JPH09502969A - アレルゲンに対するホストの免疫応答を調節するための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、興味ある免疫原、特に外因性抗原またはアレルゲンである免疫原に対するホスト免疫応答の調節または選択的抑制に有用な新規組成物および方法を提供する。目的の組成物には、抗体、誘導抗体、および興味ある免疫原に関して反応性の一次抗原の抗体様分子が含まれる。抗体または抗体様もしくは抗体誘導分子には、Fab のような抗体フラグメント、およびあらゆる種、特にヒトのフレームワーク領域中に移植することができる相補性決定領域ペプチド(CDR)が含まれる。また、これらの分子には、異種ハイブリドーマとの細胞融合、または DNAクローニングおよび発現により産生した感作ヒトリンパ球から誘導した抗体も含まれる。他の組成物には、Ｔ細胞クローンまたはハイブリドーマから得た、Ｔ細胞受容体(TCR)分子を含むか、または精製 TCR調製物として含む。また、TCR の相補性決定領域または超可変領域のいくつかまたはすべてに対応する免疫反応性ペプチドも用いる。

Description

【発明の詳細な説明】 アレルゲンに対するホストの免疫応答を調節するための 方法および組成物 １．発明の分野 本発明は、概して免疫学の分野、特に免疫原、とりわけアレルゲンのような外 因性抗原に対するホストの免疫応答を調節するための方法および組成物に関する 。本発明では、抗体、およびＴ細胞受容体(TCR)を含む抗体誘導分子を用いて、 これらの抗原に対する免疫応答をダウンレギュレーション（下方規制）する。 ２．発明の背景 ２．１ アレルギー疾病 アレルゲンに対する免疫応答のすべてのパターンは、Ｔリンパ球がアレルギー 性疾病の発生の中枢であることを示す(Romagnani、1992、Immunol．Today、13： 379〜380；O'Hehir et al.、1991、Ann．Review Immunol.、９：67〜95)。次の アレルゲン処理および抗原提示細胞(APC)による提示に次いで、これらの細胞は 、ヘルパーＴ細胞として、Ｂ細胞と協力して免疫グロブリンIgE のような抗体を 産生する。肥満細胞および好塩基細胞上の受容体は、アレルゲン特異 IgEと結合 する。その後アレルゲンに曝されると、アレルギー性症状を起こす炎症性分子が 放出される。 また、アレルゲン感作Ｔリンパ球も、アレルギー性応答の初期に直接関与する 。このことには、インターロイキン５のようなサイトカインの放出、それによる 喘息および関連疾病における好酸球媒介アレルギー性応答の促進が含まれる。ま た、それらの応答は、感作性アレルゲンと接触させることにより起こるような、 局所的炎症応答を起こす。 接触感作性アレルゲンの環境からの供給源には、自然に発生する化合物、例え ば、毒性オークおよびキヅタならびに汚染物質および工業用化学物質中に存在す るアルキルカテコールが含まれる。 ２．１．１ IgE 媒介疾病：喘息、アレルギー性鼻炎およびアトピー性皮膚炎 典型的な即時型アレルギー反応は、 IgEサブクラスの抗体により媒介され、種 々の環境アレルゲンに向けられている。これらの世界中で最も共通するものは、 ちりダニ、草からの花粉、樹木、広葉草、カビの胞子、および動物の鱗屑である 。初期感作後にこれらに曝すことにより、肥満細胞からのヒスタミンおよびプロ スタグランジンを含む炎症性分子の部類の放出により生じる即時反応が起こる。 細胞活性化の第２の変動は、数時間後に発生し、白血球浸潤を伴う脈管炎として 皮膚に現れ、好酸球およびリンパ球浸潤により肺に現れる。第２相の反応は、慢 性変化の促進、およびアレルギー性疾病を起こすことが多い過敏症によると考え られる。 ２．１．２ ちりダニアレルゲン 最近の数年間にわたり、アレルギー性鼻炎と特に喘息とにおける、ちりダニ抗 原(DMA)アレルギーの強い併発の証拠が、強まっている。近年の研究（GergenとT erkeltaub、1992年、J．All．Clin．Immunol.、90：579〜588）では、喘息を伴 わないアレルギー性鼻炎が、３種のアレルゲン、ちりダニ（ハウスダスト）、ブ タクサ、およびドクムギ(rye grass)だけに対する皮膚試験反応性と相関するこ とが示された。喘息単独では、ハウスダストおよび不完全真菌に対する反応性だ けに相関する。他の多くの報告には、家庭内のちりダニと喘息との間の密接な物 理的関連が示されている（Sporik et al．、1992年、Clin．Exp．All．、22：89 7〜906；Platts-Mills、1992年、J．All．Clin．Immunol.、89：1046〜1060）。 ちりダニには、２つの主要な種類、Dermatophagoides pteronyssinus（Der p ）およびDermatophagoides farinae（Der f ）がある。30種のタンパク質の部類 を、各種類から誘導したアレルゲンの調製物中で確認した；ただし、グループＩ のMw 25,000 とグループIIのMw 14,000 だけが、主要なダニアレルゲンとして認 識される。各グループ内で、タンパク質は、２つの種の間で高い交差反応性を有 する。これらの２種のタンパク質は、アレルギー性個体中のIgE の反応性の60〜 70％に達する。 ２．１．３ ドクムギアレルゲン 草および雑草のアレルゲンは、アレルギー性鼻炎および喘息の有力な原因であ る。草のほとんどは、農業的に栽培されるか、または観賞用に栽培され、住宅地 域で一般的に行われている。5000以上の草の種の約１ダースだけが、重要なアレ ルゲンであり、その理由は、多くの草が膨大な花粉を生成しないからである。重 要なアレルゲン草には、ライムギ、オオアワガエリ、ケンタッキーブルーおよび ケンタッキーブルーグラスが含まれる。異なる種の多くのアレルゲンは、抗原性 により交差反応し、アミノ酸配列に相同性を示し、Ｔリンパ球およびＢリンパ球 エピトープを分けることができる。 温帯に広く分布するドクムギ（Lolium perenne）は、花粉に感受性のある個体 にアレルギー反応を誘発する。５群のアレルゲン（Lol p I 、II、III 、IV、お よびV ）を、いくつかの複合的形態で、確認した（Marsh et al.、1987；Thomas 、1991年；Mathiensen et al．、1991年）。Lol p I は、主要なアレルギー性種 である。高められたLol p I 特異的 IgEのレベルを、95％までの草花粉アレルギ ー性患者の血清に見いだされた（Freidhoff et al.、1986年、J．All．Clin．Im munol.、78：1190〜1201）。Lol p I は、分子量34kDa の酸性糖タンパク質であ り、花粉の細胞質ゾル中に存在する。所定の IgE免疫優性エピトープを確認した 。例えば、Lol p I のトリプシン消化により得たＣ末端ペプチド（aa 213〜240 ）には、IgE結合部位が含まれることが見いだされた。また、Lol p I Ｃ末端か らの合成ペプチドにも IgEおよび IgG結合部位が含まれる（Van Ree et al.、19 92年）。 ２．１．４ TC媒介アレルギー性皮膚疾病：毒性オークおよびキヅタ皮膚炎 毒性オークおよびキヅタ皮膚炎は、直接的Ｔ細胞媒介アレルギー性反応の一例 である。この反応は、ハプテンウルシオールが皮膚に接触した場合、このハプテ ンウルシオールに対抗して発生する。このハプテンは、植物の油中に見いだされ る3-n-アルキルカテコールの混合物であり、体タンパク質に結合する。この結合 物は、Ｔ細胞を刺激し、このハプテンが結合する皮膚または他の細胞を直接攻撃 する。 疾病のＴ細胞病因は、モルモットおよびマウスを含む毒性オーク皮膚炎の動物 モデルにおける研究により確認された。動物における移動研究は、アレルギー反 応が、感作した動物から正常な動物へＴリンパ球により移り得ることを示した。 ヒトおよび動物の研究では、アレルゲンに対するＴ細胞反応の特異性が確認され た。これらの化合物の特異性および抗原性は、主として共通のカテコール構造に 存在する。ウルシオールを用いて見出されるこれらの免疫反応は、種々の確認さ れた感作体、例えば塩素化炭化水素およびエポキシ樹脂により発生する反応の代 表例である。 ヒトの場合、経口除感作は、３〜６カ月間毎日油を投与することが必要である ため煩わしいが、極めて効果的である。ウルシオールに対する抗体は直接的には 示されていないが、脱感作した患者からの血清の抗体画分は、マウスに耐性を運 び、調節抗体としての役割を示唆する。 ２．２ タンパク質抗原に対するIgG 媒介応答：RTA 他の場合、望ましくない免疫応答が、タンパク質抗原、例えば、リシンＡ鎖(R TA)に対して発生することがある。このタンパク質は、リンフォカインまたはモ ノクローナル抗体、例えばmAb 791T/36（免疫毒素）のような、標的物質に結合 する場合、結腸直腸ガンに向けられ、標的細胞を消滅させることができる。RTA は極めて強い免疫原であり、動物またはヒトへの免疫毒素の一回投与により、こ の分子のすべての部分に対する活発な IgG免疫応答が生じる。 ２．３ アレルギー性疾病の免疫 Ｔリンパ球、主としてCD4+サブセット(Th2)は、空気アレルゲン媒介免疫応答 の初期および維持において重要な役割を演ずる(Peltz、1991；O'Hehir et al.、 1991；Romagnani、1992)。感受性のある患者をこれに曝すと、Ｔリンパ球はＢリ ンパ球と協力してサイトカインを産生する。これらのサイトカインは、Ｔ細胞と Ｂ細胞、ならびに免疫ネットワークの他の細胞、例えば、マクロファージと相互 作用する。これらのリンフォカインは、ヘルパーＴ細胞およびＢ細胞の高められ た生成を刺激する。さらに、ヘルパーＴ細胞は、特徴的リンフォカインプロファ イルを有する２つの異なるサブセット(Th1およびTh2)に分化する。Th2細胞は、 インターロイキン４(IL-4)を産生し、IL-4は、IgE抗体合成に必要な信号の１つ である。IgE合成に関する第２の信号は、次のＴ細胞受容体／CD3複合体および主 要組織適合遺伝子複合体クラスII分子の認識が含まれる、同種のＴ−Ｂ細胞相互 作用を生じる(Romagnani、1990；Geha、1992)。 IgE産生におけるそれら細胞の役割に加え、Th2リンパ球は、他のリンフォカイ ン、特にインターロイキン５(IL-5)を産生し、これらのリンフォカインは好酸 球の補充および好酸球媒介毒性応答を開始するために必要である(Clutterbuck e t al．、1988、Blood、73：1504；Lopez et al.、1988、J．Exp．Med.、167：21 9)。また、ＩＬ−５は、サイトカイン、塩基性粒状タンパク質、および血小板活 性化因子の放出を伴うほとんどの細胞の顆粒消失を促進する。Ｔリンパ球は即時 および後期相反応のいずれでも臨界的ではないが、より直接的には後期相に含ま れる。このことは、ステロイドが後期相を妨げるのに有効であるが、即時相反応 では異なるという事実から証明される。 アレルゲンに対する免疫応答のこのすべてのパターンは、免疫グロブリンＥお よび好酸球増加症の発生という、空気アレルゲンに対するアレルギー性応答の２ つの主要成分のピボットのようなものとしてのＴ細胞を含む（O'Hehir et al.、 1991、Ann．Rev．Immunol.、９：67〜95）。したがって、免疫経路における種々 の任意の点での介入により、アレルゲンに対するＴ細胞応答を制御することは、 アレルギー性疾病を処置するための主要な方法を構成する。このことは、シクロ スポリンＡを用いた重い慢性喘息患者の処置から得られた結果によって示される 。シクロスポリンＡは、強い免疫抑制剤であり、第一にＴリンパ球に作用する。 シクロスポリンＡで処置した患者は、その喘息症状に臨床的な著しい改善が見ら れた。 ２．４ アレルゲンを用いる免疫療法 喘息、アレルギー性鼻炎、ならびにウルシオール皮膚炎を含むアレルギー性疾 病の免疫療法は、長年の間粗アレルゲン抽出物による除感作を用いて行われてい た。この種の免疫療法は、多くの患者で有効であり、免疫療法が停止された後で さえも、永続する利益を提供することができる(Busse、1988、J．All．Clin．Im munol.、82：890〜900)。草抽出物を用いた免疫療法は、アレルギー性鼻炎およ び喘息の処置に有用であると証明された(Creticos およびNorman、1987、JAMA、 258：2874〜2880；Creticos、1989、J．All．Clin．Immunol.、83：554〜562；R eid et al．、1986、J．All．Clin．Immunol.、78：590〜600)。同様の方法で、 重い喘息の患者をDMA-抗体複合体で処理して、著しく改善することができ(Machi els et al.、1990、J．Clin．Invest.、85：1024〜1035)、臨床上も改善され、 ハウスダスト抽出物で３年間免疫化した子供において(Creticos およびNorm an、1987、JAMA、258：2874〜2880；Creticos、1990、J．All．Clin．Immunol. 、83：554〜562；Bousquet et al．、1985、J．All．Clin．Immunol.、76：734 〜744)、およびブタクサから精製した AgE、またはその全抽出物のいずれかで脱 感作したアレルギー性喘息の患者において(Norman et al.、1968、J．All．、42 ：93〜108)、気管支刺激での気管支の感受性を減少させた。同様に、毒性オーク ／キヅタウルシオールを用いる、経口除感作は極めて有効であるが煩わしい。そ の理由は、この除感作が、このオイルを毎日３〜６カ月間投与することを必要と するからである。抗イディオタイプ抗体および調節Ｔ細胞のいずれか一方または 双方についての調節的役割に対する間接的な証拠は、種々の実験および臨床上の 研究で証明される。ウルシオールで除感作した患者は、マウスに耐性を与えるこ とができる免疫グロブリンを産生する(Stampf et al.、1990、J．Invest．Derm. )。しかし、この種の処置には、著しい困難性がある。アレルゲン抽出物は粗製 のものであり、結果として処置スケジュールを標準化することはできない。また 、処置が長期に経過することにより、患者の応諾が低くなる。アレルギー性抽出 物を用いる除感作により活性化される正確な免疫機構が知られていないので、通 常治療上の欠陥の原因を確立することができない。 Ｔ細胞依存アレルギー性応答の免疫調節が達成されることにより、種々の機構 を仮定することができる。１つの機構は、抗原の処理およびＴ細胞への提示を妨 げることである。他のものは、Ｔ細胞を、直接的にまたはＴ抑制細胞の産生によ り、許容させることである。この処理は、同種のＴ−Ｂ細胞相互作用またはサイ トカインの産生をいずれもブロックする。 抗イディオタイプ抗体および調節Ｔ細胞のいずれか一方または双方のための調 節的役割の間接的証拠は、種々の実験および臨床上の研究により提供される。ウ ルシオールで除感作された患者は、マウスに耐性を与えることができる免疫グロ ブリンを産生する(Byers et al．、1990)。即時型過敏症における、除感作中の 一般的所見は、最初に IgE抗体が増加し、次いで減少することである。付随して 、アレルゲン特異 IgGにおいて増加が見られる(Creticos、PS、JAMA、268：2834 〜2839)。応答の特異性を注意深く研究する場合、自己抗イディオタイプ抗体が 生ずることが見出される(Gurka et al．、1988、Ann．Allergy、61：239〜243) 。 このことは、ドクムギ除感作の場合においても同様に示される。臨床上、抗イデ ィオタイプ抗体は、ヒト患者において、高められ、次いでドクムギ抽出物で除感 作した後、付随してアレルギー性鼻炎が減少する(Hebert et al.、1990、Clin． Exp．Immunol．、80：413〜419)。 ２．４．１ 抗イディオタイプ抗体(Ab2)を用いる免疫療法 抗イディオタイプ抗体を運ぶことにより、ＴおよびＢリンパ球で開始される応 答がいずれも抑制されるが、モノクローナル、またはポリクローナル抗イディオ タイプ抗体を用いる免疫療法は、アレルギー性疾病のための好結果が発揮されな かった。この理由は、実験系における応答が矛盾していたからである。一例にお いて、マウスの処置は、タバコモザイクウイルスのタンパク質ポリペプチドと反 応するマウスのモノクローナル抗体に対して産生されるポリクローナル抗イディ オタイプ抗体を用い、このデカペプチドに応答する抗体を産生するマウスの能力 を抑制した(Norton およびBenjamini、1987、Cell．Immunol.、109：418〜419) 。他の例において、ポリクローナル抗イディオタイプ抗体は、ポリクローナル抗 ベンジルペニシロイル抗体を用いて、モルモットを感作することにより生成し、 これらの抗体は、プレまたはポスト感作のいずれかを与える場合、抗ベンジルペ ニシリン IgE抗体応答をダウンレギュレーションすることが示された(Wetterwal d et al.、1986、Mol.Immunol.、23：347〜356)。また、モノクローナル抗体に 対するポリクローナル抗イディオタイプ抗体は、タバコモザイクウイルスのデカ ペプチドと反応し、感作に先立ち投与する場合、マウスにおいてこのデカペプチ ドに対する抗体（クラスは知られていない）の誘導を抑制した(Norton およびBe njamini、1987)。臨床上、個体への複数のミツバチ刺痛に耐性を有し、以前脱感 作に対しアナフィラキシーを生じたミツバチ飼育者からの血清の移入により、受 容者は好結果の脱感作を得られ(Bousquet、1987、J．All．Clin．Immunol.、79 ：947〜954)、さらに、移入された全血清には、ミツバチの毒液に対する抗イデ ィオタイプ抗体が含まれることが示された(Boutin et al.、1993、J．All．Clin ．Immunol.、印刷中）。このことは、応答をダウンレギュレーションする Ab2の 移入によると説明された。最近、このようにして好結果をもたらすように処置し た１名の患者で、移入された全血清にミツバチ毒液に対する抗イディオタイプ 抗体が含有されていたことが確認された。また、皮膚試験反応性の減少が、移入 後に観察された(Hebert、1991)。 しかし、一般に、モノクローナル Ab2抗体での処置が、特定の抗原に対する応 答をアップレギュレーション（上方規制）することを保証した。これらの抗原に は、ガンおよびウイルス抗原が含まれる(Fung et al.、1990、J．Immunol．、14 5：2199〜2206；Raychaudhuri et al．、1990、J．Immunol．、145：760〜767、 Kohler et al．、1989、Clin．Immunol．and Immunopath.、52：104〜116に概要 を述べられた）。これらのもののいくつかは、例えばガン抗原に対する臨床試験 である(Robins et al.、1991、Can．Res．、51：5425〜5429)。これらの所見に 一致して、モノクローナル Ab2を用いた予防接種は、Lol p I アレルゲンに対し て向けられ、IgEおよび IgG抗Lol p I 抗体のアップレギュレーションを生成す る〔Boutin et al．、1991、J．All．Clin．Immunol.、87（要約）197頁〕。す べての症例で、アップレギュレーションは、Ab3抗体の誘導により説明された。 ２．４．２ Ab1抗体を用いる免疫療法 Ab1による免疫応答の調節が研究されている。ウシ血清アルブミンに対するモ ノクローナル抗体を、アジュバントの欠損下に未処置マウスに与え、その抗原を 用いる後期免疫化に対する IgG応答をダウンレギュレーションすることができる (Eddy et al.、1987、J．Immunol．、138：1693〜1698)。また、プレ感作処理し たヒツジ赤血球に対するポリクローナル抗体は、その抗原に対する IgG応答を非 特異的にダウンレギュレーションすることができる(Heyman およびWigzell、198 4、J．Immunol．、132：1136〜1143)。これらの著者は、この作用がこの分子のF c部分による非特異的な抗原阻害に由来すると示唆している。しかし、これらの 研究は、確立された免疫応答の調節を示しているものではない。 Saint-Remy et al．は、種々の出版物(Machiels et al.、1990、J．Clin．Inv est.、85：1024〜1035；Saint-Remy et al．、1988、Eur．J．Immunol.、18：10 09〜1014)において、除感作に対し無反応性の患者からの血清に、抗原を添加す ることにより作成した自己の抗原−抗体複合体が、喘息およびアトピー性皮膚炎 を含む多種のアレルギー性疾病に対する IgE応答をダウンレギュレーションする ことができることを示している。抗原−抗体複合体の投与後、抗イディオタイプ 抗体のレベルが上昇し；このことが臨床上の改善と関連した。 これらの研究において作用の機構は、あまり研究されていない。複数の機構が 有望である。これらの機構には、Fc受容体により処理される抗原の非特異的阻害 、および抗原処理による抗原特異阻害が含まれる(Heyman et al.、1990、Immuno l．Today、11：310〜313；Wiersma et al.、1989、Scan．J．Immunol．、29：43 9〜448；Sinclair et al．、1987、Immunol．Today、８：7679)。しかし、ポリ クローナル抗血清は、IgG応答をダウンレギュレーションすることができると考 えられる。IgE応答をダウンレギュレーションするためのモノクローナル抗体の 使用は、著しく一層複雑である。その理由は、モノクローナル抗体の特異性を選 定する際に、いくぶん困難性があるからである。 ３．図面の簡単な説明 図１には、50μg の免疫毒素791T/36-RTA の一回注射により処置したBALB/cマ ウスにおける抗 RTA応答を、ELISA により測定したものを示す。 図２には、天然 RTA、熱処理 RTA（56℃、30分）(H-RTA)、グリコシル化して ない組換え RTA(rRA)、または末端マンノース残基を酸化するためにポリペプチ ドを過ヨウ素酸塩処理により生成した脱グリコシル化 RTA(dGA)のいずれかへの 、３種の抗 RTA mAbの結合を示す。 図３には、２種の他の抗 RTA mAbの同様の抗原調製物への結合を示す。H-RTA に対しては反応性が高く、他の種類には比較的反応性が低い。 図４には、抗 RTA抗体力価における結果を示す。BALB／ｃマウスを、50μg の 免疫毒素を用いて初期感作した後に、100μg の一回投与量を24時間静脈内に入 れて処置した。抗 RTA力価は、ELISA アッセイにより測定し、さらに結果を、対 照として、免疫毒素で感作し、匹敵する量の、ガン胎児性抗原に対する不適切な mAb、365 を注射したマウスと比較した、割合の減少として表す。 図５には、免疫毒素で免疫化した後、25〜200 μg の範囲の投与量で24時間与 えたmAb 608/7 の投与量応答効果を示す。 図６には、免疫化後に、２〜24時間の時間で静脈内に与えた 100μg のmAb 60 8/7 の注射の効果を示す。 図７には、免疫毒素で免疫化し、mAb 608/7（中身のあるバー）または等量の 不適切なmAb 365（抗 CEA）のいずれかで処置したBALB/cマウスの抗 RTA IgG応 答における 100μg のmAb 608/7 処置の効果を示す。 図８には、免疫毒素で免疫化するに先立ち−７〜０日に与えたmAb 608/7（抗 RTA）または365（抗 CEA）のいずれかを用いる前処置の効果を示す。 図９には、モノクローナル抗体 2C7による抗Der p I モノクローナル抗体 4C1 のDer p I への結合のインビトロでの阻害を示すグラフである。 図10には、ネズミ抗 2C7ポリクローナル抗イディオタイプ抗血清による、抗De r p I モノクローナル抗体 2C7のDer p I への結合のインビトロでの阻害を示す グラフである；他の抗Der p I モノクローナル抗体(4C1、5H6)、または抗Der p II モノクローナル抗体(6D6)、または抗ガン胎児性抗原モノクローナル抗体(337 、非特異的対照として含む）に対するポリクローナル抗血清は有効でない。 図11には、ネズミ抗Der p I モノクローナル抗体10B9、2C7、4C1、および1B12 による、Der p I へのヒト血清 IgEの結合の阻害を示すグラフである；A355、A3 80、A368、A361、A362、およびA385は、アトピー性皮膚炎の患者からの異なるヒ ト IgE抗血清を示す。 図12には、Der p I で免疫化し、次いで、感作後４、７、および14日に、ミョ ウンバン中で、３種の異なる投与量、３×５μg、３×10μg、または３×20μg の投与量の抗Der p I mAb H11 で処置したマウスの耳の厚みにおける抑制を示す 。次いで、動物の耳に10μg DMA または生理食塩水を注射することにより、28日 において、免疫性を試験する。横軸は耳の厚さの増加を示す。 図13には、３種のモノクローナル抗体の免疫ブロットプロファイルを示す。す べてはライの群Ｉに対するものである。最初に、免疫ブロットＡで示されたもの は、mAb 290-A-167 である；第２の免疫ブロットＢに示すものは、mAb 348-A-6 である；さらに第３の免疫ブロットＣに示すものは、mAb 539-A-6 である。３種 の抗原混合物を用いた：NIHからのライ群Ｉ（各ブロットのレーン１）、およびO mega 社（レーン２）およびPharmacia 社（レーン３）からの粗ドクムギ抽出物 である。 図14には、ライ群Ｉ抗原の分子量を示す硝酸銀染色した SDSスラブゲル（還元 条件下の 7.5〜15％試験）を示す。レーン１は分子量マーカーであり、レーン２ および３は、それぞれ、５μg／ウエル（レーン２）または10μg／ウエル（３） を有し、アフィニティクロマトグラフィにより精製したライ群Ｉ抗原である。 mAb のそれらの相同ポリスチレン結合抗ID Ab への結合の阻害が示されている。 陰性対照として用いた。各点は３種の実験結果の平均値を示す。 -6(b)、および539A-6(c)mAb のポリスチレン結合ライＩへの結合の阻害が示さ 種の実験結果の平均値を示す。 合 290A-167(a)；348A-6(b)、および539A-6(c)mAb への結合の阻害が示されて 実験結果の平均値を示す。 図18には、抗ライＩ mAb〔290A-167(a)；348A-6(b)および539A-6(c)、中身の あるバー〕またはそれらの相同の抗イディオタイプ Ab（細かい線を引いたバー ）による、ポリスチレン結合ライＩへのヒト IgEの結合の阻害を示す。各 mAbの 濃度は１μg／mlであり、抗イディオタイプ抗体については、この濃度は 250μg ／mlであった。 図19には、抗ライＩ抗体を消失させた３種の（Ａ、Ｂ、Ｃ）血清からのヒト自 害された結合を次に示す：290A-167＝34,400 c.p.m．、348A-6＝78,526 c.p.m. および539A-6＝67,006 c.p.m．〔抗原に対する対照としての抗Hb mAb(3E3)の結 合は、43,988 c.p.m．であり、何らの自己抗ID抗体によっても阻害されなかった 。〕 図20には、イディオタイプ抗体の投与による抗アレルゲン抗体の特異的抑制を 示す。マウスの数群を、種々の量（0.01〜10μg）の290A-167(Id)または10μgの 関連のない mAb（５マウス／群）の腹腔内注射により免疫化した。血液試料を定 期的に採取し、ELISA または PCAアッセイにおいて、特異的抗Lol p I Abについ て試験した。 図21には、特異的抗体レベルにおける規定時間外の変化を示す。動物に、mAb 290、または mAb 290と同一サブクラスの抗トランスフェリン mAbを注射した。 これは、mAb 290抗原；および図11に示す機構を用いるLol p I 抗原と交差反応 しない。血清を２週間の間をおいて採取し、さらに mAb 290への結合を説明され ているELISA アッセイにより１：100 の希釈で測定した。 図22には、mAb 290投与量の関数としての抗イディオタイプ抗体レベルを示す 。５匹のマウスの群に、Lol p I 抗原、および mAb 290の濃縮物または10μg の 抗トランスフェリン mAbを、図20に示す機構を用いて0.01〜10μg の範囲で注射 した。mAb 290 と反応する抗イディオタイプ抗体のレベルを、この明細書に記載 しているようにELISA アッセイにより１：100 の希釈でアッセイした。右側の軸 は、mAb 免疫化投与量（μg）を示す。 図23および24には、mAb 290による IgEおよびIgG 抗体の特異的阻害を示す。 ５匹のマウスの群に、10μg の mAb 290または同一サブクラスの関連のない mAb （抗トランスフェリン）を注射した。抗イディオタイプ抗体活性を消失させた後 、血清をいずれも１／50に希釈し、IgE クラスの抗Lol p I 抗体についてアッセ イし、あるいは、１／100 に希釈し、IgG₁クラスの抗Lol p I 抗体についてアッ セイした。マウスはLol p I を用いて最終的に９週間で免疫化された。 図25には、ウルシオール、毒性オーク／キヅタ中のアルキルカテコールの類で 、C15 またはC17 側鎖を有するものの構造を示す。 図26には、ペンタデシルカテコール(PDC)への放射性物質で標識した mAb 991 の結合が多種の関連化合物の存在下に測定された研究を概説する。結合の最大の 阻害は PDCおよびカテコールで見られた；ペンタデカン酸、側鎖の類似物、また はレゾルシノール、およびカテコール環の類似物であるが異なる位置に水酸基を 有するもので最小であった。 図27には、BALB/cマウスを１種以上の投与量の mAb 991で前処理し、次いで P DCに感作し、さらに同一化合物で免疫性を試験した（耳に塗布することによる） 。 図28には、マウスを最初に PDCまたはウルシオールで感作し、次いで21日後、 mAb 991を注射し、しかる後42日目にこれらのマウスの耳に塗布することにより 、免疫性を試験した。 図29には、免疫性を試験するに先立ち、感作したBALB/cマウスに、ミョウバン 中の複数の異なる投与量の mAb 991を注射した実験の結果を示す。この例では、 耳の厚さにおいて、対照を超えた減少割合が、控除された背景（非特異的）腫張 とともに示される。 ４．発明の開示 本発明は、興味のある免疫原、特に外因性抗原またはアレルゲンである免疫原 に対するホスト免疫応答の調節または選択的抑制に有用な、新規組成物および方 法を提供する。主題の組成物には、抗体、誘導した抗体、および興味ある免疫原 に関する一次抗原反応性を有する抗体様分子が含まれる。抗体または抗体様もし くは抗体誘導分子には、抗体フラグメント、例えば、Fab、および相補性決定領 域ペプチド(CDR)が含まれる。これらのペプチドは、あらゆる種、特にヒトのフ レームワーク領域に融合させることができる。また、これらの分子には、ヒト抗 体が含まれ、この抗体は、異種ハイブリドーマと細胞融合することにより、また は DNAクローニングおよび発現により産生した感作ヒトリンパ球から誘導した。 他の組成物には、Ｔ細胞受容体(TCR)分子が含まれ、この分子は、Ｔ細胞クロー ンまたはハイブリドーマから得るか、または、精製した TCR調製物として得る。 また、TCRの相補性決定領域または超可変領域のいくつかまたはすべてに対応す る免疫反応性ペプチドも用いる。 好適例では、抗体および抗体誘導分子ならびに TCRは、興味あるアレルゲンの 優性エピトープ対して向けられる。アレルゲンには、ハプテン、例えば、ウルシ オールおよび所定の薬、ならびにアレルゲン性タンパク質、例えば、ちりダニア レルゲン、カビ胞子、および花粉中のものが含まれる。ダウンレギュレーション すべきアレルゲンは、環境の供給源、食物、化粧品、または医薬および治療法か らのものである。ダウンレギュレーションすべき免疫応答には、これらに限定さ れないが、毒性オークおよびキヅタ皮膚炎を起こすようなＴ細胞反応、ならびに 喘息、アレルギー性鼻炎およびアトピー性皮膚炎のような IgE媒介疾病を起こす Ｔ細胞反応が含まれる。アレルゲンの特に重要なクラスは、一般に風媒のもので ある。風媒アレルゲンは、喘息およびアレルギー性鼻炎の重大な供給源である。 その理由は、患者が、風媒アレルゲンを、肺、細気管支、および鼻の気道に吸入 して曝され、または結膜との風媒の接触により曝されるからである。喘息および アレルギー性鼻炎およびアトピー性皮膚炎のような IgE媒介アレルギー性応答は 、提供した方法、ならびに IgG応答により媒介されたアレルギー性反応により調 節される。IgG媒介アレルギー性反応は、医薬およびリシンＡ鎖により例示され たような注入アレルゲンに対する感受性において特に重要な仲介である。 本発明の組成物は、少なくとも部分的に抗イディオタイプ抗体の刺激により、 および抗原処理および免疫ネットワークの刺激において含まれる細胞との相互作 用により、興味ある免疫原に対するホスト免疫応答を抑制すると考えられる。 また、本発明は、本発明の化合物を投与することにより、興味ある免疫原に対 するホスト免疫応答を選択的に抑制する方法を提供する。好適例では、ホストを 免疫原に感作した後、目的組成物をホストに投与することができ、これにより、 ホストの感受性を調節することができる。また、ホストの感作に先立ち、組成物 をホストに投与することができる。 ５．発明の詳細な説明 この明細書で用いる Ab1またはイディオタイプ分子は、抗体、TCR、または抗 体−もしくは TCR−誘導分子である。これらの分子は、一次免疫原またはアレル ゲンに結合するか、あるいはこれらと反応する。Ab2または抗イディオタイプ分 子は、抗体、TCR、または抗体−もしくは TCR−誘導分子である。これらの分子 は、一次免疫原に対する Ab1またはイディオタイプ分子に結合するか、あるいは これらと反応する。したがって、Ab1またはイディオタイプ分子はそれ自体、二 次抗原として機能する。二次抗原は、抗イディオタイプ応答を産生することがで きる。特に関連するものは、Ab1のアレルゲン結合部位に結合する Ab2である。 この明細書で用いる”抗体誘導”分子とは、抗体、抗体フラグメント、ハイブ リダイゼーションした抗体または抗体フラグメント、または抗体結合ドメインお よび異種ポリペプチドを含むキメラ分子をいう。本発明にかかる抗体誘導分子に は、少なくとも興味あるアレルゲンに対する Ab1の結合ドメインが含まれる。こ の結合ドメインには、Ab1の相補性決定領域(CDRS)が含まれ、フレームワーク領 域(FR)に結合する。このFRは、動物またはヒトからの配列であることがあり；動 物FRをヒトFRと置換することは、ヒト化した結合ドメインを産生する。 動物からの抗体の不変ドメインは、ヒトからの対応するドメインにより置換す ることができ、ヒト化抗体を産生させることができる。本発明にかかる抗体誘導 分子には、ヒト化した結合ドメインおよびヒト化抗体のいずれもが含まれる。 TCR は、抗体誘導 Ab1と類似させて用いることができる。興味あるアレルゲン のエピトープに対する結合部位を含有する TCRは、抗体誘導 Ab1と類似した方法 で機能させることができる。”TCR 誘導”分子とは、TCR、TCR フラグメント、 ハイブリダイゼーションした TCRもしくは TCRフラグメントまたはキメラ分子を いう。TCR 誘導分子の所定の例には、TCR の結合ドメインが組み込まれるが、欠 失した TCRの他のドメインを有することがあり、または他のタンパク質、例えば 血清アルブミンからの可溶性ドメインを有するキメラ分子中に形成されることが ある。この明細書に記載する"Ab1"には、文脈でこの意味が除外されない限り、 興味あるアレルゲンのエピトープに結合する TCR誘導分子が含まれる。 本発明の好適例では、単離し精製した抗体−または TCR誘導分子を含む。本明 細書で用いるような、”単離した”とは、抗体−または TCR誘導分子以外の実質 的な量または免疫学的に活性な量の血清成分を含まない組成物を意味する。特に 、単離した抗体誘導分子は、主要な血清タンパク質およびサイトカインまたはリ ンフォカイン中で実質的に失われる。”精製した”抗体または TCR誘導分子は興 味あるアレルゲンに結合しない分子を消失させる；特に、精製したAb1 は、Ab2 および他の抗原に対する Ab1を消失させる。 しかし、本発明の組成物には、Ab1が含まれる。この組成物には、免疫学的に 活性でない分子、例えば、この組成物を投与する種からの血清アルブミンが添加 される。 特に好ましい例では、Ab1抗体−または TCR−誘導分子が含まれる。この分子 には、Ab1分子が結合するアレルゲンを実質的に含まない。“実質的に含まない ”とは、抗体結合エピトープの数の比が少なくとも10：１、好ましくは 100：１ 、より好ましくは1000：１であることを意味する。 興味ある外因性抗原の１つの範疇は、環境アレルゲンとして言及する。本明細 書で用いるような、”環境アレルゲン”とは、ヒトを含む動物が外的接触により 曝されるビン（ｂｉｎ）アレルゲンをいい、皮膚または結膜接触および風媒アレ ルゲンの吸入が含まれる。環境アレルゲンには、免疫原性高分子およびハプテン が含まれる。 所定の興味ある環境アレルゲンには、花粉が含まれる。花粉は、裸子植物（例 えば、マツおよびイトスギ）、双子葉植物の被子植物（ニレのような広葉樹なら びにブタクサおよびオオバコのような多くの通常の広葉草）ならびに単子葉植物 の被子植物（例えば、草）を含む多くの高等植物により、風で分散される。本明 細書で示す方法は、あらゆる花粉アレルゲンに適用することができる。他のアレ ルゲンには、ちりダニの体および糞からのタンパク質からなるちりダニの抗原が 含まれる。これらの抗原は、ハウスダスト、マットレスおよびカーペット中に見 出されるが、空気で運ばれない。また、アレルゲンには、alternariaのようなカ ビも含まれる。本明細書に示す方法は、これらのあらゆるアレルゲンに適用する ことができる。 興味ある第２の範疇の外因性アレルゲンは、食物および食品から誘導されるア レルゲンである。多種の食物成分、特にタンパク質は、食物アレルギーを生ずる ことが知られている。例えば、コムギおよび関連する穀粒、ならびにラッカセイ のようなマメ科植物のタンパク質である。コムギおよびラッカセイのアレルゲン 性タンパク質は、単離されている。アレルゲン性コムギおよびラッカセイのタン パク質に対する Ab1は、本発明の１つの観点の特定例である。例えば、食物アレ ルゲンに対する Ab1を含む組成物である。食物アレルゲンに対する Ab1誘導分子 を含む化合物の投与は、食物アレルギーの抑制に有用である。 注目に値する例は、コムギグルテンおよび関連するタンパク質により提供され る。これらの例は、いく名かの個体において強いアレルゲンであり、食餌中のコ ムギ生成物に IgG媒介反応を引き起こす。食物アレルゲンに対する Ab1誘導分子 を含有する化合物の投与は、食物アレルギーの抑制に有用である。本発明の化合 物および方法は、細胞毒素医薬の成分として有用なリシンＡ鎖アレルゲンで見ら れるような、IgG 反応のダウンレギュレーションを規定する。他の免疫原性タン パク質医薬の例はインシュリンにより提供される。動物または組換えヒトインシ ュリンのいずれかを投与された糖尿病患者は、抗インシュリン抗体を発現するこ とが多い。 所定のタンパク質を含む他の食物アレルゲンは、Sampson et al.の、JAMA、19 92、268：2840〜2844に概説してある。 興味ある外因性アレルゲンの第３の範疇は、医薬および治療上のアレルゲンで ある。医薬アレルゲンの顕著な例は、複数のペニシリンおよび関連するβラクタ ム抗生物質である。ペニシリンに関するアレルギー性反応は、生命を脅かすこと がある。βラクタム抗生物質に対するAb1 誘導分子を含む組成物の投与は、抗生 物質アレルギーの抑制に有用である。 興味ある第４の範疇は、ハプテンのものであり、ウルシオール（毒性キヅタ／ オーク）のような低分子量化学物質または工業上の化学物質および環境化学物質 は、接触皮膚炎または肺炎を起こさせる。 ダウンレギュレーションされるべき応答は、毒性オーク皮膚炎により例示され るような、Ｔ細胞、またはチリダニ抗原により例示される、IgE、もしくはドク ムギ、またはリシンＡ鎖もしくはドクムギにより例示される、IgG により媒介さ れるものである。 アレルギー性応答のダウンレギュレーションにおいて有用な Ab1は、任意の抗 体クラスおよびサブクラス、例えば、IgM、IgE、IgG₁、IgG₂、IgG₄、等であるこ とができ、TCR が含まれる。クラスの確認は、結合ドメインの特徴付けと比較し て第２に重要である。Ab1 は、一部で、Ab1 の結合ドメインに対する Ab2の形成 を刺激することにより作用すると考えられる。したがって、Ab1 の特異的結合ド メインは、絶対的でないが、Ab1 分子の他の部分は相当改変される。これらの部 分には、クラスを決定する抗体の部分が含まれる。 同様の理由から、所望のアレルゲンエピトープ結合ドメインが存在すれば、Ab 1 のフラグメントは活性である。結合特異性を保持するいずれの共通抗体フラグ メントも用いることができる。また、クローン化した”フラグメント”、または 結合ドメインを暗号化する短縮遺伝子の発現により得られた部分的な抗体配列は 、本発明の範囲内にある。 さらに、Ab1 結合ドメインが他のタンパク質またはタンパク質ドメインに結合 したキメラ分子も、活性な免疫調整剤である。キメラタンパク質の”パートナー （同類）”は、アレルゲン結合ドメインが結合し、著しく多様な配列から選定す ることができる。いくつかの例で、１つのクラスの抗体からの結合ドメインは、 他のクラスの不変領域に結合し、クラススイッチ抗体を生成することができる。 不変領域が異なる種からの結合ドメインのものである場合、得られるキメラ抗体 は部分的に交換された種である。この方法を用いて、ヒトに注射する際に抗原性 が減少した部分的にヒト化した抗体を作成することができる。 所定の例では、キメラパートナーを選定することができる。その理由は、この キメラパートナーが所望の可溶性または局在特性を伝えるからである。例えば、 アレルゲン結合ドメインは、標的種のコラーゲンドメインに結合することができ る。得られたキメラは細胞外マトリクスにコラーゲンドメインが結合するために 注射部位に局在するままである。他の例では、キメラパートナーを選択する。そ の理由は、このキメラパートナーが、それ自体免疫学的に活性であり、アジュバ ントとして作用するからである。これらの例には、共通の細菌病原体のタンパク 質からの抗原性ドメインが含まれる。 本発明にかかる免疫調節分子は、活性のための不変ドメインを必要としないた め、IgG 不変ドメインのFc部分は、免疫抑制に必要でない。この結果は、Fcドメ インが免疫抑制に絶対的であるとする、Heyman et al．による研究での示唆に反 する。 ５．１ モノクローナル抗体の産生 興味ある抗原に対するネズミモノクローナル抗体を、当業者に良く知られた方 法により調製する（Goding、上述の文献）。BALB/cマウスは、特異的抗原調製物 を用いて、完全アジュバントおよび不完全アジュバントのような免疫学的アジュ バントの使用を含む種々のプロトコルにより免疫化した。脾細胞は、適当な特異 性の抗体を産生することを示したマウスから調製し、Ps-NS1、Sp2/0、X63-Ag8.6 54、NSO/1 等のようなネズミミエローマ細胞系からの細胞と、確立された方法(K ohler およびMilstein、1975、Nature、256：495〜497；米国特許第 4,376,110 号)を用いて融合させる。クローンは、２ラウンドの限界希釈法により選択する 。次いで、ハイブリドーマ細胞を培地中に保存し、またはプリスタン(0.5ml)の 注射に先立ち、BALB/c雌マウスの腹膜空間中で増殖させる。ハイブリドーマ細胞 を注射した後、10〜15日のマウスから、腹水症液を採取し、この液をプロテイン Ａセファロース4Bカラムに通過させることにより抗体を精製する。 ５．２ ヒト化モノクローナル抗体の産生 ヒト化するモノクローナル抗体に関する最も進んだ技術は、CDR 移植またはリ シェーピング(Riechmann et al．、1988、Nature、332：323〜327)といわれてい る。この機構では、ネズミ抗体の相補性決定領域(CDR)をヒト抗体中の対応する 領域に移植する。CDR は、Ｈ鎖中に３つ存在し、Ｌ鎖中に３つ存在する。また、 これらの CDRは、特異的抗原に結合するマウス抗体の領域である。これらの CDR は、すべての既知マウス可変領域の配列、およびすべての既知ヒト可変領域の配 列に対して、マウスモノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列を確かめるこ とにより確認する。これらの CDRを、Kabat et al.(Sequences of Proteins of Immunological Interest、４版、米国 Department of Health and Human Servic es、米国 Government Printing Office、ワシントンDC、1987)を参照して得た 。このことにより、フレームワーク領域(FR)および CDR中へネズミモノクローナ ル抗体の可変領域を分裂させることができる。CDR が各抗体に特有であるため、 およびこのフレームワークが所定のアイソタイプのすべての抗体に対し比較的一 致するため、この比較により CDRを構成するアミノ酸の番号付けが明らかになる 。これらの CDRをヒトのフレームワークに移植するために、２種の基本的方法を 用いることができる。キメラ状のＬ鎖およびＨ鎖をマウスハイブリドーマのゲノ ム DNAクローンから構成することができ、次いでこれらの可変領域を発現ベクタ ー中のヒト不変領域に結合させることができる。この発現ベクターには、指定さ れたヒト不変領域が含まれる。クローン化cDNAの５′末端および３′末端を、ポ リメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いることにより変更する。(Erlich et al.、1988 、 Nature、331：461〜462)。次いでこれらのベクターをコス細胞系のような哺乳類 細胞に導入し、上清液を分析して抗体結合力の保有を確認する。この後、PCR 技 術を用いて、マウス CDRを有効なヒトのフレームワーク領域に挿入するか、また は全可変領域をマウス CDRの配列および既知のヒトのフレームワーク領域に基づ き配列決定することができる。ある範囲のヒトのフレームワーク領域が存在し、 発現ベクターに挿入された。有効なヒトのフレームワーク領域は、ネズミの抗体 のアミノ酸配列と著しくよく似ており、これが選択される。その理由は、これら のCDR がこのようなフレームワーク中で一層適した”適合”を見出されると考え られるからである。これらのリシェーピングしたヒトの可変領域を指定されたヒ トの不変領域を含む発現ベクター中でクローニングし、エレクトロポレーション により、コス細胞のような細胞に DNAを添加し、この混合物に電圧をかけ（例え ば、1,900 ボルト、10分）、インキュベーションして洗浄する。上清を再び試験 して、最初の抗体の結合を保持する抗体の存在を確認する。設定した処理中に、 ヒトフレームワーク領域中のわずかな位置が、臨界的位置として強調されること が多い。これらの位置で見出されるアミノ酸を保持するのが最良であるかどうか 、またはこれらアミノ酸を最初のネズミの抗体に存在するアミノ酸に変更するべ きかどうかは、いつも明らかなわけではない。したがって、結合が最適状態にお よばない場合、これらの変更を後日行うことができる。 最適な発現のために、（コス細胞は、これを用いる処理は容易であるが、抗体 産生力が高くないことが多いため）これらのベクターを、CHO 細胞のような異な る哺乳類細胞系に導入する。 この技術の他の方法は、CDR を直接クローニングし、所望のヒト抗体の可変領 域フレームワーク、および不変領域フレームワーク領域、いずれも含むベクター に挿入することができる。これらの技術は、種々の変数を有する。その変数は、 使用するプライマおよびベクター、発現系として用いる細胞、ネズミ抗体フレー ムワークに最もよく似たヒトフレームワーク、この後者の決定を行うことによる （アミノ酸配列の簡単な比較によるか、またはネズミ抗体の予想される三次元構 造のコンピュータモデリングおよび次にはこのコンピュータモデリングを、アミ ノ酸変化を有することがある選択したヒトのフレームワークに適合させることに よる）方法ならびにヒト化抗体のために DNAを運ぶための任意の最終的細胞系の 選択である。これらの技術は広範な多くの出版物に詳細に説明されている。これ らには：(WintersおよびMilstein、1991、Nature、349：293〜299；Riechmann e t al.、1988、Nature、332：323〜327；Hird et al．、1991、Br．J．Cancer、6 4：911〜914；GassowおよびSeemann、1991、Methods in Enzymology、pp．99〜1 21；Jones et al.、1986、Nature、321：522〜525；Verhoeyen et al.、1988、S cience、239：1534〜1536；Riechmann et al.、1988、Nature、332：323〜327； Kamman et al．、1989、Nucl．Acids Res.、17：5404；Maeda et al.、1991、Hu m．Antibod．Hybridomas、２：124〜133)がある。 ５．３ ネズミモノクローナル抗体の特徴付け−ヒト化 ネズミ起源のモノクローナル抗体を、ネズミ免疫グロブリン成分に関するタン パク質の免疫原性を減少させるための種々の方法により、ヒト化させる。１つの 方法には、ネズミ mAbのＶ領域を暗号化するcDNA分子をヒトの不変領域を暗号化 する DNAに結合させることによりキメラ抗体を生産することが含まれる。この方 法は、発行された特許に記載されている種々の方法を用いることができる。キメ ラ化の方法には以下のものが含まれる： (1) マウスハイブリドーマ細胞からの、メッセンジャ RNA(mRNA)の単離、次い で、クローニングおよびcDNA産生。 (2) 精製したmRNAからの全長cDNAライブラリの調製、このmRNAからの軽鎖(L) および重鎖(H)遺伝子は、適切な可変(V)領域遺伝子フラグメントを確認すること ができ、配列決定され、不変(C)領域遺伝子セグメントと矛盾しない。 (3) cDNA調製およびクローニングによる、Ｃ領域遺伝子セグメントモジュール の調製。 (4) クローン化した特異的免疫グロブリンＶ領域遺伝子セグメントをクローン 化したヒトＣ領域セグメントモジュールに結合させることによる、完全Ｈ鎖また は完全Ｌ鎖コーディング配列の構築。 (5) 原核細胞および真核細胞におけるキメラＬ鎖およびＨ鎖の発現および産生 。 詳細な方法は、Cabilly et al.の、米国特許第 4,816,567号（1989年３月28日 ）；Taniguchi et al.、欧州特許第EP 171496 号（1986年２月19日）；およびKu do et al．の、EP 184187 号（1986年６月11日）；ならびに、Cabilly et al.、 1984、Proc．Natl．Acad．Sci.、USA、81：3273〜3277；Morrison etal.、1984 、Proc．Natl．Acad．Sci.、USA、81：6851〜6855；Neuberger et al.、1985、N ature、314：268〜270；Tan et al.、1985、J．Immunol．、135：3564〜3567；S un et al.、1987、Proc．Natl．Acad．Sci.、USA、84：214〜218；Lui et al.、 1987、J．Immnol.、139：3521〜3526；およびHorowitz、1988、Proc．Natl．Aca d．Sci.、USA、95：8676〜8682を含む出版物に提供されている。 ５．４ Ab1 の選択 種々の基準を用いて、ダウンレギュレーションすべきアレルゲンに対する好まし いモノクローナル抗体を選択することができる。これらには次のものが含まれる ： ５．４．１ 選択したモノクローナル抗体がこれらの例において アレルゲン混合物中のヒト IgE免疫優性タンパク質を 認識することの証明。これらの例ではアレルゲンは単 一成分ではなく混合物である。 多くの天然アレルゲンは、タンパク質の混合物を構成し、これらのタンパク質 は、20種以上におよぶ。機能的には、臨床上重要な主要なヒト免疫応答（空気ア レルゲンの場合にはほとんどが IgEである）は、これらのタンパク質の１〜４種 に対して向けられている。例えば、ショートブタクサは、IgE 応答の50％以上が Amb v I に対して向けられている（初期の文献で AgEとして知られている）。他 の例は、ドクムギのLol p I タンパク質であり、IgE の80％までがこのタンパク 質に対して反応する。第３の例は、ちりダニアレルゲン中のDer p I タンパク質 およびDer p IIタンパク質である。これらのアレルゲン中で、これら２つのタン パク質は、IgE 応答が50％を十分超えたことの原因である。 このようなタンパク質を確認するために、免疫ブロッティングを用いることが できる。この方法では、粗抗原抽出物を SDS-PAGE にかけ、分子量によりこれら のタンパク質を分離する。次いで、所定のアレルゲン混合物と臨床上反応する患 者からの血清を、これらの分離したタンパク質上に重層する。これらのタンパク 質をニトロセルロース紙上に電気的に移した。インキュベーション後、これらの ストリップをペルオキシダーゼで標識した抗ヒト IgE血清のような試薬の添加に より発色させる。このことにより、タンパク質を確認し、これらタンパク質の相 対的貢献度を、これらタンパク質の単離、および患者の血清からの IgEの吸収に より証明することができる。IgG 免疫優性エピトープの確認は、抗ヒト IgG血清 を用いて行うことができる。セクション６．５．３を参照。 ５．４．２ 選択したモノクローナル抗体がタンパク質上のヒト IgE免疫優性エピトープを認識することの証明。 ある範囲のネズミまたはヒトモノクローナル IgGもしくは IgM抗体は、本明細 書に規定され、当業者によく知られている標準的方法により作成する。このパネ ルの抗体を用いて、ヒト IgEまたは IgG含有血清がこれらタンパク質に結合する のを実質的に阻害する能力について各抗体をチェックすることにより、この分子 上の免疫優性エピトープを確認する。実質的な阻害は、少なくとも20％、好まし くは40％、より好ましくは50％、60％、75％、またはほぼ90％である。あるいは また、ヒト IgEまたは IgG含有血清が各モノクローナル抗体の結合を阻害する能 力を試験することができる。後者の場合、¹²⁵Iを用いてモノクローナル抗体を放 射性物質で標識し、タンパク質を用いてコーティングしたポリスチレンリムーバ ウエルストリップに添加することができる。ウエルのインキュベーションおよび 洗浄後に残る放射能の測定は、ブロッキングの量を示し、免疫優性エピトープを 確認する。通常、このようなタンパク質は、２〜６個の免疫優性エピトープを有 し、これらのエピトープと反応するモノクローナル抗体は、次の研究のために選 択される。 ５．４．３ 選択したモノクローナル抗体が、アレルゲン特異免 疫療法を受けるものを含む、ヒトにおいて誘発される 抗イディオタイプ特異性と同様の抗イディオタイプ特 異性を刺激することの証明。 アレルゲンの場合、除感作を受け、それらの症状の臨床上の改善を享受するヒ トは有用である。また、これらの患者の血清中に自己抗イディオタイプ抗体の特 異性を確認することも、IgE 応答のダウンレギュレーションに効果的であると考 えられるAbの確認を促進する。その理由は、これらの抗体がダウンレギュレーシ ョンのための適切なエピトープを順に確認する、自然に発生する Ab1に対して向 けられていると考えられるからである。したがって、候補モノクローナル Ab1の 特異性を確認するための１つの方法は、¹²⁵I標識した”候補”モノクローナル抗 体がタンパク質に結合するのを阻害されるこれら抗体の能力を測定することであ る。このような１つの方法において、自然に発生するポリクローナルヒト Ab1を 、抗原を用いて吸着させることにより除感作した患者の血清から除去する。結果 として、これらの抗体はアッセイを妨げることがない。また、ネズミモノクロー ナル抗体が試験されるべきである場合、これらの抗体は、セファロースCL4Bにカ ップリングした正常なネズミ IgGに取り込まれる。次に、血清を、ネズミモノク ローナル抗ライLol p I モノクローナル抗体がその抗原に結合するのを阻害する ことについて試験する。この血清は、本明細書では問題のタンパク質に対する A b2抗体だけを含有する。この抗原は、ポリスチレン製のリムーバウエルストリッ プ上にコーティングされる。また、本明細書では放射性物質で標識した、候補モ ノクローナル抗体を吸収させたヒト血清と混合するか、または単独でインキュベ ーションする（陽性対照として）。ウエルを洗浄し測定する。放射能の減少は、 阻害の割合を追認し、著しく高い量で存在する自己抗イディオタイプ抗体の特異 性を認識するモノクローナル抗体を確認する。 一般に、抗体は、除感作患者中に誘発された少なくとも20％、より好ましくは 40％、50％、60％、75％またはそれ以上の自己抗イディオタイプ抗体と結合する 。 ５．４．４ 動物のｍＡｂでの治療が、アレルゲンに対する免疫応答に有為な負 作用を与えることの例証 動物モデルが存在する場合には、カクテルとして用いることができる選択され たモノクローナル抗体の、免疫応答に負作用を与える能力を、試験することがで きる。この場合において、この動物を、アレルゲンをアジュバントを用いて、用 いずに、またはエーロゾル形態で投与することにより感作することができる。次 に、候補となるモノクローナル抗体を、感作前または感作から種々の時間経過後 に注射し、これらの、一次応答または抗原チャレンジへの応答のいずれかに負作 用を与える能力を試験した。試験したほとんどの場合において、応答は、少なく とも５０％の幅で負作用を受けた。 これらの基準を用いて、ＩｇＥ応答の負作用に用いる最適な抗体を識別する。 広範囲の抗原または抗原混合物に対する免疫応答に、適切なＡｂ１により負作 用を与えることができる。最も複雑な場合、即ち種々のタンパク質から成る生得 のアレルゲンの場合において、以下の一連の試験は、適切なＡｂ１の選択におけ る補助となる： １．混合物中の免疫主体タンパク質の識別 多くの生得のアレルゲンが、２０種より多いタンパク質の混合物から構成され ているが；臨床的に重要である官能的に主要なヒト免疫応答（ほとんどのエーロ アレルゲン(aeroallergrn)の場合におけるＩｇＥ）は、これらのタンパク質の１ 〜４種に対するものである。１つの例は短いブタクサであり、ここで５０％を超 えるＩｇＥ応答が、Ａｍｂ ｖ １（初期の文献においてはＡｇＥとして知られ ている）に対するものである。他の例はライグラス中のＬｏｌ ｐ Ｉタンパク 質であり、ここで８０％以内のＩｇＥが、このタンパク質に対して反応する。第 ３の例はダストマイトアレルゲン中のＤｅｒ ｐ Ｉタンパク質およびＤｅｒ ｐ ＩＩタンパク質であり、ここでこれら２種のタンパク質は、５０％を大きく 上回る応答の原因となる。 このようなタンパク質を識別するために、イムノブロット法を用いることがで きる。この方法において、粗製抗原抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて、タン パク質を分子量ごとに分離する。次に、所与のアレルゲン混合物に臨床的に反応 性である患者からの血清を、ニトロセルロース紙上に電気的に転写した(electro transferred)、分離したタンパク質上に載せる。インキュベートした後、ストリ ップを、試薬、例えばペルオキシダーゼで標識したヒト抗ＩｇＥ血清を加えるこ とにより、現像する。これは、タンパク質を識別し、これらの相対的寄与を、タ ンパク質の分離および患者の血清からのＩｇＥの吸着により、例示することがで きる。 ２．次に、免疫主体エピトープを、適切なタンパク質上で識別する： ある範囲のマウスまたはヒトモノクローナルＩｇＧまたはＩｇＭ抗体を、本明 細書中の他の箇所に規定されており、当業者によく知られている標準的方法によ り製造する。この抗体のパネルを用いて、分子上の免疫主体エピトープを識別す るには、各抗体の、血清を含むヒトＩｇＥが、タンパク質に結合するのをほとん ど阻害する能力をチェックする。あるいはまた、血清を含むヒトＩｇＥの、各モ ノクローナルへの結合を阻害する能力を試験することができる。後者の場合にお いて、モノクローナル抗体を、ヒト血清と混合した¹²⁵Ｉで標識し、タンパク質 で被覆したポリスチレンリムーバウェル(removawell)ストリップに加える。ウェ ルをインキュベートし、洗浄した後に残存する放射能の測定により、ブロッキン グの量が定量され、免疫主体エピトープが識別される。通常、このようなタンパ ク質は、２〜６種の免疫主体エピトープを含み、これらのエピトープと反応する モノクローナル抗体を、他の研究用に選択する。 ３．アレルゲンの場合には、除感作を受け、症状の臨床的改善を享受しているヒ トを被検者とすることができる。これらの患者の血清中の自己抗イディオタイプ 抗体の特異性の識別もまた、ＩｇＥ応答の負作用に有効である傾向があるＡｂの 識別を補助する。その理由は、これらが、その後負作用に適するエピトープを識 別する、天然に存在するＡｂ１に対することが予想されるからである。従って、 候補となるモノクローナルＡｂ１の特異性を識別する１つの方法は、これらの、¹²⁵ Ｉで標識した「候補の」モノクローナル抗体が、タンパク質に結合するのを 阻害する能力を測定することである。このような方法の１つにおいて、天然に存 在するポリクローナルヒトＡｂ１は、除感作したヒトからの血清から、抗原との 吸着により除去され、従ってこれらはアッセイに悪影響を与えない。また、マウ スモノクローナル抗体を試験する場合には、これらは、セファロースＣＬ４ｂに 結合した正常マウスＩｇＧに吸収される。ここで、当該タンパク質に対するＡｂ ２抗体のみを含む血清を、マウスモノクローナル抗ライＬｏｌ ｐ Ｉモノクロ ーナル抗体の抗原への結合の阻害に関して試験する。この抗原をポリスチレンリ ムーバウェルストリップ上に塗布し、ここでは放射性標識した候補モノクローナ ル抗体を、吸収されたヒト血清と混合するかまたは単独でインキュベートし（ポ ジティブ対照として）、ウェルを洗浄し、放射能の減少により、阻害の百分率を 確認し、最高の量で存在する自己抗イディオタイプ抗体の特異性を認識するモノ クローナル抗体を識別する。 ４．動物モデルが存在する場合には、カクテルとして用いることができる選択さ れたモノクローナル抗体の、免疫応答に負作用を与える能力を、試験することが できる。この場合において、この動物を、アレルゲンをアジュバントを用いて、 用いずに、またはエーロゾル形態で投与することにより感作することができる。 次に、候補となるモノクローナル抗体を、感作前または感作から種々の時間経過 後に注射し、これらの、一次応答または抗原チャレンジへの応答のいずれかに負 作用を与える能力を試験した。試験したほとんどの場合において、応答は、少な くとも５０％の幅で負作用を受けた。 明らかに、臨床的に重要であるアレルゲンが、１種のタンパク質、例えば共に ＩｇＥ反応を誘発する、ニワトリ卵白中の卵白アルブミンまたはタラ中のパルア ルブミンあるいはＩｇＧ反応を誘発する牛乳中のカゼインのみを有するかまたは 、臨床的に重要なアレルゲンが、１種のエピトープ、例えばＴ細胞応答を誘発す るウルシオールのみを有する場合には、この選択方法を、短縮することができる 。 ６．実施例：ダストマイトアレルゲンに対するＡｂ１ ６．１ ダストマイトアレルゲン ダストマイトアレルギーは、ある範囲のアレルギー性疾患、主に喘息、アレル ギー性鼻炎および場合によってはアトピー性皮膚炎の原因である。これらの疾患 が、種々の他のアレルゲン、例えば花粉により誘発されるが、ダストマイトは、 最も主要な３種のオフェンダー(offender)の１つに分類される。このアレルギー は、Dermatophagoides属、特にDermatophagoides pteronyssinus(Der p)およびD ermatophagoides farinae(Der f)属のマイトに暴露されることにより発生する。 これらのマイトは、広範囲に、家庭のほこり、マットレス、敷物等中に見出され 、従ってこれらは、一年を通じて症状を発生する。少なくとも24種の異なるタン パク質が識別されているが、Der I(分子量24,000)およびDer II(分子量15,000) が、主要なマイトアレルゲンとして一般的に認識されている。これらのタンパク 質は、配列決定およびクローン化されており、現在では、いずれのエピトープが T 細胞およびIgE 抗体との反応の原因であるかを決定することができる。Der I 抗原とDer II抗原との間には、顕著な相同性があり、従って地理的に1 種が他の 種よりも優勢であっても、両方の種のダストマイトが同様の症状を発生する。ダ ストマイトアレルゲン、例えばD．pteronyssinusに対して感作された個体は、Ig G、IgA およびIgE 抗体を形成する。これらは、アトピー性個体中で生存し、ア レルギー性症状と相関する。複数のサブクラスの抗体が形成されうるが、アレル ギー性疾患に関わるものは、IgE レベルである。これらの疾患に対する主要な療 法の1 つである除感作の結果、IgG レベルが上昇し、IgE レベルが低下する；こ れは、症状の軽減に相関する。 ６．２ ダストマイト生成物 マイト体を含む、Dermatophagoides pteronyssinusまたはDermatophagoides f arinae(DMA)からの全ダストマイト生成物、便および培養基(10g)を、リン酸緩衝 液、ｐＨ7.3(10ミリリットル/g）に加え、４℃で一夜を通じてかきまぜた。生成 した混合物を、100,000gで1 時間遠心分離した。上清を除去し、50％の飽和硫酸 アンモニウムで沈殿させた。沈降物を、4,000rpmで15分間遠心分離することによ り除去し、リン酸緩衝液、ｐＨ7.3(PBS)中で再懸濁させた。この生成物を、PBS( 48時間にわたり、４リットル、４回交換）に対して透析し、生成物を-20 ℃で保 存した(DMA)。この組成は、SDS PAGE分析により特徴付けられる。Der p I タン パク質の濃度を、イムノアッセイにより測定し、米国シャーロッツビル所在のバ ージニア大学のMartin Chapman博士により提供された標準値(Luczinska等，1989 ，「J．Immunol．Methods」、118:227-2359)と比較した。 ６．２．１ 精製したＩ群マイトアレルゲン Der p I およびDer f I 生成物を、適切なマイトのDMA 抽出物から、不溶化さ れた抗Der IIモノクローナル抗体(例えば、1114/2F1O-表 1: 7AI，Lombardero 等、1990，「J．Immunol．」、144:1353-1360，1990)に対するアフィニティーク ロマトグラフィーにより分離した。一例において、マウスモノクロール抗体1114 /2F1O(50mg)を、臭化シアン活性化セファロース 4B と結合させた。ダストマイ ト抽出物を、1114/2F1O mAb- セファロース 4B を含むカラムに適用し、結合し ない物質を、PBS で長時間洗浄することにより溶出させた。次に、結合生成物を 、50％エチレングリコールに溶解した0.005Mグリシン、ｐＨ10で溶出させた。溶 出生成物を50％硫酸アンモニウムで沈殿させ、PBS に再溶解し、２リットルのPB S に対して数回透析した。最終生成物を、-70 ℃で保存した。 ６．２．２ ＩＩ群マイトアレルゲンの精製 Der p IIおよびDer f II生成物を、適切なマイトのDMA 抽出物から、不溶化さ れた抗Der IIモノクローナル抗体(例えば、1114/2F1O-表 1: 7AI; Lombardero 等、1990，「J．Immunol．」、144:1353-1360)に対するアフィニティークロマト グラフィーにより分離した。一例において、マウスモノクロール抗体1114/2F1O( 50mg)を、臭化シアン活性化セファロース 4B と結合させた。ダストマイト抽出 物を、1114/2F1O LUB- セファロース 4B を含むカラムに適用し、結合しない物 質を、PBS で長時間洗浄することにより溶出させた。次に、結合生成物を、50％ エチレングリコールに溶解した0.005Mグリシン、ｐＨ10で溶出させた。溶出生成 物を50％硫酸アンモニウムで沈殿させ、PBS に再溶解し、２リットルのPBS に対 して数回透析した。最終生成物を、-70 ℃で保存した。 ６．３ マウス抗Der p および抗Der f モノクローナル抗体の形成 ６．３．１ 免疫化プロトコル ＢＡＬＢ／ｃマウスを、以下のスケジュールに従って免疫化した：完全フロイ ントアジュバント（ＦＣＡ）に溶解した２５μｇのＤＭＡを、初期免疫化（０日 目）として、腹膜内に放出し、次に種々の間隔、即ち９〜５６日間隔で、これら を、再び、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）に溶解した２５μｇのＤＭ Ａと共に、２〜４回、腹膜内注射した。通常絶命させる３日前に、ＰＢＳに溶解 した２５μｇのＤＭＡを、静脈内注射した。マウスを、４５〜６０日目に絶命さ せ、脾臓の単一細胞懸濁液を調製し、当業者に知られている慣用法（Embleton等 、「Br．J．Cancer」、43:582-587，1981; KohlerおよびMilstein、「Nature」 、256:495-497，1975; 米国特許第4,376,110 号明細書）により、マウス骨髄腫 NSO 細胞と融合させた。 ６．３．２ ハイブリドーマ選択プロトコル ハイブリドーマを選択するのに、ＥＬＩＳＡ試験(ELISA and Other Solid Phs ae Immunoassays編、D.M．Kemeny およびS.J．Challacombe，1988)(Wiley)によ りダストマイト生成物(DMA)のPBS 抽出物と反応する抗体に関して、培養液上清 をスクリーニングした。要するに、ポリビニルマイクロタイタープレート(polyv inyl microtiter plate)(Falcon”MICROTEST III”等)を、当量の５μg/ウエル のDer p I で、ダストマイト生成物(DMA)を、一夜を通じてインキュベートする ことにより被覆した。ウェル中の被覆していない反応性部分による、非特異性抗 体結合を低減するために、マイクロタイタープレートを、トリス緩衝液ｐＨ7.3 に溶解したカゼインでブロックした。組織培養液上清を、マイクロタイタープレ ートウェルに、45分間にわたり加え、次に、過剰量を、PBS で洗浄することによ り除去した。マウスイムノグロブリンにペルオキシダーゼ結合したウサギ抗体を 加え、結合した抗体を、基質2,2'-アジド-ジ-(3-エチルベンゾチアゾリンスルホ ン酸)(ABTS)を加えた後に、色形成により検出した。一次スクリーンにおいて選 択したハイブリドーマを、２回クローン化し、ハイブリドーマ系列を確定した。 クローン化したハイブリドーマからのモノクローナル抗体(mAb)を、種々の方法 により精製し、さらに特徴付けした。ハイブリドーマ上清から精製したmAb を用 いてイムノブロット法を実施し、ここで、Der p 抽出物を、SDS-PAGEにかけ、次 にニトロセルロースに移し、その後mAb で染色した(Thompson 等、1988，「J．I mmunol．」、64:311-314)。標準(例えばDer p I)と比較することにより、これは 、mAb と反応するDer p 抽出物の成分を識別することを可能にした。選択された mAb の、他の抗ダストマイト抗体と比較した特徴を、ブロッキングアッセイを用 いて、さらに特定した。この方法において、試験されているmAb を、ダストマイ ト抽出物(DMA)で被覆したマイクロタイタープレートに加え、このようにして抗 原部位をブロックした。所定の抗体、例えば抗Der p I 抗体5H8 の結合の阻害(C hapman等、「J．Immunol．」、139:1479-1484，1987)は、試験されているmAb が 、標準抗体と同一または極めて類似するDMA 上のエピトープを認識することを示 している。mAb 結合の阻害を測定するために、ビオチニル化したmAb を、ブロッ クしたマイクロタイタープレートに加え、結合した抗体を、ストレプトアビジン −ペルオキシダーゼ結合体を加えることにより検出し、次に洗浄後に基質(ABTS) により検出した。 マウスmAb の、感作された患者の血清中の抗体がダストマイトアレルゲンに結 合するのを阻害する能力を、ブロッキングアッセイにより同様に検出した。これ らの試験において、試験されているmAb を、ダストマイト抽出物で被覆したマイ クロタイタープレートに加えた。次に、患者血清の結合の阻害を検出するために 、第１に患者血清をマイクロタイタープレートに加え、洗浄し、結合したヒトＩ ｇを、ヤギ抗ヒトＩｇペルオキシダーゼ結合体、続いて基質(ABTS)で検出した。 ６．３．３ マウス抗Der p および抗Der f モノクローナル抗体への抗イディオ タイプ抗体応答 モノクローナル抗体に対するマウス抗イディオタイプ抗体を調製するのに、同 系交配したＢＡＬＢ／ｃマウスを、キーホールリンペットヘモシアニンに結合し たモノクローナル抗体で、完全フロイントアジュバント、次に不完全フロイント アジュバントと共に免疫化した。一例において、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、第１に 、ｍＡｂ−ＫＬＨ（５０μｇ）不完全フロイントアジュバントで、次に不完全フ ロイントアジュバントに溶解したｍＡｂ−ＫＬＨ（５０μｇ）で２回、２週間お きに、免疫化した。次に、抗血清を、７〜１４日後に、抗Der p I モノクローナ ル抗体２Ｃ７（表２）および４Ｃ１のイディオタイプを決定するのに用いられる 抗体の源として得た(Chapman等、1987「J．Immunol．」、139:1479-1484)。ｍＡ ｂ ２Ｃ７のDer p I への結合を、¹²⁵Ｉで標識したｍＡｂ ２Ｃ７を用いたラ ジオイムノアッセイにより検出した。この結合の、ある範囲の抗イディオタイプ 抗体による阻害を、Der p アレルゲンで被覆したマイクロタイタープレートに加 える前に、¹²⁵Ｉで標識したｍＡｂ ２Ｃ７を抗血清と混合することにより検出 した。２Ｃ７の結合は、２Ｃ７に対する抗イディオタイプ抗体によってのみ阻害 された。４Ｃ１のDer p I への結合は、４Ｃ１に対する抗イディオタイプ抗体に よってのみ阻害された。これらの発見は、ｍＡｂ ２Ｃ７および４Ｃ１が、Der p I 上の密接に関連するエピトープを認識するが、これらは、異なる別個のイデ ィオタイプを有することを示す。 ６．４ マウス抗Der p ハイブリドーマ細胞系列 ６．４．１ ｍＡｂ １１０２／Ｈ１１ ｍＡｂを、１０％胎児ウシ血清を加えたＲＰＭＩ １６４０培地中に保持され たハイブリドーマ１１０２／Ｈ１１細胞の培養液上清から得た。ｍＡｂ １１０ ２／Ｈ１１を、セファロースプロテインＧ(Pharmacia)に対するアフィニティー クロマトグラフィーにより精製し、イソタイプ分析により、この抗体がイムノグ ロブリンIgG₁であることが確認された。 １１０２／Ｈ１１のダストマイト結合抗原との反応性を、このＤＭＡ生成物へ の結合のＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。さらにＳＤＳ ＰＡＧＥにかけ、 ニトロセルロースに移した後にDer p タンパク質に対してイムノブロット法によ り特徴づけを行うことにより、ｍＡｂ １１０２／Ｈ１１が、Der p Ｉ上のエピ トープに結合するマウスｍＡｂ ５Ｈ８（クローン５Ｈ８ Ｃ１２ Ｄ９）を検 出したのと同等の２４ｋＤａ成分と反応したことが示された(Chapman等、「J．I mmunol．」、139:1479-1484，1987)。 ブロッキングアッセイを用いて、ｍＡｂ １１０２／Ｈ１１と反応するダスト マイト抗原エピトープと４Ｃ１との関係をさらに試験した。これを図４に示し、 これは、ｍＡｂ １１０２／Ｈ１１が、ビオチニル化４Ｃ１のダストマイト抽出 物（ＤＭＡ）への結合を阻害したことを示す。これらの発見により、ｍＡｂ Ｈ １１が、ｍＡｂ ４Ｃ１により認識されたエピトープと同一であるかまたは極め て類似するDer p エピトープと反応することが確認された(Chapman等、「J．Imm unol．」、139:1479-1484，1987)。 表１に、扁桃または末梢血液からのヒトリンパ球を、ヒト−マウスヘテロミエ ローマ(heteromyeloma)EL 41 と融合させることにより形成したハイブリドーマ により形成したヒトモノクローナル抗体を列挙する。 ６．４．２ ｍＡｂ １１０７／２Ｂ１１ 抗体を、１０％胎児ウシ血清を加えたＲＰＭＩ １６４０培地中に保持された ハイブリドーマ１１０７／２Ｂ１１の培養液上清から得た。ｍＡｂ １１０７／ ２Ｂ１１を、セファロースプロテインＧ(Pharmacia)に対するアフィニティーク ロマトグラフィーにより精製し、イソタイプを特徴付けして、加えられる抗体を 決定した。ＳＤＳ ＰＡＧＥにかけ、ニトロセルロースに移した後のイムノブロ ット法による、ダストマイト抗原反応性の特徴づけは、これが、２７ｋＤａのタ ンパク質と反応したことを示した。 ６．４．３ 他のマウス抗ダストマイトｍＡｂ 同様の手順を用いて、ダストマイトDer p およびDer f 抗原と反応する、ある 範囲のマウスｍＡｂを形成した（表２）。 ６．５ Der p I およびDer p IIアレルゲンに対する免疫応答に負作用を与える ためのマウス抗Der p ｍＡｂの選択 ダストマイトに対するアレルギー性応答に負作用を与えることができる、他の 一連の抗ダストマイトモノクローナル抗体を選択した。これらのモノクローナル 抗体は、Der p I およびDer p II、即ちダストマイト中の２種の主要なアレルゲ ンに対するものである（表２）。また、これらのモノクローナル抗Der p I およ びDer p II抗体は、Der f I およびDer f IIと交差反応し、従ってDermatophago ides pteronyssinusまたはDermatophagoides farinaeのいずれかにおけるアレル ギーに対して、アレルギー性応答を調整するのに有用である。 また、選択されたｍＡｂは、これらが血清ＩｇＥ抗体のDer p I またはDer p IIのいずれかに対する相互作用をブロックする能力により測定された、アレルゲ ンの免疫主体領域を認識する。ｍＡｂ ２Ｃ７をDer p I に対して用いて得られ たデータは、抗体選択、特徴付けおよび評価の１つの例を提供する。 ６．５．１ 抗Der p I ｍＡｂ ２Ｃ７ 抗Der p I ｍＡｂ ２Ｃ７を、６．３節に記載したように形成し、セファロー ス−プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより、ハイブリドーマ培 養液上清から精製した。このｍＡｂ（イソタイプＩｇＧ_2b）は、ＥＬＩＳＡアッ セイ（６．３．２節に記載した）により例示されたように、Der p I およびDer f I と反応した（表３）。 Chapmanおよび共同研究者により報告された過去の研究において(Chapman等、 「J．Immunol．」、139:1479-1484，1987)、マウスｍＡｂ ４Ｃ１は、血清Ｉｇ ＥのDer p I への結合を４０％までブロックするため、Der p I 上の免疫主体エ ピトープと反応することが示された。また、ｍＡｂ ４Ｃ１は、Der p I および Der f I 上のエピトープと交差反応性であった。ｍＡｂ ２Ｃ７と反応するDer p I エピトープと４Ｃ１との密接な関係は、交差ブロッキングアッセイを用いて 示された。この方法において、ダストマイト抽出物で被覆したＥＬＩＳＡマイク ロタイタープレートを、ある範囲の濃度のｍＡｂ ２Ｃ７と共にインキュベート した。洗浄後、ｍＡｂ ４Ｃ１の結合を、ビオチンで標識したｍＡｂ ４Ｃ１を 用いて測定した。このアッセイにおいて、ビオチニル化ｍＡｂ ４Ｃ１を、スト レプトアビジン結合セイヨウワサビペルオキシダーゼを用いて検出した。この阻 害アッセイを用いて、ｍＡｂ ２Ｃ７は、ｍＡｂ ４Ｃ１と反応するDer p I 上 の抗原部位を完全にブロックしたことが示された（図９）。これらの発見は、ｍ Ａｂ ２Ｃ７および４Ｃ１により認識されたDer p I 上のエピトープが、同一で あるかまたは極めて類似していることを示す。対照的に、抗Der p I ｍＡｂ Ｈ １１（表３）は、ビオチニル化ｍＡｂ ４Ｃ１の、Der p I への結合をブロック することができなかった。従って、ｍＡｂ Ｈ１１は、ｍＡｂ ４Ｃ１と反応す るものとは無関係のDer p I エピトープを認識する。 ６．５．２ ｍＡｂイディオタイプの特徴付け ｍＡｂ ２Ｃ７および４Ｃ１結合エピトープの関係をさらに調査するために、 これら２種のｍＡｂのイディオタイプを決定した。ポリクローナル抗イディオタ イプ抗体を、ある範囲のマウス抗Der p I モノクローナル抗体（４Ｃ１，２Ｃ７ ，５Ｈ８）、抗Der p IIｍＡｂ（６Ｄ６）および対照ｍＡｂ ３３７（抗癌胚抗 原、ＣＥＡ）に形成した。これらのポリクローナル抗イディオタイプ抗血清を形 成するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、キーホールリンペットヘモシアニン（Ｋ ＬＨ）に結合したｍＡｂで、完全フロイントアジュバント、次に不完全フロイン トアジュバント中で免疫化した。 抗イディオタイプ抗血清を、抗Der p I ｍＡｂ（２Ｃ７、４Ｃ１および１０Ｂ ９）のDer p I ｍＡｂへの結合を阻害する能力に関してアッセイした。このアッ セイにおいて、種々の希釈度のポリクローナル抗イディオタイプ抗血清を混合し 、¹²⁵Ｉで標識したマウスモノクローナル抗体と共にインキュベートして、ｍＡ ｂと反応させた。次に、この混合物を、Der p I で被覆したＥＬＩＳＡマイクロ タイタープレートに加え、反応を、ラジオイムノアッセイにより測定した。図１ ０に示すように、抗ｍＡｂ ２Ｃ７血清は、２Ｃ７のDer p I への結合を完全に 阻害した。対照的に、抗４Ｃ１血清は、２Ｃ７のDer p I への結合を全く阻害し なかった。これらの発見は、ｍＡｂ ２Ｃ７および４Ｃ１が、密接に関連するが 同一ではないDer p I エピトープを認識することを示す。 ６．５．３ ヒトＩｇＥ抗体を誘発するDer p I エピトープと、マウス抗Der p I ｍＡｂと反応するこれらとの関係 Der p I （およびDer p II）に対するヒトＩｇＥ反応性に負作用を与えるため のマウスｍＡｂを選択するにあたり、有用な基準は、両方の抗体種が、同一のア レルゲンエピトープと反応することである。また、ダストマイトアレルゲンエピ トープは、主要な成分、即ち２５％以上、好ましくは少なくとも４０、５０また は６０％のヒトＩｇＥ応答の原因となる免疫主体成分であるのが好ましい。治療 用として一層大きい臨床的有用性のために、好ましいモノクローナル抗体は、多 くのヒト被検者中のアレルゲンに結合するＩｇＥを４０％以上阻害しなければな らない。このことは、ある範囲の抗Der p I ｍＡｂを用いて、これらが血清Ｉｇ Ｅ抗体のDer p I への結合を８０％以内ブロックすることを示す実験により、例 証された（図１１）。 これらの試験において、Der p I に対する高レベルの血清ＩｇＥ抗体を有する 、６人のアトピー性皮膚炎被検者からの血清を、試験した。Der p I で被覆した ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートに結合する、亜飽和量のＩｇＥ抗体を与え る、 あるレベルに希釈した血清試料を、マウスｍＡｂ（１００μｇ）と混合した。こ の混合物を、Der p I で被覆したマイクロタイタープレートに加えた。４℃で一 夜を通じてインキュベートした後、結合したヒトＩｇＥを、ヤギ抗ヒトＩｇＥセ イヨウワサビペルオキシダーゼ結合体を用いたＥＬＩＳＡにより検出した。図１ １に示すように、ｍＡｂ ２Ｃ７は、ヒト血清ＩｇＥのDer p I への結合を阻害 するにあたり、４種の抗Der p I ｍＡｂの中で最も有効であった。このｍＡｂに より、少なくとも５０％の血清ＩｇＥ結合が、試験した６人の患者からの血清の うち、５人分に関して得られた。得られた最大の阻害は、患者Ａ３６８からの血 清に関する８０％であった。対照的に、血清ＩｇＥ結合の４０％以上の阻害は、 マウスｍＡｂ ４Ｃ１を用いた６人分中１人分のみの血清試料に関してのみ得ら れた(Chapman等、「J．Immunol．」、139:1479-1484，1987)。 ６．５．４ ｍＡｂ ２Ｃ７およびヒト抗Der p I ＩｇＥ抗体のイディオタイプ の識別 ダストマイトアレルゲンに対するモノクローナル抗体を治療用に選択するにあ たり，重要な基準は、選択されたｍＡｂのイディオタイプが、ヒトＩｇＥ抗体の イディオタイプと同一であるかまたは極めて類似していることである。このこと をｍＡｂ ２Ｃ７に関して達成するためには、アトピー性皮膚炎患者の血清から のＩｇＥ抗体を、前記プロトコルに記載したように、ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗血清で 被覆したＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート上に捕獲した。次に、結合したヒ トＩｇＥの反応性を、マウス抗Der p I ｍＡｂに対して形成した、ある範囲のポ リクローナル抗イディオタイプ抗体を用いて決定した。表４にまとめた通り、ｍ Ａｂ ２Ｃ７に対するポリクローナルマウス抗イディオタイプ抗体は、高い抗De r p I 抗体レベルを有するアトピー性皮膚炎患者の血清からの６種のＩｇＥ生成 物すべてと反応した。対照的に、ＩｇＥ試料はいずれも、ｍＡｂ ４Ｃ１に対し て発生した抗イディオタイプ抗血清に結合しなかった。これらの観察結果は、ｍ Ａｂ ２Ｃ７のイディオタイプが、ヒトＩｇＥのイディオタイプに密接に関連す ることを示す。このことは、治療学的抗体の選択のための手法を支持し、これは 、ｍＡｂ ２Ｃ７に対する抗イディオタイプ免疫応答の刺激が、Der p I アレル ギーの免疫調節に適することを示す。 ６．６ マウスモノクローナル抗体のキメラ化−人間化 マウスから発生したモノクローナル抗体を、種々の方法により人間化して、マ ウスイムノグロブリン成分に関するタンパク質の免疫性を低下させた。１つの方 法は、マウスｍＡｂのＶ部を暗号化するｃＤＮＡ分子を、ヒト不変部を暗号化す るＤＮＡに結合させることにより、キメラ抗体を形成することを含む。このこと は、特許明細書（Cabilly 等、米国特許第4,816,567 号(1989 年3 月28日);Tani guchi 等、欧州特許第EP 171496 号(1986 年2 月19日)およびKudo等、欧州特許 第EP 184187 号(1986 年6 月11日)）並びにCabilly 等、「Proc．Natl．Acad．S ci.，USA」81:3273-3277，1984; Morrison等、「Proc．Natl．Acad．Sci.，USA 」81:6851-6855，1984; Neuberger 等、「Nature」314:268-270，1985; Tan等、 「J．Immunol．」、135:3564-3567，1985; Sun等、「Proc．Natl．Acad．Sci.， USA」84:214-218，1987; Lui 等、「J．Immunol．」、139:3521-3526，1987 お よびHorowitz，A.H．「Proc．Natl．Acad．Sci.，USA」95:8678-8682，1988を含 む刊行物に記載されている、若干の方法を用いて実施することができる。このキ メラ化方法は、以下の手順を含む： （１）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をマウスハイブリドーマ細胞から分離 し、次にクローン化し、ｃＤＮＡを形成する。 （２）精製ｍＲＮＡからの全長ｃＤＮＡライブラリーを形成し、これから、ライ ト（Ｌ）およびヘビー（Ｈ）鎖遺伝子の適切な可変（Ｖ）部遺伝子フラグメント を識別し、配列決定し、不変（Ｃ）部遺伝子断片と和合性とすることができる。 （３）Ｃ部遺伝子断片モジュールを、ｃＤＮＡ形成およびクローン化により形成 する。 （４）配列を暗号化する完全なＨおよびＬ鎖を、クローン化した特異的イムノグ ロブリンＶ部遺伝子断片を、クローン化したヒトＣ部断片モジュールに結合する ことにより構成する。 （５）キメラＬおよびＨ鎖を、原核および真核細胞中で発現させ、形成する。 ６．７ ＣＤＲ移植 人間化モノクローナル抗体は、マウス可変部のみを有し、種々の方法（Winter s およびMilstein、「Nature」349:293-299，1991; Riechmann等、「Nature」33 2:323-327，1988-，Hird等、「Br．J．Cancer」64:911914，1991; Gussow およ びSeemann，「Method in Enzymology」203:99-121，1991）を用いてＣＤＲ移植 ／新形態化することにより構成した。マウスｍＡｂの相補性決定部(CDR)を、ヒ ト抗体中の対応する領域上に移植した。ＣＤＲ（抗体ヘビー鎖中に３個、ライト 鎖中に３個）は、抗原エピトープに結合するマウスｍＡｂの領域である。ＣＤＲ の移植を達成するのに、ＣＤＲ ＤＮＡ配列を、マウスヘビーおよびライト鎖可 変（Ｖ）部遺伝子断片をクローン化することにより決定し、部位特異的突然変異 により、対応するヒトＶ部に移動する操作をした。所望のイソタイプのヒト不変 部遺伝子断片を加え、人間化したヘビーおよびライト鎖遺伝子を、哺乳類細胞中 で同時発現させて、人間化した抗体を形成した。 ＣＤＲを、齧歯動物モノクローナル抗体からヒトＦＲ上に移植して、ＰＣＲ方 法論(A.P．LewisおよびJ．S．Crowe、「Gene」1991，297-302)を用いて完全に人 間化した抗体または抗体フラグメントを作成する一般的な方法が、開発された。 ＣＤＲをブラケット(bracket)するＦＲ領域に結合するＰＣＲプライマーが開発 された；これらにより、関連するｍＡｂを分泌するハイブリドーマ細胞からのＣ ＤＲを増幅することができる。ＰＣＲ生成物をクローン化し、配列決定し、特別 の骨組および不変部に結合させる。 ７．実施例：ヒト抗Der p モノクローナル抗体の形成 Der p 抗原と反応するヒトモノクローナル抗体を、種々の方法により形成した 。これらには、ＤＭＡに対して感受性であるヒトドナーからの抗体形成細胞の、 当業者によく知られている方法を用いた、ヒトハイブリドーマまたはヒト−マウ スヘテロハイブリドーマの構成(Austin 等、「Immunology」67:525-530，1989) またはエプスタイン・バールウィルストランスフォーメーション(Roder等、「Me th.in Enzymology」121:140-167，1986)による不死化を含む。また、ヒト抗体は 、レパートリークローン化により得られる(Marks等、「J．Mol．Biol．」222:58 1-597，1991; Persson 等、「Pros.Natl．Acad．Sci．」86:2432-2436，1991; H use等、「Science」246:1275-1281，1989; Kang 等、「Pros.Natl．Acad．Sci． USA」80:4363-4366; Duchosal等、「Nature」355:258-262，1992)。 ７．１ ハイブリドーマ形成 リンパ球を、ダストマイトに対して感作されたヒト被検者からの末梢血液、扁 桃および脾臓を含む種々の組織から得た。細胞生成物を、「フィコール−ハイパ ック(FICOLL-HYPAQUE)」密度遠心分離により得、分離した直後またはインビトロ 刺激の後に融合させた。種々のインビトロ刺激方法を用い、これには、培地RPMI 1640中で培養したリンパ球の、ダストマイト抽出物での処理が含まれる。若干 の場合において、インビトロ培養条件には、免疫アジュバント、例えばアジュバ ントペプチド(Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、Sig ma)が含まれる。 ７．１．１ 融合プロトコル Austin等、「Immunology」1989，67:525-530に記載されたマウス／ヒトヘテロ ミエローマEL41細胞(1990 年5 月16日に、European Collection of Animal Cell Cultures に寄託し、寄託番号90051602として受諾された）を、ダストマイト抗 原と反応性であるヒトリンパ球と、Galfre等、「Nature」，1977，266:550 に記 載された方法に従って、ポリエチレングリコールを用いて融合した。例えば、リ ンパ球を、30ミリリットルのプラスチック製ユニバーサルボトル(universal bot tle)中に配置し、増殖培地、例えばRPMI 1640 で2 回洗浄し、リンパ球の数を、 血球計数器カウンティングにより測定した。EL41細胞を採取し、洗浄し、同様に してカウントした。次に、２種の細胞集団を、2:1 のリンパ球：融合パートナー (fusion partner)比率で混合し、３回目の洗浄をした。遠心分離した後、培地を 廃棄し、０．８ミリリットルの５０％ＰＥＧを、細胞ペレット上に、静かにかき まぜながら、１分間にわたり、ピペットで加えた。この混合物を、１分間放置し 、次に１．０ミリリットルの培地を、さらに１分間にわたり加え、次に２０ミリ リットルの培地を、５分間にわたり、ゆっくり加えた。次に、細胞を、１２００ ｒｐｍで５分間遠心分離し、培地を廃棄し、細胞を、２ミリリットルのピペット で静かに採取することにより、再懸濁させた。選択培地（ＲＰＭＩ １６４０＋ １０％ＦＣＳ＋１０^-4Ｍヒポキサンチン、１０^-5Ｍメトトレキセートおよび１． ６×１０^-6Ｍチミジン）２０ミリリットルを、最後に、細胞懸濁液に加え、細胞 を、支持細胞層としてｍｔ腹腔滲出細胞を含む、２種の９６ウェル細胞培養マイ クロタイタープレート中に等分した。さらに１００マイクロリットルの培地を、 各ウェルに加えた。選択培地を，形成したハイブリドーマが５０％合流に達する までは７２時間おきに、その後は４８時間おきに交換した。ハイブリドーマの増 殖を、規則的にチェックし、コロニーが、ウェルの５０％を覆った際に、上清を 、ダストマイト抗原と反応性であるＩｇに関して分析した。関連するＩｇを形成 したハイブリドーマを、直ちにクローン化した。形成したハイブリドーマを、１ ミリリットルの９５％ＦＣＳおよび５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の ２〜５×１０⁶個の細胞のアリコートとして凍結し、液体窒素中で保存した。 ７．１．２ リンパ球形成 末梢血液リンパ球を、ヘパリン化した(heparinized)血液を平衡塩類溶液で１ ：２ ｖ／ｖに希釈し、リンパ球分離培地(スコットランド、イリビン所在のFlo w Laboratories)によって遠心分離することにより、形成した。 リンパ球を扁桃または脾臓から、切断した組織を、１２０ゲージの格子を通し て細かくして、平衡塩類溶液中に入れることにより、形成した。洗浄後、リンパ 球をカウントし、生存率を、トリパンブルー色素排除により評価した。 ７．１．３ インビトロ刺激 ｉ．アジュバントペプチド（Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグ ルタミン、Boss，「Brain Res.」，1984，291:193）およびダストマイト生成物 リンパ球（２×１０⁶／ミリリットル）を、アジュバントペプチド（１０μｇ ／ミリリットル）およびダストマイト抗原（５μｇ／ミリリットル）と共に、１ ０％胎児ウシ血清を含む培地ＲＰＭＩ １６４０中で５日以内培養した。次に、 リンパ球を、直ちに、融合パートナーのヘテロミエローマＥＬ４１と融合した(A ustin 等、「Immunology」1989，67:525-530)。 ii．Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシン−メチルエステルでの前処理 リンパ球生成物を、Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシン−メチルエステルで処理する ことにより、大きい顆粒状リンパ球、マクロファージ、Ｃ７Ｌ前駆体およびエフ ェクター、若干のＣＤ８＋サプレッサーＴ細胞およびＮＫ細胞が除去される。こ れを用いて、ヒトモノクローナル抗体の形成のためのインビトロ免疫化方法を増 強させる(Borrebaeck等、1988，「Pros.Natl．Acad．Sci．USA.」85:3995)。要 するに、リンパ球を、１５分間、室温で、２５０μＭのＬ−ロイシル−Ｌ−ロイ シン−メチルエステルを含む培地ＲＰＭＩ １６４０中で培養した。次に、細胞 を洗浄し、１０％ヒトＡＢ血清、５０μＭの２−メルカプトエタノール、５ＩＵ の組換えインターロイキン２（ｒＩＬ−２）、２５％ ｖ／ｖの、ポークウィー ドマイトジェン（ＰＷＭ）（２４時間培養）で刺激した、照射したヒトＴ細胞か らの上清液およびダストマイト抗原５〜１００ｎｇ／ミリリットルを加えた培地 ＲＰＭＩ １６４０中で、２〜８日間培養した。また、組換えＩＬ−４（５０Ｕ ）およびｒＩＬ−６（１００Ｕ）を、若干の培養菌に、エキストラリンフォカイ ンブースト(extra lymphokine boost)として加えた。 刺激に続いてリンパ球を、ヘテロミエローマＥＬ４１と融合させた。 iii．インビトロ感作脾細胞(Boerner等、1991，「J．Immunol．」147:86-95) ２人のドナーからの脾細胞を、等しい濃度で混合し、１０％ＦＣＳおよびダス トマイト抗原１〜１０μｇ／ミリリットルを含む培地ＲＰＭＩ １６４０培地中 で、２〜５日間、３×１０⁶／ミリリットルに培養した。次に、リンパ球を、融 合パートナーのヘテロミエローマＥＬ４１と融合させた。 ７．２ ハイブリドーマ選択 ハイブリドーマを選択するのに、培養液上清を、ダストマイト抗原（ＤＭＡ） 生成物（６．３．２節参照）と反応する抗体に関して、ＥＬＩＳＡを用いてスク リーニングした。要するに、ポリビニルマイクロタイタープレート（Falcon "MI CROTEST III"等）を、当量の0.5 μｇ／ウェルのDer p I を含むダストマイト生 成物で被覆した。ウェル中の被覆していない表面部位への非特異的抗体結合を低 減するため、マイクロタイタープレートを、トリス−食塩水緩衝液ｐＨ7.3 に溶 解したカゼインでブロックした。ハイブリドーマ培養液上清を、ウェルに、４５ 分間にわたり加え、次に、過剰量を、ＰＢＳで洗浄することにより除去した。ヒ トイムノグロブリンに対するペルオキシダーゼ結合ウサギ抗体を加え、結合した 抗体を、基質（ＡＢＴＳ）を加えた後に、色形成により検出した。一次スクリー ンにおいて選択したハイブリドーマを、２回クローン化し、ハイブリドーマ系列 を、安定増殖用の培養方法を用いて確定した。初期融合生成物のハイブリドーマ 細胞生成物およびクローン系列を、凍結し、液体窒素中に貯蔵することにより、 保存した。 モノクローナル抗体を、種々の方法により精製し、特徴付けした。イムノブロ ット法を実施し、ここで、Ｄｅｒ ｐおよびＤｅｒ ｆ抽出物を、ＳＤＳ ＰＡ ＧＥにかけ、次にニトロセルロースに移し、その後ｍＡｂで染色して（Thompson 等、「Immunol.」64:311-314，1988; Chapman 等、「J．Immunol．」、139:147 9-1484，1987; Platts-MillsおよびChapman 、「J．Allergy Clin．Immunol．」 、80:755-775，1987）、各ｍＡｂが結合したダストマイトアレルゲンの分子量を 測定した。 ヒトｍＡｂと、ダストマイトアレルゲンに対して感作されたヒト被検者におい て形成した抗体との関係を、当業者によく知られている若干のイムノアッセイ（ 例えば、Didierlaurent およびGarcelon、「J．Immunol．Meth．」、145:221，4 1，1991）を用いて検出した。１つの方法において、マイクロタイタープレート （(Chapman等、「J．Immunol．」、139:1479-1484，1987)または臭化シアン活性 化ペーパーディスク(Didierlaurent およびGarcelon、「J．Immunol．Meth．」 、145:33-41，1991)を、ダストマイト抽出物で被覆した。アレルギー性ドナーか らの血清を、マイクロタイターウェルまたはディスク中でインキュベートし、洗 浄後、ヒトｍＡｂとの反応性の阻害を検出した。このために、ｍＡｂをビオチン に、慣用法により結合させた。次に、マイクロタイターウェルまたはディスク中 のビオチニル化ｍＡｂの結合の阻害を、第１にストレプトアビジン−ビオチン− ペルオキシダーゼ結合体（英国Amersham）および次にｏ−フェニレンジアミン（ ＯＰＤ）と共にインキュベートすることにより測定した。 ７．３ エプスタイン・バールウィルストランスフォーメーション エプスタイン・バールウィルス（ＥＢＶ）は、ＣＲ２補体レセプターを発現す るヒトＢリンパ球に選択的に感染するヘルペスウィルスである。Ｂリンパ球のイ ンビトロ感染により、細胞増殖が永久に刺激され、Ｂ細胞特性、例えばイムノグ ロブリン分泌が保持される(Roder 等、「Methods in Enzymology」、121:140-17 4，1986)。ＥＢＶトランスフォーメーションのために、マーモセット細胞系列Ｂ ９５−８から得られた組織培養液上清を用いた。この細胞系列は、１０％ＦＣＳ を含む標準ＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した際に、大量のウィルスを放出し た。 組織培養液上清を、増殖して合流したＢ９５−８細胞から採取し、次にこれを 、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０で１／２〜１／１０に希釈して用いて 、ヒトリンパ球（２×１０⁶／ミリリットル）に感染させた。この細胞を２時間 ３７℃でインキュベートし、次に洗浄し、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４ ０中で培養したかまたは洗浄せずに２４〜４８時間培養し、その後培地を、３〜 ４日おきに５０％交換した。 この細胞を、「COSTAR」プレート（２×１０⁶／ウェル）またはＵ底マイクロ タイタープレート（１０⁴／ウェル）中で培養した。放射したマウス脾臓細胞ま たはヒト末梢血液単核細胞を、支持細胞層として用いることができる。 ７．４ レパートリークローン化 Ｄｅｒ ｐおよびＤｅｒ ｆアレルゲンと反応する抗体を、組み合わせライブ ラリーからの抗原選択に基づいた方法により形成し、クローン化した(Orlandi等 、「Pros.Nat．Acad．Sci.」、86:3833-3837，1989;Persson 等、「Pros.Nat．A cad．Sci．USA．」88:2432-24360，1991;Kang 等、「Pros.Nat．Acad．Sci．USA ．」88:4363-4366;Duchosal等、「Nature」355:258-262，1992;Clackson 等、「 Nature」352:624-628，1991;Marks等、「J．Mol．Biol．」222:581-597，1991) 。当業者によく知られている一般的方法は、末梢血液(PBL)、扁桃組織(Ton-Ly) および脾臓(Spl-Ly)を含む種々の組織から由来する、ヒトリンパ球からのメッセ ンジャーRNA(mRNA)の抽出を含む。リンパ球は、ヒトアレルギー性被検者から由 来し、さらに、最初に、すでに記載したように、アレルゲンおよび免疫アジュバ ントに暴露することにより刺激することができる。リンパ球を刺激する他の方法 は、PBL、Ton-Ly等を、重症複合免疫不全症(SCID)のマウスに注射し、注射した マウスを、アレルゲン生成物、例えばダストマイト全抽出物(DMA)または精製し たタンパク質、例えばＤｅｒ ｐ IおよびＤｅｒ ｐ II で刺激することを含む 。また、マウスを、免疫アジュバント、例えばBacillus Calmette Guerin(BCG) で、または免疫原生成物（Ｄｅｒ ｐ I/II 等）を、種々にアジュバントalumと 記載されている水酸化アルミニウムゲルと混合することにより、治療することが できる。 適切なプライマーとのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、mRNA生成物 からの可変ヘビー（ＶＨ）および可変ライト（ＶＬ）遺伝子を、慣用法を用いて 増幅することができる（例えばOrlandi 等、「Pros.Nat．Acad．Sci．USA」、86 :3833-3837，1989）。ＲＮＡ生成物を用いて，ファージ中にＦａｂ組み合わせラ イブラリーを構成する(Persson 等、「Pros.Nat．Acad．Sci.」88:2432-2436，1 991;Huse等、「Science」246:1275-1281，1989)。スクリーニングにより選択し たクローンをプラーク精製し(plaque-purified)、ファーゲミド(phagemid)を切 除し、これを用いてEscherichia coliを形質転換させた。次に、培養形質転換細 胞からのＦａｂを、当業者によく知られている方法により形成した(Gussow およ びSeemann、「Method in Enzymology」99:121，1991，Pluckthun 、「Biotechno logy」9:545-551，1991，「Nature」347:497-498，1991)。 ７．５ 結果 ７．５．１ ＤＭ２７ １Ｅ１１ ヒト扁桃リンパ球（２×１０⁶細胞）を３日間、培地ＲＰＭＩ １６４０中で 、アジュバントペプチド(Sigma)１０μｇおよびダストマイト抽出物（５μｇ） で刺激した。細胞生成物を採集し、ＲＰＭＩ中に再懸濁させて、ヒト−マウスヘ テロミエローマＥＬ４１と融合させた。この融合から、ヒトハイブリドーマＤＭ ２７／１Ｅ１１を選択した。このハイブリドーマを２回クローン化し、増殖を、 １０％胎児ウシ血清を加えた培地ＲＰＭＩ １６４０中で継続した。ヒトｍＡｂ ＤＭ２７／１Ｅ１１を，ハイブリドーマ上清から、セファロース プロテイン Ｇ(Pharmacia)に対するアフィニティークロマトグラフィーにより得た。抗体Ｄ Ｍ２７／１Ｅ１は、ダストマイト抽出物および精製したDer p I 生成物と反応し た（表５）。抗体のイソタイプ特徴付けにより、これが、ＩｇＧ₁であることが 確認された。 ７．５．２ 他のヒト抗ダストマイトＭａｂ 表６に、ヒトリンパ球とヒト−マウスヘテロミエローマＥＬＡＩとを融合させ ることにより発生した、代表的なヒト抗ダストマイトアレルゲンモノクローナル 抗体を列挙する。リンパ球は、ヒト末梢血液（ハイブリドーマＤＭ２８／１Ｄ１ １，ＤＭ２８／２Ｂ２，ＤＭ２８／２Ｅ９）および扁桃組織（ＤＭ２７／１Ｅ１ １〜２Ｇ９およびＤＭ３１／１Ｈ２〜２Ｃ１０）から得られた。 ｍＡｂは、カゼインのみで被覆した対照マイクロタイターウェルとは対照的に 、ＥＬＩＳＡ試験でダストマイト抽出物と反応した。特異性試験は、９／１１が Der p I と反応したことを示す。 ７．５．３ ダストマイトアレルゲンに対するＴリンパ球媒介応答への負作用に 関する抗Der p Ｍａｂのインビボ試験 ダストマイトアレルゲンへの暴露により生じたアレルギー状態の病原論におけ るＴリンパ球応答の重要性は、明確に確認されている(Ishizuka、「Ann．Rev．I mmunol．」2:159-182，1984;O'Hehir等、「Int．Allergy Appl．Immunol．」88: 170-172，1989;FrewおよびKay、「J．Immunol．」141:4158，1988;Alexander 等 、「Lancet」339:324-328，1992)。 特異性ＩｇＥ抗体の合成並びにエフェクター細胞、例えば肥満細胞および好酸 球の区別および増殖は、ＣＤ４＋細胞の活性化に依存する（O'Hehir等）。 ダストマイトアレルゲンに対するＴリンパ球応答の制御は、これらの物質によ り発生するアレルギー性疾患を治療する重要な経路である。これは、免疫抑制薬 での治療により実施することができる。薬物、例えばサイクロスポリンＡの全体 的な毒性の観点から、これらの薬物は、ほとんどの喘息患者の治療に用いること はできないと考えられる。Ｔ細胞応答を、免疫ネットワークを操作することによ り抑制する代替法は、一層適切である。その理由は、これらの治療法は、毒性が はるかに低いからである。 前記の考察から、アレルギー性疾患を制御する抗ダストマイトｍＡｂの効能の 評価を実施するには、最初に、治療によって、Ｔリンパ球媒介応答が抑制される ことを例証する。 ８．塵ダニアレルゲンに対するマウスの遅延型過感作性（ＤＴＨ）応答の禁止 ８．１ 塵ダニ抽出物に対するマウスのＤＴＨの誘起 塵ダニ抽出物（ＤＭＡ）１０〜２００μｇをフロインド完全佐薬（ＣＦＡ）と １：１容積／容積比で混合したものを、ＢＡＬＢ／ｃマウスの２部位に皮下注射 した。ＰＢＳ又は不適当な蛋白質と混合したＣＦＡを対照マウスに注射した。オ ースチン等が１９９１年にJ．Natl．Cancer Inst．１９９１に記載した処理方法 を用いて、１０μｇのＤＭＡ又は精製したDer ｐＩ／II調剤をマウスの左耳翼に 皮内注射することにより、免疫性を５〜２８日後に試験した。非注射の右耳翼は 対照物とした。皮内注射の２４時間後と４８時間後に両耳の厚さを測定した。皮 内注射した耳と皮内注射しなかった耳の厚さの差を算出し、耳の膨潤の増加分と して表した測定結果をＤＴＨ応答（オースチン等のJ．Nat．Cancer Inst.１９９ １年の論文、栗林等のCell Immunol．第１０８巻第３６６〜３７７頁１９９１年 の論文及び森川等のImmunology第７４巻第１４６〜１５２頁１９９１年の論文参 照）の尺度とした。 抗塵ダニｍＡｂ処理の効果を測定する為、ＤＮＵを用いる感作化の前後の種々 の機会にマウスに抗体を入れた。ｍＡｂは種々の経路で投与することが可能であ り、免疫学的佐薬を調剤中に混入することができる。 塵ダニに対するＤＴＨ応答の抑制は、Der ｐＩ及びDer ｐII等の主要なアレル ゲン的蛋白質の異なるエピトープと反応するｍＡｂｓを用いて組合せ処理するこ とにより増進できる。この場合の一般的方法はｍＡｂｓを単独で用いるか、又は 個々のDer Ｐ（及びDer ｆ）蛋白質に対するＤＴＨ応答性を抑制するのに有効な ものと組合せて使用することであった。ＮＵＢ組合せ物のその他の選定も、粗抽 出物（ＤＭＡ）中に含有されているような混合塵ダニアレルゲンに対するＤＴＨ 応答の抑制用に用いることができる。 ＤＭＡ（１０μｇ）を用いて感作化したＢＡＬＢ／ｃマウスのＤＴＨ応答性を 誘出し、ＤＭＡを用いて５日後の耳について免疫性を試験した。ＤＭＡを用いて 感作化したマウスの耳の膨潤は、ＤＭＡを用いて感作化した後Der ｐＩ蛋白質調 剤を用いて免疫性を試験したＢＡＬＢ／ｃマウスについて同様に検出した感作化 しなかった対照マウスのＤＴＨ応答性に比べ、顕著に（ｐ＜０．０１）増大して いた。 ８．２ 抗Der ｐｍＡｂにより処理したマウス中にDer ｐＩにより誘起されたＤ ＴＨ応答性の抑制 ＤＭＡ抽出物（１０μｇ）を用いて感作化し２８日後に耳で免疫性を試験した マウスは、遅延型過感作応答を誘出した。過感作性は耳の膨潤により評価した。 ＤＭＡによる感作化後、１０〜５０μｇの抗Der ｐＩｍＡｂＨ１１を用いて処理 したマウスは、遅延型過感作応答が顕著に減少した（第１２図及び第７表参照） 。 予防薬的実験を行なったところ、ＤＭＡを用いる感作化に続いてｍＡｂＨ１１を 用いる処理は、第７表に示すようにDer ｐＩ（１０μｇ）を用いる耳の免疫性試 験に続くＤＴＨ応答性の発現を抑制した。ＤＭＡを用いて感作化したマウスをＨ １１（３×２０μｇ、４日、７日及び１４日）を用いて処理し、耳により免疫性 を試験し、２８日に顕著に減少した耳の膨潤を認めた。１μｇ〜１mgの処方量の ｍＡｂを５回迄用いることにより、ｍＡｂＨ１１処理に対するＤＴＨ応答性の顕 著な減少を得た。この応答性は、水酸化アルミニウムを佐薬とするｍＡｂＨ１１ （デンマーク国 ベドバエク所在のスーパーホス バイオセクター エー／エス の「ＡＬＨＹＤＯＧＥＬ８５」）を投与すると、さらに増大した。 ８．３ 試験管内パラメーターによるＴ細胞反応性の減少 また、これ等の感作化したマウスのリンパ節又は脾臓からリンパ球を単離し、 単細胞懸濁物を培地中に入れ、完全ＤＭＡ又はDer p Ｉ及びDer p IIの何れかを 用いて刺激した。ラジオアイソトープで標識付けしたチミジンの混入又はＩＬ− ２の生産により、Ｔ細胞活性化を測定した。Ａｂ１を注入したマウスはＡｂ１を 注入しないで感作化したマウスに比べ、Ｔ細胞活性化がこれ等の活性化マーカー の何れに於いても顕著に減少した。 ８．４ ＩｇＥ抗ＤＭＡ応答性の下方規制の評価 ８．４．１ ＳＣＩＤマウスモデル 免疫システムの重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）のマウスが欠けるように遺伝学 的に繁殖したマウスの使用により、抗ＤＭＡモノクローナル抗体の注入による抗 原処理の下方規制を評価することができる。マウスは感作化される能力を有しな いが、追憶の応答性を有することができる。これ等のマウスは末梢血単核細胞又 は扁桃からのリンパ球を用いることにより、又は喘息患者の肺等のような患者の 特定器官から採取したＴ細胞クローンと末梢血単核細胞との混合物を用いること により、ヒトの免疫システムを用いて再繁殖させる。これ等のリンパ球は、抗原 特定的なＩｇＥ、抗原に対する皮膚テストの陽性及び進行中の曝露を示す臨床徴 候により明らかなように、塵ダニ等の目的抗原に対するアレルギー反応に苦しむ アトピー症の患者から採取するのが最適である。或いは又、被験者を組織の寄贈 前に抗原に対して慎重に曝露することができる。 前述のＳＣＩＤマウスに１０×１０⁶ケのリンパ球を静脈注射し、１週間後に 血液を採取し、全体の及び抗原特定的ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＥを測定し、エン グラフティングを実証した。次いで、ＤＭＡ特定モノクローナル抗体又は同じサ ブクラスの不適当なモノクローナル抗体を注射し、佐薬を用いずに１０〜１００ μｇの抗体を用いて１〜３日後に免疫性を試験した。この抗原免疫性試験を再び ２週間繰返し、血液をその後６週間毎週採取した。 ８．４．２ 正常マウスモデル 第二のモデルとして、ＢＡＬＢ／ｃ又はＡ／ｊマウスを、精製した抗体とした 又は単純化した抽出物としたＤＭＡに曝露した。曝露物は佐薬混入又は非混入の 注射液として、２０μｇ〜１mgの処方量範囲内で１週間置きに１〜３回注射する か、又は１mg／日以下のネブライザー形式でエーロゾル化した抗体として１０日 間注射することができた。曝露に続いて、ＩｇＧ及びＩｇＥ抗ＤＭＡ抗体応答性 を決定した。 候補とするｍＡｂが応答性を下方規制できるか否かを決定する為、ｍＡｂを感 作化の前に、感作化の１週間前迄に１〜１０回の多数回に亘って、佐薬を混入又 は非混入で、０．０１〜１００μｇの処方量で注入するか、又はｍＡｂを感作化 後、最後の抗原曝露直後から曝露後１ケ月迄に亘る期間に亘って、佐薬を混入又 は非混入で注入することができた。若干の場合には、後者の群のマウスの免疫性 を再び試験して、そのような処理が二次的応答性に及ぼす影響を調べることがで きた。結果を次の第８表に示す。 これ等の試験では、Der p I を用いて１月置きに３〜５回マウスを免疫化した 。Der p I 抽出物を用いる最終処理の７日後にｍＡｂＨ１１による処理を行なっ た。ｍＡｂＨ１１を用いる最終処理の１４日後に、ＩｇＥに対する血清評価を行 なった。 ８．４．３ エーロゾル感作化したマウスモデル 応答性を下方規制するｍＡｂの能力を測定する第３のモデルとして、ＢＡＬＢ ／ｃ又はＡ／ｊマウス或いは茶色ノルウェイラットを、毎週３０分間６週に亘っ て、１μ mol未満の分子をネブライズした抗原を用いて処理し、全体及び抗原特 定のＩｇＧ及びＩｇＥの生産を試験した（シー．マクメナミン等のImmunology第 ７７巻第５９２〜５９６頁、１９９２年の論文参照）。これ等の抗原特定クラス の何れをも顕著に下方規制する候補ｍＡｂの能力を試験する為、前述の例と同様 にｍＡｂを、免疫試験の前又は後に、佐薬を混入した状態又は混入しない状態で 投与することができた。 双方の場合とも、次の第９項に記す一般方法によりＩｇＥ応答性とＩｇＧ応答 性を決定した。但し、抗体はLol p I の代りにDer I 又はDer IIを用いた。また は、被験動物には１〜１００μｇの抗体を皮内注射し、ＩｇＥ応答性の尺度とし て３０分後の皮膚応答性を決定した。 ９．実施例 塵ダニアレルゲンに対するアレルギー的応答性の抑制 ９．１ 血清ＩｇＥ応答性を検出する迄に至るＩｇＥ塵ダニねずみ科動物（ミュ ーアライン）モデルの発展 塵ダニに対するＩｇＥ媒体のアレルギー性反応をモデルシステムについて試験 した。このモデルでは、オバルブミン（ＯＶＡ）をエーロゾル化し、ＢＡＬＢ／ ｃマウスに吸入させて感作化した。これ等の動物は免疫試験すると直ちに過感作 性皮膚試験反応を発現し、血清は受動的皮膚アナフィラキシスを伝達することが できた。このモデルは抗原特定的である。ＩｇＥ感作化は感作化したマウスの細 葉性リンパ節に伝達することができる（サロガ等がJ．Clin．Invest.第９１巻第 １３３〜１４０頁１９９３年に発表した論文参照）。電場刺激に続いてミューア ラインの気管支痙れん（ラルセン等がJ．clin．Imvst．第８９巻第７４７〜７５ ２頁１９９２年発表した論文参照）が示されたが、好酸球を含む急性炎症細胞は 存在しなかった（レンズ等がJ．Allergy Clin．Immunol．第８９巻第１１２７〜 １１３８頁１９９２年に発表した論文参照）。 このＯＶＡシステムは塵ダニアレルギーの治療用の免疫治療剤を評価する為の 良好なモデルを示す。アレルギー応答性を刺激するのに佐薬は用いず、かくて非 特定Ｔ細胞及びその他の炎症応答性を回避し、これ等の免疫治療剤により生ずる 細胞機能の変化を回避した。感作化のエローゾル化経路はヒトの場合と同様であ り、空路に及ぼす影響を特定的に測定することを可能にした。 Der p I 又はDer p IIを有するこのエーロゾル化したアレルゲンモデルを用い て、ミューアラインの抗Der p I 又はDer p IIモノクローナル抗体を含有するワ クチンを用いるＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫が抗Der p I 又はDer p II ＩｇＥ抗 体応答性を抑制することを示した。説明の為、抗Der p I ｍＡｂ２Ｃ７を用いて Der p I 血清ＩｇＥ応答性を抑制した例を記す。 ９．１．１ エーロゾル化した塵ダニアレルゲンを用いる感作化 下部呼吸器に到達するのに十分に小さい２〜３μの粒子（ユがPowder Tech.第 ２１巻第５５頁１９７８年に記載した論文参照）を、ジェット式ネブライザー（ 英国ミドルセックスのインターサージカル社の「マイクロサーラス」）を用いて 約２Kg／cm²(２９Psi)の連続圧力下で生成した。１％の全体塵ダニ抽出物を殺菌 したホスフェート緩衝の塩水ｐＨ７．３中に溶解したものの超音波ネブライザー 処理により、雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（生後８〜１２週）を、ゲルファンド エ ンド アソシエーツが開発した処理方法（レンズ等がJ．Allergy Clin．Immunol ．第８９巻第１１２７〜１１３８頁１９９２年に記載した論文参照）に基づいて 感作化した。５匹迄のマウスを感作化室内に入れ、塵ダニ溶液をエーロゾルとし て吸入孔に入れた。マウスをエーロゾル化したアレルゲンに１０日に亘って２０ 分づつ曝露した。対照物には陰性対照物としてＰＢＳを含め、オバルブミン（Ｏ ＶＡ １％）及び市販の可溶性ライ麦草粗製抽出物(Lol p)を陽性対照物として 用いた。 ９．２ Der p I に対する免疫応答性 Der p I 特定ＩｇＥ応答性を受動的皮膚アナフィラキシスにより測定した。直 ちに皮膚過感作性を測定し、全体及び抗原特定ＩｇＥをＥＬＩＳＡにより測定し て、陽性の結果を見出した。アレルゲン免疫試験に対する気管支抵抗の増大を試 験することにより、空路応答性を測定した。 ９．２．１ 受動的皮膚アナフィラキシス（ＰＧＡ）近親交配したスパラーグ− タウレイ種ラット（６匹１群）に希釈液の範囲の１００μｌの血清試料を皮内注 射した。この評価では８箇所迄の皮内部位が利用できる為、試験用血清の一連の 希釈液を注射することができた。対照物として、エーロゾルとした塩水又は他の アレルゲン例えばオバルブミン又はライ麦草Lol p I に曝露した対照マウスから 採取した血清をラットに注射した。４８時間後ラットに、１０〜５０μｇの精製 Der p I（処方量は予備研究で決定した）を１mlのエバンス青色染料（１％）と 混合して静脈注射した。３０分後ラットを殺し、裏返しした皮膚表面上にエバン ス青色染料が浸潤しているのを視認することにより応答性を決定した。直径が０ ．３cmよりも大きい輪を陽性な皮膚応答性と規定した。試験血清のタイターは対 照 物との比較により定めた。 ９．３ 抗Der p I ＩｇＥ応答性の抑制 抗白痴型抗体を刺激するように規定された条件を用い、明ばん中のｍＡｂ２Ｃ ７によりＢＡＬＢ／ｃマウス（１０匹１群）を免疫とした。対照マウス（１０匹 １群）には不適当なｍＡｂ（抗ＣＥＡｍＡｂ３３７）又は塩水を与えた。免疫化 に続いてマウスを既に述べた塩水又はエーロゾル化した塵ダニ抽出物に曝露し、 血液試料を処理プロトコール完了後２日程採取した。１０匹のマウスの群からの 血液試料をプールし、受動型皮膚アナフィラキシス評価とＥＬＩＳＡ評価により ＩｇＥ特定抗体を試験した。 ９．３．１ 受動型皮膚アナフィラキシス評価 第９表に要約した実験において、エーロゾル化したDer p により感作化する前 にｍＡｂ２Ｃ７により処理したマウスは、受動型皮膚アナフィラキシスにより評 価してDer p I に対するＩｇＥ応答性が６倍減少した。これに比べ、対照ｍＡｂ ３３７により処理したマウスは、エーロゾル化したDer p に曝露した場合、依然 として抗Der P I ＩｇＥ抗体を生産した（タイター１／１２８） ９．３．２ ミューアライン血清抗Der p I ＩｇＥ抗体水準の決定 抗Der p Ｉ血清ＩｇＥ抗体タイターをＥＬＩＳＡを用いて次の処理手順で測定 した。 １．ＥＬＩＳＡマイクロタイター板を山羊抗ヒトＩｇＥ抗体を用いて被覆した。 ２．マイクロタイター板を洗浄し、カゼイン緩衝剤によりブロックした。 ３．アトピー性皮膚炎患者からのヒトの血清を添加し、一夜４℃で培養した。 ４．マイクロタイター板をＰＢＳ−−Tween を用いて洗浄した。 ５．ｍＡｂ−−キイホールかさ貝ヘモシアニンに対抗して育成したＢＡＬＢ／ｃ マウスの抗血清をマイクロタイター板に添加した。対照物として正常なＢＡＬＢ ／ｃマウスの血清を用いた。 ６．マイクロタイター板を洗浄した。 ７．このように結合したマウス抗体を、西洋わさびペルオキシダーゼにより標識 付けした山羊抗マウスＩｇＧとの反応により検出した。 ８．基質ＡＢＴＳを添加した。 ９．第６項に記載した標準ＥＬＩＳＡ試薬を用い、ＯＤ４０５nmで色の発現を測 定した。 明ばん中のｍＡｂ２Ｃ７によるＢＡＬＢ／ｃマウスの処理は、エーロゾル化し たオバルブミンを受けたマウスに、抗オバルブミンＩｇＥ抗体応答性を誘起させ ることには影響を及ぼさなかった。これ等の試験において、塩水若しくはｍＡｂ ２Ｃ７又はｍＡｂ３３７により処理し、次いでエーロゾル化したオバルブミンに 曝露したマウスのタイターは、夫々１／５１２及び１／２５６であった。 ９．３．３ 抗Der p I ＩｇＥ抗体のＥＬＩＳＡ評価 エーロゾル化したDer p に曝露したマウスからの血清試料を、上述のＥＬＩＳ Ａ評価を用いてDer p Ｉ特定ＩｇＥについて評価した。簡単に記すと、非希釈の 血清試料と１／２〜１／５０に希釈した血清試料を、Der p I により被覆したＥ ＬＩＳＡマイクロタイター板に添加した。培養及び洗浄後、ラット抗マウスＩｇ Ｅ西洋わさびペルオキシダーゼ接合物を用いて、結合したマウス血清ＩｇＥを検 出した。ＥＬＩＳＡ ＯＤ読取値（４０５nm）から血清希釈物タイターを決定し 、正常のマウス血清に曝露したマイクロタイター板を用いて得られるバックグラ ウ ンドＯＤ値と比較した。 第１０表に要約した実施例において、塩水又は対照用抗ＣＥＡｍＡｂ３３７を 用いて処理したマウスは、エーロゾル化したDer p 調製物（血清タイターが夫々 １／５０と１／４０）に曝露した場合、抗Der p ＩＩｇＥを発現した。明ばん中 に溶解した抗Der p ＩｍＡｂ２Ｃ７調合物（血清タイター１／４）を用いて免疫 化したマウスの場合、この応答性は約１０倍に減少した。対照研究において、明 ばん中に溶解したｍＡｂ２Ｃ７を用いる免疫は、エーロゾル化したオバルブミン に対するマウスの曝露に続く抗オバルブミンＩｇＥ抗体の刺激に影響を及ぼさな かった。或る試験例では、ｍＡｂ２Ｃ７又はｍＡｂ３３７（何れの場合も１／４ ００）を用いて免疫化したマウスの血清抗ＩｇＥタイターをＥＬＩＳＡにより決 定した値は、ＰＢＳ（タイター１／５００）を用いて最初に処理したマウスの値 と匹敵するものであった。 ９．３．４ 結果 前述の試験例において、明ばん中に抗Der p ＩｍＡｂ２Ｃ７を溶解した調合物 を用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを処理したところ、エーロゾル化した塵ダニ抽出物 (Der p)に曝露したときにマウスが抗Der p I ＩｇＥ抗体を製造する能力を抑制 した。他の試験例では抗Der p ＩｍＡｂＨ１１は抗Der p 血清ＩｇＥ応答性を抑 制し、ｍＡｂ２Ｈ５は抗Der p IIＩｇＥ応答性を抑制した。 １０．抗ウルシオールモノクローナル抗体（Ａｂ１）の使用による毒うるし及び 蔦うるしに対するＴ細胞応答性の下方規制 毒うるし及び蔦うるしアレルギーは、植物油中のアレルゲン（ウルシオール） に対する遅延型過感作性（ＤＴＨ）応答である。この天然アレルゲンはＣ１５又 はＣ１７の側鎖を有する３−ｎ−アルキルカテコールであって、例えば３−ｎ− ペンタデシルカテコール（ＰＤＣ）のように完全飽和のもの又は１〜３ケの不飽 和結合（第２５図参照）を有するものの混合物である（サイメス及びダウソンが J．Ann．Chem．Soc.第７６巻第２９５９〜２９６３頁１９５４年に記載の論文参 照）。このアレルゲンはアレルギー性応答の開始時に先ずキノンを生成する。キ ノンは次にスルフォヒドリル基又はアミノ基を介して細胞蛋白質と反応し、生成 物がアレルギー性応答を開始する。 １０．１ 免疫源用の３−ｎ−アルキルカテコール接合物の調製 ウルシオール及び関連する３−ｎ−アルキルカテコールはＴ細胞応答性を示し 、抗体は従来未だ示されていない。従って、抗ウルシオール抗体を生成する為に は、Ｂ細胞応答性を刺激する能力を有する同族体を合成する必要があった。これ 等の同族体は数通りの方法で合成されている。一つの好適な合成方法は、ＰＤＣ 及びウルシオールのキノンと蛋白質、ペプチド及びアミノ酸との反応である。 １０．１．１ 自動酸化したウルシオールと蛋白質との反応 この接合処理反応はリベラト等がJ．Med．Chem．第２４巻第２８〜３３頁１９ ８１年に記載した発表に基づいている。１．５６μ molのウルシオールを１mlの アセトンに溶解し、三角フラスコに入れ、窒素気流中で内面上に乾燥した。蛋白 質溶液（血清アルブメン１００mgをホスフェートを緩衝剤とする塩水１０ml中に 溶解したｐＨ７のもの、又はキイホールかさ貝ヘモシアニンを炭酸水素ナトリウ ム溶液中に溶解したｐＨ８．４のもの）を添加した。或いはまた、ウルシオール を滴加することができた。例えば０．２mlのウルシオールを、２０mgのＫＬＨを ２mlの緩衝剤液中に溶解したｐＨ８．４の溶液に溶解することができた。かくて 得た異質な混合物を空気中で常温で４８時間攪拌した。この時間中にウルシオー ルはＯ−キノンを生成し、蛋白質と結合して、赤茶色の溶液を生成した。この溶 液をクロマトグラフィ（例えばセファアデックスＧ２５）により蛋白質接合物を 分離した。典型的な一例においては、アルブミン溶液の吸収値（４８０nm）が０ から５．９に増加した。最終溶液を殺菌し、４℃で貯蔵した。 １０．１．２ 蛋白質のｎ−アセチルシステイン中間体を経て通常の蛋白質担体 に至るアルキルカテコールと蛋白質との接合 上述のリベラト等が記載した処理方法により、酸化銀を用いるウルシオール又 はＰＤＣの酸化により、ウルシオールと２−ｎ−ペンタデシルカテコール（ＰＤ Ｃ）のキノン誘導体を調製し、ｎ−アセチル−Ｓ（２，３）−ジヒドロキシ−４ −ペンタデシルフェニルシステイン（ＰＤＣ−ｎ−アセチルシステイン）を得た 。この生成物の純度を薄膜クロマトグラフィ、元素分析及びＮＭＲスペクトル分 析により測定し、上述の公知データと合致した。このウルシオールのキノン誘導 体はＮ−アセチルシステインと同様に反応した。 １０．１．３ ３−ｎ−ペンタデシルカテコール（ＰＤＣ）とポリアスパルチン 酸との接合 ＰＤＣとポリアスパルチン酸との接合はカルバミド錯体を介して行なった。Ｐ ＤＣ１０mgを１mlのジオキサンに溶解した。この溶液にジシクロヘキシルカルボ ジイミド（ＤＣＣ）２mgを添加し、４℃で１８時間反応させた。次いでこの錯体 をホスフェート緩衝のｐＨ５の塩水中の酸（５mg、４１．６μ mol）に添加し、 ３０分後接合物をセファデックスＧ２５クロマトグラフィにより単離した。スペ クトル分析（２７７nm）によると平均置換比は４２．８μ mol／mgであった。 １０．２ 抗ウルシオールモノクローナル抗体及びＴＣＲｓの生産 ミューアラインモノクローナル抗体の生産方法は第５項に記載した通りである 。ＢＡＬＢ／ｃマウスを０日に、フロインド完全佐薬中に溶解した５０μｇのＰ ＤＣ−ｎ−アセチルシステインを皮下注射することにより免疫化し、続いて７日 にブースター処方量のＰＤＣ−ｎ−アセチルシステインを静脈注射した。１１日 目に脾臓細胞を収穫し、骨髄腫Ｐ３ＮＳＯ細胞を用いて融合した。ハイブリドー マクローンを上述したようにして選定した。 抗ウルシオールを生産するモノクローナル抗体をＥＬＩＳＡ評価により同定し た。簡単に記すと、ボリビニマイクロタイター板（ファルコン）を、ウルシオー ル又はＰＤＣ及びウルシオール−ｎ−アセチルシステイン及びＰＤＣ−ポリアス パルテート等のＰＤＣ−接合物を用いて被覆した。ハイブリドーマの上澄液を添 加し、４５分培養し、洗浄し、マウス免疫グロブリンと結合させ、西洋わさびベ ルオキシダーゼを用いて除去し、兎抗マウス免疫グロブリンと接合させた。この 系統的生産方法はＰＣＤ−ｎ−アセチルシステインを用いて免疫化したマウスか らＩｇＭアイソタイプのｍＡｂ９９１／８１／７を生産した。ｍＡｂ９９１を硫 酸アンモニウム析出法によるハイブリドーマ培養上澄液から精製し、セファクリ ルＳ３００ゲル濾別クロマトグラフィーにより分別した。 １０．３ ｍＡｂ９９１の免疫反応性 ｍＡｂ９９１の免疫反応性を当初、ｍＡｂ９９１と担体分子との結合をＥＬＩ ＳＡにより評価するのではなく、ｍＡｂ９９１とウルシオール及びＰＤＣ接合物 との結合をＥＬＩＳＡにより評価することにより決定した。ｍＡｂ９９１の特殊 性をさらに、３−ｎ−アルキルカテコールに関連する化合物によるｍＡｂ９９１ と尿素−ｎ−アセチルシステインとの結合の禁止により規定した。これを第２６ 図に示す。同図はｍＡｂ９９１と尿素−ｎ−アセチルトステインとの結合の禁止 を要約して示したものである。かくて、カテコール及びカテコール部分の特色を 有するカテキン水和物等の化合物は、ｍＡｂ９９１の結合を禁止する。これ等の 試験からｍＡｂ９９１はカテコール構造と反応するものとして記述した。 １０．４ ウルシオールに対する遅延型過感作性応答の下方規制 ウルシオールに対するアレルギー性応答を抑制する抗ウルシオールモノクロー ナル抗体の使用を、ミューアラインモデルを用いて評価した（デュン等がCell I mmunol．第６８巻第３７７〜３８８頁１９８２年に記載した論文参照）。ＢＡＬ Ｂ／ｃマウスの腹部に、１００μｌのアセトン中に２〜４mgのＰＤＣ又はウルシ オールを溶解した溶液を施与することにより、マウスを感作化した。次いで、マ ウスの一方の耳にウルシオール又はＰＤＣ５０μｇを１０μｌのアセトンに溶解 した溶液を施与することにより、アレルゲンに対する感作化を４日から４２日に 検出した。マウスの他方の耳はアセトン１０μｌのみで処理した。次いで鋭敏な 圧力マイクロメーター（日本のミツトヨ社製）を用いて耳の厚さを測定し、アレ ルゲン免疫試験した耳の厚さと対照耳の厚さとの差を測定した。 第２７図に示す予防的方法においては、１〜２５μｇの処方量のｍＡｂを１回 又は複数回静脈注射することによりマウスを処理した。次いでマウスをアレルゲ ンに対して感作化し耳について免疫試験した。この予防的方法の一例として、ｍ Ａｂ９９１を１０μｇづつ３回施与した処理は、非関連のＩｇＭｍＡｂ（Ｂ５５ ．抗乳癌）を与えた対照マウスに比べて、ウルシオールに対するＤＴＨ応答を抑 制した。 治療的試験においては、ウルシオール又はＰＤＣに対する感作化後ｍＡｂを施 与した。第２８図はこのことを示すもので、ウルシオールに感作化したマウスに 感作化２１日後に、ｍＡｂ９９１を１回（１０μｇ）静脈注射したものである。 ５０μｇのウルシオールに感作化４２日後に耳の免疫性を試験したところ、ＤＴ Ｈ応答は顕著に減少した。 佐薬中にｍＡｂを溶解すると、ｍＡｂ単独よりも一そう有効である。このこと はウルシオールに感作化したマウスを７日と１４日に完全佐薬中に溶解したｍＡ ｂ９９１（１μｇ）で処理した試験と、不完全フロインド佐薬中に溶解したｍＡ ｂ９９１（１μｇ）で処理した試験により示されている。耳の免疫性を試験した ところ、対照ｍＡｂを施与した対照マウスに比べ、２１日にＤＴＨ応答が殆んど ８０％も減少した（第２９図参照）。 １０．５ 抗ウルシオール抗体 ウルシオール蛋白質担体接合物を上述した如く用いる当業技術者に周知の技術 により、ウルシオールに対するＢリンパ球型式の免疫グロブリン分子（Ｉｇ）を 、マウス、ラット、兎、モルモット等に誘起させた。例えば、これ等の動物にウ ルシオール／蛋白質接合物を１回又は２回以上注入することにより免疫化した。 これ等の接合物は静脈、皮下、筋肉及び皮内注射の何れかの経路により、佐薬を 含有しないで又は宿主免疫応答性を強化し得る佐薬を含する形で、注入した。そ のような佐薬の一例はフロインド完全又は不完全佐薬である。若干の場合には、 ウルシオールに対する免疫グロブリン分子応答は、担体蛋白質に対する免疫応答 の除去により強化される。このことはダブリュ．エー．トーマスがJ．Immunol． Me thods 第９７巻第２３７〜２４３頁１９８７年に記載した一般的処理方法を用い て、リンホトキシン的薬剤を用いる処理により、担体蛋白質に対する応答を除去 することにより達成される。簡単に記すと、担体蛋白質を用いて前述の動物を免 疫化した。免疫化後に時間を置いて、シクロホスファミド等の細胞障害薬剤を体 重１Kg当り４０mgの割合で用いて動物を処理して、担体蛋白質に対する免疫グロ ブリン分子を生成するリンパ球クローンを除去した。動物をこの処理から回復さ せた後、ウルシオール／蛋白質接合物を用いて免疫化した。免疫化した動物の血 清から免疫グロブリン分子を得た。若干の場合には、免疫供与体からの脾臓細胞 等の抗体生産性細胞を用いるハイブリドーマ生産により、マウス及び／又はラッ トのモノクローナル抗体を生産した。 １０．５．１ 佐薬含有又は非含有のウルシオール−担体を用いる簡単な免疫化 の発生 ウルシオール−キイホールかさ貝ヘモシアニン接合物（ｕｒｕ−ＫＬＨ）を用 いて、大人のＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化した。典型的な調合例においては、日 数０のときに、フロインド完全佐薬（ＣＦＡ）中に乳化した１００〜４００μｇ の蛋白質接合物乳液を最初の処方量として腹腔内に注射した。１０〜１４日に第 ２回の免疫化処理を、フロインド不完全佐薬（ＩＣＦＡ）中に乳化した１００〜 ４００μｇのＵｒｕ−ＫＬＨ乳液の腹腔注射により行なった。第３回のｕｒｕ− ＫＬＨの処方は１０〜１４日後に佐薬を混入しないで腹腔注射により行なった。 ウルシオールに対する免疫グロブリン分子が血清中に検出される迄、さらに２〜 ３週置きにｕｒｕ−ＫＬＨを処方した。 １０．５．２ その他の免疫操作を用いる抗ウルシオール応答の発生 フロインド完全佐薬中のヒトの血清アルブミン１０mgを腹腔注射して、大人の ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化した。３日後にマウスにシクロホスファミドを体重 １Kg当り４０mg腹腔注射した。この処理により、ヒトの血清アルブミン（ＨＳＡ ）に対しＩｇを生産するリンパ球は絶滅した。２〜２５日休養後、フロインド完 全佐薬中のｕｒｕ−ＨＳＡ（１００〜２００μｇ）を用いてマウスを免疫化した 。上述の実験例Ａと同様に、免疫グロブリン分子が血清中に検出される迄、フロ インド完全又は不完全佐薬を含有し又は含有しないものを、時間を置いて施与し て、 免疫化した。 １０．５．３ Ｂ細胞免疫源としのウルシオール単独使用 アセトン中に溶解した自由なウルシオールを約２．５mgまで複数回腹に塗布す ることにより、大人のＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化し、血清を試験用に反復して 抽出した。塗布は抗ウルシオール抗体が血清中に検出される迄続行した。 １０．５．４ 感作化した人からのリンパ球の使用 感作化した人を、アセトン中に溶解した０．１〜５μｇのウルシオールの皮下 （エピ皮膚的）投与により、ウルシオールを用いて免疫試験した。抗ウルシオー ル抗体について血清を試験し、末梢血又は皮膚疾患から集めたリンパ球を用いて 、当業者に周知の技術によりハイブリドーマを生産した。 １０．６ 抗ウルシオールモノクローナル抗体（Ａｂ１）の生産 １０．６．１ ミューアラインモノクローナル抗体 関心を持っている抗原に対するミューアラインモノクローナル抗体の製造方法 は、当業者には周知である（上述のゴーディングの記載参照）。例えば、ウルシ オール免疫マウスからの脾臓細胞は、血清非含有培地（ＲＰＭＩ １６４０）中 で脾臓組織を解凝集することにより得られた。マウス骨髄腫細胞（Ｐ３−ＮＳ１ 、Ｓｐ２／０、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳＯ／１等）は、副融合性で依然と した指数函数的成長のときに収穫され、血清無含有のＲＰＭＩ １６４０培地中 で洗浄した。かくて得た両細胞調製物を、骨髄腫細胞１：脾臓細胞５の比率で混 合し、三角フラスコ中で緩徐に遠心分離してペレット状とした。上澄液を除去し 、ペレット状細胞を緩め、１．８mlのポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００ ）を２分かかって添加した。三角フラスコを迅速に手で回転させて細胞を回転さ せた後、２分間静置した。容器を回転させながら血清無含有ＲＰＭＩ １６４０ 培地１mlを１分かかって滴加した後、遠心分離機に掛けて遠心分離した。上澄液 を除去し、ペレット状細胞を１５％牛胎児血清及びヒドロキサンチン、メトトレ キゼート及びチミジンと共にＲＰＭＩ １６４０中に懸濁した。 さらに成長培地を添加し、混合物をラット腹腔浸出液細胞の供給層上に、９６ ケの凹みを有する平底マイクロタイター板中の凹みに１００μｌ／１凹みの量で 、５×１０³骨髄腫細胞の割合で板に塗布した。これ等の細胞を３７℃の５％Ｃ Ｏ₂ 中で培養した（ガルフレ等がNature 第２２６巻第５５０〜５５２頁１９７７年 が記載した論文参照）。融合板を３〜４日毎に顕微鏡で検査し、凹みからの上澄 液の半数に吸気し、新鮮な成長培地と入替えた。肉眼で視えるハイブリドーマ集 落を有する凹みをＩｇについて試験した。試験管内で成長した骨髄腫細胞のハイ ブリドーマの組織培養上澄液から、ミューアラインモノクローナル抗体を得た。 これ等の抗体を種々な方法で精製した。好適な精製方法はセファローズ−蛋白質 Ａカラムクロマトグラフィによる親和性であった。この処理に於いては、ハイブ リドーマ細胞上澄液をセファローズ−蛋白質Ａを含有するクロマトグラフィカラ ムに通した。次いで、結合したＩｇを適当な媒体を用いてカラムから溶出した。 １０．６．２ 人モノクローナル抗体の生産 １０．６．２．１ ミューアラインモノクローナル抗体から ミューアラインモノクローナル抗体を用いて遺伝子融合技術によりヒトモノク ローナル抗体を生産することは、当業者には周知である。これには二つの形式が ある。第一の形式はミューアライン抗体遺伝子の変更領域をヒト抗体バックボー ンにクローンしたものを利用する。第二の形式はミューアラインモノクローナル 抗体遺伝子のイディオタイプ領域をヒトバックボーンにクローンしたものを用い る（例えばモリソン等のＥＰＯ ＥＰ１７３４９４（１９８６年３月５日）、ノ イベルガー等のＰＣＴ ＷＯ−８７０２６７１、モリソン等のProc．Natl．Acad ．Sci．USA第８１巻第６８５１〜６８５５頁１９８４年の論文、ボウリアンヌ等 のNature第３１２巻第６４３〜６４６頁１９８４年の論文及びノイベルガー等の Nature 第３１４巻第２６８〜２７０頁１９８５年の論文参照）。 キメラ抗体の生産は、関連するモノクローナル抗体を生産するミューアライン Ｂ細胞ハイブリドーマからのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の単離を含む。 これは次にクローンされ、補体ＤＮＡライブラリーが調製される。このことは例 えば、ビー．ペルバル著「A Practical Guide to Molecular Cloning」第２版ジ ョン ウイリー アンド ソン社１９８８年発行に記載されている。同書を参照 の為本明細書中に導入する。次いでＬ鎖及びＨ鎖遺伝子の所要の可変領域を適当 なプローブを用いて同定する。これ等を配列し、一定領域遺伝子部分と親和性と する。これはｃＤＮＡ調製物の生産とクローン化操作によっても得られる。Ｈ鎖 及びＬ鎖コード付け配列は、クローンした特定の免疫グロブリン変動（Ｖ）遺伝 子部分と、クローンしたヒトの一定遺伝子配列との結合によって製造される。原 核生物細胞及び真核生物細胞で表現すると、マウスモノクローナル抗体の抗体特 定性を有するがヒトＩｇアミノ酸配列の分子の殆んどを有するキメラ抗体が生産 される。 １０．６．２．２ マウス−ヒトヘテロハイブリドーマとヒトＢリンパ球の融合 による 所要の抗体を生産するヒトのリンパ球をマウス−ヒトヘテロハイブリドーマ細 胞と融合させて、ヒト化モノクローナル抗体を生産した。ヒトのリンパ球は活性 ウルシオール皮膚障害部又は末梢血から採取することができる。 一実施例においては、ＥＬ４１（１９９０年５月１６日に受理番号９００５１ ６０２号としてヨーロッパ動物細胞培養収集局に寄託したもの（オースチン等が Immunology第６７巻第５２５〜５３０頁１９８９年に記載の論文参照）等のマウ ス／ヒトヘテロ骨髄腫細胞を、上述のガルフレ等の方法を用いて、ウルシオール と反応性のヒトのリンパ球と融合させた。例えば、リンパ球を３０mlのプラスチ ックス製多目的瓶内に入れ、ドルベッコの修整イーグル培地（ＤＭＥＭ．フロウ ラボラトリース社製）等の成長培地を用いて２回洗浄し、リンパ球の数を血球計 により読取った。ＥＬ４１細胞を収穫し、同様にして洗浄し、リンパ球数を読取 った。これ等の二ケの細胞増殖部をリンパ球：融合パートナー比２：１で混合し 、第３回の洗浄を行なった。遠心分離に従って培地を廃棄し、０．８mlの５０％ ＰＥＧを緩徐に攪拌中のペレット状細胞上に１分かかって滴加した。混合物を１ 分間静置し、次いで１．０mlの培地を１分かかって添加し、次いで２０mlの培地 を緩徐に５分かかって添加した。次いで細胞を１２００rpm の遠心分離機に５分 間かけ、培地を廃棄し、２mlのピペット中に緩和にピペットで入れることにより 細胞を再懸濁させた。最後に２０mlの選択培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋１０^-1 mol ハイポキサンチン＋１０^-5molメトトレキセート＋１０^-6molチミジン）を 細胞懸濁物に添加し、細胞を２枚の９６ケの凹みを有する組織培養マイクロタイ ター板の凹みに入れた。一つの凹みは供給層としてラット腹腔内浸出液細胞２． ５×１０³を有した。各凹みに１００μｌの培地をも補足的に添加した。選択培 地は生成するハイブリドーマが５０％融合値に達する迄７２時間毎に交換し、そ の後は４８時間毎に交換した。ハイブリドーマの成長を規則的にチェックし、集 落が凹みの５０％を覆ったとき上澄液のＩｇを分析した。関心のあるＩｇを生産 するハイブリドーマを直ちにクローンした。かくて得たハイブリドーマを９５％ ＦＣＳ及び５％ジメチルスルホキジド（ＤＭＳＯ）中に２０×１０⁶細胞／mlの 量で冷凍し、液体窒素中に貯蔵した。 １０．７ 免疫原用抗ウルシオールＴ細胞受容体の生産 ハプテン（オキサゾロン．ＤＮＦＢ）感作化した供与体のリンパ節から誘導し たＴ細胞を用いる免疫化により、ウルシオールを含むハプテンに対してマウスを ホクチン接種した。ウルシオール特定Ｔ細胞を用いる免疫化によりマウスにワク チン接種した。ウルシオール特定Ｔ細胞はクローンした２０Ｔ細胞、Ｔ細胞ハイ ブリドーマ、又は特定Ｔ細胞のＴＣＲを真似するペプチドであって良い。 １０．７．１ 感作化したマウスからウルシオール特定Ｔ細胞系統の生産 ０．０１〜５mgのウルシオールをアセトン中に溶解した溶液をＢＡＬＢ／ｃマ ウスの背中の皮膚に塗布したのに続いて、マウスを感作化した。感作化したマウ スのリンパ節又はウルシオールで誘起した皮膚障害部を含む数種の給源からＴ細 胞を得て、当業者に周知の刺激処理を用いて、ウルシオール又はウルシオール− ポリマー接合物を用いる試験管内刺激により膨張させた。Ｔ細胞とミューアライ ン胸腺腫細胞との融合により、ウルシオール特定Ｔ細胞クローン又はＴ細胞ハイ ブリドーマを得た（ビックビー等がJ．Immunol．第１４３巻第３８６７〜３８７ ２頁１９８９年に記載したと同じＢＷ５１４７）。これ等の細胞はウルシオール 特定ＴＣＲに対し免疫応答を示した。このような細胞は、Ｔ細胞ワクチンとして 有用性があるもので、グルタルアルデヒド等の反応剤との交差結合により修整さ れたＴ細胞（アイ．アール．コーエン及びエッチ．エル．バイナーがImmunol．T oday第９巻第３３２〜３３５頁１９８８年に記載した論文参照）又は新生児生存 可能な又は弱毒化したＴ細胞を含む数種類の内の一つである。ウルシオール応答 性Ｔ細胞クローンのＴＣＲは、ＴＣＲの種々な部分を検出するモノクローナル抗 体との反応により同定される（カプラー等がNature第３３２巻第３５〜４０頁１ ９８８年に記載した論文参照）。 他の方法においては、ウルシオールと反応するクローンしたＴ細胞からのメッ センジャーＲＮＡ又はＤＮＡを、当業者に周知のハイブリダイゼーション方法を 用いて、ＴＣＲ遺伝子科用の核酸プローブを用いる特定のハイブリダイゼーショ ンによるポリメラーゼの連鎖反応による増幅後又は直接プローブした。ＴＣＲ配 列（部分的）は増幅したＤＮＡ又はＲＮＡから得られる。ＴＣＲアミノ酸配列の 領域は、Ｔ細胞ヘルパー／細胞障害的決定因子を予言するアルゴリズムを用いて 同定した免疫原的又は抗原的性質に基づいて選定した（ジェー．ビー．ロスバル ド及びダブリュ．アール．テイラーがＥＭＢＯ J.第７巻第９３〜１００頁１９ ８８年に記載の論文参照）。例えば、１４〜１５ケのアミノ酸を有するペプチド はウシオールに対する特定ＴＣＲ部位を有すると予言されている。次いで、選定 したアミノ酸組成のペプチドを当業者に周知の標準処理を用いて合成した。次い で、合成したペプチドを動物のワクチン接種に用いた。 １０．７．２ 免疫ヒト供与体から生産したＴＣＲ カリシ等により一般的に記載されている方法（アール．エス．カリシ及びシー ．モリモト等がJ．Clin．Invest.第８２巻第８２５〜８３２頁１９８８年に記載 した論文とJ．Invest．Dermatol.第９２巻第４６〜５２頁１９８９年の記載参照 ）により、ウルシオールにより感作化した被験者から誘導した接触皮膚炎障害部 又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、Ｔリンパ球クローンを確立した。「フィ コル−ハイプラーク」分離により静脈血から単離したＰＢＭＣを培地含有ＩＬ− ２中で培養し、試験管内でジメチルスルホキシド中のウルシオールの添加による 増殖又は自家的ＰＢＭＣ上での増殖を誘起することにより感作化又は膨脹させた （バイエル等がJ．Clin．Invest.第６４巻第１４３７〜１４４８頁１９７９年に 記載の論文参照）。ＩＬ−４等の他の成長要素も用いることができる（パリアー ド等がJ．Immunol．第４３巻第４５２〜４５７頁１９８９年に記載した論文参照 ）。満足できる細胞成長を確立する時間培養した後、標準細胞培養技術を用いて 希釈を制限することにより細胞をクローンした。次いで細胞を成長させ、陽性な 凹みを膨脹させた。この相は供給細胞として自家照射した（５０００Ｒ）ＰＢＭ Ｃ及びウルシオールを用いて細胞をさらに刺激することができる。次いでＴ細胞 クローンを標準技術により確立した。或いはまた、Ｔ細胞ハイブリドーマをＴＣ Ｒｓ 給源として使用することができる。Ｔ細胞ワクチンは、例えばグルタルアルデヒ ド等の交差結合剤により修整したＴ細胞又は新生児生存可能な又は弱毒化したＴ 細胞を含む一種又は二種以上の調製物から構成することができる（上述のコーエ ンの論文参照）。応答は一般にＴＣＲのＭＨＣ成分により制約される（アール． シュバイツがAnn．Rev．Immunol.第３巻第２３７〜２６１頁１９８５年に記載し た論文参照）ので、Ｔ細胞ワクチンは自家起源のものが理想的である。然し、或 る種のハプテン及び抗原の認識にはＭＨＣが多大に制約される（パニナ−ボルデ ィグノン等がEur．J．Immunol.第１９巻第２２３７〜２２４２頁１９８９年に記 載した論文参照）。他の代案的方法においては、多数の同種供与体から誘導した クローンしたＴ細胞のプールした調製物から構成したワクチンを投与する。 他の代案的方法に於いては、ＴＣＲの特定抗原結合領域を同定し、同領域を有 するペプチドを上述したようにして合成して、免疫原として使用することができ る。 １１．モノクロナール抗ＲＴＡ（リシンＡ鎖）抗体による外因性抗体ＲＴＡに対 するＩｇＧ抗体応答の抑制 ＢＡＬＢ／ｃマウスにミューアラインモノクローナル抗体７９１Ｔ／３６から 成る免疫毒を１回静脈注射し、ジサルフィド結合によりＲＴＡに接合した。第１ 図に示すように、注射の７日後に抗ＲＴＡ抗体の顕著なタイターが見られ、３０ 日後迄タイターが増加した。 免疫毒７９１Ｔ／３６を用いて免疫としたＢＡＬＢ／ｃマウスから採取した脾 臓細胞を用いて、ＲＴＡに対してモノクローナル抗体を生成し、骨髄腫細胞系統 Ｐ３Ｎ３１と融合させ、上述した方法でクローンして特性を有させた。５種類の ｍＡｂｓをさらに研究用に選定した。３種類のｍＡｂｓ（５９６／１３４、５９ ６／１９２及び６０８／７）は原ＲＴＡと同様に良く反応したが、５６℃で加熱 することにより修整したＲＴＡとは良く反応せず、これ等のｍＡｂｓが分子上の ペプチドエピトープスに対して指向されているが、ポリペプチド上のオリゴ糖構 造に対しては指向されていないことを示した（第２図参照）。ＲＴＡは１又は２ ケのマンノース含有残基を有することで知られている。これ等のモノクローナル 抗体中では、ｍＡｂ５９６／１３４及びｍＡｂ６０８／７が１μｇ／ml以下の濃 度で継続的な高い結合を示すことにより最大の親和性を有した。他の２種のｍＡ ｂｓ６０８／９及び６０８／４２は原ＲＴＡ分子との結合が弱かったが、脱グリ コシル化したＲＴＡに対しては極めて良好に結合して、原ＲＴＡ分子中の糖残基 により覆われるクリプトトープを認識していることを示した。 １１．２ Ａｂ１を用いるＩｇＧの下方規制 免疫毒７９１Ｔ／３６ＲＴＡを用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化し、２４時 間後１００μｇの抗ＲＴＡｍＡｂｓを１回静脈注射するか、ＲＴＡと交差結合し ないもので発癌胚抗原に対して指向された１００μｇの対照ｍＡｂ３６５を１回 静脈注射することにより処理した。最初の抗原注射の１４日後にマウスから採血 し、ＥＬＩＳＡによりＩｇＧ抗ＲＴＡ血清タイターを測定し、抑制値を抗ＣＥＡ 抗体を用いて処理した対照マウスの抑制値と比較した。５種類のｍＡｂｓの中で ３種類のｍＡｂｓ６０８／７、５９６／１３４及び５９６／１９２が抗ＲＴＡ応 答を顕著に抑制した（第４図参照）。この抑制効果はｍＡｂｓ６０８／７及び５ ９６／１３４の場合に最も著しく、禁止値は夫々７１％及び７３％であった。ｍ Ａｂ６０８／７を用いる応答の滴定値は２０〜５０μｇの抗体の１回の処方が抗 ＲＴＡ抗体のタイターを４０〜６０％減少することを示した（第５図参照）。 免疫毒処理に続く２〜２４時間の間の抗ＲＴＡｍＡｂ６０８／７を用いる処理 は、抗ＲＴＡ抗体生産を顕著に（ｐが０．００１より小）禁止した（第６図参照 ）。他の試験に於いては、ｍＡｂ６０８／７は免疫化後３日迄有効であった（第 ７図参照）。さらに他の試験に於いては、ｍＡｂ６０８／７は免疫毒処理の７日 前迄に投与した場合にも有効であり、抗ＲＴＡ応答を極めて有効に禁止した。 約２０分の半減寿命Ｔ１／２で免疫毒は迅速に循環系から除去される。この短 い半減寿命はＲＴＡ上のマンノース残基によるものであり、マンノース残基は肝 臓のクッパー細胞上の受容体と結合する。抗体は抗体曝露後３日のように遅く与 えた場合にもＩｇＧ抗体ＲＴＡ応答を下方規制する能力をなおも有する為、循環 系中には何も残らないので、抗体が抗体処理細胞に接近することを簡単に防止す ることはできない。従って、抗体処理に及ぼす影響によりｍＡｂが耐性を誘起す ることが証拠となる。 １２．ヒト脱感作プロトコル １２．１ ｍＡｂ又はＣＤＲペプチド単独又は明ばんと共に脱感作はアレルギー 季節の開始前に開始するのが最適である。脱感作は地域、気候及び屋内施設によ って異なる。かくて例えばアレルギー徴候が５月と１０月に始まる地域では、こ れ等の両季節の前月に感作を開始した。被験者はアレルギー徴候に示されるよう にＤＭＡに対するアレルギーの被害を臨床的に受けている人達と、皮膚テストに 対し陽性を示す人達であった。被験者はｍＡｂ／ＣＤＲペプチドを用いて免疫化 し、可溶性蛋白質又「アルヒドロゲル８５（デンマーク国ベデバエク市のスーパ ーフォス ビオセクタ エー／エスから市販）」と混合した蛋白質として１回投 与した。各注射液中の蛋白質量は１μｇ〜１０mgの範囲であり、明ばんの使用の 有無、抗体／ＣＤＲｓの親和力及び注射液中の成分数によって異なった。注射は ６ケ月に亘って毎週又は毎月行ない、明バンと混合した場合は皮下に、明ばんを 全く使用しない場合は皮下又は皮内に注射した。明ばん以外の佐薬を使用するこ ともできた。 被験者は対照者に比べてアレルギー徴候が顕著に減少した。アレルギー徴候は 治療したアレルギーの種類によって異なった。アトピー性皮膚炎の患者は患部皮 膚面積及び／又は使用薬剤量が減少した。喘息の患者は咳と息切れの回数が減り 、一日の投薬量が減少し、肺の機能が改善された。アレルギー性鼻炎の患者は１ 年を通して要治療月数が減り、施薬が減少した。若干の場合には、試験管内で測 定してアレルゲン特定ＩｇＥの量が減少し、抗原に応答するＴ細胞の試験管内で の増殖が同様に減少した。生体内では皮膚テストで陽性を起させる為に必要なア レルゲンの量が増加し、固定処方量の抗原における膨疹及びフレヤー反応の面積 が減少した。 １２．２ 抗原−抗体複合物 他の処理に於いては、ｍＡｂ／ＣＤＲペプチドと抗原をアレルゲン：ｍＡｂ比 １：２〜１：１０で混合し、６ケ月に亘って毎週又は毎月ｍＡｂ１〜２０μｇ／ 処方の処方量で皮内又は皮下に注射した。アレルギー徴候の減少を前述したよう にして測定した。 本発明が人のアレルギーの治療に有効な抗体、抗原−抗体複合物及び佐薬組合 せ物を当業界に加えることは、当業者には容易に理解できるであろう。 １３．寄託情報 １９９３年９月１６日に下記のハイブリドーマを次に記す所在のヨーロッパ動 物細胞培養収集局（ＥＣＡＣＣ）に寄託した。 英国ＳＰ４ ＯＪＧウイルトシャー州サリスベリー ポルトンダウン応用微生 物学及び研究の為のワクチン研究及び生産研究室公衆健康研究室サービスセンタ ー ハイブリドーマ ECAACC 受理番号 １．抗Der p Ｉ １１２２／２Ｃ７／Ｂ３／ＡＩＧ （mAb2C7） 93091612 ２．抗Der p Ｉ １１０２／Ｈ１１／Ａ１０／Ｅ７ （mAbH11） 93091613 ３．抗Der p Ｉ １１４８／１Ｂ１２／Ｄ６／２Ａ１２（mAb1B12） 93091615 ４．抗Der p II １１５４／２Ｈ５／１Ａ１０／１Ｅ７（mAb2H5） 93091614 ここに記した全ての特定の実施例と処理方法は単に本発明を例示する為に記し たもので、本発明を限定する為のものではない。 ここに記した全ての刊行物と特許出願は、それ等が個別に参照の為に特定的に 本明細書中に導入されたと同様に、本明細書中に参照の為導入する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/16 8517−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 16/18 16/18 8517−4Ｈ 16/44 16/44 9358−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/02 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．外因性アレルゲンに対するアレルギー性応答を抑制するにあたり、 動物に、前記アレルゲンのアレルゲンエピトープにインビトロで選択的に結 合することが可能な、単離し、精製した、抗体誘導分子または TCR誘導分子を含 有する非細胞性免疫抑制組成物を投与し、前記組成物が前記アレルゲンを実質的 に含まず、これにより前記アレルゲンに対する前記動物のアレルギー性応答を選 択的に抑制することを特徴とする、外因性アレルゲンに対するアレルギー性応答 の抑制方法。 ２．前記アレルギー性応答に前記アレルゲンに対する IgE抗体の産生が含まれる 請求項１記載の方法。 ３．前記アレルギー性応答に喘息が含まれる請求項２記載の方法。 ４．前記アレルギー性応答にアレルギー性鼻炎が含まれる請求項２記載の方法。 ５．前記アレルギー性応答に結膜炎が含まれる請求項２記載の方法。 ６．前記アレルギー性応答にアトピー性皮膚炎が含まれる請求項２記載の方法。 ７．前記アレルゲンエピトープに免疫優性エピトープが含まれる請求項１記載の 方法。 ８．前記動物を、風媒暴露により前記外因性アレルゲンに感作させる請求項１記 載の方法。 ９．前記外因性アレルゲンが、樹木若しくは広葉草の花粉、カビ胞子、またはち りダニ抗原である請求項１記載の方法。 10．前記外因性アレルゲンが、食物タンパク質または薬物である請求項１記載の 方法。 11．前記動物を、前記免疫抑制組成物の投与に先立ち、前記外因性アレルゲンに 感作させる請求項１記載の方法。 12．前記免疫抑制組成物が、前記アレルゲンに対する Ab2を実質的に含有しない 請求項１記載の方法。 13．前記免疫抑制組成物が、前記アレルゲンに対する Ab1以外の抗体を実質的に 含有しない請求項１記載の方法。 14．前記免疫抑制組成物が、前記アレルゲンの相異なる複数のエピトープに対す る少なくとも２つの Ab1を含む請求項１記載の方法。 15．外因性アレルゲンに選択的に結合する抗体誘導分子を含む免疫抑制組成物を 得るにあたり、 a) 前記アレルゲン上の免疫優性エピトープを認識するモノクローナル抗体の 選択し；および b) 選択したモノクローナル抗体が、前記モノクローナル抗体と前記アレルゲ ンとの結合をブロックする抗イディオタイプ抗体を刺激することを証明し、およ び前記モノクローナル抗体と前記アレルゲンとの結合をブロックする抗イディオ タイプ抗体が、前記アレルゲンを用いた抗原免疫療法を受けている患者に存在す ることを証明するか；または c) 選択した抗体が、前記アレルゲンを用いた抗原免疫療法を受けている患者 に誘発された抗イディオタイプ抗体に結合することを証明する工程を含むことを 特徴とする、外因性アレルゲンに選択的に結合する抗体誘導分子を含む 免疫抑制組成物を得る方法。 16．外因性アレルゲンに対するアレルギー性応答抑制用分子組成物であって、 前記アレルゲンのアレルゲンエピトープにインビトロで選択的に結合するこ とが可能な、単離し、精製した、抗体誘導分子または TCR誘導分子を含有し、製 薬上受け入れられる注射可能な溶液中で、前記組成物が、前記アレルゲンを実質 的に含まず、前記組成物を前記動物に投与後、前記組成物が、前記アレルゲンに 対する前記動物のアレルギー性応答を選択的に抑制することを特徴とする、外因 性アレルゲンに対するアレルギー性応答抑制用分子組成物。 17．前記抗体誘導分子が抗体フラグメントである請求項１６記載の組成物。 18．前記抗体誘導分子がFcドメインを欠く請求項１６記載の組成物。 19．前記外因性アレルゲンが、樹木もしくは広葉草の花粉、カビ胞子、またはち りダニ抗原である請求項１６記載の組成物。 20．前記外因性アレルゲンが、食物タンパク質または薬物である請求項１６記載 の組成物。 21．前記組成物が、前記アレルゲンに対する Ab1以外の抗体を実質的に含有しな い請求項１６記載の組成物。 22．前記抗体誘導分子がモノクローナル抗体である請求項１６記載の組成物。 23．前記モノクローナル抗体が、抗体2C7.の結合部位で、Der p I に結合し、少 なくとも40％の多数のDer p I に対しアレルギー性の被験者で、ヒト血清 IgEのDer p I への結合を阻害する請求項２２記載の組成物。