DK155174B - Fremgangsmaade til fremstilling af et terapeutisk immunosuppressivt middel - Google Patents

Description

i

DK 15 517 4 B

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et terapeutisk immunosuppressivt middel, der omfatter et konjugat af en D-glutaminsyre/D-lysincopolymer og et antigen.

5 Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstilles konjugater, som er egnet til induktion af en individuel immunologisk tolerance over for et antigen. Konjugaterne fungerer ved at undertrykke dannelsen af antistoffer mod et specifikt antigen. Antigener kan defineres som makromolekyler, som, når de indføres i et individ, vil medføre, at 10 individet danner antistoffer, og vil reagere specifikt med disse antistoffer.

Den grundlæggende funktion af de organer, celler og molekyler, som danner immunsystemet, er at genkende og fjerne fremmede stoffer fra 15 legemet. Sådanne fremmede stoffer fjernes ved reaktion mellem det fremmede stof og antistoffer, der dannes som respons på det fremmede stof. Almindeligvis udøves denne funktion på effektiv måde og uden at skade værten. I visse tilfælde kan der imidlertid forekomme forstyrrelser, som kan føre til sygdomstilstande, som f.eks. et 20 ukontrolleret respons (al lergi li del se) eller et abnormt respons (autoimmun sygdom). Begge disse lidelsers patogenese er direkte eller indirekte knyttet til produktionen af antistoffer mod enten udefra kommende antigener (allergener) eller autoallergener. Som følge af, at immunsystemets funktion er at erkende og fjerne 25 fremmede stoffer, er det på grund af allograftreaktion endvidere vanskeligt at gennemføre transplantation af sundt væv og sunde organer fra en donor til et genetisk afvigende (dvs. allogent) modtagerindivid.

30 Hvis et individ bringes i en "ændret tilstand" som følge af kontakt med et antigen (og dannelse af antistoffer herimod), kan efterfølgende kontakt med det pågældende antigen eller et strukturelt lignende stof fremkalde en patologisk reaktion. Sådanne individer betegnes som "hypersensitive" over for det eller specifikke reak-35 tionsfremkaldende antigener. Når disse individer inhalerer eller indtager det pågældende antigen, manifesterer det sig meget ofte i anfald af høfeber, astma, nældefeber eller lignende. Tendensen til at udvikle denne form for allergi ("atopi") er arvelig.

DK 155174 B

2

Et individs første antistofrespons på et antigen er mindre kraftigt og noget anderledes end de responser, som fremkommer ved senere udsættelse for antigenet. Den første udsættelse for et antigen fremkalder et primært respons. Efter at antistofniveauet ved det 5 primære respons er aftaget, endog til et punkt, hvor det ikke længere er detekterbart, vil et senere møde med samme antigen sædvanligvis fremkalde et øget sekundært (anamnestisk) respons.

Fremkomsten af denne atopi har forbindelse med individets dannelse 10 af en vævssensibiliserende IgE-antistoftype, som betegnes et reagin.

Disse IgE-antistoffer har høj affinitet over for receptorer på celler, som forekommer i nær forbindelse med kapillarer i bindevævet rundt omkring i kroppen og på basofile leukocyter (blodlegemer). Mastceller og basofile celler har et højt indhold af farmakologisk 15 aktive mediatorer, såsom histamin, serotonin, (5-hydroxytryptamin) og kininer (basiske peptider), koncentreret i cytoplasmatiske granuler. Kontakt mellem IgE-antistoffer, der er fikseret på mast-celler og basofiler, og antigener kan foranledige tværbinding af IgE-antistofferne. Denne tværbinding medfører igen en degranulering 20 af mastceller og basofiler, hvilket frigør de kemiske mediatorer og fremkalder udbrud af det tidligere omtalte allergiske respons.

Medens forekomsten af atopi afhænger af produktionen af cellebundne (IgE) antistoffer, tilhører en anden type af antistoffer, som er af 25 betydning for immunsystemet, IgG-klassen. Disse IgG-antistoffer betegnes cirkulerende antistoffer eller "blokerende" antistoffer. IgG-antistoffer er også i stand til at kunne bindes til antigener.

Denne binding kan inaktivere et antigen ved at "blokere" antigenets evne til at reagere med cellebundet IgE og den efterfølgende tvær-30 binding af IgE-antistofferne.

En almindelig metode til behandling af allergiske lidelser går ud på immunisering ("desensibilisering") af individet ved gentagne injektioner af små, stigende mængder antigen med visse mellemrum, f.eks.

35 ugentlige, og i doseringsniveauer, hvorved udløsning af degranule-ringen af mastceller eller basofiler undgås. Det antages, at gentagne injektioner øger niveauet af blokerende IgG-antistoffer, men ikke niveauet af cellebundne IgE-antistoffer. Denne desensibilise-ringsmetode lider imidlertid af en række ulemper. Det er blandt

DK 155174 B

3 andet vanskeligt at opnå ensartede terapeutiske resultater, og behandlingen er tidkrævende. Som følge af, at udsættelse for udefra kommende antigen medfører en efterfølgende produktion af IgE-anti-stoffer, foreligger der endvidere altid mulighed for IgE-antigen-5 reaktion og deraf følgende IgE-tværbinding.

En autoimmun lidelse er en patologisk tilstand, som stammer fra et autoimmunt respons, hvorved et individ reagerer immunologisk ved produktion af antistoffer mod et autoantigen. Autoimmunitet kan 10 ramme næsten en hvilken som helst del af legemet og involverer almindeligvis en reaktion mellem et autoantigen og et IgG-antistof. Eksempelvis kan autoimmuno lidelser forekomme i skjoldbruskkirtelen, maveslimhinden, binyrerne, huden, røde blodlegemer og ledhinder.

15 Ved visse typer autoimmune lidelser har man anvendt ikke-specifik immunosuppressiv behandling, såsom røntgenbestråling af hele legemet eller indgivelse af cytotoksiske medikamenter, men med begrænset succes. Ulemperne ved denne behandling skyldes blandt andet toksiciteten af de anvendte midler og en øget forekomst af forskellige 20 cancerformer, navnlig lymphoma og retikul osarkom efter en sådan behandling. Anvendelse af ikke-specifikke midler til kronisk immunosuppression fører endvidere til en væsentlig forøgelse af patientens modtagelighed over for alvorlige infektioner fra omgivelsernes svampe, bakterier og vira, som under normale omstændigheder ikke 25 ville skabe problemer.

Når man betragter den kendte teknik inden for det immunologiske område, er det vigtigt at erkende forskellen mellem et antigen og et hapten. Som anført ovenfor, fremkalder antigener dannelse af anti-30 stoffer og reagerer også specifikt med det dannede antistof. I

modsætning hertil defineres haptener som små molekyler, der ikke selv stimulerer antistofproduktion, men som vil bindes til et antistof, når dette engang er blevet dannet. Endvidere inducerer haptener som regel ikke cellulær immunitet, kan ikke tjene som bærer 35 for andre haptener og inducerer kun antistofdannelse, når de indføres på immunogene bærere. Et anti-hapten antistofrespons er strengt bærerspecifikt. Et sekundært respons over for haptenet kan kun udløses, når dette indgives på samme bærer; hvis det indføres på en immunologisk ubeslægtet bærer, vil et individ ikke udvise immuno-

DK 155174 B

4 logisk erindring om haptenet, og vil give et typisk primært respons.

Som følge af, at evnen til at frembringe et sekundært respons kan bevares i mange år, kan der tilvejebringes en langvarig immunitet.

5 Det primære respons er dog mindre beskyttende som følge af, at antistofferne fremkommer langsommere.

I en række publikationer har opfinderen og hans medarbejdere imidlertid tidligere påvist og karakteriseret et system med forlænget 10 haptenspecifik benmarvsafledt celletolerance under anvendelse af D-glutaminsyre/D-lysin-copolymer, hvortil den nærmere bestemte hapten var blevet knyttet. (Se J. Exp. Med., bind 1M> side 201-223 (1971); bind 136, side 1404-1429 og side 426-438 (1972); bind 138, side 312-317 (1973), bind 139, side 146-1463 (1974) og Proc. Natl.

15 Acad. Sci., U.S.A., bind 71, side 3111-3114).

Disse undersøgelser viste sig vellykkede med hensyn til induktion af tolerance i de benmarvsafledede lymfocyt-precursorer for antistofdannende celler til antistofklasser, som var specifikke for 2,4-20 di nitrophenylhaptenet (Dnp-haptenet). Undersøgelserne involverede anvendelse af konjugater af Dnp og D-glutaminsyre/D-lysin, (i det følgende betegnet "D-GL").

I The Journal of Immunology, bind 114, nr. 2 (febr. 1975), 872-876 25 er der af opfinderen og hans medarbejdere efterfølgende beskrevet en fremgangsmåde til fremstilling af konjugater af D-glutaminsyre/D-lysincopolymer og ribonucleosiderne adenosin, cytidin, guanosin eller thymin, ved hvilken fremgangsmåde D-glutaminsyre/D-lysincopoly-mer med en middelmolekylvægt på enten 38.000 eller 50.000 og et 30 giutamin/lysin-molforhold på 60:40 omsættes med det udvalgte ribonu- cleosid (side 872, spalte 2). De fremstillede konjugater viste sig at være i stand til at frembringe immunologisk tolerance i mus over for responser på injektion af disse ribonucleosider, som var gjort immunogene ved kobling til "Keyhole Limpet Hemocyanin" (KLH).

35

En tilsvarende fremstilling og virkning af konjugatet af benzylpeni-cilloyl (ΒΡ0) og D-glutaminsyre/D-lysincopolymeren er beskrevet i Proc. Natl. Acad. Sci., USA, bind 73, nr. 6, side 2091-2095 (1976) og også omtalt i Chemical Abstracts, bind 85, (1976), 121.584 g.

DK 155174 B

5 Fælles for ovennævnte kendte konjugater af D-GL er, at det involverede "antigen" er et hapten, dvs. en lavmolekylær forbindelse, som i sig selv ikke har antigen virkning men kun kan opnå en sådan ved binding til en immunogen bærer. I modsætning hertil er proteiner og 5 proteinagtige stoffer samt oligodeoxynucleotider og nucleinsyrer derimod makromolekyler, som i sig selv er antigener, og de adskiller sig således væsentligt fra de kendte haptener med "antigen" virkning i to henseender, nemlig med hensyn til fysisk molekyl størrelse, hvor proteinerne, de proteinagtige stoffer, oligodeoxynucleotiderne og 10 nuclei nsyrerne er adskillige gange større end haptenerne, og med hensyn til fysiologisk virkning, hvor proteinerne, de proteinagtige stoffer, oligodeoxynucleotiderne, og nucleinsyrerne i sig selv er immunologisk kompetente, medens haptenerne i sig selv er immunologisk inkompetente. Det var derfor på tidspunktet for nærværende 15 opfindelses undfangelse ikke muligt at forudsige noget om: a) hvorvidt det ville være muligt at frembringe et konjugat mellem en D-glutaminsyre/D-lysincopolymer og et protein, proteinagtigt stof, oligodeoxynucleotid eller nucleinsyre, 20 b) under forudsætning af, at et sådant D-g/D-l-copolymerkonjugat kunne dannes, hvorvidt det da ville være i besiddelse af nogen fysiologisk aktivitet, navnlig om det ville udvise nogen antigen eller antigen-suppressiv virkning, og 25 c) hvorledes en eventuel antigen eller antigen-suppressiv virkning ville manifestere sig.

Det har med den foreliggende opfindelse imidlertid nu vist sig, at 30 der faktisk kan fremstilles konjugater af D-GL og et protein eller et proteinagtigt stof, et oligodeoxynucleotid eller en nucleinsyre, og at sådanne konjugater har en immunosuppressiv virkning på det immunologiske respons, som frembringes af proteinet eller det proteinagtige stof alene, samt at denne suppressive virkning er mere 35 udtalt og mere langvarig end den, der opnås ved immunosuppressiv behandling med selve proteinet eller det proteinagtige stof, jvf. efterfølgende sammenlignende afprøvning. Det har endvidere vist sig, at protein-D-GL-konjugaterne selektivt undertrykker IgE-antistof-responserne på proteinet men ikke IgG-responserne herpå, idet

DK 155174 B

6

IgG-responserne snarere har en tendens til at blive forstærket (hvilket iøvrigt også gælder ved immunosuppressiv behandling med selve proteinet). Dette repræsenterer en tydelig forskel mellem protein-D-GL-systemets virkninger og virkningerne af de ovenfor 5 omtalte hapten-D-GL-systemer. Om de sidstnævnte er det tidligere blevet rapporteret, at antistofresponser i alle immunoglobulin-klasser blev undertrykt ved udsættelse for hapten-D-GL-konjugater, jvf. efterfølgende sammenlignende afprøvninger med tilhørende konklusion. - Set ud fra et terapeutisk synspunkt er det imidlertid 10 en fordel, at kun IgE-antistofresponserne på proteinet undertrykkes, idet det er produktionen af IgE-antistofferne, der som tidligere omtalt giver anledning til' de allergiske reaktioner ved eksponering med proteinet, medens en forøget produktion af IgG-anti stoffer vil fremme neutraliseringen af proteinet og dermed dets fjernelse fra 15 organismen, hvilket naturligvis er ønskeligt.

Opfindelsen angår derfor en fremgangsmåde til fremstilling af et terapeutisk immunosuppressivt middel, der omfatter et konjugat af en D-glutaminsyre/D-lysincopolymer og et antigen, hvilken fremgangsmåde 20 er ejendommelig ved, at D-glutaminsyre/D-lysincopolymer med en middelmolekylvægt på fra ca. 34.000 til ca. 64.000 og et glutamin-syre/lys i n-mol forhold på ca. 60:40 omsættes med et antigen, der er udvalgt fra gruppen bestående af proteiner og proteinagtige stoffer samt oligodeoxynucleotider og nucleinsyrer.

25

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af antigen-D-GL-konjugater kan udføres ved opløsning af en D-GL-copolymer i en alkalisk opløsning og omsætning af den alkaliske opløsning med fra ca. 2 til 3 molækvival enter af antigenet. Reaktionsblandingen holdes 30 ved en temperatur på fra ca. 10 til 30°C i ca. 1 time. Reaktionsblandingens pH-værdi holdes i området fra ca. 10 til 12 ved tilsætning af alkalisk stof, f.eks. Κ0Η eller NaOH. Antigenkonjugaterne vaskes og renses ved velkendte metoder, f.eks. dialyse. Egnede D-GL-copolymerer med en molekylevægt på henholdsvis ca. 34.000, ca.

35 50.000 og ca. 64.000 og et giutaminsyre/lysi nmol forhold på ca. 60:40 kan fås fra Miles Laboratories, Inc., Myrtle Street, Elkhart, Indiana, 46514, U.S.A.

DK 155174 B

7

Med de ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse frembragte immunsuppressive midler frembringes immunologisk tolerance over for specifikke antigener, som i et individ frembringer en uhensigtsmæssig immunologisk reaktion som f.eks. en allergisk eller 5 autoimmun reaktion. Den opnåede immunologiske tolerance kan defineres som en specifik ikke-responsiv tilstand, hvori individet undlader at danne antistoffer, som respons på antigenets kontakt med eller indføring i individet. Den inducerede tolerance manifesterer sig ved: 10 (1) En manglende evne til hos et med antigen-D-GL-konjugatet behandlet individ at udvikle et primært antigenspecifikt antistofrespons, (2) antigen-D-GL-konjugatets evne til at afbryde et 15 igangværende anti-antigen-antistofrespons, og (3) en manglende evne hos et i forvejen med et antigen påvirket individ til at danne et sekundært anti-antigen respons efter behandling med antigen-D-GL-konjugatet.

20 Undertrykkelsen opnås ved at indgive det pågældende individ en sådan mængde af antigen-D-GL-konjugatet, som har en effektiv undertrykkende virkning på det specifikke antistofrespons. I den foreliggende sammenhæng betyder betegnelsen "individ" et menneske eller et forsøgsdyr, som er en model for et menneske. Medicinske indikationer 25 for brugen af det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede konjugat er alle tilstande, for hvilke det ønskes at undertrykke antistofresponset på et specifikt antigen i individet. Betegnelsen "undertrykkelse af antistofrespons" eller et hvilket som helst ækvivalent til denne betegnelse skal forstås i betydningen "en 30 væsentlig forøgelse i immunologisk tolerance over for et specifikt antigen". Denne undertrykkelse opnås ved at give individet en dosis eller en række doser af konjugatet, som vil undertrykke eller formindske antistofresponset. Skønt mængden vil variere fra individ til individ og fra indikation til indikation, fastlægges den let af 35 en fagmand uden omfattende forsøgsarbejde. Subkutan indgivelse foretrækkes. Doseringsformer til indgivelse af konjugaterne kan fremstilles ved de inden for medieinalområdet anerkendte fremgangsmåder.

DK 155174 B

8

Til bestemmelse af de immunospecifikke egenskaber af konjugater, der er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, blev der frembragt IgE- og IgG-anti stofresponser med høj titer over for det pågældende antigen i mus ved intraperitoneal injektion af antigenet.

5 Mængden af antistof dannet som respons måltes derefter ved de nedenfor beskrevne analysemetoder. Behandling af sådanne mus med antigen-D-GL-konjugat fremstillet ved fremgangsmåden ifølge den foreligende opfindelse, enten før eller efter den primære immunisering, resulterede i en væsentlig undertrykkel se af det senere 10 anti-antigen-antistofrespons tilhørende IgE-klassen, målt på såvel humoralt som cellulært niveau.

Fremstilling af terapeutiske immunosuppressive midler.

15 Eksempel I

Insulin - D-GL-konjugat

En 50 mg portion svineinsulin opløstes i 0,01M ethylendiamintetra-20 eddikesyre (EDTA) med en pH-værdi på 3,1. Det opløste insulin dialyseredes mod samme EDTA-opløsning natten over. Dialysemediet ændredes til en 0,033 M boratpuffer med en pH-værdi på ca. 9,5 og indeholdende 2,5 x 10"^ M EDTA. Toluen-2,4-diisocyanat (TDIC) sattes til insulinopløsningen ved 0°C. Reaktionsblandingen omrørtes kraf-25 tigt ved 0° i ca. 30 minutter og centrifugeredes derefter ved 12.000 g i 10 minutter ved en temperatur på fra ca. 2 til 4°C. Supernatan-ten dekanteredes over i et reagensglas, som blev til proppet og anbragt i et isbad. Reaktionen fik lov at forløbe i yderligere én time ved isbadets temperatur.

30

En 50 mg portion af D-GL-copolymer med en gennemsnitlig molekylvægt på 64.000 og et giutaminsyre/lysin-mol forhold på 60:40 opløstes i 0,033M boratpuffer (pH 9,5) indeholdende 2,5 x 10'^M EDTA. pH-Værdien blev indstillet til 10-12 med 2N NaOH.

35 D-GL-opløsningen sattes til insulinopløsningen, og mol forholdet mellem insulin og det til reaktionsblandingen satte D-GL var 10:1. Reaktionen fik lov at forløbe i én time ved ca. 35-40°C. Reaktionsblandingen dialyseredes derefter mod 0,1M (NH4)2C03 indeholdende 2,5 -5

DK 155174 B

9 x 10 M EDTA og fraktioneredes på en "Sephadex® 675"-kolonne under anvendelse af 0,01M NH^HCOg indeholdende 2,5 x 10"^M EDTA som elueringsmiddel. Konjugatet dialyseredes yderligere mod destilleret vand og lyofili seredes.

5

Eksempel 2

Ambrosieantigen-E D-GL-konjugat 10 En 50 mg portion D-GL-copolymer med en gennemsnitlig molekylvægt på 64.000 og et giutaminsyre/lysin-molforhold på 60:40 opløstes i 2 ml destilleret vand. Opløsningen afkøledes til 0°C i et isbad og omrørtes. En 50 mg portion N-ethyl-5-phenylisoxazolium-3'-sulfonat (Woodward's reagens) opløstes i 0,5 ml destilleret vand og sattes 15 til D-GL-opløsningen under fortsat omrøring i ca. 1 time ved 0°C, hvorefter pH-værdien hævedes til 7,5-8,0 med 2N NaOH.

En 5 mg portion ambrosieantigen-E (hovedallergenkomponenten fra ambrosiepollen), som var leveret fra Worthington Biochemicals, Inc., 20 Freehold, New Jersey, 07728, blev opløst i destilleret vand og sat til opløsningen, der indeholdt D-GL og Woodward's reagens. Det omtalte ambrosieantigen-E havde en molekylvægt på 37.800, et nitrogenindhold på 17,1% og et kul hydratindhold på 0,2% og kan derfor nærmest karakteriseres som et proteinagtigt (eller proteinholdigt) 25 stof. S-værdien var 3,05, og ekstinktionskoefficienten (ved 280 jum) for en 1% opløsning ved 1 cm lyspassage var 11,3.

Blandingen omrørtes i 24 timer ved 6°C. Reaktionsblandingen fraktioneredes på en "Sephadex® G-100"-kolonne under anvendelse af 0,01M 30 NH4HC03 indeholdende 0,1M NH^HCOg som elueringsmiddel. Indholdet af de glas, som indeholdt første top, forenedes, og konjugatet dialyseredes yderligere mod destilleret vand og lyofiliseredes.

Eksempel 3 35

Nueleotid-D-GL-konjugat

Oligodeoxynucleotid (trimere og/eller tetramere) fremstilledes ved DNase-1-nedbrydning af kalvethymus-DNA efterfulgt af fraktionering

DK 155174 B

10 på en DEAE "Sephadex® A25"-kolonne. Fremgangsmåden omfattede anvendelse af en 5 mM tris (hydroxymethylJaminomethan ("TRIS")/7 M urinstofpuffer (pH 7,6) med en lineær 0-0,4 M LiCl-koncentrationsgradient. Urinstof fjernedes fra de dannede oligodeoxynucleotider ved 5 kromatografi under anvendelse af destilleret vand som eluerings-middel.

Det dannede oligodeoxynucleotid omsattes med D-GL-copolymer med en middelmolekyl vægt på ca. 64.000 og et giutaminsyre/lysin-mol forhold 10 på 60:40. Reaktionen blev udført i destilleret and under anvendelse af l-ethyl-3-diisopropylaminocarbodiimid-hydrochlorid (EDC) som koblingsmiddel.

Det fremkomne konjugat blev fraskilt urenheder og uomsat udgangs-15 materiale ved dialyse over ca. én uge ved fra ca. 2 til 4°C (se J. of Immun.. 96. 373 (1966)).

Oligonucleotider fremstilledes også ved DNase-l-nedbrydning af kalvethymus-DNA efterfulgt af filtrering af materialet gennem et 20 filter med en molekylvægtsgrænse for passage (molecular weight cut-off) på ca. 10.000. Et egnet filter leveres af Amicon, en division af Rohm and Haas Co., Independence Mall West, Philadelphia, Pennsylvania, 19105, under varebetegnelsen "PM-10". Filtratet blev anvendt som oligodeoxynucleotidkilde.

25

Nucleotider er sammensat af en heterocyclisk base, et kulhydrat med fem carbonatomer og phosphat. Nucleinsyrer og oligonucleotider er polymerer sammensat af indtil fire forskellige nucleotider, som er bundet sammen ved hjælp af phosphodiester-bi ndi nger. Oligonucleo-30 tider er små polymerer, sædvanligvis tilvejebragt ud fra nucleinsyrer og sammensat af færre end 10 nucleotider, som er sammenbundet ved hjælp af phosphodiester-bindinger. Di ester-bindingerne gør — nucleotiderne til forholdsvis komplekse kemiske stoffer. Anti stoffer, som er specifikke over for nuclei nsyre, er ikke alene 35 specifikke over for basen og/eller kul hydratet men også over for den phosphat-Vygrad”, som indeholder disse nucleotider. Ved anvendelse af et lille oligonucleotid, der er knyttet til en ikke-immunogen bærer (f.eks. D-GL), opnås der således et nucleinsyre-lignende miljø, som er direkte beslægtet med den patologiske tilstand ved en 11

DK 15 517 4 B

autoimmun lidelse. I modsætning hertil er den kendte tekniks induktion af tolerance over for nucleosider, som ikke indeholder phosphat endsige phospho-diesterbindinger, nærmere beslægtet med induktion af hapten-D-GL-tolerance, f.eks. med Dnp-D-GL. Indukton af tolerance 5 over for oligodeoxynucleotider kan anses for ækvivalent med induktion af tolerance over for nucleinsyre.

Sammenlignende afprøvning.

10 Den immunosuppressive virkning af de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede protein-D-GL-konjugater blev afprøvet i sammenligning med de tilsvarende proteiners virkning ved de i det følgende beskrevne forsøg.

15 Materialer. D-GL(D-Glu^D-Lys^, Mr 63.700), hønseæggehvide (OVA) rekrystalli seret fem gange, ambrosieekstrakt og ambrosie-antigen-E (AgE) blev opnået fra Miles.

Den generelle metodik til fremstilling, oprensning og karakterise-20 ring af protein-D-GL-konjugater var som tidligere beskrevet og er endvidere rapporteret detaljeret andetsteds (Liu, F.T., Zinnecker, M. Hamaoka, T. & Katz, D. H. (1979) Biochemistry 18, 690-697). OVA-D-GL-konjugat blev fremstillet ved en fremgangsmåde i overensstemmelse hermed.

25

De detaljerede procedurer ved fremstilling af AgE-D-GL er kort beskrevet som følger: 20 mg (540 nmol) AgE (eller ambrosiepollenekstrakt) blev blandet med 4,2 mg (13,5 /«nol i 200 /ti dimethyl formamid) maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester i 2,0 ml 0,01 M 30 phosphatpuffer, pH 7,0, og produktet (maleimidobenzoyl-AgE) fra den efterfølgende reaktion blev isoleret ved gel fil treringskromatografi på "Sephadex® G-25" som beskrevet for maleimidobenzoyl-OVA (Liu, F.

T., Zinnecker, M. Hamaoka, T. & Katz, D. H. (1979) Biochemistry 18, 690-697). AgE-D-GL blev fremstillet ved blanding af maleimidoben-35 zoylgg-AgE (16 mg, 433 nmol i 3,6 ml 0,1 M phosphatpuffer, pH 6,0) med thioleret SHjg-D-GL-biotin^g (30,6 mg, 480 nmol, indeholdende spormængder af IZ5I-mærkede molekyler i 3,13 ml phosphatpufret saltvand, der indeholdt 0,01 M EDTA) og isoleret ved affinitetssø j lekromatografi på "avidin-Sepharose®", som beskrevet for 0VA-D-GL

DK 155174 B

12 (Liu, F.T., Zinnecker, M. Hamaoka, T. & Katz, D. H. (1979) Biochemistry 18, 690-697).

Det fremstillede OVA-D-GL havde et forhold mellem OVA og D-GL på 5 0,6-0,7:1, og det modificerede OVA-protein havde bevaret 70-80% af sin antigenicitet. AgE-D-GL havde et forhold mellem AgE og D-GL på 0,5:1 og havde bevaret 10-20% af sin antigenicitet. For begge konjugaters vedkommende blev antigeniciteten bestemt ved graden af reaktivitet af konjugatet over for specifikke anti-OVA- eller 10 anti-AgE-antistoffer.

Immunisering og forsøgsdyr. CAF^-mus (8-12 uger gamle med mindre andet er angivet) blev opnået fra Jackson Laboratory og blev immuniseret og intraperitonealt injiceret 10 øg OVA eller 5 μg AgE (eller 15 ambrosieekstrakt) adsorberet på Al(0H)3-gel (alun, 4 mg eller 2 mg) i 0,5 ml steril saltvandsopløsning (Chiorazzi, N., Tung. A. S. &

Katz, D. H. (1977) J. Exp. Med. 146, 302-308) og ifølge de eksperimentelle protokoller, der er anført under resultater.

20 Måling af antistoffer. Koncentrationen af IgE anti-OVA- eller anti-AgE-antistoffer blev bestemt kvantitativt ved passive hudana-fylaksereaktioner (PCA-reaktioner) i rotter (som beskrevet af Chiorazzi, N., Tung. A. S. & Katz, D. H. (1977) i J. Exp. Med. 146, 302-308 og af Katz, D. H., Hamaoka, T., Newburger, P. E. & Benacer-25 raf, B. i J. Immunol. 113, (1974) 974-984. Sera fra de identisk behandlede grupper af mus blev forenet og serievis fortyndet (2 gange) i 2% normal rotteserum. En 0,1 ml portion af hver af de forskellige fortyndinger injiceredes intradermalt i den renbarberede dorsal hud på forsøgsrotter. Efter en 4-24 timers sensibiliserings-30 periode fremkaldtes PCA-reaktionerne, som ved denne metode kun måler IgE-antistofferne, ved intravenøs injektion af proteinantigenet (1 mg/250 g legemsvægt af barberet rotte) i 1,0% Evans' blå farvestof, opløst i phosphatpufret saltvandsopløsning. PCA-titeren udtrykkes som reciprokværdien af den største serumfortynding som giver en 35 blåningsreaktion med en diameter på 5 mm, jvf. Life Sciences, 81, siderne 813-820 (1969).

IgG-antistofaktiviteten i muse-anti-OVA-serum blev bestemt ved 125 fastfaseradioimmunoanalyse under anvendelse af I-mærket kanin-

DK 155174 B

13 antimus-Fab (Pieree, S. K. & Kl unman, N. R. (1975) J. Exp. Med. 142, 1165-1176). Antistofaktiviteten i muse-anti-AgE-serum blev bestemt 125 ved en dobbelt-antistofmetode under anvendelse af I-mærket AgE og et kanin-antimuseserum.

5

Resultater Fig. 1 10 Forklaring til Fig. 1.

OVA-D-GL inducerer vedvarende tolerance i IgE-antistofklassen men ikke i IgG-antistofklassen i CAFj-mus, der er sensibiliseret gentagne gange med OVA i alun.

15

Normale CAF-^-mus blev enten ikke behandlet (o) eller behandlet med ikke-konjugeret OVA (100 øg) (·), en blanding af ikke-konjugeret OVA (100 jug) plus D-GL (250 øg) (Δ), eller OVA-D-GL (250 øg D-GL konjugeret med 100 øg OVA) (□). Forbehandlede mus blev injiceret fire 20 gange under indgivelse af de ovenfor angivne doser hver gang. Doserne blev indgivet intradermalt, intravenøst, intravenøst og intradermalt med en dags mellemrum. Én dag efter den fjerde dosis blev alle mus injiceret første gang med 10 øg OVA i 4 mg alun. Den anden behandling blev indgivet på dagene 15 (intraperitonealt), 16 25 (intradermalt), 17 (intraperitonealt) og 20 (intradermalt). Et andet angreb blev foretaget på den 21. dag med 10 øg OVA i 2 mg alun. Et tredje angreb blev foretaget den 66. dag på samme måde (alle injektioner blev udført intraperitonealt). Serum-IgE (nederst) og-IgG (øverst) anti-OVA-antistofresponser i grupper af tre mus, hvorfra 30 der som vist blev taget blodprøver på forskellige dage efter den første immunisering, er illustreret.

Som det fremgår af tegningens Figur 1 (nederste afbildning), udviklede kontrolmus (o) meget gode primære og sekundære anti-OVA-IgE-35 antistofresponser. Mus, der forinden var blevet behandlet primært og sidenhen behandlet anden gang med OVA-D-GL (□), var ikke i stand til at frembringe detekterbare anti-OVA-IgE-antistofresponser på noget tidspunkt af observationsperioden. Denne mangel på responsivitet varede i lang tid, endog efter en tredje injektion med den sensibi- 14

DK 1 55174 B

liserende dosis af OVA, som blev indgivet 45 dage efter den anden behandling med OVA-D-GL. Musegrupper, som var blevet behandlet med enten OVA (·) eller en blanding af OVA plus D-GL (Δ), udviste også nedsatte IgE-antistofresponser. Mønsteret for ikke-responsivitet i 5 disse sidstnævnte to grupper var imidlertid væsentligt forskelligt fra det, der manifesterede sig i mus, som var blevet behandlet med OVA-D-GL (□). I begge tilfælde var undertrykkelsen af IgE-antistof-produktionen midlertidig og blev efterfulgt af et opspring i produktionen af anti-OVA-IgE-antistoffer i omfang, som var flere gange 10 større end det opspring, som blev produceret af ubehandlede kontrolmus. En særligt vedkommende kontrast i den relative effektivitet af disse forskellige behandlingsmåder illustreres af evnen hos mus, der er behandlet med en blanding af OVA plus D-GL (Δ), til frembringelse af væsentlige IgE anti-OVA-responser efter den tredje 15 antigenindsprøjtning, som blev indgivet forholdsvis sent under forløbet (dag 66), medens mus, der var behandlet med OVA-D-GL, var fuldstændigt uden respons på dette tidspunkt.

I modsætning til den tydelige effektivitet af OVA-D-GL til induce-20 ring af ikke-responsivitet i IgE-antistofklassen var denne behandling ikke i stand til at mindske anti-OVA-antistofresponserne i IgG-klassen og syntes endog at forstærke IgG-responserne (Figur 1 øverst). Dette var tilfældet for ikke blot mus, der var behandlet med OVA-D-GL (□), men også for mus, der var behandlet med enten 25 ikke-konjugeret OVA (o) eller en blanding af D-GL plus OVA (Δ). Det bemærkes, at de behandlede mus producerede større omfang af IgG anti-OVA-anti stoffer end de tilsvarende ubehandlede kontrolmus, navnlig i de tidlige observationsstadier. Tilsvarende resultater blev opnået i et særskilt eksperiment med tilsvarende design under 30 anvendelse af AgE-D-GL som middel til undertrykkelse af IgE-antistofresponser, som er specifikke for AgE (data ikke vist).

Figur 2.

35 Forklaring til Fig. 2

Ambrosie-AgE-D-GL inducerer vedvarende tolerance over for AgE, og forskellen i effektivitet mellem behandling med AgE-D-GL i forhold til behandling med ikke-konjugeret AgE er sammenfattet i Figur 2.

DK 155174 B

15

Normale CAFj-mus blev enten ikke behandlet eller behandlet med fire doser antigen-E (90 /tg) eller antigen-E-D-GL (250 øg D-GL, 90 øg konjugeret antigen-E). Doserne blev indgivet på de angivne måder med to dages mellemrum. Én dag efter sidste dosis blev alle mus første 5 gang immuniseret med 5 øg AgE i 4 mg alun (dag 0). En anden eksponering blev udført på den 127. dag med 5 øg AgE i 2 mg alun. IgE anti-AgE-antistofresponser i serum fra de behandlede mus er afsat som procentdelen af det respons, som fremkaldtes i den ubehandlede kontrolgruppe, idet de faktiske antistofniveauer i kontroldyrene er 10 angivet i parenteser over hvert datapunkt. Hver gruppe bestod af tre mus.

I modsætning til ubehandlede mus, der udviste høje niveauer for anti-AgE-antistofresponser i IgE-klassen i løbet af en periode på 15 134 dage af dette eksperiment var de grupper af mus, som var forbe handlet med enten ikke-konjugeret AgE eller AgE-D-GL ude af stand til at frembringe detekterbare IgE anti-AgE-antistofresponser i løbet af de første 21 dage efter den primære immunisering. Efter den anden sensibilisering på den 127. dag udviste de mus, som var 20 forbehandlet med ikke-konjugeret AgE imidlertid responser, som kun var 50% lavere end dem for de ubehandlede kontrol dyr, medens mus, der var behandlet med AgE-D-GL, fremviste markant lavere (otte gange) IgE-responser på dette tidspunkt.

25 Figur 3.

Forklaring til Fig. 3

Tolerancefremkaldende aktivitet af AgE-D-GL på sekundære IgE anti-30 AgE-antistofresponser i CAFj-mus.

Normale CAFj-mus blev første gang immuniseret med 5 øg antigen-E i 4 mg alun (dag 0). En måned senere blev den ene gruppe behandlet med fire doser AgE-D-GL (250 øg D-GL, 90 øg konjugeret AgE), intrader-35 malt eller intraperitonealt som angivet på dagene 30, 31, 32 og 35.

På den 39. dag blev denne gruppe og gruppen af ubehandlede kontrol-mus for anden gang eksponeret (immuniseret) med 5 øg antigen-E i 2 mg alun. IgE-antistofresponser i serum fra disse grupper på hver tre mus, hvorfra der blev udtaget blodprøver på forskellige dage som

DK 155174 B

16 vist, er gengivet i Figur 3.

Den ved behandling med AgE-D-GL inducerede tolerance er øjensynlig lettere at opnå i mus, der forinden er blevet sensibiliseret med 5 AgE, end det er tilfældet for OVA-D-GL i OVA-sensi bi li serede mus.

Det bemærkes, at i modsætning til ubehandlede kontrolmus, som frembragte gode sekundære IgE anti- AgE-responser efter den anden eksponering (immunisering) på den 39. dag var de mus, som var behandlet med AgE-D-GL ude af stand til at frembringe forstærkede 10 responser på den anden eksponering (immunisering) og, hvad der er mere betydningsfuldt, udviste et skarpt fald i størrelsen af de IgE anti-AgE-antistofniveauer, der blev produceret efter behandlingen og den anden eksponering (immunisering). Omend det ikke er vist i figuren, forblev antistofproduktionen i den AgE-D-GL-behandlede 15 gruppe på dette lave niveau i nogen tid i den efterfølgende observati onsperi ode.

Figur 4.

20 Forklaring til Fig. 4

AgE-D-GL inducerer tolerance inden for IgE-antistofklassen, når det indgives CAFj-mus et år efter en initiel sensibilisering med AgE.

25 Selv om de foregående eksperimenter demonstrerer effektiviteten af protein-D-GL-konjugater til induktion af specifik immunologisk tolerance i enten ikke-sensibiliserede eller forudgående sensibiliserede mus, når dette undersøges under akutte omstændigheder, var det ønskeligt at tilvejebringe viden om, hvor effektiv denne frem-30 gangsmåde ville være under omstændigheder, som lå tættere på et klinisk allergiproblem. Det logiske fortsæt var derfor at sensibilisere mus, i dette tilfælde med AgE, og derpå lade dem være i fred i et tidsrum på et år, inden de blev udsat for nogen yderligere manipulering. Efter dette lange tidsrum skulle nogle mus behandles 35 og andre ikke, og der skulle foretages bestemmelser af deres relative evner til frembringelse af specifikke antistofresponser efter påfølgende udsættelse for AgE. Resultaterne af en sådan undersøgelse er sammenfattet i Figur 4.

DK 155174 B

17

Normale CAFj-mus blev udsat for 250 R hel krops-røntgenbestråling kort tid inden en primær immunisering med 10 pg ambrosieekstrakt i 4 -4 mg alun (et R = 2,58 x 10 C/kg). Fra alle mus blev der taget blodprøver på 10. dagen og 20. dagen efter sensibiliseringen, og 5 niveauerne (bestemt ved passiv hudanafylaksi) for IgE anti-AgE- antistoffer er illustreret til venstre i Figur 4. Disse mus fik derpå lov til at være i fred i en periode på et år, ved hvis afslutning der blev taget blodprøver fra dem til bestemmelse af de tilbageværende niveauer for IgE anti-AgE-antistoffer (afbildet i 10 venstre side). Musene blev derpå opdelt i tre grupper, af hvilke to blev indgivet fire injektioner, som hver bestod af enten ikke-konjugeret AgE (75 jag intradermalt, intraperitonealt, intraperito-nealt og i ntraperi tonealt) (Δ), eller AgE-D-GL (250 jag D-GL, der indeholdt 75 jag AgE, intradermalt, intraperitonealt, intraperitone-15 alt og intraperitonealt) (□). Injektionerne blev indgivet med en dags mellemrum. Fem dage efter den sidste injektion blev disse to grupper og en tredje gruppe af ubehandlede kontrolmus (o) derpå udsat for eksponering med 5 jag AgE i fire mg alun. IgE anti-AgE-anti stof responserne i grupper på hver tre mus er afbildet (til 20 højre) som procentdelen af værdien for det passive hudanafylakse-respons, der frembringes i ubehandlede kontrolmus, idet de faktiske kontrolværdier er angivet i parenteser over eller under de tilsvarende datapunkter efter den sekundære eksponering.

25 Grunden til eksponeringen af musene med lave doser bestråling inden den primære sensibilisering var foranlediget af resultatet af tidligere undersøgelser i laboratoriet, som viste, at sådanne manipulationer fører til en væsentlig forøgelse af størrelsen af IgE-antistofproduktionen efter sensibilisering med et hvilket som 30 helst af et antal forskellige antigener (Chiorazzi, N., Fox, D. A. &

Katz, D. H. (1976) J. Immunol. 117, 1629-1639 og Chiorazzi, N., Fox, D. A. & Katz, D. H. (1977) J. Immunol. 118, 48-57). Som det ses af Figur 4 til venstre resulterede det benyttede immuniseringsregime i meget gode primære IgE anti-AgE-antistofresponser. Efter et års 35 forløb blev der taget blodprøver fra alle musene til bestemmelse af størrelsen af de specifikke anti-AgE IgE-antistoffer, som kunne detekteres i deres serum på dette tidspunkt. Det er interessant at bemærke, at alle de således undersøgte mus havde detekterbare IgE-antistoffer, selv om de ikke efterfølgende var blevet udsat for

DK 155174 B

18

AgE i løbet af perioden på et år med fred og ro.

Mus, som frembragte de laveste titere for IgE-antistoffer (passiv hudanafylaksetiter - 40), blev derpå delt i tre grupper. To grupper 5 blev intradermalt og intreperitonealt injiceret fire doser af enten AgE-D-GL, der indeholdt 250 øg D-GL (75 /ig konjugeret AgE), eller 75 μ$ ikke-konjugeret AgE. En tredje gruppe forblev ubehandlet som kontrol. Fem dage efter den sidste dosis blev alle mus for anden gang udsat for virkningen af 5 μg AgE plus alun. Som det ses af 10 Figur 4 til højre, frembragte ubehandlede kontrolmus kraftige sekundære IgE-antistofresponser, som toppede syv dage efter den anden eksponering (med AgE plus alun). Mus, der var behandlet med ikke-konjugeret AgE frembragte, omend de manifesterede 50% lavere responser end ubehandlede kontroldyr, på den 7. dag IgE anti-AgE-15 responser, som enten var sammenlignelige med eller op til to gange større end dem for kontroldyrene senere i responsperioden. I markant kontrast hertil udviste de mus, som var behandlet med AgE-D-GL, en bemærkelsesværdig mangel på evne til at frembringe noget som helst andet end meget små AgE-specifikke IgE-responser.

20

Diskussion.

Ovenstående resultater demonstrerer den vellykkede induktion af specifik immunologisk tolerance mod to forskellige proteinantigener, 25 0VA og AgE (hvoraf AgE nærmest må karakteriseres som et protein-agtigt eller proteinholdigt stof) i både ikke-sensibiliserede og forudgående sensibiliserede forsøgsdyr, og tolerancerne er selektivt begrænset til responser i IgE-antistofklassen. Denne tolerance fremkom ved indgivelse af passende doser af de respektive protein-30 D-GL-konjugater. Undersøgelser, som for tiden er undervejs i laboratoriet, har dokumenteret den absolutte antigenspecificitet for det inducerede tolerancestadium med det ene eller det andet af de to her benyttede protein-D-GL-konjugater, og endvidere, at den mekanisme for ikke-responsivitet, som opnås med protein-D-GL-konjugater, ikke 35 involverer deltagelse af detekterbare, aktive undertrykkelsesceller (ikke publicerede observationer).

To væsentlige karakteristika blandt disse resultater fortjener en særlig kommentar. For det første fremgår det af ovenstående data, at

DK 155174 B

19

IgE-antistofresponserne kan undertrykkes ved indgivelse af ikke blot protein-D-GL-konjugater men også ved indgivelse af tilsvarende doser af ikke-konjugeret protein alene. Det skal imidlertid understreges, at mønstrene for IgE-antistofproduktion efter behandling i hver af 5 disse to tilfælde er væsentlig forskellig. Indgivelse af ikke-konju-geret protein undertrykte således almindeligvis IgE-produktionen effektivt men kun midlertidigt; i et særligt bemærkelsesværdigt tilfælde, nemlig når behandlingen blev foretaget efter et års pause efter indledningsvis sensibilisering (Fig. 4), havde indgivelse af 10 ikke-konjugeret protein kun marginalt hæmmende virkninger på det specifikke respons, og denne virkning blev kort efter fulgt af en markant forstærket effekt på det specifikke IgE-respons. Indgivelse af protein-D-GL-konjugater resulterede på den anden side i en i nhi bering af IgE-antistofproduktionen, som varede ved i lange 15 tider, selv efter gentagen udsættelse for det sensibiliserende antigen. (Hvorvidt mekanismen for den ved disse to forskellige metoder inducerede tolerance er kvalitativt den samme eller forskellig er sidenhen blevet nærmere diskuteret af D. H. Katz et al. i The Journal of Immunology, bind 123, nr. 6, (1979)).

20

Det andet karakteristikum, som er værd at understrege, er den bemærkelsesværdige selektivitet for den i disse undersøgelser observerede ikke-responsivitet. IgE-antistofresponserne blev mindsket markant, medens specifikke IgG-antistofresponser på de samme 25 determinanter samtidig havde tendens til at blive forstærket, uanset om der i forsøgsmusene blev indgivet protein-D-GL-konjugater eller ikke-konjugerede proteiner. Dette repræsenterer en hovedforskel mellem protein-D-GL-systemet og de hapten-D-GL-systemer, der tidligere er blevet undersøgt. I de sidstnævnte systemer var det klart, 30 at antistofresponser i alle immunoglobulinklasser var modtagelige for toleranceinduktion efter udsættelse for hapten-D-GL-konjugater (Katz, D. H. (1974) i Immunological Tolerance: "Mechanisms and Potential Therapeutic Applications", ed. Katz, D. H. & Benacerraf, B. (Academic, New York), side 189-201).

35

Den oplagte konklusion af de opnåede resultater er, at allergene proteiner og proteinagtige stoffer, der er koblet til D-GL, kan være anvendelige til mennesker til specifik ophævelse af IgE-antistof-responser på det relevante allergen ved de IgE-forårsagede lidelser,

DK 155174 B

20 for hvilke arten af de dominerende sensibiliserende proteiner er kendt. Det forhold, at protein-D-GL-konjugater inducerer selektiv inhibering af IgE-antistof men ikke mindsker IgG-antistofresponser på det samme antigen, opfylder kriterier for ideelle egenskaber hos 5 terapeutiske midler af denne type til anvendelse ved behandling af allergiske humanlidelser.

Eksempler på en række af miljøets antigener, de såkaldte allergener, som er protein- eller proteinagtige stoffer, og som ved fremgangs-10 måden ifølge opfindelsen kan omdannes til antigen-D-GL-konjugater og benyttes til behandling, omfatter, men er ikke begrænset til: hormoner, såsom insulin; pollen, såsom ambrosiepollen, bermudagræspollen, hundegræspollen og timothé-pollen, blomsterpollen, såsom Chrysanthemum leucanthemum-pollen, og træpollen, såsom birkepollen; gifte, 15 såsom bigift, hvepsegift og slangegift; dyreskæl, såsom hesteskæl; dyreepidermis, såsom katteepitel; levnedsmiddel proteinallergener, såsom fra kuller (en fisk tilhørende torskefamilien) og jordbær; husstøvmider; svampe, såsom bagegær (Saccharomyces cerevisiae); skimmelsvampe, såsom Alternaria tenuis; toxiner, såsom difteritoxin; 20 toxoider, såsom tetanustoxoid; proteiner, såsom ovalbumin; enzymer, såsom trypsin, chymotrypsin og ficin samt derivater af disse allergener.

Ud over de allergener i miljøet, som medfører allergiske symptomer i 25 hypersensitive individer, har de ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse fremstillede midler terapeutisk betydning ved behandlingen af autoimmune lidelser. Autoimmune lidelser kan ramme næsten en hvilken som helst del af legemet. Visse responser er rettet mod organspecifikke antistoffer og kan være rettet mod en 30 nærmere bestemt celletype, f.eks. parietalceller (mavesaftsecernerende) i maveslimhinden ved perniciøs anæmi. Andre responsformer er rettet mod vidt udbredt forekommende antigener og er forbundet med disseminerede lidelser, f.eks. antinukleare antistoffer ved systemisk lupus erythematosus (SLE). Ved andre lidelser ligger respons-35 formerne mellem disse yderpunkter, f.eks. aflejres der ved Good- pasture's sygdom, som er ejendommelig ved kronisk glomerulonefritis og lungeblødninger, antistoffer på nyregiomerulernes og lungeparen-kymets basalmembraner.

DK 155174 B

21

Der kan også dannes antistoffer mod specifikke cellereceptorsteder, hvilket forekommer ved myasthenia gravis, hvor antistoffer mod acetylcholinreceptorsteder hæmmer transmissionen af nerveimpulser.

Der kan endvidere dannes antistoffer mod insulinreceptorsteder, 5 hvilket blokerer insulinets binding til cellerne og derved hæmmer hormonets regulerende virkning.

Eksempler på autoimmune lidelser og det ansvarlige antigen er: i« Thyroidea Hashimoti's thyroiditis Thyroglobulin (hypothyroidisme)

Thyrotoxicose Thyroideacelle- (hyperthyroidisme) overflade

Mave-faktor(l) Perniciøs anæmi Indre parietal - slimhinde (vitamin B,, mangel) celler 15 u

Binyrerne Addison's sygdom Binyreceller

Hud Pemphigus vulgaris Epidermal celler

Pemphigoid og Basalmembran mellem epidermis og dermis 20 Øje Sympatetisk ophthalmia Uvea Røde blodlegemer Autoimmun hæmolytisk anæmi Overflade af røde blodlegemer

Blodplader Idiopatisk thrombocy- Blodpladeoverflade topenisk purpura 25

Skelet- og Myasthenia gravis Muskelceller og hjertemuskel "myoide" thymus- cel1 er

Lever Primær galdecirrhose Mitochondrier (galdevejene) (i det væsentlige) 30

Spyt-og tåre- Sjogren's sygdom Omfatter sekre- kirtler tionskanaler,

mitochondrier, kerner og IgG

Synovial- Rheumatoid arthritis Fc-område af IgG

membraner m.m.

De ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse fremstillede midler finder anvendelse til behandling af patologiske tilstande, heri indbefattet en hvilken som helst antistoffejl funkti on. Eftersom 35

DK 155174 B

22 et stort antal individer som tidligere anført er hypersensitive over for udefra kommende antigener, har en behandlingsmetode, hvorved disse allergiske symptomer mildnes, umådelig terapeutisk værdi. Ved indgivelse i sådanne hypersensitive individer af de ved 5 fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse fremstillede midler opnås der en betydelig undertrykkelse af IgE-antistofproduktionen som respons på de specifikke sensibiliserende antigener.

10 15 20 25 30 35

Claims (3)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et terapeutisk immunosuppres-sivt middel, der omfatter et konjugat af en D-glutaminsyre/D-lysin- 5 copolymer og et antigen, kendetegnet ved, at D-glu-taminsyre/D-lysincopolymer med en middelmolekyl vægt på fra ca. 34.000 til ca. 64.000 og et giutaminsyre/lysin-molforhold på ca. 60:40 omsættes med et antigen, der er udvalgt fra gruppen bestående af proteiner og proteinagtige stoffer samt oligodeoxynucleotider og 10 nucleinsyrer.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at omsætningen udføres ved en pH-værdi på 10-12.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at antigenet udvælges blandt eller hidrører fra insulin, ovalbumin, lactalbumin, bermudagræspollen, timotépollen, hundegræs-pollen og græspollenkombinationer, ambrosiepollen, ambrosieantigen-E, birketræspollen, bigi ft, slangegift, hesteskæl, katteepitel, 20 kuller, husstøvmider, Chrysanthemum leucanthemum, Alternaria tenuis, trypsin, chymotrypsin, tørråd, bagegær, tetanustoxoid, difteritoxin, ficin, thyroglobulin, thyroidcelleoverflader eller cytoplasma, parietal celler, adrenalceller, epidermal celler, uveacelleoverflader, basalmembranceller, overfladen af røde blodlegemer, overfladen af 25 blodpladeceller, muskelceller, acetylcholinreceptormateriale, myoide thymusceller, mitochondrier og sekretionskanal celler. 30 35