CN101006172A - 包含导入了rna病毒的树突状细胞的抗癌剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种包含导入了RNA病毒的树突状细胞的抗癌剂。另外，本发明还提供了包含制备导入了RNA病毒的树突状细胞的步骤的抗癌剂的制备方法。另外，本发明还提供了利用导入了RNA病毒的树突状细胞的对癌症的治疗方法。本发明提供了组合使用RNA病毒与树突状细胞的有效地对抗癌症的治疗方法。

Description

包含导入了RNA病毒的树突状细胞的抗癌剂

[技术领域]

[0001]本发明涉及癌治疗的领域。

[背景技术]

[0002]近年来、以进行性癌为对象的使用增殖型病毒的病毒疗法(virotherapy)在临床研究方面得到了发展。所谓病毒疗法是指使HSV-1，及腺病毒等的增殖型病毒在肿瘤细胞中进行感染，伴随着病毒的增殖，通过病毒的杀细胞效果来达到治愈肿瘤目的的治疗方法。使用HSV-1及腺病毒时，治疗肿瘤用的增殖型病毒是在病毒基因组中进行了基因操作的变异病毒，使其继续保持有在肿瘤内的复制功能，而对人类正常组织的病原性被限制到了最低。在肿瘤细胞中感染了的治疗用增殖型病毒，在细胞内进行复制，在该过程中被感染细胞死亡。增殖了的病毒向周围的肿瘤细胞再次进行感染，来扩大其抗肿瘤的作用。(Alemany R.et al.，Replicativeadenoviruses for cancer therapy.Nat Biotechnol.，2000，18：723-727；Curiel，D.T.，The development of conditionally replicative adenoviruses for cancer therapy.，Clin Cancer Res.，2000，6：3395-9；Kirn，D.，Virotherapy for cancer：Currentstatus，hurdles，and future directions.，Cancer Gene Therapy，9：959-960，2002；Mineta T.et al.，Attenuated multi-mutated herpes simplex virus-1 for thetreatment of malignant gliomas.Nat Med 1：938-943，1995)。对癌症的病毒疗法，可以和手术，放射线疗法，化学疗法等所谓的旧有的治疗方法联合使用，并可适用于一般的固形癌，还可以进行反复给药，还可以通过在病毒基因组中直接搭载细胞因子等治疗基因来增强抗肿瘤效果等，其应用范围很广，在实用性方面具有很大优势。如果可以开发出更具显著效果的病毒疗法，可期望对癌治疗作出更大的贡献。

[非专利文献1]Alemany R.et al.，Replicative adenoviruses for cancertherapy.Nat Biotechnol.，2000，18：723-727

[非专利文献2]Curiel，D.T.，The development of conditionally replicativeadenoviruses for cancer therapy.，Clin Cancer Res.，2000，6：3395-9

[非专利文献3]Kirn，D.，Virotherapy for cancer：Current status，hurdles，and future directions.，Cancer GeneTherapy，2002，9：959-960

[非专利文献4]Mineta T.et al.，Attenuated multi-mutated herpes simplexvirus-1 for the treatment of malignant gliomas.Nat Med，1995，1：938-943

[发明的公开]

[发明将要解决的课题]

[0003]本发明提供了一种包含被导入了RNA病毒的树突状细胞的抗癌剂。另外，本发明还提供了包含制备导入了RNA病毒的树突状细胞的步骤的抗癌剂的制备方法等。另外，本发明还提供了利用导入了RNA病毒的树突状细胞来对抗癌症的治疗方法。

[为解决该课题而使用的手段]

[0004]本发明的发明者们发现了把具有基因组复制能力的RNA病毒导入到树突状细胞后，该树突状细胞可被活化，并且能够发挥出色的制癌效果。通过树突状细胞向癌中注入RNA病毒时的对癌增殖的抑制效果，比向癌中直接注入RNA病毒的效果要显著得多。向树突状细胞中导入RNA病毒的步骤由于可以在体外进行，与以前的病毒疗法相比，可以严密地控制病毒的导入条件，进一步地，通过除去没有感染树突状细胞的病毒，可以提高其安全性。另外，导入了RNA病毒的树突状细胞的制癌效果，在利用不释放感染性病毒粒子的缺损型病毒时也发现具有相同的效果。也就是说，在导入了RNA病毒的树突状细胞的制癌效果方面，RNA病毒在树突状细胞内复制基因组RNA是很重要的，而释放感染性病毒粒子，并向周围的细胞中进行扩大感染并非是必须的。因此，例如利用通过使编码病毒包被蛋白质等，感染性病毒粒子形成时必须的蛋白质的病毒基因缺损，而不具有感染性病毒粒子形成能力的安全性很高的RNA病毒，来进行病毒疗法是可能的。

[0005]也就是说本发明，涉及了一种包含被导入了RNA病毒的树突状细胞的抗癌剂，和该抗癌剂的制备方法，以及利用导入了RNA病毒的树突状细胞来对抗癌症的治疗方法。更具体地，涉及了权利要求的各项中记载的发明。再者，引用了同一权利要求的权利要求中记载的一个或者多个发明的组合组成的发明也都被包含在这些权利要求中记载的发现当中。也就是说本发明，

〔1〕一种包含导入了具有基因组复制能力的RNA病毒的树突状细胞的抗癌剂

〔2〕〔1〕中记载的抗癌剂，其中所述RNA病毒不编码外源蛋白质〔3〕〔1〕或者〔2〕中记载的抗癌剂，其中所述RNA病毒是不形成感染性病毒粒子的无复制能力的病毒

〔4〕〔1〕或者〔3〕中记载的抗癌，其中所述RNA病毒编码可溶性FGF受体或者IFN-β

〔5〕〔1〕到〔4〕任意一项中记载的抗癌剂，其中所述RNA病毒是感染性或者非感染性病毒粒子

〔6〕〔1〕到〔4〕任意一项中记载的抗癌剂，其中所述RNA病毒是基因组RNA-蛋白质复合体

〔7〕包含向树突状细胞中导入了具有基因组复制能力的RNA病毒的步骤的抗癌剂的制备方法

〔8〕涉及了包含给药导入了具有基因组复制能力的RNA病毒的树突状细胞的步骤的对癌症的抑制方法。

[对示图的简单说明]

[0006][图1]表示来自末梢血单核细胞浓缩细胞的单核细胞的树突状细胞的表型。对在P1中判定的活细胞，利用抗CD11c-PE结合抗体以及抗HLA-class II(DR，DP，DQ)的FITC结合抗体，来观察CD11c以及HLA-classII(DR，DP，DQ)的表达(左边的基质蛋白)。进一步地选择CD11c以及HLA-class II(DR，DP，DQ)共同表达阳性的细胞，利用1)抗CD14-APC结合抗体、2)抗CD1a-APC结合抗体、3)抗CD80-生物素(biotin)结合抗体(二次抗体在链霉素-APC中进行染色)，利用和CD11c的斑点杂交来分别显示各自的表达水平(右边的三个基质蛋白)。再者，实施例中的″Class II″表示使用了识别HLA-DR、DQ、DP的全部抗体的结果，″HLA-DR″表示使用特异地识别HLA-DR的抗体的結果。

[图2]表示导入了GFP表达RNA病毒的DC的GFP以及协同刺激分子(costimulatory molecules)的表达。

[图3]表示来自人单核细胞的树突状细胞的GFP表达RNA病毒的导入效率和树突状细胞的活化(感染后第2天)。

[图4]表示来自人单核细胞的树突状细胞的GFP表达RNA病毒的导入效率和树突状细胞的活化(感染后第4天)。

[图5]表示来自人单核细胞的树突状细胞的GFP表达RNA病毒的导入效率和树突状细胞的活化(感染后第8天)。

[图6]表示GFP表达RNA病毒导入后的DC数量的变化。

[图7]表示GFP表达RNA病毒导入后的GFP的表达期间。

[图8]表示在向人的DC进行GFP表达RNA病毒导入时的导入效率中的LPS的刺激效果。

[图9]表示在向人的DC进行GFP表达RNA病毒导入时的导入效率中的LPS的刺激效果。

[图10]表示向DC进行基因导入时对温育时间的探讨结果。

[图11]表示向来自脐带血的DC导入基因的图形。

[图12]表示向来自脐带血的DC导入基因的图形。

[图13]表示基因导入后的协同刺激分子(costimulatory molecules)的表达(与LPS刺激的比较)。

[图14]表示基因导入后的协同刺激分子(costimulatory molecules)的表达(与LPS刺激的比较)。

[图15]表示基因导入后的协同刺激分子(costimulatory molecules)的表达(与LPS刺激的比较)。

[图16]表示基因导入后的吞噬能力的图形。

[图17]表示基因导入后的吞噬能力的图形。

[图18]表示来自单核细胞的DC在RNA病毒导入后产生细胞因子。

[图19]表示RNA病毒导入后的树突状细胞的标记蛋白质的表达。

[图20]表示RNA病毒导入后的树突状细胞的标记蛋白质的表达。

[图21]表示导入了RNA病毒的DC对同种异体T细胞的刺激能力。

[图22]表示导入了RNA病毒的树突状细胞对抗原特异性T细胞的增殖诱导能力。

[图23]通过导入RNA病毒，在体外诱导MART-1特异性CTL的结果。

[图24]表示在皮下接种了B16黑色素瘤细胞的增殖曲线。

[图25]表示YAC-1靶细胞的⁵¹Cr的释放测试结果。

[图26]表示TRP2肽+EL-4的⁵¹Cr的释放测试结果。

[图27]表示GFP表达SeV、可溶型FGF受体表达SeV、或者可溶型PDGFRα表达SeV的体内给药对黑色素瘤的治疗效果。

[图28]表示导入了GFP表达SeV或者可溶型PDGFRα表达SeV的树突状细胞的回外给药对黑色素瘤的治疗效果。

[本发明的最佳实施方案]

[0007]本发明提供了包含导入了具有基因组复制能力的RNA病毒的树突状细胞的抗癌剂。所谓本发明中的RNA病毒是指具有RNA基因组的病毒。本发明中的RNA病毒，优选在病毒的生命周期中以RNA为模板进行RNA合成的病毒。对于RNA病毒，可以是在树突状细胞中复制基因组RNA的所望的RNA病毒，也可以是野生型病毒，还可以是减毒型病毒，或温度敏感性病毒等的变异型病毒。另外，也可以是天然的病毒(自然发生的病毒)，还可以是重组病毒等。在RNA病毒中，包含有单链RNA病毒(包含正义链RNA病毒以及负义链RNA病毒)、以及包括双链RNA病毒。另外包含有包被的病毒(包被病毒；enveloped viruses)以及没有包被的病毒(非包被病毒；non-enveloped viruses)，优选使用包被病毒。在本发明的RNA病毒中，具体地包含属于以下科的病毒。

拉萨病毒等的沙粒病毒科(Arenaviridae)

流感病毒等的正粘病毒科(Orthomyxoviridae)

SARS病毒等的冠状病毒科(Coronaviridae)

风疹等的外衣病毒科(Togaviridae)

流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、仙台病毒、RS病毒等的副粘病毒科(Paramyxoviridae)

脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、人肠道孤病毒等的细小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)

马尔堡病毒、埃博拉病毒等的丝状病毒科(Filoviridae)

黄热病病毒、登革热病毒、C型肝炎病毒、G型肝炎病毒等的黄热病病毒科(Flaviviridae)

布尼亚病毒科(Bunyaviridae)

狂犬病病毒等的棒状病毒科(Rhabdoviridae)

呼肠孤病毒科(Reoviridae)

[0008]在本发明中，被导入了具有基因组复制能力的RNA病毒的树突状细胞是指包含基因组复制能力的RNA病毒的基因组RNA的树突状细胞，通过该RNA编码的病毒蛋白质，使该RNA在树突状细胞内进行复制。RNA病毒的基因组RNA和该RNA结合的蛋白质在细胞内形成脱氧核糖核酸-蛋白质(RNP)复合体，在细胞内对该基因组RNA进行复制。该RNP又被叫做核壳体。也就是说，在本发明中，被导入了具有基因组复制能力的RNA病毒的树突状细胞是指，含有具有基因组复制能力的RNA病毒的脱氧核糖核酸-蛋白质(核壳体)的树突状细胞。

[0009]为了获得导入了RNA病毒的树突状细胞，在RNA病毒与树突状细胞或者其前驱细胞，使感染性RNA病毒粒子与它们接触以进行感染。或者，不使用感染性病毒粒子，而向细胞中导入具有基因组复制能力的RNA病毒中包含的RNP，或者也可以是没有感染性的病毒粒子，但其粒子中包含该RNP的病毒粒子(叫做非感染性病毒粒子、或者病毒样粒子(VLP))。即使是从病毒粒子中除去了包被或者外壳的RNP(病毒的核心)、只要向树突状细胞中进行导入，就可以在细胞内复制病毒基因组RNA(WO97/16538；WO00/70055)。另外，向树突状细胞中导入编码病毒基因组RNA以及该基因组RNA复制时所需的病毒蛋白质(单链负链RNA病毒时是N、P以及L蛋白质)的表达载体，便可以在树突状细胞内形成RNP。向树突状细胞或者其前驱体细胞中导入RNP或VLP时，可以利用众所周知的转染方法。具体地，磷酸钙(Chen，C.&Okayama，H.(1988)BioTechniques 6：632-638；Chen，C.and Okayama，H.，1987，Mol.Cell.Biol.7：2745)、DEAE-葡聚糖(Rosenthal，N.(1987)Methods Enzymol.152：704-709)、以各种各样的核糖体为基础的转染试剂(Sambrook，J.et al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY))、电穿孔法(Ausubel，F.etal.(1994)In Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons，NY)，Vol.1，Ch.5および 9)等，可以使用本领域工作人员所熟知的各种技术向树突状细胞进行转染。为了抑制在内体中的分解，在转染过程中，可以加入氯奎(Calos，M.P.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：3015)。如果要列举出几种转染试剂，DOTMA(Roche)、Superfect Transfection Ragent(QIAGEN，Cat No.301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Roche#1811169)、TransIT-LT1(Mirus，Product No.MIR 2300)、CalPhos^TM Mammalian Transfection Kit(Clontech#K2051-1)、CLONfectin^TM(Clontech#8020-1)等可被列举出来。特别是包被病毒粒子形成时，可以观察到其中包含有来自宿主细胞的蛋白质，这种蛋白质在向树突状细胞进行导入时，可以考虑会成为抗原性以及细胞伤害性的原因。(J.Biol.Chem.(1997)272，16578-16584)。因此，向树突状细胞中导入除去了包被的RNP是有优点的(WO00/70055)。

[0010]RNA病毒一经导入，在树突状细胞内就会进行病毒基因组的复制，诱导树突状细胞的活化，并分化成成熟的树突状细胞。获得的成熟树突状细胞，保持了使T细胞活化的能力。导入了RNA病毒的树突状细胞具有提高免疫系统活性的能力，可通过向肿瘤给药来发挥制癌作用。RNA病毒向树突状细胞的感染，例如，可以在培养基或者生理盐水等所望的生理性水溶液中进行体内(或者回外)给药。在本发明中，使从体内取出的树突状细胞或者其前驱细胞在体外与RNA病毒接触，导入病毒后，再返送到体内的回体抗肿瘤治疗是很有用处的。使RNA病毒在体外感染时，使RNA病毒与还不成熟的树突状细胞接触，或者最好与包含不成熟的树突状细胞的细胞组分混合。树突状细胞可以通过导入RNA病毒而被活化，另一方面，也可以通过与细菌或者细菌脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)等的接触而被活化。利用这种方法使树突状细胞另行被活化时，可以在活化以后再导入RNA病毒，为了不使病毒的导入效率下降，该活化操作最好在导入病毒之后，而不是在导入病毒之前进行(或者使病毒接触树突状细胞的同时)。

[0011]病毒和树突状细胞或者其前驱细胞的接触，MOI(多重感染度；对应每个细胞的感染病毒数)最好是在1到500之间，更优选是2到300、更优选是3到200、更优选是5到100、更优选是7到70。RNA病毒和树突状细胞的接触时间即使很短，也已足够，例如可以接触1分钟或以上、优选是3分钟或以上、5分钟或以上、10分钟或以上、或者20分钟或以上，例如也可以接触1到60分钟左右、更加特别指定的话是5分钟到30分钟左右。当然，也可以接触比这更长的时间，例如，数日或者更长都可以。

[0012]所谓树突状细胞(Dendritic cell；DC)是指在成熟状态下，拥有树枝状形态，并具有通过递呈抗原使T细胞活化的能力的细胞。在树突状细胞中，包含由分布在活体内各种组织器官中的来自骨髓细胞的具有树枝状形态的细胞群，以及由来自骨髓或者血液干细胞，在体外利用细胞因子等分化诱导的与分布在活体组织器官内的具有树枝状形态的细胞等同的细胞群。具体地，例如淋巴系树突状细胞(也可以诱导Th2或者免疫耐受)、髓系树突状细胞(一般使用的树突状细胞，包含未成熟树突状细胞以及成熟树突状细胞)、郎格罕斯细胞(皮肤的抗原递呈细胞，是一种重要的树突状细胞)、并指状树突状细胞(存在于淋巴结、脾脏的T细胞领域，被认为具有向T细胞进行抗原递呈功能的细胞)、滤泡树突状细胞(作为B细胞的抗原提呈细胞很重要、抗原抗体复合体、抗原补体复合体通过抗体受体、补体受体在树突状细胞上被提呈、进而向B细胞进行抗原递呈。)等被包含在内，优选是高表达MHC Class I以及Class II，更优选是表达CD11c的细胞。

[0013]另外树突状细胞具有树枝状形态，由CD11c、HLA-class II(HLA-DR、-DP、或者-DQ)、CD40、以及CD1a组成的组中，最好是选择该组表面标记的两个或以上是阳性的细胞。在本发明中的树突状细胞优选是HLA-class II⁺以及CD11c⁺的细胞、更优选是CD1a⁺、HLA-class II⁺、以及CD11c⁺的细胞、并且不表达T细胞标记(CD3)、B细胞标记(CD19、CD20)、NK细胞标记(CD56)、中性粒细胞标记(CD15)、单核细胞标记(CD14)的细胞。RNA病毒导入时使用的树突状细胞集团的CD14⁺的比例，例如是10％或以下、优选是5％或以下、更优选是1％或以下。

[0014]另外，在本发明的树突状细胞中，成熟的树突状细胞以及未成熟的树突状细胞被包含在内。所谓未成熟的树突状细胞是指T细胞活化能力较低的树突状细胞。具体地，未成熟的树突状细胞与添加LPS(1μg/ml)后培养两天的诱导了的成熟树突状细胞相比，其抗原递呈能力是二分之一或以下，优选是四分之一或以下。抗原递呈能力，例如对同种异体T细胞的活化能力(混合淋巴细胞试验；同种异体T细胞和树突状细胞混合培养，T细胞和树突状细胞以1∶10的比例混合培养，优选是变化其比率进行培养，培养结束后的8小时之前添加³H-胸腺嘧啶糖苷(thymidine)，根据其T细胞内DNA中的摄取量，来定量T细胞增殖能力：参照图21以及22；文献Gene Therapy 2000；7；249-254)、或者利用肽的特异性细胞伤害性T细胞(CTL)的诱导能力试验(向树突状细胞中添加已知的对特定抗原的特定ClassI限制性多肽，并与来自采样树突状细胞同样的健康人末梢血的T细胞共同培养(第3天以后使用25U/ml的IL-2，优选是100U/ml)(优选是在21天内进行3次由树突状细胞引起的刺激，更优选是在14天内进行2次由树突状细胞引起的刺激)，由此获得的效应细胞与⁵¹Cr标记的靶细胞(多肽限制性Class I阳性肿瘤细胞)以20∶1、10∶1、5∶1、以及2.5∶1、优选是100∶1、50∶1、25∶1、以及12.5∶1的比例，进行4小时的混合培养，利用靶细胞的⁵¹Cr释放量来进行定量(参照图2 3；根据文献Arch Dermatol Res 2000；292；325-332)。另外未成熟树突状细胞优选是具有抗原吞噬能力的，更优选是诱导T细胞活化的协同刺激受体的表达是较低的(例如如上所述，与LPS诱导的成熟DC相比是显著的)或者是阴性。另一方面，所谓成熟树突状细胞是指可使T细胞活化等的抗原递呈能力很高的树突状细胞。具体地，成熟树突状细胞是具有添加了LPS(1mg/ml)并培养两天以进行成熟诱导的树突状细胞的抗原递呈能力的二分之一或以上，优选是具有同等或以上的抗原递呈能力的细胞。另外成熟树突状细胞优选是抗原吞噬能力低或者不具有吞噬能力的细胞，更优选是诱导T细胞活化的协同刺激受体的表达是很高的。另外，所谓树突状细胞的活化是指从未成熟树突状细胞到成熟树突状细胞的转移。在活化的树突状细胞中，成熟树突状细胞，以及通过活化刺激诱导的协同刺激的CD80、CD86的表达在上升中途的树突状细胞也包含在该范畴内。在CD11c阳性的树突状细胞中，CD83阳性是成熟树突状细胞的标志。

[0015]例如，成熟树突状细胞优选是CD40、CD80、CD86以及HLA-class II的表达是强阳性的细胞。更优选是成熟树突状细胞表达CD83。例如，以CD80、CD83、以及CD86组成的群中选择出来的标记为基础，可以区分开未成熟树突状细胞和成熟树突状细胞。未成熟树突状细胞优选这些标记较弱，或者是阴性，而成熟树状突细胞是阳性。

[0016]如上所述，未成熟树突状细胞通常保持着很高的吞噬能力。在树突状细胞中添加LPS(1μg/ml)培养2天后，树突状细胞被活化，而其吞噬能力则下降。吞噬能力可以通过测定树突状细胞的小分子的吞噬量或者可吞噬细胞的比例来决定。优选，吞噬能力通过树突状细胞内的小分子的吞噬量来测定。例如，利用1μm左右的着色玻璃珠，来测定树突状细胞内的玻璃珠的吞噬量。减去4℃时成为阳性的背景后定量。所谓高吞噬能力是指树突状细胞内的小分子的吞噬量，是用上述的LPS(1μg/ml)对树突状细胞进行2天刺激了的树突状细胞的4倍或以上、更优选是5倍或以上、更优选是6倍或以上的吞噬能力。或者，吞噬了小分子的细胞的比例为2倍或以上、更优选是3倍或以上。所谓低吞噬能力是指树突状细胞内的小分子的吞噬量，是用LPS(1μg/ml)经过2天刺激的树突状细胞的4倍或以下、更优选是2倍或以下、更优选是1.5倍或以下。或者，以小分子吞噬细胞比例来测定时，为2倍或以下、更优选是1.5倍或以下。

[0017]成熟树突状细胞的判定在本专业工作人员中是普遍进行的，上述的各个标记以及其表达的测定方法也是本专业工作人员所熟知的。例如，CD11c是大约150kD的粘附糖蛋白(p150，整合素alpha链)。据报道，CD11c具有与CD18结合形成CD11c/CD18复合体，和对纤维蛋白原的结合能力、另外还有可成为iC3b以及ICAM-1的受体的报道。另外，CD11c/CD18有可能作为与接受刺激后的上皮受体结合的粘附分子起作用(Knapp，W.etal.，eds.，1989，Leucocyte Typing IV：White Cell Differentiation Antigens，Oxford University Press，New York；Barclay，N.A.et al.，eds.，1993，TheLeucocyte Antigen FactsBook，CD11 Section，Academic Press Inc.，San Diego，California，p.124；Stacker，S.A.and T.A.Springer，1991，J.Immunol.146：648)。

[0018]CD1a是约为49kD的肽，与beta2微球蛋白结合。CD1a在构造上被认为与MHC class I的抗原类似，起着抗原递呈的功能。(Knapp，W.et al.，eds.，1989，Leucocyte Typing IV：White Cell Differentiation Antigens，Oxford University Press，New York；Schlossman，S.et al.，eds.，1995，LeucocyteTyping V：White Cell Differentiation Antigens.Oxford University Press，NewYork；Hanau，D.et al.，1990，J.Investigative Dermatol.95：503；Calabi，F.and A.Bradbury.，1991.，Tissue Antigens 37：1)。

[0019]CD14是53-55 kD的糖磷脂酰肌醇(GPI)锚型单链糖蛋白，在细网树突状细胞以及特定种类的朗格罕斯细胞中表达。CD14被定性为对LPS与血清LPS结合蛋白质(LPB)的复合体具有高亲和性的表面受体(McMichael，A.J.et al.，eds.，1987，Leucocyte Typing III：White CellDifferentiation Antigens，Oxford University Press，New York；Knapp，W.et al.，eds.，1989，Leucocyte Typing IV：White Cell Differentiation Antigens，OxfordUniversity Press，New York；Schlossman，S.et al.，eds.，1995，Leucocyte TypingV：White Cell Differentiation Antigens.Oxford University Press，New York；Wright，S.D.et al.，1990，Science 249：1434)。

[0020]CD40是45-48kD的I型内在膜糖蛋白(type I integralmembrane glycoprotein)、抗CD40抗体经常被作为细胞标记来使用(Schlossman，S.et al.，eds.，1995，Leucocyte Typing V：White CellDifferentiation Antigens.Oxford University Press，New York；Galy，A.H.M.；andH.Spits，1992，J.Immunol.149：775；Clark，E.A.and J.A.Ledbetter，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.83：4494；Itoh，H.et al.，1991，Cell 66：233；Barclay，N.A.et al.，1993，The Leucocyte Antigen Facts Book.，Academic Press)。

[0021]CD80是约为60kD的膜贯穿型糖蛋白，也是免疫球蛋白超家族(Ig supergenefamily)中的一员。CD80是在T细胞中表达的CD28以及CD152(CTLA-4)的配体(Schlossman，S.et al.，eds.，1995，Leucocyte Typing V：White Cell Differentiation Antigens.Oxford University Press，New York；Schwarts，R.H.，1992，Cell 71：1065；Azuma，M.et al.，1993，J.Exp.Med.177：845；Koulova，L.et al.，1991，J.Exp.Med.173：759；Freeman，G.J.et al.，1998，J.Immunol.161：2708；Behrens，L.et al.，1998，J.Immunol.，161(11)：5943；Guesdon，J.-L.et al.，1979，J.Histochem.Cytochem.27：1131-1139)。

[0022]CD83是大约45kD的膜贯穿型蛋白质，也是免疫球蛋白超家族中的一员。CD83具有短链的V型Ig的细胞外结构域和C末端的细胞质尾区域。CD83主要在滤泡树突状细胞，循环树突状细胞，淋巴组织内的并指状树突状细胞及在体外生成的树突状细胞，以及胸腺树突状细胞中表达(Zhou，L-J.，and T.F.Tedder，1995，J.Immunol.154.3821；Zhou，L-J.et al.，1992，J.Immunol.149：735；Summers，K.L.et al.，1995，Clin Exp.Immunol.100：81；Weissman，D.et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci USA.92：826；Hart，D.N.J.，1997，Blood 90：3245)。

[0023]CD86(B70/B7-2)是约为75kD的细胞表面蛋白质，也是CD28以及CTLA-4的第二配体，在初期免疫应答中作为T细胞的协同刺激发挥着重要的作用(Azuma M.et al.，1993，Nature 366：76；Nozawa Y.et al.，1993，J.Pathology 169：309；Engle，P.et al.1994.，Blood 84：1402；Engel，P.et al.，CD86Workshop Report.In：Leukocyte Typing V.Schlossman，S.F.et al.eds.，1994，Oxford University Press；Yang，X.F.et al.，1994，Upregulation of CD86 antigenon TPAstimulated U937 cells，1994，(abstract).American Society of Hematology，Nashville，TN；Guesdon，J.-L.et al.，1979，J.Histochem.Cytochem.27：1131-1139)。

[0024]CCR7是也被叫做BLR-2、EBI-1、以及CMKBR7的7回膜贯穿型G蛋白质结合受体，是CC趋化因子MIP-3beta/Exodus 3/ELC/CCL19以及6Ckine/Exodus 2/SLC/TCA4/CCL21的受体(Sallusto，F.et al.，1999，Nature 401：708-12；Lipp，M.et al.，2000，Curr.Top.Microbiol.Immunol.251：173-9；Birkenbach，M.et al.，1993，J.Virol.67：2209-20；Schweickart，V.L.et al.，1994，Genomics 23：643-50；Burgstahler，R.et al.，1995，Biochem.Biophys.Res.Commun.215：737-43；Yoshida，R.et al.，1997，J.Biol.Chem.272：13803-9；Yoshida，R.et al.，1998，J.Biol.Chem.273：7118-22；Yoshida，R.et al.，1998，Int.Immunol.10：901-10；Kim，C.H.et al.，1998，J.Immunol.161：2580-5；Yanagihara，S.et al.，1998，J.Immunol.161：3096-102)。

[0025]HLA-class II中有DR、DP、以及DQ，通过与其全部3型结合的抗体可进行网络式的检测(Pawelec，G.et al.，1985，Human Immunology12：165；Ziegler，A.et al.，1986，Immunobiol.171：77)。HLA-DR是MHC的人类class II的抗原之一，是由alpha链(36 kDa)和beta亚基(27 kDa)组成的膜贯穿型糖蛋白质。在表皮的郎格罕斯细胞中与CDla抗原一起共同表达。CDla在抗原递呈过程中，在细胞的相互作用中起重要作用(Barclay，N.A.etal.，1993，The Leucocyte Antigen Facts Book.p.376.Academic Press)。

[0026]另外，关于人类以外的哺乳动物，以上述标记基因的相同基因产物作为指标来鉴定树突状细胞。对该等标记的抗体，例如可以从BDBiosciences社(BD PharMingen)购买，有关它的详细情况可以在该公司或者出售代理店的网址上查到。

[0027]另外，关于树突状细胞的标记，也要参考以下的Kiertscher等以及Oehler等的文献(Kiertscher SM，Roth MD，Human CD14+leukocytesacquire the phenotype and function of antigen-presenting dendritic cells whencultured in GM-CSF and IL-4，J.Leukoc.Biol.，1996，59(2)：208-18；Oehler，L.et al.，Neutrophil granulocyte-committed cells can be driven to acquire dendriticcell characteristics.，J.Exp.Med.，1998，187(7)：1019-28)。另外，关于流式细胞分析术，也可以参考Okano等以及Stites等的文献(Okano，S.et al.，Recombinant Sendai virus vectors for activated T lymphocytes.，Gene Ther.，2003，10(16)：1381-91；Stites，D.et al.，Flow cytometric analysis of lymphocytephenotypes in AIDS using monoclonal antibodies and simultaneous dualimmunofluorescence.，Clin.Immunol.Immunopathol.，1986，38：161-177)。关于各标记的表达，例如，使用同型对照抗体(isotype control antibody)染色时，以阳性率为1％以下的荧光强度作为界限，在此之上的为阳性，在此之下的为阴性。

[0028]树突状细胞或者其前驱细胞的调制可以根据或者按照众所周知的方法进行。例如，可以从血液(例如末梢血或者脐带血)、骨髓、淋巴结、其他淋巴器官、脾、皮肤等处分离。为了在本发明中使用树突状细胞，优选从血液或者骨髓中获得。另外，在本发明中使用的树突状细胞可以是皮肤的朗格罕斯细胞、输入淋巴管的隐蔽细胞(Veiled Cell)、滤泡树突状细胞、脾脏的树突状细胞、以及淋巴器官的指状突起细胞等。另外，在本发明中使用的树突状细胞包含由来自CD34⁺树状突细胞、来自骨髓的树突状细胞、来自单核细胞的树突状细胞、来自脾细胞的树突状细胞、来自皮肤的树突状细胞、滤泡树突状细胞、以及胚中心树突状细胞等组成的群中选择出来的树突状细胞。CD34⁺的树突状细胞，将从脐带血或者骨髓等得到的造血干细胞或者造血祖细胞等，通过颗粒球集落刺激因子(G-CSF)、颗粒球吞噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)-alpha、IL-4、IL-13、干细胞因子(SCF)、Flt-3配体、c-kit配体、或者它们的组合等来使其分化而获得。例如，将末梢血的单核细胞通过GM-CSF以及IL-4使其分化成未成熟树突状细胞，然后进一步地通过TNF-alpha进行刺激而使其分化成成熟的树突状细胞。

[0029]从包含树突状细胞以及它以外的细胞的组成物中选择树突状细胞时(或者浓缩)、最好是实施除掉树突状细胞以外的细胞的所谓阴性选择。通过使用阴性选择，DC-中性粒细胞的前驱细胞(J.Exp.Med.，1998，187：1019-1028；Blood，1996，87：4520-4530)不会被除去而被保留下来，并且不仅可以从具有粘附性的CD14细胞分化DC，而且还认为可以从该等前驱细胞分化DC。以此可望减轻细胞伤害性。

[0030]例如，在T细胞、NK细胞、B细胞等中使用特异性抗体，通过除去这些细胞，使浓缩树突状细胞成为可能。具体地，例如，优选CD2、CD3、CD8、CD19、CD56、CD66b中的表面标记或者它们的任意组合的表达是低的或者阴性的细胞。更优选，CD2、CD3、CD8、CD19、CD56、以及CD66b全部是低的或者阴性的细胞。因此，可以使用这些标记的抗体，来除去表达这些标记的细胞(Hsu等(1996)Nature Med.2：52)。再者，阴性选择可以使用本实施例中的多价抗体，或者免疫磁珠细胞分选法(MACS)中使用的磁珠等，也可以用于该选择。利用血球分离等方法采集单核细胞等需要大量调制细胞时，最好使用磁珠。例如，从活体细胞溶液中使单核细胞被浓缩后，以进行阴性选择来调制的树突状细胞是本发明优选使用的。

[0031]另外，在导入RNA病毒之前，如果选择使用通过粘附细胞获得的末梢血单核细胞分化成的树突状细胞，有时病毒的导入效率会下降。在本发明中使用的树突状细胞并不局限于此，在不使未成熟树突状细胞的比率下降的前提下，使RNA病毒与之接触之前的细胞培养最好是不包含如下步骤，即选择使用有固体支撑体(例如培养皿或者培养瓶等培养容器)的粘附细胞的步骤。也就是说本发明提供了，在RNA病毒和树突状细胞接触之前的24小时之内，不包含选择使用与固体支撑体粘附的细胞的步骤的方法。更优选是在RNA病毒和树突状细胞接触之前的2天、3天、5天、或者7天之内，不包含选择使用与固体支撑体粘附的细胞的步骤。

[0032]另外，在使RNA病毒接触之前，优选是不包含选择CD14⁺细胞的步骤，但并不局限于此。也就是说本发明提供了在RNA病毒和树突状细胞接触之前的24小时之内，不包含选择CD14⁺细胞的步骤的方法。更优选是在RNA病毒和树突状细胞接触之前的2天、3天、5天、或者7天之内，不包含选择CD14⁺细胞的步骤。

[0033]树突状细胞的具体分离方法是，例如在Cameron et al.，1992，Science 257：383、Langhoff et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7998、Chehimi et al.，1993，J.Gen.Viol.74：1277、Cameron et al.，1992，Clin.Exp.Immunol.88：226、Thomas et al.，1993，J.Immunol.150：821、Karhumaki et al.，1993，Clin.Exp.Immunol.91：482等中被记载。另外，关于由流式细胞分离术来进行树突状细胞的分离，例如，在Thomas et al.，1994，J.Immunol.153：4016、Ferbas et al.，1994，J.Immunol.152：4649、以及O′Dohelrty et al.，1994，Immunology 82：487等中被记载。另外，关于免疫磁珠细胞分选法，例如在Miltenyi et al.，1990，Cytometry 11：231-238等中被记述。

[0034]另外，例如关于人树突状细胞的分离以及增殖，可以利用Macatonia et al.，1991，Immunol.74：399-406、O′Doherty et al.，1993，J.Exp.Med.178：1067-1078、Markowicz et al.，1990，J.Clin.Invest.85：955-961、Romani et al.，1994，J.Exp.Med.180：83-93、Sallusto et al.，1994，J.Exp.Med.179：1109-1118、Berhard et al.，1995，J.Exp.Med.55：1099-1104等中记载的方法。另外，关于从骨髓，脐带血或者末梢血等中得到的CD34⁺细胞以及从来自末梢血的单核细胞的树突状细胞的形成，可以利用Van Tendeloo etal.，1998，Gene Ther.5：700-707记载的方法来实施。

[0035]在本发明中，优选在包含高浓度的树突状细胞或者其前驱细胞(例如CD11c⁺细胞或者CD34⁺细胞)的细胞画分中混合RNA病毒。所谓前驱细胞是指在适当的细胞因子(也就是说G-CSF、GM-CSF、TNF-alpha、IL-4、IL-13、SCF、Flt-3配体、c-kit配体、或者它们的组合)存在下，可以分化为树突状细胞的细胞，优选在4周以内，更优选是20天以内，更优选是18天以内，更优选是16天以内可以分化成树突状细胞的细胞。在这样的细胞中，CD34⁺干细胞可被列举出来。向树突状细胞的分化，例如在SCF(50ng/ml)、GM-CSF(500 U/ml)、TNF-alpha(50ng/ml)存在的条件下培养3天后，在SCF(50 ng/ml)、GM-CSF(500 U/ml)、IL-4(250 U/ml)、TNF-alpha(50ng/ml)存在的条件下继续培养来实施。另外所谓细胞画分是指通过细胞的分离(或者划分)得到的细胞集团。细胞画分可以是含有细胞以及药学上可容许的承运体的组成物。作为承运体，生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、培养基、血清等，可以悬浮活细胞的所望的溶液可被列举出来。在本发明的方法中，用于接触RNA病毒的细胞画分，在所有活细胞中树突状细胞和/或其前驱细胞的比例例如为30％或以上，优选是40％或以上，更优选是50％或以上，更优选是60％或以上，更优选是70％或以上。

[0036]另外，在接触RNA病毒的树突状细胞中，优选包含有未成熟的树突状细胞。在混合了RNA病毒的树突状细胞的细胞画分中，在所有活细胞中的未成熟树突状细胞的比例例如为10％或以上，优选是20％或以上，更优选是30％或以上，更优选是40％或以上，更优选是50％或以上，更优选是60％或以上，更优选是70％或以上。

[0037]组合了RNA病毒和树突状细胞的抗癌剂具有优良的性质。例如，如果使用RNA病毒，只通过病毒的感染就可以获得活化的树突状细胞，因此可以省略其后的为获得成熟树突状细胞而实施的步骤。为了将树突状细胞用于免疫激活，有必要对其进行活化，所以仅通过病毒的感染就能活化是一个很好的优点。另外，利用该优良性质，在体外可以在很短的时间内高效率地诱导利用T细胞导入疗法时所必须的活化T细胞，特别是细胞伤害性T细胞等。没有导入病毒的树突状细胞不能诱导CTL，并且从有关其他病毒载体的至今为止报告的性质中，仅通过其他病毒载体的基因导入，在体外进行CTL诱导是很困难的。因此，RNA病毒具有仅通过病毒的导入就能够使T细胞活化(CTL诱导)的优点(参照图21～23)。

[0038]在本发明的抗癌剂的制备中，可以将RNA病毒向干细胞中进行基因导入之后，再使其分化成树突状细胞。例如，将仙台病毒向干细胞中进行基因导入之后，诱导其向树突状细胞分化时，基因导入效率可达到近70％。这可与逆转录病毒以及慢病毒载体的修饰型可相匹敌。腺病毒载体由于在导入后游离子(episome)被稀释，其表达能力下降，因此向干细胞导入基因是很困难的。导入了基因组复制型RNA病毒的树突状细胞的调制，可以通过向干细胞导入后使其进行树突状细胞分化的方法，以及通过向由末梢血单核细胞分化的树突状细胞中导入基因的方法，可任选一种方法进行。

[0039]另外，在使RNA病毒感染时，使用较高的MOI(例如10或以上、优选为20或以上、更优选为30或以上、例如40或以上、甚至为50或以上)对细胞伤害性没有明显的影响，并且可望稳定的约以100％的导入效率向细胞进行导入。进一步地，如果利用不整合入宿主染色体的基因组RNA病毒，将具有以下优点，即因宿主染色体发生变化而导致肿瘤出现等的危险性很低。从这点来说，逆转录病毒之外的RNA病毒是优选被利用的。

[0040]本发明的RNA病毒，可以不是重组病毒，即使是天然的病毒也可以使用。关于各RNA病毒的纯化方法、增殖方法、单离株的获得方法，可以参照病毒学実験学各論，改訂第二版(国立预防卫生研究所学友会编、丸善、1982)。例如，副粘病毒科(Paramyxoviridae)的仙台病毒等副流感病毒的各型都可以在猴肾脏(MK2)、人胎儿肺部、肾脏、羊膜的初代培养细胞、以及胰蛋白酶添加Vero细胞中很好的被增殖(同上，p334；Itoh H etal.，Jap.J.Med.Sci.Biol.23，227(1970))和回收。至于纯化，可以用庶糖密度勾配离心法、平衡离心法等进行(p336)。麻疹病毒可以在猴由来的各种细胞中很好的增殖(Matsumoto M，Bact.Rev.30，152(1966))，而Vero细胞是最经常使用的，但使用Cv1、FL、KB、HeLa、HEp2等增殖也是可能的(p351)。狂犬病病毒等的棒状病毒科(Rhabdoviridae)，利用组织培养法时，可以使用BHK、CE以及Vero细胞等。至于纯化，可以将感染了3到4天的培养基较正到pH7.4或以上，利用低速离心法除去细胞碎片进行浓缩(p376)。拉撒病毒等的沙粒病毒科(Arenaviridae)，在体外可继代培养的几乎所有的培养细胞中可得到很好的增殖，但是在感染HK-21/13S细胞后，仅在琼脂中以悬浮方式进行培养才可以得到增殖(Sedwik W.D.，J.Virol.1，1224(1967))(p240)。风疹病毒等的外衣病毒，在初代非洲绿猴的肾脏细胞(GMK)、Vero、BHK21、RK13、初代鹌鹑或鸡胚细胞、R66、以及SIRC细胞等较广范围的各种培养细胞中可增殖。相对来说，为了得到较高的回收量经常使用BHK21或者Vero细胞(p227)。流感病毒等的正粘病毒科(Orthomyxoviridae)可以在发育鸡卵、以及MDCK细胞中增殖(p295)。纯化，可以通过离心分离法、对红血球的吸附·游离等方法(Laver W.G.，Fundamental Techniques in Virology，82(1969))等进行纯化(p317)。

[0041]RNA病毒，可以是从天然分离出来的病毒，也可以是通过基因重组人为制备的病毒。另外，在感染细胞中，只要保持有复制基因组RNA的能力，可以使野生型病毒含有的任意病毒基因发生变异和/或缺损。例如，优选利用使编码病毒包被蛋白质或者外壳蛋白质的至少一个基因具有变异或者缺损的病毒。这种病毒在感染细胞时可以复制RNA基因组，但不能形成感染性病毒粒子。因此，没有向周围扩大感染的担心，所以安全性很高。例如，在单链负链RNA病毒中，可以使用使编码F、H、HN、或者G等包被蛋白质或者刺状蛋白质的至少一个或者它们的组合的基因不被包含的病毒(WO00/70055以及WO00/70070；Li，H.-O.et al.，J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。使基因组复制时必需的蛋白质(例如N、P、以及L蛋白质)被基因组RNA编码时，可以在感染细胞中进行基因组的扩增。也就是说，使至少编码N、L、以及P蛋白质的基因组RNA和包含这些蛋白质的RNP、以及包含该RNP的病毒粒子，在本发明的抗肿瘤剂的制备中优选作为导入树突状细胞的物质。制备缺损型病毒，例如，可以在病毒产生细胞中外来地供给缺损的基因产物或者可以补充它的蛋白质(WO00/70055以及WO00/70070；Li，H.-O.et al.，J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。但是，例如单链负链RNA病毒中，如果是携带M蛋白质基因的病毒，即使不携带编码F蛋白质以及HN蛋白质等刺状蛋白质的基因，也可以释放出不具有感染性的病毒粒子(VLP)，所以不补充该病毒蛋白质也可以制备VLP(WO00/70070)。另外，即使不携带任何包被蛋白质基因，由N、L、P蛋白质、以及基因组RNA组成的RNP在细胞内部也可以扩增，所以可以通过离心分离细胞裂解物来回收RNP。得到的VLP以及RNP，与所望的转导试剂混合后，通过导入进树突状细胞以制备抗肿瘤药剂。

[0042]另外，利用变异型RNA病毒也可以制备本发明的抗肿瘤药剂。例如，包被蛋白质以及外壳蛋白质中已知有许多温度敏感性变异。在本发明中优选使用具有这些温度敏感受变异蛋白质基因的RNA病毒。所谓温度敏感性变异是指与低温(例如30℃乃至32℃)相比，在病毒宿主通常的温度(例如37℃乃至38℃)下，其活性有明显降低的变异。这种具有温度敏感性变异的蛋白质在容许温度(低温)下可制备病毒的性质是很有用处的。

[0043]例如，作为单链负链RNA病毒的M基因的温度敏感性变异，对由仙台病毒的M蛋白质中的G69、T116以及A183组成的群的任意的选择部位的氨基酸置换可被列举出来(Inoue，M.et al.，J.Virol.2003，77：3238-3246)。其他单链负链RNA病毒M蛋白质相同部位上的氨基酸可以很容易被鉴定，具体地，例如作为相当于SeV M蛋白质的G69的M蛋白质的相同部位，如果是人副流感病毒I型(HPIV-1)(括弧内省略)为G69、人副流感病毒III型(HPIV-3)为G73、犬瘟热病毒(PDV)以及牛瘟热病毒(CDV)为G70、海豚麻疹病毒(DMV)为G71、小反刍动物瘟疫病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)、以及牛疫病毒(RPV)为G70、亨德拉病毒(Hendra)以及尼派病毒(Nipah)为G81、人副流感病毒II型(HPIV-2)为G70、人副流感病毒IVa型(HPIV-4a)以及人副流感病毒IVb型(HPIV-4b)为E47、流行性腮腺炎病毒(Mumps)为E72可被列举出来(文字和序号表示的是氨基酸及其位置)。另外、对相当于SeV M蛋白質的T116的各M蛋白質的相同部位，如果是人副流感病毒I型(HPIV-1)的话为T116、人副流感病毒III型(HPIV-3)为T120、犬瘟热病毒(PDV)以及牛瘟热病毒(CDV)为T104、海豚麻疹病毒(DMV)为T105、小反刍动物瘟疫病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)以及牛疫病毒(RPV)为T104、亨德拉病毒(Hendra)以及尼派病毒(Nipah)为T120、人副流感病毒II型(HPIV-2)以及猴副流感病毒V型(SV5)为T117、人副流感病毒IVa型(HPIV-4a)以及人副流感病毒IVb型(HPIV-4b)为T121、流行性腮腺炎病毒(Mumps)为T119、新城疫病毒(NDV)为S120可被列举出来。对相当于SeV M蛋白质的A183的各M蛋白质的相同部位，如果是人副流感病毒I型(HPIV-1)为A183、人副流感病毒III型(HPIV-3)为F187、犬瘟热病毒(PDV)以及牛瘟热病毒(CDV)为Y171、海豚麻疹病毒(DMV)为Y172、小反刍动物瘟疫病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)以及牛疫病毒(RPV)为Y171、亨德拉病毒(Hendra)以及尼派病毒(Nipah)为Y187、人副流感病毒II型(HPIV-2)为Y184、猴副流感病毒V型(SV5)为F184、人副流感病毒IVa型(HPIV-4a)以及人副流感病毒IVb型(HPIV-4b)为F188、流行性腮腺炎病毒(Mumps)为F186、新城疫病毒(NDV)为187可被列举出来。在这里列举的病毒中，适用于本发明的病毒为上述各个M蛋白质上的上述三个部位的任意一个，优选是任意两个部位的组合，更优选是编码有三个部位的全部氨基酸被其他氨基酸置换后得到的变异M蛋白质的基因组的病毒。氨基酸变异优选被置换成与其侧链化学性质具有不同性质的其他氨基酸，例如，置换成BLOSUM62(Henikoff，S.and Henikoff，J.G.(1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919)的基值在3或以下，优选是2或以下、更优选是1或以下、更优选是0或以下的氨基酸。具体地，仙台病毒M蛋白质的G69，T116以及A183或者其他病毒M蛋白质的相同部位，可以分别被置换成Glu(E)，Ala(A)以及Ser(S)。另外，也可以利用与麻疹病毒温度敏感性株P253-505(MORIKAWA，Y.ETAL.，KITASATOARCH，EXP，MED.1991：64；15-30)的M蛋白质的变异相同的变异。变异的导入，例如可以利用寡核苷酸等，根据众所周知的变异导入方法实施。

[0044]另外，作为HN基因的温度敏感性变异，例如由仙台病毒的HN蛋白质的A262，G264以及K461组成的群的任意的选择部位上的氨基酸置换可被列举出来(Inoue，M.et a1.，J.Virol.2003，77：3238-3246)。优选的例子为，仙台病毒HN蛋白质的A262，G264以及K461或者其他病毒HN蛋白质的相同部位被分别置换成Thr(T)，Arg(R)，以及Gly(G)。另外，例如，以流行性腮腺炎病毒的温度敏感性疫苗株URABE AM9为参考，在HN蛋白质的第464位以及第468位的氨基酸中导入变异(WRIGHT，K.E.ET AL.，VIRUS RES。2000：67；49-57)。

[0045]另外单链负链RNA病毒也可以在P基因或者L基因中有变异。作为这种变异，具体地，SeV P蛋白质的第86位的Glu(E86)变异，SeVP蛋白质的第511位的Leu(L511)向其他氨基酸的置换，或者向其他单链负链RNA病毒P蛋白质的相同部位的置换可被列举出来。具体地，第86位氨基酸被Lys置换，第511位氨基酸被Phe置换可作为示例列举出来。另外，L蛋白质中，SeV L蛋白质的第1197位Asn(N1197)和/或第1795位的Lys(K1795)被其他氨基酸置换，或者被其他单链负链RNA病毒L蛋白质的相同部位置换可被列举出来。具体地，第1197位的氨基酸被Ser置换，第1795为氨基酸被Glu置换可作为示例被列举出来。P基因以及L基因的变异可以显著提高持续感染性，和对二次粒子放出的抑制以及对细胞伤害性的抑制效果。进一步地，通过组合包被蛋白质基因的变异和/或缺损，可以显著提高该等效果。

[0046]另外，利用包被病毒时，可以使用在包被中含有与本来携带包被蛋白质不同的蛋白质的病毒来感染树突状细胞。例如，在制备病毒时，通过在病毒产生细胞中表达所望的外源性包被蛋白质，可以制备含有该外源性包被蛋白质的病毒。对于这种蛋白质没有特殊的限制，具有哺乳动物细胞感染能力的所望的蛋白质都可被利用。具体地，可以列举出水疱性口内炎病毒(Vesicular stomatitis virus；VSV)的G蛋白质(VSV-G)。VSV-G蛋白质可以来源于任意的VSV株，例如可以利用来源于INDIANA血清型株(J.VIROLOGY39：519-528(1981))的VSV-G蛋白，但是并不局限于此。在本发明中使用的单链负链RNA病毒可以含有来源于其他病毒包被蛋白质的任意组合。

[0047]单链负链RNA病毒，在其基因组RNA中可以编码外源蛋白质，也可以不编码。通过导入树突状细胞，即使是不编码外源蛋白质的单链负链RNA病毒也可发挥抗癌作用，因此外源基因不是必需的。因此，本发明有着如下优点，她可以利用野生型单链负链RNA病毒或者从天然分离出来的病毒(包含变异株)等所望的单链负链RNA病毒。例如，本发明中使用的RNA病毒，可以使用不编码具有癌症治疗效果的蛋白质的RNA病毒。作为这种病毒，可包含编码没有癌症治疗效果的所望的外源蛋白质的RNA病毒，例如为了检测RNA病毒的导入，可以利用编码绿色荧光蛋白质(GFP)，荧虫素酶，各种肽标记等标记蛋白质的RNA病毒等。或者，在单链负链RNA病毒中进一步搭载有助于抗癌作用的外源基因以提高该作用。

[0048]携带有外源基因的重组单链负链RNA病毒的再构筑可以利用众所周知的方法进行。具体的典型的制备方法如下，(A)在表达病毒粒子形成时必需的病毒蛋白质的细胞中，使编码单链负链RNA病毒基因组RNA的cDNA进行转录的步骤，(B)回收含有生成的病毒的培养上清的步骤。病毒蛋白质可以由转录了的病毒基因组RNA表达，也可以以基因组RNA以外的反式方式被供给。在基因组RNA中，如果缺损有粒子形成时所必需的病毒基因时，可以在病毒产生细胞中另外表达该病毒基因，来补充粒子的形成。为了在细胞内表达病毒蛋白质或者RNA基因组，使编码该蛋白质及基因组RNA的DNA与在宿主细胞中可发挥适当功能的启动子的下流连结，并以载体的形式导入到宿主细胞中。被转录了的基因组RNA在病毒蛋白质存在下被复制，形成感染性病毒粒子。制备缺损有包被蛋白质等基因的缺损型病毒时，在病毒产生细胞中表达缺损的蛋白质或者可以补充其机能的其他病毒蛋白质等。

[0049]例如，单链负链RNA病毒的制备可以利用以下众所周知的方法进行。(WO97/16539；WO97/16538；WO00/70055；WO00/70070；WO01/18223；Hasan，M.K.et al.，J.Gen.Virol.78：2813-2820，1997、Kato，A.et al.，1997，EMBO J.16：578-587以及Yu，D.et al.，1997，Genes Cells 2：457-466；Durbin，A.P.et al.，1997，Virology 235：323-332；Whelan，S.P.et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：8388-8392；Schnell.M.J.et al.，1994，EMBO J.13：4195-4203；Radecke，F.et al.，1995，EMBO J.14：5773-5784；Lawson，N.D.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：4477-4481；Garcin，D.et al.，1995，EMBO J.14：6087-6094；Kato，A.et al.，1996，Genes Cells 1：569-579；Baron，M.D.and Barrett，T.，1997，J.Virol.71：1265-1271；B ridgen，A.andElliott，R.M.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：15400-15404)。通过上述方法，可以使包括副流感病毒、水疱性口炎病毒、狂犬病病毒、麻疹病毒、牛疫病毒(rinderpest virus)、仙台病毒等在内的单链负链RNA病毒从DNA再构筑。在本发明中，负链RNA病毒，特别是单链负链RNA病毒，优选是副粘病毒科病毒、更优选使用呼吸道合胞病毒属的病毒。

[0050]被导入了具有基因组复制能力的负链RNA病毒的树突状细胞的制备方法，具体地，在表达了基因组复制时所必需的病毒蛋白质(N、P、以及L)的细胞中，使病毒基因组RNA(负链)或者其互补链(正链)被导入或者转录。N、P、以及L蛋白质，例如，可以在细胞中导入表达这些蛋白质的表达质粒来供给。作为病毒基因组RNA，使用编码有基因组复制时所必需的病毒蛋白质(N、P、以及L)的基因组RNA。如果使该过程在树突状细胞中进行，可以在树突状细胞中形成包含有基因组RNA以及N、P、以及L的RNP，并且使该RNP在树突状细胞中自主进行复制。在本发明中，可如上所述通过在树突状细胞中直接使病毒RNP生成，以获取被导入了负链RNA病毒的树突状细胞。在利用树突状细胞以外的细胞时，回收生成的RNP、感染性或者非感染性病毒粒子。M蛋白质存在时，通过它的作用可以从细胞中释放出病毒粒子(或者VLP)。进一步地，如果刺状蛋白质(例如F·HN (或者H)蛋白质、或者G蛋白质等)存在时，形成的粒子含有这些刺状蛋白质，成为感染性病毒粒子。刺状蛋白质不存在时，在M蛋白质存在的条件下，可释放出非感染性病毒粒子(VLP)。被回收的RNP或者VLP，例如，可以与转染试剂一起被导入到树突状细胞中。感染性病毒粒子，可以保持原状添加到树突状细胞中并使之感染。如此，制备被导入了负链RNA病毒的树突状细胞已经成为可能。

[0051]对于正(+)链RNA病毒的制备方法，以下的例子可被列举出来。

1)冠状病毒

Enjuanes L，Sola I，Alonso S，Escors D，Zuniga S.

Coronavirus reverse genetics and development of vectors for geneexpression.

Curr Top Microbiol Immunol.2005；287：161-97.Review.

2)外衣病毒

Yamanaka R，Zullo SA，Ramsey J，Onodera M，Tanaka R，Blaese M，Xanthopoulos KG.

Induction of therapeutic antitumor antiangiogenesis by intratumoralinjection of genetically engineered endostatin-producing Semliki Forest virus.

Cancer Gene Ther.2001 Oct；8(10)：796-802.

Datwyler DA，Eppenberger HM，Koller D，Bailey JE，Magyar JP.

Efficient gene delivery into adult cardiomyocytes by recombinant Sindbisvirus.

J Mol Med.1999 Dec；77(12)：859-64.

3)细小核糖核酸病毒

Lee SG，Kim DY，Hyun BH，Bae YS.

Novel design architecture for genetic stability of recombinant poliovirus：the manipulation of G/C contents and their distribution patterns increases thegenetic stability of inserts in a poliovirus-based RPS-Vax vector system.

J Virol.2002 Feb；76(4)：1649-62.

Mueller S，Wimmer E.

Expression of foreign proteins by poliovirus polyProtein fusion：analysis ofgenetic stability reveals rapid deletions andformation of cardioviruslike openreading frames.

J Virol.1998 Jan；72(1)：20-31.

4)黄热病病毒

Yun SI，Kim SY，Rice CM，Lee YM.

Development and application of a reverse genetics system for Japaneseencephalitis virus.

J Virol.2003 Jun；77(11)：6450-65.

Arroyo J，Guirakhoo F，Fenner S，Zhang ZX，Monath TP，Chambers TJ.

Molecular basis for attenuation of neurovirulenee of a yellow feverVirus/Japanese encephalitis virus chimera vaccine(ChimeriVax-JE).

J Virol.2001 Jan；75(2)：934-42.

5)呼肠孤病毒

Roner MR，Joklik WK.

Reovirus reverse genetics：Incorporation of the CAT gene into the reovirusgenome.

Proe Natl Acad Sci U S A.2001 Jul 3；98(14)：8036-41.Epub 2001 Jun 26.

关于其他的RNA病毒的增殖方法以及重组病毒的制备方法参照病毒学实验学各论、改订第二版(参照国立预防卫生研究所学友会编、丸善、1982)。

[0052]对在RNA病毒中搭载的外源基因，虽然没有特殊的限制，但对于天然的蛋白质，例如荷尔蒙、细胞因子、生长因子、受体，细胞内信号分子、酶、抗体(包含全长抗体、Fab等抗体片断、单链抗体等在内)、肽等可被列举出来。蛋白质，可以是分泌蛋白质、膜蛋白质、细胞质蛋白质、核蛋白质等。对于人工的蛋白质，例如，嵌和型毒素等融合蛋白质、负显性蛋白质(包含受体的可溶性分子或者膜结合型负显性受体)、缺损型细胞粘附分子以及细胞表面分子等可被列举出来。另外，也可以是付加了分泌信号、膜定位信号、或者核转移信号等的蛋白质。作为导入基因，通过表达反义链RNA分子或者RNA切割型核酶等，可以抑制特定基因的机能。作为外源基因，如果利用显示有制癌作用的治疗用基因来调制病毒，可以更能提高其制癌作用。

[0053]例如，如果在树突状细胞中使阻碍血管形成或者血管新生的基因表达，可以更加提高其抗癌效果。关于促进血管形成或者血管新生的基因，例如已知有纤维芽细胞生长因子2(FGF2)(Baffour，R.et al.，J.Vasc.Surg.16(2)：181-91，1992)、内皮细胞生长因子(endothelial cell growth factor；ECGF)(Pu，L.Q.et al.，J.Surg.Res.54(6)：575-83，1993)、血管内皮生长因子/血管渗透性因子(vascular endothelial growth factor；VEGF/vascularpermeability factor；VPF)(Takeshita，S.et al.，Circulation 90(5 Pt 2)：II228-34，1994；Takeshita，S.et al.，J.Clin.Invest.93(2)：662-70，1994)、肝细胞生长因子/散射(scatter)因子(hepatocyte growth factor/scatter factor)(HGF/SF)等。可以使编码阻碍这些信号分子作用的分泌蛋白质的基因在树突状细胞中表达。具体地，包含与这些信号分子或者与其受体结合的抗体或者包含有其抗原结合片断的多肽、该受体的可溶型蛋白质(含有配体结合部、但不包含膜贯穿领域的分泌型受体)等可被列举出来。特别是将编码FGF受体(FGF-R)的可溶型多肽的RNA病毒导入树突状细胞，可以显著提高对癌症增殖的抑制効果。因此，编码可溶性FGF-R的RNA病毒，在本发明中是优选使用的。作为可溶性FGF-R，它可以利用天然的可溶型FGF-R，也可以利用由膜结合型FGF-R(FGF-R1等)的细胞外结构域组成的片断(A.Hanneken and A.Baird，Investigative Ophthalmology&Visual Science，Vol 36，1192-1196，1995；Takaishi，S.et al.，Biochem Biophys Res Commun.，267(2)：658-62，2000；SenoM，et al.，Cytokine，10(4)：290-4，1998；Hanneken，A.，FEBS Lett.489：176，2001)。

[0054]另外，可以将靶癌症表达的癌抗原多肽向树突状细胞进行抗原递呈。向树突状细胞递呈的抗原，可以在RNA病毒中编码，或者添加到导入了RNA病毒的树突状细胞(也就是电脉冲)，或者可以使用其他所望的载体来表达。肿瘤抗原最好是肿瘤细胞所特有的(也就是说，存在于肿瘤细胞中，但不存在于非肿瘤细胞中)，与相同类型的非肿瘤细胞相比，在肿瘤细胞中以高水平存在的物质。另外，可以是全长的癌抗原蛋白质，也可以是其部分肽。通过鉴定在树突状细胞中被递呈的抗原肽，来合成该多肽并使用。抗原肽与树突状细胞表面的MHC分子结合，然后被递呈到细胞表面以诱导免疫应答。

[0055]以CTL为主要免疫效应起作用时，作为抗原可以使用在细胞内外表达的所望的肿瘤抗原。利用树突状细胞，通过继CD4 T细胞活化后使B细胞活化，来刺激抗体的产生；在使用抗体为主要免疫效应起作用时，作为抗原优选在细胞表面露出的物质，例如可以利用细胞表面受体或者细胞粘附蛋白质。作为肿瘤抗原，例如卵巢癌等的Muc-1或者Muc-1样Mucintendem repeat peptide(浆液性串联重复肽)(美国专利第5，744，144号)、引发子宫颈癌的人乳头瘤病毒蛋白质E6以及E7、黑色素瘤抗原MART-1、MAGE-1、-2、-3、gp100以及酪氨酸酶(Tyrosinase)、前列腺癌抗原PSA、其他还有CEA(Kim，C.et al.，Cancer Immunol.Immunother.47(1998)90-96)、以及Her2neu(HER2p63-71、p780-788；Eur.J.Immunol.2000；30：3338-3346)等可被列举出来。

[0056]另外，树突状细胞如果表达细胞因子类蛋白质，可以刺激免疫系统，从而提高对癌症的免疫应答，因此导入编码有细胞因子基因的树突状细胞是十分有用的。导入了搭载有编码免疫刺激性细胞因子基因的RNA病毒的树突状细胞，是有效地肿瘤免疫诱导药剂。例如，作为免疫刺激性细胞因子，包括白细胞介素(例如IL-lalpha、IL-lbeta、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-23、IL-27)、干扰素(例如，IFN-alpha、IFN-beta、IFN-gamma)、肿瘤坏死因子(TNF)、转换型生长因子(TGF)-beta、颗粒球集落刺激因子(G-CSF)、吞噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、颗粒球吞噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、胰岛素样生长因子(IGF)-I、IGF-2、Flt-3配体、Fas配体、以及c-kit配体、同时还包含其他免疫调节型蛋白质(趋化因子以及协同刺激分子等)。

[0057]这些细胞因子的氨基酸序列为本专业工作人员所周知的，关于IL-4，例如，包含Arai等(1989)、J.Immunol.142(1)274-282、关于IL-6，例如，包含Yasukawa等(1987)、EMBO J.、6(10)：2939-2945、关于IL-12，例如，包含Wolf等(1991)、J.Immunol.146(9)：3074-3081、关于IFN-alpha，例如包含Gren等(1984)J.Interferon Res.4(4)：609-617、以及Weismann等(1982)Princess Takamatsu Symp.12：1-22、关于IFN-beta，例如包含Accessionnumber NM_002176的第139～636位的序列(氨基酸序列为NP_002167的第22～187位)可被列举出来(Derynck，R.et al.，Nature 285，542-547(1980)；Higashi，Y.et al.，J.Biol.Chem.258，9522-9529(1983)；Kuga，T.et al.，NucleicAcids Res.17，3291(1989))。另外，关于TNF，例如Pennica等(1984)Nature312：724-729、关于G-CSF，例如Hirano等(1986)Nature 324：73-76、关于GM-CSF，例如，Cantrell等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82(18)：6250-6254可被参照。更具体地，编码GM-CSF的核苷酸序列，包含Accession number NM_000758的第84～461位的序列(氨基酸序列为NP_000749的第18～144位)可被列举出来。对于编码IL-4的核苷酸序列，包含Accession number NM_000589的第443～829位的序列(氨基酸序列为NP_000580的第25～153位)可被列举出来。信号肽序列，可以置换成适当的其他蛋白质的信号肽的序列。利用编码这些细胞因子的天然基因或者基因暗号的缩重，可以构筑编码功能性细胞因子的变异基因，并导入树突状细胞内。

[0058]另外，为了表达这些细胞因子的修饰体可以对基因进行修饰。例如，关于具有前驱体以及成熟体两种形态的细胞因子(例如，通过切除信号肽来生成活性片断，或者通过蛋白质的限定分解来生成活性片断等)，为了表达前驱体或者成熟体的任意一种形态而对基因进行修饰。也可以利用其他修饰体(例如，细胞因子的活性片断和异种序列(例如，异种信号肽)的融合蛋白质)。

[0059]被导入了RNA病毒的树突状细胞，根据需要可以与药理学上可容许的所望的承运体或者载体(例如生理盐水、林格氏液、培养基、血清等)组合。另外，可以根据需要通过离心法等进行浓缩后，在培养基或者生理盐水等生理性溶液中再悬浮。根据本发明调制的树突状细胞，在对抗癌症的有效免疫疗法上是很有用处的，在导入了编码有肿瘤抗原基因的树突状细胞或者通过该树突状细胞的刺激而由T细胞引起的免疫致敏反应，对于患者是诱导抗肿瘤作用的有效方法。本发明涉及通过本发明的方法获得的树突状细胞在抗癌治疗中的使用。另外本发明还涉及到通过本发明的方法获得的树突状细胞，在抗癌剂(或者制癌药剂、癌增殖抑制药剂等)制备上的使用等。另外本发明还涉及到RNA病毒以及树突状细胞在抗癌药剂(或者制癌药剂、癌增殖抑制药剂等)制备上的使用。

[0060]得到的树突状细胞作为DC疫苗是很有用的。为了提高免疫原性，可以在导入了RNA病毒的树突状细胞中添加细胞因子、霍乱毒素、沙门氏菌毒素等一些免疫促进剂。另外还可以组合明矾、不完全弗氏佐剂(Freund′s ajuvant)、MF59(油包乳状液，Oil Emulsion)、MTP-PE(来自分枝杆菌(Mycobacterium)细胞壁的胞壁酰三肽(muramyl tripeptide))、以及QS-21(来自皂皮树(soapbark tree)的 Quilaja saponaria)等的佐剂。

[0061]另外，本发明还涉及了包含RNA病毒以及树突状病毒的包装，并包含有在癌的抑制中使用该树突状细胞的记载的包装。RNA病毒以及树突状细胞可以分别包装在各自不同的容器中，也可以是在同一容器中。另外，本发明是涉及包含有导入了RNA病毒的树突状细胞的包装，还涉及包含在癌症抑制中使用该树突状细胞的记载的包装。RNA病毒以及树突状细胞，可以在培养基或者生理盐水等溶液中悬浮。所谓在癌抑制上的使用，例如导入了RNA病毒的树突状细胞，或者包含它的组成物，作为肿瘤增殖抑制、癌的缩小、癌治疗、癌患者的处置·治疗、癌患者寿命的延长，或者抗癌药剂来使用。包含有有该记载的纸，贴纸上可以被包含在该包装内。包装可以是包含RNA病毒和/或树突状细胞的容器，此时，容器例如可以是(玻璃)瓶、软管、塑料袋、样品瓶、注射筒等。另外本发明的包装也可以是包含有该容器的袋子或者包装盒。在包装中，可以包含记录有树突状细胞给药方法的说明书，也可以进一步包含树突状细胞给药用的注射筒、导管、和/或注射针等。

[0062]通过本发明制备的制癌药剂可以在体内接种，如果除去包含在其中的树突状细胞的细胞增殖性，其安全性就更高。例如，已知来自脐带血的单核细胞经过分化诱导，其增殖能力会极度下降，因此作为细胞疫苗就更加安全，可以用加热处理、放射线处理、或者丝裂酶素C(MitomycinC)处理等进行处理，作为疫苗的功能被原封不动的保留，但却可以使其丧失增殖性。例如，利用X射线照射时，可以用总放射线量1000～3300 Rad进行照射。关于丝裂酶素C处理法，例如在树突状细胞中添加25～50mg/ml的丝裂酶素C，在37℃中温育30～60分钟。通过加热进行的细胞处理方法，例如，可以在50～65℃，加热处理20分钟左右。

[0063]在给药树突状细胞时，与可提高佐剂效果的细胞因子类组合使用也是很有效的。作为这种基因，例如，i)IL-2和单链IL-12的组合(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(15)：8591-8596，1999)、ii)IL-2和干扰素-γ(美国专利第5,798,100号)、iii)单独使用的颗粒球集落刺激因子(GM-CSF)、iv)GM-CSF和IL-4的组合(J.Neurosurgery 90(6)，1115-1124(1999))等可被列举出来。

[0064]导入了RNA病毒的树突状细胞，对在体内刺激患者自身的T细胞是很有用的，或者该树突状细胞在体外对刺激T细胞也是很有用处的。将致敏的T细胞向患者进行给药，可以通过回外免疫疗法来刺激患者的肿瘤免疫。

[0065]本发明中涉及了包含通过树突状细胞刺激T细胞的抗癌药剂的制备方法，(a)将RNA病毒导入树突状细胞或者其前驱细胞中的步骤、(b)使该细胞分化成成熟树突状细胞的步骤、(c)使该成熟树突状细胞进行癌抗原递呈的步骤、(d)使该成熟树突状细胞与T细胞接触的步骤。导入RNA病毒的树突状细胞可使T细胞活化，并诱导CTL。在树突状细胞中递呈的抗原，可以是从RNA病毒中表达的癌抗原(或者其分解产物)，也可以从外部对树突状细胞进行电脉冲导入。得到的T细胞可以用于癌治疗。在体外使T细胞和树突状细胞接触时，优选先从患者身上摘取T细胞，使其与树突状细胞接触以后，再将T细胞回体给药。

[0066]另外，本发明还涉及利用通过本发明的方法制备出来的树突状细胞对癌症进行抑制的方法。例如，可以在癌患者身上进行刺激抗肿瘤免疫的治疗。这种方法包含了向树突状细胞给药的步骤。具体地，将包含有基因组复制能力的RNA病毒的RNP复合体的树突状细胞的治疗有效量向患者给药的步骤。通过本方法，与不给药本发明的树突状细胞时相比，可望取得抑制癌增殖的效果。RNA病毒可以是不携带外源基因的病毒，或者是携带编码癌抗原、免疫刺激性细胞因子、阻碍血管新生的蛋白质的一个或者多个基因的病毒。RNA病毒被导入树突状细胞后使树突状细胞活化，即使向癌给药导入了不携带外源基因的RNA病毒的树突状细胞，也可以使患者的对癌症的免疫系统被活化。在该树突状细胞中，通过对癌抗原肽进行电脉冲，使其递呈所望的抗原，可以获得具有更高的癌症抑制效果的树突状细胞。

[0067]本发明可适用于所望的固形癌、例如舌癌、牙龈癌、恶性淋巴肿瘤、恶性黑色素肿瘤(黑色素瘤)、上颚癌、鼻癌、鼻腔癌、喉头癌、咽喉癌、神经胶肿瘤、髓膜肿瘤、神经胶肿瘤、肺癌、乳癌、胰腺癌、消化道癌(食道癌、胃癌、十二指肠癌、大肠癌)、扁平上皮癌、腺癌、肺泡上皮癌、睾丸肿瘤、前列腺癌、甲状腺癌、肝癌、卵巢癌、横纹肌肿瘤、纤维肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤等可被列举出来。给药对象癌优选为上皮癌，更优选是皮肤扁平上皮癌、皮肤基底细胞癌、皮肤癌前皮炎、乳头乳晕炎癌变、皮肤恶性黑色素肿瘤等被包含在内的皮肤癌。

[0068]给药导入了RNA病毒的树突状细胞时，通常为10⁵～10⁹细胞、优选是10⁶～10⁸细胞、更优选是大约10⁷的细胞向患者的癌病巢内给药。所谓癌病巢是指癌组织或者其周围(例如距离癌5mm以内的位置、优选是3mm以内)的区域。再者给药量，根据癌的类型以及分期、导入基因的有无可适当地进行调节。在RNA病毒中即使没有搭载外源基因，也可预期具有抗肿瘤效果。如果使IFN-beta基因或者可溶性FGF受体基因等搭载在RNA病毒中，可以得到更高的效果。另外，在将树突状细胞向肿瘤给药之前，可以通过使树突状细胞接触肿瘤抗原来获得更高的效果。使树突状细胞与肿瘤抗原的接触，可以利用将树突状细胞与肿瘤细胞的细胞裂解物混合的方法，将肿瘤抗原多肽向树突状细胞内进行电脉冲导入的方法，或者在树突状细胞中导入肿瘤抗原基因并使其表达的方法等。另外，将IFN-beta、可溶性FGF受体、或者搭载有编码它们的基因的所望的载体，与本发明的树突状细胞一起直接注入到癌病巢内，以此来获得抗肿瘤的效果。也就是说，本发明可优选使用导入了RNA病毒的树突状细胞的给药和IFN-beta或者可溶性FGF受体的抗肿瘤处置的组合。

[0069]给药通过树突状细胞活化了的T细胞时，例如T细胞可以通过静脉注射来给药，以平均每1m²的体表面积大约10⁵～10⁹细胞、优选是10⁶～10⁹细胞、更优选是10⁸～10⁹细胞的用量(参照Ridell等、1992、Science257：238-241)。注射可以所望的间隔期间(例如，每月)反复进行。对于给药后的受体可以在必要时，对任意的副作用在T细胞注射期间或者注射之后进行监测。此时，T细胞优选是从与收集树突状细胞的患者是同一患者。或者，从患者身上采集T细胞，而用于刺激T细胞的树突状细胞可来自HLA适合的健康正常的供体。或者与之相反，从患者身上采集树突状细胞，而T细胞可以来自HLA适合的健康正常的供体。

[0070]树突状细胞或者T细胞的给药次数为一次或者在临床上可容许的副作用范围内重复给药，一天的给药次数也是同样的。至于给药对象，没有特殊的限制，例如，其中包含了包括鸟类以及哺乳动物(人以及非人哺乳动物)的动物，具体包括鸡、鹌鹑、小白鼠、大鼠、狗、猪、猫、牛、兔子、山羊、绵羊、猴子以及人类等。向人类以外的动物给药时，例如以靶动物和人的体重比来换算上述给药量后给药。

[实例]

[0071]以下以实施例为例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不局限于这些实施例。再者，本说明书中引用的文献的全部作为本发明的一部分被包括在内。

[0072]A.导入效率的探讨

(实验1)

首先，从健康人体中使用阴性选择对单核细胞进行浓缩(enrichment)。为浓缩单核细胞而进行的阴性选择，利用了RosetteSep^TM-human monocyteenrichment cocktail(Stem Cell Technology Inc.)。也就是说，利用tetramericantibody(是由2分子抗体结合形成的抗体，一个是识别红血球的抗血型糖蛋白A(glycophorin A)的抗体，另一个是识别单核细胞表面抗原的抗体)，使欲除去的细胞与红血球结合，通过Ficoll Paque^TM Plus(Pharmacia Biotech Inc.)去除。通过该阴性选择，可以除去表达CD2、CD3、CD8、CD19、CD56、CD66b的细胞，剩余的细胞作为单核浓缩细胞，接下来用于DC的分化诱导。此时的CD14⁺细胞为65-80％。在单核浓缩细胞中添加GM-CSF(500U/ml)和IL-4(250 U/ml)，在无内毒素(endotoxin free)RPMI+10％FCS中培养，制成DC。在第3到4天时，将一半的培养上清以同种成分的新的培养基进行培养基的交换。在确认协同刺激分子(Costimulatory molecule)，以及CD11c、HLA-class II(DR、DP、DQ)、以及CD1a有表达时为阳性，同时并确认其他的谱系标记(lineage marker)(CD3、CD56、CD19、CD15以及CD14)没有被表达(图1以及非提示数据)。利用该细胞，进行了病毒导入效率的探讨。此时，活细胞的90-98％表达了DC表面标记(CD11c、HLA-class II(DR、DP、DQ))。

再者，在本实施例中使用了上述试剂盒对细胞进行了选择，也可以使用其表面被抗体包被的磁珠，来实施同样的选择。利用血球分离等收集单核细胞等，需要大量地调制细胞时，优选使用磁珠。

[0073](实验2)

通过实验1得到的DC(分化诱导后第7天)中，用表达绿色荧光蛋白质(GFP)的仙台病毒(SeV-GFP)(传播型、WO00/70070)对感染时使用的MOI进行了研究，并经时地对细胞数量的变化、GFP的表达、协同刺激分子的表达程度等进行检验。其结果，关于MOI，MOI 20以上时的％GFP为最高(图2～5)。关于GFP的平均荧光強度(mean fluorescence intensity；MFI)，在将MOI提高到100时可以进一步使其上升(非提示数据)。另外，到第8天为止GFP的MFI有上升。关于协同刺激分子(CD80以及CD86)，整体上看MOI 20以上时为最高。关于细胞数的减少，MOI在1～20之间时没有变化，但是在MOI 50时有略微下降的趋势，但是没有明显的差异(图6)。

[0074](实验3)

以MOI 20向DC感染SeV-GFP，并经时地利用FACS来观察GFP的表达。结果发现，2周之后表达下降(细胞数也随之减少)，但是在感染2个月后仍能确认到表达细胞的存在(图7)。如下面实施例所示，RNA病毒的感染可使DC被活化。因此，利用RNA病毒的向DC的基因导入在临床应用方面，可作为疫苗来使用。体内或者回体给药都是可能的，例如通过回体给药，可以频繁地给药已感染了RNA病毒的DC，以达到长期在体内持续进行基因表达的目的。

[0075](实验4)

探讨了活化和感染效率。根据活化的有无来探讨病毒的感染効率是否发生了变化。经过7天培养的DC在LPS(1μg/ml)中刺激2天后，使SeV-GFP以MOI 30进行感染，2天后用FACS对GFP进行了解析。相反地，SeV-GFP感染2天后在相同条件下实施LPS刺激(2天)。(图8以及9)

结果；来源于人时，LPS活化后的％GFP接近60％为阳性。与此相比，小白鼠DC中的阳性率极低(非提示数据)。但是，即使是来源于人的，其MFI也非常低，而得出了对活化后的DC进行基因导入时的效率极低的结果。与此相反，导入SeV后即使进行了LPS刺激，基因导入效率也没有变化。该结果显示了为了获得导入了RNA病毒的DC，优选使用未成熟的DC，也就是使用还未受到活化刺激的DC。

[0076](实验5)

对感染所必需的接触时间进行了探讨(图10)。结果发现，接触时间在30分钟以内时也可进行基因导入。

[0077](实验6)

在有关使用其他病毒载体的报告中，有对CD34细胞进行基因导入后，通过分化诱导DC而成功的制备了导入了基因的DC的报告(J.Immunol.Meth.2002；153-165)。SeV-GFP也利用同样的方法进行了尝试。从人脐带血中，利用CD34微珠，分离CD34阳性干细胞(CD34＞90％)以MOI 0、10、100进行感染之后，仔细清洗。然后向细胞中添加RPMI+10％FCS培养基，并在其中添加SCF(50ng/ml)、GM-CSF(500 U/ml)、TNF-alpha(50ng/ml)，经过3天的培养，使用添加了SCF(50ng/ml)、GM-CSF(500 U/ml)、IL-4(250U/ml)、TNF-alpha(50ng/ml)的培养基进行继代培养(每3到4天更换一半的新的培养基)的细胞进行病毒感染，并在病毒感染后第13天探讨了GFP的表达水平。结果发现，基因导入效率达到了65～70％，而制备了比其他载体具有更好的GFP表达效率的DC。感染后的DC，通过对协同刺激分子表达的解析，与没有感染的细胞相比，得到的活化细胞被回收(图11以及12)。

从以上实施例来看，RNA病毒与慢病毒、逆转录病毒相比，导入效率非常地出色，证实了以不亚于腺病毒的导入效率且可极其简便迅速地获得该效果的结论。另外，判明了在使用其他载体时活化标记不发生变化，而通过RNA病毒感染时可以诱导DC的活化。

[0078]B.导入后的DC功能评价

(实验1)

以MOI 30-50的SeV-GFP对DC进行感染，1天之后使用LPS刺激(2天)，然后比较了协同刺激分子的表达。作为对照，仅使用LPS刺激的、仅使用SeV-GFP感染的、以及既没用LPS刺激也没用SeV-GFP感染的、的条件下进行了比较研究。

结果；得到的结果显示，仅通过SeV的感染，就可引起DC的活化。

与LPS相匹敌的物质；CD80(+)HLA-DR(-)CD83(-)

比LPS强的物质；CD86(+)CCR7(-)

比LPS弱的物质；CD40(-)

(+)表示LPS+SeV具有相乘效果。(图13-15)

[0079](实验2)

以MOI 30对DC进行SeV-GFP感染(感染后第3天、感染后第1天、使某细胞群被LPS刺激)，对与实验1相同的组，探讨了它们的细胞吞噬能力(使用1mm PCV-RED latex-microspheres。棒状图表是减去了4℃时为阳性的基线后的值)。

结果；和活化标记的结果同样，在被SeV感染的细胞中，观察到了因活化而导致的吞噬能力的下降。尤其是，GFP的表达越高，其吞噬能力就越低。因此，例如，为了使DC进行肿瘤抗原递呈而使用肿瘤裂解物时，优选在将RNA病毒导入DC之前，将裂解物和DC一起进行共同培养(图16-17)。

[0080](实验3)

为了研究由RNA病毒诱导树突状细胞活化而导致对树突状细胞因子产生能力的影响，使经过7天培养的来自单核细胞的树突状细胞(MoDC)用12孔平板经48小时(8×10⁵/2ml/well：培养基是X-vivo15^TM+2％自体血清+GM-CSF(500 U/ml)+IL-4(250 U/ml))培养，并在下述的组的条件下，用Luminex^TM system来测定培养上清中的TNF-alpha、IL-1beta、IL-6、IL-8值。SeV以MOI 30感染并进行了2天的培养。

未刺激(Unstimulated)组：仅用培养基的组

尿囊液(Allantoic fluid)组：添加了60μl的作为SeV悬浮液的鸡卵尿囊液(不包含SeV)的组

UV-SeV-GFP组：添加了60μl的SeV-GFP溶液，该溶液经过紫外线照射，是被除去了复制能力的溶液的组

SeV-GFP组：添加了60μl的SeV-GFP溶液的组(replication-competentSeV)

结果：仅在利用未经UV照射的具有复制能力的SeV(replication-competent SeV)进行GFP基因导入时的树突状细胞中，观察到了TNF-alpha、IL-1beta、IL-6、IL-8的产生增加(图18)。此时，树突状细胞上的CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达仅在使用具有复制能力的SeV(replication-competent SeV)进行感染时可被诱导(图19以及20)。该结果意味着，仅使用SeV向树突状细胞进行基因导入，就可以在免疫应答时，通过树突状细胞可引起重要的炎症性细胞因子(proinflammatorycytokine)产生。另外，从用UV处理过的SeV不能诱导细胞因子的产生，得出在对树突状细胞进行基因导入时，与其说树突状细胞膜上的受体与SeV的接触引起了树突状细胞的活化，不如说在SeV感染之后出现的病毒基因组RNA的扩增过程，在导致树突状细胞活化时更为重要。

[0081](实验4)

为了检验由RNA病毒引起树突状细胞活化时的树突状细胞的抗原递呈能力，使用与上述相同的实验组，将该等DC用3000 rad的放射线照射之后，探讨了它们对T细胞的活化能力。(对细胞给药量进行了探讨的DC和经纯化(CD3⁺＞95％)的同种异体或者同基因T细胞(syngenic T cell)一起共同培养了3天)。作为对SeV-GFP的反应指标，使用了同基因T细胞。

结果；因DC比例和T细胞的数量较少其差值也不是非常的明显，但是即便如此，也还是可以得出单独使用SeV感染时，具有与LPS可相匹敌的同种异体T细胞刺激能力(图21)。再者，也可以使用未经放射线照射的DC。

[0082](实验5)

对由RNA病毒引起树突状细胞活化时的树突状细胞的抗原递呈能力，与由目前具有最强的使树突状细胞成熟化能力的细胞因子混合物的刺激引起的抗原递呈能力进行了比较。将经过7天培养的来自人单核细胞的树突状细胞(MoDC)用12孔平板培养84小时{1×10⁶/2ml/well：培养基为X-vivo15^TM+2％自体血清+GM-CSF(500 U/ml)+IL-4(250 U/ml)、在下述的组的条件下进行培养}。再者，作为RNA病毒，还与搭载了缺损有F基因、具有温度敏感性变异M以及HN蛋白质(M基因：G69E，T116A，A183S、HN基因：A262T，G264R，K461G)基因，并且搭载了具有持续感染型变异的变异P以及L蛋白质(P基因：L511F、L基因：N1197S，K1795E)基因的仙台病毒(SeV-dFM^tsHN^tspLmut-GFP(简称SeV/TS dF))进行了比较(WO2003/025570；Inoue M，et al.J Virol 2003；77：3238-3246；Inoue M，et al.Mol.Ther.2003；7(5)：S37)。这种病毒在被感染了的细胞中不具有感染性病毒粒子形成能力。

·SeV(-)组：仅用培养基的组

·SeV-dFM^tsHN^tspLmut-GFP组：以MOI50感染了SeV-dFM^tsHN^tspLmut-GFP(搭载了GFP的F基因缺损，M/HN/P/L变异型SeV)的组

·SeV-GFP组：以MOI 50感染了SeV-GFP(搭载了GFP的传播型SeV)溶液的组

·细胞因子混合物组：添加了细胞因子混合物(IL-1β50ng/ml、IL-6 500ng/ml、INF-α2500 U/ml、TNF-α100ng/ml、PGE₂ 20μM)的组

经过48小时培养后得到的MoDC用30Gy照射后，将MoDC(4×10⁴/孔到6.25×10²/孔)和同种异体来自末梢血的T细胞(1×10⁵/孔){从同种异体的末梢血中，利用RosetteSep^TM-human T cell enrichment kit(StemCellTechnologies，Vancouver，Canada)获得的具有96％以上纯度的T细胞}培养4天后，向各孔中添加1μCiの[³H]-thymidine，8小时后对[³H]-thymidine的摄取量用Beta Plate System(Pahrmacia LKB Biothechnology，Uppsala，Sweden)进行记数。培养基使用X-vivo15^TM+2％自体血清。示图中的X轴表示每孔中的培养MoDC数/孔的T细胞数(＝1×10⁵)、Y轴表示[³H]-thymidine摄取量(cpm)(图22)。

[0083]C.对癌抗原特异性CTL的诱导

利用A中记载的方法，由人末梢血(HLA-A 0201的健康正常供者)浓缩CD14⁺细胞，以x-vivo 15^TM(Cambrex社制造)+2％自体血清(autologousserum)作为培养基，添加GM-CSF(500U/ml)、IL-4(250U/ml)(每3到4天交换1次一半的培养基)，来制备未成熟树突状细胞。制备的未成熟树突状细胞分成下列三组，再进一步在GM-CSF(500U/ml)、IL-4(250U/ml)中培养48小时。

1组什么都没加入的组

2组SeV-GFP感染(MOI 30)的组

3组由细胞因子混合物(IL-1β50ng/ml、IL-6 500ng/ml、IFN-α2500U/ml、TNF-α100ng/ml、PGE2 20μM)引起的刺激的组

然后，回收树突状细胞，对MART-1肽(EAAGIGILTV(序列序号：1))进行电脉冲(50μg/ml；3个小时)，将与采集树突状细胞相同的健康正常人的末梢血的T细胞用阴性选择进行浓缩(CD3⁺＞97％)，与被多肽电脉冲了的上述三组树突状细胞一起培养7天(X-vivo 15^TM+2％自体血清)。(每3到4天，更换一半的培养基。第一次刺激时，在不添加IL-2的条件下使T细胞和树突状细胞混合培养，并在第3天开始添加100u/ml的IL-2)。重复该过程2次，从各自的混合培养中回收细胞，作为CTL assay的效应细胞来使用。

将T2细胞作为靶细胞使用(TAP缺损细胞株，是从HLA-A2⁺的人体中获得的T细胞-B细胞杂交瘤)。因该细胞不具有TAP(向Class I的转运蛋白)，所以不能向Class I转运由细胞内蛋白分解产生的肽，因此如果从外部添加肽时就会被Class I锁定而使Class I被表达。通过将该靶细胞用变异MART-1肽(ELAGIGILTV(序列序号：2))(对在上述的刺激中使用的肽的T细胞受体识别部位没有变化，但会加强与HLA-2的结合)，流感病毒的肽(Flu；分类于第III型的肽；GILGFVFTL(序号序列：3))进行电脉冲，然后用Cr标记细胞，以该2种细胞为靶的将上述3组效应T细胞以20∶1，10∶1，5∶1，2.5∶1混合培养4小时，最后检测它们的CTL活性。

以下是对实验组合的总结。

效应细胞第1组的效应T细胞第2组的效应T细胞第3组的效应T细胞第1组的效应T细胞第2组的效应T细胞第3组的效应T细胞

靶细胞变异MART1肽+T2细胞变异MART1肽+T2细胞变异MART1肽+T2细胞Flu肽+T2细胞Flu肽+T2细胞Flu肽+T2细胞

图形的象征实线的黑四角实线的黑三角实线的黑倒三角虚线的黑菱形虚线的黑圆形虚线的白四角

结果；使用上述三组DC中没有被活化的DC(MART1肽+)来刺激T细胞，不能诱导MART-1特异性CTL，但是使用作为阳性对照的在细胞因子中被活化(目前，肿瘤免疫的树突状细胞疗法中其活化能力最强的方法)的树突状细胞来刺激T细胞时，可诱导MART-1特异性CTL(作为取代使用电脉冲向靶细胞导入变异MART-1肽的方法，利用MART-1肽进行刺激时也得到了同样的结果)。在使用导入了SeV的树突状细胞时，可以获得与阳性对照同等程度的CTL活性(图23)。也就是说，利用CTL测定判断时，可以得出仅用SeV感染就可以使树突状细胞活化，并且可以在体外诱导与用细胞因子活化的树突状细胞同等程度地CTL。T细胞活化时如果使用SeV，可以在导入靶基因的同时诱导活化，所以没有必要添加细胞因子等活化因子，而有助于在削减成本、节省时间、保持细胞生存率(viability)等方面作出贡献。

[0084]D.由导入了RNA病毒的DC引起的对癌症增殖的抑制

本实施例为通过体内以及回体给药RNA病毒对肿瘤进行治疗的一个方法。

(实验1)

作为肿瘤模型，采用了仅以非常低的水平表达MHC Class I的缺乏免疫原性的B16黑色素瘤的移植模型。作为肿瘤模型的小白鼠，采用了C57BL/6小白鼠(6-8周龄、雌性)(日本Charles River Laboratories)，树突状细胞是从C57BL/6小白鼠(8周龄、雌性)(日本Charles River laboratories)中采集的。树突状细胞，从C57BL/6小白鼠的股骨抽取骨髓，采用了SpinSep^TM，murine hematopoetic progenitor enrichmentcocktail(抗CD5抗体，抗CD45R抗体，抗CD11b抗体，抗Gr-1抗体，抗TER119抗体，抗7/4抗体、干细胞技术(Stem Cell technology))除去T cell之后，添加IL-4以及GM-CSF培养1周以后可获得。在第0天，将1×10⁵/100ml的B16黑色素瘤接种到小白鼠的腹部皮下(s.c.)。在第10天，第17天以及第24天，将未给予活化刺激的树突状细胞、在LPS中活化的树突状细胞(LPS DC)、或者导入SeV-GFP以及表达小白鼠干扰素β的SeV-IFNβ来活化的树突状细胞(分别为SeVGFP DC或者SeV IFNβ DC)给药到肿瘤周围。此时，也进行了向树突状细胞进行肿瘤抗原(B16的反复冻溶肿瘤裂解物)的电脉冲后给药的实验。此外，在肿瘤接种后第10天(day 10)将SeV-IFNβ直接注入到肿瘤内(intratumoralinjection)，进行了观察其抗肿瘤效果的实验。

向树突状细胞进行的SeV导入，在如上所述培养1周的树突状细胞中使SeV-IFNβ以MOI 40进行感染，并培养8小时。对肿瘤抗原进行电脉冲时，回收如上述培养了1周的树突状细胞，将作为肿瘤抗原的肿瘤裂解物进行电脉冲(DC∶肿瘤裂解物＝1∶3)，培养18小时后，使SeV-IFNβ以MOI40进行感染，并再培养8小时。在这之后，回收这些树突状细胞，并以5×10⁵到10×10⁵细胞数量给药到小白鼠的肿瘤周围。

[0085]如图24所示，通过将SeV-IFNβ直接注入到肿瘤内以及通过树突状细胞进行的回体给药，两种方法中的任意一种方法都可以抑制肿瘤的增殖。特别是，在用DC/SeV-IFNβ处理过的小白鼠中，观察到了非常明显的肿瘤抑制效果。

[0086]对上述各治疗组的抗肿瘤效果进行了更加详尽的探讨。为了测试自然杀伤性(NK)细胞的活性，对上述的各治疗组，在进行了3次的DC疗法的第7天从小白鼠中摘取脾脏，制备效应细胞。作为靶的，利用Yac-1，进行了⁵¹Cr的释放测试。另外，为了测试对T淋巴细胞的细胞伤害性，利用上述用于测试NK细胞活性的脾脏细胞的剩余细胞，与B16的肿瘤抗原TRP-2肽一起，将培养了5天的细胞作为效应细胞来使用，与将mTRP-2肽进行电脉冲的EL-4靶细胞一起共同培养，进行了⁵¹Cr的释放测试。特异性⁵¹Cr释放比例是按照以下方式计算的。

[(样品cpm-自发释放出的cpm)/(最大释放出的cpm-自发释放出的cpm)]×100

在这里，最大释放量的测试使用与1％的triton X一起温育了的靶细胞，自发释放量的测试则使用了仅用培养液温育了的靶细胞。

[0087]自然杀伤性(NK)细胞的活化仅在直接注入SeV的小白鼠中可以被观察到，在树突状细胞给药组中没有被检测出来(图25)。与此相反，细胞伤害性T淋巴细胞(cytotoxic T-lymphocytes，CTL)的活化在DC/LPS处理组以及DC/SeV-IFNβ处理了的小白鼠中最为明显，DC/SeV-GFP处理组比前者稍微弱一些，而在SeV-IFNβ的直接注入组中没有检测出该活性(图26)。肿瘤裂解物的电脉冲对肿瘤增殖和CTL应答都没有显著的影响。如上所述，使用SeV向树突状细胞进行免疫刺激性细胞因子的基因导入的肿瘤免疫疗法，可以发挥很强的抗肿瘤治疗效果。尽管DC/LPS处理组和DC/SeV-IFNβ处理组之间的CTL活性略有差异，但也可以观察到同等程度的抗肿瘤效果。如此，得出了将SeV-IFNβ直接给药时可以增强NK细胞活性，而通过树突状细胞间接给药时可诱导CTL活性的结论。因此，在治疗时将它们组合使用时，可期待获得更加有效的治疗效果。

[0088](实验2)

将黑色素瘤细胞株B16F1(ATCC CRL-6323)以1×10⁵向C57BL/6小白鼠(6～8周岁，雌性)的腹部皮下接种(n＝4)。在接种后的第5天(day 5)以及第12天(day 12)，将不携带特别的治疗基因的SeV(GFP表达SeV；SeV-GFP)、表达人可溶型FGF受体的仙台病毒(SeV-sFGFR)、或者表达人PDGFRα可溶型的SeV-hsPDGFRα，各以1×10⁸pFU注射到肿瘤内，并在这之后，经时地对肿瘤大小进行测定。结果发现，任意的SeV给药组与非SeV给药组相比，其肿瘤的大小有明显缩小(图27)。如此，在SeV体内给药时，即使不携带治疗基因，也可以发挥抗肿瘤效果。而给药表达可溶型FGF受体的SeV时，确认到了比SeV-GFP给药组更强的抑制肿瘤增殖的效果，并且给药表达可溶型PDGFRα的SeV时的抗肿瘤效果最为显著，肿瘤大小几乎没有增加。

[0089](实验3)

将1×10⁵的黑色素瘤细胞株B16F1(ATCC CRL-6323)向C57BL/6小白鼠(6周岁、雌性)的腹部皮下进行接种(n＝4)。另外，采集C57BL/6小白鼠(6～8周岁、雌)的骨髓细胞，并使通过SpinSep^TM(STEM CELL TECHNOLOGIES，INC)的CD45R、CD5、CD11b、TER119、Gr-1、7-4的阴性选择而被提取的细胞在GM-CSF 250IU/ml、IL-4 250IU/ml存在下培养7天，以获得来自小白鼠骨髓细胞的树突状细胞。对该树突状细胞，使不携带治疗基因的仙台病毒(GFP表达SeV；SeV-GFP)以MOI 60，或者表达人可溶型PDGFα受体的仙台病毒(SeV-hsPDGFRα)、表达肿瘤抗原TRP2的仙台病毒(SeV-TRP2)、或者表达肿瘤抗原gp100的仙台病毒(SeV-gp100)分别以MOI 20感染以进行基因导入。

[0090]在B16F1接种后的第10天(day 10)以及第17天(day 17)，将导入了SeV-GFP或者SeV-hsPDGFRα的1×10⁶的树突状细胞注射到肿瘤内，以后经时的对肿瘤大小进行测定，其结果如图28所示。并且，与上述病毒体内给药时相同，即使在给药导入了SeV-GFP的树突状细胞的小白鼠中，与给药未导入SeV的树突状细胞的小白鼠相比，也能观察到肿瘤大小的明显缩小。SeV引起的抗肿瘤效果，利用树突状细胞的体外给药要比SeV的体内给药其效果更明显(图28)。在使用将表达可溶型PDGFRα的SeV给药到树突状细胞的回体给药中，抗肿瘤效果更为有效，肿瘤大小几乎没有增加。

[产业上的可利用性]

[0091]通过本发明提供一种以导入了RNA病毒的树突状细胞为有效成分的抗癌剂。RNA病毒的导入可引起树突状细胞的活化，因此可以省略病毒导入后的由细胞因子等进行活化处理的步骤，并且认为在维持细胞的生存率以及削减成本，进而可以减少回体的操作时间等方面作出贡献。本发明使组合使用RNA病毒与树突状细胞的新的病毒疗法成为可能。

序列表

<110>株式会社载体研究所(DNAVEC RESEARCH INC.)

<120>包含导入了RNA病毒的树突状细胞的抗癌剂

<130>D3-A0307Y1P3

<140>

<141>

<150>JP2004-187028

<151>2004-06-24

<150>PCT/JP2004/16089

<151>2004-10-29

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>10

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人工合成的肽

<400>1

Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val

1               5                   10

<210>2

<211>10

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人工合成的肽

<400>2

Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val

1               5                   10

<210>3

<211>9

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人工合成的肽

<400>3

Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu

1               5

Claims (8)

1.种包含导入了具有基因组复制能力的RNA病毒的树突状细胞的抗癌剂。

2.权利要求1中记载的抗癌剂，其中所述RNA病毒不编码外源蛋白质。

3.权利要求1中记载的抗癌剂，其中所述RNA病毒为不形成感染性病毒的粒子的病毒。

4.权利要求1中记载的抗癌剂，其中所述RNA病毒编码可溶性FGF受体或者IFN-β。

5.权利要求1-4的任意一项中记载的抗癌剂，其中所述RNA病毒是感染性或者非感染性病毒粒子。

6.权利要求1-4的任意一项中记载的抗癌剂，其中所述RNA病毒是基因组RNA-蛋白质复合体。

7.一种包含将具有基因组复制能力的RNA病毒导入树突状细胞的步骤的抗癌剂的制备方法。

8.一种包含给药导入了具有基因组复制能力的RNA病毒的树突状细胞的步骤的癌症抑制方法。

Images