JP2005535571A - 抗イディオタイプ抗ｃｅａ抗体分子および癌ワクチンとしてのその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、分子、好ましくは、ＣＥＡ陽性腫瘍に対する抗イディオタイプワクチンとしての使用に適するよう設計された免疫グロブリンを提供する。その分子はＣＥＡを有する腫瘍細胞に対するＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの両方により仲介される免疫反応を誘導し、効率的かつ持続的な宿主抗腫瘍反応を引き起こすものである。本発明は、ワクチン接種特性が改良された、抗イディオタイプ抗ＣＥＡ抗体(好ましくはマウス抗体708)を改変したバージョンを提供する。その改変は、前述の抗体分子の可変領域に、例えばＣＥＡ、ＣＤ55抗原およびＣＥＡ癌特異的ＭＨＣエピトープに由来する配列領域を導入することに関する。
Description
（本発明の技術分野）
本発明は、分子、好ましくは、ＣＥＡ(癌胎児抗原)陽性腫瘍に対する抗イディオタイプワクチンとしての使用に適するよう設計された免疫グロブリンを提供する。本分子は、ＣＥＡを有する腫瘍細胞に対するＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスIIの両方により仲介される免疫応答を誘導し、効率的かつ持続的な宿主抗腫瘍反応を引き起こすものである。本発明は、ワクチン接種特性が改善された、抗イディオタイプ抗ＣＥＡ抗体(好ましくはマウス抗体708)を改変したものを提供する。その改変は、前述の抗体分子の可変領域に、例えばＣＥＡ、ＣＤ55抗原およびＣＥＡ癌特異的ＭＨＣエピトープに由来する配列領域を導入することに関する。
本発明は、分子、好ましくは、ＣＥＡ(癌胎児抗原)陽性腫瘍に対する抗イディオタイプワクチンとしての使用に適するよう設計された免疫グロブリンを提供する。本分子は、ＣＥＡを有する腫瘍細胞に対するＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスIIの両方により仲介される免疫応答を誘導し、効率的かつ持続的な宿主抗腫瘍反応を引き起こすものである。本発明は、ワクチン接種特性が改善された、抗イディオタイプ抗ＣＥＡ抗体(好ましくはマウス抗体708)を改変したものを提供する。その改変は、前述の抗体分子の可変領域に、例えばＣＥＡ、ＣＤ55抗原およびＣＥＡ癌特異的ＭＨＣエピトープに由来する配列領域を導入することに関する。
（背景）
生体から癌細胞を除去するために、癌細胞を含むヒト免疫系の相互作用を刺激または増幅することができる組成物を提供したいという長年の願いがあった。感染因子に免疫を与えるワクチン接種とは対照的に、免疫系を利用して癌細胞を除去することはさらに取り組みがいのある技術的な目的である。特に、免疫系は確立している免疫寛容がある細胞に向けられなければならず、また場合によっては、癌細胞それ自体が、自ら正常な免疫学的検出または除去を回避することができるようにする特性を獲得していることもある。
生体から癌細胞を除去するために、癌細胞を含むヒト免疫系の相互作用を刺激または増幅することができる組成物を提供したいという長年の願いがあった。感染因子に免疫を与えるワクチン接種とは対照的に、免疫系を利用して癌細胞を除去することはさらに取り組みがいのある技術的な目的である。特に、免疫系は確立している免疫寛容がある細胞に向けられなければならず、また場合によっては、癌細胞それ自体が、自ら正常な免疫学的検出または除去を回避することができるようにする特性を獲得していることもある。
本発明は、癌細胞に、Ｔ細胞依存性免疫応答を誘導することに関するものである。これまでの研究はほとんど、ＣＤ８陽性Ｔ細胞およびＭＨＣクラスＩに制限された免疫原に着目したものであった。しかし、本発明は、ＭＨＣクラスIIに制限されたＣＤ４陽性Ｔ細胞応答の重要性を認識するものであり、好ましい実施形態において、クラスＩおよびクラスIIの両方に制限された癌抗原エピトープを送達すことができるワクチンが提供される。
本発明の分子が標的とする癌抗原は、癌胎児性抗原(ＣＥＡ)である。ＣＥＡは、多様な固形癌によって過剰発現されている細胞表面タンパク質であり、ワクチン開発のターゲットとして、世界中の多くの様々な研究グループの注目の的となっている。ＣＥＡ分子は、結腸直腸癌の90％、胃癌、膵臓癌および非小細胞肺癌の70％ならびに乳癌の50％に発現しているｇｐｉ−アンカー型180ｋＤａ糖タンパク質である。このタンパク質は、正常な顆粒球上にみられる非特異的交差反応性抗原(ＮＣＰ)および胆汁糖タンパク質(billiary glycoprotein)(ＢＧＰ)と、かなりの相同性を示す。ＣＥＡは、大多数のＣＥＡ陽性腫瘍患者の血液循環中に検出することができ、またヒト胎児の正常な消化管にも認められる。このタンパク質は接着分子として機能すると考えられ、また、ＣＥＡに向けられる療法は腫瘍転移を防ぐのにも有益となる可能性があるという期待がもたれている。ＣＥＡが存在する場合、通常、腫瘍表面上の高いレベルで存在しているため、ＣＥＡはワクチン接種計画を含む癌免疫療法の興味深いターゲットである。
これまで、多くの研究によって、治療に対するワクチン接種というアプローチにおいて、ＣＥＡ由来蛋白質配列が開発されてきた。マウスによる研究では、痘疹(ｒＶ−ＣＥＡ)中に発現しているＣＥＡが、ワクチンとしての組換えＣＥＡより優れているということが実証され、また樹立した腫瘍の退行をもたらす細胞傷害性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)反応の誘導が示された(Kantor、J. et al (1992)、J. Natl. Cancer Inst..84：1084-1091)。転移性癌患者を対象とした第Ｉ相臨床試験では、ｒＶ−ＣＥＡは、ＣＥＡに対するＣＴＬ反応を引き起こし、腫瘍細胞を死滅させることができた(Tsang、K. Y. et al (1995) J. Natl. Cancer. Inst. 87：982-990)。しかし、有用な臨床結果を達成するために、被験者におけるその後の免疫化の見込みを制限するような痘疹への重要な免疫応答も誘導された。ｒＶ−ＣＥＡを投与して初回免疫を行い、次に、avipoxベクター内にコードされたＣＥＡを追加免疫する他の臨床試験では、ＧＭ−ＣＳＦおよび低用量のＩＬ−２の投与も受けている患者において有望な反応が達成された(Marshall、J.L. et al (2000) J. Clin. Oncology. 18：3964-3973）。そのような複雑なワクチン接種計画の有用性を実証することができる前に、さらに進んだ臨床研究が必要となる。
ＣＥＡを標的とするために用いる別のアプローチとして、抗イディオタイプによる免除化がある。抗腫瘍抗体の結合部位を認識する抗イディオタイプ抗体は、抗原の機能的な擬態の働きをすることができる。そのため、そのような抗体は、体液性応答と細胞性応答の両方を刺激するために使用することが可能である。進行結腸直腸癌患者のＣＥＡを擬態するマウス抗イディオタイプ３Ｈ１に関する第Ｉ相臨床試験が行われた。３Ｈ１抗体は、米国特許明細書第5,977,315号に詳細に記載されており、この抗体は患者に反ＣＥＡ抗体反応を誘導することが明らかにされている。そのうちの数名には、ＣＥＡに対する増殖反応がみられた(Foon、K.A. et al (1995) J.Clin.Invest. 96：334-342)。微小残存病変患者を治療するその他の研究では、抗イディオタイプ抗体およびＣＥＡの両方に対するＴ細胞反応を示す患者があることが明らかにされた。しかしこの研究では、抗イディオタイプはＣＴＬ反応を誘導することができなかった(Foon、K.A.、et al (1999) J.Clin.Oncology. 17：2889-2895)。
ＣＥＡ以外に腫瘍抗原を擬態する抗イディオタイプ抗体が、治療ワクチンとしての有用性をもつかどうかについて臨床研究が行われた。そのうちの数例を挙げると、ＧＤ２抗原および抗イディオタイプ抗体１Ａ７(米国特許明細書第6,509,016号)、ＧＤ３抗原の抗イディオタイプ抗体(米国特許明細書第5,529,922号、欧州特許明細書第0473721号)の他、ｐ97抗原によるメラノーマ(米国特許明細書第4,918,164号)などがある。例えば、米国特許明細書第5,766,588号において教示されているように、抗イディオタイプ抗体を開発する、より複雑で適応可能な免疫治療法も進められている。
特に、抗イディオタイプ抗体を使用するワクチン接種計画の一例として、ヒトモノクローナル抗体107ＡＤ５に関する研究が挙げられる。この抗体は、結腸直腸癌細胞上にみられる腫瘍関連抗原791Ｔ／ｇｐ72としても知られているＣＤ55タンパク質の分子擬態となるということが明らかにされた。ＣＤ55タンパク質は、補体が仲介する攻撃から細胞を守る働きをするため、通常、癌細胞の中で高いレベルでみられる(Li、L.、et al (2001) Br.J.Cancer 84：80-86)。107ＡＤ５抗体は多くの臨床試験において有望であることが示された。また、多数の患者において、ＩＬ−２誘導を含む抗腫瘍免疫応答を測定することができた(Robins、R.A et al(1991)Cancer Res. 51：5425-5429；Denton、G.W.L.、et al (1994) Int.J.Cancer 57：10-14；およびWO90/04415号)。しかし、近年の臨床試験によって、大きな腫瘍負荷をもつ患者にとって有効であるのはこの抗体だけではないだろうということがわかり、この抗体を用いたワクチン接種戦略は微小残存病変を有する患者においてより有益ではないかと考えられる(Maxwell-Armstrong、C.A. et al (2001) Bri.J.Cancer 84：1443-1446)。
このように明らかな進展があるとはいえ、ヒト癌細胞全般、また特にＣＥＡ陽性癌細胞および／またはＣＤ55過剰発現陽性の癌への免疫応答を誘導することができる改良分子が依然として必要とされている。
（発明の要約）
本発明は、ＣＥＡ陽性腫瘍に対する抗イディオタイプワクチンとして使用するのに好適なポリペプチドを提供する。本願発明者らは、効率的かつ持続的な宿主抗腫瘍反応を引き起こすため、ＣＥＡを有する腫瘍細胞に対するＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスIIの両方により仲介される免疫反応を誘導することが必要かつ重要であることを認識した。本願のポリペプチド組成物は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスIIの両方に限定されるＣＥＡエピトープを提供することができる。
本発明は、ＣＥＡ陽性腫瘍に対する抗イディオタイプワクチンとして使用するのに好適なポリペプチドを提供する。本願発明者らは、効率的かつ持続的な宿主抗腫瘍反応を引き起こすため、ＣＥＡを有する腫瘍細胞に対するＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスIIの両方により仲介される免疫反応を誘導することが必要かつ重要であることを認識した。本願のポリペプチド組成物は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスIIの両方に限定されるＣＥＡエピトープを提供することができる。
本発明は、ポリペプチド配列の大部分がマウス抗イディオタイプ抗体708由来である改変されたポリペプチドを提供する。ポリペプチド配列が、抗体708のＶ領域と配列領域を共有する場合、ＣＥＡおよび／またはＣＤ55抗原からの配列領域が、付加的に提供される多くの実施形態を提供する。別の実施形態では、アミノ酸置換が実施される結果、所望しないＴ細胞エピトープが除去されたポリペプチド配列が提供される。そのような組成では、ＣＥＡおよび／またはＣＤ55エピトープ成分に誘導される免疫応答を集中させ、所望の抗癌反応に寄与しない、競合するペプチドエピトープを除去することを意図している。
親708抗体は抗ＣＥＡ抗体ＮＣＲＣ23を抗原として用いて作製した。ＮＣＲＣ23モノクローナル抗体それ自体はＣＥＡ特異的エピトープに結合し、正常組織と最小限の交差反応性を示す(Price、M.R. et al(1987)、Cancer、Immunology and Immunotherapy(免疫学と免疫療法).25：10-15)。抗イディオタイプ抗体708はＮＣＲＣ23を特異的に認識し、ＣＥＡを認識するマウスおよびラット中のＡｂ３抗体を誘導することができる。特に重要なことは、708の抗イディオタイプ抗体はまた、ＣＥＡまたはＣＥＡを発現する腫瘍細胞のいずれかを認識する癌患者からのヒトＴリンパ球を初回免疫することができるということである(Durrant、L.G. et al(1992), Int.J.Cancer. 50：811-816)。
708抗体の可変領域配列を得て、ＣＥＡタンパク質の各領域と相同性を有する配列要素の存在の有無について分析を行った。Ｈ鎖(ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３)の第１および第２相補性決定領域は、ＣＥＡとの相同性を示すが、密接な関係のある分子ＮＣＡまたはＢＧＰとの相同性はない。特にＨ鎖の708可変領域および相補性決定領域(ＣＤＲ)は、ＣＥＡ分子の特定の要素の分子擬態を表わす。これらはまた、ＣＥＡのための708抗体のイディオタイプ特質の根拠となると考えられる。
本発明は、親抗体708を改変した誘導体のバージョンを含む。すべての好ましい実施形態において、改変708分子には、親マウスＣ領域の代わりにヒトＣ領域ドメインが含まれる。その他の改変は、分子のＶ領域ドメイン内で行われる。そのような改変は、以下の目的に向けられる１つ以上の変更を含むものとして要約することができるが、ＣＥＡ配列に向けられる変更を少なくとも１つ含まなければならない。
Ｉ．既存のＣＥＡ相同性をもつ領域の、ＣＥＡ配列同一性をもつ領域への転換。
ＩＩ．既存の短い配列領域をＣＥＡ由来配列領域と置換。
ＩＩＩ．既存の短い配列領域を抗体107ＡＤ５由来配列領域と置換。
ＩＶ．既存の短い配列領域をＣＤ55由来配列領域と置換。
Ｖ．特定のアミノ酸残基を代替アミノ酸残基と置換することによる所望しないＴ細胞エピトープの除去。
Ｉ．既存のＣＥＡ相同性をもつ領域の、ＣＥＡ配列同一性をもつ領域への転換。
ＩＩ．既存の短い配列領域をＣＥＡ由来配列領域と置換。
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ＩＶ．既存の短い配列領域をＣＤ55由来配列領域と置換。
Ｖ．特定のアミノ酸残基を代替アミノ酸残基と置換することによる所望しないＴ細胞エピトープの除去。
その結果、本発明は、上記の目的のうち１つ以上に従ってそれぞれ設計され、かつ天然の708Ｖ領域、ヒトＣＥＡ分子、および／またはヒトＣＤ55分子あるいはＣＤ55分子のイディオタイプとの同一性または密接な相同性をもつ配列要素をそれぞれに特徴として備えた新規のポリペプチド配列を、マウス抗体107ＡＤ５の形態で提供する。本発明は、上記にリストした「設計要素」のすべてを共に包含する多くのポリペプチド配列を組込む。本発明に開示される各ポリペプチドは、本発明の実施形態である。
要約すると、本発明は次の問題に関するものである。
・親抗イディオタイプ抗ＣＥＡ抗体に由来し、ヒト由来の定常領域および合成的に設計された可変領域を含む免疫グロブリン分子あるいはその断片であって、ヒト腫瘍抗原ＣＥＡ(癌胎児性抗原)に由来する５つ以上(好ましくは５から20)の連続するアミノ酸残基を有する配列領域を１つ以上含むことを特徴とする分子またはその断片。対応する抗イディオタイプ抗体の軽鎖または重鎖のＣＤＲと正確に同じ長さ(アミノ酸残基数)をもつ配列領域が最も好ましい(例えば、５、７、８、９、10、11、12、17、18)。
・前記配列領域の少なくとも１つが、前記免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖の相補性決定領域(ＣＤＲ)の成分であるか、または前記ＣＤＲに隣接するフレームワーク領域に隣接する残基とオーバーラップすることを特徴とする、対応する免疫グロブリン分子。
・前記成分が、前記ＣＤＲのアミノ酸残基の30〜100％(好ましくは80〜100％)を形成することを特徴とする、対応する免疫グロブリン分子。
・前記親抗イディオタイプ抗体が、マウス抗体708であることを特徴とする、対応する免疫グロブリン分子。ただし本発明によればこれ以外の抗イディオタイプ抗ＣＥＡ抗体も好適である。
・可変領域内に、ヒトＣＤ55抗原由来の５〜25(好ましくは10から20)の連続するアミノ酸残基を有する配列領域あるいは抗イディオタイプ抗ＣＤ55抗体の超可変領域を追加的に含むことを特徴とする、対応する免疫グロブリン分子。ここで抗体105ＡＤ７が好ましい。
・可変領域内で、さらに可能性のあるＭＨＣクラスIIエピトープ(ＣＥＡ陽性ヒト癌細胞への免疫応答に寄与しない)が、アミノ酸置換によって除去されていることを特徴とする、対応する免疫グロブリン分子。
・可変領域内に、さらにＭＨＣクラスＩエピトープであるＣＥＡ由来配列領域(好ましくはＴＬＬＳＶＴＲＮＤＶおよびＹＬＳＧＡＮＬＮＬ)を含むことを特徴とする、対応する免疫グロブリン分子であって、本発明の好ましい実施形態においては、前記配列領域が、前記免疫グロブリンの軽鎖のＣＤＲの１つ以上の一部であるか、またはその全部を成す免疫グロブリン分子。
・可変領域内に、ＣＥＡ由来の、ＭＨＣクラスIIエピトープである配列領域を追加的に含み、この配列領域がＣＥＡ陽性ヒト癌細胞に向けられる免疫応答に寄与することを特徴とする、対応する免疫グロブリン分子。
・図４乃至７に示される配列のいずれかより選ばれる可変重鎖および／または図８および９に示される配列のいずれかより選ばれる可変軽鎖を含むことを特徴とする、対応する免疫グロブリン分子。
・可変重鎖および／または軽鎖が、以下の群から選ばれる配列領域と同一性を有する１つ以上の配列領域を含むことを特徴とする、対応する免疫グロブリン分子。
(i)ヒトＣＥＡの３４５〜３５４
(ii)ヒトＣＥＡの３８７〜３９６
(iii)ヒトＣＥＡの５７１〜５７９
(iv)ヒトＣＥＡの６２９〜６４５
(v)ヒトＣＤ５５の１４８〜１６７
・生物学上有効な量の上記免疫グロブリン分子、アジュバント、および場合により薬学的に許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤を含むことを特徴とする医薬品組成物。
・ＣＥＡ陽性固形腫瘍または転移性腫瘍に罹患しているヒト個体にワクチン接種を行うための薬剤を製造するための、上記の指定された請求項のうちのいずれか１項に記載の免疫グロブリン分子または医薬品組成物の使用。ここで前記ワクチン接種は前記個体中にＣＤ８および／またはＣＤ４陽性のＴ細胞の改善された刺激をもたらすことが好ましい。
・ＣＥＡ(癌胎児性抗原)陽性の固形腫瘍または転移性腫瘍に罹患しているヒト個体の治療に好適な、合成的に設計された免疫グロブリン分子に基づくワクチン分子の作製方法であって次のステップを含む、
(i)非ヒト抗イディオタイプ抗ＣＥＡ抗体を選択する、好ましくはマウス抗体708であり、
(ii)非ヒト定常領域をヒト定常領域と置換する、
(iii)部分的または完全に超可変領域(ＣＤＲ)の１つ以上を、ＣＥＡ由来配列領域で交換し、それによって、前記ＣＤＲに隣接しているフレームワーク残基を含み、さらに場合により、次のグループから選ばれるステップ１つ以上をさらに含むことを特徴とする方法。
(iv)可変領域内の配列領域を、ＣＤ55抗原由来の領域または抗イディオタイプ抗ＣＤ55抗体のＣＤＲと置換する。
(v)可変領域内の配列領域を、ＣＥＡ陽性ヒト癌細胞に向けた免疫応答に寄与するＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣIIエピトープである可変領域と置換する。
(vi)可変領域内において、ＣＥＡ陽性ヒト癌細胞への免疫応答に寄与しない潜在的ＭＨＣクラスIIエピトープを除去する。
・親抗イディオタイプ抗ＣＥＡ抗体に由来し、ヒト由来の定常領域および合成的に設計された可変領域を含む免疫グロブリン分子あるいはその断片であって、ヒト腫瘍抗原ＣＥＡ(癌胎児性抗原)に由来する５つ以上(好ましくは５から20)の連続するアミノ酸残基を有する配列領域を１つ以上含むことを特徴とする分子またはその断片。対応する抗イディオタイプ抗体の軽鎖または重鎖のＣＤＲと正確に同じ長さ(アミノ酸残基数)をもつ配列領域が最も好ましい(例えば、５、７、８、９、10、11、12、17、18)。
・前記配列領域の少なくとも１つが、前記免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖の相補性決定領域(ＣＤＲ)の成分であるか、または前記ＣＤＲに隣接するフレームワーク領域に隣接する残基とオーバーラップすることを特徴とする、対応する免疫グロブリン分子。
・前記成分が、前記ＣＤＲのアミノ酸残基の30〜100％(好ましくは80〜100％)を形成することを特徴とする、対応する免疫グロブリン分子。
・前記親抗イディオタイプ抗体が、マウス抗体708であることを特徴とする、対応する免疫グロブリン分子。ただし本発明によればこれ以外の抗イディオタイプ抗ＣＥＡ抗体も好適である。
・可変領域内に、ヒトＣＤ55抗原由来の５〜25(好ましくは10から20)の連続するアミノ酸残基を有する配列領域あるいは抗イディオタイプ抗ＣＤ55抗体の超可変領域を追加的に含むことを特徴とする、対応する免疫グロブリン分子。ここで抗体105ＡＤ７が好ましい。
・可変領域内で、さらに可能性のあるＭＨＣクラスIIエピトープ(ＣＥＡ陽性ヒト癌細胞への免疫応答に寄与しない)が、アミノ酸置換によって除去されていることを特徴とする、対応する免疫グロブリン分子。
・可変領域内に、さらにＭＨＣクラスＩエピトープであるＣＥＡ由来配列領域(好ましくはＴＬＬＳＶＴＲＮＤＶおよびＹＬＳＧＡＮＬＮＬ)を含むことを特徴とする、対応する免疫グロブリン分子であって、本発明の好ましい実施形態においては、前記配列領域が、前記免疫グロブリンの軽鎖のＣＤＲの１つ以上の一部であるか、またはその全部を成す免疫グロブリン分子。
・可変領域内に、ＣＥＡ由来の、ＭＨＣクラスIIエピトープである配列領域を追加的に含み、この配列領域がＣＥＡ陽性ヒト癌細胞に向けられる免疫応答に寄与することを特徴とする、対応する免疫グロブリン分子。
・図４乃至７に示される配列のいずれかより選ばれる可変重鎖および／または図８および９に示される配列のいずれかより選ばれる可変軽鎖を含むことを特徴とする、対応する免疫グロブリン分子。
・可変重鎖および／または軽鎖が、以下の群から選ばれる配列領域と同一性を有する１つ以上の配列領域を含むことを特徴とする、対応する免疫グロブリン分子。
(i)ヒトＣＥＡの３４５〜３５４
(ii)ヒトＣＥＡの３８７〜３９６
(iii)ヒトＣＥＡの５７１〜５７９
(iv)ヒトＣＥＡの６２９〜６４５
(v)ヒトＣＤ５５の１４８〜１６７
・生物学上有効な量の上記免疫グロブリン分子、アジュバント、および場合により薬学的に許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤を含むことを特徴とする医薬品組成物。
・ＣＥＡ陽性固形腫瘍または転移性腫瘍に罹患しているヒト個体にワクチン接種を行うための薬剤を製造するための、上記の指定された請求項のうちのいずれか１項に記載の免疫グロブリン分子または医薬品組成物の使用。ここで前記ワクチン接種は前記個体中にＣＤ８および／またはＣＤ４陽性のＴ細胞の改善された刺激をもたらすことが好ましい。
・ＣＥＡ(癌胎児性抗原)陽性の固形腫瘍または転移性腫瘍に罹患しているヒト個体の治療に好適な、合成的に設計された免疫グロブリン分子に基づくワクチン分子の作製方法であって次のステップを含む、
(i)非ヒト抗イディオタイプ抗ＣＥＡ抗体を選択する、好ましくはマウス抗体708であり、
(ii)非ヒト定常領域をヒト定常領域と置換する、
(iii)部分的または完全に超可変領域(ＣＤＲ)の１つ以上を、ＣＥＡ由来配列領域で交換し、それによって、前記ＣＤＲに隣接しているフレームワーク残基を含み、さらに場合により、次のグループから選ばれるステップ１つ以上をさらに含むことを特徴とする方法。
(iv)可変領域内の配列領域を、ＣＤ55抗原由来の領域または抗イディオタイプ抗ＣＤ55抗体のＣＤＲと置換する。
(v)可変領域内の配列領域を、ＣＥＡ陽性ヒト癌細胞に向けた免疫応答に寄与するＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣIIエピトープである可変領域と置換する。
(vi)可変領域内において、ＣＥＡ陽性ヒト癌細胞への免疫応答に寄与しない潜在的ＭＨＣクラスIIエピトープを除去する。
本発明の第１の実施形態は、ヒト定常領域をもつ抗体708を含む抗体分子の提供である。
第２の実施形態は、ヒト定常領域をもち、かつＶ領域ドメインの改変を特徴とする抗体708の提供である。好ましい改変は、その分子のＣＤＲ部位の１つ以上の中で行われ、その結果ヒトＣＥＡとの同一性をもつ配列領域が存在することになる。このようなＣＥＡ配列要素は「所望の」エピトープと見なされる。別の実施形態では、所望のＣＥＡエピトープの数は、他のＣＥＡ由来配列要素の導入によってさらに増加する。また別の実施形態では、代替の所望のエピトープが、アミノ酸残基の置換により、配列の中に付加的に含まれる。特に所望される代替エピトープは、ヒトＣＤ55抗原または105ＡＤ７と名付けられたマウス抗体からの配列である。105ＡＤ７は、それ自体が、自らＣＤ55タンパク質の分子擬態となる抗イディオタイプモノクローナル抗体である(Maxwell Armstrong、C.A.、et al (2001) Bri.J.Cancer 84：1433-1436)。そのような所望の追加のエピトープは、ＣＤＲを含んでいてよい位置の抗体Ｖ領域かまたは隣接するフレームワーク領域に挿入される。
本発明の別の実施形態では、所望しないエピトープ配列を欠失させたＶ領域ドメイン内に所望のエピトープ配列を１つ以上含む抗体配列が提供される。この場合、そのような配列はＭＨＣクラスIIに向けられるエピトープであり、ヒト母集団において残存する少なくとも１つのＭＨＣクラスIIアロタイプのリガンドを構成するペプチド内の判断力のあるアミノ酸置換によって除去される。
本発明のスキーム下では、４つの異なるＨ鎖Ｖ領域配列および２つの異なるＬ鎖Ｖ領域配列が提供される。本発明の開示において、完全抗体分子を構成するために提供されてもよいＨ鎖およびＬ鎖の可能な組み合わせに制限はない。完全抗体分子の構成は、組換ＤＮＡ技術、および当該分野で既知の抗体分子を精製・操作する方法によって達成されてもよい。本発明に開示されるポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド(例えばＤＮＡ)分子は、本発明の範囲下で等しく考慮され、好ましい実施形態である。
本発明の抗体分子は完全な状態での使用を意図されているが、これに制限されるものではなく、抗体の免疫原性断片の使用を考慮してもよい。したがって、Ｆｖ、Ｆａｂ、又はＦ(ａｂ')２あるいは他の誘導体を、組換え技術を用いて調製してもよいし、従来の抗体タンパク質分解分割・精製技術を用いて断片を調製してもよい。
本発明の課題は、本発明に開示される抗体が、免疫原量の、および最も好ましくは治療量の本発明の改変抗体分子の少なくとも１つを含む組成物中に有用性を見出すことである。免疫原量または治療量とは、本治療を受ける患者のうち、免疫応答が最も好ましくは体液性応答と細胞性応答の両方である患者の免疫応答を刺激することができる抗体組成物の量である。その治療量が、ＣＥＡを発現する腫瘍細胞に対する活動亢進を示す患者の免疫系をもたらす組成物を提供することが最も好ましい。本組成物は腫瘍細胞を除去したり腫瘍の成長を抑制するのに治療効果を発揮する。
（図面の説明）
図１は、708抗イディオタイプ抗体およびＣＥＡのＣＤＲ部位の配列比較である。太字のアミノ酸は同一のものを示し、下線付きのアミノ酸は次のアミノ酸と同一であるかまたは類似していることを示す。
図１は、708抗イディオタイプ抗体およびＣＥＡのＣＤＲ部位の配列比較である。太字のアミノ酸は同一のものを示し、下線付きのアミノ酸は次のアミノ酸と同一であるかまたは類似していることを示す。
図２は、708抗イディオタイプの重鎖のＣＤＲ２およびＣＤＲ３の可変領域のＭＨＣ結合モチーフ分析の例である。太字のアミノ酸は同一のものを示し、下線付きのアミノ酸は次のアミノ酸と同一であるかまたは類似していることを示す。
図３は、抗体708の可変領域のタンパク質配列(１文字コード)を示す。Ａは重鎖、Ｂは軽鎖、下線付きの配列はＣＤＲである。ＦＲはフレームワーク配列である。ＣＤＲ指定はＫａｂａｔのスキームによる(Martin、A.C.R. (1996)、PROTEINS：Structure、Function and Genetics(構造、機能、および遺伝学)、25 130-133）。ただし残基のナンバリングは本発明に従い個別に修正されている。
図４は、708ＶＨ１のタンパク質配列(１文字コード)を示す。この配列は708ＶＨを含み、所望でないエピトープは除去されている。下線付きの配列はＣＤＲである。
図５は、708ＶＨ２のタンパク質配列(１文字コード)を示す。この配列は708ＶＨを含み、所望でないエピトープは除去されている。また付加的なＣＥＡ関連配列を含んでいる。下線付きの配列はＣＤＲである。
図６は、708ＶＨ３のタンパク質配列(１文字コード)を示す。この配列は708ＶＨを含み、所望でないエピトープは除去されている。また付加的なＣＥＡおよびＣＤ55由来配列を含んでいる。下線付きの配列はＣＤＲである。
図７は、708ＶＨ４のタンパク質配列(１文字コード)を示す。この配列は708ＶＨを含み、所望でないエピトープは除去されている。また付加的なＣＥＡおよび105ＡＤ７由来配列を含んでいる。下線付きの配列はＣＤＲである。
図８は、708ＶＬ１のタンパク質配列(１文字コード)を示す。この配列は708ＶＬを含み、所望でないエピトープは除去されている。下線付きの配列はＣＤＲである。
図９は、708ＶＬ２のタンパク質配列(１文字コード)を示す。この配列は708ＶＬを含み、所望でないエピトープは除去されている。また付加的なＣＥＡ関連配列を含んでいる。下線付きの配列はＣＤＲである。
図10は、ＣＥＡのタンパク質配列(１文字コード)を示す。
図11は、ＣＤ５５抗原のタンパク質配列(１文字コード)を示す。
（発明の詳細な説明）
本発明の分子は、抗癌ワクチンの有効成分としての有用性をもつ改変抗体分子である。したがって、本発明はヒト疾患の治療に関する。本分子は、708と名付ける抗イディオタイプ抗体として考案されるものである。708モノクローナル抗体は、抗ＣＥＡモノクローナル抗体ＮＣＲＣ23に対するものとして作製した。天然の708抗体は、抗原を備えたＮＣＲＣ23の相互作用をブロックすることができ、この抗原を特異的に認識する抗体反応およびＴ細胞反応の両方を誘導することができる。しかし、天然のマウス708抗体は、正常なドナーからのリンパ球を刺激することができなかった(Durrant、L.G. t al(1992)、ibid)。抗癌ワクチンとしての働きの能力を改良しようと、天然の708抗体に対して様々な改変を行った。そのような改変の結果、本発明に開示される組成物が生み出され、また本発明の実施形態となった。天然の(親)マウス708抗体への改変はすべて、当技術分野で既知の遺伝子工学的手段を広く使用することによって実施することができる。
本発明の分子は、抗癌ワクチンの有効成分としての有用性をもつ改変抗体分子である。したがって、本発明はヒト疾患の治療に関する。本分子は、708と名付ける抗イディオタイプ抗体として考案されるものである。708モノクローナル抗体は、抗ＣＥＡモノクローナル抗体ＮＣＲＣ23に対するものとして作製した。天然の708抗体は、抗原を備えたＮＣＲＣ23の相互作用をブロックすることができ、この抗原を特異的に認識する抗体反応およびＴ細胞反応の両方を誘導することができる。しかし、天然のマウス708抗体は、正常なドナーからのリンパ球を刺激することができなかった(Durrant、L.G. t al(1992)、ibid)。抗癌ワクチンとしての働きの能力を改良しようと、天然の708抗体に対して様々な改変を行った。そのような改変の結果、本発明に開示される組成物が生み出され、また本発明の実施形態となった。天然の(親)マウス708抗体への改変はすべて、当技術分野で既知の遺伝子工学的手段を広く使用することによって実施することができる。
そのような改変の第一番目は、各変異708分子に共通するものである。その修正は、定常領域のドメインヒト定常領域蛋白質配列となるよう改変するものである。当該分野では、そのような改変を行った抗体をキメラ抗体と名付けることが一般的である。本発明に関して、マウス708抗体のキメラ抗体への転換は、改変される708分子が抗癌ワクチンとして働く能力に関してきわめて重要な意味をもつ。本発明者らは、ナイーブＴ細胞応答を刺激するには、樹状細胞のような適切な抗原提示細胞の標的が必要であることを認識した。本発明のそれぞれの改変708分子のヒト定常領域ドメインは、樹状細胞などの細胞上のＦｃ(ＣＤ64)受容体によってその分子の取り込みが可能になる。このルートを経由して取り込まれる結果、ヘルパー細胞反応および細胞傷害性Ｔ細胞反応の両方の初回抗原刺激が行われることが示された(Durrant、L.G.、 et al (2001)、 Int.J.Cancer.92：414-420)。本例では、ヒトＩｇＧ１アイソタイプが708由来ＶのＶ領域に改変された。ただし、原則として、本発明のスキーム下では、Ｆｃ受容体系によって認識されることができるいかなるアイソタイプも組込むことが可能であるということは理解されなければならない。
708抗体の第１の改変がキメラ抗体への転換であり、したがって定常領域の改変を伴う場合、後の改変、およびそれ故の本発明の実施形態は、親708抗体のＶ領域の改変に向けられる。708のＶ領域配列はすでに記述されているが(WO98/52976)、そのタンパク質配列を図３として再び本願において示す。相補性決定領域(ＣＤＲ)配列を、ＣＥＡおよびＮＣＡのような関連配列との相同性をもつ領域について解析した。ＣＤＲＨ２はＣＥＡの３つの特定範囲との相同性を示す。また、このうちの２つはＮＣＡとの相同性も共有する。三番目の領域はＣＥＡに特異的な領域にある。ＣＥＡ特異的領域に結合する、オリジナルのＡｂ１ ＮＣＲＣ23として、抗イディオタイプ708がＣＥＡ相同配列を含むことは予期できないことではない。ＣＤＲＨ２にみられる領域に加えて、ＣＤＲＨ３はＣＥＡの３つの部位との相同性を示し、また、これらはＮＣＡとの相同性も共有している。ポリペプチドとポリヌクレオチドの配列の比較分析は当該分野で既知であり、そのような手順を可能にする多くのソフトウェアツールがある。上述の抗体708とＣＥＡ配列の比較に用いられるそのようなツールの１つが、「DNAstar」(DNASTAR社、マディソン、ウィスコンシン州、アメリカ)である。DNAstarは、タンパク質配列の類似性解析に特に役立つLipman ＆ Pearson(Lipman ＆ Pearson (1985)、Science 227：1435-1441)を含むいくつかのアラインメントアルゴリズムを実装している。
抗体708の重鎖および軽鎖領域、ならびに認識されたＴ細胞エピトープモチーフに一致するヒトＣＥＡについての分析も行われた。そのような解析は、例えばWO98/52976またはSYFPEITHI (Rammensee、H.G. et al (1999) Immunogenetics 50：213-219)などのデータベースを参照して記述される、当該分野で既知の方法を用いて行ってよい。ある解析では、ＨＬＡ−Ａ３、Ａ11、Ａｗ68、Ｂ35、Ｂ53、ＤＲ１、ＤＲ３、ＤＲ７およびＤＲ８結合モチーフを含むＣＤＲＨ２領域が明らかにされている。並行して行われたＣＥＡ配列の解析では、さらに、ＨＬＡ−Ａ３、ＤＲ１およびＤＲ７モチーフがＣＤＲＨ２との相同性をもつＣＥＡ特異的エリアの中に存在することが確認された。ＣＤＲＨ３領域には、ＨＬＡ−Ａ２、Ａ３、Ａ11、Ａ24、Ｂ27、ＤＱ７、ｐａｎ ＤＲ、およびＤＲ１結合モチーフが含まれていた。ＨＬＡ−Ａ３モチーフもＣＥＡの相同部位において見出された。ＣＥＡのこの領域はＮＣＡとの相同性も示すが、ＮＣＡには、ロイシンからアルギニンまでのアミノ酸の差異がある。ロイシンはＡ３結合のための重要なポケット残基であるため、ＮＣＡを発現する細胞がＨＬＡ−Ａ３の文脈中でこのエピトープを提示することは考えられない。以上の結果により、ＨＬＡ−ＤＲ１または７、およびＨＬＡ−Ａ３表現型をもつ患者は、天然の708に対するヘルパー細胞応答と細胞傷害性Ｔ細胞応答の両方を示し、それらのＣＥＡ陽性腫瘍にも応答する可能性が高いことが示唆された。
総合すると、以上の結果と観察により、天然の708のＶ領域配列はＣＥＡ分子の分子擬態を提供するということが理解される。また、その擬態は、ＣＥＡ配列上の多くの異なる位置に向けられると思われる。そして今度は、これらの配列が、多くのＴヘルパーおよび細胞傷害性Ｔ細胞タイプモチーフを確認する。本発明者らは、分子内のＣＥＡ様配列の程度を増加させるように配列を改変することにより、天然の708配列の固有のＣＥＡ様免疫原プロファイルを増加させようと努力を重ねてきた。戦略を拡張し、入ってくるＣＥＡ由来配列との既存の相同性が存在しない位置で、付加的なＣＥＡ由来配列要素の親708Ｖ領域への接種を行った。このことを可能にしたのは免疫グロブリンＶ領域の固有の柔軟性であった。すなわち、特定のゾーン(ＣＤＲ)で配列の超可変性を受け入れることができ、それでいて、全体的な構造上の統合性をもち、かつ他のあらゆる免疫グロブリン分子として発現され処理される能力を保持しているという点である。このプロセスは、改変された抗体は抗原結合活性のどんな形式も保持しなければならないという必要性はないことによってさらに促進される。実際に、本発明の製剤によって、任意の抗原、特に細胞結合抗原との相互作用が可能にならないことが最も好ましい。
本発明のポリペプチド分子は、被験体患者の免疫系に免疫性エピトープを提供し、ＣＥＡを発現する細胞を除去するため、患者の免疫系を新たな標的とする目的で設計された。したがって、免疫系の体液性と細胞性の両面の力を惹起することが重要であり、このことは、強力なＴヘルパーエピトープおよびＭＨＣクラスＩ限定エピトープの両方によって可能になるものである。多くのＭＨＣクラスＩ限定エピトープが、過去においてＣＥＡ配列内で同定されており、臨床試験のテーマとなった場合もあった(Kwong、Y. et al (1995) JNCI 87：982-990)。本発明において、既知のＭＨＣクラスＩエピトープであるＣＥＡ由来配列領域ＴＬＬＳＶＴＲＮＤＶ(残基345-353位)およびＹＬＳＧＡＮＬＮＬ(残基571-579位）を、軽鎖のＣＤＲに改変した。
ＣＥＡ由来配列領域を用いるという点に加えて、本発明の別の重要な特徴は、ＣＤ55配列の取り込み、および抗体105ＡＤ７からの配列領域という形態でのＣＤ55の一部の擬態バージョンである。ＣＤ55分子は、正常なヒト組織で広く発現し、そこで補体およびナチュラルキラー(ＮＫ)細胞が仲介する溶解から細胞を保護する役割をする。免疫療法の目標としてのＣＤ55の有効性は、多数の腫瘍タイプ上で増加したＣＤ55の発現を観察することや、抗体105ＡＤ７を用いる研究から示される。この抗体105ＡＤ７は、ＣＤ55の上のエピトープを擬態する。また、ワクチン接種戦略として完全105ＡＤ７抗体による治療を受けた患者のＴ細胞応答が刺激されたことが臨床試験において実証された(WO97/32021およびその中の全参考文献)。
本発明は、初めて、ＣＥＡ、ＣＤ55および／または105ＡＤ７由来の免疫原性エピトープの組み合わせを特徴としてもつ組成物を提供するものである。さらに、ヒト免疫応答の刺激という点で、それぞれに証明された生物学的能力をもつエピトープを、エピトープがそれぞれ合成ペプチドとして提供されるスキームの例により技術的にも生物学にもメリットの大きい免疫グロブリン分子の一部として提供する。分子実体として、本発明のポリペプチドを「抗原化抗体」と記載することができるかもしれない。文献ではＭＨＣクラスＩとＭＨＣクラスIIタイプエピトープとの組み合わせを特徴としてもつ抗体に含まれる、抗原化抗体についての報告がある(Zaghouani、H. et al (1993) Eur.J.Immunol. 23：2746-2750；Xiong、S. et al (1997) Nature Biotech. 15：882-886およびその中の文献）。本発明者らが本発明のスキームにより理解するところによれば、これらのアプローチのいずれも、開発されたイディオタイプ決定基である自己抗原に向けられておらず、また所望でない免疫原性エピトープの改変されない配列を減らす手順も踏んでいない。同様に、これらの従来の研究はいずれも、癌免疫療法に向けられた組成物を提供していなかった。
したがって、本発明は、ＣＥＡ分子の領域への同一性を共有する、配列領域を含む改変されたＶ領域配列を提供する。本発明はさらに、ＣＤ55分子の中に存在する配列領域と同一性を共有するＶ領域配列を開示する。さらに別の実施形態では、抗体107ＡＤ５からの配列領域を含むよう改変されたＶ領域配列が開示される。具体的には、ＣＥＡ配列からの残基345-354、386-397、571-579、および629-645との同一性をもつ残基およびＣＤ55分子の残基148-167との同一性をもつ配列を含むＶ領域配列を提供する。抗体107ＡＤ５のＶＨ鎖の大多数のフレームワーク１に対応する配列は、本発明において開示された１つの変異体に組み込まれる。具体的には、図７の配列による組成物が好ましく、本発明中に記述される708ＶＨ３配列内の対応する領域と置換される107ＡＤ５ ＶＨフレームワーク１領域の配列要素を含んでいる。
改変708分子のＶＨ鎖に挿入されたＣＥＡ配列要素については、その挿入は、ＣＥＡ配列との顕著な相同性が親分子に存在した領域中に行われたということが理解されよう。したがって、図５に示される好ましいＶＨ組成物は、ＣＤＲＨ２領域を包含するゾーンでＶＨ鎖に挿入されたＣＥＡ残基629-645を含み、かつ、ＣＤＲＨ３領域を包含するゾーンでＶＨ鎖に挿入されたＣＥＡ残基386-397をも含むものである。好ましいＶＬ鎖組成物は、ＣＥＡ配列要素345-354と571-579を提供する。345-354はＣＤＲＬ１ゾーンを、また571-579はＣＤＲＬ３ゾーンを抱合する領域でＶＬ鎖に挿入される(図９)。領域148-167のような前記ＣＤ55配列要素を含んでいる好ましい組成物は、フレームワーク１の遠位部とＣＤＲＨ１の全体を含むゾーン内に、ＶＨ鎖に挿入された前記ＣＤ55配列を含んでいる(図６)。
本願で用いる「免疫原性」という用語は、宿主動物において(特に「宿主動物」がヒトである場合）、体液性応答またはＴ細胞仲介応答を刺激し、誘導し、さもなくば促進する能力を含むことが理解されなければならない。
本願で用いる「抗体」すなわち「免疫グロブリン」という用語は、最も広義で用いられ、具体的には、所望の生物活性を示すものであれば、完全なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全な抗体から形成される多重特異的な抗体(例えば二重特異性抗体)、および抗体断片まで含まれる。その用語には、一般に、共に連結される異なる結合特異性をもつ２つ以上の抗体またはその断片からなる異種抗体が含まれる。
それらの定常領域のアミノ酸配列によって、完全な抗体を様々な「抗体(免疫グロブリン)クラス」に割り当てることができる。完全な抗体には５つの主なクラスがある。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭであり、これらのいくつかのものはさらに「サブクラス」(アイソタイプ)(例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２)に分類されてもよい。異なるクラスの抗体に相当する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれている。本発明の抗体のための好ましい主なクラスはＩｇＧであり、より詳細にはＩｇＧ１およびＩｇＧ２である。
抗体とは、通常２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖からなる、分子量約150,000の糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有結合のジスルフィド結合によって重鎖に連結される。ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンのアイソタイプの重鎖により異なっている。各重鎖および軽鎖はまた、規則的に間隔を置いて配置された鎖内ジスルフィド架橋をもっている。各重鎖はその一端に可変領域(ＶＨ)をもち、その後に多くの定常ドメインが続いている。可変領域には超可変領域すなわち「ＣＤＲ」領域が含まれるが、これは抗原結合部位を含んでおり、抗体の特異性を担っている。可変領域にはまた、また抗体の親和性／結合活性という点で重要な「ＦＲ」領域が含まれる。超可変領域には、一般に「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」(例えば軽鎖可変ドメインの残基24-34位(L1)、50-56位(L2)、および89-97位(L3)、ならびに重鎖可変ドメインの31-35位(H1)、50-65位(H2)、および95-102位(H3))から、および／または「超可変ループ」(例えば軽鎖可変ドメインの残基26-32位(L1)、50-52位(L2)、および91-96位(L3)、ならびに重鎖可変ドメインの26-32位(H1)、53-55位(H2)、および96-101位(H3)；(Chothia and Lesk J.Mol.Biol. 196：901-917 (1987)からのアミノ酸残基が含まれる)が含まれる。本願で定義する「ＦＲ」残基(フレームワーク領域)は、超可変領域の残基以外の可変領域残基である。各軽鎖は、片側(ＶＬ)に可変領域を、またもう一方の側に定常領域をもっている。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと並んでおり、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並んでいる。特定のアミノ酸残基が、軽鎖と重鎖の可変ドメインの間の境界面を形成していると考えられている。あらゆる脊椎動物種から得られる抗体の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)およびラムダ(λ)と呼ばれる２つの明白に異なる型のうちの１つに割り当てることができる。
「相補性決定領域」(ＣＤＲ)という用語は、Ｖ領域ドメインの残りに関連のある、抗体Ｖ領域内の超可変な配列セグメントを指す。抗原結合抗体のＣＤＲは抗体抗原相互作用の決定において決定的な役割をもつ。各Ｖ領域は３箇所のＣＤＲを含んでいる。ＶＨからのＣＤＲは、慣習的にＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と名付けられている。同様に軽鎖のＣＤＲはＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３と名付けられている。ＣＤＲには、「フレームワーク」(ＦＲ)セグメントまたはドメインと名付けられている、比較的変動しない領域が点在している。
本発明では、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖の両方のＣＤＲおよびフレームワーク領域の両方に対して改変を加えた。改変のうちのいくつかは分散した単一アミノ酸置換であるが、新しい配列領域を親Ｖ領域配列に挿入したものもある。
本明細書で使用するＶＨとは、長さで約110〜125アミノ酸残基であるポリペプチドを意味する。その配列は、ＶＬと組み合わせて免疫グロブリン分子を構成することができる、本発明中で指定されるＶＨ鎖のあらゆるものに対応する。同様に、本明細書で使用するＶＬとは、長さで約95〜130アミノ酸残基であるポリペプチドを意味する。その配列は、ＶＨと組み合わせて共結合でき、かつ完全免疫グロブリンテトラマーを構成することができる、本発明中で指定される、ＶＬ鎖のあらゆるものに対応する。完全長免疫グロブリン重鎖は分子量約50ｋＤａで、Ｎ末端でＶＨ遺伝子によりコードされ、またＣ末端で定常領域遺伝子(例えばγ)のうちの１つよりコードされている。同様に、完全長軽鎖は分子量約25ｋＤａで、Ｎ末端でＶ領域遺伝子によりコードされ、またＣ末端でκまたはλ定常領域遺伝子よりコードされている。
当該分野において、「抗体」という用語は、結合し、相互作用し、さもなくば抗原と結合できる分子を示すと受け取られている。また「抗原」という用語は、抗体と相互作用することができる物質を指すものとして用いられる。
本発明に関して、上記および以下で定義の改変免疫グロブリン配列は、特定の免疫原性ペプチド配列を輸送する媒体として役立てるために構築するものであり、また、本発明に開示されるポリペプチド配列の任意の組み合わせから生じる免疫グロブリンが、抗原のための結合実体として機能することができるかもしれないという期待はないしそのような願望もないということは容易に認識されよう。抗原結合を除くすべての点で、本発明に開示される分子は、抗体として同じドメイン構造および定常領域配列を保持し、それゆえ引き続き抗体と見なされる。
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、本質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、わずかな量存在する可能性がある天然の突然変異を除いて、同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対して向けられる、高度に特異的な抗体である。また、異なる決定基(エピトープ)に向けられる異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、合成してもよく他の抗体によって汚染されないという点で利点がある。モノクローナル抗体の製造法としては、KohlerおよびMilstein(1975、Nature 256、495)によって記述され、また「Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas(モノクローナル抗体技術、げっ歯動物およびヒトハイブリドーマの生産と特徴)」中に記載されているハイブリドーマ法などが挙げられる (1985年、Burdonら、Eds、生化学および分子生物学における検査手技、13巻、エルセビアーサイエンス出版、アムステルダム)。あるいは有名な組換ＤＮＡ方法によって作られてもよい(米国特許明細書第4,816,567号)。モノクローナル抗体はまた、例えば、Clackson et al. (Nature、352：624-628 (1991) and Marks et al.、 J.Mol.Biol.、 222：58、1-597 (1991)らにより記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。
「キメラ抗体」という用語は、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスやサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるかまたは相同性をもち、その一方で重鎖および／または軽鎖の残りが、別の種に由来するかまたは別のクラスやサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるかまたは相同性をもつ抗体を意味する。また、所望の生物活性(例えば米国特許明細書第4,816,567号；Morrison et al.、 Proc.Nat.Acad.Sci.USA、81：6851-6855 (1984)など)を示すものであれば、これらの抗体の断片も意味する。さらに、キメラ抗体およびヒト化抗体を作る方法は当技術分野で既知である。例えば、キメラ抗体を作る方法としては、Boss(Celltech)およびCabilly(Genentech)(米国特許明細書第4,816,397号、および同第4,816,567号)によって特許として記載されたものが挙げられる。
本発明の免疫グロブリンは、免疫グロブリンの完全抗体または断片であってもよい。「抗体フラグメント」は、それの抗原結合か可変領域を好ましくは含んで、完全な抗体の部分を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２、Ｆｖ、およびＦｃ断片、二重特異性抗体、線状抗体、単一鎖抗体分子、および抗体フラグメントから形成される多重特異的抗体が挙げられる。「完全な」抗体とは、抗原結合可変領域の他、軽鎖定常ドメイン(ＣＬ)および重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む抗体である。完全な抗体は１つ以上のエフェクター機能を持っていることが好ましい。抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体抗原結合性断片を産生する。これらは、それぞれ、単一の抗原結合部位およびＣＬおよびＣＨ１領域、そして残余の「Ｆｃ」断片(この名前は容易に結晶する能力を反映している)を含んでいる。抗体の「Ｆｃ」領域は、通例、ＣＨ２、ＣＨ３およびＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体主要クラスのヒンジ領域を含む。ヒンジ領域は、ＣＨ１領域とＣＨ２-ＣＨ３領域とが結合した約15アミノ酸残基のグループである。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を持っており抗原を架橋することができる「Ｆ(ａｂ')２」断片が産生される。「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、非共有結合でしっかりと結合した１つの重鎖可変領域および１つの軽鎖可変領域の二量体から成る。この配置において、個々の可変領域の３つの超可変領域(ＣＤＲ)が相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を規定する。６つの超可変領域がまとまって、抗原結合特異性を抗体に付与している。しかし、単一の可変ドメイン(あるいは１つの抗原に特異的な３つの超可変領域しか含まないＦｖの半分)でさえ、結合部位全体と比べると親和性は低いが、抗原を認識し結合する能力を持っている。Ｆａｂフラグメントもまた、軽鎖定常領域および重鎖の第１の定常領域(ＣＨ１)を含んでいる。「Ｆａｂ'」フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端で少数の残基が追加されるという点でＦａｂフラグメントと異なる。Ｆ(ａｂ')２抗体フラグメントは、もともとはＦａｂ'のペアとして生成され、Ｆａｂ'間にヒンジシステインをもつ断片である。抗体フラグメントの他の化学結合も知られている(Hermanson、Bioconjugate Techniques(バイオコンジュゲート技術)、Academic Press、1996；米国特許明細書第4,342,566号参照)。「一本鎖Ｆｖ」すなわち「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントとは、抗体の２つのＶドメインを含むもので、これらのドメインが単一のポリペプチド鎖の中に存在する。Ｆｖポリペプチドは、抗原との結合のため、ｓｃＦｖが所望の構造を組織することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメイン間のポリペプチド・リンカーをさらに含むことが好ましい。一本鎖ＦＶ抗体は、例えば、Pluckthun(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(モノクローナル抗体の薬理学)、Vol.113、Rosenburg and Moore eds.、Springer-Verlag、New York、pp.269-315 (1994))、WO93/16185、米国特許明細書第5,571,894号、同第5,587,458号、Huston et al.(1988、Proc.Natl.Acad.Sci. 85、5879)またはSkerra and Plueckthun (1988、Science 240、1038)によるものが公知である。
本発明の免疫グロブリンはまた、二重特異性抗体であってもよい。「二重特異的抗体」とは、２つの違なる特異的抗原結合部位をもつ、単一の二価抗体(または免疫療法に有効なその断片)である。例えば、第１の抗原結合部位が、血管形成受容体(例えばインテグリンまたはＶＥＧＦ受容体)に向けられ、第２の抗原結合部位がＥｒｂＢ受容体(例えばＥＧＦＲまたはＨｅｒ ２)に向けられる。二重特異性抗体は化学的手法(例えば、Kranz et al. (1981) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78、5807参照)、「ポリドーマ」技術(米国特許明細書第4,474,893号参照)、または組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。これらの技術はすべてそれ自体公知である。さらなる方法がWO91/00360、同92/05793、および同96/04305に記載されている。二重特異性抗体も一本鎖抗体(例えば、Huston et al. (1988) Proc.Natl.Acad.Sci. 85、5879；Skerra and Plueckthun (1988) Science 240、1038参照)から調製することができる。
さらに、本発明の免疫グロブリンは免疫複合体であってもよい。「免疫複合体」という用語は、抗体すなわち免疫グロブリン、またはその免疫学的に有効な断片(非免疫学的に有効な分子との共有結合によって融合している)を意味する。この融合パートナーは、ペプチドまたはタンパク質であることが好ましく、それはグリコシル化してもよい。前記非抗体分子は、抗体の定常重鎖のＣ末端、あるいは可変軽鎖および／または重鎖のＮ末端と結合することができる。融合パートナー同士はリンカー分子によって結合することができる。このリンカー分子は、概して、ペプチドを含む３-15アミノ酸残基である。本発明による免疫複合体は免疫グロブリンまたは免疫療法的に有効なその断片からなり、受容体チロシンキナーゼ、好ましくはＥｒｂＢ(ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ２)受容体およびインテグリン拮抗性ペプチド、または脈管形成受容体、好ましくはインテグリンもしくはＶＥＧＦ受容体およびＴＮＦαあるいはＴＮＦαとＩＦＮαあるいは別の適切なサイトカインから主になる融合タンパク質に向けられる。この融合タンパク質は、前記免疫グロブリン、好ましくはそのＦｃ部分のＣ末端へ、そのＮ末端と共に結合させる。この用語には、二重特異的もしくは多重特異的免疫グロブリン(抗体)またはその断片を含む、対応する融合構築物も含まれる。
本発明の抗体分子は、ワクチン製剤の活性(つまり、免疫原性の)成分として機能するよう考案したものである。なお、ここで「ワクチン」という用語は、免疫反応を誘導する目的で被験者に投与する製剤であるとして説明する。本発明の文脈では、免疫反応を治療のために引き起こすという意図があるが、ワクチン剤を、腫瘍の外科的除去に対する補助療法または疾患もしくは疾患の再発予防のために用いてもよい。
本発明について理解されるところによれば、「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、ＭＨＣクラスＩもしくはクラスIIを結合することができ、Ｔ細胞を刺激すること、およびまたはＭＨＣクラスＩもしくはクラスIIとの複合体でＴ細胞を結合すること(測定が必要な活性化をすることなしに)が可能なアミノ酸配列を意味する。
本明細書および添付のクレームで使用する用語「ペプチド」とは、２つ以上のアミノ酸を含む化合物である。アミノ酸は、ペプチド結合(以下に本願での定義を述べる)によって結合したものである。ペプチドの生物産生に関わる20種の異なる天然アミノ酸が存在しており、それらのうちの任意の数のアミノ酸が、ペプチド鎖または輪を形成する任意の順序で結合されてよい。ペプチドの生物産生に用いられる天然のアミノ酸はすべて、Ｌ型配置をもつ。合成ペプチドは、従来の合成方法によって利用するＬアミノ酸、Ｄアミノ酸あるいは、２つの異なる配置のアミノ酸の様々な組み合わせなどを利用して調製することができる。ペプチドのなかにはごくわずかのアミノ酸単位を含むものがある。短いペプチド、例えば10未満のアミノ酸単位をもつものを「オリゴペプチド」と呼ぶことがある。他のペプチドは多数のアミノ酸残基(例えば100まで、またはそれ以上)を含んでおり「ポリペプチド」と呼ばれる。慣習的に、「ポリペプチド」は３つ以上のアミノ酸を含んでいる任意のペプチド鎖で、「オリゴペプチド」は特定の種類の「短い」ポリペプチドと一般に考えられている。したがって、本願中で「ポリペプチド」に言及する場合は常にオリゴペプチドも含むことを理解するべきである。さらに、「ペプチド」に言及する場合は常に、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質を含んでいる。異なる配置のアミノ酸は、それぞれ異なるポリペプチドまたはタンパク質を形成する。ポリペプチドの数、すなわち形成することができる異なるタンパク質の数には、事実上制限がない。
本発明は一連の改変ＶＨおよび改変ＶＬ配列を提供する。すでに述べた通り、ＩｇＧ型抗体分子は、ジスルフィド結合によって結合した２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。原則として、重鎖と軽鎖とのあらゆる組み合わせを作ることが可能であることが理解されよう。また、１つの手段として、同じ細胞内からの適切な抗体遺伝子を共発現させることもできるだろう。本発明中で開示される様々な重鎖および軽鎖配列については、いかなる特定の重鎖と特定の軽鎖との組み合わせも限定する主旨のものではないが、１つの特に好ましい組み合わせのセットとしては、Ｈ鎖１とＬ鎖１、Ｈ鎖２とＬ鎖２、Ｈ鎖３とＬ鎖２、およびＨ鎖４とＬ鎖２となるであろう。これ以外の組み合わせを考えてもよい。例えば、図３に示す親708Ｖ領域のいずれかを特徴としてもつ組み合わせが挙げられる。
タンパク質由来の抗原をＭＨＣクラスＩまたはクラスII分子へ特異的に輸送するためには、そのタンパク質は、後の放出ならびにＭＨＣクラスＩおよびクラスII分子上のペプチド提示のための適切な区画内で正確に処理されなければならない。ヒト定常領域ドメインが存在し、また特に本発明の分子の好ましいＩｇＧ１アイソタイプがあるために、タンパク質がＦｃ(ＣＤ65)表面受容体によって取り上げられて抗原提示細胞(ＡＰＣ)に入る機会は最大限に広がる。一般に、タンパク質が細胞質の中で処理される場合は、クラスＩのぺプチド提示は促進され、タンパク質がエンドソームの区画の中で処理される場合、ＭＨＣクラスII上の提示が促進される。外因性のタンパク質抗原はしばしば、ＭＨＣクラスIIが仲介する適切な応答を引き起こす(特にヘルパーＴ細胞の拡張)。しかしＭＨＣクラスＩ仲介応答は貧弱である。Ｆｃ(ＣＤ65)受容体による取り込みは特別な事例であり、クラスＩおよびクラスIIエピトープの両方の最適な提示をもたらす[Durrant、 L.G. (2001)、ibid]。
ＣＥＡタンパク質から生じ、Ｔ細胞によって認識される可能性があるような、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスIIの両方に限定される組織特異的なペプチドの共通の特徴は、それらがＭＨＣペプチド結合溝には親和性が低いということである(Pardoll、D. (1998) Nat.Medicine 4：525-531)。したがって、そのようなエピトープは、相対的には低い効率でＡＰＣ表面へ提示され、また、それらの同族のＴ細胞集団は、癌抗原の自己ペプチドに対して寛容ではなかったかもしれない。したがって、所望の癌抗原を提示する可能性を最大限にでき、また、提示する競合的なペプチドの数を最小限にする媒体を用いて、その癌抗原を提供することができるワクチン製剤を提供することが大いに望まれる。この点で、本発明の分子を、ＭＨＣクラスII分子を結合可能なペプチドが存在するかどうかについて解析した。また、本発明の１つの実施形態では、ＭＨＣクラスIIとの結合能をもつそのような所望しないペプチド配列は、前記結合相互作用がもう起こらないように改変した。
ペプチドがＡＰＣ表面上で提示されるために特定のＭＨＣクラスII分子と結合する能力は、多くの因子によって決まるが、とりわけ、その一次配列が顕著な因子である。これは、そのタンパク質分解による切断の傾向と、ＭＨＣクラスII分子のペプチド抗原結合溝(binding cleft)内での結合のための親和性との両方に影響を及ぼすだろう。ＡＰＣ表面上のＭＨＣクラスIIペプチド複合体は、ペプチドの露出した残基およびＭＨＣクラスII分子の両方によって提供される決定基を認識することができる特定のＴ細胞受容体(ＴＣＲ)への結合面を提示する。当該分野には、例えば、反応性ＤＲ限定エピトープを広く見つける方法[WO99/61916]を含めて、ＭＨＣクラスII分子を結合することができる合成ペプチドを同定するための方法がいくつか存在する。しかし、そのようなペプチドは、処理領域あるいは他の現象により特にin vivoではあらゆる状況でＴ細胞エピトープとして機能しないかもしれない。また、実験的に決定したＴ細胞エピトープの認識された配列モチーフをスキャンする計算手段によって、あるいはＭＨＣクラスII結合ペプチドを推定する計算技術を用いることによって、Ｔ細胞エピトープの検出を可能にする方法も提供されている。一例として、WO02/069232で教示されているヒトＭＨＣクラスII ＤＲアロタイプのサブセットを結合する潜在能力をもつポリペプチド配列を同定するためのスレッド計算法(computational threading approach)の提供がある。
本発明の課題は特に、ワクチンへの免疫応答が所望の１セットのＴ細胞エピトープに最大限集中し、かつ不要な潜在的Ｔ細胞エピトープの数が減少するポリペプチドワクチン分子を提供することである。708由来ペプチドのＭＨＣクラスII分子への結合傾向を同定するため、以前に開示された方法のうち任意のものを適用することが可能である(WO98/59244、同98/52976、同00/34317、同02/069232)。実際、本発明で具体化される組成物は、WO02/069232で概説されているスキームを利用するソフトウェアツールを使用して実施された解析に従って導き出されたものである。そのソフトウェアは、簡潔に述べると、任意の所定のペプチド配列の結合スコアを提供するため、ペプチドＭＨＣクラスII結合相互作用のレベルで抗原提示の生物学的プロセスをシミュレートする。そのスコアは、ヒト母集団に残存する優勢なＭＨＣクラスIIアロタイプの多くを決定するためのものである。このスキームでは、いかなるタンパク質配列もテストすることができるため、ペプチドのＭＨＣクラスII結合溝と相互作用する能力に関して、アミノ酸置換、付加、または欠失の結果を予測することが可能である。したがって、ＭＨＣクラスIIと相互作用することができるペプチドの数が少なくて、それゆえ免疫原性Ｔ細胞エピトープとして機能する新しい配列組成物を設計することが可能である。
したがって、本発明に開示される組成物に到達するプロセスは、第１に、所望しないＭＨＣクラスII結合エピトープの存在を同定することであった。第２に、アミノ酸置換によって所望しないＭＨＣクラスII結合配列を除去し、ＭＨＣクラスII系とはもはや結合することができない配列を与えることであった。さらに第３に、改変配列を、ＭＨＣクラスII分子と結合するあらゆる継続的な能力について、または改変中に導入された可能性のあるあらゆる追加的ＭＨＣクラスIIリガンドの存在について再解析することであった。
したがって、ＭＨＣクラスIIエピトープを除去するには、望ましくないＴ細胞エピトープが減少した改変された変異体を作製するためアミノ酸置換を行う必要があった。アミノ酸置換は、実質的な還元または、所望しないＴ細胞エピトープの活性の除去を達成するために予測されるペプチド配列内の適切なポイントで行った。「適切なポイント」とは、ＭＨＣクラスII結合溝内に提供される結合ポケットのうちの１つの中で結合するアミノ酸残基と同等であると見なす。ペプチドのいわゆるＰ１すなわちＰ１アンカー位置での溝の第１のポケット内の結合を変更することが最も好ましい。ペプチドのＰ１アンカー残基とＭＨＣクラスII結合溝の第１ポケットとの結合相互作用の質は、全ペプチドの全体的な結合能を決定する重要な要因であると認識される。ペプチドのこの位置での適切な置換は、そのポケット(例えば置換)内に容易に収容されない残基、例えば親水性残基へ置換するためと考えられる。ＭＨＣ結合溝内の他のポケット領域内の結合と同等と見なされる位置のペプチド中のアミノ酸残基も考慮され、本発明の範囲である。
当業者には明白であるように、所望しないエピトープを除去する目的を達成する、複数の代替セットを作成することも可能である。しかし、得られる配列は、大まかには、本発明に開示される特別な組成物と相同性を維持し、したがって、本発明の範囲に入ると思われる。典型的には、本発明の特別な配列と約70％以上の相同性をもつ配列を、それらの最も相同性が低い部位上に作成することができると考えられ、それでも操作上は同等である。そのような配列は同様に本発明の範囲に入るであろう。
本発明は、ＣＥＡ分子の各領域と相同性を共有する配列領域を含む改変されたＶ領域配列を開示する。そのような相同性が存在する場合、それは親708抗体配列に本来備わっている特徴である。本発明は、708親配列を改変した形式を提供する。また、この点で本発明は、不要な免疫原性活性を除去または縮小する目的で、抗体のフレームワークドメインの各領域がヒトの被験者に投与する分子への残基置換を含む配列を提供する。不要な免疫原性活性は、親マウスＶ領域に由来する配列要素と関係があり、ヒトＣＥＡ、ヒトＣＤ55、またはその配列へ慎重に改変された105ＡＤ７抗体要素との相同性をもつ配列要素は含まないと考えられる。本願で定義される不要な、すなわち所望しないエピトープは、所望しない配列要素が、ＭＨＣクラスII分子に結合する能力、またはＭＨＣクラスII分子内での提示によってＴ細胞を刺激する能力、あるいはヒトＴ細胞もしくはＴ細胞受容体複合体と結合してもよい可溶ＭＨＣクラスII複合体と結合する能力によって測定されてよい。
本発明のスキーム下では、４つの異なる重鎖Ｖ領域配列および２つの異なる軽鎖Ｖ領域配列を提供する。本発明の開示が提供する完全抗体分子を構成するために提供されてもよい重鎖および軽鎖の可能な組み合わせに、制限はない。完全抗体分子の構成は、組換ＤＮＡ技術、および当該分野で既知の抗体分子を精製および操作する方法によって達成することができる。必要な技術は、「Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子クローニング実験室マニュアル)」、second edition(Sambrook et al.、1989)、「Oligonucleotide Synthesis(オリゴヌクレオチド合成)」(M.J. Gait、ed.、1984)、「Animal Cell Culture(動物細胞培養)」(R.I. Freshney、 ed.、1987)、「Methods in Enzymology(酵素学の方法)」(Academic Press、Inc.)、「Handbook of Experimental Immunology(実験免疫学のハンドブック)」(D.M. Weir ＆ C.C. Blackwell、eds.)、「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(哺乳動物細胞のための遺伝子導入ベクター)」(J.M. Miller ＆ M.P. Calos、eds.、1987)、「Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新プロトコール)」(F.M. Ausubel et al.、eds.、1987)、「PCR：The polymerase Chain Reaction(ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応)」(Mullis et al. 、eds.、1994)、および「Current Protocols in Immunology(免疫学最新プロトコール)」(J.E. Coligan et al. 、eds.、1991) などの文献中に詳細に説明されている。
本発明の好ましい分子は、いくつかの方法のうちの任意によって調製することができるが、慣習的な組換え法を利用して実施することが最も好ましい。本願で提供される蛋白質配列および情報を用いて、好ましい抗体Ｖ領域の任意のものをコードするポリヌクレオチド(ＤＮＡ)を引き出すことは、比較的容易な方法である。これは例えば、DNSstarソフトウェアスーツ(DNAstar社、マディソン、ウィスコンシン州、米国)のようなコンピューターソフトウェアツールを使用することで達成することができる。本発明の好ましいポリペプチドまたはその重要な相同体をコードする能力をもつ、いかなるそのようなＤＮＡ塩基配列も、本発明の実施形態と見なされるべきである。
一般的なスキームとして、任意のＶ重鎖またはＶ軽鎖遺伝子を、遺伝子合成によって作成することができ、かつ適切な発現ベクターにクローン化することができる。そして発現ベクターは、宿主細胞と選択された細胞へ導入され培養される。抗体分子は培地から容易に精製され、治療のため投与されるワクチン製剤へと調製される。
限定するものではないが、１例として、そのようなスキームの１つでは、合成オリゴヌクレオチドのパネルを使用する遺伝子合成プロセスを経る必要がある。遺伝子は、リガーゼ連鎖反応(ＬＣＲ)用いてアセンブリされる。これは、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を利用し、補足的な末端を特徴としてもつオリゴヌクレオチドをアニーリングした後増幅し補充するものである。ＰＣＲは、プライマーの役割をする隣接したオリゴヌクレオチドの濃度を上げたものを添加することによって行われる。ＰＣＲ産物は、免疫グロブリン遺伝子の５'および３'隣接領域を含むベクターから、さらなるＰＣＲによって、また、抗体全体の発現のための発現ベクターにサブクローニングすることによって、完全長抗体遺伝子にアセンブリされる。アセンブリされるＶＨおよびＶＬ遺伝子は、本発明に開示されるようなあらゆる複数の異なる抗体配列の突然変異生成および構築のための鋳型として役立たせることができる。Higuchiら(Higuchi et al(1988) Nucleic Acids Res.16：7351)によって記載されている「オーバーラップ伸長ＰＣＲ」という戦略を用いるのが特に都合がよいが、他の方法や系を容易に用いることもできるだろう。
可変領域カセットを含んでいる完全長免疫グロブリン遺伝子を、オーバーラップＰＣＲによって組み立てる。簡潔に述べると、ベクターＭ13−ＶＨＰＣＲ１およびＭ13−ＶＫＰＣＲ１(Orlandi et al(1989)、PNAS、89：3833-7)を鋳型として用いて、オーバーラップＰＣＲ断片をさらに２つ生成し、マウス重鎖グロブリンプロモーターを有しリーダーシグナルペプチドをコードする５'隣接配列と、スプライス部位およびイントロン配列を含む３'隣接配列とを含む、それぞれ所望のＶ重鎖およびＶ軽鎖を得る。このようにして各ＶＨおよびＶＬのために作製したＤＮＡ断片は、完全長ＤＮＡ塩基配列を得るのに必要な隣接プライマーを使用してＰＣＲによって結合させる。
５'および３'隣接配列が完全にそろった重鎖遺伝子は、ヒトＩｇＧ１定常領域ドメイン(Takahashi et al (1982) Cell、 29：671)および哺乳類細胞における選択のためのgpt遺伝子を含む発現ベクターpSVgpt(Reichmann et al (1988) Nature、332：323)へクローン化する。５'および３'隣接配列が完全にそろった軽鎖遺伝子は、gpt遺伝子がヒグロマイシン耐性(hyg)遺伝子と置換され、ヒトカッパ定常領域ドメイン(Heiter et al (1980) Cell、22：197)を含む発現ベクターpSVHyg(Reichmann et al ibld)にクローニングする。両方のベクターについて、完全に組み立てられたＶＨ遺伝子またはＶＬ遺伝子は、ゲル電気泳動法によって精製したＨｉｎｄｌＩＩ／ＢａｍＨＩ断片としてサブクローニングし、既知の方法および試薬系を使用して処理する。
重鎖および軽鎖発現ベクターは、European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC)から得たマウス骨髄腫産生非免疫グロブリンであるＮＳＯへ、エレクトロポレーションを使用して共トランスフェクトする。Gpt遺伝子を発現するコロニーは、10％(v/v)ウシ胎仔血清および抗生物質(例えばGibcoから、ペーズリー、英国)、ならびに0.8μｇ／ｍｌミコフェノール酸および250μｇ／ｍｌキサンチン(シグマ、プール、英国)を添加したダルベッコー修飾イーグル培地(DMEM)中で選択する。トランスフェクトした細胞のクローンによるヒト抗体の産出は、ELISAによって容易にヒトＩｇＧが測定される(Tempest et al (1991)Bio Technology 9：266)。抗体を分泌する細胞株を増殖させ、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーによって精製する(Harlow E.＆ Lane D.；ibid)。精製した抗体の濃度は、目的とする抗体のヒトカッパ定常領域を検出するELISAにより測定する。
本発明の分子は、単独療法として単独で投与してもよいし、他の薬学的に有効な医薬品と組み合わせて投与してもよい。そのような医薬品の例としては、細胞傷害性をもつ有効な放射標識同位体を含む免疫療法剤もしくは化学療法剤、またはその他の細胞傷害性ペプチド(例えばサイトカイン)などの細胞傷害性剤、あるいは細胞障害性薬物等が挙げられる。本願で用いる「細胞傷害性薬剤」という用語は、細胞の機能を阻害したり妨げたりする物質、および／または細胞の破壊を引き起こす物質を意味する。この用語には、放射性同位体、化学療法剤、および細菌、菌類、植物、もしくは動物由来の酵素活性を有する毒素またはその断片などの毒素も含まれると意図される。この用語にはさらに、サイトカインファミリー(好ましくはＩＦＮγおよび細胞傷害性活性も有する抗悪性腫瘍薬)のメンバーも含まれてよい。上記も指定したように、「化学療法剤」または「抗悪性腫瘍剤」は、本発明について理解されるところによれば、「細胞傷害性薬剤」のクラスのメンバーであると見なされ、抗悪性腫瘍効果を発揮する化学薬剤を含む。すなわち、生体応答修飾のようなメカニズムによって間接的にではなく、腫瘍細胞上で直接(例えば細胞増殖抑制性効果あるいは細胞傷害性効果によって)新生細胞の発生、成熟、または蔓延を防ぐものである。本発明の好適な化学療法剤は、自然または合成の化学化合物であることが好ましい。しかし、タンパク質のような生体分子、ポリペプチドなどを意味ありげに除外するものではない。商業的用途、臨床評価、および前臨床の開発において利用可能な抗悪性腫瘍薬が数多く存在する。これも、本発明においては、ＥＧＦ受容体拮抗剤のような他の薬剤と併せて適宜、ＴＮＦαおよび上記に引用したような抗血管新生剤との併用療法による腫瘍／新形成治療用の薬剤に含まれる。前記の薬剤の組み合わせと併せて、化学療法剤を適宜投与してよいということを指摘しておく必要がある。化学療法剤または作用物質の例としては、アルキル化薬(例えばナイトロジェンマスタード、エチレンイミン化合物、アルキルスルホン酸塩、ならびにニトロソウレア、シスプラチンおよびダカルバジンなどのアルキル化作用を有する他の化合物)、代謝拮抗物質(例えば葉酸、プリン、ピリミジン拮抗剤)、有糸分裂阻害剤(例えばビンカアルカロイド、ポドフィロトキシンの誘導体)、細胞傷害性の抗生物質およびカンプトテシン誘導体等が挙げられる。好ましい化学療法剤または化学療法の例としては、アミフォスチン(ethyol)、シスプラチン、ダカルバジン(DTIC)、ダクチノマイシン、メクロールエサミン(ナイトロジェンマスタード)、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルヌスチン(BCNU)、ロムスチン(CCNU)、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、ドキリルビシン・リポ(ドキシル)、ゲムシタビン(ジェムザール)、ダウノルビシン、ダウノルビシン・リポ(daunoxome)、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキセート、５−フルオロウラシル(５−FU)、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル(タキソール)、ドセタキセル(タキソテール)、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、ＣＰＴ−11、10−ヒドロキシ−７−エチル−カンプトテシン(ＳＮ38)、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンα、インターフェロンβ、イリノテカン、ミトキサントロン、トポテカン、リュープロライド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトーテン、ペガスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブチル、およびそれらの組み合わせが挙げられる。本発明による最も好ましい化学療法剤は、シスプラチン、ゲムシタビン、ドキソルビシン、パクリタキセル(タキソール)およびブレオマイシンである。
本発明の別の態様は、本発明が、改変抗体組成物を使用するヒトの治療法に関するものであるということである。個体への投与のためには、いかなる改変抗体組成物も、少なくとも純度80％であり、かつ発熱性物質および他の汚染物質を含まないように生産される。また、改変抗体タンパク質の治療用組成物は、当業界で一般に知られているアジュバントおよび担体物質と併用してもよいことを理解しなければならない。そのような物質自体は免疫原性エピトープを提供しない。よく知られているアジュバントは鉱油乳剤を含有し、フロイントアジュバントと名付けられるが、欧州特許出願公開明細書第0745388号、同第0781559号、米国特許明細書第5,057,540号、同第5,407,684号、同第5,077,284号、同第4,436,728号、同第5,171,568号、および同第4,726,947号等による他の製剤も同様に考慮してよい。ワクチン製剤は、薬学的に許容される賦形剤と併せて投与することが好ましい。そのような賦形剤は、希釈剤の役割をすることができ、安定化剤、湿潤剤ならびに乳化剤、塩、封入剤、バッファー、および皮膚浸透エンハンサーを含む。例は、RemingtonのPharmacological Sciences(薬学)(Alfonso R.Gennaro、ed．、18th edition、1990)に記載されている。リポソーム封入も治療用のタンパク質を製剤化するための１つの手段と見なしてよい。また、そのような使用は、さらにＧＭＣＳＦおよびまたはＩＬ−２または他のタンパク質のような生体応答調節剤が関わる治療のスキームを含んでいてもよい。
ワクチン製剤は、免疫応答を誘発するため、または個体のＣＥＡ関連腫瘍を治療するために、個体に非経口投与するが、皮下、筋肉内、または皮内投与が可能であることを認識するべきである。「癌」および「腫瘍」という用語は、無秩序な細胞増殖によって典型的に特徴づけられる、哺乳動物中の生理的状態を意味するかまたは説明する。本発明の分子および医薬組成物により、乳腺、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭および首、子房、前立腺、脳、膵臓、皮膚、硬骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、睾丸、頚部および肝臓などの腫物、好ましくはＣＥＡ関連腫瘍を治療することができる。本発明によって治療されるのが好ましい癌は、結腸直腸癌、胃癌、膵臓癌、非小細胞肺癌および乳癌である。
本発明の分子は、医薬組成物によって個体に投与される。本発明の「医薬組成物」は、本発明との併用療法(「補助療法」)に関連する副作用を緩和したり回避したりする作用薬を含んでよい。そのような作用薬としては、例えば、骨吸収阻害剤、心臓保護作用薬等の抗癌剤癌の毒性作用を低下する作用薬が挙げられるが、これらに限定されない。前記の補助作用薬は、化学療法、放射線療法もしくは手術に関連する悪心嘔吐の発生を防いだり低下させたり、または骨髄抑制抗癌薬の投与に関連する感染の発生を低下させる。補助作用薬は当業界において既知である。
本発明の免疫グロブリン作用薬は、ＢＣＧや免疫系刺激物のようなアジュバントと組み合わせて投与することが好ましい。
ワクチン製剤の投与量は、いくつかの因子(例えば患者の体調や投与経領域)によって決まる。限定するものではないが、投薬レジメンの１例としては、約0.1ｍｇから約20ｍｇの間の用量で、２週間に１度４回投与し、その後、必要に応じて毎月投与することが可能である。維持量は、治療を受けている個体の体調および応答によると考えられる。
本発明のワクチン製剤は、癌のための従来の外科的処置に対する補助治療として特に有用であると考えられる。したがって腫瘍再発および臨床的再発の可能性を低める役目をするだろう。
本ワクチン投与の有効性は、例えば炎症の指標の検出、乳房Ｘ線造影法(マンモグラフィー）、放射線シンチグラフィー、および当該分野で既知の他の臨床的調査法を含む、癌の進行を判定するための臨床テストを行って確認できる。
本発明のワクチンを接種される患者においては、細胞性免疫応答を判定することが特に好ましい。特に好ましいアッセイとしては、特異的なＴ細胞活性に注目し、例えばＴ細胞増殖を測定することなどが考えられる。このアッセイでは、全血サンプルから末梢血単核細胞(PBMC)を得る。その細胞を、例えばヒトＣＥＡまたはヒトＣＤ55由来の合成ペプチドの存在下で培養する。または、全ＣＥＡタンパク質もしくは様々な濃度の照射ＣＥＡ発現細胞で抗原投与する。刺激細胞は応答細胞との自己由来であることが好ましい。刺激指数(ＳＩ)は、通常、細胞増殖のマーカーとして3Ｈ−チミジン取り込みを用いて判定する。そのようなアッセイでは、測定されたＳＩの値が少なくとも2.0、好ましくは2.5以上であれば、ＣＥＡまたはＣＤ55誘発増殖は陽性であると結論される。このアッセイについては、ＳＩ＝ＣＰＭ試験培地／ＣＰＭ未処理対照培地とする。
Ｔｈ１Ｔ細胞の刺激は、細胞傷害性Ｔ細胞を形成する「助け」となるものであるが、８〜10日目に培養液上清中のインターフェロンγ産生をアッセイすることにより測定することができる。インターフェロンγ産生は、市販のELISAに基づく系を使用して、容易に測定される。
ＣＥＡまたはＣＤ55特異的細胞障害性Ｔ細胞の活性も、特に情報に富むものである。このタイプの特に好適なアッセイが、Kantorら(Kantor、J. et al (1992) Cancer Res.52：6917-6925 ＆ JNCI (1992) 84：1084-1091)およびKwongら(Kwong、Y. et al (1995) JNCI 87：982-990)の両者によって記載されている。そのアッセイは、標識されたＣＥＡ発現標的細胞から培地中への51Ｃｒの放出を測定するものである。単独で培養した標識標的(ネガティブコントロール)および界面活性剤で溶解した標的(ポジティブコントロール)と比較した、培地中への51Ｃｒのパーセント特異的(percentspecific)放出を測定する。
限定するものではないが、さらに１例として、本発明の好ましいタンパク質配列を誘導するための方法をここで記述する。キメラ708の作製については、すでに記載がある(Durrant、L.G.、 et al (2001)、 Int.J.Cancer. 92：414-420)。WO98/52976に記載された方法および設計した配列変異形を用いて、可変領域タンパク質配列に所望しないＴ細胞エピトープが存在するかどうかを調べた。さらに、ヒトＣＥＡタンパク質配列(Schrewe、H. et al (1990)、Mol Cell.Biol、10：2738-2748)、ヒトＣＤ55タンパク質配列(Caras、I.W. et al 1987) Nature 325：545-549)、および抗体107ＡＤ５可変領域配列(WO97/32021)について解析を行った。解析は、市販のソフトウェアスーツ(例えば「DNAstar」、DNASTAR社、Madison、ウィスコンシン州、米国)を用いた相同性アラインメント、および他の文献(WO98/59244、同98/52976、同00/34317、およびRammensee、H.G. et al(1999)ibid)に記載されているエピトープ解析によって行った。ＭＨＣクラスII結合リガンドの役割をする潜在力をもつペプチド配列解析のスキームは、すでに詳細に記載されている(WO02/069232)。この方法を用いて、１つ以上のアロタイプの複数のＭＨＣクラスIIリガンドを、抗体708Ｖ領域ドメイン中で同定した。ＭＨＣクラスIIリガンドを欠乏させた変異形の配列を編集した。これは、アミノ酸置換および再解析のサイクルをくり返すことによって達成され、エピトープの除去を確認した。所望の組成物のタンパク質配列を図４〜９に示す。
Claims (24)
- 親抗イディオタイプ抗ＣＥＡ抗体に由来し、ヒト由来の定常領域および合成的に設計された可変領域を含む免疫グロブリン分子あるいはその断片であって、ヒト腫瘍抗原ＣＥＡ(癌胎児性抗原)に由来する５つ以上の連続するアミノ酸残基を有する配列領域を１つ以上含むことを特徴とする分子またはその断片。
- 前記配列領域のうちの１つが、５個から20個の連続するアミノ酸残基を含むことを特徴とする請求項１に記載の免疫グロブリン分子。
- 前記配列領域の少なくとも１つが、前記免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖の相補性決定領域(ＣＤＲ)の成分であるか、または前記ＣＤＲに隣接するフレームワーク領域に隣接する残基とオーバーラップすることを特徴とする請求項１または２に記載の免疫グロブリン分子。
- 前記成分が、前記ＣＤＲのアミノ酸残基の30〜100％を形成することを特徴とする請求項３に記載の免疫グロブリン分子。
- 前記ＣＤＲが、前記免疫グロブリンの重鎖のＣＤＲであることを特徴とする請求項３または４に記載の免疫グロブリン分子。
- 各重鎖および／または軽鎖の少なくとも２つのＣＤＲが、完全にＣＥＡ由来の配列領域から成ることを特徴とする請求項３に記載の免疫グロブリン分子。
- 前記親抗イディオタイプ抗体が、マウス抗体７０８であることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の免疫グロブリン分子。
- 可変領域内に、ヒトＣＤ５５抗原由来の５〜25個の連続するアミノ酸残基を有する配列領域あるいは抗イディオタイプ抗ＣＤ５５抗体の超可変領域を追加的に含むことを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の免疫グロブリン分子。
- 前記抗イディオタイプ抗ＣＤ５５抗体が、マウス抗体１０５ＡＤ７であることを特徴とする請求項８に記載の免疫グロブリン分子。
- 可変領域内で、さらに可能性のあるＭＨＣクラスIIエピトープ(ＣＥＡ陽性ヒト癌細胞への免疫応答に寄与しない)が、アミノ酸置換によって除去されていることを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の免疫グロブリン分子。
- 可変領域内に、さらにＭＨＣクラスＩエピトープであるＣＥＡ由来配列領域を含むことを特徴とする請求項１から10のいずれか一項に記載の免疫グロブリン分子。
- 前記ＣＥＡ由来の配列領域が、ＴＬＬＳＶＴＲＮＤＶおよびＹＬＳＧＡＮＬＮＬであることを特徴とする請求項11に記載の免疫グロブリン分子。
- 前記ＣＥＡ由来配列領域が、前記免疫グロブリンの軽鎖のＣＤＲの１つ以上の一部であるか、またはその全部を成す請求項11または12の免疫グロブリン分子。
- 可変領域内に、ＣＥＡ由来の、ＭＨＣクラスIIエピトープである配列領域を追加的に含み、この配列領域がＣＥＡ陽性ヒト癌細胞に対する免疫応答に寄与することを特徴とする請求項１から12のいずれか一項に記載の免疫グロブリン分子。
- 図４から７に示される配列のいずれかより選ばれる可変重鎖を含むことを特徴とする請求項１から13のいずれか一項に記載の免疫グロブリン分子。
- 図８および９に示される配列のいずれかより選ばれる可変軽鎖を含むことを特徴とする請求項１から13のいずれか一項に記載の免疫グロブリン分子。
- 図４から７に示される配列のうちのいずれかより選ばれる重鎖ならびに図８および９に示される配列のいずれかより選ばれる軽鎖を含むことを特徴とする請求項１から13のいずれか一項に記載の免疫グロブリン分子。
- 可変重鎖および／または軽鎖が、以下の群から選ばれる配列領域と同一性を有する１つ以上の配列領域を含むことを特徴とする請求項１から11のいずれか一項に記載の免疫グロブリン分子。
（ｉ）ヒトＣＥＡの３４５〜３５４
（ｉｉ）ヒトＣＥＡの３８７〜３９６
（ｉｉｉ）ヒトＣＥＡの５７１〜５７９
（ｉｖ）ヒトＣＥＡの６２９〜６４５
（ｖ）ヒトＣＤ５５の１４８〜１６７ - 生物学上有効な量の請求項１から18のいずれか一項に記載の免疫グロブリン分子、アジュバントおよび場合により薬学的に許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤を含むことを特徴とする医薬品組成物。
- ＣＥＡ陽性固形腫瘍または転移性腫瘍に罹患するヒト個体にワクチン接種を行うための薬剤を製造するための、上記の指定された請求項のうちのいずれか一項に記載の免疫グロブリン分子または医薬品組成物の使用。
- 前記ワクチン接種が、前記個体において、ＣＤ８および／またはＣＤ４陽性のＴ細胞の改善された刺激をもたらすことを特徴とする請求項20に記載の使用。
- ＣＥＡ(癌胎児性抗原）陽性の固形腫瘍または転移性腫瘍に罹患しているヒト個体の治療に好適な、合成的に設計された免疫グロブリン分子に基づくワクチン分子の作製方法であって、
(i)非ヒト抗イディオタイプ抗ＣＥＡ抗体を選択するステップと、
(ii)非ヒト定常領域をヒト定常領域と置換するステップと、
(iii)超可変領域(ＣＤＲ)の１つ以上をＣＥＡ由来配列領域と部分的または完全に交換し、それによって、前記ＣＤＲに隣接しているフレームワーク残基を含んでもよいステップと、
を含むことを特徴とする方法。 - 次のグループから選ばれる１つ以上のステップをさらに含むことを特徴とする、請求項22に記載の方法。
(iv)可変領域内の配列領域を、ＣＤ５５抗原由来の領域または抗イディオタイプ抗ＣＤ５５抗体の超可変領域と置換するステップ、
(v)可変領域内の配列領域を、ＣＥＡ陽性ヒト癌細胞に応答するＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスIIエピトープである領域と置換するステップ、
(vi)可変領域内において、ＣＥＡ陽性ヒト癌細胞への免疫応答に寄与しない潜在的ＭＨＣクラスIIエピトープを除去するステップ。 - 前記非ヒト抗イディオタイプ抗ＣＥＡ抗体が、マウス抗体７０８であることを特徴とする請求項22または23に記載の方法。
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