及细胞外基质形成了高度复杂的肿瘤免疫抑制微环境，限制了免疫疗法在实体瘤中的响应。肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage，TAM)是一种最丰富的肿瘤浸润白细胞，且一般表现为M2抗炎表型。越来越多的研究表明，M2在肿瘤进展中起关键作用，例如促进肿瘤血管生成，保护肿瘤细胞对化疗耐药，促进肿瘤细胞生长和转移，抑制免疫细胞毒性T细胞的反应等。大量证据表明，实体瘤中M2的丰度与疾病的不良预后和对治疗抵抗相关。鉴于他们的在肿瘤中具有强大的免疫抑制作用，M2有望用于诊断和预后生物标志物，以及治疗各种癌症的靶点。目前，靶向巨噬细胞的治疗策略主要包括限制单核细胞募集至肿瘤微环境、清除M2型巨噬细胞、促进巨噬细胞吞噬活性或诱导M2巨噬细胞重编程为M1型。然而，目前尚未有很好的靶向M2型巨噬细胞的策略。
最新研究发现M2型巨噬细胞表面特异性表达ERp57，该研究通过体内噬菌体展示技术筛选到能特异性结合ERp57的9个氨基酸短肽CSSTRESAC，并进一步发现该短肽与ERp57结合后能促进M2型巨噬细胞表达促炎细胞因子。最后用CSSTRESAC靶向修饰携带自杀基因的腺病毒进行M2型巨噬细胞靶向清除，发现具有显著的抑瘤作用，表明ERp57作为M2型巨噬细胞靶向的可行性。然而，由于短肽通常与目的蛋白的亲和力有限，存在脱靶的风险，因此，迫切需要筛选出能与ERp57高亲和的分子。
此外，ERp57还具有作为肿瘤免疫原性死亡（immunogenic cell death，ICD）靶点的潜力。ICD是一种免疫相关的调控性死亡模式，其可以激发而非抑制机体T细胞针对正在发生死亡的癌细胞的免疫反应，主要特征是引起癌细胞大量转位或释放免疫刺激分子，也即发生肿瘤细胞损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）反应，这个过程中ERp57会与钙网蛋白（calreticulin，CRT）一起从内质网转位至肿瘤细胞膜表面。目前已发现多种化疗药物如阿霉素（adriamycin）、蒽环类药物（anthracyclines）、表阿霉素（epirubicin）、米托葱醌（mitoxantrone，MTX）和奥沙利铂（oxaliplatin，OXP）等均能诱导肿瘤ICD产生。另外，光热治疗（photothermal therapy，PTT）、光动力疗法（photodynamic therapy, PDT）和放疗等肿瘤治疗方法也可诱导ICD的发生。大量研究表明ICD能够显著提升免疫检测点抑制剂（immune checkpoint blockade，ICB）的疗效，并且能够促进嵌合抗原受体T细胞疗法（chimeric antigen receptor T cell therapy，CAR-T）的抗肿瘤作用。因此，对ICD进行成像意义重大，目前仅有的一项通过体内检测CRT的转位来评估ICD应答的研究，是基于靶向CRT的7肽，将其与18F偶联用于正电子发射型计算机断层显像（positron emission computed tomography，PET）成像。然而，该研究选取的7肽与CRT蛋白的亲和力只有1.868μM，存在检测不灵敏和脱靶的风险。因此，迫切需要一种更高亲和力的ICD靶向分子用于ICD成像以及治疗。而转位的ERp57具有作为ICD成像或治疗靶点的潜力，目前还未见相关研究。
纳米抗体是在骆驼和鲨鱼血液中发现的新型抗体，只有两条重链而没有轻链，即重链抗体（heavy chain-only antibodies，HcAbs）。纳米抗体的结合位点由重链的可变区（variable domain of the heavy chain of the HcAbs，VHH）构成，是目前得到的具有完整生物学功能的最小单位抗体，相对分子质量约为15kDa，是常规抗体的十分之一左右。这一特殊结构使其不但保留了传统抗体的优势，同时也具备了一些新的功能。首先，纳米抗体有比传统抗体更长的CDR3序列，该序列可以灵活的调节和构象扩展，使它能够到达常规抗体无法接近的表位。其次，纳米抗体基因序列与人VH基因家族III序列有高度的同源性，因此免疫原性较低，与人体具有很好的相容性。此外，其不但保留了传统抗体与靶分子具有较高亲和力的优势，同时也具备了小分子多肽高组织渗透性的特点，已被广泛地用于靶向药物的递送。而且纳米抗体可以使用大肠杆菌系统进行表达纯化，使得制备成本极大地降低。
噬菌体展示筛选技术是一种快速、高通量的筛选与特定靶分子结合的多肽或抗体片段的方法。将多肽、蛋白或抗体片段表达在噬菌体外壳蛋白上，利用噬菌体在宿主菌中快速复制的生物特性，可以在较短的时间内通过几轮的结合-漂洗-洗脱-扩增筛选，获得与靶标分子结合的多肽、蛋白或抗体片段。因此，近年来，噬菌体展示纳米抗体库被广泛地用来筛选鉴定各种靶标的纳米抗体，通过筛选构建好的天然纳米抗体文库或者免疫驼类后制备的免疫噬菌体纳米抗体文库，可以快速获得和靶标蛋白结合的纳米抗体。
目前，现有技术中尚未有靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体的报导，而传统的抗体的亲和力比纳米抗体差。
发明内容
基于此，有必要提供一种亲和力更高的靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体。
此外，还有必要提供一种靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体的应用。
一种靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体，所述靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体的氨基酸序列的互补决定区包括如SEQ ID NO:1所示的CDR1、如SEQ ID NO:2所示的CDR2、如SEQ ID NO:3所示的CDR3。
或者，所述靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体的氨基酸序列的互补决定区包括如SEQ ID NO:9所示的CDR1、如SEQ ID NO:10所示的CDR2以及如SEQ ID NO:11所示的CDR3。
在一个实施例中，所述靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体的氨基酸序列的框架区包括SEQ ID NO:4所示的FR1、如SEQ ID NO:5所示的FR2、如SEQ ID NO:6所示的FR3以及如SEQ ID NO:7所示的FR4；
或者，所述靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体的氨基酸序列的框架区包括SEQ IDNO:12所示的FR1、如SEQ ID NO:13所示的FR2、如SEQ ID NO:14所示的FR3以及如SEQ IDNO:15所示的FR4。
在一个实施例中，所述靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO:8所示；
或者，所述靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
一种核酸，包括编码上述的靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体的核酸序列或其互补序列。
一种表达载体，包括上述的核酸。
一种宿主细胞，包括上述的表达载体。
在一个实施例中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
一种上述的靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体，在制备靶向二硫化物异构酶A3的检测试剂、活体成像探针、嵌合抗原受体修饰的细胞治疗产品或治疗性抗体中的应用。
结合说明书具体实施例部分的数据，Biacore检测结果表明本发明的两种靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体与ERp57蛋白的亲和力均在纳摩尔水平，具有较高的亲和力。
由此可以看出，本发明的靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体相对于传统的抗体具有更高的亲和力。
附图说明
图1为ERp57蛋白的转位的免疫荧光照片，其中，MOCK为未用药物处理对照组，OXP为奥沙利铂处理实验组，DAPI为细胞核染料，Cell Mask为细胞膜染料，ERp57为二硫化物异构酶A3，Merge为不同荧光通道合并展示。
图2为ERP57蛋白的转位的流式细胞术检测结果图，其中，HCT116为人结肠癌细胞系，unstain为未加抗体对照处理，MOCK为未用药物处理对照组，OXP为奥沙利铂处理实验组，CT26为小鼠结肠癌细胞系，ERp57-AF 647为用荧光染料AF 647标记的ERp57蛋白。
图3为ERp57蛋白线性结构域示意图，其中，ERp57为二硫化物异构酶A3，NH2为氨基酸氨基末端，COOH为氨基酸羧基末端。
图4为ERp57蛋白表达纯化后电泳考马斯亮蓝染色图片，其中，M为蛋白marker，Huamn ERp57为人源的二硫化物异构酶A3，mouse ERp57为小鼠二硫化物异构酶A3。
图5为ERp57蛋白表达纯化后anti-His标签的WB结果图，其中，Anti his tag为His标签蛋白，Huamn ERp57为人源的二硫化物异构酶A3，mouse ERp57为小鼠二硫化物异构酶A3。
图6为ERp57蛋白纳米抗体的筛选结果图，其中，1st为第一轮筛选，2nd为第二轮筛选，3rd为第三轮筛选，pfu为噬斑形成单位。
图7为ERp57噬菌体ELISA验证的结果图，其中，OD450为450纳米处吸光度，Ag为抗原，BSA为牛血清白蛋白。
图8为ERp57纳米抗体表达纯化的验证结果图，其中，M为蛋白marker。
图9为ERp57纳米抗体的WB检测结果图，其中，Anti-HA为HA标签蛋白，HA标签蛋白的序列为YPYDVPDYA。
图10为ERp57纳米抗体结合力的ELISA验证结果图，其中，OD450为450纳米处吸光度，Nb为纳米抗体。
图11为纳米抗体NbA11与ERp57蛋白的亲和常数的Biacore检测结果图，其中，KD为平衡解离常数，ka为结合常数，kd为解离常数。
图12为纳米抗体NbG6与ERp57蛋白的亲和常数的Biacore检测结果图，其中，KD为平衡解离常数，ka为结合常数，kd为解离常数。
图13为NbG6纳米抗体对ICD转位ERp57蛋白的识别的荧光图片，其中，MOCK为未用药物处理对照组，OXP为奥沙利铂处理实验组，DAPI为细胞核染料，Cell Mask为细胞膜染料，ERp57为二硫化物异构酶A3，NbG6为纳米抗体G6，Merge为不同荧光通道合并展示。
图14为NbG6纳米抗体竞争结合商业化抗体ERp57的结合位点的荧光图片，其中，MOCK为未用药物处理对照组，OXP为奥沙利铂处理实验组，DAPI为细胞核染料，Cell Mask为细胞膜染料，ERp57为二硫化物异构酶A3，NbG6为纳米抗体G6，Merge为不同荧光通道合并展示。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步地描述。
本发明公开了一实施方式的靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体。
具体来说，靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体共有两条，分别命名为NbA11和NbG6。
NbA11的氨基酸序列的互补决定区包括如SEQ ID NO:1所示的CDR1、如SEQ ID NO:2所示的CDR2、如SEQ ID NO:3所示的CDR3。
NbG6的氨基酸序列的互补决定区包括如SEQ ID NO:9所示的CDR1、如SEQ ID NO:10所示的CDR2以及如SEQ ID NO:11所示的CDR3。
结合说明书具体实施例部分的数据，Biacore检测结果表明本发明的两种靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体与ERp57蛋白的亲和力均在纳摩尔水平，具有较高的亲和力。
由此可以看出，本发明的靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体相对于传统的抗体具有更高的亲和力。
优选的，NbA11的氨基酸序列的框架区包括SEQ ID NO:4所示的FR1、如SEQ ID NO:5所示的FR2、如SEQ ID NO:6所示的FR3以及如SEQ ID NO:7所示的FR4。
优选的，NbG6的氨基酸序列的框架区包括SEQ ID NO:12所示的FR1、如SEQ ID NO:13所示的FR2、如SEQ ID NO:14所示的FR3以及如SEQ ID NO:15所示的FR4。
本发明中，依次连接的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4组成了靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体的氨基酸序列。
具体来说，NbA11的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
具体来说，NbG6的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
本发明还公开了一实施方式的核酸，其包括编码上述的靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体的核酸或其互补序列。
本发明还公开了一实施方式表达载体，包括上述的核酸。
本发明还公开了一实施方式宿主细胞，包括上述的表达载体。
一般来说，宿主细胞可以为大肠杆菌。
本发明还公开了一实施方式的上述的靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体，在制备靶向二硫化物异构酶A3的检测试剂、活体成像探针、嵌合抗原受体修饰的细胞治疗产品或治疗性抗体中的应用。
具体来说，上述的靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体可用于靶向血栓性血小板聚集蛋白二硫化物异构酶A3的各种成像、治疗和相关药物递送。
上述的靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体还可用于靶向心脏血管的蛋白二硫化物异构酶A3的各种成像、治疗和相关药物递送。
上述的靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体还可用于针对蛋白二硫化物异构酶A3设计的各种治疗方法，包括CAR T， CAR NK，双特异性抗体，纳米材料相关药物的递送等。
上述的靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体还可用于靶向肿瘤免疫原性死亡诱导的蛋白二硫化物异构酶A3的各种成像、治疗和相关药物递送。
以下为具体实施例：
需要指出的是，实施例中未特别说明的材料、设备和方法，均采用本领域常规选择。
实施例1体内外验证ICD诱导后ERp57蛋白的转位情况
1）体外验证（免疫荧光）
复苏HCT116和CT26细胞，传代3次后将细胞接种在24孔板中，用300 μM的OXP进行ICD诱导，同时设无处理的MOCK对照组。诱导4小时后，进行和免疫荧光检测，具体步骤如下。
a)，将细胞置于冰上，用PBS洗涤3次，0.25％多聚甲醛固定5分钟；
b)，用PBS洗涤3次，2％驴血清封闭1小时；
c)，用封闭液按1：200稀释ERp57抗体，与细胞共孵育1小时；
d)，预冷PBS洗涤3次，用封闭液按1：1000稀释Alexa 594偶联的二抗，与细胞共孵育1小时；
e)，预冷PBS洗涤3次，用含DAPI的封片剂封片，荧光倒置显微镜检测ERp57蛋白的转位情况，得到图1。
2）体外验证（流式细胞）
细胞处理与ICD诱导同上，药物处理后
a)，细胞使用无酶消化液处理，收集细胞；
b)，将细胞置于冰上，用PBS洗涤3次，使用PI染色5分钟后用0.25％多聚甲醛固定5分钟；
c)，用PBS洗涤3次，2％驴血清封闭30分钟；
d)，用封闭液按1：200稀释ERp57抗体，与细胞共孵育30分钟；e)，预冷PBS洗涤3次，用封闭液按1：1000稀释Alexa 647偶联的二抗，与细胞共孵育30分钟；
e)，预冷PBS洗涤3次，流式细胞仪检测ERp57转位情况，得到图2。
本项目中首先使用OXP（奥沙利铂）处理两个细胞系HCT116、CT26证实ICD关键蛋白ERP57的转位。
由图1和图2可以看出，使用ERP57抗体通过流式细胞和免疫荧光在细胞水平发现ERP57在药物处理后转位到细胞膜上，HCT116未处理时已有大量ERp57转位至细胞膜。
由此说明，OXP处理之后HCT116和CT26的ICD关键蛋白ERP57的转位明显增多。
实施例2 ERp57蛋白的表达纯化
结合图3，ERp57蛋白含有4个结构域，我们克隆了ERp57全长序列，蛋白大小约57kDa，作为纳米抗体的筛选靶标。
接着设计并合成ERp57全长用于纳米抗体筛选。
表达纯化步骤如下：
a)，为防止形成包涵体和蛋白降解，拟通过不同浓度的IPTG在16℃低温进行诱导条件摸索；
b)，根据预实验诱导条件进行大量诱导表达，高压破菌仪工作条件1000 W进行破菌；
c)，17000 g，4℃离心30 min，取上清与Ni填料4℃共孵育1小时；
d)，Ni柱纯化后进行分子筛分离，AKATA参数设置0.5 mL流速/分钟，每1 mL收集一次；
e)，根据电泳结果确定目的蛋白纯度，BCA法测定蛋白浓度。
密码子优化后合成ERp57基因进行大肠杆菌诱导表达纯化，为了避免蛋白降解和包涵体的产生，我们用0.2 mM的IPTG在16℃低温过夜进行诱导，最后通过Ni柱和分子筛纯化后分别进行电泳考马斯亮蓝染色和anti-His标签的WB检测，得到图4和图5。
由图1和图2可以看出，纯化后我们得到了高纯度的目的蛋白，可以用于后续纳米抗体筛选。
实施例3 ERp57纳米抗体的筛选鉴定
采用免疫管法对天然的羊驼源噬菌体展示纳米抗体文库进行筛选，所选择的噬菌体展示库容量为2×109。
筛选步骤如下：
a)，将目的蛋白按10μg/mL浓度包被在免疫管上，进行3轮富集筛选；
b)，使用第三轮噬菌体洗脱液铺板，随机挑取96个单克隆进行ELISA验证，以ELISA读数大于对应BSA读数3倍且读数大于0.5为阳性标准；
c)，经过2次噬菌体ELISA鉴定的阳性单克隆送公司测序确定序列信息；
d)，根据测序信息设计并合成筛选到的纳米抗体，通过大肠杆菌进行表达纯化；
e)，利用ELISA亲和性实验来初步鉴定纳米抗体的亲和力，选择亲和力较好的纳米抗体，进行表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR）测定亲和常数。
具体来说，我们首先对ERp57 N+P进行了噬菌体纳米抗体文库的筛选，三轮筛选之后，文库富集将近3000倍。
由图6可以看出，以ERp57蛋白为靶点，进行三轮噬菌体纳米抗体文库的筛选，显示文库被高度富集。
我们接着从第三轮所得文库挑取约200个克隆进行两次噬菌体ELISA作初步验证，初步鉴定出7个阳性克隆，分别命名为A11、B8、B9、C6、C10、G6和C7。
由图7可以看出，鉴定出的7个阳性克隆与ERp57均具有结合活性。
接下来将针对上述7个阳性克隆进行进一步的纯化表达、亲和力检测和特异性检测。
我们进一步纯化表达上述7个纳米抗体并进行anti-HA WB检测证实蛋白的正确性。
分别将NbA11纳米抗体和NbG6纳米抗体的基因序列克隆入PET-14B载体，同时融合表达血凝素标签（hemagglutinin HA tag）用于后续检测。
表达纯化步骤如下：
a)，为防止形成包涵体和蛋白降解，使用0.2mM浓度的IPTG在16℃低温进行诱导；
b)，根据预实验诱导条件进行大量诱导表达，高压破菌仪工作条件1000 W进行破菌；
c)，17000 g，4℃离心30 min，取上清与Ni填料4℃共孵育1小时；
d)，Ni柱纯化后进行分子筛分离，AKATA参数设置0.5 mL流速/分钟，每1 mL收集一次。
由图8可以看出，表达纯化7个融合了HA标签的纳米抗体，获得高纯度纳米抗体，大小约18kD左右。由图9可以看出，使用HA 标签抗体进行WB检测，证实纳米抗体蛋白表达正确。
我们之后进行ELISA验证，确认7个纳米抗体与ERp57的结合活性。
将HA标签融合到纳米抗体基因编码序列里，表达具有HA标签的纳米抗体，ELISA板包被ERp57蛋白，封闭，之后加入各种浓度的纳米抗体在室温孵育1小时，PBS漂洗3次，anti-HA抗体室温孵育1小时后，辣根过氧化物酶标记的抗HA抗体放大信号，TMB显色，同时做无关纳米抗体的对照和无关蛋白抗原的空白对照。
由图10可以看出，ELISA检测这7个纳米抗体与ERp57蛋白的结合，发现4个纳米抗体显示结合活性，其中NbA11和NbG6结合力最佳，进行后续应用分析。
需要指出的是，NbA11纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，NbG6纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
NbA11纳米抗体和NbG6纳米抗体的具体的氨基酸序列结构如前文所述，在此不再赘述。
实施例4 表面等离子共振实验
此实验用来验证在体外表达纯化的纳米抗体与体外纯化的抗原蛋白直接相互作用，并计算二者的平衡常数。
纯化抗原蛋白被固定在芯片上，不同浓度的纳米抗体被顺序加入来分析与抗原蛋白的亲和力，记录360秒内的反应信号，制作动力学曲线，计算各相关参数。
由图11可以看出，NbA11与ERp57蛋白的亲和力为418.8nM。由图12可以看出，NbG6与ERp57蛋白的亲和力为1.59nM。
结合图11和图12，使用Biacore，进一步检测了NbA11和NbG6克隆与ERp57蛋白的亲和力常数，发现二者与ERp57蛋白的亲和力均在纳摩尔水平，具有较高的亲和力。
实施例5 纳米抗体靶向性验证
根据SPR结果，选择亲和力较好的纳米抗体进行靶向性验证。体外诱导CT26细胞ICD 4小时后，实验所得纳米抗体与细胞进行孵育，通过免疫荧光检测anti-HA标签来反应纳米抗体对ERp57的识别情况。
具体来说，我们检测了NbG6纳米抗体是否可以识别ICD中发生转位的ERp57蛋白，先用1μM NbG6纳米抗体与细胞共孵育1h，再用anti-HA抗体（NbG6纳米抗体携带HA tag）与anti-ERp57抗体共孵育，结果显示OXP处理CT26细胞后ERp57转位到细胞膜上，NbG6纳米抗体可与ERp57 抗体指示的ERp57蛋白共定位，显示NbG6纳米抗体对ERp57蛋白的特异性。
结合图13，OXP处理CT26细胞后，ERp57蛋白转位到细胞膜，细胞在未穿透的情况可见ERp57定位于细胞膜上，而NbG6纳米抗体可以与ERp57发生共定位。
进一步地，我们用1μM NbG6纳米抗体与ERp57商业化抗体（abcam, Cat# ab10287，1：100稀释）共孵育1h后，检测NbG6纳米抗体与ERp57共定位情况。
结合图14，我们发现NbG6竞争结合ERp57商业化抗体结合位点。
以上所述实施方式仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳市人民医院
<120> 靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体及其应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Arg Ala Phe Ser Arg Tyr Ala Val
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ser Tyr His Gly Gly Tyr Thr Ala Tyr
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asp Ala Arg Ala Leu Tyr Asp Tyr
1 5
<210> 4
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala
1 5 10 15
Ile
<210> 6
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Thr Ser
1 5 10 15
Asn Thr Val His Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys Asn Thr
35
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 8
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Tyr Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
35 40 45
Val Ala Ala Ile Ser Tyr His Gly Gly Tyr Thr Ala Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Thr Ser Asn Thr Val
65 70 75 80
His Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Asn Thr Asp Ala Arg Ala Leu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gly Ser Ile Leu Ser Phe Asn Ser Met
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Ser Ile His Lys Thr Ser Ser Asn Tyr
1 5
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Val Gln Arg Gly Gln Ser Arg Ile Ser Tyr
1 5 10
<210> 12
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser
20 25
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Gly Trp His Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gln Arg Glu Leu Val Ala Gly
1 5 10 15
Ile
<210> 14
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Ala Asn Phe Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys
1 5 10 15
Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
35
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 16
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ser Ile Leu Ser Phe
20 25 30
Asn Ser Met Gly Trp His Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gln Arg Glu Leu
35 40 45
Val Ala Gly Ile Ser Ile His Lys Thr Ser Ser Asn Tyr Ala Asn Phe
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Val Gln Arg Gly Gln Ser Arg Ile Ser Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120

Claims (8)

1.一种靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体，其特征在于，所述靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体的氨基酸序列的互补决定区包括如SEQ ID NO:1所示的CDR1、如SEQ ID NO:2所示的CDR2、如SEQ ID NO:3所示的CDR3；
或者，所述靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体的氨基酸序列的互补决定区包括如SEQID NO:9所示的CDR1、如SEQ ID NO:10所示的CDR2以及如SEQ ID NO:11所示的CDR3。
2.根据权利要求1所述的靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体，其特征在于，所述靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体的氨基酸序列的框架区包括SEQ ID NO:4所示的FR1、如SEQ IDNO:5所示的FR2、如SEQ ID NO:6所示的FR3以及如SEQ ID NO:7所示的FR4；
或者，所述靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体的氨基酸序列的框架区包括SEQ ID NO:12所示的FR1、如SEQ ID NO:13所示的FR2、如SEQ ID NO:14所示的FR3以及如SEQ ID NO:15所示的FR4。
3.根据权利要求2所述的靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体，其特征在于，所述靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；
或者，所述靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
4.一种核酸，其特征在于，包括编码如权利要求1~3中任意一项所述的靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体的核酸序列。
5.一种表达载体，其特征在于，包括如权利要求4所述的核酸。
6.一种宿主细胞，其特征在于，包括如权利要求5所述的表达载体。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。
8.一种权利要求1~3中任意一项所述的靶向二硫化物异构酶A3的纳米抗体，在制备靶向二硫化物异构酶A3的检测试剂、活体成像探针、嵌合抗原受体修饰的细胞治疗产品或治疗性抗体中的应用。
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