JPH0586378B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用可能性〕 本発明は人のイムノグロブリンＧのFcフラグ
メントを主成分とする免疫調整ないし免疫変更医
薬に関する。この医薬は自己免疫疾患の処置を含
む免疫機能障害の処置において、また移植免疫禁
止剤として、また臓器移植を既に受けているかも
しくはこれから受けるべき疾患の処置において特
に使用されることができる。 〔従来の技術〕 臓器特に腎臓及び髄の移植は広く行なわれてい
る。主要な組織適合性についての研究は進んでい
るといつても、移植された臓器の外部的細胞を生
体が破壊する反応即ち拒絶反応をさけるために免
疫禁止を人為的に惹起させることが必要とされて
いる。 このような免疫防衛を禁止するために、特に完
全な照射、化学療法（アルキル化剤、プリン塩基
の類縁物）、或る種の抗生物質及び抗リンパ球血
清の使用に基づいた種々の方法が知られている。 これらの免疫禁止法には、周知のように、これ
らが移植に対する生体の自然の防衛だけでなくウ
イルスや微生物のような感染性病原体に対する自
然の防衛をも麻ひさせるという不具合がある。患
者はこれらの感染に対して無防備になり、これを
防ぐための強制的な対策が講じられなければなら
ない。 〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明の目的は、移植された臓器に対する免疫
防衛反応を禁止し、感染に対する防衛において重
要な役目をすることがわかつている体液性免疫の
防衛反応は禁止せずにむしろ増進させる薬剤を提
供することにある。 本発明による医薬の活性成分は人のイムノグロ
ブリンＧのFcフラグメント又はその類縁物によ
つて形成される。 〔問題点を解決するための手段〕 周知のように、イムノグロブリン（Igと略記さ
れる）は、いろいろの規準に従つて複数のクラス
（IgG、IgM、IgA、IgD及びIgE）に分類されて
いる蛋白質である。 血清の主要なイムノグロブリンであるIgGは、
他のイムノグロブリンと同様に、多鎖構造をも
ち、いろいろの脱離反応（特に酵素化学的脱離反
応）によつて、この蛋白質のいろいろのフラグメ
ントが単離されている。 即ち、IgG分子は、パパイン又はプラスミンで
加水分解した場合、３つのフラグメント即ち抗体
の場所を各々有する２つのフラグメント（Fabフ
ラグメントと呼ばれる）と、抗体の場所は有しな
いがいろいろのエフエクター機能を有する１つの
フラグメント（Fcフラグメントと呼ばれる）と
を生ずる。 パパイン、プラスミンなどによる酵素化学的脱
離によつてFcフラグメント又は類縁のフラグメ
ントを取得する方法は周知であり例えばR.R.
PORTER，Biochem.J.73，p119（1959）に記載
されている。 本明細書において特に反応の表示がなければ
Fcフラグメントとは人のIgGのフラグメントFc
を表すものとする。 Fcフラグメントの薬理学的特性と、種々の免
疫防衛機構においてのその種々の役割とについて
は現在までの多くのことが未だ解明されていな
い。動物モデルについての研究は、他の種におい
ての活性について結論を導出させえない。それは
周知のようにイムノグロブリン特にIgGが種によ
つて相違することと、イムノグロブリンが異なる
種の免疫応答に異なつた作用を示すこととのため
である。 種々のイムノグロブリンのFcフラグメントが
ラツト及び人のリンパ球の多クローン活性及び増
殖応答に対し刺激作用を抗原の存在又は不在にお
いて示すことは多くの文献に記載されている。そ
の反対に、マウスのリンパ球に対して山羊のイム
ノグロブリンのFcフラグメントは、ごくわずか
な細胞分裂効果を示すにすぎないし、ウサギ又は
ガチヨウのイムノグロブリンのFcフラグメント
は、用量と無関係に、いかなる刺激作用も示さな
い（例えばM.A.BERMAN et al，The Journal
of Experimental Medicine，146pp.241−256
（1977）及びThe Journal of Immunology，
122，89−96（1979）参照）。 人のミエロームのFcフラグメントが混合リン
パ球反応においてマウスのリンパ球の増殖の促進
ないしは増大を誘発することも知られている（例
えばE.L.MORGANほか、J.Exp.Med.153，pp
1161−1172（1981）参照）。 人のIgG及びFcフラグメントが〔IgGインタク
ト（即ちIgGそのもの）と同様に〕抗体依存細胞
性細胞毒禁止効果をもつことも知られている（例
えばWislφff et al，Scand.J.of Immunol.，３，
pp29−38（1974）参照）。 或る種の免疫反応に関与する人のNK（ナチユ
ラル・キラー）細胞はIgGのFcフラグメントの受
容体（レセプター）をもつが、NK細胞の細胞毒
活性はこの受容体と調和しない、ということも知
られている（M.E.Neville，Journal of
Immunol.，125，p.2604（1980）参照）。 免疫防衛機構の複雑さと免疫調節現象の多様性
とに留意して、免疫変更薬剤のような活性物質の
使用は、免疫学の分野の実際の知識に基づいて、
体液性及び細胞性のいろいろの免疫反応、特に細
胞毒性細胞及び抑制細胞の活性化及び禁止に対す
る活性物質の活性全体を突きとめた後にしか試み
えないことを知るべきである。この突きとめは同
種のモデルについて行なうべきであり、さもない
と前述した理由により医薬としての最低の活性も
実用化できなくなる。 同種のモデルに対する人のIgGのFcフラグメン
トの性質の研究により、このフラグメントを免疫
変更薬剤として利用し、特に自己免疫疾患を処置
したり、臓器移植の際の拒絶反応を防ぎ、または
その効果を低減させることを可能とする有用な薬
理学的性質が見出された。 リンパ球の増殖応答を刺激する人のIgGのFcフ
ラグメントは１次同種反応（reaction
proliferative primaire）に対しては作用しない。
その反対に、Fabフラグメント及びIgGインタク
トは１次同種反応に禁止作用を示し、増殖応答に
は作用しない。 人のIgGのFcフラグメントは、Fabフラグメン
ト及びIgGインタクトと同様に、抗原の存在下
に、リンパ球応答に刺激作用も禁止作用も示さな
い。 人のIgGのFcフラグメントは１次混合リンパ球
反応（CML）において細胞毒性細胞の発生現
象を禁止せず、また誘発もしない。しかしFcフ
ラグメントが、IgGインタクト及びFabフラグメ
ントと同様に、２次混合リンパ球反応（CML）
において細胞毒の禁止活性をもつことが見出され
ている。 この最後に述べた性質が見出されたことによ
り、抑制細胞の刺激ないしは増殖に対してFcフ
ラグメントが有しうる影響を研究することになつ
た。以下にこの明細書の実験部分に示される研究
は、人のIgGのFcフラグメントが、抑制リンパ球
の発達を促進する活性並びに予備抑制細胞の刺激
を助長する活性をもつことを示している。 最後に、細胞分裂型反応においての全イムノグ
ロブリンの産生に対するFcフラグメントの影響
の研究により、全イムノグロブリンの産生は増大
し、Fabは不活性であり、IgGインタクトは、逆
に、全イムノグロブリンの産生の禁止をもたらす
ことが示された（A.Durandy et al，J.Clin.
Invest.，67，pp867−877、1981年３月）。 なお、抗体依存細胞毒活性（ADCC）の禁止と
抑制細胞の分化とについて、検討中の物質の用量
に比例した効果が認められている。これはFcフ
ラグメントがＴリンパ球小個体群の或るものに直
接作用することを考えさせる。 従つて、人のIgGのFcフラグメントのこれらの
特性は体液性免疫を助長しつつ細胞性免疫を禁止
し、従つて臓器移植を受ける疾患、免疫機能障害
を伴う疾患並びに特に自己免疫疾患の処置に有利
に使用しうる免疫調節薬剤として、該フラグメン
トを用いることを可能にする。 本発明による薬剤は、その有効成分が、IgGイ
ンタクトのFcフラグメント及び／又はFabフラグ
メントにより形成され、これらを（Fc＋Fab＋
IgG）全重量に対し２重量％より、特に１重量％
より、多くは含まないこととを特徴とする。 なお、本明細書において「人のIgGのFcフラグ
メントの類縁物」とはFcフラグメント全体、又
はFcフラグメント上に存在するペプチド連鎖を
含む合成もしくは半合成ペプチド全体もしくはこ
れらのフラグメントであり、ただしこれらのフラ
グメント又はペプチドは次の諸条件、、即ち (イ) 抑制細胞の分化の活性化特性をもつこと、 (ロ) 抗体依存細胞毒の禁止特性をもつこと、並び
に (ハ) NK細胞の活性化特性をもたないこと を満たすものとする。 本発明による薬剤はこれを経口的にまたは静脈
内に又は筋肉内に投与することができる。本発明
による薬剤はそのためにカプセル、ゼラチン袋、
糖衣錠、注射液又は注射用凍結乾燥粉末の形態と
されてよい。 経口投与の場合、胃の障害を通過しうるように
耐酸性の錠皮に包んだ薬剤形式とする。 臓器移植の場合、本発明による医薬の投与は移
植の前後に医療により使用される免疫低減技術に
従つて種々の形態で行なわれることができる。 本発明による医薬は、移植の免疫低減を惹起さ
せるために、臓器移植前に、又はその後に、他の
免疫抑制医薬に続いて、又はそれと共に投与され
てよいが、本発明による医薬の免疫変更効果は一
般に６〜10日後にしか生じないことに配慮すべき
である。 用量は特に投与形態と処置相とに依存し、一般
に成人の場合に有効成分は１日１mg〜10gの範囲
にある。例えば静注の場合Fcフラグメントの用
量は成人１日当り1g〜10gである。 本発明は、特に自己免疫疾患を処置し、臓器移
植を受けたか又は受けるべき疾患において拒絶反
応を抑制するか又はその効果を少くすることので
きる免疫変更医薬を製造するために、人のIgGの
フラグメントFc又はその類縁物を使用すること
をも対象とする。この使用は特に通常の方法に従
つて医薬としての適切な形態とすることに関係し
ている。 本発明による医薬はもちろん他の免疫低減剤又
はコルチコイドと併用して差支えない。 以下の例はもちろん本発明を限定するものでは
ない。 本明細書に使用する略記法の意味は次の通りで
ある。 ADCC…抗体依存性細胞性細胞毒。 BAS…ウシの血清アルブミン。 CML…リンパ球性細胞毒（Cytotoxicite′
me′diation Iymphocytaire）。 Ｆ（ab′）²…ペプシンでIgGを脱離して得たフラグ
メント。 GRP…ヒナ鳥の赤血球。 Haplotype DR…HLA系の“Ｄ−関連”決定要
因。 HLA Dr，HLA Ａ，Ｂ，HLA Ｄ…人の白血球
の組織適合系の抗体決定要因。 Ig…イムノグロブリン。 MLR…混合リンパ球反応。 PBS…リン酸塩緩衝液。 PHA−Ｍ…植物性血球凝集素。 PWM…poke weed mitogen（ヤマゴボウの細胞
分裂誘発因子。 SVF…ウシ胎児血清。 SrAB…AB血清。 以下の実施例においてFcとFabのフラグメント
の分離は（硫酸アンモニウムによる）塩析、次い
でコラムによる分子フルイ（ゲル濾過）とによつ
て遂行された。 実施例 １ 人のイムノグロブリンのFcフラグメントの薬
理学的性質の研究。 …リンパ球増殖の研究 IgGのFc及びFabフラグメント及びIgGのリン
パ球増殖活性の研究。 原材料及び方法 １ 種々のリンパ球個体群の調製 ａ リンパ球の取得 Bo¨yum A.（Scand.J.Clin.Lab.Invest.Suppl.97，
1968，21，pl）の技術に従つて、フイコール−ラ
ジオセレクタンの勾配（ｄ：1077）で、60人の自
発的な血液供給者の末梢静脈のリンパ球を採取し
た。 ｂ マクロフアージ富化リンパ球個体群の取得 前記のようにして得たリンラ球個体群からウル
マー及びフラツドの方法（J.Immunol.Methods，
1979，30 p.1）に従つて、ペルコールの勾配
（ｄ：1064）で、単核白血球を分離した。 ｃ 粘着細胞のなくなつたリンパ球の取得 前項(a)に従つて取得したリンパ球個体群を（フ
アルコン型）のフラスコ内で１時間37℃で培養し
た。非粘着細胞は回収した。 これらの３形式（ａ，ｂ，ｃ）の細胞個体群を
−260℃で保存し、試験の際にばらばらにした。 ｄ ペルオキシダーゼ反応 各個体について１塗抹標本当り全400細胞の数
で、SATO（traite´ de biologie applique´e，
1964，vol.3，p95）によつて組合されたペルオキ
シダーゼ反応に従つて、各々のリンパ球個体群内
の単核白血球の百分比を定めた。 ２ Fc−Fab及びIgGフラグメント プラスミンで処置した人の血漿IgGを出発物質
として、既知の方法に従つて、いろいろのサブフ
ラグメントを作製した。IgG（PRG）はr¹型（30
％）とr²型（70％）とである。FabはFc4.1％で
汚染されているがFcは純粋である。 ３ 培 養 ａ 脱補体自己類縁血清（se´rum autologue
de´comple´mente´）20％を加えたRPMIで、丸
底のマイクロプレート（微小板）上（板１枚当
り96カツプ）で、リンパ球の変性試験を行なつ
た。 各々のカツプに、RPMIで希釈したFc，
Fab，IgG又はPWM（Gibco）50μと自己類縁
血清RPMI（20％）150μmlとの下に、細胞
200000個を分散させた。各フラグメントの各々
の希釈物を３組作成して試験した。 ｂ 培養。空気95％についてCO₂５％の雰囲気中
において、水分を飽和させた37℃の培養器内で
微小板を６日間培養した。 ｃ トリチウム処理されたチミジンによる標識。
トリチウム処理されたチミジン１マイクロキユ
リーを144時間目に各々のピツトに加えた。＋４
℃に冷却することにより、16〜18時間後に、合
併を中止した。 ｄ ベータ計数器により、シンチレーシヨン溶液
の助けを借りて、スカトロン上に沈殿させて回
収した細胞を計数した。 結 果 試験した60個の個体のうち43.4％は高応答（≧
10000cpm）、18.3％は低応答（＜10000cpm）、
38.3％は無応答（2000cpm）であつた。 高応答又は低応答の基準は、フラグメントFc
（表）の場合、細胞培養についての増殖応答に
従つて設定された。 正のペルオキシダーゼ細胞の百分比は３つの群
について32％であり、粘着細胞のなくなつたリン
パ球個体率の場合は、１〜２％であつた。 Fc、Fab及びIgGのフラグメントについては、
１培地当り6.12μg及び24μgにおいて試験した。50
及び100μgの場合には先行する群（Ｄ−Ｎ−Ｓ）
について目立つた差異を与えない。 結果は表１に示す通りである。 結 論 Fab又は全IgGに比べてリンパ球増殖応答にお
いてフラグメントFcが刺激作用を示すことと、
この活性にとつて必要なマクロフアージの存在す
ることとがこの試験により明らかになつた。この
結果は、最大増殖応答が１培地当り10μg、５日
間であるマウスのリンパ球についてウエイグル
（Weigle）の研究に近いものである。同様に、粘
着細胞がなくなることは、マウスのリンパ球の増
殖応答の不在を惹起させる（J.Exp.Med.1979，
150，p.256）。 同種リンパ球増殖の研究 １次同種増殖応答においてのIgGのFc及びFab
フラグメント並びにIgGインタクトの助長又は禁
止活性の研究。 原材料及び方法 種々のフラグメントの取得と単核白血球及びリ
ンパ球の分離技術については以上に説明した。 Ｔリンパ球の取得 M.ユリウスほかの方法（Eur.J.Immunol.1973，
３，p.645）に従つて、ナイロンウールのカラム
上でＴリンパ球の分離を行なつた。10mlの注射器
（シリンジ）中において、ナイロンウール0.6gと
共に、37℃で30分間リンパ球４×10⁷個を培養し
た。 非粘着細胞を回収した。ペルオキシダーゼ及び
ロセツトＥの発色の制御を、リンパ球富化を確め
るために行なつた。 これらの細胞を混合培地の応答細胞として利用
した。 種々のIgフラグメントの存在下においてのリン
パ球の培地の上清の回収（vol.128，p.590） 単核白血球富化（１×10⁶／ml）されたリンパ
球をトーマン・マリリンの方法（J.Immunol.，
1982）に従つて、Fc、Fab又はIg 60μgと共に
RPMI 1640−20％ SrAB媒質中で24時間37℃で
培養した。24時間後に上清を遠心分離によつて回
収した。 リンパ球の混合培養 応答細胞（非粘着細胞）を計数し、１×10⁶／
mlの濃度に調節した。刺激細胞（全リンパ球又は
単核白血球富化リンパ球の全個体）を１ml及び細
胞数１×10⁶個当りマイトマイシンＣ 25μgで
（（BACH，Science，1966，vol.153，p545の方法
により）30分間37℃で処理した。 処理後に細胞をRPMI 10％ SrABで２回洗浄
した。細胞の懸濁体を１×10⁶／ml、12×10⁴／
ml、６×10⁴／ml及び３×10⁴／mlの異なつた濃度
に調節した。 ハミルトン注射器を用いて、円錐底の微小板内
で、応答細胞0.05ml、刺激細胞0.05ml、RPMI
0.05ml、20％ SrABの割合で刺激細胞及び応答
細胞を分布させた。 37℃−５％CO₂の培養室で５日間微小板を用い
て培養した。96時間目に１カツプ当り2μCuのト
リチウム処理されたチミジンを18時間かけて加え
た。スカトロン型マイクロ沈殿器を用いてフロー
濾過器上で沈殿させることにより培養物を回収し
た。各々の濾過器を乾燥後にプラスチツク管に入
れた。シンチレーシヨン溶液３mlを各管に加えた
後、液体シンチレーシヨンカウンターで計数を行
なつた。結果を１分間打点数（cpm）で表わす。 結 果 いろいろの濃度のMLRとFc、Fab及びIg いろいろの濃度のいろいろのフラグメントFc、
Fab及びIgをMLRに添加した。 いろいろの濃度（12、25、50及び100μg／培
地）のフラグメントFcは、RPMに比べて、
MLRの助長作用又は禁止作用を示さなかつた。 その反対に、100μg／培地の濃度のFabフラグ
メントはMLRの禁止を示した。50及び100μg
の濃度のIgGはMLRの禁止を起した。 刺激細胞の濃度をいろいろに変えたMLRに対
するFc、Fab及びIgGの作用 この方法は増殖応答の準最適条件において種々
のフラグメントの作用を発現させるために行なわ
れた。MLRに比べて顕著な差異はみられなか
つた。50μgの濃度までのIgGのみはMLRの禁
止を与えた。 単核白血球富化刺激細胞の使用下のMLRに対
するFc、Fab及びIgGの作用 フラグメントFcの誘発によるＴリンパ球の活
性化が、マクロフアージを介して行なわれるた
め、準最適培養条件を保つて、最も好都合の培養
条件にあるように努めて培養を行なつた。試験さ
れたいかなる用量においても、補助ないし助長効
果は認められなかつた。禁止効果は１培養物当り
24μgのIgGについて認められた。 Fc、Fab又はIgを用いて培養した細胞の上清及
びMLR 増殖応答は刺激細胞と応答細胞との間の接触後
何時間かして開始され、マイクロフアージに対す
るサブフラグメントFcの産生は最初の24時間内
に行なわれるので、種々のフラグメントと共に24
時間37℃で培養した単核白血球富化リンパ球由来
上清をMLRに添加した。 これらの上清は応答細胞の自己類縁性細胞から
調製され、最適及び準最適の増殖条件の下に
MLR内において試験された。 Fc、Fabフラグメント又はIgについて、いかな
る禁止効果も助長効果も認められなかつた。 結 論 １次同種リンパ球反応において、細胞５×10⁴
個当り６、12、24、50及び100μgの濃度で、人の
リンパ球に対して、フラグメントFcではいかな
る顕著な助長又は禁止活性も認められなかつた。
使用した用量の選定は、Ｔリンパ球に対するフラ
グメントFcの増殖作用が発現された時に定めら
れた（前掲プロトコール）。 その反対に、全イムノグロブリンとフラグメン
トFabとは、試験された全部のモデルにおいて、
１次同種応答の抑制を与える。 細胞毒性リンパ球に対する活性の研究
（CML及びCML） 細胞毒性のいろいろの形式に対するFc、Fab各
フラグメント及びIgGの活性の研究。 原材料及び方法 ボランテイアの供与者の末梢血管リンパ球の分
離及び種々のフラグメントの取得については前述
した通りである。 Fc、Fab及びIgG プラスミンで消化されたガンマ胎盤 IgGサブクラス：IgG １＝57％ IgG ２＝39％ IgG ３＝0.2％ IgG ４＝3.7％ 抗体依存性細胞性細胞毒（ADCC） 使用される方法はF.WISLφFF，T.E.
MICHAELSON，S.S.ERφLAND，Scand.J.
Immunol.，３，pp29−38，1974）に記載されて
いる。 標的細胞は、ウサギの抗−GRPのIgGで感作さ
れクロム51で標識されたGRPである。 試験ADCC エフエクター細胞（末梢血管のリンパ球）は計
数され、５×10⁶／ml RPM10％ SVFの濃度
に調節された。 ハミルトン注射器を用いて３組の異なる濃度の
被検生成物50μエフエクター細胞100μを丸底
微小板内に分布させた。 20分間37℃で培養した後、感作され標識された
GRP50μを分布させ、１標的細胞に対するエフ
エクター細胞50個の最終比（50：１）とした。 自然塩析（largage spontane′）は、RPM
10％SVFの媒質の使用下にGRPを培養してこれ
を定め、最大塩析は、1N塩酸をGRPに添加して
これを定めた。抗血清活性の参照として、正常な
ウサギの血清で予め培養したGRPと向い合いに
エフエクター細胞をおいた。 湿めつた雰囲気中で５％CO₂下に18時間37℃で
培養した後、微小板を800rpmで10分間遠心分離
にかけ、バツフアフイルター（Flow，ref.78−21
−005）上に上清を回収した。 細胞毒性「ナチユラル・キラー」（NK） 使用された方法はB.M.VOSE，F.WANKY，
S.ARGOV及びE.KLEIN、Eur.J.Immunol.，
1977，７，pp753−757に記載されている。 標的細胞は、クロム51で標識された細胞K562
（人のリニエ・ミエロイド〔骨髄菌株〕）である。 NK試験 エフエクター細胞（末梢血管のリンパ球）を５
×10⁶／ml、2.5×10⁶／ml、1.2×10⁶／ml及び６×
10⁵／mlの濃度に調節した。 これらの分布及び処理はADCCの場合と同じ方
法に従つて行なわれた。標的細胞を50μ中に分
散させ、１標的細胞に対するエフエクター細胞数
50の最終比とした（50：１、25：１、12：１及び
６：１）。自然塩析と最大塩析並びに上清の回収
はADCC試験の場合と同一の条件下に行なわれ
た。 １次リンパ球性細胞毒（CML）及び２次リ
ンパ球性細胞毒（CML） この研究はLIGHTBODY et al，Gen.Bact.
Virol.Immunol.，1971，vol.64，p243に従つて行
なわれる。 エフエクター細胞 同質感作相は、前述したものと同様の混合培養
に対応する（前記（）参照）。 ２つの試験において感作は、応答細胞と刺激細
胞とのHLA Ａ、HLA Ｂの間の差を勘案して、
単一Haplotype Drに対して行なわれた。 標的細胞 ２つの試験において、それぞれのMLRの感作
に用いた刺激細胞を標的細胞として使用した。
PHA−Ｍ（Gibco）により72時間感作されたこれ
らの細胞は、10・10⁶個の細胞について200μの
割合で、試験の前に18時間クロム51で標識され
た。 連続洗浄後に細胞をブルートリパン（bleu
trypan）を用いて計数し、200・10³／mlに調節す
る。次にCML試験を丸底微小板内において行な
う。前述したように処理した100μ中エフエク
ター細胞を、湿めつた雰囲気内で、５％CO₂の下
に37℃で４時間標的細胞50μと共に培養し、
CMLの場合には50：１、CMLの場合には
50：１、25：１、12：１及び６：１の比とする。
自然塩析、最大塩析及び上清の回収を前記の条件
の下に行なう。４つの細胞毒性試験において、ク
ロム51の塩析を２分間ガンマ計数器により測定し
た。測定結果は次式 Cr51の塩析％＝（（cpm塩析試験）−（cpm自然塩析）／
（cpm最大塩析）−（cpm自然塩析））×100 に従つて、細胞毒の百分比として表わした。 10％より高い細胞毒性はこれを全て正値とし
た。 結 果 抗体生存細胞毒 抗体依存細胞毒のFcフラグメント及びIgにお
いての禁止は全部の被検個体について認められ
た。この禁止はFcフラグメント又はIgGの濃度に
比例して増大する（表２）。 キラー活性の禁止は、Fcフラグメントの場合、
IgGに比べて常に強く現出される。即ちFc6μgは
Ig50μgと同等の禁止を示す。 その反対にFabフラグメントについては、用量
を非常に高くしても、いかなる抑制効果も発現さ
れない。 「ナチユラル・キラー」活性 Fc−Fabフラグメント又はIgにおいては、用量
を非常に高くしてもNK活性の抑制は全く認めら
れなかつた。この結果を確かめるために２つの極
限用量（6μgと100μg）を用いて、エフエクター
細胞−標的細胞の異なつた比においてNK活性を
試験した。どんな用量及び比においてもいかなる
顕著な差異を認められなかつた。（表３）。 １次及び２次細胞性細胞毒 CMLは、いろいろの用量において試験され
たIgG及びFc、Fabフラグメントの作用により変
更されなかつた。 その反対にCMLは25、50、100μgの用量で
Fc及びFabの各フラグメントによつて禁止され
た。IgGは使用した全部の用量において顕著な禁
止を示した（表４）。 １次同質応答の抑制細胞及び予備抑制細胞の
活性に対する人のIg及びFc−Fabフラグメント
の作用の研究 目 的 予備抑制細胞の分化における同質増殖応答の抑
制Ｔ細胞に対するFc、Fabフラグメント及びIgの
活性の研究 原材料及び方法 自発的な供与者の末梢血管のリンパ球の分離法
及びいろいろのフラグメントの取得については前
述した通りである。 プラミスンで消化されたガムマ胎盤：AGA44
ゲル濾過において利用されたフラグメントの純
度：Fc：100％、Fab：94.6％（5.4％7S）、Ig
（PRG）7S：95.4％ 10S：2.8％ 10S：1.8％、
IgG1：57％、IgG2：39％、IgG3：0.2％、
IgG4：3.7％。 従来の、または変更された血清学的方法及びリ
ンパ毒性によつて、HLA−Dr複合体の主な決定
因について、血液の自発供与者を研究した（Ｂ細
胞富化リンパ球懸濁体）。 同種感作M.J.SHEENY，F.H.BACH，Tissue
Antigens，1976、８、pp157−171 試験管内の同種感作のために、刺激剤として用
いられたAgHLA−Dr（25μg／10⁶細胞／ml）に対
して不調和のマイトマイシン処置同種細胞10・
10¹⁶個と、応答体として用いたリンパ球10・10¹⁶
個とを共存させる。10日間５％CO₂の存在下に37
℃で加湿培養室内で血清ABプール10％を添加し
たRPMF1640の媒質20mlと共に、フアルコンび
ん（CA3013）内において培養を行なう。 抑制試験（J.DAUSSET，Nature，1978、267
pp.502） ３つの細胞個体群、即ち応答リンパ球、マイト
マイシン処置刺激細胞及びマイトマイシン処置同
種感作化細胞（これらの細胞は応答細胞に対し自
己類縁性である）を存在させて、MLR内にお
いて、同種感作化リンパ球の抑制活性を試験管内
で評価する。 液体シンチレーシヨンカウンターを用いて計数
を行なう。 抑制率は次式によつて評価する。 抑制率（％） ＝（１−実験平均値（CPM）／対照平均値（CPM）） ×100 予備抑制細胞及び抑制細胞に対する種々のフラ
グメントの活性の研究 予備抑制細胞の刺激作用を証明するために２つ
の異なるモデルについて試験を行なつた。 第１のモデルは、別々のFc、Fabフラグメント
又はIgGについて末梢血液の全リンパ球を１時間
予備培養することである。これらの細胞を数回洗
浄した後にマイトマイシン処置し、第３の細胞と
して前記条件の下にMLR中においた。参照群
はRPMで予備培養したものであつた。 第２のプロトコールにより、抑制細胞の発達に
対し時に助長作用が見られることが実証された。
同種感作期において、０日（試験当初）に、いろ
いろの用量でFc、Fabフラグメント及びIgGを添
加した。10日間の感作後にこれらの細胞を前記の
条件の下にMLRに第３細胞として添加する。 最後に、抑制細胞に対するこれらのフラグメン
トの活性を記述するために、３種類の細胞に対す
る試験にFc、Fab、Igをいろいろの用量で添加し
た。 結 果（表５） １ 第３の細胞として添加された感作されない細
胞の予備培養中のFc、Fabフラグメント及びIg
の活性 抑制試験の際に洗浄及びマイトマイシン処置前
に、いろいろの用量のFc、Fabフラグメント又は
Igを感作細胞と共に１時間培養した。 Fcフラグメントと共に予め培養した細胞は、
使用したFcの用量に比例したMLRの禁止の増
大を与える。この増大は15μg／ml及び30μg／ml
の用量について顕著である。15μgの用量で1gの
存在下に予備培養した細胞についてはMLRの顕
著な禁止が見られる。 その反対に、Fabフラグメントと共に予備培養
した細胞は同種応答の顕著な禁止を示さない。 ２ 同種感作中のFc、Fab、IgGの活性 同種感作の第０日に、異なつた用量のFc、Fab
フラグメント及びIgGインタクトを添加した。 フラグメントFcの存在下に感作した抑制細胞
は、１培地当り1.5μgにおいても、100μgにおいて
も、対照細胞に比べて非常に顕著なMLR禁止
活性を示す。他方では、Igインタクトと共に培養
した細胞は、3μgよりも高い用量において、
MLRの禁止の顕著な増大を示す。その反対に
フラグメントFabの存在下に感作した細胞はいか
なる顕著な差異も示さない。 抑制比が非常に高くなつた場合には、それによ
り増大の評価が困難になる。補助的な実験を行な
つた。応答細胞／抑制細胞比が１：１、２：１、
４：１になるように、異なる濃度で、同種感作さ
れマイトマイシン処理された細胞を添加した。こ
の場合に、Fcフラグメントの存在下に感作され
た細胞に対する８：１の希釈において抑制活性の
顕著な増大が見られる。 ３ 同種応答の抑制試験においてのFc、Fabフ
ラグメント及びIgの活性 試験に際して３種類の細胞のMLRに異なる
用量のフラグメントFc、Fab及びIgを導入した。
助長活性も禁止活性も認められなかつた。 結 論 ２次応答の間に発達した抑制細胞の存在の最初
の表示は、同一の同種抗原に対し２回感作された
細胞が、１回感作の場合よりも少い増殖応答を与
えることの観察に由来し、活性過程の証明は照射
同種感作細胞を従来の１次MLRに添加すること
によつてもたらされた。 抑制細胞は、刺激細胞により供与されたHLA
−Dr抗原に対し特異性を示す。10日間の培養の
後に、同種感作細胞の95％がロセツトＥを形成
し、３％以下が表面IgGを有し、２％以下が単核
白血球を有するので、抑制細胞はＴリンパ球とし
て現出される。試験管内の同種過多免疫（hyper
immunization allogenique）により惹起される
抑制機構は、腎臓移植前に行なわれる多量輸液過
程に非常に近いように思われ、これはOpelz et
Teroski（Trans plantation，1980、29、p153）
に示されるように、移植腎臓の生存率を改善させ
る。 以上に述べた実験の目的は抑制細胞に対する直
接活性と予備抑制リンパ球の発達においてのFc、
Fabフラグメント及びIgGの活性とを証明するこ
とにあつた。 フラグメントFc，Fab，IgGからの全イムノ
グロブリンの産生の研究 目 的 Fc，Fab，IgGによる刺激によるイムノ
グロブリンの産生の証明 原材料及び方法 １ いろいろのリンパ球個体群の作製 自発的供与者の末梢血液のリンパ球分離方法
及びいろいろの小個体群の取得、例えばいろい
ろのフラグメントの取得。上記参照。プラスミ
ンで消化されたガンマ胎盤：（純度及び特性に
ついては上記参照）。 ２ 抗血清のヨード125による標識 山羊のＦ（ab′）２からの人の抗全Ig（カツペ
ル・ラボラトリーズ）をヨード125 S4で標識
する。 次に、過剰なヨードと標識Ｆ（ab′）２との混
合物をSephadexG50カラムの中に入れる。リ
ン酸塩緩衝液0.5M PH7.5の標識の結果によれ
ば、第１のピークはＦ（ab′）２（分子量50000）
に対応し、第２のピークは８〜10mlの容積に対
応する。プロテイン支持としてガムマグロブリ
ンのない馬の血清１％（最終）を添加する。 標識効率を次式により計算する。 CpmピークＦ（ab′）２／CpmピークＦ（ab′）２＋CpmI
₁₂₅過剰×100 比活性を次式により計算する。 Cpm／ngF（ab′）２標識 ngF（ab′）２標識＝1000×
容積供試μ×Ｆ（ab′）２量（μg）／容積最終Ｆ（a
b′）２標識（μ） ３ 人のIgGの滴定：RIA試験 互換性カツプに人の抗Ig山羊Ｆ（ab′）２を＋４
℃で一夜中吸収させた後に１時間37℃でPBS＋
５％BSAをこれらのカツプに吸入し飽和させる。 Ａ 被検体の培養 標準ガムマグロブリンの希釈： 濃度60μg／mlの胎盤ガムマグロブリンを用い
た。PSB，0.5％BSA及び0.05Tween20でこの溶
液の1/2，1/2を続けて10回希釈する。 被検物の希釈： 60μg／mlの割合で、Fc，Fab，Ig又はRPMIの
存在下に、10％SVFプラスRPMI1・10⁶／mlと共
に、末梢血液の細胞、非粘着細胞及びマクロフア
ージ富化細胞を６日間培養し、遠心分離後に上清
を集収する。 次にこれらを1/5，1/25，1/125としてPSB、
0.5％BSA及び0.05％Tween20中において使用す
る。 生成物の各々の希釈の分配は、３コピーで１カ
ツプ当り100μの割合とする。 これらを２時間37℃で培養し、何回か洗浄す
る。 Ｂ 抗原接触−山羊のＦ（ab′）２、人の抗Ig、標
識、ヨード125 各々のカツプに標識希釈Ｆ（ab′）２（100μ）
を分配する。２時間37℃で培養した後に
PBSTweenで何回か洗浄する。これに続いて各
カツプを完全に吸引する。ガムマカウンターで計
数する。 Ｃ 上清中のIg量の決定 cpm真＝cpm（Fc^*＋リンパ＋RPMI血清）−
cpm（Fc＋RPMI血清） ＊Fc，Fab又はIg 次に標準の関数として曲線の回帰
（re′gression）の研究によりこれらのcpmを分析
する。 結果及び結論（表６） Fcフラグメントの存在下のいろいろのリンパ
球小個体群からの全イムノグロブリンの産生は
Fabフラグメントを用いる場合よりも相当に大き
くなることが示されている。 その反対に、IgGは、IgGの自然産生の場合に
比べて、全IgGの産生を刺激するというよりもむ
しろ禁止するようである。 RIA技術にイムノグロブリン及びサブフラグメ
ントを導入することは、比較可能な結果を得るた
めに細胞なしに５日間上清について平行チエツク
を行なう必要をもたらす。 この方法は、Fcで刺激されたリンパ球からIgG
が試験管内で産生されることを証明する助けにな
る。 実施例２：医薬組成物の製造 ONCLEY J.L.及びcoll.J.Am.Chem.Soc.，
1949、71、p541の技術に従つて精製され、
PLAN R.及びMAKULA M.F.，Vox
Sanguinis，1975、Vol.28、pp157−175の技術に
従つて人の血漿で処理した人のIgGからフラグメ
ントFcを作製する。これらのIgGは、胎盤から抽
出又は静脈から採取した血液に由来する。Fc
apyrogｅneフラグメント溶液を無菌に濾過し、
１つのフラスコについて活性成分ないし有効成分
2.5gの割合に分散させ、凍結乾燥する。 使用時には溶液を注射可能な調製物のために用
いる水で再構成する。 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ その有効成分が人のIgGのFcフラグメント又
   はこのフラグメントの類縁物により形成され、該
   有効成分がIgGインタクト及び／又はFabフラグ
   メントを含まないか、或いは、（Fc＋Fab＋IgG）
   全重量に対し２重量％より多くは含まないことを
   特徴とすると共に、人のIgGのFcフラグメントの
   該類縁物はFcフラグメント全体、又はFcフラグ
   メント上に存在するペプチド連鎖を含む合成もし
   くは半合成ペプチド全体もしくはこれらのフラグ
   メントであり、ただしこれらのフラグメント又は
   ペプチドは次の諸条件、即ち、 (イ) 抑制細胞の分化の活性化特性をもつこと、 (ロ) 抗体依存細胞毒の禁止特性をもつこと、並び
   に (ハ) NK細胞の活性化特性をもたないこと の各条件を満たすことを特徴とする免疫調整医
   薬。 ２ Fabフラグメント及び／又はIgGインタクト
   を１重量％よりも多くなく含有することを特徴と
   する特許請求の範囲第１項記載の免疫調整医薬。 ３ Fabフラグメント及び／又はIgGインタクト
   を含まないことを特徴とする特許請求の範囲第１
   項記載の免疫調整医薬。 ４ 有効成分がFcフラグメントにより形成され
   たことを特徴とする特許請求の範囲第１〜３項の
   いずれか１項に記載の免疫調整医薬。