CN100425290C

CN100425290C - 人cea基因疫苗、其构建方法及其在制备防治肿瘤疫苗中的应用

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Publication number: CN100425290C
Application number: CNB2003101119560A
Authority: CN
Inventors: 罗超权; 黄爱强
Original assignee: GUANGXI SANPOTEL PHARMACEUTICAL CO Ltd; Science And Technology Development Centre Of Zhongshan Medical College Of Zhongs
Current assignee: GUANGXI SANPOTEL PHARMACEUTICAL CO Ltd; Science And Technology Development Centre Of Zhongshan Medical College Of Zhongs
Priority date: 2003-10-30
Filing date: 2003-10-30
Publication date: 2008-10-15
Anticipated expiration: 2023-10-30
Also published as: CN1611264A

Abstract

人CEA基因疫苗、其构建方法及其在制备防治肿瘤的疫苗的应用，系利用真核细胞表达质粒构建带白细胞介素2同步表达的癌胚抗原(CEA)基因疫苗，经检测，其在体外细胞中同步表达CEA和IL-2蛋白分子，动物模型试验表明，CEA基因疫苗具有防治癌胚抗原阳性肿瘤的作用，在体内无免疫毒性作用。

Description

人CEA基因疫苗、其构建方法及其在制备防治肿瘤疫苗中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说涉及人癌胚抗原阳性肿瘤的基因疫苗的构建及其在制备防治肿瘤疫苗中的应用。

背景技术

DNA疫苗(DNA vaccine)又称基因疫苗(Gene vaccine)，其本质为将外源蛋白编码基因片段克隆在真核质粒表达载体上，直接接种机体后可在细胞内表达外源蛋白并诱发机体产生特异性细胞和体液免疫应答从而达到预防和治疗疾病的目的。由于它可克服传统疫苗的部分缺陷，能同时诱发机体产生特异性细胞和体液免疫应答，并具有性质稳定的优点，因而被认为是继减毒疫苗、灭活疫苗和基因工程亚单位疫苗之后的第三代疫苗，多个DNA疫苗也已获准进行了人体临床I期试验。

癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)是发现最早认识最全面的肿瘤相关抗原，也是国际公认的肿瘤标志物。目前CEA肿瘤(癌胚抗原阳性肿瘤，如90％左右的胃肠道恶性肿瘤、胰腺癌，80％以上的非小细胞性肺癌，50％左右的乳腺癌)的治疗主要采用化疗、放疗和生物免疫治疗等，但由于无法达到特异性杀伤肿瘤的目的，因此效果不尽人意，每年因CEA肿瘤而死亡的人数是全部肿瘤死亡人数的60％以上，是一类严重危害人类健康的常用肿瘤。

目前尚未有人CEA肿瘤利用带有细胞因子同步表达的癌胚抗原CEA的基因疫苗用于预防治疗CEA肿瘤的报道。

发明内容

本发明的目的就是为了提供一种预防治疗人CEA肿瘤好的带有人类细胞因子hIL-2同步表达的癌胚抗原CEA的基因疫苗及其在制备预防、治疗CEA肿瘤的疫苗中的应用。

本发明是这样实现的。

采用Invitrogen公司质粒小量纯化试剂盒Cytoplasmic RNAReagent或其他类似试剂盒一步法提取CEA肿瘤组织细胞总RNA，使用RobusT I RT-PCR KIT或其他类似试剂进行一步法扩增目的基因cDNA；同时用LA DNA聚合酶进行PCR扩增hIL-2；使用真核细胞表达载体构建hIL-2质粒；选择合适的限制性内切酶，酶切hIL-2质粒和CEA cDNA片段，回收目的片段后通过快速DNA连接试剂盒连接，构建CEA-hIL-2质粒；选择NotI和XhoI双酶切pGE-IRES-SN商业工具质粒(美国Clontech公司生产)和CEA-hIL-2质粒，凝胶电泳分离回收目的片段后，通过快速DNA连接试剂盒连接；即制得本发明的CEA肿瘤重组质粒，重组质粒转染大肠杆菌，经质粒DNA抽提，凝胶电泳鉴定，筛选出阳性克隆制备成甘油菌，于-70℃下保存。

本发明的重组质粒疫苗的工业化生产方法是用重组质粒转化大肠杆菌，从中筛选出克隆工程菌；利用发酵罐进行扩增培养收集菌体；抽提、纯化基因疫苗质粒；经鉴定、定量后，加以佐剂适量，制备成基因疫苗。

本发明的带有细胞因子hIL-2同步表达的癌胚抗原CEA基因疫苗，采用化学发光免疫法和ELISA双抗夹心法分别检测CEA抗原和hIL-2因子的表达，结果表明所构建的重组质粒能在体外细胞内同步表达CEA和IL-2蛋白分子。通过CEA基因疫苗联合不同佐剂免疫小鼠后，小鼠血清中可检测到明显的CEA抗体水平；同时，CEA基因疫苗免疫小鼠的外周血和脾脏淋巴细胞对小鼠黑色素瘤细胞均有显著性的特异性杀伤作用。CEA基因疫苗免疫的小鼠接种CEA+黑色素瘤细胞后，全程观察均无肿块出现，说明预防效果良好。长期毒性试验表明，本发明的CEA基因疫苗在体内无免疫毒性作用。

IL-2是一种重要的免疫调节淋巴因子，不仅能促进T淋巴细胞等的增殖和成熟，提高肿瘤杀伤细胞活性，还能有效地刺激其它细胞因子如干扰素的产生。有学者将编码CEA真核表达质粒直接注射到小鼠体内，结果有效地诱导了针对CEA抗体的产生，并且CTL显著增殖，提示此方法可用于大肠癌的治疗。为了提高基因疫苗的免疫应答水平，我们将表达免疫调节因子的重组质粒与含有特异性抗原质粒共同免疫。但在构建多基因表达载体中，常导致多种不同的mRNA出现或者在转录中存在非等量分子数表达等问题，直接或间接降低疫苗免疫应答的生物学活性，而且质粒之间或质粒内部启动子之间的相互干扰，可明显抑制双方的基因表达水平；脊髓灰质炎病毒的内部核糖体进入位点(Internal Ribosome Entry Site，IRES)不影响其上游和下游基因的表达，可以保证CEA及hIL-2 cDNA同时转录到同一mRNA上，并且，因其可直接结合到核糖体大小亚基之中，使mRNA在翻译过程中具有同步表达双蛋白质的作用。

本发明的CEA基因疫苗可以直接采用粉针剂，通过注射用生理盐水溶解后，直接肌肉注射，也可以采用添加其他辅料，制备成口服液或口服固体剂型。由于注入的DNA往往不会整合入染色体中而游离于染色体之外，不会引起突变和肿瘤的发生，因此，是一种安全的基因治疗手段。

本发明的基因疫苗可以用于制备预防、治疗CEA肿瘤。并也可以与其它抗肿瘤的药物联合应用，包括制成复方制剂。

本发明的CEA基因疫苗所用的载体是真核细胞表达载体。包括可以采用Invitrogen公司生产的pcDNA3.0和pcDNA3.1、pVAX1载体(其结构见Invitrogen公司网页http://www.invitrogen.com.cn)等。

本发明的CEA(癌胚抗原)cDNA可取自中国人大肠癌组织，也可以是GeneBank公布的同源CEA cDNA NO.M17303、NO.M29540序列或其它来源的癌胚抗原cDNA，其中CEA癌胚抗原基因可以与CEA cDNANO.M17303在99％范围内相同即可。本发明的IRES元件可以采用脊髓灰质炎病毒的IRES片段、心肌炎病毒的IRES片段、或人工合成的双顺反子元件。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为本发明的实施例1CEA基因疫苗构建流程图。

具体实施方式

实施例1

1.1CEA肿瘤组织细胞总RNA的提取和鉴定：按照Invitrogen公司Concert^TM Cytoplasmic RNA Reagent一步法提取细胞总RNA。总RNA提取液进行1％甲醛凝胶电泳鉴定，并用紫外分光光度计测定OD₂₆₀和OD₂₈₀值，-70℃下保存备用。

1.2编码人CEA cDNA的引物合成和RT-PCR扩增：用GenBank公布的M17303的全长cDNA序列作为引物设计的模板，分别引入了EcoR I和Not I限制性内切酶位点，经GeneFisher在线筛选，并通过分子生物学软件PCRDESN和Oligo5.0分析所设计的PCR引物之GC比值、Tm值、发夹结构、基序结构及特异性等，合成如下引物：

正义链引物(sense primer)：5’-GTCGAATTCAGACAGCAGAGACCATGGA-3’

反义链引物(antisense primer)：5’-AAGCGGCCGCAAACTACACCAGGGCTGCTA-3’

使用RobusT I RT-PCR KIT进行一步法扩增目的基因cDNA。

1.3hIL-2cDNA的引物合成和PCR扩增 hIL-2的PCR扩增引物分别引入Xho I和Apa I限制性内切酶位点进行设计和合成：

正义链引物(sense primer)：5’-GACCTCGAGATGTACAGGATGCAACTCCT-3’

反义链引物(antisense primer)：5’-GACGGGCCCTCAAGTCAGTGTTGAGATGA-3’

使用LA DNA聚合酶进行PCR扩增，操作按说明书进行。

1.4CEA与IL-2同步表达质粒的构建和筛选同步表达重组质粒构建流程见图1。

1.4.1p V-hIL-2的构建将Apa I和Xho I双酶切回收的线性pVAX1和hIL-2 cDNA片段，在22℃下用Rapid DNA Ligation Kit连接30min。将酶切回收的线性pVAX1也在同等条件下自环连接作为阴性对照。用0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定。重组质粒转化JM109，接种于含有Kanamycin(500μg/ml)的LB平板上，37℃培养16h。挑取克隆株于含有Kanamycin的LB培养液3ml中培养，37℃振荡培养10h，进行快速质粒DNA抽提，Apa I和Kpn I酶切过夜后，用0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性株。阳性克隆菌制备成含有40％甘油的LB培养液，于-70℃下保存备用。

1.4.2pV-CEA-hIL-2的构建将EcoR I和Not I双酶切回收的线性pV-hIL-2和CEA cDNA片段，在22℃下用Rapid DNA LigationKit连接30min。将酶切回收的线性pV-IL-2也在同等条件下自环连接作为阴性对照。用0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定。重组质粒转化JM109，接种于含有Kanamycin(500μg/ml)的LB平板上，37℃培养16h。挑取克隆株于3ml含有Kanamycin的LB培养液中培养，37℃振荡培养10h，快速质粒DNA抽提，Apa I和EcoR I酶切过夜后，用0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定。阳性克隆制备成甘油菌，其中甘油浓度为30～50％体积百分比。于-70℃下保存备用。

1.4.3本发明的基因疫苗质粒pVCEA2的构建分别用Not I和Xho I双酶切pGE-IRES-SN质粒和pV-CEA-hIL-2，0.8％琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段，在22℃下用Rapid DNA Ligation Kit连接30min。将酶切回收的线性pV-CEA-IL-2也在同等条件下自环连接作为阴性对照。用0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，重组质粒转化JM109，并接种于含有Kanamycin(500μg/ml)的LB平板上，37℃培养16h。挑取克隆株于3ml含有Kanamycin的LB培养液中培养，37℃振荡培养10h，快速质粒DNA抽提，ApaI和EcoRI酶切过夜后，用0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定。阳性克隆制备成甘油菌，其中甘油浓度为30～50％体积百分比于-70℃下保存备用。

1.5序列测定和蛋白质预测分析和比较阳性克隆甘油菌测序。将获取的CEA cDNA序列与M29540和M17303标准序列进行蛋白质分析和比较。NCBI BLAST在线同源序列分析；用DNAclub 2a软件分析序列的氨基酸组成及排列顺序；用巴斯德研究所在线分析工具EMBOSS分析蛋白质的分子量、等电点、抗原性和潜在的信号肽与断裂位点预测。

1.6构建的pVCEA2电泳鉴定和测序结果重组质粒pVCEA2先后分别经EcoR I、Not I、Xho I和Apa I酶切处理后，可以回收到CEAcDNA片段(2.1kb)、IRES片段(0.6kb)、hIL-2cDNA片段(0.5kb)和线性pVAX1(3.0kb)，与插入的目的片段大小一致。

测序结果显示重组质粒构建正确，插入的目的核苷酸序列总长为3250bp，(包含引入的限制性酶切口序列)。同源序列分析说明，扩增所得的CEA cDNA全长为2140bp，其序列与GenBank公布的M29540和M17303序列99.8％同源(其中与M29540有4个核苷酸不同，与M17303有5个核苷酸不同)，蛋白质读码框完整；IRES元件(590bp)与hIL-2PCR产物(462bp)测序结果与母本的cDNA序列100％一致。本实施例的重组质粒的完整序列为SEQ ID NO.1。其中第759-2898号核苷酸残基为CEA基因DNA，第2907-2542号为IRES元件，第3548-4009号为hIL-2基因cDNA。

1.7RT-PCR产物编码的CEA蛋白质特性预测和分析

经蛋白质分析软件分析，RT-PCR产物编码的蛋白质序列有三个氨基酸与GenBank公布的同源癌胚抗原不同(脯氨酸P-丝氨酸S、精氨酸R-谷氨酰胺Q、丝氨酸S-天冬酰胺N)，但理化性质、膜结构特征及抗原性位点基本一致，抗原性分值未变(见表1)。

表1.RT-PCR产物编码蛋白质与癌胚抗原的特性比较

实施例2用CHO(中国仓鼠卵巢细胞株)体外转染后，检测CEA抗原和hIL-2的表达

2.1CHO细胞复苏、培养、脂质体转染液氮中取出的CHO细胞迅速放置于37℃水浴中解冻复苏，2000rpm离心5min，弃去上清，加入含10％新生小牛血清的RPMI 1640细胞培养基中(不含抗菌素)，37℃及5％CO₂中培养。将长至85％以上的贴壁单层细胞用0.025％的胰酶消化后，加入培养基吹打细胞，1000rpm离心10min，细胞计数稀释后于6孔板中传代24h，然后将重组质粒pVCEA2约4μg(混匀于250μl的无血清培养基中)和lipofectAMINE200010μl(混匀于250μl的无血清培养基中)轻轻混匀后转染CHO细胞。于第24、48h吸取培养液各200μl，离心取上清用于瞬时表达的测定，对照组用无转染CHO细胞培养液上清测定。上述CHO细胞转染48h后，加入G418(1mg/ml)进行筛选。筛选7d后，G418浓度改为0.5mg/ml继续筛选。克隆株形成后G418浓度改为0.25mg/ml，继续筛选14d停用。分别于筛选7、14、21、28、35、70d吸取培养液各200μl，离心取上清进行体外产物稳定表达的观察，对照组用无转染CHO细胞培养液上清测定。

2.2重组质粒表达产物CEA和hIL-2的测定

(1)按有关说明书操作，表达产物CEA采用癌胚抗原化学发光双抗体异位点一步夹心法测定，用医学统计软件SPSS v11.5统计，根据标准品所测CPS值，建立CEA浓度-CPS值相关的回归方程，根据各样品的CPS值，直接换算成相应的CEA含量。

(2)按有关说明书操作，表达产物hIL-2采用双抗体夹心ELISA法测定，每个标准品和样品的OD_450nm值减去零孔的OD_450nm值，根据标准品所测OD_450nm值，建立hIL-2浓度-OD_450nm值相关的标准曲线，根据各样品的ODD_450nm。值，在标准曲线上查出其相应的数值，乘上稀释倍数计算hIL-2含量。

2.3CHO阳性克隆株体外瞬时表达和稳定表达的测定结果

2.3.1CEA体外瞬时表达的测定的结果以未转染的CHO细胞培养液上清为参照，绘制得标准浓度-CPS回归曲线，转染重组质粒的24h和48h的上清液CEA表达量分别为5.3ng/ml和8.6ng/ml。

2.3.2h I L-2体外瞬时表达的测定结果根据酶标仪的测定结果绘制标准浓度-OD_450nm回归曲线，计算出转染重组质粒后24h和48h培养液上清的hIL-2表达量分别为1480pg/ml和2320pg/ml。

2.3.3h I L-2体外稳定表达的测定结果分别以未转染的CHO细胞培养液上清为基线，绘制得标准浓度-OD_450nm回归曲线，转染的CHO细胞经G418筛选后的培养液上清的hIL-2稳定表达量见表2。

表2pVCEA2转染CHO细胞阳性克隆株hIL-2稳定表达观察(pg/ml)

结果表明，重组质粒体外转染CHO细胞后，可以获得稳定高效的表达。

实施例3实施例1的CEA基因疫苗的免疫小鼠CEA抗体水平检测3.1实验方法：二级雄性BALB/C小鼠，6-8周龄，随机分成五组，每组各6只。

I pVAX1对照组

II pVCEA实验组(pVAX1-CEA-hIL-2)

III pVCEA2实验组(即实施例1所获取的基因疫苗)

IV 混合实验组(CEA-rV+pVCEA2)

V 复合实验组(pVCEA2+pV35-I-40)

小鼠每次免疫前，先注射0.25％布比卡因于两后腿股四头肌各50μl，24h后每侧再注射质粒50μg(混合组中第一次免疫注射的药物为CEA-rV，用量为5×10⁶PFU，第二、三次为pVCEA2；复合组每成分各50μg)。第25d和第45d各再免疫1次，共三次。分别于第1次免疫后7d、第2次免疫后7d、第3次免疫后7d、14d和28d小鼠眼眶内取血，肝素钠抗凝试管中1000rpm离心5min，取血清，于-20℃冰箱保存，用作血清CEA抗原和抗体的测定。

3.2检测结果：CEA基因疫苗联合不同佐剂免疫小鼠后，小鼠血清中可检测到明显的CEA抗体水平(见表3)。

表3基因疫苗联合不同佐剂免疫血清CEA抗体水平(ng/ml)

说明：1、各实验组的血清CEA抗体含量随免疫的次数和时间增加而提高，第3次免疫后28d达到最高峰。各组CEA抗体含量高低依次为复合组＞混合组＞pVCEA2组＞pVCEA组。

2、与pVCEA组对比，复合组、混合组、pVCEA2组CEA抗体分别提高了614％、370％和344％.。

3、其中复合组抗体分泌最高达316.35ng/ml，pVCEA组最低仅为51.56ng/ml。

实施例4实施例1对CEA阳性肿瘤细胞的特异性杀伤作用实验

4.1方法：

免疫小鼠的建立

二级雄性BALB/C小鼠，6周龄，共12只。分别于第1d、第25d和第45d各免疫1次，共三次。小鼠每次免疫前，先注射0.25％布比卡因于两后腿股四头肌各50μl，24h后每侧再注射质粒(pVCEA2和pV35-I-40各50μg)。

免疫小鼠外周血及脾脏淋巴细胞的制备

重组质粒第三次免疫后28d，75％乙醇消毒小鼠，无菌状态下摘眼球收集小鼠外周血于自制的肝素钠抗凝管(每管含肝素钠0.3mg)中。或于无菌状态下取出脾脏，用无血清1640培养液冲洗，剪粹并玻片挤压，200目铜网过滤组织液，Hank’s液洗涤；收集的抗凝外周血或脾脏细胞Hank’s液按1∶1与Hank’s液混匀后，再等量小心加于一份比重为1.092的小鼠专用淋巴细胞分离液上，1500rpm离心15min，吸取中间界面淡黄色云雾状细胞层至另一试管，加Hank’s液，1500rpm离心10min，共洗涤2次，无血清1640培养液，1000rpm离心10min，共洗涤1次，最后用含10％小牛血清的1640培养液将效应细胞调至浓度1×10⁷/ml备用。

肿瘤靶细胞的制备

将传代良好的长至90％以上的小鼠黑色素瘤细胞株(B16)和癌胚抗原阳性小鼠黑色素瘤细胞株(B16-CEA⁺)，分别用0.025％的胰酶消化后，加入培养液吹打细胞，1000rpm离心10min，加入含10％新生小牛血清的RPMI 1640细胞培养液中(含抗菌素)，细胞计数稀释成浓度为2×10⁵/ml备用。

MTT方法测定特异性肿瘤细胞杀伤活性

取制备的效应细胞和靶细胞按100∶1比例接种至96孔细胞培养板(对照组仅加靶细胞不加效应细胞)。按以下进行分组：

非特异性实验对照组 B16

实验I组 B16+外周血淋巴细胞

实验II组 B16+脾脏淋巴细胞

特异性实验对照组 B16-CEA⁺

实验I组外周血淋巴细胞+B16-CEA⁺

实验II组脾脏淋巴细胞+B16-CEA⁺

每样品设3个复孔，37℃、5％CO₂培养48h后，吸弃上清，用无血清1640培养液小心洗涤2次，并分别加无血清1640培养液100μl和MTT(5mg/ml)10μl，继续培养4h，然后吸弃上清，以DMSO 150μl溶解甲结晶，平板振荡器上轻轻振荡充分溶解，于酶标仪双波长570nm(测定波长)和690nm(参照波长)测定OD值。

4.2结果：

肿瘤细胞杀伤活性测定结果

各孔样本经MTT孵育，DMSO充分溶解后，于酶标仪双波长570nm(测定波长)和690nm(参照波长)测定OD值，根据酶标仪OD值测定结果，按下列公式计算特异性肿瘤细胞杀伤率，分析结果见表4。

表4CEA基因疫苗免疫小鼠特异性肿瘤细胞杀伤率(％)

说明：在第三次免疫后28d，免疫小鼠的外周血和脾脏淋巴细胞对小鼠黑色素瘤细胞均有一定的杀伤作用，其中对CEA阳性的B16-CEA⁺杀伤率最高。

实施例5实施例1对CEA阳性肿瘤的预防和治疗作用实验

5.1方法：

小鼠免疫模型的建立

二级雄性BALB/C小鼠，6周龄，随机分成三组，每组各8只。

I pVAX1对照1组

II pVAX1对照2组

III 实验组(pVCEA2+pV35-I-40)

小鼠每次免疫前，先注射0.25％布比卡因于两后腿股四头肌各50μl，24h后每侧再注射质粒50μg(实验组每成分各50μg)。

第25d和第45d各再免疫1次，共三次。

小鼠荷瘤模型的建立

上述各组小鼠第三次疫苗接种后7d，进行荷瘤试验。于每只小鼠颈背部皮下组织接种5×10⁵个黑色素瘤细胞，具体如下：

I 对照1组(pVAX1)接种5×10⁵个B16黑色素瘤细胞

II 对照2组(pVAX1)接种5×10⁵个B16-CEA⁺黑色素瘤细胞

III 实验组(pVCEA2+pV35-I-40)接种5×10⁵个B16-CEA⁺黑色素瘤细胞

接种后，观察各组免疫小鼠肿瘤出现时间及其生长和存活情况，计算小鼠的生命延长率。每7d检查1次小鼠肿瘤生长情况，成瘤时间以初次扪及肿块之日起计算，肿瘤体积＝(宽径²×长径)÷2。接种肿瘤8w后存活者并仍然没有肿块生成，定为有效生存，再次于腹部皮下接种5×10⁵个肿瘤细胞。于第8w解剖成瘤小鼠，取肿瘤和肌肉、心、肝、脾、肾等组织；或处死存活超过16w的小鼠，切取原接种肿瘤部位的组织及各脏器，肉眼及切片观察。

5.2结果：CEA基因疫苗免疫实验组接种B16-CEA⁺黑色素瘤细胞后，全程观察均无肿块出现。于第8w再次于腹部皮下接种5×10⁵个B16-CEA⁺肿瘤细胞，观察至第16w仍无肿块扪及。解剖接种部位，可见皮下组织结构清晰，无异常观察指标可见。

实施例6实施例1免疫毒性观察

6.1方法：小鼠免疫毒性模型的建立

二级雄性BALB/C小鼠，6周龄，随机分成2组，每组各6只。

I 对照组(生理盐水)

II 实验组(pVCEA2)

每次免疫前，先注射0.25％的布比卡因于小鼠两后腿股四头肌各50μl，24h后每侧再注射重组质粒50μg(对照组每侧注射50μl生理盐水)。第25d和第45d各再肌肉注射1次，共三次。用药后观察小鼠的正常饮食情况、行为和健康状态。

模型小鼠病理切片制备和显微镜观察

各组分别于免疫2d、7d和100d，处死2只小鼠，取小鼠用药部位肌肉组织，以及心、肝、脾、肾、盲肠和结肠等脏器组织，进行肉眼病理观察后，用10％甲醛固定过夜，常规脱水、石蜡包埋和切片，再HE染色，所得病理切片于显微镜下观察各组织结构的病理性改变。

6.2结果：小鼠经连续三次人用剂量肌肉注射用药后，除早期注射局部可见肿胀和局部刺激症状、后脚行动不便外，观察长达100d，饮食均正常，行为处于正常活跃的健康状态，也未见其它毒副反应，观察期间无一小鼠产生疾病或意外死亡。实验组小鼠经解剖观察，2d的小鼠后腿股四头肌除稍有肿胀之外，无肉眼可见的病变，病理切片下，其肌肉结构清晰，但局部可见明显的炎性反应，有淋巴细胞侵润现象，炎性部位旁边可观察到明显增生的淋巴结组织；7d的小鼠后腿股四头肌，无任何肉眼可见病变，显微镜下，可见肌肉结构清晰，但局部肌肉细胞有明显纤维化现象；实验组用药2d、7d的小鼠其他组织脏器和100d小鼠所有组织脏器肉眼观均无异常，病理切片观察未见有明显病理性改变。

因此，从病理毒理学角度来说，同步表达免疫佐剂CEA基因疫苗在体内用药是无免疫毒性作用的，是安全可行的。

本发明的上述实施例是用来说明本发明可实施的效果，而绝非对本发明的任何限制。本发明不限于上述实施例。

CEA基因疫苗、其构建方法及其在制备防治肿瘤疫苗的应用.seq

<110>黄爱强

<120>CEA基因疫苗、其构建方法及其在制备防治肿瘤疫苗的应用

<160>1

<210>1

<211>6211

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>misc_feature

<400>1

GACTCTTCGC GATGTACGGG CCAGATATAC GCGTTGACAT TGATTATTGA CTAGTTATTA 60

ATAGTAATCA ATTACGGGGT CATTAGTTCA TAGCCCATAT ATGGAGTTCC GCGTTACATA 120

ACTTACGGTA AATGGCCCGC CTGGCTGACC GCCCAACGAC CCCCGCCCAT TGACGTCAAT 180

AATGACGTAT GTTCCCATAG TAACGCCAAT AGGGACTTTC CATTGACGTC AATGGGTGGA 240

CTATTTACGG TAAACTGCCC ACTTGGCAGT ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTACGCC 300

CCCTATTGAC GTCAATGACG GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT ACATGACCTT 360

ATGGGACTTT CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC ATCGCTATTA CCATGGTGAT 420

GCGGTTTTGG CAGTACATCA ATGGGCGTGG ATAGCGGTTT GACTCACGGG GATTTCCAAG 480

TCTCCACCCC ATTGACGTCA ATGGGAGTTT GTTTTGGCAC CAAAATCAAC GGGACTTTCC 540

AAAATGTCGT AACAACTCCG CCCCATTGAC GCAAATGGGC GGTAGGCGTG TACGGTGGGA 600

GGTCTATATA AGCAGAGCTC TCTGGCTAAC TAGAGAACCC ACTGCTTACT GGCTTATCGA 660

AATTAATACG ACTCACTATA GGGAGACCCA AGCTGGCTAG CGTTTAAACT TAAGCTTGGT 720

ACCGAGCTCG GATCCACTAG TCCAGTGTGG TGGAATTCAG ACAGCAGAGA CCATGGAGTC 780

TCCCTCGGCC CCTCCCCACA GATGGTGCAT CCCCTGGCAG AGGCTCCTGC TCACAGCCTC 840

ACTTCTAACC TTCTGGAACC CGCCCACCAC TGCCAAGCTC ACTATTGAAT CCACGCCGTT 900

CAATGTCGCA GAGGGGAAGG AGGTGCTTCT ACTTGTCCAC AATCTGCCCC AGCATCTTTT 960

TGGCTACAGC TGGTACAAAG GTGAAAGAGT GGATGGCAAC CGTCAAATTA TAGGATATGT 1020

AATAGGAACT CAACAAGCTA CCCCAGGGCC CGCATACAGT GGTCGAGAGA TAATATACCC 1080

CAATGCATCC CTGCTGATCC AGAACATCAT CCAGAATGAC ACAGGATTCT ACACCCTACA 1140

CGTCATAAAG TCAGATCTTG TGAATGAAGA AGCAACTGGC CAGTTCCGGG TATACCCGGA 1200

GCTGCCCAAG CCCTCCATCT CCAGCAACAA CTCCAAACCC GTGGAGGACA AGGATCCTGT 1260

GGCCTTCACC TGTGAACCTG AGACTCAGGA CGCAACCTAC CTGTGGTGGG TAAACAATCA 1320

GAGCCTCCCG GTCAGTCCCA GGCTGCAGCT GTCCAATGGC AACAGGACCC TCACTCTATT 1380

CAATGTCACA AGAAATGACA CAGCAAGCTA CAAATGTGAA ACCCAGAACC CAGTGAGTGC 1440

CAGGCGCAGT GATTCAGTCA TCCTGAATGT CCTCTATGGC CCGGATGCCC CCACCATTTC 1500

CCCTCTAAAC ACATCTTACA GATCAGGGGA AAATCTGAAC CTCTCCTGCC ACGCAGCCTC 1560

TAACCCACCT GCACAGTACC CTTGGTTTGT CAATGGGACT TTCCAGCAAT CCACCCAAGA 1620

GCTCTTTATC CCCAACATCA CTGTGAATAA TAGTGGATCC TATACGTGCC AAGCCCATAA 1680

CTCAGACACT GGCCTCAATA GGACCACAGT CACGACGATC ACAGTCTATG CAGAGCCACC 1740

CAAACCTTTC ATCACCAGCA ACAACTCCAA CCCCGTGGAG GATGAGGATG CTGTAGCCTT 1800

AACCTGTGAA CCTGAGATTC AGAACACAAC CTACCTGTGG TGGGTAAATA ATCAGAGCCT 1860

CCCGGTCAGT CCCAGGCTGC AGCTGTCCAA TGACAACAGG ACCCTCACTC TACTCAGTGT 1920

CACAAGGAAT GATGTAGGAC CCTATGAGTG TGGAATCCGG AACGAATTAA GTGTTGACCA 1980

CAGCGACCCA GTCATCCTGA ATGTCCTCTA TGGCCCAGAC GACCCCACCA TTTCCCCCTC 2040

ATACACCTAT TACCGTCCAG GGGTGAACCT CAGCCTCTCC TGCCATGCAG CCTCTAACCC 2100

ACCTGCACAG TATTCTTGGC TGATTGATGG GAACATCCAG CAACACACAC AAGAGCTCTT 2160

TATCTCCAAC ATCACTGAGA AGAACAGCGG ACTCTATACC TGCCAGGCCA ATAACTCAGC 2220

CAGTGGCCAC AGCAGGACTA CAGTCAAGAC AATCACAGTC TCTGCGGAGC TGCCCAAGCC 2280

CTCCATCTCC AGCAACAACT CCAAACCCGT GGAGGACAAG GATGCTGTGG CCTTCACCTG 2340

TGAACCTGAG GCTCAGAACA CAACCTACCT GTGGTGGGTA AGTGGTCAGA GCCTCCCAGT 2400

CAGTCCCAGG CTGCAGCTGT CCAATGGCAA CAGGACCCTC ACTCTATTCA ATGTCACAAG 2460

AAATGACGCA AGAGCCTATG TATGTGGAAT CCAGAACTCA GTGAGTGCAA ACCGCAGTGA 2520

CCCAGTCACC CTGGATGTCC TCTATGGGCC GGACACCCCC ATCATTTCCC CCCCAGACTC 2580

GTCTTACCTT TCGGGAGCGA ACCTCAACCT CTCCTGCCAC TCGGCCTCTA ACCCATCCCC 2640

GCAGTATTCT TGGCGTATCA ATGGGATACC GCAGCAACAC ACACAAGTTC TCTTTATCGC 2700

CAAAATCACG CCAAATAATA ACGGGACCTA TGCCTGTTTT GTCTCTAACT TGGCTACTGG 2760

CCGCAATAAT TCCATAGTCA AGAGCATCAC AGTCTCTGCA TCTGGAACTT CTCCTGGTCT 2820

CTCAGCTGGG GCCACTGTCG GCATCATGAT TGGAGTGCTG GTTGGGGTTG CTCTGATATA 2880

GCAGCCCTGG TGTAGTTTGC GGCCGCTCTA GAACTAGTGG ATCTCCACGT GGCGGCTAGT 2940

ACTCCGGTAT TGCGGTACCC TTGTACGCCT GTTTTATACT CCCTTCCCGT AACTTAGACG 3000

CACAAAACCA AGTTCAATAG AAGGGGGTAC AAACCAGTAC CACCACGAAC AAGCACTTCT 3060

GTTTCCCCGG TGATGTCGTA TAGACTGCTT GCGTGGTTGA AAGCGACGGA TCCGTTATCC 3120

GCTTATGTAC TTCGAGAAGC CCAGTACCAC CTCGGAATCT TCGATGCGTT GCGCTCAGCA 3180

CTCAACCCCA GAGTGTAGCT TAGGCTGATG AGTCTGGACA TCCCTCACCG GTGACGGTGG 3240

TCCAGGCTGC GTTGGCGGCC TACCTATGGC TAACGCCATG GGACGCTAGT TGTGAACAAG 3300

GTGTGAAGAG CCTATTGAGC TACATAAGAA TCCTCCGGCC CCTGAATGCG GCTAATCCCA 3360

ACCTCGGAGC AGGTGGTCAC AAACCAGTGA TTGGCCTGTC GTAACGCGCA AGTCCGTGGC 3420

GGAACCGACT ACTTTGGGTG TCCGTGTTTC CTTTTATTTT ATTGTGGCTG CTTATGGTGA 3480

CAATCACAGA TTGTTATCAT AAAGCGAATT GGATAGGATC AAGCTTATCC ATACCCTCGA 3540

CCTCGAGATG TACAGGATGC AACTCCTGTC TTGCATTGCA CTAAGTCTTG CACTTGTCAC 3600

AAACAGTGCA CCTACTTCAA GTTCTACAAA GAAAACACAG CTACAACTGG AGCATTTACT 3660

GCTGGATTTA CAGATGATTT TGAATGGAAT TAATAATTAC AAGAATCCCA AACTCACCAG 3720

GATGCTCACA TTTAAGTTTT ACATGCCCAA GAAGGCCACA GAACTGAAAC ATCTTCAGTG 3780

TCTAGAAGAA GAACTCAAAC CTCTGGAGGA AGTGCTAAAT TTAGCTCAAA GCAAAAACTT 3840

TCACTTAAGA CCCAGGGACT TAATCAGCAA TATCAACGTA ATAGTTCTGG AACTAAGGGG 3900

CEA基因疫苗、其构建方法及其在制备防治肿瘤疫苗的应用.seq

ATCTGAAACA ACATTCATGT GTGAATATGC TGATGAGACA GCAACCATTG TAGAATTTCT 3960

GAACAGATGG ATTACCTTTT GTCAAAGCAT CATCTCAACA CTGACTTGAG GGCCCGTTTA 4020

AACCCGCTGA TCAGCCTTGA CTGTGCCTTC TAGTTGCCAG CCATCTGTTG TTTGCCCCTC 4080

CCCCGTGCCT TCCTTGACCC TGGAAGGTGC CACTCCCACT GTCCTTTCCT AATAAAATGA 4140

GGAAATTGCA TCGCATTGTC TGAGTAGGTG TCATTCTATT CTGGGGGGTG GGGTGGGGCA 4200

GGACAGCAAG GGGGAGGATT GGGAAGACAA TAGCAGGCAT GCTGGGGATG CGGTGGGCTC 4260

TATGGCTTCT ACTGGGCGGT TTTATGGACA GCAAGCGAAC CGGAATTGCC AGCTGGGGCG 4320

CCCTCTGGTA AGGTTGGGAA GCCCTGCAAA GTAAACTGGA TGGCTTTCTC GCCGCCAAGG 4380

ATCTGATGGC GCAGGGGATC AAGCTCTGAT CAAGAGACAG GATGAGGATC GTTTCGCATG 4440

ATTGAACAAG ATGGATTGCA CGCAGGTTCT CCGGCCGCTT GGGTGGAGAG GCTATTCGGC 4500

TATGACTGGG CACAACAGAC AATCGGCTGC TCTGATGCCG CCGTGTTCCG GCTGTCAGCG 4560

CAGGGGCGCC CGGTTCTTTT TGTCAAGACC GACCTGTCCG GTGCCCTGAA TGAACTGCAA 4620

GACGAGGCAG CGCGGCTATC GTGGCTGGCC ACGACGGGCG TTCCTTGCGC AGCTGTGCTC 4680

GACGTTGTCA CTGAAGCGGG AAGGGACTGG CTGCTATTGG GCGAAGTGCC GGGGCAGGAT 4740

CTCCTGTCAT CTCACCTTGC TCCTGCCGAG AAAGTATCCA TCATGGCTGA TGCAATGCGG 4800

CGGCTGCATA CGCTTGATCC GGCTACCTGC CCATTCGACC ACCAAGCGAA ACATCGCATC 4860

GAGCGAGCAC GTACTCGGAT GGAAGCCGGT CTTGTCGATC AGGATGATCT GGACGAAGAG 4920

CATCAGGGGC TCGCGCCAGC CGAACTGTTC GCCAGGCTCA AGGCGAGCAT GCCCGACGGC 4980

GAGGATCTCG TCGTGACCCA TGGCGATGCC TGCTTGCCGA ATATCATGGT GGAAAATGGC 5040

CGCTTTTCTG GATTCATCGA CTGTGGCCGG CTGGGTGTGG CGGACCGCTA TCAGGACATA 5100

GCGTTGGCTA CCCGTGATAT TGCTGAAGAG CTTGGCGGCG AATGGGCTGA CCGCTTCCTC 5160

GTGCTTTACG GTATCGCCGC TCCCGATTCG CAGCGCATCG CCTTCTATCG CCTTCTTGAC 5220

GAGTTCTTCT GAATTATTAA CGCTTACAAT TTCCTGATGC GGTATTTTCT CCTTACGCAT 5280

CTGTGCGGTA TTTCACACCG CATACAGGTG GCACTTTTCG GGGAAATGTG CGCGGAACCC 5340

CTATTTGTTT ATTTTTCTAA ATACATTCAA ATATGTATCC GCTCATGAGA CAATAACCCT 5400

GATAAATGCT TCAATAATAG CACGTGCTAA AACTTCATTT TTAATTTAAA AGGATCTAGG 5460

TGAAGATCCT TTTTGATAAT CTCATGACCA AAATCCCTTA ACGTGAGTTT TCGTTCCACT 5520

GAGCGTCAGA CCCCGTAGAA AAGATCAAAG GATCTTCTTG AGATCCTTTT TTTCTGCGCG 5580

TAATCTGCTG CTTGCAAACA AAAAAACCAC CGCTACCAGC GGTGGTTTGT TTGCCGGATC 5640

AAGAGCTACC AACTCTTTTT CCGAAGGTAA CTGGCTTCAG CAGAGCGCAG ATACCAAATA 5700

CTGTCCTTCT AGTGTAGCCG TAGTTAGGCC ACCACTTCAA GAACTCTGTA GCACCGCCTA 5760

CATACCTCGC TCTGCTAATC CTGTTACCAG TGGCTGCTGC CAGTGGCGAT AAGTCGTGTC 5820

TTACCGGGTT GGACTCAAGA CGATAGTTAC CGGATAAGGC GCAGCGGTCG GGCTGAACGG 5880

GGGGTTCGTG CACACAGCCC AGCTTGGAGC GAACGACCTA CACCGAACTG AGATACCTAC 5940

AGCGTGAGCT ATGAGAAAGC GCCACGCTTC CCGAAGGGAG AAAGGCGGAC AGGTATCCGG 6000

TAAGCGGCAG GGTCGGAACA GGAGAGCGCA CGAGGGAGCT TCCAGGGGGA AACGCCTGGT 6060

ATCTTTATAG TCCTGTCGGG TTTCGCCACC TCTGACTTGA GCGTCGATTT TTGTGATGCT 6120

CGTCAGGGGG GCGGAGCCTA TGGAAAAACG CCAGCAACGC GGCCTTTTTA CGGTTCCTGG 6180

GCTTTTGCTG GCCTTTTGCT CACATGTTCT T 6211

Claims

1. 人CEA基因疫苗，其结构是真核细胞表达质粒上有人癌胚抗原CEA基因、人白细胞介素2基因、IRES片段。

2. 根据权利要求1所述的人CEA基因疫苗，其特征在于真核细胞表达质粒为pVAX1。

3. 根据权利要求1所述的人CEA基因疫苗，其特征在于人CEA癌胚抗原基因与CEA cDNA NO.M17303基因在99％范围内相同。

4. 根据权利要求1所述的人CEA基因疫苗，其特征在于IRES片段，选自下列片段之一：

脊髓灰质炎病毒的IRES片段，或者

心肌炎病毒的IRES片段，或者

人工合成的双顺反子元件。

5. 根据权利要求1~4之一所述的人CEA基因疫苗，其特征在于其核苷酸序列为SEQ ID No.1。

6. 权利要求1的人CEA基因疫苗的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

一步法提取人CEA肿瘤组织细胞总RNA；一步法扩增目的基因cDNA；同时用LA DNA聚合酶进行PCR扩增hIL-2；使用真核细胞表达载体构建hIL-2质粒；选择合适的内切酶，酶切hIL-2质粒和CEA cDNA片段，回收目的片段后通过快速DNA连接试剂盒连接，构建CEA-hIL-2质粒；选择NotI和XhoI双酶切pGE-IRES-SN商业工具质粒和CEA-hIL-2质粒，凝胶电泳分离回收目的片段后，通过快速DNA连接试剂盒连接；重组质粒转染大肠杆菌。

7. 根据权利要求6所述的人CEA基因疫苗的构建方法，其特征在于大肠杆菌为JM109。

8. 权利要求1所述的人CEA基因疫苗在制备防治肿瘤疫苗中的应用。

9. 根据权利要求8所述的人CEA基因疫苗在制备防治肿瘤疫苗中的应用，其特征在于疫苗剂型为肌肉注射针剂、口服液或口服固体制剂。