JP3769014B2 - 多段カスケード型追加免疫ワクチン - Google Patents

Description

技術分野
本発明は悪性細胞および感染性生物に対する体液性免疫応答および細胞性免疫応答を誘導する方法に関する。より詳しくは、本発明は抗体、および腫瘍または感染性生物に関連する抗原のエピトープによく似る抗イディオタイプ抗体を用いて、腫瘍細胞または感染性生物に対する一体化した免疫応答を生み出す方法に関する。さらに、本発明は抗体およびサイトカインを用いて、この一体化した応答を増強する方法に関する。さらにまた、本発明はＭＨＣに制限されない、腫瘍関連抗原または感染性生物関連抗原を標的とするＴ細胞を産生する方法に関する。
背景技術
免疫療法の主要目標の一つは、腫瘍細胞または感染性生物に対して患者の免疫系を利用することにある。癌療法は正常細胞を標的とすることなく、腫瘍細胞に関連する抗原のみを標的として、患者の免疫系を腫瘍細胞に向けることを目的としている。この腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、これまで同定することが難しかった。しかしながら、ある種の腫瘍細胞は、成人では通常全く発現しないか、発現しても発現度が極めて低いが、胎児の発生中には存在する抗原を発現する。この腫瘍胎児性ＴＡＡの一つの例が肝臓癌細胞によって発現されるαフェトプロテインである。もう一つの腫瘍胎児性ＴＡＡとして、内胚葉由来の消化系上皮のほとんどの腺癌、ならびに乳房腫瘍細胞と非小細胞型肺癌細胞によって発現される癌胎児性抗原（ＣＥＡ）がある。Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０３２：１７７（１９９０）を参照されたい。
癌免疫療法では、ＴＡＡによく似る抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）の投与が最も有望な方法の一つである。Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．９４：２９７（１９９３）を参照されたい。Ａｂ２は、通常用いられる抗体（Ａｂ１）の可変部に対する抗体である。Ａｂ２と抗原とはＡｂ１の結合部位の同一領域と結合することができる。したがって、あるＡｂ２（「Ａｂ２β」または「内部写像（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｉｍａｇｅ）」抗体と命名する）は、この名目上の抗原（ｎｏｍｉｎａｌ ａｎｔｉｇｅｎ）の立体構造によく似る。Ｊｅｒｎｅ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１：２４３（１９８２）、Ｌｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４６：３１０（１９９０）、Ｌｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：３４２１（１９９１）、Ｌｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５６：５８０（１９９４）を参照されたい。Ａｂ２βで免疫された個体は、抗体に対する抗体の抗体（Ａｂ３）を持つようになり、その一部（Ａｂ１’）が名目上の抗原と結合することができるのである。
抗イディオタイプ抗体が抗原によく似るという特性があることから、名目上の抗原が直ちに手に入らない場合、あるいは宿主が名目上の抗原に寛容性を持つ場合、Ａｂ２βを代理抗原（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）（すなわち、抗イディオタイプ・ワクチン）として使用するようになった。実験系で、あるＴＡＡによく似るＡｂ２βで免疫すると、このＴＡＡに対する特異的な免疫が生じ、その後の腫瘍の増殖を防ぐようになる。例えば、Ｎｅｐｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：２８６４（１９８４）、Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２７１（１９８７）を参照されたい。同様にして、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)［ＭｃＮａｍａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６：１３２５（１９８４）］、Ｂ型肝炎ウイルス(hepatitus B virus)［Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３：９３０（１９８４）］、大腸菌Ｋ１３(Escherichia coli K13)［Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１００１（１９８４）］、Schistosomiasis mansoni［Ｋｒｅｓｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８３：９１２（１９８９）］およびモロニーマウス肉腫ウイルス［Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：１３１８（１９８９）］などの感染性生物に対する抗イディオタイプ・ワクチンが開発された。
癌患者に動物由来の抗ＴＡＡ抗体を投与すると、通常はＡｂ１に対する抗体類が産生され、これらの抗免疫グロブリン抗体中にＡｂ２が含まれている。Ｈｅｒｌｙｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８５：２７（１９８５）、Ｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：４００２（１９８８）を参照されたい。また、この抗イディオタイプ反応は、Ｔ細胞（Ｔ２）の産生を含む。Ｆａｇｅｒｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３７：２６４（１９９３）を参照されたい。さらに、Ａｂ２は、引き続き体液性および細胞性の抗イディオタイプに対する反応、つまり、それぞれＡｂ３およびＴ３の産生を誘導する。このＡｂ３およびＴ３は、Ａｂ１と同じエピトープを認識する。前掲と同じ。
したがって、免疫療法としてこの体液性免疫系および細胞性免疫系を利用する方法を提供することができる。これまでに本出願人は腫瘍細胞ならびに感染性生物に対する一体化された応答を刺激する方法を開発した。さらに本出願人は免疫カスケードを増幅する方法も開発した。
発明の要旨
したがって本発明の目的は、抗体および腫瘍関連抗体または感染性生物に関連した抗原のエピトープによく似る抗イディオタイプ抗体を用いて、腫瘍および感染性生物に対する体液性免疫応答および細胞性免疫応答を誘導する方法を提供することにある。本発明の他の目的は、抗体およびサイトカインを用いてこの一体化された応答を増幅する方法を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、腫瘍関連抗原または感染性生物に関連した抗原を発現する細胞を標的とするＴ細胞を産生する方法を提供することにある。このＴ細胞を用いて、腫瘍細胞または感染性生物に対する免疫応答をさらに増幅することができる。
これらの目的および他の目的は、本発明の一実施例により、腫瘍関連抗体（ＴＡＡ）を発現する腫瘍または感染性生物に起因する疾患に対する哺乳動物の体液性免疫応答および細胞性免疫応答を誘導する方法であって、
（ａ）ＴＡＡ、または感染性生物に関連する抗原と結合し、可溶の免疫原性担体タンパク質と複合している抗体成分を含む第一のワクチンを哺乳動物に投与するステップと、
（ｂ）ＴＡＡまたは感染性生物抗原のエピトープとよく似ていて、可溶の免疫原性担体タンパク質と複合している抗イディオタイプ抗体成分を含む第二のワクチンを哺乳動物に投与するステップと
を含む方法を提供することにより達成することができる。
ステップ（ａ）の抗体成分は、（ａ）マウス・モノクローナル抗体と、（ｂ）マウス・モノクローナル抗体から誘導されたヒト化抗体と、（ｃ）ヒト・モノクローナル抗体と、（ｄ）これらの（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に由来する抗体フラグメントとからなる群から選ばれる。この抗体フラグメントはＦ（ａｂ’）₂、Ｆ（ａｂ）₂、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆv、ｓＦvおよび最少認識単位からなる群から選ばれる。
さらにステップ（ｂ）の抗イディオタイプ抗体成分は、（ａ）ポリクローナル抗体と、（ｂ）マウス・モノクローナル抗体と、（ｃ）この（ｂ）に由来するヒト化抗体と、（ｄ）ヒト・モノクローナル抗体と、（ｅ）類人霊長類の抗体と、（ｆ）これらの（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）に由来する抗体フラグメントとからなる群から選ばれる。この抗体フラグメントはＦ（ａｂ’）₂、Ｆ（ａｂ）₂、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆv、ｓＦvおよび最少認識単位からなる群から選ばれる。
本発明はさらに、（ｃ）第二のワクチンの投与前および投与中にインターフェロンγまたはインターロイキン２を投与するステップをさらに含む方法に関する。代わりに、ワクチンの投与前および投与中にインターフェロンγおよびインターロイキン２を同時投与してもよい。
本発明はまた、次のステップからなるＴＡＡを発現する腫瘍または感染性生物に起因する疾患に対する哺乳動物の体液性免疫応答および細胞性免疫応答を誘導する方法であって、
（ａ）ＴＡＡまたは感染性生物に関連する抗原と結合し、可溶の免疫原性担体タンパク質と複合している抗体成分を含むワクチンを哺乳動物に投与するステップと、
（ｂ）可溶の免疫原性担体タンパク質と複合しておらず、ＴＡＡまたは感染性生物関連抗原と結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントを投与するステップと
を含む方法を意図している。
本発明はさらに、上記のステップ（ｂ）の抗体または抗体フラグメントがビオチンと複合していて、（ｃ）アビジンを投与してビオチン化抗体またはビオチン化抗体フラグメントの循環濃度を低下させるステップをさらに含む方法に関する。
本発明はさらに、（ｄ）上記のステップ（ａ）のワクチンの第二回投与を行うステップをさらに含む方法を意図している。
本発明はさらに、（ｅ）ワクチンの第二回投与前および第二回投与中にインターフェロンγまたはインターロイキン２を投与するステップをさらに含む方法に関する。代わりに、インターロイキン２とインターフェロンγとを、ワクチン投与前および投与中に同時投与してもよい。
本発明はさらに、ＴＡＡを発現する腫瘍または感染性生物に起因する疾患に対する患者の体液性免疫応答および細胞性免疫応答を誘導する方法であって、
（ａ）患者からＴ細胞を得るステップと、
（ｂ）キメラ免疫グロブリン／Ｔ細胞レセプターまたはキメラ免疫グロブリン／ＣＤ３タンパク質のいずれかをコードするＤＮＡ分子を含み、このＤＮＡ分子の免疫グロブリンをコードする部分がＴＡＡまたは感染性生物に関連する抗原と結合する抗体の可変部をコードしている発現ベクターをＴ細胞中に導入して、トランスフェクトしたＴ細胞を得るステップと、
（ｃ）トランスフェクトしたＴ細胞の増殖を刺激して、トランスフェクトしたＴ細胞数を増加させるステップと、
（ｄ）数の増加したトランスフェクトしたＴ細胞集団を患者に戻すステップと
を含む方法に関する。
本発明はさらに、（ｅ）キメラ免疫グロブリン／Ｔ細胞レセプターまたはキメラ免疫グロブリン／ＣＤ３タンパク質の免疫グロブリン部分と結合する抗イディオタイプ抗体を含み、このイディオタイプ抗体成分が可溶の免疫原性担体タンパク質と複合しているワクチンを患者に投与するステップをさらに含む方法に関する。かわりに、トランスフェクトしたＴ細胞を戻す時からステップ（ｅ）を実施する時までの間に、インターフェロンγとインターロイキン２とからなる群から選ばれるサイトカインのうち少なくとも一種類を患者に投与してもよい。
本発明はさらに、ＴＡＡを発現する腫瘍または感染性生物に起因する疾患に対して患者の体液性免疫応答および細胞性免疫応答を誘導する方法であって、
（ａ）患者からＴ細胞を得るステップと、
（ｂ）キメラ免疫グロブリン／Ｔ細胞レセプターまたはキメラ免疫グロブリン／ＣＤ３タンパク質のいずれかをコードするＤＮＡ分子を含み、このＤＮＡ分子の免疫グロブリンをコードする部分が、ＴＡＡのエピトープまたは感染性生物に関連した抗原のエピトープによく似る抗体の可変部をコードしている発現ベクターを該Ｔ細胞中に導入して、トランスフェクトしたＴ細胞を得るステップと、
（ｃ）トランスフェクトしたＴ細胞の増殖を刺激して、トランスフェクトしたＴ細胞数を増加させるステップと、
（ｄ）数の増加したトランスフェクトしたＴ細胞集団を患者に戻してやるステップと
を含む方法を意図している。
本発明はさらに、（ｅ）キメラ免疫グロブリン／Ｔ細胞レセプターまたはキメラ免疫グロブリン／ＣＤ３タンパク質の免疫グロブリン部分と結合する抗体成分を含み、この抗体成分が可溶の免疫原性担体タンパク質と複合しているワクチンを患者に投与するステップをさらに含む方法に関する。かわりに、トランスフェクトしたＴ細胞を戻す時からステップ（ｅ）を実施する時までの間に、インターフェロンγとインターロイキン２とからなる群から選ばれるサイトカインのうち少なくとも一種を患者に投与してもよい。
本発明はさらに、製薬的に許容できる担体および可溶の免疫原性担体タンパク質と複合している治療有効量の抗ＣＥＡ抗体成分を含む、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を発現する腫瘍を持つ患者の治療用ワクチンに関する。抗ＣＥＡ抗体成分は、（ａ）マウス・モノクローナル・クラスIII抗ＣＥＡ抗体と、（ｂ）マウス・モノクローナル・クラスIII抗ＣＥＡ抗体に由来するヒト化抗体と、（ｃ）ヒト・モノクローナル抗ＣＥＡ抗体と、（ｄ）これらの（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に由来する抗体フラグメントとからなる群から選ばれる。
本発明はさらに、製薬的に許容できる担体、および可溶の免疫原性担体タンパク質と複合していて、ＣＥＡのエピトープによく似る治療有効量の抗イディオタイプ抗体成分を含む、ＣＥＡを発現する腫瘍を持つ患者の治療用ワクチンに関する。抗イディオタイプ抗体成分は、（ａ）クラスIII抗ＣＥＡ抗体の可変部と結合するポリクローナル抗体と、（ｂ）クラスIII抗ＣＥＡ抗体の可変部と結合するモノクローナル抗体と、（ｃ）この（ｂ）に由来するヒト化抗体と、（ｄ）クラスIII抗ＣＥＡ抗体の可変部と結合する類人霊長類抗体と、（ｅ）クラスIII抗ＣＥＡ抗体の可変部と結合するヒト・モノクローナル抗ＣＥＡ抗体と、（ｆ）これら（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｅ）に由来する抗体フラグメントとからなる群から選ばれる。
本発明はまた、次のステップからなる、ＴＡＡを発現する腫瘍または感染性生物に起因する疾患に対する哺乳動物の体液性免疫応答および細胞性免疫応答を誘導する方法であって、
（ａ）ＴＡＡまたは感染性生物に関連した抗原と結合する抗体を含み、この抗体成分は可溶の免疫原性担体タンパク質と複合している第一のワクチンを哺乳動物に投与するステップと、
（ｂ）可溶の免疫原性担体タンパク質と複合しておらず、ＴＡＡまたは感染性生物に関連する抗原と結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントを投与するステップと、
（ｃ）ＴＡＡまたは感染性生物抗原のエピトープによく似ていて、可溶の免疫原性担体タンパク質と複合している抗イディオタイプ抗体を含む第二のワクチンを哺乳動物に投与するステップと
を含む方法を意図している。
この方法では、第一のワクチンはクラスIII抗ＣＥＡ抗体を含み、ステップ（ｂ）の抗体はクラスIII抗ＣＥＡ抗体であり、および第二のワクチンはクラスIII抗ＣＥＡ抗体の可変部と結合する抗体を含むことが好ましい。
本発明はさらに、二重特異性抗体を患者に投与するステップを含むＣＥＡを発現する腫瘍を有する患者の治療方法に関する。この二重特異性抗体は、ＣＤ３タンパク質と結合する部分とＣＥＡと結合する部分とを有し、ＣＥＡ結合性部位はクラスIII抗ＣＥＡ抗体に由来する抗体である。
発明の詳細な説明
１．定義
下記の説明には、多くの用語が広範に使用されている。したがって、本発明の理解を容易にするため、定義を次のように定める。
構造遺伝子は、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写された後、特定のポリペプチドを特徴づけるアミノ酸配列に翻訳されるＤＮＡ配列である。
プロモーターは、構造遺伝子の転写を指令するＤＮＡ配列である。典型的には、プロモーターの位置は、構造遺伝子の転写開始部位に近い、遺伝子の５’領域内にある。プロモーターが誘導プロモーターである場合には、誘導要因に応答して転写速度が早くなる。一方、プロモーターが構成プロモーターである場合には、転写速度は誘導要因によって調節されることはない。
単離ＤＮＡ分子は、生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれていないＤＮＡフラグメントである。例えば、クローニングされたＴ細胞レセプター遺伝子は、哺乳動物の細胞のゲノムＤＮＡから単離されているＤＮＡフラグメントである。単離ＤＮＡ分子のもう一つの例として、生物のゲノムＤＮＡに組み入れられていない化学的に合成されたＤＮＡ分子を挙げることができる。
エンハンサーは、エンハンサーと転写開始部位との距離や方向に拘らず、転写効率を上げることのできるＤＮＡ調節要素である。
相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、逆転写酵素によってｍＲＮＡテンプレートから形成される一本鎖ＤＮＡ分子である。典型的には、ｍＲＮＡの部分に相補的なプライマーが逆転写の開始のために用いられている。当業者は「ｃＤＮＡ」という語を、この一本鎖ＤＮＡ分子とその相補的ＤＮＡ鎖からなる二本鎖ＤＮＡ分子を指すのにも用いている。
発現という語は、遺伝子産物の生合成を指す。例えば、構造遺伝子の場合、発現とは、構造遺伝子がｍＲＮＡに転写されて、ｍＲＮＡが一以上のポリペプチドに翻訳されることである。
クローニング・ベクターは、宿主細胞中で自律的に複製することができるプラスミド、コスミド、またはバクテリオファージなどのＤＮＡ分子である。クローニング・ベクターには、典型的には、一個または少数の制限酵素認識部位があって、ベクターの必須生物機能を損なったり、クローニング・ベクターで形質転換する細胞の同定や選択に使うのに好適なマーカー遺伝子を損なうことなく、同定が可能な形で外来のＤＮＡ配列を挿入することができる。マーカー遺伝子には、典型的には、テトラサイクリン耐性やアンピシリン耐性を付与する遺伝子を含まれる。
発現ベクターは、宿主細胞中で発現される遺伝子を含むＤＮＡ分子である。遺伝子の発現は、典型的には、構成プロモーターまたは誘導プロモーター、組織特異的調節要素、エンハンサーを含む特定の調節要素によって制御されている。このような遺伝子は、調節要素と「操作可能なように連結」しているという。
組換え宿主は、クローニング・ベクターまたは発現ベクターのどちらかを含有している原核細胞または真核細胞である。この用語には、宿主細胞の染色体またはゲノムがクローニングされた遺伝子を含有するように遺伝子操作された原核細胞または真核細胞を指す場合も含める。
腫瘍関連抗原は、通常では正常な抗原によって発現されていないか、されても発現度がきわめて低いタンパク質のことである。腫瘍関連抗原の例としては、αフェトプロテインと癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を挙げることができる。
本明細書においては、感染性生物は、微生物および寄生虫の両方を指す。「微生物」には、ウイルス、細菌、リケッチア、マイコプラズマ、原虫、真菌、およびこれらに類似する他の微生物がある。「寄生虫」は、感染性の、一般には顕微鏡でしか見ることができない、又はきわめて小さな、マラリア原虫、スピロヘータなどの多細胞性無脊椎動物、またはその卵や幼虫で、抗体により除去したり、溶菌あるいは食細胞によって分解することができる。
本明細書においては、抗ＣＥＡ・ＭＡｂはＰｒｉｍｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４３：６８６（１９８３）およびＰｒｉｍｕｓ ｅｔ ａｌ．に付与されている米国特許第４，８１８，７０９号で説明されているクラスIIIＭＡｂを指す。これらの文献は引用することにより本明細書の一部とする。
本明細書においては、Ａｂ１は、腫瘍関連抗原または感染性生物に関連する抗原と結合する抗体である。
本明細書において、抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）は、Ａｂ１と結合する抗体である。重要なことは、Ａｂ２はＡｂ１の可変部に結合するので、Ａｂ２が腫瘍関連抗原のエピトープ、あるいは感染性生物に関連する抗原のエピロープによく似ることができることである。
抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆ（ａｂ）₂、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどの抗体の部分である。抗体フラグメントはどのような構造であっても、完全な抗体が認識するものと同じ抗原と結合する。例えば、抗ＣＥＡ・Ｍａｂ（Ａｂ１）フラグメントは、ＣＥＡと結合するが、一方Ａｂ２フラグメントは、Ａｂ１の可変部と結合し、かつ、ＣＥＡのエピトープによく似たものである。
この「抗体フラグメント」という用語には、特定の抗原と結合して複合体を形成することにより、抗体に似た作用を持つ合成タンパク質または遺伝子操作タンパク質も含めるものとする。例えば、抗体フラグメントには、Ｌ鎖可変部からなる単離フラグメント、ＨおよびＬ鎖の可変部からなる「Ｆｖ」フラグメント、ＬおよびＨ鎖の可変部がペプチド・リンカーによって連結されている組換え一本鎖ポリペプチド分子（「ｓＦｖタンパク質」）、および超可変部によく似るアミノ酸残基からなる最少識別単位が含まれている。
ヒト化抗体はマウスＭＡｂの相補性決定領域を、マウス免疫グロブリンのＨおよびＬ可変鎖からヒト可変ドメインに転移させた組換えタンパク質である。
本明細書において、抗体成分という用語には、全抗体と抗体フラグメントの両方を含めるものとする。
本明細書においては、キメラ免疫グロブリン／Ｔ細胞レセプターは、αおよびβポリペプチド鎖の可変部が、抗体（Ａｂ１）または抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）どちらかのＨおよびＬ鎖の可変セグメントによって置換されている機能的なＴ細胞レセプターである。
本明細書においては、キメラ免疫グロブリン／ＣＤ３タンパク質は、ＣＤ３ポリペプチドの機能を保持していて、かつ、Ａｂ１またはＡｂ２どちらかのＨおよびＬ鎖の可変セグメントを含む組換えタンパク質である。
２．モノクローナル抗体、ヒト化抗体、霊長類抗体、およびヒト抗体の作製
特定の抗原に対する齧歯類のモノクローナル抗体は、当業者に公知の方法により得ることができる。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）、およびＣｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１，２．５．１−２．６．７頁（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９１）［以下、「Ｃｏｌｉｇａｎ」と称す］を参照されたい。このモノクローナル抗体の作製方法を簡単に説明する。マウスに抗原を含む組成物を注射し、血清サンプルを採取して抗体が産生されていることを確認し、脾臓を摘出してＢリンパ球を得る。このＢリンパ球をミエローマ細胞と融合して、ハイブリドーマをつくる。ハイブリドーマのクローニングを行った後、抗原に対する抗体を産生する陽性の（ポジティブ）クローンを選択する。抗原に対する抗体を産生する陽性のクローンを培養した後、ハイブリドーマ培養物から抗体を単離する。
これまでに腫瘍関連抗原や感染性生物に関連する抗原に対する、極めて多種のモノクローナル抗体が開発された。例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，国際特許出願公告第ＷＯ９１／１１４６５（１９９１）号、およびＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、国際特許出願公告第ＷＯ９４／０４７０２（１９９４）号を参照されたい。引用することにより、これらの出願各々の全文を本明細書の一部とする。
好適なＭａｂの例としては、クラスIII抗ＣＥＡ・Ｍａｂが挙げられる。ＣＥＡに対する通常の抗血清には、ＣＥＡと密接に関連する一群の物質と反応する抗体が含有されている。この群の主要なＣＥＡ関連抗原は、（１）組織分布がＣＥＡに類似する正常交差反応抗原（ＮＣＡ）、および（２）物理化学特性がＣＥＡとほとんど同一である胎便抗原（ＭＡ）である。Ｐｒｉｍｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４３：６８６（１９８３）は、一群のモノクローナル抗体（Ｍａｂ）により、ＣＥＡ分子上のＮＣＡと交差反応性を有するエピトープ、ＭＡと交差反応を有するエピトープ、およびＣＥＡに特異的なエピトープの特徴を初めて明らかにした。特に３クラスの抗ＣＥＡ抗体が同定された。すなわち、１）ＣＥＡ、ＮＣＡおよびＭＡと反応するクラスＩ抗体、２）ＣＥＡとＭＡには反応するが、ＮＣＡとは反応しないクラスII抗体、および、３）ＣＥＡに特異的であって、ＮＣＡおよびＭＡとは結合しないクラスIII抗体がそれである。クラスIII抗ＣＥＡ・ＭＡｂの作製方法は、Ｐｒｉｍｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４３：６８６（１９８３）、およびＰｒｉｍｕｓ ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第４，８１８，７０９号に開示されている。さらに、第二世代クラスIII抗ＣＥＡ・ＭＡｂの作製が、Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ７１：３４７８（１９９３）で開示されている。これらの文献は引用することにより本明細書の一部とする。
ＭＡｂは、よく確立されている各種の技術により、ハイブリドーマ培養物から単離精製することができる。このような単離技術としては、プロテインＡ・セファロースを用いるアフィニテイー・クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーがある。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎの２．７．１−２．７．１２頁、および２．９．１−２．９．３頁を参照されたい。またさらに、Ｂａｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，”Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ（ＩｇＧ），”ｉｎ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１０，７９−１０４頁（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２）を参照されたい。
他の実施例において、本発明の抗体は類人霊長類の抗体である。ヒヒを用いて治療に有用な抗体をつくる一般的な技術が、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．に付与された国際特許公告第ＷＯ９１／１１４６５（１９９１）号、およびＬｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４６：３１０（１９９０）で開示されている。これらの文献は引用することにより本明細書の一部とする。
さらに他の実施例において、本発明の抗体は「ヒト化」モノクローナル抗体である。すなわち、マウス相補性決定領域をマウス免疫グロブリンのＨおよびＬ可変鎖からヒト可変ドメインに転移した後、マウス可変鎖のフレームワーク領域をヒト残基に置換する。本発明によるヒト化モノクローナル抗体は治療法に用いるのに好適である。マウス免疫グロブリンの可変ドメインをクローニングする一般的技術は、例えばＯｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．のＰｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３８３３（１９８９）での発表において説明されている。この文献は引用することにより本明細書の一部とする。ヒト化ＭＡｂの作製方法は、例えばＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４（１９８８）、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５（１９９２）、Ｓａｎｄｈｕ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７（１９９２）、およびＳｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５０：２８４４（１９９３）で説明されている。これらの文献各々は引用することにより本明細書の一部とする。
さらに他の実施例において、本発明の抗体はヒト・モノクローナル抗体である。この抗体は、抗原攻撃に応答して特定のヒト抗体を産生するよう「操作」したトランスジェニックマウスから得ることができる。この技術では、ヒトのＨ鎖及びＬ鎖遺伝子座の部分を、内因性のＨ鎖及びＬ鎖遺伝子座が破壊されている胚性幹細胞系に由来するマウスの細胞株に導入する。このトランスジェニックマウスは、ヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、このマウスを使ってヒト抗体を分泌するハイブリドーマを産生することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法はＧｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．７：１３（１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６（１９９４）、およびＴａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）で説明されている。これらの文献は引用することにより本明細書の一部とする。
３．抗体フラグメントの作製
本発明は、Ａｂ１のフラグメントまたはＡｂ２のフラグメントを使用することを意図している。抗体を加水分解によりタンパク質分解したり、フラグメントをコードするＤＮＡを大腸菌中で発現させることにより抗体フラグメントを作製することができる。
従来法では、ペプシンやパパインで全抗体を消化して抗体フラグメントを得ることができる。この抗体の製法では、例えば、先ずペプシンで抗体を酵素切断してＦ（ａｂ’）₂という５Ｓフラグメントを得る。次に、チオール還元剤を用い、ジスルフィド結合が切断されたために生じたスルフヒドリル基を適宜保護しつつ、このフラグメントをさらに切断すると一価の３．５Ｓ Ｆａｂ’フラグメントを生じる。これに代わり、ペプシンを用いる酵素切断によってそれぞれ一価のＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントの二つを一度に作製することもできる。これらの方法は、例えばＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇに付与された米国特許第４，０３６，９４５号および第４，３３１，６４７号、ならびにこれらの特許の引用文献で説明されている。引用することによりこれらの特許全文を本明細書の一部に組み込むものとする。さらにまた、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０（１９６０）、Ｐｏｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９（１９５９）、Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ ＶＯＬ．１，４２２頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９６７）、およびＣｏｌｉｇａｎ ２．８．１−２．８．１０頁および２．１０．−２．１０．４頁を参照されたい。
この他にも、全抗体が認識できる抗原に結合するフラグメントを得ようとする限りでは、Ｈ鎖を単離して一価のＬ・Ｈ鎖フラグメントを得る方法、フラグメントをさらに切断する方法、あるいはこの他の酵素技術、化学技術または遺伝子技術などの抗体切断方法を使用することができる。
例えば、Ｆｖフラグメントは、Ｖ_HおよびＶ_L鎖の会合からなっている。これをＩｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２６５９（１９７２）が説明する方法により非共有結合することができる。この他、可変鎖を分子間ジスルフィド結合で結合したり、グルタルアルデヒドなどの化学物質で架橋することもできる。例えば、前掲のＳａｎｄｈｕを参照されたい。
Ｆｖフラグメントは、ペプチド・リンカーで結ばれているＶ_HおよびＶ_L鎖からなっていることが好ましい。このような抗原結合性一本鎖タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによって結合されているＶ_HおよびＶ_LドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構成して作製する。構造遺伝子を発現ベクター中に挿入した後、この発現ベクターを大腸菌などの宿主細胞に組み入れる。このようにした組換え宿主細胞は、二つのＶドメインを架橋するペプチド・リンカーを持つ一本鎖ポリペプチドを合成する。ｓＦｖの作製方法は、例えばＷｈｉｔｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：９７（１９９１）で説明されている。さらにまた、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６（１９８８）、Ｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第４，９４６，７７８号、Ｐａｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１２７１−１２７７（１９９３）、および前掲のＳａｎｄｈｕを参照されたい。
抗体フラグメントのもう一つの形態として、１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドがある。ＣＤＲペプチド（「最少認識単位」）は、興味ある抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構成して得ることができる。この遺伝子は、ポリメラーゼ連鎖反応を利用して、抗体産生細胞のＲＮＡから可変部を合成することにより作製する。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１０６（１９９１）を参照されたい。
４．抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）の作製
ポリクローナルＡｂ２は、標準技術によりＡｂ１やフラグメントを動物に免疫して作製することができる。例えば、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，”Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ，”ｉｎ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ：ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，Ｍａｎｓｏｎ（ｅｄ．），１−１２頁（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９９２）を参照されたい。また、Ｃｏｌｉｇａｎの２．４．１−２．４．７頁も参照されたい。
この他、免疫原としてＡｂ１またはフラグメントを用い、上記の技術によりモノクローナルＡｂ２を作製することもできる。例３ではラット・モノクローナルＡｂ２の作製を例示している。
この他さらに、上記の技術によりヒト化Ａｂ２や類人霊長類Ａｂ２を作製することもできる。
５．二重特異性抗体の作製
二重特異性抗体を用いてＴ細胞を拾い上げ、このＴ細胞に腫瘍細胞を標的に向けさせることができる。二重特異性抗体は、同一ではないＬおよびＨ鎖を対として組み合わせてなる、異なる二つの抗体特異性を持つハイブリッド分子である。例えばこれまでも、Ｔ細胞でＣＤ３シグナル伝達タンパク質を認識する第一の結合部位と、腫瘍関連抗原に対する第二の結合部位を持つ二重特異性抗体が作製されていた。例えば、Ｃａｎｅｖａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４２：１８（１９８８）、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｌ．１７：１０５（１９８７）、Ｖａｎ Ｄｉｊｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４３：３４４（１９８９）、およびＲｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：８３３（１９９４）を参照されたい。
各種の従来法により二重特異性抗体を作製することができる。これら従来法の例としては、ジスルフィド切断法、ならびに全抗体、好ましくはＦ（ａｂ’）₂フラグメントの混合物の再形成法、一以上のハイブリドーマを融合して一以上の特性を持つ抗体を産生するポリオーマを形成する方法、および遺伝子操作が挙げられる。従来は、異なる抗体を還元切断して得たＦａｂ’フラグメントを酸化切断して、二重特異性抗体を作製していた。例えば、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３（１９９１）を参照されたい。この方法は有利な方法である。先ず、二つの異なる抗体をペプシンで消化して作製した二つの異なるＦ（ａｂ’）₂フラグメントを混合する。これを還元切断して、Ｆａｂ’フラグメントからなる混合物を形成する。続いて、ジスルフィド結合を酸化により再形成して、元のエピトープ各々に特異的なＦａｂ’部分を含有する二重特異性抗体を含むＦ（ａｂ’）₂フラグメントの混合物を形成するのである。この抗体複合体を作製する一般技術は、例えばＮｉｓｏｎｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．９３：４７０（１９６１）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２８：１４６１（１９６８）、および米国特許第４，３３１，６４７号で説明されている。
マレイミド−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどの異種二官能リンカーを使えば、より選択的に結合することができる。このエステルを抗体またはフラグメントと反応させると、抗体またはフラグメントにアミン基が誘導される。この誘導体を、例えば遊離スルフヒドリル基を持つＦａｂ抗体フラグメント（または、トラウト試薬等でスルフヒドリル基を付加したより大きなフラグメントまたは全抗体）と反応させる。このようにして得たリンカーは、同一抗体内の基を互いに架橋する可能性が少ないので、結合の選択性が向上する。
抗体やフラグメントは、抗原結合部位から離れている部位で結合するのが有利である。この結合は、例えば、上記のように鎖間スルフヒドリル基を切断して、これに結合すればよい。もう一つの方法は、炭水化物部分を酸化した抗体を、少なくとも一個の遊離アミン官能基を持つ他の抗体と反応させる方法である。こうすると、始めにシッフ塩基（イミン）結合ができる。この結合は、第二アミンに還元すること、例えば水素化ホウ素により還元することにより安定化して、最終複合体を形成するので好ましい。このような部位特異性の結合は、小さい分子のものが米国特許第４，６７１，９５８号、大きな付加物のものが米国特許第４，６９９，７８４号に開示されている。
本明細書においては、二重特異性抗体はＴ細胞と結合する部分と、腫瘍細胞関連抗原または感染性生物に関連する抗原を結合する部分とを含む。例えば、ＣＥＡ結合部分はクラスIII・Ｍａｂから得ることができ、またＴ細胞結合部分は抗ＣＤ３・Ｍａｂから得ることができる。抗ＣＤ３抗体の作製方法は当業者によく知られている。例えば、前掲のＣａｎｅｖａｒｉ ｅｔ ａｌ．、前掲のＶａｎ Ｄｉｊｋ ｅｔ ａｌ．、Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，”Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ Ｄｅｆｉｎｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ），”ｉｎ ＬＥＵＫＯＣＹＴＥ ＴＹＰＩＮＧ：ＨＵＭＡＮ ＬＥＵＫＯＣＹＴＥ ＭＡＲＫＥＲＳ ＤＥＴＥＣＴＥＤ ＢＹ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｂｅｒｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．）１９５−２１２頁（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ １９８４）、および米国特許第４，３６１，５４９号を参照されたい。上記以外では、抗ＣＤ３抗体はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１２７３ ４８５）およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ；ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８００１［ＯＫＴ−３］）から市販されており、これらから入手することもできる。
二重特異性抗体の作製は、例えば上記と同様にして先ず抗ＣＥＡクラスIII・ＭａｂからＦ（ａｂ’）₂フラグメントを形成する。Ｌ−Ｈ鎖結合ができないように注意しながら、抗ＣＥＡクラスIII・Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントの鎖間ジスルフィド架橋をシステインで穏やかに還元して、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを形成する。ＳＨ基を過剰のビスマレイミド・リンカー（１，１’−（メチレンジ−４，１−フェニレン）ビスマレイミド）で活性化する。抗ＣＤ３・ＭａｂをＦａｂ’−ＳＨに転換した後、活性化した抗ＣＥＡクラスIII・Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントと反応させて、二重特異性抗体を得る。
この代わりに、抗体ＣＤ３・Ｍａｂと抗ＣＥＡクラスIII・Ｍａｂを産生する二つのハイブリドーマ細胞系を融合して、二重特異性抗体を産生させることもできる。テトラドーマをつくる技術は、例えばＭｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７（１９８３）およびＰｏｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５４：４１８（１９９３）で説明されている。
最後に、二重特異性抗体は遺伝子操作によっても作製することができる。例えば、抗ＣＥＡクラスIII・Ｍａｂの可変ドメインをコードするＤＮＡを含有しているプラスミドを、抗ＣＤ３抗体を分泌するハイブリドーマに導入する。このようにして得た「トランスフェクトーマ」は、ＣＥＡとＣＤ３に結合する二重特異性抗体を作製する。また、抗ＣＤ３結合ドメインと抗ＣＥＡ結合ドメインの両方をコードするように、キメラ遺伝子を設計してもよい。遺伝子操作により二重特性抗体をつくる一般技術は、例えばＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６４：２７１（１９８９）、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５（１９９１）、およびＷｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．１４７：４０３５（１９９１）で説明されている。
６．腫瘍細胞および感染性生物に対する体液性免疫応答および細胞性免疫応答を増幅することを目的とする抗体とサイトカンの使用
本発明はＡｂ１、Ａｂ１に対して作られるＡｂ２、およびＡｂ１またはＡｂ２いずれかのフラグメントを治療に使用することを意図している。これらの抗体やフラグメントをワクチンとして用いて、投与された哺乳動物の体液性および細胞性応答の両方を誘導することができる。さらに、Ａｂ１および／または二重特異性抗体の投与を利用して、一体化された免疫反応を増幅することもできる。
本発明の一方法によれば、哺乳動物にＡｂ１またはそのフラグメントを含むワクチンで免疫して、Ａｂ２とＴ細胞（Ｔ２細胞）の産生を誘導する。哺乳動物がＴ２細胞を産生し始めるようになったら、Ａｂ１またはそのフラグメントを静脈内投与してＴ２細胞集団を大きく育てるようにする。この第二回投与には上記の他に、抗体やフラグメントが腫瘍細胞または感染性生物上の同系の抗原に結合するので、Ｔ２細胞の標的としての役割を果たすことができる利点がある。特定の抗体と反応するＴ細胞の産生を検出する方法は、当業者によく知られている。例えば、Ｆａｇｅｒｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３７：２６４（１９９３）を参照されたい。この文献は引用することにより本明細書の一部とする。
好適な方法によれば、さらにその後哺乳動物にＡｂ２またはそのフラグメントを含むワクチンを接種して、Ａｂ３の形成と、Ａｂ２を認識するＴ細胞（Ｔ３細胞）の形成を誘導する。このＡｂ２の追加接種には、腫瘍関連抗原や感染性生物抗原を発現する細胞が、その抗原に対するＴ３細胞および抗原が結びついているＡｂ３に対するＴ２細胞によって破壊されるという利点がある。例４ではＡｂ１ワクチン、Ａｂ１（または、フラグメント）、およびＡｂ２ワクチンの投与を含む治療方法を例示している。
さらに、Ａｂ２ワクチン接種後、Ａｂ１抗体またはフラグメントを静脈内に投与することによりＴ２応答をさらに増幅させることができる。
静脈内投与されて循環しているＡｂ１抗体の存在のために、Ａｂ２ワクチンの効果が低下する可能性がある。したがって、Ａｂ２ワクチンの投与前に循環しているＡｂ１を取り除いておくことが好都合である。Ａｂ１の除去方法の一つは、ビオチンと複合しているＡｂ１抗体を利用して、Ａｂ１を除去する方法である。この方法では、循環しているビオチン化Ａｂ１は、Ａｂ２接種前にアビジンを静脈内に投与して取り除くことができる。Ａｂ１（または、そのフラグメント）の投与一日あるいは二日後アビジンによる除去を行うことが好ましい。この抗体の除去技術はＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇの国際特許出願公開第ＷＯ９４／０４７０２（１９９４）号で説明されている。
上記に代わる免疫療法としては、哺乳動物をＡｂ１ワクチンで免疫し、Ａｂ１（またはフラグメント）で治療して大部分の腫瘍抗原部位または感染性生物抗原部位を飽和させる。その後、Ａｂ１ワクチンで高度免疫を行い、Ａｂ１（または、そのフラグメント）でおおわれた細胞に対する多数の細胞障害性リンパ球を発生させる方法がある。
免疫療法の好適方法によれば、サイトカインの投与により免疫応答がさらに増幅される。サイトカインの例としては、インターフェロン（ＩＮＦ）、インターロイキン（ＩＬ）および腫瘍壊死因子が挙げられる。ＩＮＦ−γはマクロファージ、ならびにリンパ球および単球上の細胞表面クラスII組織適合性抗原を誘導する。例えば、Ｋｌｅｇｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，”Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ｍｏｎｏｋｉｎｅｓ，”ｉｎ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＰＨＡＲＭＡＣＹ，Ｐｅｚｚｕｔｏ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），５３−７０頁（Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ １９９３）、およびＲｏｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，第３版、７．８−７．１４頁（Ｍｏｓｂｙ １９９３）を参照されたい。ＩＬ−２はＴ細胞成長因子であり、天然に存在するキラー細胞の刺激因子であり、しかも腫瘍反応性Ｔ細胞の刺激因子でもある。前掲に同じ。したがって、ＩＮＦ−γとＩＬ−２とは免疫応答を増強するのに好ましいサイトカインなのである。
本発明の抗体とフラグメントとは、可溶の免疫原性担体タンパク質と複合させてワクチンとして使用することができる。好適な担体タンパク質には、カギアナカサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）を含むが、これは好ましい担体タンパク質でもある。抗体とフラグメントは標準法により担体タンパク質と複合させることができる。例えば、Ｈａｎｃｏｋ ｅｔ ａｌ．，”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ａｓ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ，”ｉｎ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ：ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，Ｍａｎｓｏｎ（ｅｄ．），２３−３２頁（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９９２）を参照されたい。
好ましい接種用組成物は、抗体複合体またはフラグメント複合体と、アジュバントを含む。好適なアジュバントの例としては、水酸化アルミニウムと脂質が挙げられる。ワクチン組成物の製剤方法は当業者によく知られている。例えば、Ｒｏｌａ，”Ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｋｉｎ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，”ｉｎ ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，第１８版、Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），１３８９−１４０４頁（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０）を参照されたい。
加工ステップ数を増加することにより、治療用途でワクチン作用の持続時間を制御できる製剤を製造することができる。抗体やフラグメントの複合体を作るポリマー、あるいは抗体やフラグメントを吸収するポリマーを用いて、徐放製剤を作製することができる。生体適合性ポリマーとしては、例えばポリ（エチレンビニルアセテート）のマトリックス、およびステアリン酸二量体とセバンシン酸のポリアンヒドリド・コポリマー（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）のマトリックスがある。Ｓｈｅｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１４４６（１９９２）を参照されたい。抗体や抗体フラグメントがマトリックスから放出される速度は、抗体やフラグメントの分子量、マトリックス内の抗体またはフラグメントの量、ならびに分散粒子の大きさに依存している。Ｓａｌｔｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．５５：１６３（１９８９），前掲のＳｈｅｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．を参照されたい。この他、固体剤形もＡｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＡＬ ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，第５版（Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ １９９０）、および，Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，第１８版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０）で説明されている。
本発明の抗体製剤は、公知の製薬的に有用な組成物の製法により製剤することができる。すなわち、抗体または抗体フラグメントを製薬的に許容できる担体と混合して混合物を作るのである。投与された哺乳動物にとって寛容な組成物は、「製薬的に許容できる担体である」ということができる。無菌リン酸緩衝塩水は、製薬的に許容できる担体の一例である。他の好適な担体も当業者によく知られている。例えば、Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＡＬ ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，第５版（Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ １９９０）、および，Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，第１８版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０）を参照されたい。
抗体やフラグメントは哺乳動物の静脈内または皮下に投与する。さらに、連続注入による投与あるいは一回または複数回の大量投与を行うことができる。好ましくは、抗体ワクチンは皮下投与し、ワクチンではない抗体製剤は静脈内に投与する。一般に、ヒトに対する抗体やフラグメントの投与量は、患者の年齢、体重、身長、性別、病状一般、および病歴などの要因によって変わってくる。典型的には、（薬剤の用量／患者の体重の比で）約１ｐｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの用量範囲の抗体またはフラグメントを患者に与えることが望ましい。この場合、必要に応じて投与量を増減することができる。
治療の目的のためには、治療有効量の抗体またはフラグメントを哺乳動物に投与する。「治療有効量」の抗体製剤を投与するとは、生理的に有意な用量を投与することである。薬剤が存在することにより投与された哺乳動物の生理に変化が検出されることを生理的に有意であるという。特に、本発明の抗体製剤の場合は、投与された哺乳動物にこの抗体製剤が存在することにより、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答が刺激されることが生理的に有意であるという。
Ａｂ１ワクチンやＡｂ２ワクチンの投与前および投与中に、ＩＮＦ−γやＩＬ−２などのサイトカインを投与する。上記に代わり、抗体ワクチンの投与前と投与中に、ＩＮＦ−γとＩＬ−２を同時に投与してもよい。サイトカインは哺乳動物の静脈内、筋肉内、または皮下に投与する。例えば、組換えＩＬ−２は、静脈内に６×１０⁵ＩＵ／ｋｇの大量投与ができるし、あるいは１８×１０⁶ＩＵ／ｍ²／ｄを連続注入することができる。Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１０：２７５（１９９２）を参照されたい。上記に代わり、１２×１０⁶ＩＵの組換えＩＬ−２を皮下投与することもできる。Ｖｏｇｅｌｚａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１１：１８０９（１９９３）を参照されたい。さらに、ＩＮＦ−γは１．５×１０⁶Ｕを皮下投与することができる。Ｌｉｅｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１０：５２（１９９２）を参照されたい。好適なＩＬ−２製剤としてはＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．／Ｃｅｔｕｓ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ；Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）およびＴＥＣＥＬＥＵＫＩＮ（Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｃ．；Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）を挙げることができ、他方ＡＣＴＩＭＭＵＮＥ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．；Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）が好適なＩＮＦ−γ製剤である。
さらに、Ａｂ１による初回治療後、二重特異性抗体を投与してもよい。二重特異抗体の機能は、リンパ球とＣＥＡを有する腫瘍細胞とを架橋し、リンパ球を介して細胞溶解を引き起こすことにある。二重特異性抗体は上記の一般指針にしたがって投与する。しかしながら、二重特異性抗体は抗体ワクチンとは異なり、免疫原と結合しない。
当業者は、上記した各種方法が感染性生物の予防にも使用できることを理解するであろう。したがって、本発明は本明細書で説明する各種方法を、哺乳動物が感染生物にであう前の予防を目的として使用することを意図している。
７．キメラ免疫グロブリン／Ｔ細胞レセプターまたはキメラ免疫グロブリン／ＣＤ３タンパク質を発現するＴ細胞の作製ならびに治療を目的とするその使用
Ｔ細胞は相互排他的な二つの集団に分類される。αおよびβＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）ポリペプチドを発現するＴ細胞と、γおよびδＴＣＲポリペプチドを発現するＴ細胞がそれである。一般的に、Ｒｏｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，ＩＭＭＵＮＯＬＧＹ，第３版（Ｍｏｓｂｙ １９９３）、およびＢｏｌｈｕｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３４：１（１９９１）を参照されたい。αβポリペプチドの組は、９５％以上の末梢Ｔ細胞と極めて大多数のＴＣＲ−発現胸腺細胞によって発現される。対照的に、γδポリペプチドの組は胸腺と二次リンパ器官のＴ細胞によって発現されるが、その割合は低い。その反面γδＴ細胞は各種上皮に豊富に存在している。
ＴＣＲヘテロ二量体のポリペプチド鎖各々は、どちらも免疫グロブリン様の外側可変ドメインと定常ドメインの二つを含み、トランスメンブラン・ペプチドと短い細胞質尾部によって形質膜中に固定されている。ＴＣＲポリペプチドのＮ末端ドメインには、免疫グロブリンの可変ドメインと相同である可変部が含まれている。さらに、これらのＴＣＲ可変ドメインを分析した結果、免疫グロブリンの超可変部（ＣＤＲ）に対応する比較的に大きな変異性を有する領域が存在することが分かった。αβおよびγδポリペプチドの可変ドメインは、免疫グロブリン分子のＶ_H／Ｖ_Lドメインの会合に似た形で互いに会合していて、６個のＴＣＲ超可変部を一緒に抗原結合部位を形成していると考えられている。
ＴＣＲαβおよびγδポリペプチドは両方とも、まとめてＣＤ３と命名されている一連のポリペプチド（γ、δ、ε、ζ、およびη）と非共有結合的に会合して、完全なＴＣＲ複合体を形成している。ＴＣＲポリペプチドとは対照的に、ＣＤ３成分のアミノ酸配列は、Ｔ細胞が異なっていても変異性を示さないので、ＣＤ３成分はＴＣＲポリペプチドに関する多様性を創り出すことはできない。その代わり、ＴＣＲ複合体では、ＴＣＲと抗原の相互作用によって発生するシグナル伝達にＣＤ３成分を必要としている。
一般に、抗原提示細胞の表面上で、Ｔ細胞は主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子と共同して細胞結合抗原を認識する。しかしながら、特定の腫瘍を標的とするが、ＭＨＣによって制限されないＴ細胞を作製する方法がある。上記した二重特異性抗体がＴ細胞を標的に向わせる一つの方法である。もう一つの方法はＴ細胞を遺伝子操作によってキメラ免疫グロブリン／Ｔ細胞レセプターを持たせることである。効果を上げるためには、キメラ免疫グロブリン／ＴＣＲがＴ細胞によって安定的に発現され、キメラ免疫グロブリン／ＴＣＲとＣＤ３シグナル伝達ポリペプチドとの間に機能的な共同関係が形成されなければならない。
これまでにＴＣＲα鎖およびβ鎖の可変遺伝子セグメントを免疫グロブリンのＨおよびＬ鎖の可変遺伝子セグメントで置換した、機能的なキメラ免疫グロブリン／ＴＣＲｓが作製されてきた。例えば、Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５８：９１１（１９８９）、Ｅｓｈｈａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６２（Ｓｕｐｐｌ．１０）：２７（１９９０）、Ｇｏｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６０：９２９（１９９０）、Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．２１：１２７（１９８９ａ）、およびＧｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２４（１９８９ｂ）を参照されたい。これらの文献は引用することにより本明細書の一部とする。本発明は、ＴＣＲα鎖およびβ鎖の可変部がＡｂ１またはＡｂ２のいずれかのＨ鎖およびＬ鎖の可変遺伝子セグメントによって置換されいる、キメラ免疫グロブリン／ＴＣＲを構成することを意図している。
さらにまた、これまでに免疫グロブリン可変セグメントをコードするＤＮＡフラグメントがγ、ζまたはηＣＤ３ポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントと融合している機能的なキメラ免疫グログリン／ＣＤ３タンパク質が作製されてきた。例えば、Ｓｅｅｄ ｅｔ ａｌ．，国際特許出願公告第ＷＯ９２／１５３２２（１９９２）号、およびＥｓｈｈａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：７２０（１９９３）を参照されたい。これらの文献は引用することにより本明細書の一部とする。したがって、本発明は、Ａｂ１またはＡｂ２のいずれかのＨ鎖およびＬ鎖の可変遺伝子セグメントを含むキメラ免疫グロブリン／ＣＤ３タンパク質を構成することを意図している。
キメラ免疫グロブリン／ＴＣＲおよびキメラ免疫グロブリン／ＣＤ３タンパク質は、標準的な技術を使って構成することができる。典型的な技術として、次の方法を例示するが、この方法は抗ＣＥＡ（または、Ａｂ２）／ＴＣＲの構成に使用することができる。
抗ＣＥＡ・Ｍａｂまたは抗イディオタイプ・Ｍａｂの可変部をコードするＤＮＡ分子は、これらの抗体を産生するハイブリドーマのＲＮＡのポリメラーゼ連鎖反応によって合成することができる。マウス可変部と好適なプライマーの一般的な合成技術は、例えば前掲のＯｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．、Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１０６（１９９１）、およびＫａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（前掲１１１頁と同じ）で説明されている。
ヒトＴ細胞レセプターのポリペプチドをコードするＤＮＡ分子の作製方法は、当業者によく知られている。例えば、Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ２６：３０４（１９８７）、およびＬｕｒｉａ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．６：３３０７（１９８７）を参照されたい。さらに、キメラ免疫グロブリン／ＴＣＲの構成技術およびキメラ遺伝子を発現ベクターに挿入する技術は、例えば前掲のＢｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．、前掲のＥｓｈｈａｒ ｅｔ ａｌ．、前掲のＧｏｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ.、前掲のＧｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９ａ）、および前掲のＧｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９ｂ）で説明されている。さらに、免疫グロブリン融合タンパク質を構成する標準プロトコルは、Ｃｏｌｉｇａｎの１０．１９．１−１０．１９．１１頁で説明されている。発現ベクターは、安定なトランスフェクトされた細胞をつくるために優先選択マーカーを含有していることが好ましい。
キメラ免疫グロブリン／ＴＣＲ遺伝子を含む発現ベクターをヒトＴ細胞に導入する。ヒト末梢血液細胞は、簡単に静脈を穿刺し、フィコール・ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）勾配単離法により分画して、単核細胞の画分を得ることができる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎの７．１．１−７．１．２頁を参照されたい。その上で、ロゼット法によりＴ細胞を他の単核細胞から単離する。前掲７．２．１−７．２．４頁を参照されたい。発現ベクターをヒトＴ細胞画分に導入する方法としては、電気穿孔法その他よく知られている方法がある。例えば、Ｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）、およびＣｏｌｉｇａｎの１０．１３．２−１０．１７．７頁を参照されたい。
代わりに、レトロウイルスを介する遺伝子の転移によって、キメラ免疫グロブリン／ＴＣＲをＴ細胞に導入することもできる。この方法には、プロウイルスのコピーがすべて安定してＴ細胞の染色体に組み込まれるため、キメラ免疫グロブリン／ＴＣＲｓが確実に構成的に発現されるという利点がある。レトロウイルスを介する遺伝子転移によりヒトＴ細胞をトランスフェクトする方法は、Ｋａｓｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：４７３（１９９０）、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２３：５７０（１９９０）、およびＭｏｒｅｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３２：３４２（１９９１）で説明されている。
発現ベクターを担持するトランスフェクトされたＴ細胞は、優先選択マーカーを使って選択する。例えば、Ｇ４１８を使って、アミノグリコシド・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子を持つ発現ベクターを担持するトランスフェクトＴ細胞を選択することができる。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：３２７（１９８２）を参照されたい。トランスフェクトされたヒトＴ細胞をＧ４１８によって選択する方法は、前掲のＭｏｒｅｃｋｉ ｅｔ ａｌ．で説明されている。この代わりに、ハイグロマイシンＢを使って、ハイグロマイシンＢ−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子を持つ発現ベクターを担持するトランスフェクトされた細胞を選択することもできる。Ｐａｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：１０５５（１９８７）を参照されたい。さらに、アミノプテリンやミコフェノール酸を使って、キサンチン−グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を持つ発現ベクターを担持するトランスフェクトされた細胞を選択することもできる。Ｍｕｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２（１９８１）を参照されたい。。
安定にトランスフェクトされたＴ細胞は、患者に投与する前に、培養し細胞数を増やす。Ｔ細胞を適当な抗原と共にインキュベートして、細胞増殖を誘導する。例えば、ＣＥＡを精製した製剤を使って、キメラ抗ＣＥＡ／ＴＣＲポリペプチドを発現するＴ細胞の増殖を誘導することができる。一方、抗ＣＥＡ抗体（または、そのフラグメント）を精製した製剤を使って、キメラ抗イディオタイプ／ＴＣＲポリペプチドを発現するＴ細胞を刺激することができる。抗原で誘導されるＴ細胞増殖の標準技術は、Ｃｏｌｉｇａｎの７．１０．４頁で説明されている。これと関連して、抗原で誘導されるＴ細胞の増殖の重要な機能は、機能的な免疫グロブリン／ＴＣＲ、または機能的な免疫グロブリン／ＣＤ３タンパク質の存在を確認できるということである。
培養増殖が終わったら、静脈内注入または腹腔内投与によってＴ細胞を患者に戻してやる。例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：１３１８（１９８６）、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１９：１６７６（１９８８）、Ｈｅｒｃｅｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄｉｆ．９：５４６（１９９０）、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２３：５７０（１９９０）、およびＢａｒｔｈｏｌｅｙｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１１：１２０２（１９９１）を参照されたい。
要するに、遺伝子操作により、キメラ免疫グロブリン／ＴＣＲやキメラ免疫グロブリン／ＣＤ３タンパク質を発現することができる形質転換されたヒトＴ細胞を作製することができる。Ａｂ１／ＴＣＲやＡｂ１／ＣＤ３タンパク質を発現するＴ細胞はＴ３に対応し、抗イディオタイプ（Ａｂ２）／ＴＣＲやＡｂ２／ＣＤ３タンパク質を発現するＴ細胞はＴ２細胞に対応する。
養子免疫療法の場合、効能を増進するいくつかの方法がある。Ａｂ１／ＴＣＲやＡｂ１／ＣＤ３タンパク質を発現するＴ細胞を投与した後、Ａｂ２ワクチンを投与して、注入されたＴ細胞をin vivoで増加させる。同様にして、Ａｂ２／ＴＣＲやＡｂ２／ＣＤ３タンパク質を発現するＴ細胞を投与した後、Ａｂ１を接種する。どちらの場合でも、形質転換したＴ細胞の投与後、ＩＮＦ−γとＩＬ−２各々の単独投与、あるいはＩＮＦ−γとＩＬ−２の同時投与をすると、免疫半応はさらに増幅する。したがって、形質転換したＴ細胞を用いる養子免疫療法は、抗体の接種とサイトカインによる処置によってその効果を補い、かつ、増進することができる。
上記において本発明を一般的に説明したが、理解を容易にするため下記では実施例により説明する。これらの実施例は説明を目的としてなされるものであって、本発明を制限することを意図していない。
下記は更なる本発明の実施態様例である。
１．（ａ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または感染性生物に関連する抗原に結合する抗体成分を含む第一のワクチンと、
ここで、前記抗体成分は可溶性免疫原性担体タンパク質と複合している、
（ｂ）前記ＴＡＡのエピトープまたは前記感染性生物の抗原のエピトープによく似た抗イディオタイプ抗体成分を含む第二のワクチンと、
ここで、前記抗イディオタイプ抗体成分は可溶性免疫原性担体タンパク質と複合している。
（ｃ）可溶性免疫原性担体タンパク質と複合していない抗体またはその抗原結合性フラグメントと、
ここで、前記抗体または前記フラグメントは前記ＴＡＡまたは感染性生物と関連する前記抗原に結合できる、
を別々の容器の中に含んでなり、
前記ＴＡＡを発現している腫瘍または前記感染性生物に起因する疾患に対する哺乳動物において一体となった体液性免疫応答及び細胞性免疫応答を誘導するための方法に使用するための治療用組み合わせ物であって、別々の容器中の前記ワクチン、抗体、またはそのフラグメントの以下の組み合わせ
（ｉ）（ａ）前記第一のワクチン及び（ｂ）前記第二のワクチン、
（ｉｉ）（ａ）前記第一のワクチン及び（ｃ）前記抗体またはその抗原結合性フラグメント、または
（ｉｉｉ）（ａ）前記第一のワクチン及び（ｃ）前記抗体またはその抗原結合性フラグメント及び（ｂ）前記第二のワクチン
のうちいずれか一を前記哺乳動物に投与することを特徴とする治療用組み合わせ物。
２．前記第一のワクチン及び前記第二のワクチンを含む前記組み合わせ（ｉ）が前期哺乳動物に投与される上記実施態様例１に記載の治療用組み合わせ物。
３．前記第一のワクチンの前記抗体成分が抗ＣＥＡ抗体成分であり、前記第二のワクチンの抗イディオタイプ抗体成分がＣＥＡのエピトープによく似る抗イディオタイプ抗体成分である上記実施態様例２に記載の治療用組み合わせ物。
４．前記第一のワクチン及び前記抗体または抗原結合性フラグメントを含む前記組み合わせ（ｉｉ）が、前記哺乳動物に投与される上記実施態様例１に記載の治療用組み合わせ物。
５．前記抗体またはその抗体フラグメントが、二重特異性抗体である上記実施態様例４に記載の治療用組み合わせ物。
６．前記二重特異性抗体はＣＤ３タンパク質と結合する部分と、ＣＥＡと結合する部分とを含んでなり、前記ＣＥＡと結合する部分はクラスIII抗ＣＥＡ抗体に由来する上記実施態様例５に記載の治療用組み合わせ物。
７．前記第一のワクチン、前記抗体またはその抗原結合フラグメント、及び、前記第二のワクチンを含んでなる前記組み合わせ（ｉｉｉ）が、前記哺乳動物に投与される上記実施態様例５に記載の組み合わせ物。
８．前記第一のワクチンが二回投与される上記実施態様例７に記載の治療用組み合わせ物。
９．前記抗体またはその抗原結合性フラグメントがビオチン化され、前記組み合わせ物が別の容器中にアビジンを更に含み、前記哺乳動物に前記アビジンが投与されてビオチン化抗体またはその抗原結合性フラグメントの循環している濃度を減少させる上記実施態様例７または８に記載の治療用組み合わせ物。
１０．前記抗体またはその抗原結合性フラグメントが二回投与される上記実施態様例７、８または９に記載の治療用組み合わせ物。
１１．第一のワクチンまたは第二のワクチンの抗体成分、抗体、またはその抗原結合性フラグメントが
（ａ）マウスモノクローナル抗体、
（ｂ）マウスモノクローナル抗体に由来するヒト化抗体、
（ｃ）ヒトモノクローナル抗体、
（ｄ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）に由来する抗体フラグメント、
（ｅ）類人霊長類抗体、及び、
（ｆ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）
からなる群から選択される上記実施態様例１〜１０のいずれか一に記載の治療用組み合わせ物。
１２．前記抗体フラグメントが、Ｆ（ａｂ'）₂、Ｆ（ａｂ）₂、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ及び最少認識単位からなる群から選ばれる上記実施態様１１に記載の治療用組み合わせ物。
１３．前記最少認識単位が、前記抗体フラグメントの超可変部によく似るアミノ酸残基を含む上記実施態様例１２に記載の治療用組み合わせ物。
１４．前記組み合わせ物が、前記第一のワクチンまたは前記第二のワクチン投与前または投与中に投与される少なくとも一のサイトカインを別の容器内にさらに含む上記実施態様１〜１３に記載の治療用組み合わせ物。
１５．サイトカインが、インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子及びそれらの組み合わせからなる群から選択される上記実施態様例１４に記載の治療用組み合わせ物。
１６．サイトカインが、インターロイキン−２、インターフェロン−γ又はそれらの組み合わせである上記実施態様例１４に記載の治療用組み合わせ物。
１７．第一のワクチンの抗体成分が
（ａ）マウスモノクローナルクラスIII抗ＣＥＡ抗体、
（ｂ）マウスモノクローナルクラスIII抗ＣＥＡ抗体に由来するヒト化抗体、
（ｃ）ヒト化モノクローナル抗ＣＥＡ抗体、及び
（ｄ）上記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に由来する抗体フラグメント
からなる群から選択される上記実施態様例１１に記載の治療用組み合わせ物。
１８．第二のワクチンの抗体成分が
（ａ）クラスIII抗ＣＥＡ抗体の可変部に結合するポリクローナル抗体、
（ｂ）クラスIII抗ＣＥＡ抗体の可変部に結合するモノクローナル抗体、
（ｃ）上記（ｂ）に由来するヒト化抗体、
（ｄ）クラスIII抗ＣＥＡ抗体の可変部に結合する類人霊長類抗体、
（ｅ）クラスIII抗ＣＥＡ抗体の可変部に結合するヒト化モノクローナル抗体、及び、
（ｆ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）に由来する抗体フラグメント
から成る群から選択される上記実施態様例１１に記載の治療用組み合わせ物。
１９．前記抗体フラグメントが、Ｆ（ａｂ'）₂、Ｆ（ａｂ）₂、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ及び最少認識単位からなる群から選ばれる上記実施態様１１７または１８に記載の治療用組み合わせ物。
２０．前記最少認識単位が、前記抗体フラグメントの超可変部によく似るアミノ酸残基を含む上記実施態様例１９に記載の治療用組み合わせ物。
２１．前記第一のワクチンがクラスIII抗ＣＥＡ抗体を含み、前記抗体又はその抗原結合性フラグメントがクラスIII抗ＣＥＡ抗体を含み、前記第二のワクチンがクラスIII抗ＣＥＡ抗体の可変部と結合する抗体を含む上記実施態様例７に記載の治療用組み合わせ物。
例 １
マウス抗ＣＥＡ・Ｍａｂ（ＭＮ−１４）の作製
クラスIII抗ＣＥＡ・ＭａｂであるＭＮ−１４の作製は，Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ７１：３４７８（１９９３）で説明されている。この文献は引用することにより本明細書の一部とする。簡単に説明すると、体重２０グラムのＢＡＬＢ／ｃ雌マウスに、部分精製したＣＥＡ７．５μｇを完全フロイントアジュバント中に懸濁した懸濁液を皮下接種した。第３日ＣＥＡ７．５μｇとフロイントアジュバントとの懸濁液を皮下に追加接種した。第６日と第９日にはそれぞれ、ＣＥＡ７．５μｇを食塩水に溶解した溶液を静脈内に追加接種した。第２７８日にはＣＥＡ６５μｇを、また第４０４日にはＣＥＡ９０μｇをそれぞれ食塩水に溶解した溶液を静脈内投与した。第４０７日マウスを殺して、脾臓細胞の懸濁液を作製し、ポリエチレングリコールを用いて脾臓細胞とマウスミエローマ細胞ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８１）とを融合し、８−アザグアニンを含有する培地で細胞を培養した。ハイブリドーマ培養上清は、¹²⁵I−ＣＥＡラジオイムノアッセイ（Ｒｏｃｈｅ；Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）を用いて、ＣＥＡ−反応性抗体についてスクリーニングされた。陽性のクローンは、再度クローニングされた。
ＭＮ−１４と命名した一つのクローンは、クラスIII抗ＣＥＡ特異的ＭＡｂであるＮＰ−４と特性が類似していて、正常交差反応性抗原および胎便抗原とは反応しなかった。しかしながら、ＮＰ−４と比較すると、ＭＮ−１４は、ヒト結腸腫異種移植片モデルにおいて腫瘍を標的とする作用が有意に優れており、また常に結腸癌の凍結切片を強く染色した。
例 ２
ＣＤＲ−移植ＭＮ−１４（ｈＭＮ−１４）とｈＡｂ１ワクチン（ｈＭＮ−１４ワクチン）の作製
ＭＮ−１４の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトＩｇＧ₁抗体のフレームワーク領域に移植した修飾抗体を作製した。このＣＤＲを移植した（「ヒト化」）ＭＮ−１４抗体を「ｈＭＮ−１４」と命名した。ヒト化抗体を作製する一般技術は、例えばＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４（１９８８）、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５（１９９２）、Ｓａｎｄｈｕ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７（１９９２）、およびＳｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５０：２８４４（１９９３）で説明されている。
ｈＭＮ−１４ワクチンは、ｈＭＮ−１４をカギアナカサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）と複合させて作製する。複合体（２ｍｇ／注射）に

（Ｏｒｇａｎｏｎ；Ｗｅｓｔ Ｏｒａｎｇｅ，ＮＪ）１００μｌ（菌数１０⁷個）を混合して皮下注射したところ、患者は典型的に免疫された。
例 ３
ＭＮ−１４に対するラット・モノクローナルＡｂ２（ＷＩ２）およびＡｂ２ワクチン（ＷＩ２ワクチン）の作製
Ｌｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５６：５８０（１９９４）が説明している方法により、ＭＮ−１４に対するラットＡｂ２を作製した。この文献を引用することにより本明細書の一部とする。簡単に説明すると、３週齢の雌のコペンハーゲン・ラットに、ＭＮ−１４のＦ（ａｂ’）₂フラグメント２００μｇを完全フロイントアジュバントで乳化した乳化剤を腹腔内注射した。ラットは第２００日、第２３０日および第２３５日に、同量の抗原を不完全フロントアジュバントで懸濁したもので追加接種した。最後の注射の４日後ラットを殺して、脾臓細胞の懸濁液を作製し、標準技術により細胞をマウス非分泌型形質細胞腫ＳＰ２／０と融合させた。ラット腹腔支持細胞の存在下（１０、０００細胞／容量２００μｌの培養ウェル）でハイブリドーマ細胞を培養した。
ＥＬＩＳＡにより培養上清に対し、ＭＮ−１４とは反応性があること、および対照マウスＭＡｂｓとは反応性がないものをスクリーニングした。陽性のハイブリドーマはラット腹腔支持細胞の存在下で、限界希釈法により少なくとも２回クローニングを行った。
ＷＩ２はＭＮ−１４に特異的なＩｇＧ_1κＡｂ２で、イソタイプが同一の他の抗ＣＥＡ・ＭＡＢとは反応しない。マウスまたはウサギをＷＩ２で免疫することにより（対照ラットＩｇＧは接種しなかった）、Ａｂ１’抗ＣＥＡ抗体の産生を誘導した。したがってＷＩ２は、ＣＥＡ産生腫瘍を持つ患者に、イディオタイプワクチンとして使用することができる。
ＷＩ２ワクチンは、ｈＭＮ−１４ワクチンと同様にしてＷＩ２から作製する。
例 ４
ｈＭＮ−１４ワクチン（ｈＡｂ１ワクチン）およびＷＩ２ワクチン（Ａｂ２ワクチン）による治療
一次腫瘍を切除したＤｕｋｅｓ Ｃ結腸癌を持つ患者を、フロロウラシルとレバミゾールアジュバントにより治療した。手術前のＣＥＡ力価は１５．５ｎｇ／ｍｌであった。一次腫瘍の切除手術の三ヶ月後のＣＥＡ力価は正常範囲、すなわち２．５ｎｇ／ｍｌ以下であった。
２年後、この患者のＣＥＡ力価が２５ｎｇ／ｍｌに上昇し、ＣＡＴによるスキャンで肝臓左葉に５ｃｍの腫瘍、右葉に２ｃｍの腫瘍があるとの所見を得た。一ヶ月後、ＣＥＡ力価が２５ｎｇ／ｍｌであったので、ｈＡｂ１ワクチン２ｍｇを皮下接種した（第０日）。第７日にも再接種を行った。
第３０日ではＡｂ１と反応するリンパ球が患者に認められた（Ｔ２細胞）。第３０日では患者にｈＡｂ１を１００ｍｇ静脈内投与した。二ヶ月後ＣＥＡ力価は５ｎｇ／ｍｌとなり、ＣＡＴによるスキャンでは、左葉の腫瘍が２ｃｍまで小さくなっており、また右葉の腫瘍は完全に退縮していたことが認められた。
六ヶ月後、左葉の腫瘍が大きくなり、腹部に大きな腫瘍塊が認められ、ニードルバイオプシーで確認することができた。ＣＥＡ力価は５０ｎｇ／ｍｌに上昇していた。患者には第０日および第３０日にＷＩ２ Ａｂ２ワクチン（２ｍｇ）を皮下投与したところ、第３５日において注射部位に重篤な反応が発生したが、これは徐々に消散した。
三ヶ月後、ＣＥＡ力価は２．５ｎｇ／ｍｌ以下に低下し、左葉の腫瘍は完全に消失していることが認められた。腹部の塊は小さくなり、生検針では腫瘍の存在を見い出すことができず、リンパ球が侵入している繊維状の組織のみが認められるにすぎなかった。
二年後のＣＡＴスキャンでは腫瘍の再発を認めず、ＣＥＡ力価は２．５ｎｇ／ｍｌ以下であった。
上記の説明は特定の好適実施例について述べられているが、本発明はそれだけに限定されるものではない。当業者は、開示された実施例について各種の変更を加えることが可能であるが、このような変更は次の請求の範囲で定める本発明の範囲内に含めるものであることを理解するであろう。
本明細書で引用した全ての文献および特許出願は、本発明が関連する技術分野の技術水準を示すものである。あたかも各文献または特許出願が具体的にかつ個別的に名を挙げられ引用されて全文を組入れるごとく、これらすべての文献と特許出願を引用することにより本明細書の一部とする。

Claims (4)

1. （ａ）ＣＥＡに結合する抗体成分を含む第一のワクチンと、
   ここで、前記抗体成分は可溶性免疫原性担体タンパク質と複合している、
   （ｂ）ＣＥＡのエピトープによく似た抗イディオタイプ抗体成分を含む第二のワクチンと、
   ここで、前記抗イディオタイプ抗体成分は可溶性免疫原性担体タンパク質と複合している、
   （ｃ）可溶性免疫原性担体タンパク質と複合していない抗体またはその抗原結合性フラグメントと、
   ここで、前記抗体または前記フラグメントはＣＥＡに結合できる、
   を別々の容器に含んでなり、
   ＣＥＡを発現している腫瘍に対する哺乳動物において一体となった体液性免疫応答及び細胞性免疫応答を誘導するための方法に使用するための治療用組み合わせ物であって、別々の容器中の前記ワクチン、抗体、またはそのフラグメントの以下の組み合せ
   （ｉ）（ａ）前記第一のワクチン及び（ｂ）前記第二のワクチン、または、
   （ｉｉ）（ａ）前記第一のワクチン及び（ｃ）前記抗体またはその抗原結合性フラグメント及び（ｂ）前記第二のワクチン
   のうちいずれか一を前記哺乳動物に投与することを特徴とする治療用組み合わせ物。
2. 前記組み合わせ（ｉｉ）が前記哺乳動物に投与される請求項１に記載の治療用組み合わせ物。
3. 前記第一のワクチンに含まれる抗体成分若しくは前記第二のワクチンに含まれる抗体成分のいずれか、または前記第一のワクチンに含まれる抗体成分及び前記第二のワクチンに含まれる抗体成分の両方が、ヒト化されている請求項１に記載の治療用組み合わせ物。
4. （ａ）第一のワクチンに含まれる抗体成分、（ｂ）第二のワクチンに含まれる抗体成分及び（ｃ）抗体またはその抗原結合性フラグメントのうちの少なくとも一つがヒト化又はキメラ抗体である請求項１に記載の治療用組み合わせ物。