JPH01501388A - 標的細胞の死滅を目的とするエフエクター細胞の生体外活性化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 標的細胞の死滅を目的とするエフェクター細胞の生体外活性化反呪 （技術分野） 本発明は、細胞毒性法、及び特に、腫瘍のような標的細胞を、抗体依存、生体外 活性化エフェクター白血球により死滅させる方法に関するものである。

（発明の背景） 神経外胚葉腫瘍は非常に悪性であり、それには、神経芽細胞腫、肺の小細胞ガン 腫、ダリア細胞腫、神経芽細胞腫及びメラノーマが含まれる。神経外胚葉腫瘍の うち、神経芽細胞腫は、幼児及び児童初期に発生する。ウィルムス腫瘍は別にし て、それらは全んど共通して、児童におけるＤ膜後腔腫瘍である。神経芽細胞腫 は、一般に副腎髄質に発生するが、それらは、胸部又は腹部内の他の交感性神経 節にまで進展する。これらの腫瘍は、リンパ芽球、肝臓、骨、肺及び骨髄へと広 く転移する。その腫瘍は、明らかな転移がみられない場合は、しばしば良好とな るが、転移を伴うと、外科手術、Ｘ線治療及び化学療法試剤を十分はどこしても 、予後の回復は望みが薄い。

最近、いくつかの抗原決定基がモノクローナル抗体（Ｍａｂ）により、神経芽細 胞腫細胞上に検出された；シーガー（Ｓｅｅｇｅｒ）、アナルス・オン・インタ ーナシラナル・メディシン（Ａｎｎ、Ｉｎｔｅｒｎ。

Ｍｅｃｌ）　、９７巻、８７３頁（１９８２年）；ライクストランド（Ｗｉｋｓ ｔｒａｎｄ）等、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）　４２巻、 ２６７頁（１９８２年）；ライクストランド（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ）等、リサー チ）Ｌｔ＋オプ０ニューロイムノロジー（Ｊ、Ｎｅｗｒｏｆｓｕｎｏｌｏｇｙ） 　％３巻、４３頁、（１９８２年）、アイゼンバース（Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ） 等、プロシーディング・イン・ナシヨナル・アカデミ−・オン・サイエンス（Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、　７６巻、４９１３頁（１９ ７９年）；リアオ（Ｌｉａｏ）等、ヨーロピアン・ジャーナル・オン・イムノロ ジー（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）　１１巻、４５０頁（１９８１年）　： シーガー（Ｓｅｅｇｅｒ）等、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、 ）　４巻、２７１４頁（１９８１年）；ケネット（ｋｅｎｎｅｔｔ）等、アドバ ーンシズ・イン・ニューロプラスドーマ・リサーチ（Ａｄｖａｎｅｓ　ｉｎ　Ｎ ｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、２０９頁、レーベンプレス版 、ニューヨーク（エドバンス（Ｅｄｖａｎｓ）　＆ｔＷ）（１９８０年）；シー ガー（Ｓｅｅｇｅｒ）等、ジャーナル・オン・イムノロジー（Ｊ、Ｉｍ＋ｗｕｎ ｏ１．）　、１２８巻、９８３頁（１９８２年）；ケムスヘンド（Ｋｅｍｓｈｅ ａｄ）等、ペディアトール・リサーチ（Ｐｅｄｉａｔｒ、Ｒｅｓ、）　１５巻、 １２８２頁（１９８１年）、ガングリオシドＧＤ３及びＧＤ２は、神経芽細胞腫 細胞上に検出された、抗原決定基である。

従って、ガングリオシド（シアル酸含有糖脂’Ｊｔ）は、モノクローナル抗体（ Ｍａｂ）仲介の免疫治療に対する関連標的抗原である腫瘍マーカーとして、直ち に特徴づけられる（ディボルド（Ｄｉｐｐｏｌｄ）等、（１９８３年）キャンサ ー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、）４４巻、８０６頁〜８１０頁；ヒユーテ ン（Ｒｏｕｇｈ　ｔｅｎ）等、（１９８５年）、プロシーディング・イン・ナシ ョナル・アカデミ−・オン・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、）　Ｕ　Ｓ　Ａ、　８２巻、１２４２〜１２４６頁；ヘルストロム（Ｈｅｌ ｌｓｔｒｏｍ）等（１９８５年）プロシーディング・イン・ナショナル・アカデ ミ−・オン・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　Ｕ　Ｓ 　Ａ％　８２巻、１４９９〜１５０２頁；チェレンジｓ　（Ｃｈｅｒｅｓｈ）等 、（１９８５年）プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミ−・オプ・サ イエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　）　Ｕ　Ｓ　Ａ％　８２ 巻、５１５５〜５１５９頁；ホンシフ（Ｈｏｎｓｉｋ）等（１９８５年）、ナチ ュラル・イムニティー・アンド・バイオロジカル・レスポンス（Ｎａｔｕｒａｌ Ｉｍｍｕｎｔｔｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ）　４巻 、２５３頁；及びステプルウスキ（Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｉ）等（１９８５年）プ ロシーディング・イン・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエンス（Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　）　ＵＳＡ、　８２巻、８６５３〜８６５７頁）参照。

ジシアロガングリオシドＧＤ３は、選択的に、ヒトのメラノーマ細胞上に発現す る（ディボルド（Ｄｉｐｐｏｌｄ）等、（１９８０年）、プロシーディング・イ ン・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、）　Ｕ　Ｓ　Ａ、７７Ｓ、６１１４〜６１１８頁、チェレッジｚ　 （Ｃｈｅｒｅｓｈ）等、（１９８４年）、プロシーディング・イン・ナショナル ・アカデミ−・オン・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、） 　Ｕ　Ｓ　Ａ、　８１巻、５７６７〜５７７１頁）、そして、補体仲介腫瘍細胞 溶解及び抗体依存細胞性細胞毒性の両方に対し、イン・ビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒ ｏ）で有効な標的となる（ヘルストロム（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ）等、（１９８５ 年）、プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンス（ Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ、　８２巻、１４９９〜１５０２頁： チェレッシュ（Ｃｈｅｒｅｓｈ）等、（１９８５年）、プロシーディング・イン ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、）　Ｕ　Ｓ　Ａ％　８２巻、５１５５〜５１５９頁：ホンシ フ（Ｈｏｎｓｉｋ）等、（１９８５年）、ナチュラル・イムニテイー・アンド・ バイオロジカル・レスポンス（Ｎａｔｕｒａｌ＋Ｉｍｍ＋ｕｎｉｔｙ　ａｎｄＢ ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ）　４巻、２５３頁）、ＧＤ３に対する ＩｇＧ３クラスのモノクローナル抗体が異種ｍ織移植したヌードマウスの結節中 のヒトのメラノーマ腫瘍の樹立を効果的に抑制することが報告されている（ヘル ストロム（ｌ（ｅｌｌｓｔｒｏｍ）等、（１９８５年）、プロシーディング・イ ン・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、）　Ｕ　Ｓ　Ａ、　８２巻、１４９９〜１５０２頁：及びチェレソ シュ（Ｃｈｅｒｅｓｈ）等、（１９８５年）プロシーディング・イン・ナショナ ル・アカデミ−・オン・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｊ、 ）　Ｕ　Ｓ　Ａ　、、　８２巻、５１５５〜５１５９頁）。

抗−〇Ｄ３Ｍａｂで１武装″したネズミの単核肺臓細胞は、ヌードマウス中、非 常によく引立し、生育するヒトのメラノーマ腫瘍を根絶するこ六が、最近報告さ れた（ホンシフ（Ｈｏｎｓｉｋ）等（１９８５年）ナチュラル・イムニティ・ア ンド・バイオロジカル争レスポンス（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ａｎ ｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ）、４巻、２５３頁）、さらに、 ヒユーテン（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ）等は、（（１９８５年）、プロシーディング・ イン・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、）　Ｕ　Ｓ　Ａ、　８２巻、１２４２〜１２４６頁）は、ＧＤ３ に対するＭａｂＲ２４（Ｉ　ｇＧ３）（米国特許第４，５０７．３９１号で議論 されている）を用い、フェーズエの臨床試験において、その抗体で処置したメラ ノーマ患者１１人中、３人が、大部分の腫瘍抑制を示したことを観察した。また 、ディボルド（Ｄｔｐｐｏｌｄ）等の報告（キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅ ｒ　Ｒｅｓ、）、４４巻、８０６頁（１９８４年）、では、ＭａｂＲ２４は、そ の抗体に長時間さらしたく２４時間以上）後の、ＧＤ３含有ヒト・メラノーマ細 胞を、イン・ビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）で死滅させることができ、このことは、 まだ明らかになっていない、別の腫瘍細胞死滅化のメカニズムの存在を示唆して いることが報告されている。総合すると、これらの知見は、抗ＧＤ３Ｍａｂの潜 在的治療効果が、免疫治療的標的としてさらにガングリオシドを研究することを 正当化していることを示している。

ＧＤ２抗原が、数多くの腫瘍細胞系列と同様に、全んどの切り取ったメラノーマ 及び５ＣＣＬＩＩ瘍上に非常に多く発現しており、一方では、全んどの正常な組 織には、事実上存在しないという事実は、それがイン・ビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ） における特異的免疫治療及び腫瘍のイメージングに、良い標的抗原になりうろこ とを暗示している。

クラスエのヒトの組織適合性抗原上の１つのエピトープに対するＭａｂのアイソ タイプ・スイッチ変異体を用いたキップス（Ｋｉｐｐｓ）等（ジャーナル・オプ ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、）　１６１巻、１頁 （１９８５年））の最近の報告の中で、ＩｇＧ２ａアイソタイプ変異体は、対応 するＩｇＧ１又はＩ　ｇＧ２　ｂ変異体よりもＡＤＣＣを指向する上でより効果 的であることが示された。我々の研究室での最近の研究でも（シュルツ（Ｓｃｈ ｕｌｚ）等（１９８５年）、ジャーナル・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ 、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、）　１６１巻、１３１５〜１３２５頁）、特異的細胞溶解が 示された。ヒトのメラノーマ細胞上に選択的に発現するコンドロイチン・硫酸プ ロテオグリカンと免疫反応を起こすＭ　ａ　ｂ　９．２．２７、ＩｇＧ２ａモノ クローナル抗体を用いたこの研究は、ヌードマウス中で樹立し、増殖するヒトの メラノーマ腫瘍は、相対的に大量の単核肺臓細胞と共に、同時にこのＭａｂを注 入することにより、根絶することができることを示した。肺臓細胞又は、その抗 体いずれも単独では、有意な腫瘍の抑制を行なうことはできない。

パーク（Ｐａｒｋ）等（セルラー・イムノロジー（ＣｅｌｌｕｌａｒＩｓｓｕｎ ｏｌ、）　８４巻、９４頁（１９８４年））は、ＩｇＧ２ｂアイソタイプのモノ クローナル抗体は、ＡＤＣＣ仲介の溶解に対して、Ｋ５６２ヒトの赤白血病細胞 を感作することを報告した。その場合、そのＭａｂは、天然キラー（ＮＫ）細胞 中に豊富であることが知られている、大顆粒リンパ細胞により、標的細胞の死滅 を促進することが報告されている。

総合すると、これらの研究結果は、モノクローナル抗体ががんの免疫治療のため の有効な試薬であるばかりでなく、種々のＭａｂは、いくつかの別々な、又は、 それらを組合せたエフェクターメカニズムにより、腫瘍の死滅を誘導することが できることを示している。

いくつかの最近の報告では、マウスのモノクローナル抗体は、比較的よくヒトに 許容され、危険も少なく、副作用は、あったとしても、ごく僅かであることが示 されている（オールドハム（Ｏｌｄｈａｍ）等、ジャーナル・オン・クリニカル ・オンコロジー（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、０ｎｃｏ１．）　２巻、１２３５頁（１９８４ 年））、メラノーマ患者を処置するのに、先に議論した、マウスのＭａｂ９’、 ２．２７を用いた場合、その抗体は、有害な副作用がほとんどなく、腫瘍部位に 特異的に局在化することが上記の研究者により示されたが、大きい腫瘍をもつ、 第四期の患者においては、研究期間に渡って、その病気の臨床的に明らかな改善 をもたらすことはできキン−２（ＩＬ−２）に、単核リンパ細胞をさらし、リン フ才力イン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞を作る方法がある（イロン（Ｙｒｏｎ） 等（１９８０年）、ジャーナル・オン・イムノロジー（Ｊ、Ｉｓｍｕｎｏｌ、） 　１２５巻、２３８−２４５頁；ロッ゛ンｓ、　（Ｌｏｔｚｅ）等、（１９８１ 年）キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）、４１巻、４４２０〜４ ４２５頁ニゲリム（Ｇｒｉｓｔｓ）等（１９８２年）、ジャーナル・オン・エク スベリメンタル・メディシン（Ｊ、Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、）　、１５５巻、１８２３〜１８４１頁；グリム（Ｇｒｉｌｌｌｌ）等 、（１９８３年）、ジャーナル・エクスベリメンタル・メディシン（Ｊ、Ｅｘｐ 、Ｍｅｄ、）　１５８巻、１３５６〜１３６１頁）。

例えば、ローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）等は、フェーズＩの臨床試験に おける、組換えＩＬ−２（ｒ　Ｉ　Ｌ−２）活性化ヒトＬＡＫ細胞の使用は、異 常増殖する新生細胞を有する数人の患者で、著しい腫瘍抑制を起こしたことを報 告した（ローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎ−ｂｅｒｇ）　等（１９８５年）、ニュー イングランド・ジャーナル・オン・メディシン（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ 、　）　３１３巻、１４８５〜１４９２頁）、これらの臨床試験において、多数 （１０１０〜１０”）のヒトの末梢血液白血球を、９６時間までの時間、生体外 でｒｌＬ−２（Ｉ０００Ｕ／１．５Ｘ１０’紺胞／１０で処理し、その後、静脈 注射で患者に戻した。これらの人々はその後、処置の間に渡り、さらにｒＩＬ− ２の静脈注射（体重贈当り１００，０００Ｕまで）を受けた。

いくつかの劇的なＩｌｌ瘍の抑制が、著しい新生細胞をもつ数人の患者に観察さ れたけれども、この処置はまた多くの比較的厳しい臨床的問題をも生じさせた。

これら臨床的問題には、液体貯留、肺水腫及び挿管法を必要とする発作的呼吸困 難などがある。これらの問題は、ｒｌＬ−２注入の直接的毒性効果の結果として 起こる。

さらに、より最近の報告では、ローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）等は（１ ９８６年）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｅ）　、２３３＠、１３１８〜１３２１頁 ）　、＋ａ）免疫抑制試薬、シクロホスホアミド、（ｂ）　ｆ８）と共に用いる 、切除した腫瘍から得られる、ｒＩＬ−２膨張腫瘍侵入リンパ細胞及び（ｃｌｒ ｌＬ−２の比較的低い投与からなる３部ｍｏｄａｌｔｔｙの使用が、進行した肝 臓への転移のＭＣ−３８コロン・アデノカルシノーマを有する１２匹のマウスの 治癒に成功し、また、進行した肺への転移をもつマウスの５０％を治癒したこと を報告した。報告によると、ｒｌＬ−２を、４日間にわたり、毎日２５，０００ ユニツトを３度、系統的に投与した。これらの腫瘍は、ＬＡＫ治療には応答しな かったと報じられている。

い（つかのグループは、標的細胞溶解を仲介する、二特異性をもつ、異種結合体 （ハイブリッド）抗体の使用を報告している。

例えば、ジヤツジ（Ｊｕｎｇ）等（１９８６年）、プロシーディング・イン・ナ シヨナル・アカデミ−・オン・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　Ｕ　Ｓ　Ａ　ｓ　８３巻、４４７９〜４４８３頁）は、 標的細胞上の抗原と免疫反応を起こす１つのパラトビツク分子及び、ヒトのＴ細 胞と免疫反応を起こす第２のパラトビツク分子（ＯＫＴ３、ＡＴＣＣＣＲＬ８０ ０１）を含む、二特異的ハイブリッド抗体でコートした、ヒトのメラノーマ標的 細胞の効果的死滅化を報告した。予め、０ＫＴ３と接触させることにより活性化 したヒトのＴ細胞を、エフェクター細胞として用いた。

ベバン（Ｒｅｖａｎ）、スターズ（Ｓｔａｅｒｚ）及び共同研究者は、マウスシ ステム中の標的細胞を死滅させるための二特異的ハイブリッド抗体の使用を取扱 った、いくつかの報告を刊行した０例えば、スターズ（Ｓｔａｅｒｚ）等（（１ ９８５年）ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）、３１４巻、６２８〜６３１頁）は、 １つのパラトビツク領域が末梢Ｔリンパ細胞の約２５パーセントのＴ細胞レセプ ター上のアロタイプ・エピトープと免疫反応を起こし、他の１つバラトビツク領 域がＴｈｙ−１，１アロ抗原と免疫反応を起こす、ハイブリッド抗体の使用を報 告した。その報告は、Ｔｈｙ−１，１７０抗原を発現する標的Ｓ、ＡＫＲリンパ 腫細胞が、その標的細胞を、２特異的ハイブリッド抗体でコートし、ひきつづい て、そのコートした標的細胞を、そのハイブリッドのもう１つのパラトビツク領 域により認識される抗原を持つ細胞毒性Ｔリンパ細胞の種々の希釈物と混合する ことにより死滅することを示した。”ｒｈｙ−ｘ。

１抗原を持たない潜在的標的細胞は死滅しなかった。そのグループによる関連し た研究は、スターズ（Ｓｔａｅｒｚ）及びベバン（Ｂｅｖａｎ）（１９８６年） プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンス（Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　Ｕ　Ｓ　Ａ、　８３　巻、１４５３〜１ ４５７頁、スターズ（Ｓｔａｅｒｚ）及びベバン（Ｂｅｖａｎ）（１９８６年） ヨーロピアン・ジャーナル・オン・イムノロジー（Ｅｕｒ、Ｊ、１ｍ＋５ｕｎｏ １．）　１６巻、２６３〜２７０頁、及びスターズ（Ｓｔａｅｒｚ）及びベバン （Ｒｅｖａｎ）　（１９８５年）、ヨーロピアン・ジャーナル・オン・イムノロ ジー（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｔｍａ＋ｕｎｏ１．）　１５巻、１１７２〜１１７７頁）、 に見られる。

さらに、ベレズ（Ｐｅｒｅｚ）等（（１９８６年）ジャーナル・オン・エクスベ リメンタル・メデイシン（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、）　１６３巻、１６６−１７８ 頁）は、報告によると、ｒｌＬ−２活性化末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を組織 に指し向ける、二特異的異種結合体抗体について記述している。従って、その異 種結合体の１つの領域は、そのパラトープ（Ｍａｂ　０ＫＴ３のＦａｂ断片（Ａ ＴＣＣＣＲＬ８００１））を通して活性化ＰＢＭＣに結合し、一方、その異種結 合体のもう１方の領域（標的結合Ｍ　ａ　ｂのＦａｂ断片）は、標的組織に結合 する。

彼等の研究では、ベレズ（Ｐｅｒｅｚ）等は、Ｌ６ｕ−１１＝陽性（Ｌｅｕｌｌ ′″）細胞同様、単細胞のリンパ細胞をエフェクター細胞群について述べている 。彼等は、ＩＬ−２活性化エフエクターがＴ８抗原（７８″″）を示し、Ｍａｂ 　０ＫＴ８　（ＡＴＣＣＣＲＬ８０１４）及び補体を用いたＴ８”″細胞の除去 は、細胞毒性を失わせてしまうことを報告した。同様な戦術によるＴ４”細胞の 除去（Ｍａｂ　０ＫＴ４　（ＡＴＣＣＣＲＬ　８００２）＋補体）は、ＩＬ−２ 活性の存在下及び非存在下での溶解を増加させる。また、これらの著者は、活性 化した、ハイブリッド抗体コートしたエフェクターを、８から２４時間、ＩＬ− ２のない状態に維持すると、溶解活性の約半分が失なわれると報告している。

二特異的異種二官能性モノクローナルバラトビツク分子とその調製方法も、米国 特許第４．４４４．８７８号及びＰ　ＣＴ／　ＬＪ　Ｓ　８２１０１７６６（Ｗ Ｏ８３１０２２８５）で公開されており、その内容は、参考としてここに組込ま れている。リシンＡサブユニットに抗腫瘍抗体のＦａｂ領域を結合するための、 米国特許第４．３５０．６２６号に記載されている技術も、二特異的ハイブリッ ドを作る上で、望ましい抗体のＦａｂ領域を結合するのに用いることができる。

（本発明の簡単な概要） 本発明は、標的細胞を死滅させる方法及びその方法に有用な組成物を考案してい る。この方法は、生体外で活性化され、活性化試薬を含まず、標的細胞と免疫反 応する抗体で武装し、そして、後に、標的細胞と共にインキュベートするエフェ クター細胞を利用している。

このように、本発明の１つの特徴は、特異的に標的細胞を死滅させる方法の考案 であり、 （ａ）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、又はＩｇＧ３抗体Ｆｃレセプターを 含む、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）又は、末梢血液リンパ細胞（ＰＢＬ）のよ うな白血球細胞の培養物を、それら細胞のナチュラルキラー活性を高揚し、かつ ＩＬ−２活性化エフエクター細胞を形成するのに十分な量のインターロイキン− ２（ＩＬ−２）により、生体外で活性化する。

（ｂｌ　その後、ＩＬ−２活性化エフエクターを、毒性量のＩＬ−２から分離し 、ついで、ＩＬ−２を持たない細胞を集める。

（Ｃ１それから、これらＩＬ−２活性化エフエクター細胞のＦｃレセプターを、 クラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、又は１ｇＧ３Ｆｃ領域のモノクロー ナル抗体（Ｍａｂ）と結合して、武装した、ＩＬ−２活性化エフエクター細胞を 形成する。

有用なＭａｂのバラトビツク領域は、標的細胞の表面に発現した抗原に結合（免 疫反応）する。

＋ｄ＋　細胞毒性量の武装した、Ｉ　Ｌ−２活性化エフエクター細胞を、標的細 胞と接触させる。

（ｅ）　この接触を、標的細胞が死滅するのに十分な時間維持する。

以上のｌａｌ〜ｌｅ）のステップを含む、この方法は、インビトロ（ｉｎ　ｖｉ ｔｒｏ）でもインビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）でも有効である。その接触及び維持ス テップは実質的に、外からＩＬ−２を供給することなしに行なう。

上記方法の別の態様には、標的細胞に対して、Ｔ細胞の表面上に発現するＴ３抗 原と免疫反応を起こす、第１の抗Ｔ３バラトビツク領域と、標的細胞の表面上に 発現する第２のエピトープと免疫反応を起こす、第２のバラトビツク領域とを含 む、細胞溶解量の二特異的ハイブリッドモノクローナルバラトビツク分子を接触 させることが含まれる。この第２の標的細胞エピトープは、上述の、第１Ｍａｂ と結合した抗原とは異なり、かつ、これら第１Ｍａｂの免疫反応は、二特異的ハ イブリッド分子の第２パラトビツク領域の免疫反応を妨害せず、またその逆も成 り立つ。

二特異的ハイブリッド分子を、武装した、ＩＬ−２活性化エフエクター細胞と接 触させる前に、実質的には同時に、又は、その後に、標的細胞に接触させること ができる。その接触は、実質的に、武装した、ＩＬ−２活性化エフエクターとの 接触と同時であることが望ましい、その二特異的ハイブリッド分子が、標的細胞 を接触する前に、Ｔ３抗原を発現する抗Ｔ３活性化Ｔ細胞の表面にコートされ、 かつ、それらハイブリッドコートした、又は武装した抗Ｔ３活性化Ｔ細胞が、武 装した、ＩＬ−２活性化エフエクター細胞と共に存在することが最も好ましい。

本発明のもう１つの特徴は、標的細胞死滅化組成物である。その組成物は、標的 細胞を死滅するのに十分な量（細胞溶解量）の、白血球細胞群由来の、武装した ＩＬ−２活性化エフエクター細胞を分散させた形で含む、水性の生理学的に許容 できる希釈媒体を含む、ＩＬ−２活性化エフエクター細胞を、活性化細胞のＦｃ レセプターと結合し、そして、そのバラトビツク領域が、標的細胞の表面上に発 現した抗原と免疫反応を起こす、クラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、又 はＩ　ｇＧ３のモノクローナル抗体で武装する。

また、この組成物は、Ｔ細胞の表面上に発現するＴ３抗原と免疫反応する第１の 抗Ｔ３パラトビツク分子及び、標的細胞表面上に発現する第２のエピトープと免 疫反応を起こす、第２のバラトビツク領域を含む細胞毒性量の二特異的ハイブリ ッドモノクローナルバラトビツク分子を、先に議論した様に含むことが可能であ る。その二特異的分子は、武装した、抗Ｔ３活性化Ｔ細胞のような、抗Ｔ３活性 化Ｔ細胞の表面をコートした組成物中に存在することが望ましい。

本発明にはいくつかの利点及び長所がある。これらの利点及び長所の中で顕著な ものには、白血球群が、生体外で活性化され、武装しうろこと及び、外からＩＬ −２を補給することなしに標的細胞を死滅するのに利用しうろこと、それによっ て、受容動物に、外来から供給されるＩＬ−２の投与に伴う毒性の問題を避ける ことができることがある。

本発明の、その他の利点及び長所は、ひきつづ（本発明の説明から明らかであろ う。

（図の簡単な説明） 本公開の一部をなす図には、次のようなものが含まれる０図１は、抗体（Ｙ形体 ）及びエフェクター細胞により仲介される標的細胞溶解の種々の戦術の図的表現 である。戦術Ａでは、Ｔ細胞レセプターのようなエフェクター細胞上のエピトー プと免疫反応を起こすモノクローナル抗体が、標的細胞の表面に共有結合で結合 しているように示されている０戦術Ｂは、標的細胞（Ｔ−Ｆｃ結合）のＦｃレセ プターを介して、標的細胞と複合体を作るエフェクター細胞エピトープと免疫反 応を起こすモノクローナル抗体を示している０戦術Ｃは、標的細胞上のエピトー プ及びエフェクター細胞上のエピトープと免疫反応を起こす、異種二官能性ハイ ブリッドモノクローナル抗体の使用を示している；このハイブリッド抗体の二つ の領域は、広い線と、細い線で示しである０戦術Ｃの特徴は、ここでも利用可能 である。戦術りは、標的細胞上のエピトープと免疫反応し、かつ、エフェクター 細胞のＦｃレセプターを介してエフェクター細胞と複合体を作る（Ｅ−Ｆｃ結合 ）モノクローナル抗体の使用を示している。戦術りは、ここで議論している発明 で利用している原則的戦術である。この図は、フランス、ポカ・ラドン（Ｂｏｃ ａ　Ｒｏｍｏｎ）、ＣＨ２版、Ｅ１ボダク（Ｐｏｄａｃｋ）　ｋＭ、“細胞溶解 性リンパ細胞と補体”中のスターズ（Ｓｔａｅｒｚ）等の、“Ｔ−リンパ細胞仲 介溶解のためのハイブリッド抗体によるターゲフティング２からとったものであ る。

図２は、イン・ビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で、＄ＩＣｒ標１１Ｍ２１ヒトのメ ラノーマ細胞に関する、組換えインターロイキン−２（ｒｌＬ−２）をもつ、ヒ トの末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）の短期間生体外活性化により誘導される抗体 依存細胞性細胞毒性の増加を示している。ミリリフドル当り１０ｈ個のヒトＰＢ ＭＣを、種々の時間、３７℃で、ミリリンドル当り２５０ユニツトのｒｌＬ−２ と混合することにより、活性化する。その後、Ｐ　Ｂ　Ｍ　Ｃを実質的に毒性量 のｒｌＬ−２を含まなくなるまで洗浄し、ついで、横軸に示したエフェクター／ 標的細胞比で、ＭａｂｌｌＣ６４及び標的Ｍ２１ｉｔ胞と混合する。縦軸は、標 的細胞の比溶解率ユニットで示しである。各点で４回の測定を行ない、約ｌＯパ ーセント以下の標準偏差を示した。用いた生体外活性化時間を次に示す：ｒｌＬ −２なしく口）；１５分間のｒｌＬ−２活性化（）；３０分間のｒｌＬ−２活性 化（・）；１時間の活性化（△）；２時間の活性化（ム）；及び４時間の活性化 （Ｏ）。

図３は、４時間検定時間を採用したときの、４人のメラノーマ患者及びコントロ ールとして、２人の正常な、無症候性の大由来（７）ＰＢＭＣで試験した。　” Ｃｒ１１ｉｉ！＋Ｍ２１　ヒ）　・メラ／　−マ細胞のＡＤＣＣによる細胞溶解 を示す棒グラフである。患者１．２及び４は緩和をみせたが、患者３は、病状が 進行し、大きな腫瘍をもつに至った。エフェクター／標的細胞比は５０／１とし たが、エフェクター−標的細胞混合前に、次に示すエフェクターとのインキユベ ーションがとられた；５００Ｕ／−ｊ！　ｒｌＬ　２（黒棒）；ミリリットル当 り２５マイクログラムのＭａｂｌｌＣ６４（斜線棒）　；５００Ｕ／ｓ＋４！ｒ ＩＬ−２＋２５／ｊｇ／ｓＡＭａｂｌｌｃ６４（０棒）。

図４は、ｒｌＬ−２活性化ヒトＰＢＭＣによるＡＤＣＣの増加を示す、一群の棒 グラフである。ここでは、正常な無症候性の提供者由来のＰＢＭＣを、示したよ うな種々のエフェクター／標的細胞比で、標的ヒトゝ’Ｃｒ標ｍＭ２１メラノー マ細胞と混合した。

示されている４時間検定間のＰＢＭＣ処理には、ｒｌＬ−２２５０Ｕ／ｍＪとの 混合（水平斜線棒）、ＭａｂｌｌＣ６４２５マイクログラム／ミリリツトルとの 混合（垂直斜線棒）、及びｒｌＬ−２２５０Ｕ／ｍＪ＋Ｍａｂｌｌｃ６４　２５ ．ｃ＋ｇ／ｍｊ！とのインキュベーシヨン（０棒）が含まれている。示されてい る比溶解率は、ＮＫ溶解の値を差引いた後に得たものである。

（発明の詳細な説明） １、定義 “抗体”という言葉は、抗原と特異的に結合することができるイムノグロブリン と呼ばれる一群のグリコジル化タンパク質の一員である分子を意味する。そのよ うな抗体は、抗原の抗原決定基（エピトープ）と、その抗体の抗体結合部位（パ ラトープ）との間の特異的な免疫学的結合相互作用により、その抗原と結合する 。

“抗体結合部位”とは、特異的に抗原と結合する、Ｈ及びＬ鎖の可変及び超可変 領域を含む抗体分子の構造領域をいう、シャーン（Ｊｅｒｎｅ）の命名法によっ て（アナルス、オン、イムノロジー（Ａｎｎ、　ｌ５ｎｕｎｏ１．）　（パスツ ール研究所）、１２５Ｃ巻、３７３頁（１９７４年））、通常抗体結合部位は、 ここでは“パラトープ２を意味する。

”抗原”という言葉は、歴史的に、抗体と結合する実体にも用いられるし、また 、抗体の産生を誘導する実体にも用いられる。

最近では、抗原の意味を、抗体と結合する実体に限って用い、一方、抗体産生を 誘導する実体には“免疫原”という言葉を用いる。

ここで議論する実体は、抗原性及び免疫原性の両方を有するが、一般的に抗原と 呼ぶことにする。

６抗原決定基”という語句は、免疫学的に、抗体結合部位と結合する、実質的な 構造領域を意味する。シャーン（Ｊｅｒｎｅ）の命名法では、抗原決定基を“エ ピトープと定義している。

“生物学的に活性°という言葉は、他の一般的、もしくはエフェクター能が同時 に存在する場合でも、少なくとも、抗原又は特異的抗体結合部位に、特異的に結 合する能力を意味している。抗体結合部位を含むパラトビツク分子の生物学的活 性は、抗体パラトープ（結合部位）が、そのエピトープ（抗原決定基）と、水性 媒体中、混合することにより免疫学的反応を起こし、少な（とも、生理学的ｐＨ ４ａ及びイオン強度で、免疫反応物を形成することにより証明される。生物学的 活性は、生物学的条件下、すなわち、本発明のパラトープ含有分子が、そのエピ トープと結合する、ｐｕ値約５から約９、イオン強度は、蒸留水から、約１モル 濃度の塩化ナトリウム液、そして、温度は約４℃から約４５℃の範囲である条件 で起こることが望ましい、ここで用いるモノクローナル・パラトビツク分子は生 物学的に活性である。

“イライザ法”は、同相に結合した抗原又は抗体、及び酵素−抗体又は酵素−抗 原結合体を用いた、試料中の抗原又は抗体の検出及び定量を行う、酵素結合免疫 吸着検定法である。イライザ法の説明は、１９８２年、カリフォルニア州、ロス ・アルトス（ＬｏｇＡｌ　ｔｏｓ）のラング・メディカル・パブリケーション（ Ｌａｎｇｅ　ＭｅｄｉｃａｌＰａｂｌｉｃａｔｉｏｎ）から出版された、Ｄ、Ｐ 、サイト（Ｓｉｔｅ）等による、“基本及び臨床免疫学”第４版、２２章及び米 国特許第３，６５４，０９０号、第３．８５０，７５２号及び第４，０１６，０ ４３号にみられ、これらは参考“酵素”とは、しばしばこれに特異的な基質に、 触媒的作用により、ある変化を促進させたり、又は生じさせる能力のあるタンパ ク質を意味する。

ここで用いている“免疫反応物”という言葉は、免疫学的反応の産物、すなわち 抗原が、抗体又は、パラトープを含む分子と結合したときに生じる実体を意味す る。それゆえ、免疫反応物は分子間で形成する特異的な複合体である。

“本来の抗体”という言葉は、細胞により分泌される完全な抗体を、抗原との免 疫反応における生物学的活性に必要なパラ）−ブも含む他の、より小さな、分子 と区別して、ここで用いている。

本発明に有用なバラトビツク分子はモノクローナル・バラトビツク分子である。

１モノクローナル抗体”　（ここでは、しばしばＭａｂ″と呼ぶ）は、ある種の 抗体を分泌するハイブリドーマのクローンにより産生される抗体であり、また、 モノクローナルバラトビツク分子とはモノクローナル抗体のことである。そのハ イブリドーマ細胞は、抗体産生細胞と、ミエローマ又は他の自己増殖細胞系列と の融合により作られる。最初に、そのような抗体を報告したのは、コラ−（Ｋｏ ｈｌｅｒ）とミススタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）（ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ ）　、２５６．４９５−４９７頁（１９７５年））であり、この報告を、本報告 でも引用している。

１モノクローナルバラトビツク分子”バラトビツク分子′、“モノクローナル抗 体”及び“Ｍａｂ″は、ここでは、本来のモノクローナル抗体をさして、互換的 に使われている。

“分泌”及び“産生“という言葉は、抗体が得られる細胞に対し、この分野では 互換的に使われている。しかし、抗体を産生ずる細胞は、その環境にそれらの分 子を分泌するとは限らない、ここで目的のハイブリドーマ細胞は、その環境にモ ノクローナル抗体を分泌する。しかし、ここでは、時々、このような細胞を“抗 体産生細胞”と呼び、またそれらの抗体に対し、当分野で用いる語句である“産 生された′というように用いる。

“上清′という語句は、ここでは、細胞を培養したときのイン・ビトロ（ｉｎ　 ｖｉｔｒｏ）の液体媒体を意味する。ここで目的とするハイブリドーマ培養によ り産生されるモノクローナルバラトビツク分子は、その培養媒体環境に分泌され る。従って、その培養媒体上清は、１つの好ましいモノクローナルバラトビツク 分子源であり、かつ既知技術により、ハイブリドーマ細胞と分離して、容易に得 ることができる。これらの技術の例には、液体媒体から細胞を沈降させる、低速 遠心がある。別に、モノクローナル抗体は、その中にハイブリドーマ組織を導入 した実験動物の腹水腫瘍液（腹水）から入手できる０両方法とも、後に説明する 。

■、一般的説明 すでに述べてきたように、細胞溶解を行うために、いくつかの戦術が開発されて きている。ｒＩＬ２の系統的投与及び、ｒｌＬ−２で活性化によって生じるＬＡ Ｋ紺胞の単独使用のような処理は、−ｉ的使用には非特異的すぎることが示され た。ＴＩＬ細胞及びＩＬ−２を用いた最近報告された結果では、マウスでは効果 的であるが、なお、ｒＩＬ−２の系統的投与を利用している。

ＩＬ−２は毒性があるので、そのような系統的使用は避けた方が得策であろう。

また、以前に指摘されたように、その絶妙なモノクローナル抗体の特異性は、予 め特定された標的細胞群の溶解をひき起こすように企ろまれでいる。しかし、単 なる様式として用いた場合は、モノクローナル抗体のみを用いたときの結果は不 均一なものとなる。

エフェクター細胞と共に、標的細胞特異的Ｍａｂを利用した、４つの戦術を、図 １に図武的に示した。その図の戦術Ａは、そのバラトビツク領域がエフェクター 細胞上のエピトープと免疫反応を起こし、かつ、そのＦｃ領域が、標的細胞と共 存結合するＭａｂの使用を説明している０戦術Ｂは、抗体に結合する標的細胞上 のＦｃレセプターと、エフェクター細胞に結合するバラトープを利用している０ 戦術Ｃは、エフェクター細胞と免疫反応する第１のバラトープ領域と、一方、標 的細胞と免疫反応する第２のパラトープ領域を含むハイブリッドモノクローナル 抗体を利用している。

戦術Ｃの特徴は、ここでは、戦術りとの合併様式の１部として用いられる０戦術 りは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ又はＩ　ｇＧ３のＦｃ領域と結合しく Ｅ−Ｆｃレセプター結合）、一方、その抗体バラトープは、標的細胞上のエピト ープと免疫反応する。

本発明は、標的細胞を死滅させる原則様式の特徴として、図１の戦術りの一般的 概念を利用する０本発明の基本とする研究は、これまで述べてきたＩＬ−２の系 統的投与のような技術よりも、より臨床的問題の少ない別の技術を得、一方では 、腫瘍細胞のような標的細胞を特異的に溶解する目的を達成するよう設計された 。

後に、説明するように、本発明は、メラノーマ又は神経芽細胞腫細胞のような標 的細胞上に選択的に高密度に発現される、ＧＤ２及びＧＤ３のような抗原を指向 するＭａｂで、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）のようなＩＬ−２活性化白血球を “武装”し、特異的に、目標を定める。

ここでの結果は、ＰＢＭＣのようなヒトの白血球を、低用量のｒｌＬ−２と、簡 単に（１５分から４時間）、生体外でインキエベーシッンすると、ヒトのメラノ ーマ及び神経芽細胞腫標的細胞の、ナチユラル・キリング（Ｎ　Ｋ）及び特に、 抗体依存の細胞性細胞毒性（Ａ　Ｄ　ＣＣ）の双方を増加させることを示してい る。加えて、ここで示した結果は、Ｍａｂ標的化、活性化ヒトＰＢＭＣに対し、 神経芽細胞腫細胞と同様、ヒトのメラノーマ上で、ジシアロガングリオシドＧＤ ２及びＧＤ３が、効果的な標的構造をとっていることを示した。さらに、これら のＭａｂ武装及びｒｌＬ　２活性化エフエクター細胞は、特異的に、化学的に限 定されるＧＤ２及びＧＤ３ジシアロガングリオシド標的構造を区別できる。

本発明の１つの特徴は、標的細胞すなわち、その表面に特別な抗原を発現する、 死滅することが望ましい細胞を特異的に死滅させる方法にある。このような細胞 の例としては、その表面に、抗原として、ガングリオシドＧＤ２、そして、また はＧＤ３を発現する腫瘍細胞がある。ここでは、そのような細胞を、そのような 標的細胞の一例であることを理解した上で、説明のため、標的細胞として用いて いる。

別の代表的標的細胞、その表面抗原及び免疫反応を起こすＭａｂについては後述 する。イン・ビポ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）についても、腫瘍細胞のような標的細胞が Ｍａｂによって結合されうる抗原を選択的に発現し、その結果、正常細胞の溶解 を最小限におさえられることが望ましいことは理解されるであろう、別に言えば 、そのＭａｂが免疫反応する標的細胞上の抗原は、実質的に非標的細胞にはない か、または、非標的細胞は、実質的に、そのＭａｂが免疫反応する抗原を含まな い。

本方法に従って、ＩｇＧ１．、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３抗体に対す るレセプターを含む末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）のような白血球群を、それら の細胞がナチュラルキラー（ＮＫ）活性を高め、ＩＬ−２活性化エフエクター細 胞となるのに十分なインターロイキン−２を含む水性培地中、生体外培養する。

その後、これら活性化エフェクター細胞を、洗浄することで、毒性量のｒＩＬ− ２を除（（分離する）。

そのＩＬ−２活性化エフエクター細胞のＦｅレセプターを、その標的細胞の表面 上に発現している抗原と免疫反応するクラスＸｇＧ１、ＩｇＧ２ａ％ＩｇＧ２ｂ 又はＩ　ｇＧ３のＦｃ含有モノクローナル抗体と結合させ（コーティングする） 、武装した、ＩＬ−２活性化エフエクター細胞を作る。その後、その武装したＩ Ｌ−２活性化エフエクター細胞を、標的細胞と混合し、接触させる。その混合を 、モノクローナル抗体武装した、ＩＬ−２活性化エフエクター細胞が標的細胞を 死滅させるのに十分な時間、維持する。

使用する白血球は、オートロガスである、すなわち、その腫瘍細胞と同じ動物由 来であってもよいし、その標的細胞と混合したとき、それらの細胞が、悪性の免 疫応答を起こさない限り、他の適合する動物由来のものであってもよい、使用す る白血球は、より狭義の細胞群へとさらに分画することなしに、血清又は、血漿 から得ることができる。

より特異的な白血球亜群が望ましい場合は、その白血球のフィコール−ハイバー ク密度勾配遠心による分画により、ＰＢＭＣを提供するか、又は、末梢血液リン パ細胞（Ｐ　Ｂ　Ｌ）の非連続パーコール勾配遠心により、大顆粒リンパ細胞（ Ｌ　Ｇ　Ｌ）に冨む細胞群を得る。ＬＧＬは、ＮＫ細胞及び好中球上にもみられ るＬｅｕ−１１抗原を示す、これらの細胞はＬｅｕ−１１”と呼ばれる。その他 にも、なお一層狭義のエフェクター細胞群が、既知方法を用い、望むように得る ことができる。

ＰＢＭＣ及びＰＢＬ群は、それら自身部分的に、潜在的に活性化エフェクターに 冨んでおり、ここでも、活性化エフェクター細胞を得るための、代表的白血球群 として利用している。

正常な白血球群は、抗体のＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ又はＩ　ｇＧ３の Ｆｃｊｌ域を結合しうるレセプターを含んでいるＩＬ−２活性化可能エフエクタ ー細胞を含んでいる。従って、望ましいレセプターの有無による、白血球の特別 な選択は一般的に必要ない、加えて、以後議論する結果に示すように、適当な白 血球は、攻撃及び溶解を受ける腫瘍細胞を有する患者のＰＢＭＣ中に存在するの と同様に、正常な無症候性のヒトのＰＢＭＣにも存在する。

活性化可能なエフェクター細胞のより大きい群が通常、ＩｇＧ　１Ｆｃ領域に対 するものよりも、ＩｇＧ２ａ、Ｉ　ｇＧ２　ｂ又は１ｇＧ３Ｆｃに対するレセプ ターを含むものに存在することに注意が必要である。結果的に、ＩｇＧ２ａ、Ｉ ｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３を含むＭａｂが、そのようなモノクローナル抗体のＦｃ領 域に対するレセプターを含む活性化可能なエフェクター細胞として望ましい。

ＰＢＭＣのような白血球を、そのような哺乳類細胞のための通常の培養条件下で 、生体外培養する０代表的培養技術及び培養培地は、材料と方法セクションで議 論している。しかし、典型的には、それらの細胞を、ミリリンドル当り、約５Ｘ １０’から約５×１０ｈ個の濃度で培養する。

その白血球を、それらの細胞のＡＤＣＣ及びＮＫ活性を高揚するのに十分な量の インターロイキン−２と培養することにより活性化し、ＩＬ−２活性化エフエク ターを作る。天然のＩＬ−２も入手可能で、ここでも有用である０例えば、米国 特許第４．４７３．６４２号参照、しかし、組換えＩＬ−２（ｒｌＬ＝２）もよ り簡単に入手可能で、本目的にも有効である。

ここでの培養条件も、哺乳類細胞に対し、当分野で通常用いられているものであ り、また、それらの培養は典型的には、３７℃で行う、使用するｒｌＬ　Ｚ量は 、その最小量が最小培養時間で使用される限り、大きな制限因子とはならないよ うである０例えば、表４に示すように、４時間、３７℃培養が、エフェクター／ 標的細胞比６：１〜５０：１かつ１０６個ＰＢＭＣで行なわれたとき、ｒｌＬ− ２が５０から５００００　Ｕ／ｒａｇＯ）範囲で、ＡＤＣＣに差はなかった。し かし、ｒＩＬ−２５０Ｕ／ｍｊ！以下では、同条件で効果がみられなかった。加 えて、図２に示したように、適当な活性は、ｒｌＬ−２との培養約１５分間程で 達成される。

適当な生体外活性化標本は、熟練した研究者によって容易に得ることが可能であ る。

また、エフェクター細胞のＩＬ−２活性化は、標準的標的細胞系列に対する、そ の活性比を検定する細胞群のＮＫ活性を測定することにより、確かめることがで きる８Ｍ２１メラノ一マ細胞系列は、ヒトのメラノーマＳＫ−ＭＥＬ−２８（Ａ ＴＣＣＨＴＢ７２）及びＷＭ２６６−４　（ＡＴＣＣＣＲＬ１６７６）細胞系列 と同様、そのような系列の１つである。典型的に、ＰＢＭＣを用いると、ＩＬ− ２活性化エフエクター細胞は、予め決めた量の標準的標的細胞に対し、同じＥＡ Ｔ比を用いた時、同数の非活性ＰＢＭＣの約２倍のＮＫ活性を示した。従って、 比較的簡単なテストが、白血球の活性化を測定できる外的コントロールとして使 用可能である。活性化していないことが知られている正常で無症候性の動物の白 血球から調製した標準物質を、最初に用いた白血球がそれ自身活性化しているエ フェクターでないことを保証するのに用いることができる。

武装した、ＩＬ−２活性化エフエクター細胞は、活性化エフェクター細胞を、効 果量の適当なＭａｂと混合し、そのＭａｂのＦｃ領域を、活性化エフェクターの Ｆｃレセプターに結合させることによって作る。このプロセスは、ここで、しば しば、そのエフェクターを“コーティングするというように呼ばれる。使用する Ｍａｂは通常コーティングの前に精製され、また、いくつかある既知技術のうち の１つを使って、そのように調製される。

典型的な調製では、ＰＢＭＣをｒｌＬ−２で活性化し、洗浄により、実質的に毒 性量のｒｌＬ−２を含まないよう分離し、さらに、適当な水性媒体中でＭａｂと 混合し、接触させる。そのようにしてできた混合物を、抗体Ｆｃｊｉｌ域が、Ｉ ｔ、−２活性化エフエクター細胞の表面上のＦｃレセプターと反応（複合体形成 ）するのに十分な時間維持し、Ｍａｂ武装した、ＩＬ−２活性化エフエクター細 胞を作る。典型的混合、接触及びＭａｂでエフェクター細胞を武装する維持（イ ンキュベージぢン）時間は、約５分から約２４時間であり、約５から約６０分が より好ましく、また、温度は、約０から約４０℃で、約３７℃がより好ましい０ 通常、Ｆｃレセプター保有細胞に結合すると期待される以上の、過剰量のＭａｂ がエフェクター細胞の至適コーティングを達成するのに使用される。

ヒトのシステムにおいてマウスのモノクローナル抗体を使用する、先に述べた報 告は、それらのＭａｂがヒトに導入されたとき、はとんどまたは全（、不適当な 反応を起こさないことを示したので、過剰量のＭａｂを使用でき、そして、その 過剰量のものは、その武装した、ＩＬ−２活性化エフエクターから除く　（分離 ）する必要がない、しかし、そのような分離は、容易に、通常の遠心及び洗浄操 作により行うことができる。望ましいなら、そのＩＬ−２活性化エフエクター細 胞を、それらを武装後ＩＬ〜２から分離することができ、それにより、洗浄ステ ップを１回少な（することができ、その結果、！Ｌ−２及び過剰のＭａｂ　（用 いた場合）は、ワンステップで、武装置Ｌ−２活性化エフェクターを分離するこ とができる。

そのように作った、効果的、細胞毒性量のＭａｂ武装置Ｌ−２活性化エフエクタ ー細胞を、実質的に外から供給するＩＬ−２の非存在下、腫瘍細胞のような標的 細胞と混合及び接触させる。それらを混合するとき、典型的には、水性媒体中の 標的及びエフェクター細胞を混合する。Ｍａｂ武装置Ｌ−２活性化エフエクター の水性媒体は、ＤＭＥＭ又はＰＢＳのような生育又は他の媒体が通常使われる。

その接触を、イン・ビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で行うときは、標的細胞に対す る水性媒体は、同様の媒体が用いることができるし、また、接触をイン・ビボ（ ｉｎ　ｖｉｖｏ　）で行うときは、血液や他の通常の体液が用いられる。

武装したＩＬ−２活性化エフエクター及び標的細胞の接触は、外的に供給される ＩＬ−２の非存在下、及び先に議論した生物学的条件下、その武装したＩＬ−２ 活性化エフエクター細胞が標的細胞を死滅（溶解）するのに十分な時間、維持す る。典型的な、イン・ビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）でのその接触の維持時間は、 約１から約６時間で、ここでは、例として、４時間が用いられている。イン・ビ ボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ　）投与の場合、その接触時間は、動物中に導入された組成 物の武装エフェクター（Ｍａｂ武装置Ｌ−２活性化エフエクター細胞＋生理学的 に許容できる希釈剤のような水性媒体）が受容動物の正常な身体機能により、除 去されるのに十分な時間、維持する。

標的細胞のイン・ビトロ（ｉｎ　’ｖｉ　ｔｒｏ）での溶解は、ここで用いられ ているように、Ｓ　Ｉ　Ｃｒのような放射性標識の使用により容易に観察される 。マウス、ラット、モルモット又はヒトのような受容動物のイン・ビボ（ｉｎ　 ｖｉｖｏ　）処理に対し、通常の技術により確認される腫瘍の減少は、簡便な検 定法を提供する。標的細胞抗原の増加量に対する血清学的又は他の検定法も、標 的細胞の死滅を確認する有用な方法である。

以下の、表１は、本発明の有用な代表的モノクローナル抗体をリストした。これ らのＭａｂは、出版物中で用いられている名称、及びそれらのハイプリドーマ、 その抗体のクラス、及び報告によればＭａｂが免疫反応を起こす抗原の、報告さ れているＡＴＣＣ受理番号（ＡＴＣＣ１ｋ）でリストされている。各Ｍａｂ及び その免疫反応の議論に対する引用は、抗原リストの脚注に与えられている。

表　１ 代表的Ｍａｂ Ｍａｂ　ＡＴＣＣ番号　クラス　抗　原ＭＢ　３．６　ＨＢ　８８９０　１ｇＧ ３　Ｇ０３′１４．１８　ＨＤ　９１１８　１ｇＧ３　Ｇロ２２１１Ｃ６４１ｇ Ｇ３　ＧＤ３’ ９、２．２７　１ｇＧ２ａ　］　ンドロイチン硫酸 プロテオグルカン４ Ｒ２４１ｇ０３　Ｇ０３′ １１Ｔ２９／２６　１１Ｂ　８２４７　１ｇＧ２ａ　結腸がん６グリコプロテイ ン ｇρ２９ ＩＩＴ２９／３６　１１Ｂ　８２４８　１ｇＧ３　結腸がんＣグリコプロティン ｐ　２９ ＣＬＴ８５　１１Ｂ　８２４０　１ｇＧ１　結腸がん１Ｆ６４．５　１ｇＧ２ａ 　哺乳類 細胞がん１１！Ｉ！７ ８３８、　ｌ　ＩｇＧ１　パンカルシノーマ７０　ｋｄタンパク質フ ロＡ２　１１［１８１１２１ｇＧ３　３９　ｋｄ　ｌ１ｉｂ外膜タンパク質１ ２Ｅ１０　１ｇＧ２ａ　４５　ｋｄ　１ｌｉｂ外膜タンパク質８ 表　１　（続き） Ｍａｂ　ＡＴＣＣ番号　クラス　抗　原８Ｆ８　１ｇＧ３　３９　ｋｄ　ｌ１ｉ ｂ外膜タンパク質８ １７Ａ１０　１ｇＧ２ａ　３９　ｋｄ　１ｌｉｂ外膜タンパク質１ １６Ｃ２−１ｇＧ２ｂ　３７　ｋｄ　１ｌｉｂ外膜タンパク質８ Ｆ３６／２２　Ｈｅ　８２１５　１ｇＧ３　ヒト胸部がん腫８Ｔ１６　ＩＩＢ　 ８２７９　１ｇＧ２ｂ　ヒト膀胱腫瘍Ｔｌ０Ｉ　！ＩＢ　８２７３　１３Ｇ２ａ 　ヒト膀胱腫瘍１０１１１６−ＮＳ−１９−９１１Ｏ８０５９１ｇＧＩ　Ｍ腸が ん腫モノシアロガングリオシド■ １、　チェレフシュ（Ｃｈｅｒｅｓｈ）等、（１９８５年）プロシーディング・ イン・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

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５、米国特許第４，５０７．３９１号 ６、米国特許第４，５７９，８２７号 ７、米国特許第４，５２２．９１８号 ８、米国特許第４．４５６．２９６号 Ｈｉｂ薗へモフィラス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｌｕｓｉｎｆｌ ｎｅｎｚａｅ）　ｂタイプ ９、　ヨーロッパ特許出願番号、８４４００４２０．０．１９８４年、９月１２ 日刊行、刊行番号第０１１８３６５号１０、ヨーロッパ特許出願番号、８４１０ ２５１７．４．１９８４年、９月１９日刊行、刊行番号第０１１８８９１号１１ 、米国特許第４．４７１．０５７号本発明の方法及びその使用により得られた結 果は意外にも、Ｍａｂ単独、ＩＬ−２活性化ＰＢＭＣ単独、もしくは、非活性化 ＰＢＭＣ及び適当なＭａｂから得られた結果とは異なっていた。この結果の驚く べき差異は、表６に関連して、以後議論される、イン・ビボ　（ｉｎ　ｖｉｖｏ ）の研究で特に示されている。

また、ＩＬ−２活性化後、標的細胞の溶解に、さらなるＩＬ−２を必要としない ことは、驚くべきことである０例えば、表５参照。

本発明が働（ための明確なメカニズムは分っていない、後に議論するように、図 １０で図式的に説明されているように、少なくとも強化された抗体依存細胞性細 胞毒性（Ａ　Ｄ　ＣＣ）は、強化されたナチュラル・キラー（ＮＫ）活性と同様 に、重要な復側を果すと考えられている。さらに別のメカニズムが関与している かどうかは不明確である。これらの研究から得た結果、特に、以後述べるイン・ ビポ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）での研究結果は、ＩＬ−２誘導ＮＫ活性及び正常なＡＤ ＣＣにより得られた結果の合計よりもより大きい相乗的細胞溶解の結果であるよ うだ。

生理学的に許容しうる希釈水性媒体中に分散した、効果的細胞毒性量のＭａｂ武 装置Ｌ−２活性化エフエクター細胞を含む、水性組成物は、本発明の別の特徴を 構成する０代表的水性媒体には、水、正常生理食塩水、ＰＢＳ、リンゲル液、ラ クテートリンゲル液などが含まれる。

武装した、活性化エフェクター細胞は、標的細胞量、標的細胞のタイプ、使用す る検定法及び接触時間や温度と同様に、イン・ビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で使 うか、イン・ビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）で使うかによっても左右されうる。イン・ ビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）での細胞毒性に対し、エフェクター／標的細胞比（ Ｅ　：　Ｔ）は、約５：１から約５００１が適しており、約２５：１から約１０ ０＝１が好ましい。

イン・ビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）での細胞毒性に対して、武装した活性化細胞は、 ＰＢＭＣ群として計算すると、人に対し、約１０”から約１×１０１６個、好ま しくは約１０”個から約５Ｘ１０．’個が使用される。一方、マウスの場合は、 約５Ｘ１０’個から約５Ｘ１０’個が用いられる。典型的に、それらの細胞は、 先に議論したように、約ｌＸ１０’から約２Ｘ１０’個の細胞当り、約２００か ら約４００マイクログラム（μｇ）の精製したＭａｂを使って調製する。

Ｍａｂとエフェクター細胞との混合は、−ｉ的にミリリフドル当り、約０．０２ ５から約５ミリグラム、好ましくは、約０．５から約２■ｈｌのＭａｂと、約１ ×１０６から約Ｉ　Ｘ　１０”細胞／　ｍ　Ｉｔ、より好ましくは、約ｌＸｌ０ ’から約５Ｘ１０’細胞／　ｓ　１の間で、Ｍａｂと細胞の濃度を正の相関をも たせて行う。

一般的に、本発明の組成物は、イン・ビポ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）処理を行う場合は 特に、単位投与で与えられる。“単位投与”という言葉は、希釈剤としての、生 理学的に許容しうる水性媒体と共に、望ましい治療効果を生ずると計算される、 武装した活性化エフェクター細胞の既定量を含む、動物に与える１回の投与に通 した、物理的に分けられた単位を意味する。

零発叫の別の特徴では、二特異的もしくは、異種二官能的ハイブリッドモノクロ ーナル・パラトビツク分子（通常、ここでは、二特異的ハイブリッド分子又はハ イブリッドと呼ぶ）及び活性化エフェクター細胞を合せた、先に議論した様式の 方法を使用していることがある。このような二特異的ハイブリッド分子を調製す る方法は、先に述べられた報告及び特許で議論されており、ここでは、これ以上 取扱かわない。

本発明のこの点に関し有効な、二特異的ハイブリッド分子は、図ＩＣで図式的に 説明しているもので、１つのパラトビツク領域は、標的細胞表面上に発現してい る１つのエピトープと特異的に結合（免疫反応）して、一方では、別のパラトー プがＴ細胞の表面上に発現しているＴ３抗原と免疫反応する。Ｔ３抗原と免疫反 応するパラトビツク領域はしばしばここで、抗Ｔ３バラトビツク領域又は抗Ｔ３ Ｍａｂと呼ぶ。

このハイブリッドを、先に述べた方法と組合せて用いるので、二特異的ハイブリ ッドバラトープによって結合された標的細胞のエピトープは、そのエピトープへ の競合を避けるために、先に述べた方法で用いたエピトープとは異なり、また１ つのモノクローナル・パラトビツク分子によって仲介される標的細胞の死滅のた めの第２の手段を提供する。そのようなエピトープは非干渉エピトープと呼ぶこ とができる。そのエピトープの非干渉性は、先に述べたＭａｂ及び二特異的ハイ ブリッドを利用した結合研究によって容易に検定できる０代表的二特異的ハイブ リッド分子を後に議論する。

活性化ＰＢＭＣのようなＩＬ−２活性化白血球は、Ｔ３抗原を含む多くのＴ細胞 、すなわちＴ３”細胞を含んでいる。このようなＴ３”細胞は、本発明のこの点 において有効であるが、先に述べた方法における活性化エフェクターであると考 えな（でよい。

次に続く議論は、少なくとも３グループの活性化可能なエフェクター細胞（エフ ェクター前駆体）が、通常みられる白血球群に存在することを示している。

二特異的ハイブリッド分子を使用した第１の態様において、ＰＢＭＣのような白 血球を、そのＴ細胞が活性化するのに十分な時間、生物学的条件下に、効果量の 抗Ｔ　３　Ｍａｂと混合、接触及び維持することにより、これらの細胞を活性化 する。十分な量の活性化は、その培養物中のＴ３°細胞の濃度が、培養物中の生 細胞数が一定のままか、もしくは本来存在したもの以上に増加した状態で、元々 存在した細胞の約７５パーセントを占めるときに、達成される。ＰＢＭＣは、” ｒ３”ｉ胞の濃度が、その集団中の生細胞総数を再び一定かもしくは、元々存在 した数より増加した状態で、元々存在した濃度の約５０パーセントになるまで培 養することが望ましい。

典型的には、適当な活性化エフェクター細胞群は、各々、細胞密度、ミリリフド ル当り約３〜８Ｘ１０’細胞、抗Ｔ３Ｍａｂとして、精製０ＫＴ３（ＡＴＣＣＣ ＲＦ８００１）、ミリリフドル当り約２００〜６００ナノグラム及び約３７℃で のインキュベーション培養３及び５日後に達成できる。Ｔ３゛細胞の相対数及び その濃度は、０ＫＴ３又はＬｅｕ４抗体のフルオレセイン・イソチオシアネート （ＦＩＴＣ）結合体のような、Ｔ３と免疫反応を起こす抗体に結合する螢光ラベ ルと、螢光活性化セルソーター（ＦＡＣ３）を用いて、容易にＴ＋１！認できる 。

典型的に、活性化細胞群は、Ｔ３抗原を示さないが、（Ｔ３−）、Ｔ４又はＴ８ は示す（Ｔ４１又はＴ８ａ、Ｔ細胞を多（含んでいる。このような細胞をＴ３− １Ｔ４”又はＴ３＼Ｔ８”と呼ぶことができる。〔モノクローナル抗体　０ＫＴ ４　（ＡＴＣＣＣＲＬ８００２）及び０ＫＴ８（ＡＴＣＣＣＲＬ８０１４）をＴ ｇ胞抗原を同定するのに用いることができる。〕同じ活性化Ｔ８”細胞が、休止 Ｔ８’″細胞を、０ＫＴ３又はＬｅｕ　４及びＩＬ−２で別に活性化することに よっても得ることができると考えられている。

０ＫＴ３によるＴ３のエンゲージメントは、限定した実験条件下でＩＬ−２レセ プターの発現、ＩＬ−２の産生及び増殖へと導くことが示された。〔パン・ワウ エ（Ｖａｎ讐ａｕｗｅ）等（１９８０年）ジャーナル・オン・イムノロジー（Ｊ 、Ｉｍ＋ｍｕｎｏ１．）１２４巻、２７０８〜２７１３頁；シュワプ（Ｓｃｈｗ ａｂ）等（１９８５年）、ジャーナル。

オン・イムノロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）　１３５巻、１７１４〜１７１８ 頁；マンガ−（Ｍａｎｇｅｒ）等（１９８５年）、ジャーナル・オン・イムノロ ジー（Ｊ、Ｉ＋ＩＩ＋５ｕｎｏ１．）　１３５　巻、３６６９〜３６７３真；及 びトソウカス（Ｔｓｏｕｋａｓ）等；ジャーナル・オン・イムノロジー（Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、）　１　３　５　巻、　１７１９〜１７２３　頁、　）しかし 、驚くべきことに、ここで議論されているように、０ＫＴ３で活性化し、これら 抗体を洗浄により除き、そして、Ｍａｂ９．２゜２７（メラノーマ表面抗原に結 合する、クラスＩｇＧ２ａの抗体）と混合したヒトのＰＢＭＣ及びＭ２１メラノ ーマ標的細胞は、二特異的ハイブリッド分子＋活性化細胞で観察できるものより も、実質的に少なく、また、ハイブリッド＋非活性化ＰＢＭＣで観察されるもの と同程度の、標的細胞溶解を提供する。ジャンプＵｕｎｇ）等（１９８６年）プ ロシーディング・イン・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンス（Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　Ｕ　Ｓ　Ａ％　８３巻、４４７９〜４４ ８３頁、ＩＬ−２は、おそらく、これら活性化条件下で発生するであろうから、 先に議論した、本発明の方法に従う、細胞溶解経路はＴ細胞＋ハイブリッドの抗 Ｔ３活性化の経路と明らかに異なる。

活性化エフェクターＴ細胞のフォトマイクログラフは、顆粒状の塩基性染色性細 胞質を有する比較的大きい細胞の存在を示した。

非活性化細胞のフォトマイクログラフは密度の高い核と、乏しい細胞質をもつ、 小さい休止リンパ細胞の典型的形態を示した。ジャンプ（Ｊｕｎｇ）等（１９８ ６年）プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンス（ Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、５ｃｆｆｉ、）ＵＳＡ、８３巻、４４７９〜 ４４８３頁参照。

活性化及び抗Ｔ３活性化細胞を抗Ｔ３Ｍａｂから分離するための洗浄の後、抗Ｔ ３活性化エフェクター細胞を含有するＰＢＭＣ培養物は、−ｉに約２４時間以内 に使用する。この使用においては細胞を、第１の抗Ｔ３含有パラトビ７り領域が その培養物中に存在するＴ３含有細胞と免疫反応を起こすのに十分な時間、例え ば３７℃で約５分間から約１時間、その二特異的ハイブリッド分子と混合、接触 及び維持（インキュベート）シ、二特異的抗Ｔ３武装化抗Ｔ３活性化Ｔエフェク ター細胞を形成する。

その後、細胞毒性量の、それら二特異的抗Ｔ３武装化、抗Ｔ３活性化エフェクタ ーＴ細胞を先に議論した、水性の生理学的に許容しうる希釈媒体に分散する。生 じた組成物を標的細胞と混合し、そのエフェクター標的細胞混合物を、先に議論 したように、標的細胞の死滅に十分な時間維持する。

イン・ビトロ（ｉＩｌｙｉｔｒｏ）での標的細胞の死滅化のための代表的ＥＸＴ 比は、標準としてＰＢＭＣ調製物由来の武装したエフェクターを用い、ここで議 論している５ＩＣｒ細胞溶解検定において、１００マイクロリツトル（μｉ）当 り、１．５Ｘ１０’個の標的細胞、すなわち約ｉ、５ｘｉｏ’細胞／　ｍ　Ｉｔ の標的細胞を用いたとき、先に議論した比と同様である。

イン・ビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）での使用の場合、本発明の両面に対し、単一のＰ ＢＭＣ群を使用するのが簡便である。結果的にそのように、単一の調製物を用い る場合、その細胞は典型的に、先に議論した、ＩＬ−２と共にそれらを用いたと きの約２４時間以内の活性化のときと同様、先に議論したように、抗Ｔ３を用い たとき、３から５日間以上の活性化が行なわれる。適当な二特異的ハイブリッド 及びモノクローナルバラトビツク分子を混合し、それら各々の細胞をコートし、 ２つのタイプの武装化活性化エフェクター細胞を形成する。活性化及びコーティ ングの順序は、これら２つのタイプの武装化活性化エフェクターが、最終的組成 物中に存在し、かつ、その組成物及び、その武装した活性化エフェクターが、そ の受容哺乳動物に導入される際、ＩＬ−２を含まない限り、特に重要ではない。

従って、この２つの様式で、実質的に同時に、すなわち、互いに１５分以内に投 与される、分離した白血球調製物又は単一の調製物由来のものが、イン・ビボ（ ｉｎ　ｖｉｖｏ）又はイン・ビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）で標的細胞に投与される 。

また、その２つの様式の各々は、別々に、最初の投与後、約０時間から約３日後 に投与される。また、各々、繰返し投与も行なわれる。

別の態様において、ベレツ（Ｐｃｒｅｚ）等（（１９８６年）、ジャーナル・オ ン・エクスペリメンタル・メデイシン（Ｊ、　［ｉｘｐ、　Ｍｅｄ、　）、１６ ３巻、１６６〜１７８頁）により報告されているものと１．刺着の操作が利用さ れた。つまり、ＰＢＬ又はＰＢＭＣのような白血球調製物を、約２４から約３６ 時間、３７℃、生物学的条件下で、ＩＬ−２で活性化する。その後ＩＬ−２活性 化細胞を、ここで議論されている二特異的ハイブリッド分子でコートする。

これらの研究者は、ＰＢＭＣを、セファデツスクＧＩＯカラムに通しついでハス コック（Ｈａｔｈｃｏｃｋ）等の方法に従かい（（１９８１年）、ニューＥｌ− り一？−セル　デツカ−社版（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｃｃｋｅｒ。

Ｉｎｃ、　）ハースコウィッツ＜Ｈｅｒｓｃｏｗｉｔｚ）等編１マクロファージ 実験マニュアル：採取、特性化及び機能”７２３〜７４５頁）単細胞のＰＢＭＣ 群をデプリートし、また、Ｌｅｕ　−１ｌ　ｂ　（ＣＡ州、マウンテン中ビュー 、ベラキン、ディッキンソン・アンド・カンパニ（Ｂｅｋｉｎ、口１ｃｋｉｎｓ ｏｒ＋　＆　Ｃ口、））及びウサギの補体とインキュベートすることにより、Ｌ ｅｕ−１１’細胞をデプリートした。その様な除去操作は、単細胞及びＬｅｕ− １１’細胞が有効なエフェクターであることから、ここでは必要ではない。

ベレツ（Ｐｅｒｅｚ）等は、それらのデプリートした細胞群を、１０＠細胞／　 ｍ　１の濃度に対し、ＩＯＵ／ｍｆのｒｌＬ−２を用い、２４時間使って活性化 した。より長い活性化には、同量のｒｌＬ−２を毎日投与した。ベレン（Ｐｅｒ ｅｚ）等量の方法を分離投与として用いた場合、他の著者により議論されている 活性化法に従うこともできる。しかし、エフェクター細胞の単一投与が行なわれ る場合、先に議論したＩＬ−２活性化がその後行なわれる。

細胞が一度活性化されると、先に議論したように、ＩＬ−２含有培養媒体から、 それらを分離し、さらに、二特異的ハイブリッド分子でコートした。そのコート した、ＩＬ−２活性化エフエクター細胞を、その後、すでに議論してきた、標的 細胞と混合、接触及び維持する。これらのコートした活性化細胞は、活性化後約 ８時間から約２４時間以内に用いることが望ましく、先に議論した武装、抗Ｔ３ 活性化エフェクター細胞と同様に投与されつる。

ハイブリッドを用いた、先に議論した２つの態様において、エフェクター細胞を 、約１０”〜１０ｓ細胞当り、精製ハイブリッド約５マイクログラムの比で、ハ イブリッドでコートする。

毒性量のＩＬ−２と同様に、いかなる未結合のハイブリッドを、洗浄により除去 （分離）できるので、活性化、武装（コート）Ｔエフェクター細胞含有組成物か ら、未結合ハイブリッドを除去する必要はない。

非活性化エフェクター細胞と用いるとき、二特異的ハイブリッド分子は、細胞毒 性量与えても、より小さい細胞溶解効果しかみられないことも注目に値する。従 って、細胞毒性量の二特異的ハイブリッド分子も、その各々の活性化エフェクタ ー細胞を、それらでコーティングすることなしに投与することができる。

先に述べたように、その二特異的ハイブリッド分子は、標的細胞のエピトープと 免疫反応を起こすが、先に述べたＩｇＧ１ＩｇＧ２ａ　、ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ ３バラトビツク分子と結合する抗原上のエピトープを妨害することはないが、こ れとは異なるバラトープ同様、市販されているＭａｂ　０ＫＴ３及びＬｅｕ−４ により提供されうるような抗−Ｔ３バラトープを含んでいる。抗Ｔ３Ｍａｂに加 えて、その二特異的ハイブリッド分子に有用な代表的標的細胞結合Ｍａｂを、最 初に議論した方法で使用する代表的関連Ｍａｂと共に表２にリストした。

ＡＤＣＣ又は補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）も、そのハイブリッドを必要としない ので、ＩｇＭＭａｂのバラトビツク領域、例えばＦ　ａｂ、、Ｆ　（ａｂ　’　 ）　Ｆ　（ａｂ　’　）又はＦ（ａｂ’）ｚ抗体領域も、そのハイブリッドに使 用できる。

二特異的ハイブリッド分子の標的バラトープＩＭａｂ”　ＡＴＣＣ番号３　結合 抗原４　関連Ｍａｂ’　代表的標的−ＭＢ　３．６　ＨＢ　８８９０　ＧＤ　３ 　１４．１８　Ｍ　２１メラノーマ １４．１８　ＨＢ　９１１８　ＧＤ　２　１１　Ｃ６４Ｍ　２１メラノーマ Ｒ２４ＧＤ　３　９．２．２７　ＦＭ　９メラノーマ １２６’　ＨＢ　８５６８　Ｇｏ　２　ＭＢ　３．６　Ｍ　１４ＣＬＩＩ　６” 　ＩＩＢ　８２３２　結腸がん　ＩＩＴ　２９／２６　ＨＴ　２９結！Ｉ！７ヂ ノカルシノーマ ＣＬＨ４７９”　ＨＢ　８２４１　結腸がん　ＨＴ２９／２６　Ｓ祉４８結腸が ん １９．９’　ＣＲＬ　８０１９　ＣＥＡ　ＨＴ　２９／２６　ＳＷ　１２２２結 腸がん腫 Ｆ　３６／２２　１１８８２１５　胸部がん腫　ＨＴ　２９／２６　ＢＴ−２０ 胸部がん腫 ＣＬＮＨ５”　肺がん腫　１４．１８　Ｔ　２９３肺がん腫 Ｔ　４３’！　ＨＢ　８２７５　膀胱がん　Ｔ１６　Ｔ２４ｇｐ　８０，６０　 膀胱がん腫 １６−８８’！　結腸がん１１　ＨＴ２９／２６　Ｓ賛４０３結腸がん腫 １、　この二特異的ハイブリッド分子はＴ３抗原と免疫反応する０ＫＴ３のよう な第１の抗Ｔ３Ｍａｂバラトープ及び、標的細胞の表面上に発現するエピトープ と免疫反応する第２のバラトープを含む。

２、Ｍａｂ＝標的エピトープ結合パラトープを含むモノクローナル抗体の公表さ れた名称又は記号。ＭａｂＭＢ３．６．１４．１８、Ｒ２４及びＦ　３６／２２ に対する引用文献は表１の脚注に示した。

３、ＡＴＣＣＮα＝示したＭａｂを分泌するハイブリドーマの報告されているＡ ＴＣＣ受理番号。

４、　ノート２のＭａｂと結合する抗原５、関連Ｍａｂ＝先に議論した方法で用 いた、本来のＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３モノクローナル・ バラトビツク分子。

６、代表的標的＝ハイブリッド分子の第２パラトープと免疫反応し、かつ、関連 Ｍａｂと反応する、代表的標的細胞。

７、チェレジｘ　（Ｃｈｅｒｅｓｈ　）等（１９８６年）、ジャーナル・オン・ セルラー・バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、）　、１０２巻、「；３８ 頁。

８、米国特許第４．５７９．８２７号。

９、米国特許第４．３４９．５２８号。

１０．１９８４年、９月１２日刊行、ヨーロッパ特許出願番号８４４００４２０ 、０号、刊行番号第０１１８３６５号。

１１、特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８３１００７８１、ＷＯ３３１０４３１３゜１２． １９８４年、９月１９日刊行、ヨーロッパ特許出願番号８４１０２５１７．４号 、刊行番号第０１１８８９１号。

１３．１９８５年、８月７日刊行、ヨーロッパ特許出願番号８５３００６１０、 ４号、刊行番号第０１５１０３０号。

１４、米国特許第４，５２２，９１８号。

１５、米国特許第４．４５５．２９６号。

このように、本発明のこの方法の好ましい態様において、ＰＢＬ及びＰＢＭＣの ような白血球調製物中にみられるようなＴ３”及びＴ８”細胞を含むＴ細胞群を 、（８〕ある量のモノクローナル抗Ｔ３抗体と共に、スルなくとも、培養物中の 総細胞数を維持するか又は増加しつつ、そのＴ３’細胞数が約７５パーセント減 少するのに十分な時間、水性培地中で培養するか、又は（ｂｌ、活性化量のＩＬ −２を含む水性培地中で培養することにより活性化し、活性化エフェクターＴ細 胞を作る。

その後、活性化エフェクターＴ細胞を、洗浄することにより、抗Ｔ３抗体又は、 ＭＬ−２と分離する。水性媒体中、その分離した、活性化Ｔエフェクターを、Ｔ ３抗原と免疫反応する第１のバラトビツク領域（抗Ｔ　３　Ｍａｂ）及び、標的 細胞表面上に発現するエピトープと免疫反応する第２のバラトビツク領域を含む 二特異的ハイブリッド分子と、混合し、かつ接触させる。その混合、接触させた 活性化エフェクターＴ細胞及びハイプリントを、そのハイブリッドが活性化エフ ェクターＴ細胞に結合しくその活性化エフェクター細胞をコートし）、そして、 二特異的ハイブリッド武装した（抗Ｔ３）、活性化エフェクターＴ細胞ができる のに十分な時間、生物学的条件に維持する。これらの武装細胞を典型的には、洗 浄することにより、媒体から分離し、収集する。

二特異的ハイブリッド武装した、活性化エフェクターＴ細胞を、水性の生理学的 に許容しうる希釈媒体に分散し、その後、細胞毒性量のこれら武装活性化Ｔ細胞 を含む、これら組成物のある量を、標的細胞と混合及び接触させる。先に議論し たように、この接触を、標的細胞が死滅するのに十分な時間、生物学的条件で維 持すＴ細胞群は、ＦＡＣ３で得られるような、予め分別したものである。活性化 されるＴ細胞群は、先に議論した方法で使用した白血球群中に存在することがよ り望ましい、従って、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ又は１ｇＧ３　Ｆｃ　 Ｍａｂレセプターを含むＩＬ−２活性化可能Ｌｅｕ−１１”エフェクター及び、 抗Ｔ３−又はＩＬ−２活性化可能Ｔ３◆、Ｔ８”　Ｔ細胞エフェクターは、同白 血球群の一部である。

ジシアロガングリオシドＧＤ２及びＧＤ３を、その表面に発現する・Ｍ２１メラ ノーマ細胞を、標的細胞として用いる典型的操作において、ＰＢＭＣのような白 血球調製物を、抗Ｔ３Ｍａｂとして０ＫＴ３を用い、５日間、８Ｘ１０’／＋ｌ ｔｌのＰＢＭＣ，６００ｎｇ／ｗ＊の０ＫＴ３、水性媒体としてＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ を用いた、生物学的条件下で活性化する。その後、活性化細胞を、洗浄により０ ＫＴ３と分離する。

分離した抗Ｔ３活性化細胞を、約ｌＸｌ０’細胞／１Ｉａｌとなるように水性媒 体に分散しさらに、５００Ｕ／ｍｊ？となるようにｒｌＬ−２を混合する。でき た細胞懸濁液を、３７℃で４時間、生物学的条件に維持し、ＩＬ−２活性化細胞 群を作る。抗Ｔ３活性化Ｔエフェクター細胞及びＩＬ−２活性化エフエクターを 含む、この細胞を洗浄により、ｒｌＬ−２と分離する。（この分離で、抗Ｔ３Ｍ ａｂも活性化細胞から分離される。）その後、この分離した活性化エフェクター 細胞含有調製物を、約２００μｇ／ｍＩ！濃度の、ＡＴＣＣ受理番号ＨＢ９１１ ８のハイプリドーマから分泌されるＭａｂｌ　４．１８のような抗ＧＤ２Ｍａｂ 及び、第１のパラトビツク領域がＯＫ　Ｔ　３　（ＡＴＣＣＣＲＬ　８００１） のもので、第２のパラトビツク領域が抗ＧＤ３Ｍａｂ　ＭＢ３．６（ＡＴＣＣＨ ８８８９０）のものである、二特異的ハイブリッド分子と共にインキュベートし 、コート化した、武装活性化エフェクター細胞を含む水性組成物を作る。細胞毒 性量の武装化ｒｌＬ−２活性化エフェクター及び武装化抗Ｔ３活性化エフェクタ ーを含む、効果量の組成物を、標的細胞の溶解に必要な十分な時間、例えば４時 間、Ｍ２１メラノーマ標的細胞と共にインキュベートする。

■、結果 以後議論する特別の結果は、ヒトのｒｌＬ−２を、ヒトの末梢血液単核エフェク ター細胞のような、白血球と、比較的に簡単な、生体外でのインキュベーション することは、イン・ビトロ　（ｉｎｖｉＬｒｏ）でのヒトのメラノーマ及び神経 芽細胞腫細胞、及びイン・　“ビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）でのヒトのメラノーマの ナチュラルキリング及びＡＤＣＣ仲介細胞溶解を著しく増加する。ＩＬ−２活性 化エフエクター細胞は、使用されたＰＢＭＣを、他の研究者が述べている稈長時 間インキュベートしなくても、リンフ才力イン活性化キラー　（ＬＡＫ）細胞に なりうるき考えられる（イロン（Ｙｒｏｎ）等、（１９８０年）ジャーナＪｌｚ −オン・イムノロジー（Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．　）、１２５巻、２３８−２４ ５頁；ロツゼ（Ｌｏｔｚｅ）等（１９８１年）、キャンサー・リザーチ（（：ａ ｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）４１巻、４４２０〜４４２５頁；グリム（Ｇｒｉｍｍ）等 、（１９８２年）、ジャーナル・オン・エクスベリメンタル・メディシン（Ｊ、 Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、）　、１５５巻、１８２３−１８４１頁；グリム（Ｇｒｉｍｍ ）等、（１９８３年）ジャーナル・オン・エクスベリメンタル・メデイシン（Ｊ 、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、）　１５８巻、１３５６〜１３６１頁）。別に、これらエフ ェクター細胞は、ＡＤＣＣにも効果があるので、活性化ナチュラルキラー（ＮＫ ）細胞と見ることもできる。

ここに示す結果は、６０回以上の独立したＡＤＣＣ検定で分析した、２０名の別 々の提供者由来のＰＢＭＣから得たちのである。

全ての試験において、その結果は、明白に、かつ、同様に、ヒトのＰＢＭＣをｒ ｌＬ−２に、比較的低い量かつ、簡単に接触させることにより、生体外で活性化 させることは、ヒトのメラノーマ及び神経芽細胞腫標的細胞のナチュラルキリン グ及びＡＤＣＣ仲介細胞溶解の両方を増加させることを示している。

また、これらの結果は、Ｍａｂｌ　４．　１８　（抗ＧＤ２）及びｌＩＣ６４（ 抗ＧＤ３）は、ｒＩＬ−２による活性化の有無にかかわらず、エフェクター細胞 を効果的に武装化し、その細胞に各々の標的を指向させることを示している。加 えて、正常な提供者由来のＰＢＭＣにより、ナチュラルキリング及びＡＤＣＣを 増加させる、ｒｌＬ−２を用いた、同様の生体外プロトコールは、メラノーマ患 者由来のＰＢＭＣでも有効である。ＰＢＭＣの細胞溶解の増加が、３乗倍のｒＩ Ｌ−２の投与でも同レベルであったことは、１度、活性化のスレッシユホールド を越えると、もはや、さらにｒｌＬ−２を加えてもさらに、細胞溶解が促進され ることはないことを示しており、このことは重要なことである。

また、広い範囲のＡＤＣＣ活性が、２０名の提供者由来のＰＢＭＣで観察された が、各提供者のＰＢＭＣのＡＤＣＣ活性の相対的レベルは、再現的パターンを示 したことも重要である。ある場合には、生体外活性化及びエフェクター標的化Ｍ ａｂを用いたときはいつも、明らかな共働性が見られた。他の場合には、特にイ ン・ビ）　０　（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で、ｒＩＬ−２誘導の増加は、ｒＩＬ−２ 誘導のナチュラルキリングと、ｒｌＬ−２不在下で、ＡＤＣＣによって生ずる別 のキリングとの、正味の細胞溶解を合せた効果のように思われる。各々の事象に おいて、生体外ｒｌＬ−２活性化の使用は、有効であることが示され、また、そ れにより、イン・ビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）でのその使用は、ｒＩＬ−２の系統的 処理に伴う毒性を回避することができる。

ｒｌＬ−２非存在下で維持される、溶解活性の期間も、各提供者によって様々で ある。しかし、ｒｌＬ−２活性化ＰＢＭＣを用いて得られた活性化データは、Ａ ＤＣＣキリング法で有効な、何人かの提供者のエフェクター細胞（ＩｇＧ１％Ｉ ｇＧ２ａ。

ＩｇＧ２ｂ又は１ｇＧ３のＦｃレセプター含有、ＩＬ−２活性化エフエクター） が一度活性化され、ついで、ｒｌＬ−２を除去されても、それらは、その活性化 状態を発展、増加しつづけることを示している。

さらにそれらの結果は、正常な提供者の間で種々のレベルの細胞溶解活性レベル が存在することを示している。またこのことは、リンフ才力イン誘導の増加によ って達成される、溶解活性の潜在的レベルの場合も同様であると思われる。また 、この溶解能力の多様性は、ヒトのエフェクター細胞より応答性がかなり悪いマ ウスのエフェクター細胞に関する以前なされた観測によっても示されている（ホ ンシフ（Ｉｌｏｎｓｉｋ）等（１９８５年）ナチュラル・イムニティー・アンド ・バイオロジカＪし・レスポンス（％ＢｊｕｒａｌＩｍｍｕｎｉｔｙ　ａｎｄ　 ［ｌｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ）　４巻、２５３頁）。また、マウ スのエフェクター細胞を、ｒｌＬ−２と短期間（４時間）インキュベートしても 、それらのヒトのメラノー７細胞の溶解能は有意に増加しなかった。

種々の提供者由来のＰＢＭＣのキリング能力の多様性とは関係なしに、正常人又 は、メラノーマ患者から得たそれらの細胞の細胞毒性活性は、比較的小量のｒｌ Ｌ−２と単時間生体外インキュベーションすることで、−貫して、また再現性よ く増加した。これらの結果は、ヒトのＰＢＭＣをｒｌＬに短時間（５分間）Ｂら すと、ヒトのＡ３４９及びに５６２赤白血球標的に関するナチュラルキリングを 増加することを示した、スベデルスキ（Ｓｖｅｄｅｒｓｋｉ）等（（１９８４年 ）ジャーナル・オン・イムノロジー（Ｊ、　ｉ＋ｎｍｕｎｏ１．）１３３巻、７ １４〜７１８頁）の結果と一致している。

Ａ、メラノーマに付随する、ジシアロガングリオシドＧＤ３は、イン・ビポで、 関連する標的抗原を従供する。

ＧＤ３が免疫治療のための標的構造として効果的に使用しうるかどうかを決める ための研究が、異種組織移植ヌードマウスモデルで始まった＠２．５Ｘ１０”個 のＭ１４ヒト・メラノーマ細胞をする。Ａ３７５−Ｐヒト・メラノーマ細胞を用 いた別の研究では、５ｘｉｏ’個の細胞を、そのような動物の右腹部に皮下注射 している。最初のメラノーマ移植後、２．４．９．１１．１４．１６．２１及び ２３日後にＰＢＳ又は、水性の生理学的に許容しうる希釈媒体としてのＰＢＳ中 の７５マイクログラム（μｇ）のＭａｂＭＢ３．６　（抗ＧＤ３）を皮下注射に よる動物の治療を行った。

上述の治療法は、Ｍ１４メラノーマのイノキュレーション後４０日まで、腫瘍の 樹立を抑制するのに成功し、その細胞の９９パーセントが、ＦＡＣ３分析による と、Ｍａｂ抗ＣＤ３と反応した。しかし、この処置は、Ａ３７５−Ｐメラノーマ 細胞に対して行ったとき、その１３パーセントしか、抗ＧＤ３Ｍａｂと反応しな いことから、効果的ではなかった。

加えて、Ｍ１４異種組織移植体の場合の増殖の抑制は、７０日間でその動物の５ ０パーセントにまでＬｌｆ＆が発達してしまったことから、中間的なものである ことが分った。そのような腫瘍は組織培養中に再樹立し、ひきつづ＜　ＦＡＣ３ 分析でＧＤ３発現が確認された。

再樹立したこれら１ｉＩＩＸのうちのおよそ９５％は、ＧＤ３を発現した、しか し、６個の腫瘍のうちの５個の腫瘍由来の細胞は、平均螢光強度の著しい減少（ ５０％）、すなわち、組織培養で、維持された親のＭ１４細胞系列と比較してＧ Ｄ３密度の５０パーセントの減少が示された。これに対し、ＨＬＡクラスＩ抗原 及びメラノーマ付随プロテオグリカンの発現は、クラスｎＨＬＡ抗原の発現にお ける非常に僅かな変化はあったが、親のＭ１４細胞系列のものと同様であった。

従って、Ｍａｂ　ＭＢ３．６で処理した無胸腺症（ｎｕ／ｎｕ）マウス中での、 これらメラノーマ腫瘍の連続増殖は、ＣＤ３陰性変異体の免疫選択によるもので はなく、むしろこのジシアロガングリオシドをより低いレベルで発現する変異体 によるものである。これら腫瘍細胞は、おそらく、注入される抗体量や治療時間 が不十分なため、ある細胞は、治療をまぬがれて、一時的にせよ、ＧＤ３を変化 させているのかもしれない。これらの結果は、Ｍａｂ治療のみの別法として、エ フェクター細胞と組合せて抗ＧＤ３　Ｍａｂを用いる、いくつかの最初のイン・ ビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）の研究を喚起させる。

Ｂ、抗ＧＤ３で武装したＮＫ活性を有するエフェクター細胞は、ＡＤＣＣにおい て顕著な効果を示す。

Ｍａｂ　ＭＢ３．６で武装したＮＫ活性を有する細胞は、ヒト、メラノーマ腫瘍 細胞標的に対するＡＤＣＣを著しく増加させ、このことは、フラノ−マイ１随プ ロテオグリカンを指向するＭａｂ９゜２．２７　（ＩｇＧ２ａ）と組合せたエフ ェクター細胞により達成される、イン・ビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）における腫瘍抑 制に関する、以前に報告されている効果の説明を支持している（シュルツ（Ｓｃ ｈｕｌｚ）等、（１９８５年）、ジャーナル・オン・エクスペリメンタル・メデ ィシン（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、）　１６１巻、１３１５〜１３２５頁）。

その後、ＮＫ活性を有する細胞が、ヒト・メラノーマ標的細胞に対し、ＭａｂＭ ８３．６　（抗ＧＤ３）を、マウスの単核膵臓細胞を使用したとき、ＡＤＣＣを 増加させる主要なエフェクター細胞群であるかどうかを測定した。ＮＫ欠損Ｃ５ ７Ｂ　Ｌ　／　６ｂｇＪ／　ｂｇ／Ｊマウス由来の膵臓細胞の使用は、ＮＫ活性 Ｃ５７ＢＬ／６又はＮ　Ｉ　Ｈ（ｎｕ／ｎｕ）マウス由来の膵臓細胞で観察され る陽性のＡ［ｌＣＣを示さなかった。従って、ＮＫ活性をもつ細胞は、これらの 研究の重要なエフェクター細胞群であると考えられる。

正常な提供者又は、最近切除手術を受けたメラノーマ患者由来のヒト単核細胞は 、Ｍ２１メラノーマ細胞に対するＡＤＣＣを効果的に仲介することが報告されて いる（チェレッジｓ　（Ｃｈｅｒｅｓｈ）等（１９８５年）プロシーディング・ イン・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、）　ＬＩＳＡ８２巻、５１５５〜５１５９頁）。ＮＫ細胞に富む 細胞群を得るために、不連続パーコール勾配で分画したヒトのＰＢＬを用いた、 現在進行中の研究の結果は、螢光活性化セルソーター（ＦＡＣ３）分析でＬｅｕ −１１陽性（Ｌｅｕ−１１”）を示す、ＮＫリッチな大顆粒リン細胞を５０パー セント以上含む両分中に、ＡＤＣＣ活性の明らかな増加が確認された。これらの 研究において、■、ＧＬリッチ画分は、エフェクター／標的比を２００８１にし たときに最高６５パーセントの特異的溶解しか生じなかった単核ＰＢＬに比べ、 エフェクター／標的比、わずか６：１で８０パ一セント以上の特異的溶解を生じ た。

ＮＫ欠損及びＮＫ活性マウスから得たエフェクター細胞を使った研究結果と、高 いＮＫ活性を有するＬＧＬを豊富に含むヒトのＰＢＬを用いて得られたデータと を組合せると、Ｉ　ｇＧ３サブクラスの抗Ｇ　Ｄ　３　Ｍａｂにより仲介される 抗体性細胞性細胞毒性におけるそのような細胞の中枢的役割を示唆していること がわかる。

抗ジシアロガングリオシドＭａｂを用いたときに得られたこれらの励みとなるＡ ＤＣＣの結果は、さらに、そのような抗体によって指向される、“武装化した” 活性化及び非活性化エフェクター細胞を用いることにより、そのような治療方法 の、イン・ビボ（ｉｎｖｉｖｏ）での評価同様、イン・ビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒ ｏ）での評価も勧める。

Ｃ，ｒｌＬ−２活性化の有無にかかわらず、ガングリオシドＧＤ２及びＧＤ３に 対するモノクローナル抗体は、特異的細胞仲介溶解を誘発する。

ジシアロガングリオシドＧＤ２及びＧＤ３の両方を発現するメラノーマ細胞系列 Ｍ２１及びＧＤ２Ｂ性であるがＧＤ３陰性である、神経芽細胞腫細胞系列、５Ｋ −Ｎ−ＡＳを各々Ｓ　＋　Ｃｒで標識し、標的細胞として用いた。３種のＩ　ｇ Ｇ３サブクラスのＭａｂを、ヒトＰＢＭＣを標的とするのに用いた。すなわち、 １１Ｃ６４（抗ＧＤ３）　、１４．１８　（抗ＧＤ２）及びＪ６０６　（抗レバ ン及びインシュリン）である、下記の表３に示すように、ＧＤ３及びＧＤ２を指 向するＭａｂで武装したエフェクター細胞は、その各々の標的に精妙な特異性を 示したが、コントロールのＭａｂ　Ｊ　６０６で武装した細胞は、非反応性であ った。

標的−エフェクター混合物へのｖＩＬ−２の添加〔ミリリフドル当り５００ユニ ツト〕は、これら武装したエフェクター細胞群による非特異的な活性化は起こさ ない。標的細胞のみと、ｒｌＬ−２とのインキユベーシヨンにより誘導されるバ ンクグランド溶解は、常に約２パーセント以下であった。

表　３ ヒト・メラノーマ及び神経芽細胞Ｉｌｌ細胞の、抗ＧＤ２及びＧＤ３性細胞仲介 キリングの特異性、１Ｍ２１メラノーマ標的２ ＳＫ−Ｎ−Ａｓ 神経芽細胞腫標的 指示したＥＣＴ比での比溶解率 ＰＭＢＣ＋ 五ユ’　１００　５０　２５　１００　５０　２５ｒｌＬ−２２４１６７１９９ ７ ＭａｂｌｌＣ６４４０２１７４００ ＭａｂｌｌＣ６４＋ｒｌＬ−２　６７　５４　２８　１４　９　４Ｍａｂ１４． １８　４７　１９　７　２９　８　４Ｍａｂ１４．１８＋ｒＴＬ−２６６４２’ ２０　４６　２５　１３Ｍａｂ　Ｊ６０６　３　４　３　３　１　１ＭａｂＪ６ ０６＋ｒｌＬ−２２４１６７１９９３１、示されたエフェクター／標的細胞比（ Ｅ　：　Ｔ）での、ヒト・メラノーマ及び神経芽標的細胞に関する、Ｍａｂ　１ １Ｃ６４（抗−ＧＤ３）及び１４．１８（抗ＧＤ２）及び正常なヒト・エフェク ター細胞により仲介されるＡＤＣＣ，比活性率は、４時間検定中、ｒＩＬ−２存 在下、又は不在下、％　ｌ　Ｃｒ標識標的について測定した。

ＭａｂＪ６０６はいずれの標的細胞系列にも結合しなかった。

２、Ｍ２１メラノーマ細胞は、ＧＤ２及びＧＤ３を発現している。

３、　３に−Ｎ−ＡＳＩＢ胞はＧＤ２のみを発現している。

４、いずれの場合も、モノクローナル抗体濃度は２５μｇ　／　ｗＩｊ！　。

ｒｌＬ−２の量、５００　Ｕ／　ｍｌ！及び標的細胞数は、５Ｘ１０’／ｍｌで 行った。

Ｄ、ＮＫ及びＡＤＣＣ細胞溶解活性は、少量のｒｌＬ−２で活性化される。

２人の別々な提供者のＰＢＭＣの溶解活性能力を分析するために、４時間ＡＤＣ Ｃ検定中、５０Ｕ／醜ｌから５００００Ｕ／ｍＡの範囲でｒｌＬ−２を投与した 。最低投与量の５０Ｕ／ｍｆｆ１という値は、それより低い濃度のｒｌｌ、−２ の投与は、ＰＢＭＣに効果を及ぼさないことから選択した。

これらの提供者からは、ＡＤＣＣ検定において、２５μｇ　／ｅｘ　１のＭａｂ 　１１　Ｃ６４と組合せて、５０Ｕ／ｍＡ！から５００００Ｕ／■ｌの範囲のｒ ＩＬを添加したとき、溶解活性において、はとんど同じ程度の、３０００倍以上 の活性化が観察された。これらのデータを表４に示す。

表４ ナチュラルキリング及びＡＤＣＣ活性におけるｒＩＬ−２濃度の増加の効果１ ｒＩＬ−２ｉｎ　Ｕ　ｗｒｉｔ −四−ユ四−ユ並ｌ−堕甜し］化１並−」ル婁曵エフェク　−：　−ゲット　ナ チュラルキリング（％　）・勺！５０：ｌ　１０　１２　１１　１０　１２　１ ３２５：１　５　８　４　５　５　７ ６：１　１　３　０　３　２　４ ＡＤＣＣ（％　”’　”）　” ５０：１　５８　５６　５９　５２　５８　５７２５：１　３８　４２　３５　 ３５　４０　３９６：１　１９　１９　１８　１７　１９　１６１、Ｍ２１ヒト ・メラノーマ細胞を”Ｃｒで標識し、Ｍａｂ１１Ｃ６４の存在下又は非存在下、 ヒトの末梢血液単核細胞でチャレンジした。３０００倍以上の濃度で、４時間検 定にｒｌＬ−２を添加し、その後、ｒｌＬ−２そして、またはＭ　ａ　ｂを受容 したＰＢＭＣに対し、比溶解率を測定した。

２、　ｒＩＬ−２非存在下での、ＰＢＭＣによるナチュラルキリングは３〜５％ の範囲であった。

３、Ｍａｂ　１１Ｃ６４、ｒｌＬ−２及びＰＢＭＣの混合による特異的溶解。

提供者１の場合、エフェクター／標的細胞比２５：１のとき、ｒｌＬ−２により 誘導されるＮＫ溶解における増加は、４から８％の範囲であった。ＭａｂｌｌＣ ６４で武装した非活性化ＰＢＭＣで得られる溶解は、１６パーセントで、一方、 組合せ様式では（ＰＢＭＣ＋ｒｌＬ−２＋Ｍａｂ　１１Ｃ６４）３５パーセント から４２パーセントの範囲の値であった０組合せ様式では、正味平均３８パーセ ントの溶解、すなわち、ｒｌＬ−２なしの武装エフェクター細胞の１００パーセ ント増しであった。提供者１に対するこの相乗作用を、２つの別の研究で繰り返 した。この同様の研究において、提供者２は、提供者１で観察されるレベルと同 じ、ｒｌＬ−２ｔ１度３樅の範囲に渡って細胞溶解活性を示した。

Ｅ、ｒｌＬ−２によるヒト単核細胞の細胞溶解性の促進、ＡＤＣＣの研究は、比 較的高いＥＡＴ比１００：１での、１５分間又は４時間のｐＢＭｃ４びｒｌＬ− ２の生体外インキュベーションは、ＡＤＣＣ検定において、９５．５パーセント 及び９３．４パーセントという同程度のレベルのＭａｂ性キワキリングじた。

ｒＩＬ−２による活性化なしでのＭａｂｌｌＣ６４性キンリグは７５パーセント であった（図２）。

さらに、より低いＥＡＴ比２５：１での、この細胞溶解促進の試験で、溶解の活 性化は、迅速に起こることが明らかになった。

特に、ＡＤＣＣ溶解活性は、３０分間に２４パーセントから４４パーセントに増 加し、４時間のインキュベーションの間に最高６４パーセントにまで増加しつづ けた。別の研究では、ｒｌＬ−２活性化により誘導される細胞溶解の増加は、単 核エフェクター細胞とのインキュベーション１０分後に観察された。

Ｆ、ヒト・メラノーマ標的細胞のナチュラル・キリング及びＭａｂ性キワキリン グｒｌＬ−２活性化により増加する。

これらの研究は、ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）とｒｌＬ−２との短時間イ ンキュベーションは、メラノーマ標的細胞に対するＡＤＣＣを増加することを証 明した。ここでは、これらエフェクター細胞を３人の提供者から入手し、次に示 す５つのグループについて、し時間検定法で、５ＩＣｒ標識Ｍ２１標的細胞の溶 解活性を検定した：（ａ）ｒｌＬ−２のみ；（ｂ）ＰＢＭＣのみ；　（Ｃ）　Ｐ ＢＭＣ＋２５＃ｇ／　ｍｊＭａｂ　ｌ　ＩＣ６４；（ｄｌＰＢＭｃ＋２５０ｕ／ ５ｊｒＩＬ２；及び（ｅ）ＰＢＭＣ＋　２５　ＩＩ　ｇ／　ｗｊ！Ｍａｂ　１１ 　Ｃ６４＋２５０ｕ／　ｉｍｊｒＩＬ−２の複合様式。

ＰＢＭＣのみ、又は、抗体とインキュベートした、あるいは、ｒＩＬ−２で活性 化したＰＢＭＣと比較すると、ＰＢＭＣを、ｒＩＬ−２及びＭａｂｌｌＣ６４と 共にインキュベートした時はいつも、全て３名の提供者の細胞について、明らか な溶解の増加がみられた。ある提供者のエフェクター細胞から得た代表的結果を 図４に示した。標的細胞とｒｌＬ−２のみをインキュベートしたときに誘導され るバックグランド溶解は、約２％以下であった。

Ｇ、生体外でのｒｌＬ　２活性により誘導される細胞溶解の増加は、それが不在 となっても維持される。

ＰＢＭＣとｒｌＬ−２との生体外４時間インキュベーションは、ｒｌＬ−２非存 在下でも、少なくとも２０時間維持される、ＮＫ仲介溶解及びＭａｂ性溶解ＣＡ 　Ｄ　ＣＣ＞の両溶解活性に著しい増加をもたらす（表５）０次に示す研究では 、ＰＢＭＣを、生体外で４時間ｒ　ＩＬ−２（５００ｕ／　ｍｌ）とインキュベ ートし、ｒｌＬ−２がなくなるまで洗浄し、ついで、７．５％ＣＯを加温雰囲気 下、３７℃で、ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清中、ｒｌＬ−２の非存在下、さら に２０時間インキュベートする。その後、同提供者のＰＢＭＣを、ｒｌＬ−２の 活性化を行なうことなしに、同条件で、２４時間インキュベートしたもの又は、 同提供者から、検定と同じ日に得た新鮮なＰＢＭＣの効率と比較することにより 、そのＡＤＣＣ検定法における溶解活性を検定した。これらの結果を下の表５に 示す。

表５ ＰＲ？ＩＣのｒｌＬ−２での前処理によるＡ［ｌＣＣ細胞溶解活性の増加１下記 Ｅ：Ｔ比での溶解率 一処一旦！　１００：Ｉ　ＪＬ二ＬＪｉ辷ＬＡ　５６　（３）”　３１　（３） 　１４　（２）Ｂ　６５　（１３）　４７　（７）　２７　（４）Ｃ８３（７７ ）　７０　（５８）　５２　（２３）Ｄ　８（１（７６）　８０　（５２）　６ ０　（２３）１、指示したエフェクター／標的細胞比を用い、フォードルブリケ ート・ウェル中で、５ＩＣｒ標識Ｍ２１ヒト・メラノーマ細胞について、その細 胞溶解活性を検定した。Ｃｐ１１測定における標準偏差は５％を越えなかった。

２、ＰＢＭＣ（５Ｘ１０’細胞／ｌ１１）の処理は次のように行った；　（Ａ） 新鮮なＰＢＭＣ；　（Ｂ）ＰＢＭＣを２４時間３７℃に維持した；　（Ｃ）ＰＢ ＭＣを５００ｕ／＋ｗｊ！のｒｌＬ−２で４時間前処理し、洗浄後、ｒｌＬ−２ の非存在下で、２０時間、３７℃に維持した；及び（Ｄ）ＰＢＭＣを３７℃で２ ４時間、５００ｕ／ｍｌのｒＩＬ−２存在下に維持した。全ての処理は２００μ ｇ／Ｉ１１のＭａｂ　１１Ｃ６４を含んでいる。

３、　カッコ内の数字は、Ｍｂ　１１Ｃ６４非存在下での溶解率である。

上の表５のデータは、ＰＢＭＣのｒＩＬ−２による（５００ｕ／ｍｊり４時間生 体外活性化と、ひきつづ（２０時間のｒｌＬ−２の不在は、溶解活性の増加をま ね（（７７％のＮＫ溶解、８２．７％のＭａｂ　１１Ｃ６４性キリング）ことを 明らかにした。この溶解の増加は持続し、そして２４時間、ｒｌＬ−２に連続的 にさらしたＰＢＭＣによって生じるものと同程度であった（ＮＫ溶解７６％、　 Ｍａｂ　１１Ｃ６４性キリング８０％）、オーバーナイトインキュベーシッンで 得られるコントロール値は、ＮＫＲ解１３％及びＭａｂ　１１Ｃ６４性キリング ６４．６％であった。

Ｈ，メラノーマ患者の単核細胞の細胞毒性活性は、ｒｌＬ−２との短時間生体外 インキユベーシヨンにより増加する。

ＰＢＭＣは、それぞれ病気の段階が異なる４名のメラノーマ患者から入手した。

すなわち、患者は、非常に異なる腫瘍を示していた。ＥＡＴ比１００　：　１で 、メラノーマ患者のＰＢＭＣ＋Ｍａｂ１１Ｃ６４は、２４から７３パーセントの 範囲の溶解を誘導した。メラノーマ患者のＰＢＭＣを４時間検定の間、ｒＩＬ− ２とインキュベートしたとき、誘導される溶解は１８〜３９パーセントであった 。最終的に、ｒｌＬ−２及びＭａｂ　１１Ｃ６４とのメラノーマ患者ＰＢＭＣの インキュベーシヨンは、４８〜８８パーセントの溶解を誘導する。これら同様の 研究において、正常なコントロール値は、Ｍａｂ　１１Ｃ６４性ＰＢＭＣでは３ ０パーセント、ＰＢＭＣ＋ｒ　１Ｌ−２では２５パーセント、及び、組合せ様式 では、５４パーセントであった。

全ての４人の患者のＰＢＭＣは、ｒｌＬ−２及びＭａｂ　１１Ｃ６４武装したＰ ＢＭＣの組合せ様式のインキュベーシヨンを行ったときはいつも、種々の溶解率 の増加を示した（図３）、広い範囲の腫瘍を有する患者からのＰＢＭＣは、Ｍａ ｂ　１１Ｃ６４で武装し、かつ、ｒｌＬ−２を用い生体外で活性化されたとき、 ＡＤＣＣに効果的であることは、非常に興味深い。

■、生体外においてｒ−Ｉ　Ｌ　−２で活性化した、Ｍａｂ武装Ｐ　ＢＭＣは、 無胸腺症（ｎｕ／ｎｕ）マウスにおけるヒト・メラノーマ腫瘍の増殖を抑制する 。

無胸腺症（ｎｕ／ｎｕ）マウスの右腹への、５ｘｉｏ’個のＭ２１細胞の皮下注 射は、メラノーマ障害を発達させる。注射から１２日後、メラノーマ障害が平均 体積、４００１０１’となったとき、グループ当り４匹の動物が次の処理を受け た：　（ａ）ＰＢＭＣ（２Ｘ１０’）　ｉ、ｐ、；　（ｂ）　ＭａｂｌｌＣ６４ ４００μｇで前処理したＰＢＭＣ（２Ｘ１０’）ｉ、Ｔ）、；　（ｃ）ｒｌＬ− ２２００Ｕで４時間前処理したＰＢＭＣ（２Ｘ１０’　）；　（ｄ）ｒ　ＩＬ− ２２０００Ｕで４時間前処理し、１度洗浄後、つづいて、４００μｇのＭａｂ　 １１Ｃ６４で武装したＰＢＭＣ（２Ｘ１０’　）の水性媒体分散物のｉ−ｐ、； 　（ｅ）　ＰＢＳｉ、ｖ、注射を受けたコントロール動物。注射の前、ＰＢＭＣ を、３７℃で３０分間、２００マイクロリツトル容積中、ミリリットル当り、２ ミリグラムのＭａｂ　ｌＩＣ６４とインキユベーションすることにより武装した 。各動物の平均腫瘍体積（ＭＴＶ）は、目盛付細管でメラノーマ障害を測定し、 かつ、 式　ＭＴＶ　＝　ｒｒ　（ｄ、）＜ｄｉ）（ｄ、）　／２を用いることにより、 ４週間後に得られた。

ｒＩＬ−２による生体外での活性化と、ひきつづ＜　Ｍａｂ　１１［６４での武 装化及び細胞毒性組成物のさらなる注射という組合せ様式治療を受けたグループ 中の全ての動物は、腫瘍体積の著しい減少を示し、また、それらマウスのうちの １匹は、完全に腫瘍が無くなった。事実、これらの動物のＭＴＶの減少は平均８ ０パ一セント以上であった。これらの研究結果を以下の表６に示す。

表６ １．Ｍ２１ヒト−メラノーマ細胞（５Ｘ１０’）を、２０匹ノヌード・マウスに 皮下注射した。動物（４）は、メラノーマ障害がＭＴＶ４０ｍｍ３となったとき 、２００μＪ（７）ＰＢＳ又は、２Ｘ１０’のＰＢＭＣのｔ、　Ｉ）、注射を受 けた。ｒＩＬ−２で活性化したこれらのＰＢＭＣは、ＤＭＥＭ中３７℃、４時間 、２０００　ＵのｒｌＬ−２を与えられ、注射前に一度洗浄した。

２．１匹の動物は腫瘍がなくなり、他の動物は各々腫瘍体積が１６８．１８９及 び２２５ｍ’となった。

Ｊ、　種々のモノクローナル・アイソタイプによる、腫瘍細胞のＡＤＣＣ仲介キ リングの効果は、ＰＢＭＣ提供者に依存する。腫瘍標的細胞のＡＤＣＣキリング において、特別なＭａｂアイソタイプに選択性が存在するかどうかを評価する研 究が行なわれた。キフプス（Ｋｉｐｐｓ）等（（１９８５年）、ジャーナル・オ ン・エクスベリメンタル・メディシン（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、）　１６１巻 、１〜１７頁）に述べられた、螢光活性化セルソーティング法を用いて、抗ＧＤ ２Ｍａｂ　１４．　１８の一群のアイソタイプ・スイッチ変異体をＵ４’Ｊした 。その後、２人の提供者由来のＰＢＭＣを用いて得られた効果を比較する４時間 ＡＤＣＣ検定法でスクリーニングした。

表７のデータにみられるように、全てのアイソタイプは、提供者ＰＢＭＣのＮＫ 活性を越えるＡＤＣＣ仲介キリング活性を示した。またこれらのデータは、Ｉｇ Ｇ１アイソタイプによるＡＤＣＣ仲介キリングは、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ又は Ｉ　ｇＧ３に対して示されたものよりも小さいことを示している。

個々の提供者による多様性も、用いるアイソタイプ及び標的細胞の両方に依存す ることがわかった。従って、エフェクター細胞を武装するのに４種のアイソタイ プのどれでも用いることができるけれども、至適のアイソタイプは、提供者の活 性化可能な白血球及び標的細胞に依存する。

表７ 神経外胚葉腫瘍細胞の死滅率 Ｍ　２１　Ｔ２９３　５Ｋ−Ｎ−Ａｓ 提供者　提供者　提供者 ■ゴムニ１２　１２　１１ ＮＫ　１２１２１２ １ｇＧ３　２２３７　１７２３　９１５１ｇＧ２ａ　３２５５　３６４１　４１ ３５℃ｇＧ２ｂ　１９３８　１７２３　３６２３℃ｇＧ１　１９　５　７　３　 ３５１５１、？８解率は、材料と方法セクションでｌｉ論しているように、５Ｉ Ｃｒ標議標的細胞を用いた標準ＡＤＣＣ検定で測定した。

２．２組のデータを、ＮＫキリングに対して得、一方、Ｍａｂ　１４゜１８の種 々のアイソタイプ・スイッチ変異体によるキリングに対しては、１組しかデータ を取らながった。

■、材料と方法 Ａ、動物 ＢＡＬＢ／Ｃ無胸腺症ｎｕ／ｎｕマウスは、ＣＡ州サすディエゴのカリフォルニ ア大学のヌードマウスコロニーから入手した。

Ｃ５７ＢＬ／６ｂｇＪ／ｂｇ／Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６及びｎｕ／ｎｕマウスはＣＡ 州、う・ジョラのザ・スクリップス・クリニック・アンド・リサーチ・ファンデ ーシラン（丁ｈｅ　５ｃｒｊｐｐｓ　Ｃ１１ｎｉｃ　ａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈ　 Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）の飼育所から入手した。

Ｂ、細胞系列 Ｍ１４及びＭ２１ヒト・メラノーマ細胞系列は、Ｄ、Ｌ、モートン博士（ロサン ジエルス；カリフォルニア大学）から戦いた。

５Ｋ−Ｎ−ＡＳ細胞系列は、Ｌ、ヘルソン（Ｈｅｌｓｏｎ）博士（二ニーヨーク 、メモリアル　スローンーケタリング　キャンサー・センター（Ｍｅ＋ｇｏｒｉ ａｌ　Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｎｔｅｒ）から戦 いた。

Ａ−３７５−Ｐ細胞系列は、Ａ−３７５（ＡＴＣＣＣＲＬｌ　６１９）のサブク ローンで、Ｊ、フィドラー（Ｆｉｄｌｅｒ）　（ヒユーストン、ユニバージティ ー・オン・テキサス・ヘルス・サイエンス・センター）博士から載いた。Ｔ２９ ３ヒト小細胞肺がん腫細胞系列は、マシエ（Ｍａｓｉｅ）博士及びす）−（Ｓａ ｔｏ）博士（サンディエゴ、カリホルニア大学）より載いた。その腫瘍細胞は、 ７．５％のＣＯｔを含む雰囲気下、３７℃で、各々、１０％ウシ胎児血清、１％ グルタミン及び５０μｇ／ｍｆｆ１（生育培地）のゲンタマイシンを補足したＲ ＰＭＩ　１６４０培地（ＮＹ州、グランド・アイランド・ギブコ・ラボラトリー ズ（ＧＩＢＣＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））又はダルベコ修正イーグル培地（ ＤＭＥＭ；　ＣＴ州、ハンデン、フロー・ラボラトリーズ（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ）　）に維持した。

Ｃ，モノクローナル抗体 各々、ジシアロガングリオシドＧＤ２及びＧＤ３に対する、ＭＢ３．６　（１ｇ Ｇ３）（ＡＴＣＣＨＢ　８８９０）及び１１Ｃ６４（Ｉ　ｇＧ３）と同様、Ｍａ ｂｌ　４．１　Ｂ　（Ｉ　ｇＧ３）　（ＡＴＣＣＨ８９１１８）は、我々の研究 室で作り、Ｊ６０６　（１ｇＧ３）、抗レバン及びイヌリンは、Ｍ、コーン（Ｃ ｏｈｎ）博士（ＣＡ州、うジョラ　ソーク　インスチチュート（Ｓｏａｋ　１口 ５ｔｉｔｕｔｅ）から載いた。これらのＭａｂを、脱塩及びプロティンＡ・セフ ァロース（スエーデン、アブサラ（ｌｌｐｐｓａ　Ｉａ）　、ファルマシア・フ ァインケミカルス）によるアフィニティー・クロマトグラフィーと、イ（Ｂｙ） 等（（１９７８年）、イムノケミストリー（Ｉｍｍｕｎｏ　ｃｈｅ＋＋＋１ｓｔ ｒｙ）　１５巻。

４２９−４３６頁）の操作に従って精製した。集めた両分はさらに、ｐＨ６，７ の５％スクロース（Ｗ／Ｖ）を含むクエン酸バッファで透析した。精製したＭａ ｂは、−７０℃で保存し、それらの活性は以前にチェレッシュ（Ｃｂｅｒｅｓｈ ）等により報告された＜（１９８４年）。

プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミ−・オン・サイｘンｘ　（Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　（ＵＳＡ）　８１巻、５７６７〜 ５７７１頁）、イライザ検定法で検定した。Ｍａｂ調製物の純度及び安定性は、 ベックマンモデルＥの超遠心機を用いて、それが７８タンパク質単量体であるこ とを明らかにした沈降速度分析法により、明らかにされた（ジカルディ（Ｚｉｃ ｃａｒｄｉ）等（１９８４年）、ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミスト リー（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｏ＋、）２５９巻、１３６７４〜１３６７９頁）。

アイソタイプは、次の示すように、イライザ法で測定した。

ウサギの抗マウスＩｇＧ１．ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、１ｇＧ３又はＩｇＭ（Ａ Ｌ州、バーミンガム、サウザーン・バイオチク・アソシエーツ（ＳｏｕＬｈｅｒ ｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ））　５０マイクロリツトル（ＰＢ Ｓでの１　：　１０００希釈液）を、平底ポリ塩化ビニルマイクロプレート（Ｖ Ａ州、アレキサンドリア・ダイナチク（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）　）のウェルに入れ る。そのプレートを乾燥器中で、１晩３７℃でインキコベートする。乾燥したプ レートを、使用するまで、４℃で保存する。イライザ法の前に、乾燥したプレー トを、０．１％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗ ｅｅｎ　２０）及び、０．０２％のチメロザール（ＭＯ州、セントルイス、シグ マ、ソディウム・エチルマーキエリチオサリシレート）を含む、ｐ）１７．４の ＰＢＳＩＯミリリットルで各２分間、２回洗浄して再水和する。

その後、ＰＢＳで１：２に希釈した、ハイブリドーマ培養上清を、ウェル当り、 ５０マイクロリンドル加え、４℃で１時間維持する。２回洗浄後、１０００倍希 釈したホースラディツシュ・バーオキシダーセ標識したヤギの抗マウス免疫グロ ブリン（ＣＡ州。

リッチモンド、バイオラド・ラボラトリーズ）５０マイクロリツトルを各ウェル に加え４℃で１時間維持する。

結合したパーオキシダーゼ活性を検定するのに用いた基質は使用直前に調製し、 それは、０．２３％ｌｂｏ！を含むｐＨ６，０の８０−Ｍクエン酸−リン酸バフ ファ中、４００マイクログラム／−ｌの０−フェニレンジアミン（ＭＯ州、セン トルイス、シグマ）を含んでいる。２回の最終的洗浄の後、各ウェルに、５０μ Ｅの基質溶液を加え、暗所で１５分間発色させる。４モル濃度（Ｍ）のＨｔＳＯ 。

２５μ！を各ウェルに加えて、発色を停止し、その４９２ナノ・メーター（ｎｍ ）における光学密度を、マルチスキャン・イライザプレート・リーダー（ＶＡ州 、バーリントン、バイオ・テクインスツルメント社（Ｂｉｏ−ｔｅｋ　Ｉｎｓｔ ｒｕｍｅｎｔｓ　Ｉｎｃ、）　）で測定した。

ＩｇＧ１．ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂアイソタイプのアイソタイプ・スイッチ変 異体を、ここで参考として引用しているキソブス０［１ｐＧＩＳ）等（（１９８ ５年）、ジャーナル・オン・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ、　Ｅｘｐ、 　Ｍｅｄ、）　１６１巻、１〜１７頁）の螢光活性化セルソーティング法を用い て、Ｍａｂ　１４．　１８　（１ｇＧ３）から、この研究室で調製した。Ｍａｂ 　０ＫＴ３，０ＫＴ４及び０ＫＴ８は、ＮＪ州、ラリタン（Ｒａｒｉｔａｎ）の オルトダイアグノスティック・システム社から入手できる。　Ｍａｂ　Ｌｅｕ− ４，Ｌｅｕｌｌａ及びＬｅｕ−１１ｂは、ＣＡ州、マウンテン・ビュー　（Ｍｏ ｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ）のベクトン、ディンキンソン、モノクローナルセンタ ーから入手できる。

Ｄ、抗体依存細胞性細胞毒性（Ａ　Ｔ　ＣＣ）メラノーマ及び神経芽細胞腫細胞 （１０’　）をｌ　ｍｌｌの、先に述べた、”Ｃｒ＋　２００マイクロキユリー （μＣｉ）を含む生育培地（１ミリキューリー７−１のクロム酸ナトリウム、Ｍ Ａ州、ボストン、二ニー・イングランド・ニュークリア（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎ ｄＮｕｃｌｅａｒ）　）中で標識し、３７℃で９０分間インキュベートする。

その後、その細胞を、Ｐ）１７．２のリン酸バッファ食塩水（ＰＢＳ）で２回洗 い、２　ｍｌｉの生育培地に再懸濁する。

９６大のマイクロプレート（フロー・ラボラトリーズ社）の各ウェルに標的細胞 （５ｘ１０ｓ個／１０μｍ）を入れる。生育培地で２００μｇ／＋ｓ＃（２５μ りに希釈した精製抗体を標的細胞を入れたウェルに加える。ヒトの組換えＩＬ− ２（ロット＃ＬＰ−３０３Ｂ）（ＣＡ州、エメリービル（Ｅｗｅｒｙｖｉｌｌｅ ）セタス・コーポレーション（Ｃｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から載い た）は大腸菌中で、ワンプ（Ｗａワｇ）等（（１９８４年）、サイエンス（Ｓｃ ｉｅｎｃｅ）２２４巻、１４３１−１４３３頁））の方法に従って調製した。

ヒトの末梢血液単核細胞は、メラノーマ患者（タクソン（Ｔｕｅｓｏｎ）　＋ア リシナ大学、Ｆ、メイスケンズ（Ｍｅｙｓｋｅｎｓ）博士より戦いた）又は、ボ ユム（Ｂｏｙｕｍ）　（（１９７６年）、ナチビグ（Ｎａｔｉｖｉｇ）［。

“リンパ細胞、単離、分画及び特徴”）で述べられているような、コントロール の健康人のヘパリン化血液から、フィコール／ハイバーク（ノルウェイ、オス口 、ナイガード社すンホブレブ（Ｌｙｓｐｈ（１ｐｒｅｐ）　）勾配遠心により単 離した。これらの細胞を、指示した標的：エフェクター比となるようにマイクロ プレートのウェルに加えた。そのプレートを３７℃で４時間インキュベートし、 以前にチェレフシェ（Ｃｈｅｒｅｓｈ）等（（１９８５年）プロシーディング・ イン・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ、８２巻、５１５５−５１５９頁）により報告 されている方法に従って処理した。

溶解率は、次の式 “放出測定値”とは、各実験で測定される５ＩＣｒ減衰の分当りの計数値（ｃｐ ｓ　）であり、“自然放出値”とは、バックグランド減衰値及び“放出最高値” とは、試料中のカウントしうる最高計数値である。

ＡＤＣＣ又はｒｌＬ−２誘導の増加に寄因する比溶解を計算するために、抗体又 はｒＩＬ−２の非存在下、エフェクター細胞による溶解率、すなわち、ナチュラ ル・キラー（Ｎ　Ｋ）溶解は、上で得られ各値から差し引かれる。

本発明は、好ましい態様に関して報告されている。当業者にとって、この公開さ れた事項の修正、そして、または変化は、これまで述べてきた本発明の範囲を逸 脱することなしに行うことができることは明らかであろう。

標　的　エフェクター Ｔ−Ｆｃレセグター結合 ハイブリッド抗体 ＦＩＧ、　２ エフエクター二標的比 ％比溶解 ＦＩＧ、　４ ＴＩＬ、２　Ａ　Ｄ　ＣＣの増加 エフェクター：標的 国際調査報告 １＾τ・（＋ＡＩ□１１１藏ム紳べ１啼＋〜・　ｐｃτ／じ５８）１０２５２０ ＰＣ？／υ３８７１０２５２０ Ａｔ　ａ　ｗｅｎｔ　ｔｏ　Ｆ　ｒ＋ｎ　ＰＣ丁　工ＳＡ　ＯａＨ，ＦＩＥＬＤ Ｓ　５ＥＡＲＣＨＥＤ　５ＥＡＲＣＨＴＥＲＭＳｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ｃ ｙｔｏｌｙｓｉｓ、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｌｎ−２，セｕｍｏｒ、ｎｅｏｐｌａｓ ｍ。

ｍｅｌａｎｏｍａ、　ｎｅｕｒｃｂｌａｓｔｃｍａ、　ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ、 　ｃａｎｃｅｒ、　？−１ｙｍｐｈｏｃｙｔｅ。

Ｔ−ｃｅｌｌ、　Ｌｅｕ−１ｉ、　ａｐｐｌｉｃａｎｔｓ’　ｒ＋ａｍｅｓ。

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）ＩｇＧｌ，ＩｇＧ２ａ，ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３抗体Ｆｃレセプタ ーを含む白血球の培養物を、その細胞のナチュラル・キラー活性を増加し、ＩＬ −２活性化エフェクター細胞を作るのに十分な量のインターロイキン−２ととも に生体外で活性化し、（ｂ）上記エフェクター細胞を、毒性量のインターロイキ ン−２から分離し、 （ｃ）上記１Ｌ−２活性化エフェクター細胞を、クラスＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ、 ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３のＦｃ含有モノクローナル抗体であって、そのパラトピ ック領域が標的細胞の表面に発現する抗原と免疫反応するＦｃ含有モノクローナ ル抗体と結合させ、武装化１Ｌ−２活性化エフェクター細胞を作り、（ｄ）標的 細胞を、上記武装化１Ｌ−２活性化エフェクター細胞と接触させ、 （ｅ）その接触を、上記武装化１Ｌ−２活性化エフェクター細胞が、上記標的細 胞を死滅させるのに必要な十分な時間維持する、上記（ａ）〜（ｅ）のステップ を含む、標的細胞を特異的に死滅させる方法。
2. （２）上記標的細胞が腫瘍細胞であり、かつ、上記標的腫瘍細胞の表面上に発現 する上記抗原がジシアロガングリオシドＧＤ２又はＧＤ３である、請求項（１） 記載の方法。
3. （３）上記モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣ受理番号ＨＢ８８９０のハイブリド ーマから分泌される、請求項（２）記載の方法。
4. （４）上記モノクローナル抗体がＡＴＣＣ受理番号ＨＢ９１１８のハイブリドー マから分泌される、請求項（２）記載の方法。
5. （５）上記標的細胞を、Ｔ細胞表面上に発現するＴ３抗原と免疫反応する第１抗 Ｔ３パラトピック領域及び、標的細胞の表面上置発現するエピトープで、上記の 第１の、Ｆｃ含有モノクローナル抗体が免疫反応するものとは異なる第２のエピ トープと免疫反応する、第２のパラトピック領域を含む、二特異的ハイブリッド モノクローナル・パラトピック分子の細胞毒性量と接触させることをさらに含む 、請求項（１）記載の方法。
6. （６）Ｔ３抗原と免疫反応する上記抗Ｔ３パラトピック領域がＡＴＣＣ受理番号 ＣＲＬ８００１であるハイブリドーマから分泌される、請求項（５）記載の方法 。
7. （７）上記標的細胞がジシアロガングリオシドＧＤ２及びＯＤ３の両方を発現し 、上記第１のＦｃ含有モノクローナル抗体は、上記ジシアロガングリオシドの一 方と免疫反応し、かつ、上記ハイブリット分子の上記第２のパラトピック領域が 、上記ジシアロガングリオシドのもう一方と免疫反応する、請求項（６）記載の 方法。
8. （８）上記二特異的ハイブリッド分子を、上記標的細胞と接触させ、さらにそれ と実質的に同時に、その標的細胞を、上記武装化１Ｌ−２活性化エフェクター細 胞と接触させる、請求項（５）記載の方法。
9. （９）上記二特異的ハイデリット分子を、上記標的細胞と接触させる前に、Ｔ３ 抗原を発現する抗Ｔ３活性化Ｔ細胞の表面をコートする、請求項（８）記載の方 法。
10. （１０）（ａ）Ｔ３′Ｔ細胞を含むＴ細胞群を、活性化量の抗Ｔ３モノクローナ ル抗体と混合及び接触させ、 ｂ）上記接触を、生物学的条件下、Ｔ３′細胞の濃度が、その接触の開始時に、 その濃度の約７５％に減少するのに十分なと時間、上記接触を維持し、一方では 細胞群の給数は、ほぼ一定を保ちつつ抗Ｔ３活性化下細胞を作り、 （ｃ）上記抗Ｔ３活性化Ｔ細胞を、上記抗Ｔ３抗体と分離し、（ｄ）上記の分離 した抗Ｔ３活性化Ｔ細胞を、上記抗Ｔ３含有二特異的ハイブリッド分子でコーテ ィングする、以上（ａ）〜（ｄ）のステップにより、上記抗Ｔ３活性化Ｔ細胞を 作る、請求項（９）記載の方法。
11. （１１）（ａ）ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ，ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３抗体Ｆｃレセプ ターを含む末梢血液単核細胞の培養物を、生体外で、上記細胞のナチュラルキラ ー活性を増加させるのに十分な量のインタ一口イキン−２で活性化し、ＩＬ−２ 活性化エフェクター細胞を作り、 （ｂ）上記１Ｌ−２活性化エフェクター細胞を、毒性量のインターロイキン−２ から分離し、 （ｃ）上記１Ｌ−２活性化エフェクター細胞を、クラスＩｇＧｌ、ＩｇＧ２ａ、 １ｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３のＦｃ含有モノクローナル抗体であって、そのパラトピ ック領域がジシアロガングリオシドＧＤ２又はＧＤ３と免疫反応するＦｃ含有モ ノクローナル抗体と結合させ、武装化１Ｌ−そ２活性化エフェクター細胞を作り 、（ｄ）細胞毒性量の、上記武装化１Ｌ−２活性化エフェクター細胞を、ＧＤ２ 及びＧＤ３からなる群から選択されたジシアロガソグリオシドを発現する腫瘍細 胞と接触し、（ｅ）この接触を、上記武装化、ＩＬ−２活性化エフェクター細胞 が、上記腫瘍細胞を溶解するのに十分な時間、維持する、上記（ａ）〜（ｅ）の ステップを含む、腫瘍細胞のＡＤＣＣを増加させる方法。
12. （１２）上記接触を、イン・ビトロで行なう、請求項（１１）記載の方法。
13. （１３）上記接触をイン・ビボで行なう請求項（１１）記載の方法。
14. （１４）上記標的細胞が、ＧＤ２かつＧＤ３を発現し、かつ、上記標的細胞を、 Ｔ細胞の表面上に発現するＴ３抗原と免疫反応する第１の抗Ｔ３パラトピック領 域及び上記Ｆｃ含有モノクローナル抗体は免疫反応しない、ジシアロガングリオ シドＧＤ２又はＧＤ３と免疫反応する第２のパラトピック領域を含む、細胞毒性 量の二特異的ハイブリッドモノクローナル分子と接触させる別のステッブを含む 、請求項（１１）記載の方法。
15. （１５）上記二特異的ハイブリッド分子の上記抗Ｔ３パラトピック領域が、ＡＴ ＣＣ受理番号ＣＲＬ８００１のハイブリドーマから分泌され、上記Ｆｃ含有モノ クローナル抗体が、ＡＴＣＣ受理番号ＨＢ８８９０及びＨＢ９１１８のハイブリ ドーマからなる群から選択したものから分泌され、かつ上記二特異的ハイブリッ ドの第２のパラトピック領域がＡＴＣＣ受理番号ＨＢ８８９０，ＨＢ９１１８及 びＨＢ８５６８のハイブリドーマからなる群から選択した、ハイブリドーマによ り分泌されたものである、請求項（１４）記載の方法。
16. （１６）標的細胞の表面上に発現する抗原と免疫反応するパラトビック領域を有 するＩＬ−２活性化細胞のＦｃレセプターに結合するクラスＩｇＧ１，ＩｇＧ２ ａ，ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３のモノクローナル抗体で武装した標的細胞を死滅す るのに効果的な量の武装化、白血球群から得たＩＬ−２活性化エフェクター細胞 を分散して含む、水性の生理学的に許容できる希釈媒体を含む、標的細胞キリン ダ組成物。
17. （１７）上記標的細胞が、それら細胞表面にジシアロガングリオシドＧＤ２又は ＧＤ３を発現する、請求項（１６）記載の組成物。
18. （１８）上記モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣ受理番号ＨＢ８８９０又はＨＢ９ １１８のハイブリドーマにより分泌される、請求項（１７）記載の組成物。
19. （１９）Ｔ細胞の表面上に発現するＴ３抗原と免疫反応する第１の抗Ｔ３パラト ピック領域と、上記第１のモノクローナル抗体が免疫反応する抗原とは異なる、 上記標的細胞の表面上に発現する第２のエピトープと免疫反応する第２のパラト ピック領域とを含む、細胞毒性量の二特異的ハイブリッドパラトピック分子をさ らに含む、請求項（１８）記載の組成物。
20. （２０）上記組成物の上記二特異的ハイブリットパラトピック分子は、上記武装 した、ＩＬ−２活性化エフェクター細胞と共に武装した抗Ｔ３活性化Ｔ細胞とし て、抗Ｔ３活性化Ｔ細胞の表面上をコートする形で存在する、請求項（１９）記 載の組成物。