JPH03272693A - 免疫抑制因子の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は免疫抑制因子の製造法Ｉこ関する。さらに詳し
くは、本発明はりウマチ、全身性エリテマトーデス（Ｓ
ＬＥ）などの自己免疫疾患の治療、臓器移植時の免疫抑
制および免疫反応の亢進Ｉこよって生じる各種疾患の診
断などに有用な免疫抑制因子の製造法に関する。

従来の技術 動物細胞が産生ずる免疫抑制因子に関して従来多数の報
告があるが、その作用物質が純粋な形で取られたものは
これまでに報告がなく、また本発明の製造法によって得
られる免疫抑制因子ＩＳＦ−Ｔのように、抗原特異的に
誘導された抑制性Ｔ細胞によって産生され、抗原特異的
に増殖するヘルパーＴ細胞の増殖を抑制する抗原非特異
的な免疫抑制因子に関する報告はなされていない。例え
ば、Ｈ，Ｃａｎｔｏｒらによって報告されているＴ細胞
由来の免疫抑制因子（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　　ｌ
　５３　。

１２６０（１９８１））、Ｃ，Ｊ、　Ｂｅ１１ｏｎａら
のＴハイブリドーマ由来免疫抑制因子（Ｊ、　１ｍ５ｕ
ｎｏｌ。

±４２．２４４（１９８９））、Ｌ、　Ａｄｏｒｉｎｉ
　らのＴｍｔｘｔ由来の免疫抑制因子（Ｅｕｒ、　Ｊ、
　Ｌｗｍｕｎｏｌ、　　１７　＋５７５（１９８７））
、あるいはＴ、　ＴａｄａらのＴハイプリドーマ由来の
免疫抑制因子（Ｊ、Ｉ■−ｕｎｏ　１　。

１１３．１３７１（１９８４））は、いずれも抗原との
結合部位をもち、特異抗原に対する免疫反応しか抑制し
ない。また％　Ｃ，Ｗ、　Ｐｉｅｒｃｅらによって報告
されてる、５ｏｌｕｂｌｅ　　ｉｍｍｕｎｅ　　ｒｅｓ
ｐｏｎｓｅｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ（Ｓ　　Ｉ　　ＲＳ）
　　（Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　　ｌ≦［」Σ。

３２３８（１９８５））は、その活性の発現に過酸化水
素を必要とする点で本発明のＩｌ造法によって得られる
免疫抑制因子ＩＳＦ−Ｔとは異なり、Ｔ、　Ｔｓｕｎｅ
ｍａｔｓｕらの免疫抑制因子（Ｊ、　Ｉ＋ｕ＋ｕｎｏｌ
。

上３６．２９０４（１９８６））は、Ｃ，Ｗ、　Ｐｉｅ
ｒｃｅら＋７）ＳｉＨ２と同様にコンカンバリンＡによ
って活性化されたＴＪＩａから産生され、７４１Ｍ非依
存性の抗体産生も抑制する点が本発明の免疫抑制因子Ｉ
ＳＦ−Ｔと興なっている。さらに、ラット繊維芽細胞を
トランス７オームさせる物質として発見され、最近にな
って免疫抑制作用を示すことが見い出されたＴＧＦ−β
は塩基性の蛋白であり、しかも本発明の免疫抑制因子Ｉ
ＳＦ−Ｔを産生する細胞であるマウスＴ細胞株１３Ｇ２
（ＩＦＯ５０２２０）がＴＧＦ−βを産生していないこ
となどから、本発明の免疫抑ｔＩｌｉ因子Ｉ　５Ｆ−Ｔ
とは異なっている。

発明が解決しようとする課題 現在抗リウマチ剤として用いられている免疫抑制剤は金
製剤が主流であり、金チオリンゴ酸ナトリウムやオーラ
ノフィンなどが用いられているが、これらの薬剤の効果
は必ずしも満足できるものではない。又、臓器移植時の
免疫抑制に用いられている薬剤としては、アザチオプリ
ン、ステロイド。

サイクロフォスフアミド、サイクロスポリンＡなどが挙
げられるが、アザチオプリン、ステロイド。

サイクロフォスフアミドはいずれも副作用が強く、時に
は重篤な副作用を招くこともあるので、そのような欠点
を持たない薬剤の開発が望まれている。

一方、サイクロスポリンＡもその作用が弱いことと腎毒
性が問題になっている。このように、実用上満足できる
ような免疫抑制剤がないのが現状である。これに対し、
本発明の免疫抑制因子ＩＳＦ−Ｔは生体が産生ずる免疫
抑制因子であり、比較的副作用が少ないことが期待され
る。さらに、自身は抗原非特異的に作用するが、抗原刺
激によって活性化されたＴ細胞にのみ作用することから
、免疫系に特異的に作用し、且つ広い範囲の免疫反応を
抑制することが期待されるので、各種の免疫反応の完遂
した疾患に対する治療薬となりうる可能性がある。又、
従来の免疫抑制剤とは異なる作用機構を有するので、従
来の薬剤との併用効果も期待される。

課題を解決するための手段 本発明者はウシａｓｌ−カゼインの抗原性に関する研究
を行い、その結果ウシａｓｌ−カゼインとＩＬ−２の刺
激によって増殖する細胞株を樹立することに成功し、免
疫抑制活性を示す抑制性７８１１株（マｔ　；ｚ　Ｔｍ
ｌｌｔ株１３　Ｇ　２　ＸＦｉ本免ｆＭ学会学術集会記
録、上８．１００（１９８８））と、この活性によって
抗原特異的な増、殖が阻害されるヘルパーＴ細胞株（マ
ウスＴ細胞株３Ｄ２０Ｘ日本農芸化学会誌、６３．２５
２（１９８９））を見イタシ、この知見に基づいてさら
に研究を進めた結果、本発明を完成した。

すなわち本発明は、免疫抑制因子ＩＳＦ−Ｔを産生する
細胞を培養して培養物中にＩＳＦ−Ｔを生成、蓄積させ
、これを採取することを特徴とするＩ　５Ｆ−Ｔの製造
法である。

免疫抑制−子ＩＳＦ−Ｔを産生する細胞としては、後述
の免疫抑制因子ＩＳＦ−Ｔを産生しうる細胞であればい
ずれでもよく、例えばＴＪＩＩＩＩなかでもマウスＴ細
胞などが挙げられ、具体的にはＣＤ３（＋）、ＣＤ４（
−）、ＣＤ８（＋）、ＴＣＲ（＋）である典型的なＴ細
胞、細胞傷害活性を示さないＴ細胞、ＭＨＣの拘束を受
けないＴ細胞などが挙゛げられるが、より具体的ｌ；は
後述の実施例１こ開示するマウスＴ細胞株１３Ｇ２［Ｉ
Ｆｏ　　５０２２０、ＦＥＲＭ　　ＢＰ−３０８８１が
例示される。

本発明のＩ　５Ｆ−Ｔ産生能を有する細胞の培養に際し
て用いられる培地は、核細胞が本発明のＩＳＦ−Ｔを産
生し得るものであればどのようなものでも良い。たとえ
ば培養に適した動物細胞培養培地、たとえば市販のＲＰ
ＭＩ　　１６４０培地［ジャーナル・オブ・アメリカン
・メヂヵル・アソシエーション、８１９９巻、５１９頁
（１９６７年）］などが有利に用いられる。これらの培
地には好ましくは約０．０５ないしｌ　ｍｇ／−の抗生
物質、たとえばカナマイシン、ペニシリン、ストレプト
マイシンなどを加えて用いてもよい。かかる培地に動物
血清、たとえばウシ胎児血清または仔ウシ血清を約０．
１ないし５０Ｗ／Ｗ％、好ましくは約２ないし２０Ｗ／
Ｗ％となるように添加した培地中で培養を行なってもよ
いが、ＩＳＦ−Ｔの精製を容易ならしめるために培地に
動物血清を加えずに培養する方が有利である。

培養の際に添加される誘導物質としては、たとえばフレ
チンｃ例、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、フィトへマ
グルチニンＡ（ＰＨＡ）など］、各種の抗原。

ホルボールエステル［１２−０−テトラデカノイルホル
ボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）］などが挙げられ
、またこれらの二種または三種を組み合わせて使用して
もよい。

上記抗原としては、たとえばアロ抗原【例、マイトマイ
シンＣ処理（通常　ＩＯないし２００μｇ／−で３０分
ないし５時間処理する）またはＸ線照射等で細胞分裂を
抑制した異系または異種のＢリンパ球細胞が挙げられる
。さらに特異抗原［例えば１３Ｇ２の場合は１〜５００
＊ｇ／−のａＳｌ−カゼイン）と抗原提示細胞（例えば
１３Ｇ２の場合は５〜５０ＸｌＯ＠個／ｓ１２のＣ５７
Ｂ　Ｌ　／　５　？ウスの牌細胞）を加えることもでき
る。

組み合わせて使用する場合の例としては、レクチン、ホ
ルボールエステルおよびアロ抗原が挙げられる。具体的
にはたとえばフレチンとしてＣｏｎＡを、ホルボールエ
ステルとしてＴＰＡを、アロ抗原として異系牌細胞を使
用するのが好ましく、それぞれ、たとえば約５ないし８
０ｐｇ／ｄｔ、約１ないしｌ　５００ｎｇ／ｓｄ、約１
Ｘ１０’ないし５×ＩＯ６個／−の濃度で添加する。

培養は静置培養、スピンナー培養、ローラーボトル培養
などによってなされる。血清含有培地で大量培養を行っ
て本発明ＩＳＦ−Ｔを得るためにはローラーボトル培養
が好ましい。通常的０．ｌないし５０Ｘ１０’個／−１
好ましくは約１ないし５×１０１個／ｄの細胞濃度で接
種し、約１〜２０％ＣＯ８存在下で約３０ないし４０℃
で培養する。

培養中の培地のＤＨは、通常的６ないし８．好ましくは
約７ないし７．４に保たれる。

培養時間は本発明のＩＳＦ−Ｔ自体の誘導産生量を指標
にして決定するが、通常約１０〜１２０時間、とりわけ
約４８〜９６時間の培養で培養上清を分離、採取するの
が好ましい。培地中に蓄積された本発明のＩＳＦ−Ｔの
測定にはσｓｌ−カゼイン特異的ヘルパーＴ細胞株３Ｄ
２０を用いることができる。

本発明のＩＳＦ−Ｔの各成分を培養上清から分離、精製
するには、自体公知の分離、精製法を適切に組み合わせ
て行うことができる。これらの公知の分離、精製法とし
ては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、
＠外濾過法、ゲル濾過法および５ＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用す
る方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差
を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーな
どの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマ
トグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法１等電点
電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが挙げ
られる。

本発明のＩＳＦ−Ｔは、本発明に記載したＩＳＦ−Ｔ産
生能を有する細胞の培養液より分離。

採取されるが、このような方法以外に謂わゆる遺伝子操
作の手法により大量に得ることが可能である。また、本
発明のＩＳＦ−Ｔを免疫原としてマウス、家兎その他の
動物を免疫することにより本発明のＩ　５Ｆ−Ｔに対す
るモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を得る
ことが可能であり、このような抗体を取得して抗体アフ
ィニティーカラムを作成して本発明のＩＳＦ−Ｔの分離
、採取が可能である。

本発明の製造法によって得られる免疫抑制因子ＩＳＦ−
Ｔは下記の生物、物理、化学的性状を示す新規免疫抑制
因子である。

ｉ）免疫反応を特異的に抑制する ｉｉ）抗原特異的な免疫反応を抗原非特異的に抑制する １ｉ）Ｔ細胞非依存性の抗体産生による免疫反応を抑制
しない ｉｖ）抗原提示細胞を介したＴ細胞への抗原提示過程を
阻害することによって、免疫抑制作用を発揮する Ｖ）分子量が１０，０００−１００．０００であｖｉ）
ＩＩ（ｐＨ２，０）処理で失活しないｄ）抗原特異的ヘ
ルパーＴ細胞（例、マウスＴ細胞株３Ｄ２０など）の増
殖促進作用による免疫反応を抑制する 上記ＩＳＦ−Ｔは、マウスＴ細胞株３Ｄ２０をその特異
抗原であるウシｇｓｌ−カゼインで刺激したときに５１
き起こされる細胞増殖を阻害するので、マウスＴ細胞株
３Ｄ２０をＩＳＦ−Ｔの活性測定に用いることができる
。因みに、マウスＴ細胞株３Ｄ２０の増殖を５０％阻害
するのに必要なＩＳＦ−Ｔの濃度を１Ｕｎｉｔ／ｄとす
ると、マウスＴ細胞株１３Ｇ２［ＩＦＯ５０２２０，Ｆ
ＥＲＭ　　ＢＰ−３０８８］は約１００　Ｕｎｉｔ／　
ｓｇのＩＳＦ−Ｔｔｊｌ生する。

本発明の製造法により得られる免疫抑制因子ＩＳＦ−Ｔ
はそのまま、あるいは他の薬理学的に許容され得る担体
、賦形剤、希釈剤とともに医薬組成物（例、注射剤など
）としての製剤化を行い、温血動物（例、ヒト、サルな
ど）に対して経口または非経口的に安全に投与すること
ができる。

さらに、製剤化にあたっては、ブドウ糖などの単糖類や
、アミノ酸、各種塩類、ヒト血清アルブミンなどを添加
しても良く、その他に等張化剤、ｐＨ調節剤、無痛化剤
、防腐剤などを加えて安定で有効な免疫抑制製剤を調製
することができる。

本発明の免疫抑制因子ＩＳＦ−Ｔは、リウマチ。

全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患の改善、治
療、臓器移植時の免疫抑制因子および免疫反応の亢進に
よって生じる各種疾患の診断などに有用である。例えば
、関節リウマチの改善、治療に用いる場合の上記ＩＳＦ
−Ｔの投与量は、投与ルート（例、静脈内投与、関節的
投与など）および症状の程度などにより適宜選定される
が、通常的０゜０１〜１００μｓ／ｋｇ／日の範囲で静
脈内投与するのが適切である。なお、投与量は投与方法
や投与期間などによってその至適条件が異なるので、必
ずしもこの範囲に限定されるものではない。

Ｕ盟 以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが
、これらが本発明の範囲を限定するものでないことは言
うまでもない。

なお、以下の実施例で用いたマウスＴ細胞株１３Ｇ２は
、平成２年１月９日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）
に受託番号ＩＦＯ５０２２０として、また千＊２午９月
ｌＯ日から通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥＲＭ　　ＢＰ−３０８８とし
て寄託されている。

実施例１　免疫抑制性Ｔ細胞株及び増強性Ｔ細胞株の樹
立 牛乳アレルギーの主要原因物質であるウシσＳｌ−カゼ
インでＣ５７ＢＬ／６マウスを繰返し免疫した後、その
リンパ節細胞を取り出して培養した。その培養系に毎週
−回向系Ｘ線照射（３０００Ｒ）マウス牌臓細胞と１０
０μｇ／−のウシａｓｌ−カゼインとによる刺激を繰り
返した。

との時、同時にフンカナバリンＡで刺激した同系マウス
牌臓細胞の培養上清を１０％加えて、Ｔ細胞の増殖を促
進した。培養２週日に限界希釈法にてクローニングを行
い、免疫抑制活性を有するマウス抑制性Ｔ細胞株１３Ｇ
２目ＦＯ５０２２０゜ＦＥＲＭ　　ＢＰ−３０８８］ｒ
以下、１３Ｇ２と略称することがある１を樹立した。さ
らに、同様の方法で、抗原特異的に増殖するマウス増強
性Ｔ細胞株３Ｄ２０［以下、３Ｄ２０と略称することが
ある］を樹立した。

実施例２　免疫抑制活性の測定法 ３Ｄ２０を用いて免疫抑制因子ＩＳＦ−Ｔの活性を次の
ような方法で測定した。即ち、Ｉ　５Ｆ−Ｔを含む測定
試料（１３Ｇ２の培養上清を限外濾過によって２０倍濃
縮した分子量１万以上の分画）［１０％ウシ胎子血清（
Ｆｅ２）、５ＸｌＯ″″′Ｍ２−メルカプトエタノール
、１００μｇ／−ペニシリン、　ｌ　ＯＯＵｎｉｔ／ｄ
ｔストレプトマイシン添加ＲＰＭＩ−１６４０培地］で
適宜希釈したもの２０ｐＬ培養用培地３０ｐＨ，４Ｘｌ
Ｏ’ｌ／ｍ２の３Ｄ２０浮遊液５０．ｕＬ４ＸｌＯ・個
／１１１７）Ｃ５７ＢＬ１５マウス牌臓細胞浮遊液５０
μａ及び４００μｇ／ｄｉのウシσｓｌ−カゼイン（抗
原）溶液５０μａを９６穴マイクロカルチヤープレート
の各穴に入れて混合する。５％ＣＯ！存在下３７℃で３
日間培養し、さらにｌ　ｐｃｉの３Ｈ−チミジンを加え
て、１６時間培養を続ける。その後、細胞へ取り込まれ
た３Ｈ−チミジンを液体シンチレーションカウンターを
用いて測定する。第１図に示すように、限外濾過により
分子量１０．０００以上の分画を２０倍濃縮した試料中
のＩＳＦ−Ｔ活性（３Ｄ２０に対する増殖抑制）を測定
した結果、約２．０００Ｕｎｉｔ／ｄのＩＳＦ−Ｔが含
まれることが分かった。なお、ウシａｓｌ−カゼイン非
存在下ではＩＳＦ−Ｔは何ら影響を与えなかった（第１
図中、−〇−は抗原刺激群を、−口−は無刺激群を示す
）。さらに、ＩＳＦ−Ｔを含む測定試料の代わりにＸ線
照射１３Ｇ２細胞を加えて培養した場合にも同様で、種
々の抗原刺激による細胞増殖が抑制された（第２図）（
＠２図中、−〇−は抗原刺激群を、−Δ−は抗原無刺激
群を示す）。

実施例３　免疫抑制因子の抗原特異性 ウシｆｆ５１−カゼイン（ａｓｌ−ＣＮ）、カラス貝ヘ
モシアニン（ＫＬＨ）、あるいはβ−ラクトグロブリン
（β−ＬＧ）で免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスのリンパ
節細胞をそれぞれに対する抗原で刺激した時の細胞増殖
に対するＩＳＦ−Ｔの効果を調べた。

すなわち、各抗原５０μｇを７０インド完全アジユバン
ト（ＦＣＡ）と共にＣ５７ＢＬ１５マウスの足しやに免
疫し、その７日目にリンパ節細胞を採取した。９６穴マ
イクロカルチヤープレートの各穴に４ＸｌＯ’個のリン
パ節細胞を入れ、さらにそれぞれの抗ｊｌ［１００μｇ
／−を加えて２次抗原刺激した。この時、１３Ｇ２の培
養上清のｌ／２００〜３／２０を加えて４日間培養して
、リンパ節細胞に対する増殖抑制作用を検討した。抑制
活性は１Ｈ−チミジンの取り込み阻害率で示した（第３
図）。

いずれの抗原刺激の系の場合でもＩＳＦ−Ｔは細胞増殖
を阻害した（第３図中、−Δ−１−〇−および一口−は
それぞれＫＬＨ，ｇｓｌ　−ＣＮおよびβ−ＬＧ＠激群
を示す）。阻害の程度には差が認められたが、細胞の免
疫状態が同じではないので、抗原の種類によってＩＳＦ
−Ｔの効果が違うとは言えない。

実施例４　各種刺激で増殖する３Ｄ２０に対する免疫抑
制因子の効果 ３Ｄ２０をＩ　Ｌ　−２（ＣｏｎＡ刺激牌臓細胞の培養
上清）あるいは抗ＣＤ３抗体で刺激することによって誘
導される細胞増殖に対するＩ　５Ｆ−Ｔの効果を調べた
。

すなわち、３Ｄ２０．２０，０００個ニ対シテ１）２０
．０００個のＸ線照射１３Ｇ２あるいは■）１３Ｇ２の
培養上清１０％を加えて、３Ｄ２０に対する細胞増殖阻
害活性を経日的に検討した。第４図Ａは、抗原による刺
激を実施例２と同様に行ったときの結果を示し、第４図
ＢはＩ　Ｌ−２による刺激を４０　Ｌｌｎｉｔ／ｗｉｔ
のＩ　Ｌ−２活性を持っＣｏｎ　Ａ刺激肺臓細胞の培養
上清を１０％加えて行ったときの結果を示し、第４図Ｃ
は、抗ＣＤ３抗体による刺激を１４５−２Ｃ１１バイブ
リド−？（Ｎ　ＩＨのＯ，Ｌｅｏ博士から恵与された）
の培養上溝を１０％加えて行ったときの結果を示す。な
お、第４図中−〇−は無添加群を、−ローは１３Ｇ２添
加群を、−△−はＩＳＦ−Ｔ添加群を示す。ウシａｓｌ
−カゼイン刺激の場合では、ＩＳＦ−Ｔは１３Ｇ２との
混合培養の場合と同程度に３ないし４日目に３Ｄ２０の
細胞増殖を抑制した（第４図Ａ）。一方、ＩＳＦ−Ｔは
Ｉ　Ｌ−２や抗ＣＤ３抗体のような抗原非特異的刺激に
よる３Ｄ２０の増殖を抑制しなかった（第４図Ｂ１第４
図Ｃ）。

実施例５　抗原刺激による１　３Ｇ２の細胞増殖とＩＳ
Ｆ−Ｔ産生 固相化した抗マウスＣＤ３抗体、抗Ｔ細胞レセプター（
ＴＣＲ）抗体あるいはＩＬ−２で１Ｘ１０６個／−の１
３Ｇ２を刺激し、その後のＩＳＦ−Ｔ産生を実施例２に
記載の測定法により調べた。

その結果、いずれの系でも培地中のＩＳＦ−Ｔ活性は培
Ｉ１１日目までに最大となり、その後は５日目までほと
んど増加しなかった（第１２図）。

これに対して、抗ＴＣＲ抗体で刺激した１　３Ｇ２の細
胞増殖を３Ｈ−チミジンの取り込みを指標として調べた
結果、１３Ｇ２の細胞増殖は２日目に最大となった（第
１３図）。

実施例６　免疫抑制因子の分子量 １３Ｇ２の培養上清をセファデックスＧ−１００を用い
たゲル濾過に付し、ＩＳＦ−Ｔの分子量を推定した。

すなわち、２０倍に濃縮した１３Ｇ２の培養上清１５−
を１００ｄのセファデックスＧ−１００カラムにチャー
ジした。得られた各７ラクシｌンの２８Ｏｎ＋ｓの吸光
度（−）及び実施例２に記載の測定系に各７ラクシ厘ン
ｌＯ％を加えてその細胞増殖抑制活性（−−−−）を測
定した結果を第５図に示す。第５図中、ＢＳＡ、０ＶＡ
Ｌよびａ−ＬＡはそれぞれウシ血清アルブミン、卵白ア
ルブミンおよびａ−ラクトグロブリンを示す。第５図か
ら、分子量１’０．０００−１００．０００の分画に３
Ｄ２０の抗原特異的増殖を抑制する活性が認められた。

また、得られた分画の活性は、酸（ｐＨ２，０）処理で
は失活しなかった。

実施例７１３Ｇ２細胞の細胞表面抗原 １３Ｇ２の細胞表面抗原の解析をフローサイトメトリー
を用いて行った。

すなわち、１３Ｇ２を抗ＣＤ４抗体［ハイブリドーマＧ
Ｋ１．５（シカゴ大のＦ、　Ｆｉｔｃｈ博士より恵与さ
れた）の培養上清］、抗ＣＤ８抗体［ハイブリドーマ５
３−６．７２（スタンフォード大のり。

Ａ、　ｌ（６ｒｚｅｎｂｅｒｇ博士から恵与された）の
培養上清］で染色する場合は抗体無理後、さらにＦＩＴ
Ｃ標謙ヤギ抗ラット免疫グロブリン抗体で処理した。

抗ＣＤ３抗体（ハイブリドーマ１４５−２Ｃ１１の培養
上清）の場合は抗体処理後、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ハムス
ター免疫グロブリン抗体で染色した。

抗Ｔ細胞レセプター（Ｖβ８）抗体［バイブリド−ｖｐ
　２３．ｌ（５ｃｒｉｐｐｓ　　Ｃ１１ｎｉｃ　　ａｎ
ｄ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔ　ｔｏｎのＵ、
　Ｄ、　５ｔａｒｅｒｚ博士から恵与された）の培養上
清］の場合は、抗体処理後ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス免
疫グロブリン抗体で染色した。

コントロールには２次抗体だけで染色したものを用い、
ＦＡＣＳで細胞表面抗原陽性率を調べた。

結果を第６図ＡおよびＢに示す（第６図Ａ中、−一一一
はコントロールを、−は抗ＣＤ４抗体を、−ｍ−は抗Ｃ
Ｄ８抗体を示し、第６図Ｂ中、−一一一はコントロール
を、−は抗ＣＤ３抗体を、−ｍ−は抗Ｖβ８抗体を示す
）。

第６図ＡおよびＢに示すように、１３Ｇ２は抗ＣＤ３抗
体、抗ＣＤ８抗体、抗ＴＣＲ（Ｖβ８）抗体（Ｆ２３．
１）では染まったが、抗ＣＤ４抗体では染まらず、典型
的な抑制性Ｔ細胞株であることが分かった。

実施例８　抗体産生に対する効果 ウシａｓｌ−カゼインで免疫したマウスリンパ節細胞を
抗原刺激して誘導される抗ウシａｓｌ　−カゼイン抗体
産生に対するＸ線照射１３Ｇ２の効果を調べた。すなわ
ち、Ｃ５７Ｂ　Ｌ／６マウスに５０Ｆｇのウシｔｔｓｌ
−カゼインを７０インド完全アジユバントと共に足しや
に注射して免疫し、１４４日目リンパ節細胞を採取した
。４８大のカルチャーグレートの各穴に２ＸｌＯ’個の
リンパ節細胞と１００〜３．０００個のＸ線照射１３Ｇ
２または３Ｄ２０を入れ、１０Ｆｇ／ａｌｌのウシａｓ
１−カゼインで２次刺激した。１１日間培養し、その培
養上溝中の抗ウシαｓｌ−カゼイン抗体量をＥＬ　Ｉ　
ＳＡ法で測定した。ＥＬ　Ｉ　ＳＡはウシａｓｌ−カゼ
インをコートしたマイクロカルチャープレートに培養上
清を添加し、結合した抗体量をアルカリ７オス７アター
ゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体を用いて定量した。

結果を第７図に示す（第７図中、−〇−は１３Ｇ２添加
群を、−△−は３Ｄ２０添加群を示す）。第７図に示す
ように、リンパ節細胞２ＸｌＯ＠個に対して３００個の
１３Ｇ２を加えると抗つシａｓ−カゼイン抗体の産生は
約１１５に低下し、１０００個の１３Ｇ２を加えた場合
、はぼ完全に抗体産生が抑制された。このような抗体産
生に対する抑制活性は３Ｄ２０では認められなかった。

一方、実施例２で得られた第２図から明らかなように３
Ｄ２０の抗原特異的な細胞増殖を完全に抑制するには、
２０゜０００個の３Ｄ２０対してｌ　Ｏ，０００個の１
３Ｇ２が必要であった。

実施例９　免疫抑制のＭＭＣ拘束性 Ｃ３Ｈ／ＨｅあるいはＢＡＬＢ／ｃマウスをウシａｓｌ
−カゼインで免疫し、そのリンパ節細胞の抗原特異的な
増殖がＸ線照射１３Ｇ２との混合培養によって阻害され
るかどうかを調べた。すなわち、１００μｇのウシσｓ
ｌ−カゼインを７０インド完全アジユバント（Ｆ　ＣＡ
）と共にＣ３Ｈ／ＨｅあるいはＢＡＬＢ／ｃマウスの足
しゃに免疫し、その７日目にリンパ節細胞を採取した。

９６六マイクロカルチヤープレートの各穴に４×１０’
個のリンパ節細胞と３ＸｌＯ’個のＸ線照射１３Ｇ２を
入れ、さらに、抗Ｋ　１００　ｐｇ／ｗｌｌを加えて４
日間培養し、リンパ節細胞に対する増殖抑制作用を検討
した。抑制活性は！Ｈ−チミジンの取り込み抑制で調べ
た。結果を第８図に示す。

第８図に示すように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの場合（第
３図）と同様Ｃ３Ｈ／ＨｅあるいはＢＡＬＢ／Ｃマウス
のリンパ節細胞の抗原特異的増殖も抑制されることが分
かった。即ち、１３Ｇ２の免疫抑制作用にはＭＨＣ拘束
性は認められなかった。

実施例１０７細胞非依存性の抗体産生に対する効Ｃ５７
ＢＬ／６マウスの肺臓細胞をＢ細胞マイトーゲンである
リポポリサッカライド（ＬＰＳ）で刺激したときに誘導
されるＩｇＭ抗体産生に及ぼすＸ線照射１３Ｇ２の影響
を調べた。すなわち、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肺臓細胞
（４ＸＩＯ″個／穴）に２５Ｆｇ／−のＬＰＳを加えて
、４日間培養して誘導されるＩｇＭ抗体産生に対するＸ
線照射１３Ｇ２あるいは３Ｄ２０（１００〜３．０００
個／穴）の作用を検討した。産生されたＩｇＭ抗体量は
ＥＬ　Ｉ　ＳＡで測定した。ＥＬ　Ｉ　ＳＡはヤギ抗マ
ウスＩｇＭ抗体をコートしたマイクロカルチャープレー
トに培養上清を添加し、結合したＩｇＭ抗体量をアルカ
リフォスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体を用い
て定量した。結果を１！Ｊ９図に示す（第９図中、−〇
−は１３Ｇ２添加群を、−△−は３Ｄ２０添加群を、　
○はＬＰＳ無添加群を示す）。第９図から明らかなよう
に、１３Ｇ２はヘルパーＴ細胞株である３Ｄ２０と同様
、ＬＰＳによるＩｇＭ産生誘導には全く影響を与えなか
った。このことから、１３Ｇ２はＢ１８胞ｌこは直接作
用しないと考えられる。

実施例１１　抗原提示細胞に対する効果マウスＬ細胞に
Ｈ−２クラス■抗原の一つであるＩ−Ａ”の遺伝子を導
入し、細胞表面にＩ　−Ａ’抗原を発現したＬ細胞（Ｎ
　Ｉ　ＨのＲ，Ｇｅｒｍａｉｎ博士から恵与された）を
作製し、これを１％のパラフォルムアルデヒドで固定し
て抗原提示細胞（２０，０００ｍ／穴）とし、ウシａ５
１−カゼインあるいは３Ｄ２０が認識するウシσｓｌ−
カゼインの抗原部位（１３６〜１５５アミノ酸残基）の
そｔｔソｔｔ　１００　ｐｇ／ｗｌｔ＊ｔＲ，Ｗ、トＩ
、テ３　Ｄ　２０細胞（２０，０００個／穴）を刺激し
、Ｘ線照射１３Ｇ２（１０，０００個／穴）を加えて４
日間培養し、３Ｄ２０の細胞増殖に対する影響を検討し
た。結果を第１０図に示す。第１ｏ図から明らかなよう
に、２０．０００個＋７）３Ｄ２０！：対してｌＯ，０
００個のＸ線照射１３Ｇ２を加えたとき、ウシａｓｌ〜
カゼインの抗原決定基７ラグメントで刺激したときにの
み、３Ｄ２０の細胞増殖は約１／３に抑制された。この
結果は、１３Ｇ２の免疫抑制作用が抗原提示ｍ胞（マク
ロファージや樹状細胞）を介さないこと、及びＬｍａ上
のＩ−Ａ’抗原とウシσｓ１−カゼイン自身とは互いに
相互作用できないことを示唆している。

次にＩＳＦ−Ｔの作用機序をさらに明らかにするために
、ＩＳＦ−Ｔが抗原提示細胞とヘルパーＴ細胞のいずれ
に作用するかを３Ｄ２０の３Ｈ−チミジン取込み値を指
標として検討した。、Ｘ線照射した抗原提示細胞をＩＳ
Ｆ−Ｔ存在下で１６時間培養し、ＩＳＦ−Ｔを洗浄除去
後、３Ｄ２０および抗１Ｋ　（ａ　Ｓ　１−カゼイン）
と共に培養したところ、３Ｄ２０の細胞増殖はＩＳＦ−
Ｔ無処理群に比べて約１／３に抑制された。一方、３Ｄ
２０を同様にあらかじめＩＳＦ−Ｔで処理した後、抗原
提示細胞及び抗原と共に培養しても３Ｄ２０の細胞増殖
は変化しなかった（表１）。

抗原提示細胞　　　＋　　　　２６７５±　３００３Ｄ
２０ １５２６９±　８７６ 実施例１２１３Ｇ２の細胞傷害性 Ｈ−２１に対するアロキラー細胞を陽性コントロールと
して、１３Ｇ２の３Ｄ２０及びＣ５７ＢＬ／６マウス由
来Ｂ細胞株ＭＬＰＢ６に対する細胞障害性を検討した。

すなわち、Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスの膵臓細胞をＸ線照射し
たＣ５７ＢＬ／６マウスの肺臓細胞で８日間刺激して得
られたＨ−２”特異的アロキラー細胞及び１３Ｇ２の細
胞傷害活性を、３Ｄ２０あるいはＣ５７ＢＬ／６マウス
由来のＢ細胞株ＭＬＰＢ６を標的として４時間１１（ｒ
遊離試験によって検討した。結果を［１１図ＡおよびＢ
Ｉ；示す（第１１図ＡおよびＢは、それぞれ３Ｄ２０８
よびＭＬＰＢ６に対する細胞傷害活性を示し、−・−お
よび−○−は、それぞれアロキラー細胞および１３Ｇ２
の細胞傷害活性を示す）。第１１図ＡおよびＢから明ら
かなように、１３Ｇ２は正常肺臓細胞と同様、３Ｄ２０
及びＭＬＰＢ６に対してほとんど細胞障害活性を示さな
かった。即ち、１３Ｇ２の細胞増殖抑制作用はｍｓ傷害
作用によるものではなく、ヘルパーＴ細胞を不活化する
ことによって発揮されると考えられる。

発明の効果 本発明は、抗原特異的な免疫反応を抑制する抗原非特異
的抑制性７７６１７１１１株が産生ずる免疫抑制因子Ｉ
ＳＦ−Ｔを、高感受性細胞株を用いる高感度測定系を活
用することによって精製、単離し、その生物学的性質を
解明して、リウマチやＳＬＨなどの自己免疫疾患の治療
及び臓器移植時の免疫抑制に応用しようとするものであ
る。

また、従来の免疫抑制剤が、薬効としての免疫抑ｌ＃Ｊ
ｒＰ用が弱く、シかも１１ｒＦ用が強いため、実用上十
分満足できるものではないのに対し、本発明の製造法で
得られる免疫抑制因子ＩＳＦ−Ｔは、理想的な免疫抑制
剤になりうるものと期待できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、１３Ｇ２の培養上清（２０倍希釈）中の免疫
抑Ｓ因子Ｉ　５Ｆ−Ｔによる３Ｄ２０に対する増殖抑制
作用を示す（実施例２参照）。 第２図は、３Ｄ２０の抗原特異的増殖に対する１３Ｇ２
の抑制作用を示す（＊施例２参照）。 第３図は、各種抗原で免疫したマウスのリンパ節細胞の
増殖に対する免疫抑制因子ＩＳＦ−Ｔの抑制効果を示す
（実施例３参照）。 第４図は、各種刺激による３Ｄ２０の増殖に対する抑制
効果を示す（実施例４参照）。 第５図は、免疫抑制因子ＩＳＦ−Ｔのゲルフィルトレー
ジョンパターンを示す（実施例６参照）。 第６図は、１３Ｇ２の細胞表面抗原の７０−サイ°トメ
トリーによる解析結果を示す（実施例７参照）。 第７図は、抗つシｇｓｌ−カゼイン抗体産生に対する１
　３Ｇ２の抑制作用を示す（実施例８参照）。 第８図は、ウシａｓｌ−カゼイン免疫ｃ　３　Ｈ／Ｈｅ
及びＢＡＬＢ／ｃマウスのリンパ節細胞を抗原刺激して
誘導される細胞増殖に対する１３Ｇ２の影響を示す（＊
施例９参照）。 １ｓ９図は、ＴＩＩＢ胞非依存性の抗体産生Ｉこ対する
１　３Ｇ２または３Ｄ２０の効果を示す（実施例１０参
照）。 第１Ｏ図は、特異抗原決定基とＩ−Ａゝ陽性り細胞で刺
激された３Ｄ２０の細胞増殖に対する１３Ｇ２の影響を
示す（実施例１１参照）。 第１１１！Ｉは、１３Ｇ２の細胞傷害活性を示す（５Ｉ
！施例１２参照）。 第１２図は、抗Ｔ細胞しセプター抗体刺激後の１３Ｇ２
培養上溝中のＩＳＦ−Ｔ活性［○□○：培養１培養１培
目上清、　ｘ−−−−−−−・×：培養５日目の培養上
清、△：３Ｄ２０に対して抗原無刺激時（対照）〕を示
す（実施例５参照）。 ｊｌ！１３図は、抗Ｔ細胞しセプター抗体刺激後の１３
Ｇ２の細胞増殖を示す（実施例５参照）。 ０　　１／１２５０　１／２５０　１１５０　　１／１
０１３Ｇ２の培養上清（２０倍濃縮液）の希釈度３０／
２００ １０／２００ ３／２００ １　／２００ １３Ｇ２培養上清の添加率 ０．３１ １３Ｇ２の添加数（ＸＩＯ’個） 宕呂 増殖阻害率（％） ＄６図 Ｌｏｇ堂光強皮 Ｌｏｇ虫光強戻 １０２３ＸＩＯ”　　　　　ｔｏ’ １３Ｇ２または３Ｄ２０の添加数 １ ＋ 第１０図 ｓＨ−チミジン取’）込ｈＭ（ｃｐｍＸｌＯ−’　）１
０’ ３Ｘ１０２１０３ 細　　胞　　数 ３ＸｌＯ” １３Ｇ２培養上清添加量 ３ ０ ０ ０ ０ エフェクター／標的細胞比

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 免疫抑制因子ＩＳＦ−Ｔを産生する細胞を培養して培養
   物中にＩＳＦ−Ｔを生成、蓄積させ、これを採取するこ
   とを特徴とするＩＳＦ−Ｔの製造法。