JP2013151523A - Ｒｎａウイルスが導入された樹状細胞を含む抗癌剤 - Google Patents

Abstract

【課題】RNAウイルスと樹状細胞を組み合わせた効果的な癌の治療剤およびその製造方法の提供。
【解決手段】ゲノム複製能を持つセンダイウイルスを未成熟樹状細胞に導入することにより成熟化が誘導されて製造された成熟樹状細胞を含む抗癌剤。
【選択図】なし

Description

本発明は癌治療の分野に関する。

近年、進行癌を対象とした増殖型ウイルスによるウイルス療法 (virotherapy) の臨床研究が進められている。ウイルス療法とは、HSV-1やアデノウイルスなどの増殖型ウイルスを腫瘍細胞に感染させ、ウイルス増殖に伴うウイルスの殺細胞効果により腫瘍の治癒を図る治療法である。HSV-1やアデノウイルスの場合、腫瘍治療用の増殖型ウイルスは、ウイルスゲノムに遺伝子操作を加えた変異ウイルスで、腫瘍内での複製能を保ちつつ、ヒト正常組織での病原性が最小限に押さえられている。腫瘍細胞に感染した治療用の増殖型ウイルスは、細胞内で複製し、その過程で感染細胞は死滅する。増殖したウイルスは周囲の腫瘍細胞に再感染し、抗腫瘍作用を広げる（Alemany R. et al., Replicative adenoviruses for cancer therapy. Nat Biotechnol., 2000, 18:723-727; Curiel, D.T., The development of conditionally replicative adenoviruses for cancer therapy., Clin Cancer Res., 2000, 6:3395-9; Kirn, D., Virotherapy for cancer: Current status, hurdles, and future directions., Cancer Gene Therapy, 9:959-960, 2002; Mineta T. et al., Attenuated multi-mutated herpes simplex virus-1 for the treatment of malignant gliomas. Nat Med 1:938-943,1995）。癌に対するウイルス療法は、手術・放射線療法・化学療法といった従来の治療法との併用が可能で、固形癌一般に適用が可能であること、反復投与が可能であること、サイトカインなどの治療遺伝子をウイルスゲノムに直接組み込んで抗腫瘍効果を増強するができることなど、その応用範囲が広く、実用面で優れている。より効果的なウイルス療法を開発することができれば、癌治療に大きく貢献できるものと期待される。

Alemany R. et al., Replicative adenoviruses for cancer therapy. Nat Biotechnol., 2000, 18:723-727 Curiel, D.T., The development of conditionally replicative adenoviruses for cancer therapy., Clin Cancer Res., 2000, 6:3395-9 Kirn, D., Virotherapy for cancer: Current status, hurdles, and future directions., Cancer Gene Therapy, 2002, 9:959-960 Mineta T. et al., Attenuated multi-mutated herpes simplex virus-1 for the treatment of malignant gliomas. Nat Med , 1995, 1:938-943

本発明は、RNAウイルスが導入された樹状細胞を含む抗癌剤を提供する。また本発明は、RNAウイルスが導入された樹状細胞を製造する工程を含む、抗癌剤の製造方法を提供する。また本発明は、RNAウイルスが導入された樹状細胞を用いた癌の治療方法を提供する。

本発明者らは、ゲノム複製能を持つRNAウイルスを樹状細胞に導入すると、樹状細胞が活性化され、優れた制癌効果を発揮することを見出した。樹状細胞を介してRNAウイルスを癌に注入した場合の癌増殖に対する抑制効果は、RNAウイルスを直接癌に注射するよりも有意に高かった。樹状細胞にRNAウイルスを導入する工程は体外で行うことができるため、従来のウイルス療法に比べウイルス導入条件を厳密に制御することが可能であり、さらに、樹状細胞に感染しなかったウイルスを除去することで安全性を高めることもできる。また、RNAウイルスを導入した樹状細胞による制癌効果は、感染性ウイルス粒子を放出しない欠損型ウイルスを用いた場合にも同様に見られた。すなわち、RNAウイルスを導入した樹状細胞による制癌効果は、RNAウイルスが樹状細胞内でゲノムRNAを複製することが重要であり、感染性ウイルス粒子を放出して周囲の細胞に感染を広げる必要は必ずしもない。従って、例えばウイルスエンベロープ蛋白質などの、感染ウイルス粒子の形成に必須の蛋白質をコードするウイルス遺伝子を欠損させることで感染性ウイルス粒子の形成能をなくした安全性の高いRNAウイルスを用いて、ウイルス療法を行うことも可能になる。

すなわち本発明は、RNAウイルスが導入された樹状細胞を含む抗癌剤、該抗癌剤の製造方法、およびRNAウイルスが導入された樹状細胞を用いた癌の抑制方法に関し、より具体的には請求項の各項に記載の発明に関する。なお同一の請求項を引用する請求項に記載の発明の１つまたは複数の組み合わせからなる発明は、それらの請求項に記載の発現に既に意図されている。すなわち本発明は、
〔１〕ゲノム複製能を持つRNAウイルスが導入された樹状細胞を含む抗癌剤、
〔２〕RNAウイルスが外来蛋白質をコードしない、〔１〕に記載の抗癌剤、
〔３〕RNAウイルスが感染性ウイルス粒子を形成しない複製欠損ウイルスである、〔１〕または〔２〕に記載の抗癌剤、
〔４〕RNAウイルスが可溶性FGF受容体またはIFN-βをコードする、〔１〕または〔３〕に記載の抗癌剤、
〔５〕RNAウイルスが感染性または非感染性ウイルス粒子である、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の抗癌剤、
〔６〕RNAウイルスがゲノムRNA−蛋白複合体である、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の抗癌剤、
〔７〕ゲノム複製能を持つRNAウイルスを樹状細胞に導入する工程を含む、抗癌剤の製造方法、
〔８〕ゲノム複製能を持つRNAウイルスが導入された樹状細胞を投与する工程を含む癌の抑制方法、に関する。

末梢血単球濃縮細胞の単核細胞に由来する樹状細胞の表現型を示す図である。PIで判別できた生細胞にゲートをかけ、抗CD11c-PE結合抗体及び抗HLA-class II(DR, DP, DQ) FITC結合抗体を用いて、CD11cおよびHLA-class II(DR, DP, DQ)の発現を観察した（左のマトリックス）。更にCD11cおよびHLA-class II(DR, DP, DQ) が共に陽性のゲートを選択し、１）抗CD14-APC結合抗体、２）抗CD1a-APC結合抗体、３）抗CD80-biotin結合抗体 (2次的にストレプトアビジン-APCで染色) を使用して、それぞれの発現レベルをCD11cとのドットプロットで示した（右の3つのマトリックス）。なお、実施例中の"Class II"はHLA-DR、DQ、DPを全て認識する抗体を使用した結果を、"HLA-DR"はHLA-DRを特異的に認識する抗体を使用した結果を表す。 GFP発現RNAウイルスを導入したDCにおけるGFPおよびcostimulatory moleculesの発現を示す図である。 ヒト単球由来樹状細胞へのGFP発現RNAウイルスの導入効率と樹状細胞の活性化を示す図である（感染後2日目）。 ヒト単球由来樹状細胞へのGFP発現RNAウイルスの導入効率と樹状細胞の活性化を示す図である（感染後4日目）。 ヒト単球由来樹状細胞へのGFP発現RNAウイルスの導入効率と樹状細胞の活性化を示す図である（感染後8日目）。 GFP発現RNAウイルス導入後のDC数の変化を示す図である。 GFP発現RNAウイルス導入後のGFP発現期間を示す図である。 ヒトDCへのGFP発現RNAウイルス導入導入効率におけるLPS刺激の効果を示す図である。 ヒトDCへのGFP発現RNAウイルス導入導入効率におけるLPS刺激の効果を示す図である。 DCへの遺伝子導入におけるインキュベーション時間の検討結果を示す図である。 臍帯血由来のDCへの遺伝子導入を示す図である。 臍帯血由来のDCへの遺伝子導入を示す図である。 遺伝子導入後のcostimulatory moleculesの発現を示す図である (LPS刺激との比較)。 遺伝子導入後のcostimulatory moleculesの発現を示す図である (LPS刺激との比較)。 遺伝子導入後のcostimulatory moleculesの発現を示す図である (LPS刺激との比較)。 遺伝子導入後の貪食能を示す図である。 遺伝子導入後の貪食能を示す図である。 RNAウイルスの導入後の単球由来DCのサイトカイン産生を示す図である。 RNAウイルスの導入後の樹状細胞上のマーカー蛋白質の発現を示す図である。 RNAウイルスの導入後の樹状細胞上のマーカー蛋白質の発現を示す図である。 RNAウイルスを導入したDCのアロT細胞刺激能を示す図である。 RNAウイルスを導入した樹状細胞の抗原特異的T細胞の増殖誘導を示す図である。 RNAウイルスの導入により、MART-1特異的CTLをインビトロで誘導した結果を示す図である。 皮下接種されたB16メラノーマ細胞の増殖曲線を示す図である。 YAC-1ターゲット細胞の⁵¹Cr放出アッセイの結果を示す図である。 TRP2ペプチド+EL-4の⁵¹Cr放出アッセイの結果を示す図である。 GFP発現SeV、可溶型FGF受容体発現SeV、または可溶型PDGFRα発現SeVのin vivo投与によるメラノーマに対する治療効果を示す図である。 GFP発現SeVまたは可溶型PDGFRα発現SeVを導入した樹状細胞のex vivo投与によるメラノーマに対する治療効果を示す図である。

本発明は、ゲノム複製能を持つRNAウイルスが導入された樹状細胞を含む抗癌剤を提供する。本発明においてRNAウイルスとは、RNAゲノムを持つウイルスを言う。本発明においてRNAウイルスは、好ましくはウイルスのライフサイクルにおいてRNAを鋳型にRNA合成を行うウイルスである。RNAウイルスとしては、樹状細胞においてゲノムRNAを複製する所望のRNAウイルスであってよく、野生型ウイルスであっても、弱毒型ウイルスや温度感受性ウイルスなどの変異型ウイルスであってよい。また、天然のウイルス（自然発生したウイルス）であっても、組み換えウイルスであってもよい。RNAウイルスには、一本鎖RNAウイルス（プラス鎖RNAウイルスおよびマイナス鎖RNAウイルスを含む）、および二本鎖RNAウイルスを含む。またエンベロープを有するウイルス（エンベロープウイルス；enveloped viruses）およびエンベロープを有さないウイルス（非エンベロープウイルス；non-enveloped viruses）を含むが、好ましくはエンベロープウイルスが用いられる。本発明においてRNAウイルスには、具体的には以下の科に属するウイルスが含まれる。
ラッサウィルスなどのアレナウイルス科（Arenaviridae）
インフルエンザウイルスなどのオルソミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）
SARSウイルスなどのコロナウイルス科（Coronaviridae）
風疹ウイルスなどのトガウイルス科（Togaviridae）
ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、センダイウイルス、RSウイルスなどのパラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）
ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルスなどのピコルナウイルス科（Picornaviridae）
マールブルグウイルス、エボラウイルスなどのフィロウイルス科（Filoviridae）
黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、C型肝炎ウイルス、G型肝炎ウイルスなどのフラビウイルス科（Flaviviridae）
ブンヤウイルス科（Bunyaviridae）
狂犬病ウイルスなどのラブドウイルス科（Rhabdoviridae）
レオウイルス科（Reoviridae）

本発明において、ゲノム複製能を持つRNAウイルスが導入された樹状細胞とは、ゲノム複製能を持つRNAウイルスのゲノムRNAを含む樹状細胞であって、該RNAがコードするウイルス蛋白質によって、該RNAが樹状細胞内で複製する細胞を言う。RNAウイルスのゲノムRNAと、該RNAに結合するウイルス蛋白質は、細胞内でリボヌクレオプロテイン（RNP）複合体を形成し、細胞内で該ゲノムRNAを複製する。このRNPはヌクレオカプシドとも呼ばれる。すなわち、本発明においてゲノム複製能を持つRNAウイルスが導入された樹状細胞は、ゲノム複製能を持つRNAウイルスのリボヌクレオプロテイン（ヌクレオカプシド）を有する樹状細胞を意味する。

RNAウイルスが導入された樹状細胞を得るには、RNAウイルスを樹状細胞またはその前駆細胞に、感染性RNAウイルス粒子を接触させ感染させればよい。あるいは、感染性ウイルス粒子を使用しなくても、ゲノム複製能を持つRNAウイルスに含まれるRNPを細胞に導入したり、あるいは感染性のないウイルス粒子であって、該RNPを含むウイルス粒子（非感染性ウイルス粒子、またはウイルス様粒子 (VLP) と呼ぶ）を細胞に導入してもよい。ウイルス粒子からエンベロープまたは外殻を除去したRNP（ウイルスコア）であっても、樹状細胞に導入されれば、細胞内においてウイルスゲノムRNAを複製することができる（WO97/16538; WO00/70055）。また、ウイルスゲノムRNAおよび該ゲノムRNAの複製に必要なウイルス蛋白質（マイナス鎖RNAウイルスであればN、PおよびL蛋白質）をコードする発現ベクターを樹状細胞に導入して、樹状細胞内でRNPを形成させてもよい。RNPやVLPを樹状細胞またはその前駆細胞に導入するには、周知のトランスフェクション方法を利用することができる。具体的には、リン酸カルシウム (Chen, C. & Okayama, H. (1988) BioTechniques 6:632-638; Chen, C. and Okayama, H., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745)、DEAE-デキストラン (Rosenthal, N. (1987) Methods Enzymol. 152:704-709)、種々のリポソームベースのトランスフェクション試薬 (Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY))、エレクトロポレーション (Ausubel, F. et al. (1994) In Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, NY), Vol. 1, Ch. 5 および 9) など、当業者に知られる様々な技術で樹状細胞にトランスフェクトすることが可能である。エンドソームでの分解を抑制するため、トランスフェクションにおいてクロロキンを加えることもできる（Calos, M. P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015）。トランスフェクション試薬を幾つか例示すれば、DOTMA（Roche）、Superfect Transfection Ragent（QIAGEN, Cat No. 301305）、DOTAP、DOPE、DOSPER（Roche #1811169）、TransIT-LT1 (Mirus, Product No. MIR 2300)、CalPhos^TM Mammalian Transfection Kit (Clontech #K2051-1)、CLONfectin^TM (Clontech #8020-1) などが挙げられる。特にエンベロープウイルスは、ウイルス粒子形成の際に宿主細胞由来の蛋白質を取り込むことが知られており、このような蛋白質は、樹状細胞に導入した際に抗原性や細胞傷害性の原因となることが考えられる（J. Biol. Chem. (1997) 272, 16578-16584）。従って、エンベロープが除去されたRNPを樹状細胞に導入することには利点がある（WO00/70055）。

RNAウイルスが導入されると、樹状細胞内でウイルスゲノムの複製が起こり、樹状細胞の活性化が誘導され成熟樹状細胞に分化する。得られた成熟樹状細胞は、T細胞を活性化する能力を保持している。RNAウイルスを導入した樹状細胞は免疫系を活性化する高い能力を有しており、腫瘍に投与することにより制癌作用を発揮できる。RNAウイルスの樹状細胞への感染は、例えば培養液または生理食塩水など所望の生理的水溶液中でin vitro（またはex vivo）で行うことができる。本発明は、体内から取り出した樹状細胞またはその前駆細胞を体外でRNAウイルスと接触させ、ウイルスを導入後に体内に戻すex vivoの抗腫瘍治療において有用である。RNAウイルスを体外で感染させる場合は、RNAウイルスを未成熟樹状細胞に接触、または未成熟樹状細胞を含む細胞画分と混合することが好ましい。樹状細胞はRNAウイルスを導入することにより活性化することができるが、それとは別に、細菌またはリポポリサッカライド（LPS）などとの接触によっても活性化することができる。樹状細胞をこのような方法で別途活性化させる場合は、活性化してからRNAウイルスを導入してもよいが、ウイルスの導入効率が低下しないようにするため、活性化の操作を、ウイルスの導入前ではなく、ウイルスを導入した後（またはウイルスを樹状細胞に接触させるのと同時）に行うことが好ましい。

ウイルスと樹状細胞またはその前駆細胞との接触においては、MOI（多重感染度; 細胞1つあたりの感染ウイルス数）は1〜500の間にすることが好ましく、より好ましくは2〜300、さらに好ましくは3〜200、さらに好ましくは5〜100、さらに好ましくは7〜70である。RNAウイルスと樹状細胞との接触は短い時間でも十分であり、例えば1分以上、好ましくは3分以上、5分以上、10分以上、または20分以上接触させればよく、例えば1〜60分程度、より特定すれば5分〜30分程度であってよい。もちろん、それ以上の時間接触させてもよく、例えば数日間またはそれ以上接触させてもよい。

樹状細胞（Dendritic cell; DC）とは、成熟状態において樹枝状形態をとり、抗原を提示してT細胞を活性化する能力を持つ細胞である。樹状細胞には、生体内各種組織器官に分布する骨髄細胞由来の樹枝状形態をとる細胞群、および骨髄または血液由来の幹細胞から、in vitroでサイトカイン等を利用して分化誘導をかけた生体内組織器官に分布する樹枝状形態をとる細胞と同等の細胞群が含まれる。具体的には、樹状細胞には、例えばリンパ球系樹状細胞（Th2への誘導または免疫寛容を誘導するものであってもよい）、骨髄球系樹状細胞 (一般的に用いられる樹状細胞。未熟樹状細胞および成熟樹状細胞を含む)、ランゲルハンス細胞（皮膚の抗原提示細胞で重要な樹状細胞）、相互連結細胞（リンパ節、脾臓のT細胞領域にあり、T細胞への抗原提示に働いていると考えられている細胞）、ろ胞樹状細胞（B細胞への抗原提示細胞として重要、抗原と抗体複合体、抗原と補体複合体を抗体レセプター、補体レセプターにより、樹状細胞上に提示することで、B細胞に抗原提示している。）などを含むものであり、好ましくは、MHCクラスIおよびクラスIIを高発現しており、さらに好ましくはCD11cを発現している細胞である。

また、樹状細胞は、樹枝状形態を有し、CD11c、HLA-class II (HLA-DR、-DP、または -DQ)、CD40、およびCD1aからなる群より選択される表面マーカーの２つ以上が陽性の細胞であってよい。本発明において樹状細胞は、より好ましくは、HLA-class II⁺およびCD11c⁺の細胞、より好ましくはCD1a⁺、HLA-class II⁺、およびCD11c⁺の細胞で、かつT細胞マーカー（CD3）、B細胞マーカー（CD19、CD20）、NK細胞マーカー（CD56）、好中球マーカー（CD15）、単球マーカー（CD14）を発現してない細胞である。RNAウイルスの導入に使用される樹状細胞集団のCD14⁺の割合は、例えば10％以下、好ましくは5％以下、更に好ましくは1％以下がよい。

また、本発明において樹状細胞には成熟樹状細胞および未成熟樹状細胞が含まれる。未成熟樹状細胞とは、T細胞活性化能力が低い樹状細胞を言う。具体的には、未成熟樹状細胞は、LPS (1 micro-g/ml) を添加し2日間培養して成熟を誘導した樹状細胞に比べ、抗原提示能が1/2未満、好ましくは1/4未満のものであってよい。抗原提示能は、例えばアロT細胞活性化能（混合リンパ球試験；アロT細胞と樹状細胞の混合培養で、T細胞対樹状細胞の割り合いは1：10で培養、好ましくはその比率を変化させて培養したもので、培養終了8時間前に^３H-thymidineを添加し、そのT細胞のDNA内の取込み量によって、T細胞増殖能力を定量したもの:図２１および２２参照；文献 Gene Therapy 2000; 7; 249-254）、あるいはペプチドを用いた特異的細胞傷害性T細胞（CTL）の誘導能試験（樹状細胞に、ある抗原のあるClass I 拘束性の既知のペプチドを添加して、樹状細胞を採取したのと同じ健常人末梢血のT細胞を共培養（3日目以降はIL-2を25U/ml、好ましくは100U/ml)（好ましくは21日間３回の樹状細胞による刺激、更に好ましくは14日間2回の樹状細胞の刺激）し、得られたエフェクター細胞を⁵¹Crでラベルされたターゲット細胞（ペプチドの拘束性のClass I陽性の腫瘍細胞）と20:1、10:1、5:1、および 2.5:1、好ましくは100:1、50:1、25:1、および12.5:1で4時間混合培養してターゲット細胞の⁵¹Cr遊出量で定量したもの；図２３参照；文献 Arch Dermatol Res 2000; 292; 325-332）により定量することができる。また未成熟樹状細胞は、好ましくは抗原貪食能を持ち、更に好ましくはT細胞活性化のための副刺激を誘導する受容体の発現が低発現（例えば上記のようにLPS誘導した成熟DCに比べ有意に）あるいは陰性である。一方で、成熟樹状細胞とはT細胞活性化などの為の抗原提示能力が高い樹状細胞を言う。具体的には、成熟樹状細胞は、LPS (1 micro-g/ml) を添加し2日間培養して成熟を誘導した樹状細胞の抗原提示能の1/2以上、好ましくは同等以上の抗原提示能を持つ細胞であってよい。また成熟樹状細胞は、好ましくは抗原貪食能が低いか、または持たず、更に好ましくはT細胞活性化のための副刺激を誘導する受容体の発現が高いものをいう。また、樹状細胞の活性化とは、未成熟樹状細胞から成熟樹状細胞への移行を言い、活性化樹状細胞には、成熟樹状細胞、および、活性化刺激により副刺激を誘導するCD80、CD86の発現を上昇させている途中経過の樹状細胞が、その範疇に含まれる。CD11c陽性の樹状細胞においては、CD83陽性が成熟樹状細胞の指標とされる。

例えば成熟樹状細胞は、好ましくは CD40、CD80、CD86およびHLA-class IIの発現が強陽性の細胞であってよい。更に好ましくは、成熟樹状細胞はCD83を発現する。例えば、CD80、CD83、およびCD86からなる群より選択されるマーカーを基に、未成熟樹状細胞と成熟樹状細胞を見分けることができる。未成熟樹状細胞ではこれらのマーカーは弱いか、好ましくは陰性であるが、成熟樹状細胞では陽性である。

上記のように、未成熟樹状細胞は、通常、高い貪食能を保持している。樹状細胞にLPS (1 micro-g/ml) を添加し2日間培養すると、樹状細胞は活性化され貪食能は低下する。貪食能は、樹状細胞内への小分子の取り込み量または取り込み細胞の割合を測定して知ることができる。好ましくは、貪食能は、樹状細胞内への小分子の取り込み量で決定される。例えば、1 micro-m程度の着色ビーズを用いて、樹状細胞内へのビーズの取り込みを測定することができる。4℃で陽性となるバックグランドを差し引いて定量する。高い貪食能とは、樹状細胞内への小分子の取り込み量が、樹状細胞を上記のようにLPS (1 micro-g/ml) で2日間刺激した樹状細胞の4倍以上、より好ましくは5倍以上、より好ましくは6倍以上の貪食能を言う。あるいは、小分子の取り込み細胞の割合が2倍以上、より好ましくは3倍以上である。低い貪食能とは、樹状細胞内への小分子の取り込み量が、LPS (1 micro-g/ml) で2日間刺激した樹状細胞の4倍未満、より好ましくは2倍未満、より好ましくは1.5倍未満である。あるいは、小分子の取り込み細胞の割合で測定した場合に、2倍未満、より好ましくは1.5倍未満である。

成熟樹状細胞の判別は当業者が通常行っており、上記の各マーカーおよびその発現の測定方法も当業者に周知である。例えばCD11cは約150 kDの接着糖蛋白 (p150, インテグリンalpha鎖) である。CD11cはCD18と結合してCD11c/CD18複合体を形成し、フィブリノーゲンへの結合力を有し、また、iC3bおよびICAM-1の受容体となることが報告されている。また、CD11c/CD18は刺激を受けた上皮の受容体に結合する接着分子として働きうることが報告されている（Knapp, W. et al., eds., 1989, Leucocyte Typing IV: White Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press, New York; Barclay, N.A. et al., eds., 1993, The Leucocyte Antigen FactsBook, CD11 Section, Academic Press Inc., San Diego, California, p. 124; Stacker, S.A. and T.A. Springer, 1991, J. Immunol. 146:648）。

CD1aは約49 kDのポリペプチドでbeta 2ミクログロブリンと結合する。CD1aはMHC class I抗原と構造的に類似しており、抗原提示に機能するとみなされる（Knapp, W. et al., eds., 1989, Leucocyte Typing IV: White Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press, New York; Schlossman, S. et al., eds., 1995, Leucocyte Typing V: White Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press, New York; Hanau, D. et al., 1990, J. Investigative Dermatol. 95: 503; Calabi, F. and A. Bradbury., 1991., Tissue Antigens 37: 1）。

CD14は53-55 kDのグリコシルホスファチジルイノシトール (GPI) アンカー型単鎖糖蛋白で、細網樹状細胞およびある種のランゲルハンス細胞で発現する。CD14はLPSと血清LPS結合蛋白質 (LPB) の複合体に対する高親和性の表面受容体として同定された（McMichael, A.J. et al., eds., 1987, Leucocyte Typing III: White Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press, New York; Knapp, W. et al., eds., 1989, Leucocyte Typing IV: White Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press, New York; Schlossman, S. et al., eds., 1995, Leucocyte Typing V: White Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press, New York; Wright , S.D. et al., 1990, Science 249:1434）。

CD40は45-48 kDのI型膜嵌入型蛋白質（type I integral membrane glycoprotein）であり、抗CD40抗体は細胞マーカーとしてよく使用されている（Schlossman, S. et al., eds., 1995, Leucocyte Typing V: White Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press, New York; Galy, A.H.M.; and H. Spits, 1992, J. Immunol. 149: 775; Clark, E.A. and J.A. Ledbetter, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 4494; Itoh, H. et al., 1991, Cell 66: 233; Barclay, N.A. et al., 1993, The Leucocyte Antigen Facts Book., Academic Press）。

CD80は約60 kDの膜貫通型糖蛋白であり Ig supergene familyの一員である。CD80はT細胞で発現するCD28およびCD152 (CTLA-4) のリガンドである（Schlossman, S. et al., eds., 1995, Leucocyte Typing V: White Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press, New York; Schwarts, R.H., 1992, Cell 71: 1065; Azuma, M. et al., 1993, J. Exp. Med. 177: 845; Koulova, L. et al., 1991, J. Exp. Med. 173: 759; Freeman, G.J. et al., 1998, J. Immunol. 161: 2708; Behrens, L. et al., 1998, J. Immunol., 161(11):5943; Guesdon, J.-L. et al., 1979, J. Histochem. Cytochem. 27: 1131-1139）。

CD83は約45 kDの膜貫通蛋白質でIg superfamilyの一員である。CD83は短鎖のV型Igの細胞外ドメインとC末の細胞質tailを持つ。CD83は主にろ胞樹状細胞、循環樹状細胞、リンパ組織の相互連結 (interdigitating) 樹状細胞、in vitroで生成させた樹状細胞、および胸腺樹状細胞に発現する（Zhou, L-J., and T.F. Tedder, 1995, J. Immunol. 154. 3821; Zhou, L-J. et al., 1992, J. Immunol. 149: 735; Summers, K.L. et al., 1995, Clin Exp. Immunol. 100:81; Weissman, D. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci USA. 92: 826; Hart, D.N.J., 1997, Blood 90: 3245）。

CD86 (B70/B7-2) は約75 kDの細胞表面蛋白質でCD28およびCTLA-4の第2のリガンドであり初期免疫応答におけるT細胞の副刺激に重要な役割を持つ（Azuma M. et al., 1993, Nature 366: 76; Nozawa Y. et al., 1993, J. Pathology 169: 309; Engle, P. et al. 1994., Blood 84: 1402; Engel, P. et al., CD86 Workshop Report. In: Leukocyte Typing V. Schlossman, S.F. et al. eds., 1994, Oxford University Press; Yang, X.F. et al., 1994, Upregulation of CD86 antigen on TPAstimulated U937 cells, 1994, (abstract). American Society of Hematology, Nashville, TN; Guesdon, J.-L.et al., 1979, J. Histochem. Cytochem. 27: 1131-1139）。

CCR7はBLR-2、EBI-1、およびCMKBR7とも呼ばれる7回膜貫通型G蛋白質結合受容体であり、CCケモカインである MIP-3beta/Exodus 3/ELC/CCL19 および 6Ckine/Exodus 2/SLC/TCA4/CCL21 の受容体である（Sallusto, F. et al., 1999, Nature 401:708-12; Lipp, M. et al., 2000, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 251:173-9; Birkenbach, M.et al., 1993, J. Virol. 67:2209-20; Schweickart, V. L. et al., 1994, Genomics 23:643-50; Burgstahler, R. et al., 1995, Biochem. Biophys. Res. Commun. 215:737-43; Yoshida, R. et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:13803-9; Yoshida, R. et al., 1998, J. Biol. Chem. 273:7118-22; Yoshida, R. et al., 1998, Int. Immunol. 10:901-10; Kim, C. H. et al., 1998, J. Immunol. 161:2580-5; Yanagihara, S. et al., 1998, J. Immunol. 161:3096-102）。

HLA-class IIはDR, DP, およびDQがあり、その全てに結合する抗体により網羅的に検出することができる（Pawelec, G. et al., 1985, Human Immunology 12:165; Ziegler, A. et al., 1986, Immunobiol. 171:77）。HLA-DRはMHCのヒトclass II抗原の1つでalpha鎖 (36 kDa) とbetaサブユニット (27 kDa) からなる膜貫通糖蛋白質である。表皮のランゲルハンス細胞ではCD1a抗原と共発現する。CD1aは抗原提示において細胞の相互作用に主要な役割を果たす（Barclay, N.A. et al., 1993, The Leucocyte Antigen Facts Book. p. 376. Academic Press）。

またヒト以外の哺乳動物に関しても、上記のマーカー遺伝子の相同遺伝子産物を指標に樹状細胞を特定することができる。これらのマーカーに対する抗体は、例えばBD Biosciences社（BD PharMingen）より入手することができ、その詳細は同社または販売代理店のウェブサイトで知ることができる。

また、樹状細胞マーカーに関しては、以下のKiertscherらおよびOehlerらの文献も参照のこと（Kiertscher SM, Roth MD, Human CD14+ leukocytes acquire the phenotype and function of antigen-presenting dendritic cells when cultured in GM-CSF and IL-4, J. Leukoc. Biol., 1996, 59(2):208-18; Oehler, L. et al., Neutrophil granulocyte-committed cells can be driven to acquire dendritic cell characteristics., J. Exp. Med., 1998, 187(7):1019-28）。また、フローサイトメトリーに関しては、Okanoら、およびStitesらの文献を参照することができる（Okano, S. et al., Recombinant Sendai virus vectors for activated T lymphocytes., Gene Ther., 2003, 10(16):1381-91; Stites, D. et al., Flow cytometric analysis of lymphocyte phenotypes in AIDS using monoclonal antibodies and simultaneous dual immunofluorescence., Clin. Immunol. Immunopathol., 1986, 38:161-177）。各マーカーの発現については、例えば、isotype control antibodyで染色した時に、陽性率が1％以下の蛍光強度を境界として、それ以上は陽性、それ未満は陰性と判断される。

樹状細胞またはその前駆細胞の調製は、公知の方法に従ってまたは準じて行うことができる。例えば、血液（例えば末梢血または臍帯血）、骨髄、リンパ節、他のリンパ器官、脾臓、皮膚などから分離することができる。好ましくは、樹状細胞は、本発明に使用するために血液または骨髄から得られる。また、本発明で用いられる樹状細胞は、皮膚のランゲルハンス細胞、輸入リンパ管のベール細胞、ろ胞樹状細胞、脾臓の樹状細胞、およびリンパ器官の指状突起細胞などであってもよい。また本発明で用いられる樹状細胞は、CD34⁺由来樹状細胞、骨髄由来樹状細胞、単球由来樹状細胞、脾細胞由来樹状細胞、皮膚由来樹状細胞、濾胞樹状細胞、および胚中心樹状細胞からなる群から選択される樹状細胞が含まれる。CD34⁺由来樹状細胞は、臍帯血または骨髄等から得た造血幹細胞または造血始原細胞等から、顆粒球コロニー刺激因子 (G-CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (GM-CSF)、腫瘍ネクローシスファクター (TNF)-alpha、IL-4、IL-13、ステムセルファクター (SCF)、Flt-3リガンド、c-kitリガンド、またはその組み合わせなどにより分化させることができる。例えば、末梢血の単球をGM-CSFおよびIL-4により未成熟樹状細胞に分化させ、さらにTNF-alphaで刺激することにより成熟樹状細胞へと分化させることができる。

樹状細胞およびそれ以外の細胞を含む組成物から樹状細胞を選択（または濃縮）する場合は、樹状細胞以外の細胞を取り除くいわゆるネガティブ選択を実施することが好ましい。ネガティブ選択を用いることにより、DC-granulocytesのprecursor（J. Exp. Med., 1998, 187: 1019-1028; Blood, 1996, 87: 4520-4530) が除去されずに残り、接着性のCD14細胞から分化したDCだけでなく、それらのprecursorから分化したDCをあわせて回収することが可能と考えられる。これにより細胞障害性を軽減することが期待できる。

例えば、T細胞、NK細胞、B細胞などに特異的な抗体を用いて、これらの細胞を取り除くことにより、樹状細胞を濃縮することが可能である。具体的には、例えば、CD2、CD3、CD8、CD19、CD56、CD66bから選択される表面マーカーまたはその任意の組み合わせの発現がlowまたはnegativeの細胞を得ることが好ましい。より好ましくは、CD2、CD3、CD8、CD19、CD56、およびCD66bの全てがlowまたはnegativeの細胞である。そのために、これらのマーカーに対する抗体を用いて、これらのマーカーを発現する細胞を除去するとよい（Hsuら（1996）Nature Med. 2: 52）。なお、ネガティブ選択においては、本実施例に示されているような多価抗体を用いて行うことができるし、あるいは磁気細胞分離 (MACS) のためにビーズ等を用いても、同様のセレクションを実施することが可能である。血球分離等をもちいて単核球を採取するなど、細胞を大量に調整する場合は、ビーズを用いることが好ましい。例えば生体から得た細胞溶液から単球をエンリッチし、これに対してネガティブ選択を行って調製した樹状細胞を本発明において好適に用いることができる。

また、RNAウイルスを導入する前に接着細胞により得られた末梢血単球を樹状細胞へ分化させたものを選択すると、ウイルスの導入効率が低下することがある。本発明で用いられる樹状細胞はこれに限られるものではないが、未成熟樹状細胞の比率を低下させないように、RNAウイルスを接触させる前の細胞培養は、固体支持体（例えば培養ディッシュまたはボトルなどの培養容器）に接着した細胞を選択する工程を含まないことが好ましい。すなわち本発明は、RNAウイルスと樹状細胞との接触の前24時間以内に、固体支持体に付着した細胞を選択する工程を含まないような方法を提供する。より好ましくは、RNAウイルスと樹状細胞との接触の前の2日、3日、5日、または7日以内に、固体支持体に付着した細胞を選択する工程を含まないようにするとよい。

また、これに限られるものではないが、RNAウイルスを接触させる前に、CD14⁺細胞を選択する工程を含まないことが好ましい。すなわち本発明は、RNAウイルスと樹状細胞との接触の前24時間以内に、CD14⁺細胞を選択する工程を含まないような方法を提供する。より好ましくは、RNAウイルスと樹状細胞との接触の前の2日、3日、5日、または7日以内に、CD14⁺細胞を選択する工程を含まないようにするとよい。

樹状細胞の具体的な単離方法は、例えば Cameron et al., 1992, Science 257: 383、Langhoff et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7998、Chehimi et al., 1993,J. Gen. Viol. 74: 1277、Cameron et al., 1992, Clin．Exp．Immunol. 88: 226、Thomas et al., 1993, J. Immunol. 150: 821、Karhumaki et al.， 1993, Clin．Exp．Immunol. 91: 482 などに記載されている。また、フローサイトメトリーによる樹状細胞の単離については、例えば、Thomas et al., 1994, J．Immunol. 153: 4016、Ferbas et al., 1994, J．Immunol. 152: 4649、および O'Dohelrty et al., 1994, Immunology 82: 487 に記載されている。また、磁気細胞選別については、例えば Miltenyi et al., 1990, Cytometry 11: 231-238 に記述されている。

また、例えばヒト樹状細胞の単離および増殖に関しては、Macatonia et al., 1991, Immunol. 74: 399-406、O'Doherty et al., 1993, J. Exp. Med. 178: 1067-1078、Markowicz et al., 1990, J. Clin. Invest. 85: 955-961、Romani et al., 1994, J. Exp. Med. 180: 83-93、Sallusto et al., 1994, J. Exp. Med. 179: 1109-1118、Berhard et al., 1995, J. Exp. Med. 55: 1099-1104 などに記載の方法を用いてもよい。また、骨髄、臍帯血、または末梢血等から得られるCD34⁺細胞および末梢血由来の単核細胞からの樹状細胞形成については Van Tendeloo et al., 1998, Gene Ther. 5: 700-707 に記載の方法を用いて実施してもよい。

本発明においては、樹状細胞またはその前駆細胞（例えばCD11c⁺細胞またはCD34⁺細胞）を高濃度で含む細胞画分にRNAウイルスを混合することが好ましい。前駆細胞とは、適当なサイトカイン（すなわちG-CSF、GM-CSF、TNF-alpha、IL-4、IL-13、SCF、Flt-3リガンド、c-kitリガンド、またはそれらの組み合わせ）の存在下で樹状細胞に分化することができる細胞を言い、好ましくは4週間以内、より好ましくは20日以内、より好ましくは18日以内、より好ましくは16日以内に樹状細胞に分化できる細胞である。このような細胞には、CD34⁺幹細胞が挙げられる。樹状細胞への分化は、例えばSCF (50 ng/ml)、GM-CSF (500 U/ml)、TNF-alpha (50 ng/ml) の存在下で3日間程度培養後、SCF (50 ng/ml)、GM-CSF (500 U/ml)、IL-4 (250 U/ml)、TNF-alpha (50ng/ml) の存在下で培養することで実施することであってよい。また細胞画分とは、細胞の分離（または分画）により得られた細胞集団である。細胞画分は、細胞および薬学的に許容される担体を含む組成物であってよい。担体としては、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、培養液、血清など、生細胞を懸濁することができる所望の溶液が挙げられる。本発明の方法においてRNAウイルスの接触に用いられる細胞画分は、全生細胞中の樹状細胞および／またはその前駆体の割合が、例えば30％以上、好ましくは40％以上、好ましくは50％以上、好ましくは60％以上、好ましくは70％以上である。

また、RNAウイルスに接触させる樹状細胞中には、未成熟樹状細胞が含まれることが好ましい。RNAウイルスを混合する樹状細胞を含む細胞画分は、全生細胞中の未成熟樹状細胞の割合が、例えば10％以上、好ましくは20％以上、より好ましくは30％以上、より好ましくは40％以上、より好ましくは50％以上、より好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上である。

RNAウイルスと樹状細胞とを組み合わせた抗癌剤は優れた性質を有している。例えばRNAウイルスを用いれば、ウイルスの感染のみで、活性化樹状細胞が得られ、後の成熟樹状細胞を得るための工程が省略できる。樹状細胞を免疫賦活に用いるためには活性化が必要であるので、ウイルスの感染だけで活性化を起こせることには利点がある。また、この性質を利用し、in vitroでT細胞移入療法に必要な活性化T細胞、特に細胞傷害性T細胞などを効率良く短期間で誘導することができる。ウイルスを導入していない樹状細胞ではCTLを誘導できず、他のウイルスベクターでこれまで報告されている性質から、他のウイルスベクターの遺伝子導入のみではin vitroでのCTL誘導は困難である。従って、RNAウイルスは、ウイルスの導入のみでT細胞を活性化（CTL誘導）が可能という利点を有している（図２１〜２３参照）。

本発明の抗癌剤の製造においては、RNAウイルスを幹細胞に遺伝子導入した後に、樹状細胞を分化させてもよい。例えばセンダイウイルスを幹細胞に遺伝子導入した後に、樹状細胞への分化を誘導した場合、遺伝子導入効率は70％近くに達する。これは、レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターの改変型に匹敵する。アデノウイルスベクターは、導入後のepisomeの希釈により発現が低下するため、幹細胞から遺伝子導入することは困難である。ゲノム複製型RNAウイルスが導入された樹状細胞の調製は、幹細胞に導入後に樹状細胞分化を行う方法、および、末梢血単核球より分化させた樹状細胞に遺伝子を導入する方法、のどちらの方法によっても可能である。

また、RNAウイルスを感染させる時にMOIを高く（例えば10以上、好ましくは20以上、より好ましくは30以上、例えば40以上、さらには50以上）すれば、細胞傷害性に有為な影響なく、安定してほぼ100％の導入効率で細胞に導入することが期待できる。さらに、宿主染色体にゲノムを組み込まないRNAウイルスを用いれば、宿主ゲノム改変に起因する腫瘍発生などのリスクが低いという利点も有している。この点で、レトロウイルス以外のRNAウイルスが好適に用いられる。

RNAウイルスとしては、組み換えウイルスでなくても、天然のウイルスでも使用することが可能であり、各RNAウイルスの精製方法、増殖方法、単離株の取得方法については、ウイルス学実験学 各論、改訂二版（国立予防衛生研究所学友会編、丸善、1982）を参照することができる。例えば、パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）のセンダイウイルスなどパラインフルエンザウイルスは、各型ともサル腎臓（MK2）、ヒト胎児肺、腎臓、羊膜の初代培養細胞、およびトリプシン添加 Vero 細胞で良く増殖し（同上, p334；Itoh H et al., Jap. J. Med. Sci. Biol. 23, 227 (1970)）回収することができる。精製は、ショ糖密度勾配遠心法、平衡遠心法などで精製できる（p336）。麻疹ウイルスは、サル由来の各種細胞で良く増殖でき（Matsumoto M, Bact. Rev. 30, 152 (1966)）Vero 細胞が最も汎用されているが、CV1, FL, KB, HeLa HEp2 などを使用して増殖可能である（p351）。狂犬病ウィルスなどのラブドウィルス科（Rhabdoviridae）では組織培養法を用いて、BHK、CEおよびVero細胞などが使用されている。精製法としては、感染3〜4日の培養液をpH7.4以上に補正し、低速遠心で細胞片を除き濃縮する（p376）。ラッサウィルスなどのアレナウイルス科（Arenaviridae）は、in vitroで継代されているほとんどの培養細胞でよく増殖するが、HK-21/13S細胞に感染させた後、寒天中にsuspendした形で培養することによって増殖が可能である（Sedwik W.D., J. Virol. 1, 1224 (1967)）（p240）。風疹ウイルスなどのトガウイルス科（Togaviridae）は、初代アフリカミドリザル腎細胞（GMK）、Vero、BHK21、RK13、初代ウズラまたはニワトリ胚細胞、R66、およびSIRC細胞など広範囲にわたる各種の培養細胞中で増殖する。比較的収量の高いウィルスを得るにはBHK21あるいはVero細胞がよく用いられる（p227）。インフルエンザウイルスなどのオルソミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）は、発育鶏卵やMDCK細胞において増殖できる（p295）。精製は遠心分画法、赤血球への吸着・游出による精製（Laver W.G., Fundamental Techniques in Virology, 82 (1969)）などで精製できる（p317）。

RNAウイルスは、天然から単離されたウイルスであっても、遺伝子組み換えにより人為的に作出したウイルスであってもよい。また、感染細胞においてゲノムRNAを複製する能力を保持する限り、野生型ウイルスが持ついずれかのウイルス遺伝子に変異および/または欠損があるものであってよい。例えば、ウイルスのエンベロープ蛋白質または外殻蛋白質をコードする少なくとも１つの遺伝子に変異または欠損を有するウイルスを好適に用いることができる。このようなウイルスは、感染細胞においてはRNAゲノムを複製することはできるが、感染性ウイルス粒子を形成できない。従って、周囲に感染を拡大する懸念がないので安全性が高い。例えばマイナス鎖RNAウイルスにおいては、F、H、HN、またはGなどのエンベロープ蛋白質またはスパイク蛋白質をコードする少なくとも１つの遺伝子、あるいはそれらの組み合わせが含まれていないウイルスを用いることができる（WO00/70055 および WO00/70070; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000)）。ゲノム複製に必要な蛋白質（例えば N、P、およびL蛋白質）をゲノムRNAにコードしていれば、感染細胞においてゲノムを増幅することができる。つまり、少なくともN、L、およびP蛋白質をコードするゲノムRNAとそれらの蛋白質とを含むRNP、ならびに該RNPを含むウイルス粒子は、本発明の抗腫瘍剤の製造において樹状細胞に導入されるものとして適当である。欠損型ウイルスを製造するには、例えば、欠損している遺伝子産物またはそれを相補できる蛋白質をウイルス産生細胞において外来的に供給する（WO00/70055 および WO00/70070; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000)）。但し、例えばマイナス鎖RNAウイルスにおいては、M蛋白質遺伝子を持つウイルスであれば、F蛋白質やHN蛋白質などのスパイク蛋白質をコードする遺伝子を持たなくても非感染性のウイルス粒子（VLP）が放出されるので、ウイルス蛋白質を相補することなくVLPを製造することが可能である（WO00/70070）。また、エンベロープ蛋白質遺伝子を何も持たなくても、N、L、P蛋白質、およびゲノムRNAからなるRNPは細胞内において増幅することができるので、細胞ライセートから遠心分離等によりRNPを回収することができる。得られたVLPやRNPは、所望のトランスフェクション試薬と混合して樹上細胞に導入することにより、抗腫瘍剤を製造することができる。

また、変異型のRNAウイルスを用いて本発明の抗腫瘍剤を製造することもできる。例えば、エンベロープ蛋白質や外殻蛋白質において多数の温度感受性変異が知られている。これらの温度感受性変異蛋白質遺伝子を有するRNAウイルスを本発明において好適に用いることができる。温度感受性変異とは、低温 (例えば30℃ないし32℃) に比べ、ウイルス宿主の通常の温度（例えば37℃ないし38℃）において有意に活性が低下する変異のことである。このような、温度感受性変異を持つ蛋白質は、許容温度（低温）下でウイルスを作製することができるので有用である。

例えば、マイナス鎖RNAウイルスのM遺伝子の温度感受性変異としては、センダイウィルスのM蛋白質におけるG69、T116、およびA183からなる群より任意に選択される部位のアミノ酸置換が挙げられる（Inoue, M. et al., J.Virol. 2003, 77: 3238-3246）。他のマイナス鎖RNAウイルスM蛋白質の相同な部位のアミノ酸は容易に同定できるが、具体的に示せば、例えばSeV M蛋白質のG69に相当するM蛋白質の相同部位としては、human parainfluenza virus-1 (HPIV-1)（括弧は略称）であればG69、human parainfluenza virus-3 (HPIV-3) であればG73、phocine distemper virus (PDV)およびcanine distemper virus (CDV)であればG70、dolphin molbillivirus (DMV)であればG71、peste-des-petits-ruminants virus (PDPR)、measles virus (MV)、およびrinderpest virus (RPV)であればG70、Hendra virus (Hendra)およびNipah virus (Nipah)であればG81、human parainfluenza virus-2 (HPIV-2)であればG70、human parainfluenza virus-4a (HPIV-4a)およびhuman parainfluenza virus-4b (HPIV-4b)であればE47、mumps virus (Mumps)であればE72が挙げられる（文字と番号はアミノ酸とその位置を表す）。また、SeV M蛋白質のT116に相当する各M蛋白質の相同部位としては、human parainfluenza virus-1 (HPIV-1)であればT116、human parainfluenza virus-3 (HPIV-3)でればT120、phocine distemper virus (PDV)およびcanine distemper virus (CDV)であればT104、dolphin molbillivirus (DMV)であれはT105、peste-des-petits-ruminants virus (PDPR)、measles virus (MV)およびrinderpest virus (RPV)であればT104、Hendra virus (Hendra)およびNipah virus (Nipah)であればT120、human parainfluenza virus-2 (HPIV-2)およびsimian parainfluenza virus 5 (SV5)であればT117、human parainfluenza virus-4a (HPIV-4a)およびhuman parainfluenza virus-4b (HPIV-4b)であればT121、mumps virus (Mumps)であればT119、Newcastle disease virus (NDV)であればS120が挙げられる。SeV M蛋白質のA183に相当する各M蛋白質の相同部位としては、human parainfluenza virus-1 (HPIV-1)であればA183、human parainfluenza virus-3 (HPIV-3)であれなF187、phocine distemper virus (PDV)およびcanine distemper virus (CDV)であればY171、dolphin molbillivirus (DMV)であればY172、peste-des-petits-ruminants virus (PDPR)、measles virus (MV)およびrinderpest virus (RPV)であれはY171、Hendra virus (Hendra)およびNipah virus (Nipah)であればY187、human parainfluenza virus-2 (HPIV-2)であれはY184、simian parainfluenza virus 5 (SV5)であればF184、human parainfluenza virus-4a (HPIV-4a)およびhuman parainfluenza virus-4b (HPIV-4b)であれはF188、mumps virus (Mumps)であればF186、Newcastle disease virus (NDV)であればY187が挙げられる。ここに挙げたウイルスにおいて、それぞれのM蛋白質に上記の3つの部位のいずれか、好ましくは任意の2部位の組み合わせ、さらに好ましくは3つの部位全てのアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異M蛋白質をコードするゲノムを有するウイルスは、本発明において好適に用いられる。アミノ酸変異は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましく、例えばBLOSUM62マトリックス（Henikoff, S. and Henikoff, J. G. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919）の値が3以下、好ましくは2以下、より好ましくは1以下、より好ましくは0以下のアミノ酸に置換する。具体的には、センダイウィルス M蛋白質のG69、T116、およびA183あるいは他のウイルスM蛋白質の相同部位を、それぞれGlu (E)、Ala (A)、およびSer (S) へ置換することができる。また、麻疹ウイルス温度感受性株 P253-505（Morikawa, Y. et al., Kitasato Arch. Exp. Med. 1991: 64; 15-30）のM蛋白質の変異と相同な変異を利用することも可能である。変異の導入は、例えばオリゴヌクレオチド等を用いて、公知の変異導入方法に従って実施すればよい。

また、HN遺伝子の温度感受性変異としては、例えばセンダイウイルスのHN蛋白質のA262、G264、およびK461からなる群より任意に選択される部位のアミノ酸置換が挙げられる（Inoue, M. et al., J.Virol. 2003, 77: 3238-3246）。好ましい一例を挙げれば、センダイウィルス HN蛋白質のA262、G264、およびK461あるいは他のウィルスHN蛋白質の相同部位を、それぞれThr (T)、Arg (R)、およびGly (G) へ置換する。また、例えば、ムンプスウィルスの温度感受性ワクチン株 Urabe AM9を参考に、HN蛋白の464及び468番目のアミノ酸に変異導入することもできる（Wright, K. E. et al., Virus Res. 2000: 67; 49-57）。

またマイナス鎖RNAウィルスは、P遺伝子またはL遺伝子に変異を有していてもよい。このような変異としては、具体的には、SeV P蛋白質の86番目のGlu（E86）の変異、SeV P蛋白質の511番目のLeu（L511）の他のアミノ酸への置換、または他のマイナス鎖RNAウィルスP蛋白質の相同部位の置換が挙げられる。具体的には、86番目のアミノ酸のLysへの置換、511番目のアミノ酸のPheへの置換などが例示できる。またL蛋白質においては、SeV L蛋白質の1197番目のAsn（N1197）および/または1795番目のLys（K1795）の他のアミノ酸への置換、または他のマイナス鎖RNAウィルスL蛋白質の相同部位の置換が挙げられ、具体的には、1197番目のアミノ酸のSerへの置換、1795番目のアミノ酸のGluへの置換などが例示できる。P遺伝子およびL遺伝子の変異は、持続感染性、2次粒子放出の抑制、または細胞傷害性の抑制の効果を顕著に高めることができる。さらに、エンベロープ蛋白質遺伝子の変異および/または欠損を組み合わせることで、これらの効果を劇的に上昇させることができる。

またエンベロープウイルスを用いる場合は、ウイルスが本来持つエンベロープ蛋白質とは異なる蛋白質をエンベロープに含むウイルスを樹状細胞に感染させてもよい。例えば、ウイルス製造の際に、所望の外来性エンベロープ蛋白質をウイルス産生細胞で発現させることにより、これを含むウイルスを製造することができる。このような蛋白質に特に制限はなく、哺乳動物細胞への感染能を付与する所望の蛋白質が用いられる。具体的には、例えば水疱性口内炎ウイルス（Vesicular stomatitis virus; VSV）のG蛋白質（VSV-G）を挙げることができる。VSV-G蛋白質は、任意のVSV株に由来するものであってよく、例えば Indiana血清型株（J. Virology 39: 519-528 (1981)）由来のVSV-G蛋白を用いることができるが、これに限定されない。本発明において用いられるRNAウイルスは、他のウイルス由来のエンベロープ蛋白質を任意に組み合わせて含むことができる。

RNAウイルスは、ゲノムRNA中に外来遺伝子をコードしてもよいし、しなくてもよい。樹状細胞に導入されることによって、外来蛋白質をコードしないRNAウイルスでも制癌作用を発揮するため、外来遺伝子は必ずしも必要ではない。従って本発明には、野生型RNAウイルスや天然から単離されたウイルス（変異株を含む）などの所望のRNAウイルスを利用できる利点がある。例えば本発明において用いるRNAウイルスとしては、癌治療効果を有する蛋白質をコードしないRNAウイルスを用いることができる。このようなウイルスとしては、癌治療効果を有さない所望の外来蛋白質をコードするRNAウイルスが含まれ、例えばRNAウイルスの導入を検出するために、緑色蛍光蛋白質（GFP）、ルシフェラーゼ、各種ペプチドタグなどのマーカー蛋白質をコードするRNAウイルスなどを用いることができる。あるいは、RNAウイルスに制癌作用を助ける外来遺伝子をさらに組み込むことで、制癌作用をより高めることもできる。

外来遺伝子を持つ組み換えRNAウイルスの再構成は公知の方法を利用して行えばよい。具体的な手順は、典型的には、（ａ）RNAウイルスゲノムRNAをコードするcDNAを、ウイルス粒子形成に必要なウイルス蛋白質を発現する細胞で転写させる工程、（ｂ）生成したウイルスを含む培養上清を回収する工程、により製造することができる。ウイルス蛋白質は、転写させたウイルスゲノムRNAから発現されてもよいし、ゲノムRNA以外からトランスに供給されてもよい。ゲノムRNAにおいて粒子形成に必要なウイルス遺伝子が欠損している場合は、そのウイルス遺伝子をウイルス産生細胞で別途発現させ、粒子形成を相補する。ウイルス蛋白質やRNAゲノムを細胞内で発現させるためには、該蛋白質やゲノムRNAをコードするDNAを宿主細胞で機能する適当なプロモーターの下流に連結したベクターを宿主細胞に導入する。転写されたゲノムRNAは、ウイルス蛋白質の存在下で複製され、感染性ウイルス粒子が形成される。エンベロープ蛋白質などの遺伝子を欠損する欠損型ウイルスを製造する場合は、欠損する蛋白質またはその機能を相補できる他のウイルス蛋白質などをウイルス産生細胞において発現させる。

例えば、マイナス鎖RNAウイルスの製造であれば、以下の公知の方法を利用することができる（WO97/16539; WO97/16538; WO00/70055; WO00/70070; WO01/18223; Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997、Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587 及び Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466; Durbin, A. P. et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S. P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M. J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al., 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M. D. and Barrett, T., 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404）。これらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、リンダーペストウイルス、センダイウイルスなどを含むマイナス鎖RNAウイルスをDNAから再構成させることができる。本発明においては、マイナス鎖RNAウイルス、特に一本鎖マイナス鎖RNAウイルス、より好ましくはパラミクソウイルス科ウイルス、より好ましくはレスピロウイルス属ウイルスを好適に用いることができる。

ゲノム複製能を持つマイナス鎖RNAウイルスが導入された樹状細胞の製造方法をより具体的に示せば、ゲノム複製に必要なウイルス蛋白質（N、P、およびL）を発現する細胞に、ウイルスゲノムRNA（マイナス鎖）またはその相補鎖（プラス鎖）を導入または転写させる。N、P、およびL蛋白質は、例えば、これらの蛋白質を発現する発現プラスミドを細胞に導入して供給する。ウイルスゲノムRNAとしては、ゲノム複製に必要なウイルス蛋白質（N、P、およびL）をコードするものを用いる。この過程を樹状細胞で行えば、樹状細胞内でゲノムRNAおよびN、P、およびLを含むRNPが形成し、該RNPは樹状細胞内で自律的に複製させることができる。本発明においては、このように樹状細胞においてウイルスRNPを直接生成させて、マイナス鎖RNAウイルスが導入された樹状細胞を得ることもできる。樹状細胞以外の細胞を用いる場合は、生成したRNP、感染性または非感染性ウイルス粒子を回収する。M蛋白質が存在すれば、その働きにより細胞からウイルス粒子（またはVLP）が放出される。さらにスパイク蛋白質（例えばF・HN (またはH) 蛋白質、あるいはG蛋白質など）が存在すれば、形成された粒子にはこれらのスパイク蛋白質が取り込まれ、感染性ウイルス粒子となる。スパイク蛋白質が存在しない場合は、M蛋白質の存在下、非感染性ウイルス粒子（VLP）が放出される。回収されたRNPまたはVLPは、例えばトランスフェクション試薬などと共に、樹状細胞に導入される。感染性ウイルス粒子は、そのまま樹状細胞に添加して感染させることができる。こうして、マイナス鎖RNAウイルスが導入された樹状細胞を製造することが可能である。

プラス (+) 鎖RNAウイルスの製造方法としては、以下の例が挙げられる。
１）コロナウイルス
Enjuanes L, Sola I, Alonso S, Escors D, Zuniga S.
Coronavirus reverse genetics and development of vectors for gene expression.
Curr Top Microbiol Immunol. 2005;287:161-97. Review.
２）トガウイルス
Yamanaka R, Zullo SA, Ramsey J, Onodera M, Tanaka R, Blaese M, Xanthopoulos KG.
Induction of therapeutic antitumor antiangiogenesis by intratumoral injection of genetically engineered endostatin-producing Semliki Forest virus.
Cancer Gene Ther. 2001 Oct;8(10):796-802.
Datwyler DA, Eppenberger HM, Koller D, Bailey JE, Magyar JP.
Efficient gene delivery into adult cardiomyocytes by recombinant Sindbis virus.
J Mol Med. 1999 Dec;77(12):859-64.
３）ピコルナウイルス
Lee SG, Kim DY, Hyun BH, Bae YS.
Novel design architecture for genetic stability of recombinant poliovirus: the manipulation of G/C contents and their distribution patterns increases the genetic stability of inserts in a poliovirus-based RPS-Vax vector system.
J Virol. 2002 Feb;76(4):1649-62.
Mueller S, Wimmer E.
Expression of foreign proteins by poliovirus polyprotein fusion: analysis of genetic stability reveals rapid deletions and formation of cardioviruslike open reading frames.
J Virol. 1998 Jan;72(1):20-31.
４）フラビウイルス
Yun SI, Kim SY, Rice CM, Lee YM.
Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus.
J Virol. 2003 Jun;77(11):6450-65.
Arroyo J, Guirakhoo F, Fenner S, Zhang ZX, Monath TP, Chambers TJ.
Molecular basis for attenuation of neurovirulence of a yellow fever Virus/Japanese encephalitis virus chimera vaccine (ChimeriVax-JE).
J Virol. 2001 Jan;75(2):934-42.
５）レオウイルス
Roner MR, Joklik WK.
Reovirus reverse genetics: Incorporation of the CAT gene into the reovirus genome.
Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Jul 3;98(14):8036-41. Epub 2001 Jun 26.
その他のRNAウイルスの増殖方法および組み換えウイルスの製造方法については、ウイルス学実験学 各論、改訂二版（国立予防衛生研究所学友会編、丸善、1982 を参照のこと。

RNAウイルスに搭載させる外来遺伝子としては、特に制限はないが、天然の蛋白質としては、例えばホルモン、サイトカイン、増殖因子、受容体、細胞内シグナル分子、酵素、抗体（全長抗体、Fabなどの抗体断片、一本鎖抗体などを含む）、ペプチドなどが挙げられる。蛋白質は分泌蛋白質、膜蛋白質、細胞質蛋白質、核蛋白質などであり得る。人工的な蛋白質としては、例えば、キメラ毒素などの融合蛋白質、ドミナントネガティブ蛋白質（受容体の可溶性分子または膜結合型ドミナントネガティブ受容体を含む）、欠失型の細胞接着分子および細胞表面分子などが挙げられる。また、分泌シグナル、膜局在化シグナル、または核移行シグナル等を付加した蛋白質であってもよい。導入遺伝子としてアンチセンスRNA分子またはRNA切断型リボザイムなどを発現させて、特定の遺伝子の機能を抑制することもできる。外来遺伝子として制癌作用を示す治療用遺伝子を用いてウイルスを調製すれば、制癌作用をより高めることが可能となる。

例えば、血管形成または血管新生を阻害する遺伝子を樹状細胞で発現させることで、抗癌効果をより高めることができる。血管形成または血管新生を促進する遺伝子としては、例えば線維芽細胞増殖因子2（FGF2）（Baffour, R. et al., J. Vasc. Surg. 16(2):181-91, 1992）、内皮細胞増殖因子（endothelial cell growth factor; ECGF）（Pu, L. Q. et al., J. Surg. Res. 54(6):575-83, 1993）、血管内皮増殖因子/血管透過性因子（vascular endothelial growth factor; VEGF / vascular permeability factor; VPF）（Takeshita, S. et al., Circulation 90(5 Pt 2):II228-34, 1994; Takeshita, S. et al., J. Clin. Invest. 93(2):662-70, 1994）、肝細胞増殖因子/scatter因子 (hepatocyte growth factor/scatter factor) (HGF/SF) などが知られている。これらのシグナル分子の作用を阻害する分泌蛋白質をコードする遺伝子を樹状細胞で発現させることが可能である。具体的には、これらのシグナル分子またはその受容体に結合する抗体またはその抗原結合断片を含むポリペプチド、該受容体の可溶型蛋白質（リガンド結合部を持ち、膜貫通領域を持たない分泌型受容体）などが挙げられる。特に、FGF受容体（FGF-R）の可溶型ポリペプチドをコードするRNAウイルスを樹状細胞に導入すると、癌の増殖抑制効果は有意に上昇させることができる。従って、可溶性FGF-RをコードするRNAウイルスは、本発明において好適に用いられる。可溶性FGF-Rとしては、天然の可溶型FGF-Rを用いることもできるし、膜結合型のFGF-R（FGF-R1など）の細胞外ドメインからなる断片を用いてもよい（A. Hanneken and A. Baird, Investigative Ophthalmology & Visual Science, Vol 36, 1192-1196, 1995; Takaishi, S. et al., Biochem Biophys Res Commun., 267(2):658-62, 2000; Seno M, et al., Cytokine, 10(4):290-4, 1998; Hanneken, A., FEBS Lett. 489:176, 2001）。

また、標的とする癌が発現する癌抗原ペプチドを樹状細胞に提示させることもできる。樹状細胞に提示させる抗原は、RNAウイルスにコードさせたり、あるいはRNAウイルスを導入した樹状細胞に添加（すなわちパルス）したり、または別の所望のベクターで発現させることができる。腫瘍抗原は腫瘍細胞に特異的なもの （すなわち、腫瘍細胞に存在するが、非腫瘍細胞には存在しないもの）が好ましいが、同じタイプの非腫瘍細胞よりも腫瘍細胞に高レベルで存在するものであってもよい。また、癌抗原蛋白質全長であっても、その部分ペプチドであってもよい。樹状細胞において提示されるペプチドを同定することで、そのペプチドを合成して用いることができる。抗原ペプチドは、樹状細胞表面のMHC分子に結合して細胞表面に提示され、免疫応答が誘導される。

CTLが主なエフェクターとして働く場合は、抗原としては細胞内外に発現する所望の腫瘍抗原を用いることができる。樹状細胞を用いて、CD4 T細胞の活性化から引き続くB細胞の活性化による抗体産生を惹起し、抗体をエフェクターとして作用させる場合には、抗原としては細胞表面に表出するものが好ましく、例えば、細胞表面受容体または細胞接着蛋白質を用いることができる。腫瘍抗原の例としては、卵巣癌等にするMuc-1 または Muc-1様ムチンタンデムリピートペプチド（米国特許第 5,744,144号）、子宮頸癌を引き起こすヒト乳頭腫ウイルス蛋白質E6およびE7、メラノーマ抗原MART-1、MAGE-1、-2、-3、gp100およびチロシナーゼ、前立腺癌抗原PSA、その他にも、CEA（Kim, C. et al., Cancer Immunol. Immunother. 47 (1998) 90-96）、およびHer2neu（HER2p63-71、p780-788; Eur. J. Immunol. 2000; 30: 3338-3346）などが挙げられる。

また、樹状細胞からサイトカイン類を発現させれば、免疫系を刺激して癌に対する免疫応答を高めることから、サイトカインをコードする遺伝子を導入した樹状細胞も有用である。免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子を搭載するRNAウイルスが導入された樹状細胞は効果的な腫瘍免疫誘導剤となる。例えば、免疫刺激性サイトカインとして、インターロイキン（例えば、IL-1alpha、IL-1beta、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-23、IL-27）、インターフェロン（例えば、IFN-alpha、IFN-beta、IFN-gamma）、腫瘍壊死因子（TNF）、トランスフォーミング増殖因子(TGF)-beta、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インスリン様増殖因子 (IGF)-Ｉ、IGF-2、Flt-3リガンド、Fasリガンド、およびc-kitリガンド、ならびに他の免疫調節蛋白質（ケモカインおよびコスティミュラトリー分子など）が含まれる。

これらのサイトカインのアミノ酸配列は当業者には周知であり、IL-4については、例えば、Araiら (1989)、J. Immunol. 142(1) 274-282、IL-6については、例えば、Yasukawaら (1987)、EMBO J.、6(10): 2939-2945、IL-12は、例えば、Wolfら (1991)、J. Immunol. 146(9): 3074-3081、IFN-alphaは、例えば、Grenら (1984) J. Interferon Res. 4(4): 609-617、およびWeismannら (1982) Princess Takamatsu Symp. 12: 1-22、IFN-betaは、例えばAccession number NM_002176 の139〜636番目の配列（アミノ酸配列はNP_002167の22〜187番目）を含む配列が挙げられる（Derynck, R. et al., Nature 285, 542-547 (1980); Higashi, Y. et al., J. Biol. Chem. 258, 9522-9529 (1983); Kuga, T. et al., Nucleic Acids Res. 17, 3291 (1989)）。また、TNFは、例えば、Pennicaら (1984) Nature 312: 724-729、G-CSFは、例えば、Hiranoら (1986) Nature 324:73-76、GM-CSFは、例えば、Cantrellら (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82(18): 6250-6254 を参照することができる。より具体的には、GM-CSFをコードする核酸配列としては Accession number NM_000758の84〜461番目の配列（アミノ酸配列はNP_000749の18〜144番目）を含む配列が挙げられる。IL-4をコードする核酸配列としては、Accession number NM_000589の443〜829番目の配列（アミノ酸配列はNP_000580の25〜153番目）を含む配列が挙げられる。シグナルペプチド配列は、適宜他の蛋白質のシグナルペプチドの配列に置換してもよい。これらのサイトカインをコードする天然の遺伝子または遺伝子暗号の縮重を利用して、機能的サイトカインをコードする変異遺伝子を構築し、樹状細胞に導入することができる。

また、これらのサイトカインの改変体を発現するように遺伝子改変してもよい。例えば、前駆体および成熟体の２つの形態を持つサイトカイン（例えば、シグナルペプチドの切断により活性フラグメントを生成するもの、または蛋白質の限定分解により活性フラグメントを生成するものなど）について、前駆体または成熟体のいずれかを発現するように遺伝子改変してもよい。その他の改変体（例えば、サイトカインの活性フラグメントと異種配列（例えば、異種シグナルペプチド）との間の融合タンパク質）を用いてもよい。

RNAウイルスが導入された樹状細胞は、必要に応じて薬理学的に許容される所望の担体または媒体（例えば生理食塩水、リンゲル液、培養液、血清など）と組み合わせることができる。また、必要に応じて遠心などにより濃縮され、培養液または生理食塩水などの生理的溶液中に再懸濁されてよい。本発明によって調製される樹状細胞は、癌に対する有効な免疫療法において有用であり、腫瘍抗原をコードする遺伝子が導入された樹状細胞またはその樹状細胞で刺激されたT細胞による免疫感作は、患者において抗腫瘍作用を誘導する有効な方法となる。本発明は、本発明の方法により得られた樹状細胞の抗癌治療における使用に関する。また本発明は、本発明の方法により得られた樹状細胞の、抗癌剤（または制癌剤、癌増殖抑制剤など）の製造における使用に関する。また本発明は、RNAウイルスおよび樹状細胞の、抗癌剤（または制癌剤、癌増殖抑制剤など）の製造における使用に関する。

得られた樹状細胞は、DCワクチンとして有用である。免疫原性を高めるために、RNAウイルスが導入された樹状細胞には、サイトカイン、コレラ毒素、サルモネラ毒素等の免疫促進剤を添加することもできる。またミョウバン、不完全Freund'sアジュバント、MF59 (オイルエマルジョン)、MTP-PE (マイコバクテリア細胞壁由来の muramyl tripeptide)、および QS-21 (soapbark tree Quilaja saponaria 由来）などのアジュバントを組み合わせることもできる。

また本発明は、RNAウイルスおよび樹状細胞を含むパッケージであって、該樹状細胞を癌抑制に使用することの記載を含むパッケージに関する。RNAウイルスおよび樹状細胞は、別々の容器中に含まれていてもよいし、同一の容器に含まれていてもよい。また本発明は、RNAウイルスが導入された樹状細胞を含むパッケージであって、該樹状細胞を癌抑制に使用することの記載を含むパッケージにも関する。RNAウイルスおよび樹状細胞は、培養液または生理食塩水などの溶液中に懸濁されていてよい。癌抑制に使用することとは、例えばRNAウイルスが導入された樹状細胞、またはそれを含む組成物が、腫瘍増殖抑制、癌の縮退、癌治療、癌患者の処置・治療、癌患者の延命、または抗癌剤として用いられることである。該記載は、パッケージに直接記載されていてもよいし、該記載を含む紙やシールをパッケージに含んでいてもよい。パッケージは、RNAウイルスおよび/または樹状細胞を含む容器であってよく、その場合、容器は、例えばボトル、チューブ、ビニールバッグ、バイアル、シリンジ等であってよい。また本発明のパッケージは、該容器を収納するバッグまたは外箱等を含んでもよい。パッケージには、樹状細胞の投与方法が記載された説明書を含んでもよく、樹状細胞投与のためのシリンジ、カテーテル、および/または注射針等をさらに含んでもよい。

本発明により製造される制癌剤は体内に接種されることから、そこに含まれる樹状細胞は細胞増殖性を無くしておくとより安全である。例えば、臍帯血由来の単球は分化誘導することにより増殖能が極度に低下することが知られているが、細胞ワクチンとしてより安全に利用するため、加熱処理、放射線処理、あるいはマイトマイシンC処理などで処理し、ワクチンとしての機能を残したまま、増殖性をなくすことができる。例えば、X線照射を利用する場合、総放射線量1000〜3300 Radで照射することができる。マイトマイシンC処理法は、例えば、樹状細胞に25〜50 micro-g/mlのマイトマイシン Cを添加し、37℃、30〜60分間保温処理することができる。熱による細胞処理方法は、例えば、50〜65℃で20分間加熱処理を行うことができる。

樹状細胞の投与に際しては、アジュバント効果を高めるサイトカイン類を組み合わせることも有効である。このような遺伝子としては、例えば i）IL-2と一本鎖IL-12 との組み合わせ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (15): 8591-8596, 1999）、ii）IL-2とインターフェロン-γ（米国特許第 5,798,100号）、iii）単独で用いられる顆粒球コロニー刺激因子（GM-CSF）、iv）GM-CSF と IL-4 の組み合わせ（J. Neurosurgery 90 (6), 1115-1124 (1999)）などが挙げられる。

RNAウイルスが導入された樹状細胞は、患者自身のT細胞をin vivoで刺激するのに有用であり、あるいはこの樹状細胞はT細胞をin vitroで刺激するのにも有用である。感作したT細胞を患者に投与し、エクスビボ免疫療法を介して患者の腫瘍免疫を刺激することもできる。

本発明は、樹状細胞により刺激されたT細胞を含む抗癌剤の製造方法であって、（ａ）RNAウイルスを樹状細胞またはその前駆細胞に導入する工程、（ｂ）該細胞を成熟樹状細胞に分化させる工程、（ｃ）該成熟樹状細胞に癌抗原を提示させる工程、（ｄ）該成熟樹状細胞をT細胞に接触させる工程、を含む方法に関する。RNAウイルスを導入した樹状細胞はT細胞を活性化し、CTLを誘導する。樹状細胞で提示させる抗原は、RNAウイルスから発現させた癌抗原（またはそのプロセスされた産物）であってもよいし、外から樹状細胞にパルスしてもよい。得られたT細胞は癌治療のために使用できる。インビトロでT細胞と樹状細胞を接触させる場合、患者からT細胞を採取して、樹状細胞と接触させた後、T細胞をエクスビボ投与することが好ましい。

また本発明は、本発明の方法により製造した樹状細胞を用いて、癌を抑制する方法に関する。例えば癌患者において抗腫瘍免疫を刺激する治療を行うことができる。この方法は、樹状細胞を投与する工程を含む方法である。具体的には、ゲノム複製能を持つRNAウイルスのRNP複合体を有する樹状細胞の治療上有効量を、患者に投与する工程を含む方法である。本方法により、本発明の樹状細胞を投与しない場合に比べ、癌の増殖を抑制することが期待できる。RNAウイルスは、外来遺伝子を持たないものであってもよく、あるいは癌抗原、免疫刺激性サイトカイン、血管新生を阻害する蛋白質などの１つまたは複数をコードする遺伝子を持つものであってもよい。RNAウイルスが樹状細胞に導入されることにより、樹状細胞は活性化するので、外来遺伝子を持たないRNAウイルスを導入した樹状細胞を癌に投与することによっても、癌に対する患者の免疫系を活性化させることができる。この樹状細胞に、癌抗原ペプチドをパルスして、所望の抗原を提示させることで、癌抑制効果をより高めた樹状細胞を得ることができる。

本発明は、所望の固形癌に適用することができ、例えば舌癌、歯肉癌、悪性リンパ腫、悪性黒色腫(メラノーマ)、上顎癌、鼻癌、鼻腔癌、喉頭癌、咽頭癌、神経膠腫、髄膜腫、神経膠腫、肺癌、乳癌、膵癌、消化器癌（食道癌、胃癌、十二指腸癌、大腸癌）、扁平上皮癌、腺癌、肺胞上皮癌、睾丸腫瘍、前立腺癌、甲状腺癌、肝癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫などが挙げられる。対象となる癌は、好ましくは上皮癌であり、より好ましくは、皮膚扁平上皮癌、皮膚基底細胞癌、皮膚ボーエン病、皮膚ページェット病、皮膚悪性黒色腫などを含む皮膚癌である。

RNAウイルスを導入した樹状細胞を投与する場合は、一般的には10⁵〜10⁹細胞、好ましくは10⁶〜10⁸細胞、より好ましくは約10⁷細胞を患者の癌病巣に投与する。癌病巣とは、癌組織またはその周囲（例えば癌から5 mm以内、好ましくは3 mm以内）の領域を言う。なお投与量は、癌のタイプやステージ、導入遺伝子の有無等により適宜調節されてよい。RNAウイルスは外来遺伝子を搭載していなくても抗腫瘍効果が期待できるが、IFN-beta遺伝子または可溶性FGF受容体遺伝子などをRNAウイルスに搭載させることでより高い効果が得られる。また、樹状細胞を腫瘍に投与する前に、樹状細胞に腫瘍抗原を接触させるとより高い効果を得ることができる。樹状細胞への腫瘍抗原の接触は、樹状細胞と腫瘍細胞のcell lysate (細胞溶解物) とを混合する方法、腫瘍抗原ペプチドを樹状細胞にパルスする方法、あるいは樹状細胞に腫瘍抗原遺伝子を導入して発現させる方法などを用いることができる。また、IFN-beta、可溶性FGF受容体、またはそれらをコードする遺伝子を搭載する所望のベクターを、本発明の樹状細胞と共に癌病巣に直接注入することによっても抗腫瘍効果が得られる。すなわち、RNAウイルスを導入した樹状細胞の投与と、IFN-betaまたは可溶性FGF受容体による抗腫瘍処置との組み合わせは、本発明において好適である。

樹状細胞により活性化したT細胞を投与する場合は、例えばT細胞は、1 ｍ²の体表面積あたり約10⁵〜10⁹細胞、好ましくは10⁶〜10⁹細胞、より好ましくは10⁸〜10⁹細胞の用量で、静脈内注入によって投与され得る（Ridellら、1992、Science 257: 238-241 を参照）。注入は、所望の間隔（例えば、毎月）で繰り返され得る。投与後のレシピエントは、必要に応じて任意の副作用について、T細胞注入の間または注入後にモニターされてよい。このとき、T細胞は樹状細胞を得た患者と同じ患者から得ることが好ましい。あるいは、T細胞を患者から採取し、T細胞を刺激するために用いる樹状細胞は、HLA適合性の健常なドナーに由来してもよい。または逆に、樹状細胞を患者から採取し、T細胞はHLA適合性の健常なドナーに由来してもよい。

樹状細胞またはT細胞の投与回数は、１回または臨床上容認可能な副作用の範囲で複数回可能であり、１日の投与回数についても同様である。投与対象としては特に制限はないが、例えば、ニワトリ、ウズラ、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ネコ、ウシ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、サル、およびヒトなどを含む鳥類、哺乳動物（ヒトおよび非ヒト哺乳動物）が挙げられる。ヒト以外の動物に投与する場合は、例えば目的の動物とヒトとの体重比で上記の投与量を換算した量を投与することができる。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書中に引用された文献は、すべて本明細書の一部として組み込まれる。

A. 導入効率の検討
（実験１）
健常者より単球をネガティブセレクションで濃縮 (enrichment) した。単球の濃縮のためのネガティブセレクションは、RosetteSep^TM-human monocyte enrichment cocktail (Stem Cell Technology Inc.) を用いた。すなわち、tetrameric antibody（抗体2分子が結合している抗体で、一方は赤血球を認識する抗glycophorin A抗体、他方が単核球の表面抗原を認識する抗体でできている）を用い、除去したい細胞を赤血球に結合させ、Ficoll Paque^TM Plus (Pharmacia Biotech Inc.) で除去することにより実施した。このネガティブセレクションにより、CD2、CD3、CD8、CD19、CD56、CD66bを発現している細胞が除去され、残った細胞を単球濃縮細胞として、次のDCの分化誘導に用いた。この時のCD14⁺細胞は65-80％であった。単球濃縮細胞に GM-CSF (500 U/ml)とIL-4 (250 U/ml) を添加し、endotoxin free RPMI + 10%FCSで培養後、DCの作成を行った。3-4日目に半分の培養上清を同じ組成の新しい培養液で培養液交換を行った。副刺激分子（Costimulatory molecule）、ならびにCD11c、HLA-class II (DR, DP, DQ)、およびCD1aの発現が陽性であることを確認し、その他のlineage marker（CD3、CD56、CD19、CD15およびCD14）を表出していないことも確認した（図１および非提示データ）。この細胞を用いて、ウイルスの導入効率を検討した。この時点で、生細胞の90-98％がDCマーカー (CD11c、HLA-class II(DR,DP,DQ)) を発現していた。
なお、本実施例におけるセレクションは上記キットを用いたが、抗体でコートされた磁気ビーズを用いても、同様のセレクションを実施することが可能である。血球分離等をもちいて単核球を採取するなど、細胞を大量に調製する場合は、ビーズを用いることが好ましい。

（実験２）
実験１より得られたDC (分化誘導後7日目) に、緑色蛍光蛋白質 (GFP) を発現するセンダイウイルス (SeV-GFP)（伝播型、WO00/70070）をMOIをふって感染させ、経時的に細胞数の変化、GFPの発現、costimulatory moleculesの発現程度について検討した。その結果、MOIについては、MOI 20以上で%GFPは最大となった（図２〜５）。GFPの平均蛍光強度 (mean fluorescence intensity; MFI) については、MOI 100まで上げることにより更に上昇させることが可能である (非提示データ)。また、8日目までGFPのMFIは上昇した。costimulatory molecules (CD80およびCD86) については、全体的にMOI 20以上で最大となった。細胞数の減少については、MOIで1〜20の間はあまり変化ないが、MOI 50ではやや減少する傾向が見られたが有意差はなかった（図６）。

（実験３）
MOI 20でDCにSeV-GFPを感染させ、経時的にFACSを用いて、GFPの発現を検討した。その結果、2週以後は発現が低下する（細胞数も減少）ものの、2箇月までは発現細胞を確認できた（図７）。以下の実施例で示すように、RNAウイルスの感染でDCは活性化される。従って、RNAウイルスを用いたDCへの遺伝子導入は臨床応用として、ワクチンへの応用が可能である。投与はインビボでもエクスビボでも可能であるが、例えばエクスビボ投与によりRNAウイルスを感染させたDCを頻回投与することにより、長期にわたって体内における遺伝子発現を持続させることが可能である。

（実験４）
活性化と感染効率を検討した。活性化の有無でウイルスの感染効率が変化するかどうか検討を行った。7日間培養後のDCに2日間LPS (1 micro-g/ml) で刺激した後、SeV-GFPをMOI 30で感染、2日後にFACSでGFPを解析した。逆にSeV-GFP感染2日後にLPS刺激（2日間）を同じ条件で施行した。(図８および９）
結果；ヒトでは、LPSで活性化した後に、％GFPにおいて60%近くの陽性を認めた。これに対してマウスDCでは陽性率は極めて低かった (非提示データ)。しかしヒトにおいてもMFIは非常に低く、活性化した後のDCには遺伝子導入効率の極端な低下を認めた。これに対して、SeVを導入後にLPSで刺激しても、遺伝子導入効率は変化しなかった。この結果は、RNAウイルスを導入したDCを得るには、未成熟DC、すなわち活性化を受けていないDCを使用することが好ましいことを示している。

（実験５）
感染に必要な接触時間の検討を行った（図１０）。その結果、約30分以下で遺伝子導入が可能であることが判明した。

（実験６）
他のウイルスベクターでの報告でCD34細胞に遺伝子導入し、DC分化誘導で遺伝子導入DC作製に成功した報告がある (J. Immunol. Meth. 2002; 153-165)。SeV-GFPでも同様の方法を試みた。ヒト臍帯血より、CD34マイクロビーズを用いて、CD34陽性幹細胞を分離（CD34 >90％）し、MOI 0、10、100で感染させた後、良く洗浄した。その細胞をRPMI + 10%FCSにSCF (50 ng/ml)、GM-CSF (500 U/ml)、TNF-alpha (50 ng/ml) を添加し、3日間培養後、SCF (50 ng/ml)、GM-CSF (500 U/ml)、IL-4 (250 U/ml)、TNF-alpha (50ng/ml) を添加したメディウムで継代 (半量のメディウムを3〜4日に交換) したものをウイルス感染より13日目にGFPの発現を検討した。その結果、遺伝子導入効率は65〜70％に達し、他のベクター以上にGFPの発現効率の良いDCが作製された。感染後のDCは副刺激分子の発現の解析より、感染させていないものと比べて活性化を受けているものが回収された。（図１１および１２）
以上の実施例から、RNAウイルスはレンチウイルス、レトロウイルスに比較して、導入効率は格段に優れており、アデノウイルスに劣らない導入効率を極めて簡便に迅速に得ることができることが実証された。また、他のベクターでは活性化マーカーは変動しないが、RNAウイルスの感染によりDCを活性化を誘導できることが判明した。

B. 導入後のDC機能の評価
（実験１）
DCにSeV-GFPをMOI 30-50で感染させ、１日後にLPSで刺激（２日間）し、その後、costimulatory moleculesの発現を検討した。コントロールとして、LPS刺激のみ、SeV-GFP感染のみ、およびLPS刺激もSeV-GFP感染もなし、の条件について比較検討した。
結果；得られた結果から、SeV感染のみでもDCの活性化が起こることが示された。
LPSと匹敵するもの；CD80（+）HLA-DR（-）CD83（-）
LPSより強いもの；CD86（+）CCR7（-）
LPSより弱いもの；CD40（-）
(+)はLPS+SeVで相乗効果のあるものを表す。（図１３−１５）

（実験２）
MOI 30でDCにSeV-GFPを感染（感染後3日目、感染後1日目に、あるグループはLPSで刺激）させ、実験１と同様の群について、食細胞能力を検討した（1 micro-m PCV-RED latex-microspheres を使用。棒グラフは4℃で陽性となるバックグランドを差し引いたもの）。
結果；活性化マーカーでも見たように、SeVで感染したものは、活性化のため、貪食能の低下が見られた。特に、GFPの発現が高いもの程、貪食能が低かった。従って、例えばDCで腫瘍抗原を提示させるために腫瘍のlysateを使用する場合は、RNAウイルスをDCに導入する前にlysateとDCを共培養することが好ましい。（図１６−１７）

（実験３）
RNAウイルスによる樹状細胞の活性化に伴う樹状細胞サイトカイン産生能を検討するために、7日間の培養で得られた単球由来樹状細胞 (MoDC) を12穴のプレートで48時間（8x10⁵/2ml/well：メディウムはX-vivo15^TM+2%自己血清+ GM-CSF (500 U/ml)+IL-4 (250 U/ml))、以下の群の条件で培養した上清中のTNF-alpha、IL-1beta、IL-6、IL-8の値をLuminex^TM systemで測定した。SeVの感染はMOI 30で2日間培養した。
Unstimulated群：メディウムのみの群
Allantoic fluid群：SeVの浮遊液である鶏卵しょう尿液（SeVは含まない）60 micro-L添加した群
UV-SeV-GFP群：SeV-GFP溶液を紫外線照射し、replication能力を除去した溶液60 micro-L添加した群
SeV-GFP：SeV-GFP溶液を60 micro-L添加した群（replication-competent SeV）
結果：UV照射をしない複製可能なSeV（replication-competent SeV）でGFPを遺伝子導入した樹状細胞のみTNF-alpha、IL-1beta、IL-6を産生、IL-8の産生を増大した（図１８）。この時の、樹状細胞上のCD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DRの発現上昇はreplication-competent SeVのみで誘導された（図１９および２０）。このことは、SeVを樹状細胞に遺伝子導入するのみで、免疫応答時に重要な炎症性サイトカイン（proinflammatory cytokine）の樹状細胞による産生を惹起することができることを意味している。また、UV処理したSeVではサイトカイン産生を誘導できなかったことから、樹状細胞遺伝子導入時における樹状細胞の膜上のレセプターとSeVの接触による樹状細胞の活性化というよりも、SeVの感染後におこるウイルスゲノムRNAの増幅過程が、樹状細胞の活性化に重要であることも示唆している。

（実験４）
RNAウイルスによる樹状細胞の活性化に伴う樹状細胞抗原提示能を検討するために、上記と同様の実験群について、それらのDCを3000 radの放射線を照射した後、T細胞の活性化能力について検討した。（doseをふったDCと純化（CD3⁺>95%）のアロあるいはsyngenic T細胞と3日間共培養した）。SeV-GFPに対する反応の指標として、syngenic T細胞を用いた。
結果；DC比とT細胞の量が少なく差が比較的顕著でないが、SeV感染単独で、LPSに匹敵するアロT細胞刺激性を持っていることが示された（図２１）。なお、DCは放射線照射しないで用いることも可能である。

（実験５）
RNAウイルスによる樹状細胞の活性化に伴う樹状細胞抗原提示能を、現在もっとも樹状細胞成熟化能力が強力とされているサイトカインカクテル刺激による抗原提示能と比較した。7日間の培養で得られたヒト単球由来樹状細胞 (MoDC) を12ウエルのプレートで48時間培養した｛1 x 10⁶/2 ml/well：メディウムはX-vivo15^TM+2%自己血清+ GM-CSF (500 U/ml)+IL-4 (250 U/ml)、以下の群の条件で培養｝。なおRNAウイルスとして、F遺伝子を欠失し、温度感受性の変異MおよびHN蛋白質（M遺伝子: G69E, T116A, A183S、HN遺伝子: A262T, G264R, K461G）遺伝子を搭載し、且つ、持続感染型変異を有する変異PおよびL蛋白質（P遺伝子：L511F、 L遺伝子：N1197S, K1795E）遺伝子を搭載するセンダイウイルス（SeV-dFM^tsHN^tsPLmut-GFP (SeV/TS dFとも略称する)）も比較として用いた（WO2003/025570; Inoue M, et al. J Virol 2003;77:3238-3246; Inoue M, et al. Mol. Ther. 2003; 7(5):S37）。このウイルスは、感染した細胞において感染性ウイルス粒子を形成する能力を失っている。
・SeV(-)群：メディウムのみの群
・SeV-dFM^tsHN^tsPLmut-GFP群：SeV-dFM^tsHN^tsPLmut-GFP（GFPを搭載したF遺伝子欠損, M/HN/P/L変異型SeV）をMOI 50で添加した群
・SeV-GFP群：SeV-GFP（GFPを搭載した伝播型SeV）溶液ををMOI 50で添加した群
・サイトカインカクテル群：サイトカインカクテル群（IL-1β 50 ng/ml、IL-6 500 ng/ml、INF-α 2500 U/ml、TNF-α 100 ng/ml、PGE₂ 20μM）を添加した群
48時間後に得られたMoDCに30 Gy照射した後、そのMoDC（4 x 10⁴/ウエルから6.25 x 10²/ウエル）とアロの末梢血由来Ｔ細胞（1 x 10⁵/ウエル）｛アロの末梢血より、RosetteSep^TM-human T cell enrichment kit （StemCell Technologies, Vancouver, Canada)を用いて得られた96％以上の純度のT細胞｝を4日間培養した後、各ウエルに1μCiの[³H]-thymidineを添加し、8時間後の[³H]-thymidineの取り込み量をBeta Plate System (Pahrmacia LKB Biothechnology, Uppsala, Sweden) でカウントした。メディウムはX-vivo15^TM+2%自己血清を使用した。示された図のX軸はウエルあたりの培養MoDC数/ウエルあたりのT細胞数（=1 x 10⁵）、Y軸は[³H]-thymidine取り込み量（cpm）を示す（図２２）。
結果：刺激していない樹状細胞と比較し、SeV-GFPを感染させた樹状細胞はアロのT細胞を有意に増殖させ、その能力は、ポシティブコントロールで、現在もっとも樹状細胞成熟化能力が強力とされているサイトカインカクテル刺激と同等以上であった。この抗原提示能力の程度はF欠損型HN温度感受性SeV（SeV-dFM^tsHN^tsPLmut-GFP）を感染させた樹状細胞でもほぼ同等であった（図２２）。

C. 癌抗原特異的CTLの誘導
Aに記載の方法でヒト末梢血（HLA-A 0201の健常ドナー）より、CD14⁺細胞を濃縮し、x-vivo 15^TM (Cambrex社製) + 2% autologous serumをメディウムとして、GM-CSF (500U/ml)、IL-4 (250U/ml) を添加（3〜4日に一度、半量のメディウムを交換）、未熟樹状細胞を作製した。作製した未熟樹状細胞を次の3群に分け、更に48時間GM-CSF (500U/ml)、IL-4 (250U/ml) の存在下に培養した。
１群 何も加えない
２群 SeV-GFPの感染 (MOI 30）
３群 サイトカインのカクテル (IL-1β 50ng/ml、IL-6 500ng/ml、IFN-α 2500U/ml、TNF-α 100ng/ml、PGE2 20 micro-M) による刺激
その後、樹状細胞を回収して、MART-1ペプチド (EAAGIGILTV (配列番号：１)) をパルス（50 micro-g/ml；３時間）して、樹状細胞を採取したのと同じ健常人末梢血のT細胞をネガティブセレクションで濃縮 (CD3⁺>97%) して、ペプチドパルスした上記３群の樹状細胞と７日間培養した（X-vivo 15^TM + 2%autologous serum）。（３-４日毎、あるいはメディウムの黄変時に半量のメディウムを交換した。最初の刺激時はIL-2なしでT細胞と樹状細胞を混合培養し、3日目からIL-2を100 U/ml添加開始した。）これを2回繰り替えし、それぞれの混合培養から、細胞を回収し、CTL assayのエフェクター細胞として使用した。
ターゲット細胞は、T2細胞（HLA-A2⁺の人から得られたT細胞-B細胞ハイブリドーマでTAP欠損細胞株）を使用した。この細胞は、TAP（class Iへのトランスポーター）がないため、細胞質内の蛋白の分解により産生されたペプチドをClass Iに誘導できないことから、ペプチドを外来から添加するとそのペプチドがClass Iにload されて、Class Iの発現が起こる。このターゲットを変異MART-1ペプチド (ELAGIGILTV (配列番号：２))（上記の刺激で使用したペプチドに対してT細胞レセプター認識部は変化なく、HLA-A2の結合を強めたもの）をパルスしたもの、Infuluenzaのペプチド (Flu; third partyとしてのペプチド; GILGFVFTL (配列番号：３)) をパルスしたものを作製し、Crで細胞をラベルし、上記３群のエフェクターT細胞とこの2種類のtargetを20:1、10:1、5:1、2.5:1 で４時間混合培養してCTL活性を調べた。
以下に実験の組み合わせをまとめた。
──────────────────────────────────
エフェクター細胞 ターゲット細胞 図のシンボル
1群のエフェクターT細胞 変異MART1ペプチド + T2細胞 実線の黒四角
2群のエフェクターT細胞 変異MART1ペプチド + T2細胞 実線の黒三角
3群のエフェクターT細胞 変異MART1ペプチド + T2細胞 実線の黒逆三角
1群のエフェクターT細胞 Fluペプチド + T2細胞 点線の黒菱形
2群のエフェクターT細胞 Fluペプチド + T2細胞 点線の黒丸
3群のエフェクターT細胞 Fluペプチド + T2細胞 点線の白四角
──────────────────────────────────
結果；上記3群のDCで活性化をしていないDC（MART1ペプチド＋）でT細胞を刺激しても、MART-1特異的CTLは誘導できないが、ポジティブコントロールとして、サイトカインで活性化（現在腫瘍免疫の樹状細胞療法で最も強く活性化できる方法）した樹状細胞で、T細胞を刺激するとMART-1特異的CTLが誘導できた（ターゲットにパルスする変異MART-1ペプチドに替えて、刺激に用いたMART-1ペプチドを用いても同様の結果が得られた）。SeVを導入した樹状細胞を使用した場合、ポジティブコントロールと同程度のCTL活性が得られた（図２３）。つまり、CTLアッセイで判定した場合、SeVを感染させるだけで樹状細胞は活性化され、サイトカインで活性化した樹状細胞と同じレベルにin vitroでCTLを誘導できることが示された。T細胞賦活化としてSeVを使用すれば、標的遺伝子の導入とともに活性化が起こせるので、サイトカインなどの活性化因子を添加する必要がなくなり、コスト節減、時間節減、細胞のviabilityの保持に寄与する。

D. RNAウイルス導入DCによる癌増殖抑制
本実施例は、RNAウイルスのインビボおよびエクスビボ投与による腫瘍の治療方法の一例を示す。
（実験１）
腫瘍モデルとして、MHC Class Iを非常に低いレベルでしか発現せず免疫原性に乏しいB16メラノーマの移植モデルを採用した。腫瘍モデルマウスには、C57BL/6マウス（6〜8週齢、メス）（日本チャールズ・リバー）を用い、樹状細胞はC57BL/6マウス（8週齢、メス）（日本チャールズ・リバー）より採取した。樹状細胞は、C57BL/6 マウスの大腿骨より骨髄を採取し、SpinSep^TM, murine hematopoetic progenitor enrichmentcocktail (抗CD5抗体, 抗CD45R抗体, 抗CD11b抗体, 抗Gr-1抗体,抗TER119抗体, 抗7/4抗体、StemCell technology) を使用し、T cell を除去した後、IL-4およびGM-CSFを添加し1週間培養して得た。1 x 10⁵/100 micro-L のB16メラノーマ細胞をday 0にマウスの腹部皮下 (s.c.) 接種した。Day 10、17、および24に、活性化刺激を加えない樹状細胞、LPSで活性化させた樹状細胞 (LPS DC)、あるいはSeV-GFPまたはマウス インターフェロンβを発現するSeV-IFNβを導入して活性化させた樹状細胞 (それぞれSeV GFP DCまたはSeV IFNβ DC) を腫瘍周囲に投与した。このとき、樹状細胞に腫瘍抗原（B16のfreeze and thawによる腫瘍ライセート）をパルスしてから投与する実験も行った。これらとは別に、腫瘍接種後10日目 (day 10) にSeV-IFNβを直接、腫瘍内注入 (intratumoral injection) して抗腫瘍効果を調べる実験も行った。
樹状細胞へのSeVの導入では、上記のように1週間培養した樹状細胞にSeV-IFNβをMOI 40で感染させ、8時間培養した。腫瘍抗原をパルスする場合は、上記のように1週間培養した樹状細胞を回収し、腫瘍抗原となるtumor lysateをパルス (DC : tumor lysate= 1 : 3) し、18時間培養した後、SeV-IFNβをMOI 40で感染させ、8時間培養した。その後、これらの樹状細胞を回収し、5x10⁵ から 10x10⁵ 細胞数をマウスの腫瘍周囲に投与した。

図２４に示すように、SeV-IFNβの直接腫瘍内注入および樹状細胞を介したエクスビボ投与は、どちらも腫瘍増殖を抑制した。特にDC/SeV-IFNβで処理したマウスでは、非常に強い腫瘍抑制効果が観察された。

上記の各治療群における抗腫瘍効果をより詳細に検討した。ナチュラルキラー (NK) 細胞活性をアッセイするために、上記の各治療群について、3回のDC療法終了7日後のマウスより脾臓を摘出し、エフェクター細胞を作成した。ターゲットとしてYac-1を使用し、⁵¹Cr放出アッセイを行った。また、Tリンパ球の細胞傷害性をアッセイするため、上記のNK細胞活性アッセイに使用した脾臓細胞の残りを用いて、B16の腫瘍抗原であるTRP-2ペプチドとともに、5日間培養した細胞をエフェクター細胞として用い、mTRP-2ペプチドをパルスしたEL-4ターゲット細胞と共培養し、⁵¹Cr放出アッセイを行った。特異的⁵¹Cr放出の割合は以下のように計算した。
[(試料のcpm - 自発放出のcpm) / (最大放出のcpm - 自発放出のcpm)] x 100
ここで、最大放出は1% triton X と共にインキュベートしたターゲット細胞、自発放出は培養液のみでインキュベートしたターゲット細胞を用いた。

ナチュラルキラー (NK) 細胞の活性化は、直接SeVを注入したマウスにのみ見られ、樹状細胞投与群では検出されなかった（図２５）。これに対して、細胞傷害性Tリンパ球 (cytotoxic T-lymphocytes, CTL) の活性化は、DC/LPS処理群およびDC/SeV-IFNβで処理したマウスで最も強く、DC/SeV-GFP処理群ではそれよりも若干弱く、SeV-IFNβの直接注入群では検出されなかった（図２６）。腫瘍ライセートのパルスは、腫瘍増殖にもCTL応答にも有意に影響しなかった。このように、SeVにより免疫刺激性サイトカイン遺伝子を導入した樹状細胞を用いた腫瘍免疫治療は、強い抗腫瘍治療効果を発揮することが示された。DC/LPS処理群とDC/SeV-IFNβ処理群の間でCTL活性に若干の違いがあるにも関わらず、同程度の抗腫瘍効果が見られた。このように、SeV-IFNβの直接投与はNK細胞を強く活性化する一方で、樹状細胞を介した間接投与はCTL活性を誘導することが判明した。従って、これらを組み合わせた治療はより効果を発揮することが期待される。

（実験２）
メラノーマ細胞株 B16F1（ATCC CRL-6323）1×10⁵個を、C57BL/6マウス（６〜８週齢、雌）の腹側皮下へ接種した（n = 4）。接種後5日（day 5）および12日（day 12）に、特別な治療遺伝子を有さないSeV（GFP発現SeV；SeV-GFP）、ヒト可溶型FGF受容体を発現するセンダイウイルス（SeV-sFGFR）、またはヒトPDGFRα可溶型を発現するSeV-hsPDGFRα、各1×10⁸PFUを腫瘍内注射し、以降、腫瘍サイズを経時的に測定した。その結果、いずれのSeV投与群においても、SeV非投与群に比べて腫瘍サイズが有意に縮小した（図２７）。このように、SeVのインビボ投与は、治療遺伝子を持たないものであっても抗腫瘍効果を発揮することができた。可溶型FGF受容体を発現するSeVを投与した場合は、SeV-GFP投与群よりも強い腫瘍増殖抑制効果が確認され、可溶型PDGFRαを発現するSeVを投与した場合の抗腫瘍効果は最も顕著で、腫瘍サイズはほどんど増加しなかった。

（実験３）
メラノーマ細胞株 B16F1（ATCC CRL-6323）1×10⁵個を、C57BL/6マウス（６週齢、雌）の腹側皮下へ接種した（n = 4）。それとは別に、C57BL/6マウス（６〜８週齢、雌）の骨髄細胞を採取し、SpinSep^TM （STEM CELL TECHNOLOGIES, INC）によるCD45R、CD5、CD11b、TER119、Gr-1、7-4のネガティブセレクションにて抽出した細胞をGM-CSF 250IU/ml、IL-4 250IU/ml存在下に７日間培養し、マウス骨髄細胞由来の樹状細胞を得た。その樹状細胞に、治療遺伝子を有さないセンダイウイルス（GFP発現SeV；SeV-GFP）をMOI 60、あるいはヒト可溶型PDGFα受容体を発現するセンダイウイルス（SeV-hsPDGFRα）、腫瘍抗原TRP2を発現するセンダイウイルス（SeV-TRP2）、または腫瘍抗原gp100を発現するセンダイウイルス（SeV-gp100）をそれぞれMOI 20ずつで感染させ、遺伝子導入を行った。

B16F1の接種後10日（day 10）および17日（day 17）に、SeV-GFPまたはSeV-hsPDGFRαを導入した樹状細胞1×10⁶個を腫瘍内注射し、以降、腫瘍サイズを経時的に測定した結果を図２８に示した。上記のウイルスのインビボ投与と同様に、SeV-GFPを導入した樹状細胞を投与したマウスでも、SeV未導入樹状細胞を投与したマウスに比べ腫瘍サイズが有意に縮小した。SeVによる抗腫瘍効果は、樹状細胞を用いたエクスビボ投与の方が、SeVのインビボ投与よりも顕著であった（図２８）。可溶型PDGFRαを発現するSeVを投与した樹状細胞のエクスビボ投与では抗腫瘍効果はさらに上昇し、腫瘍サイズはほどんど増加しなかった。

本発明により、RNAウイルスが導入された樹状細胞を有効成分とする抗癌剤が提供された。RNAウイルスの導入は樹状細胞の活性化を惹起するため、導入後のサイトカインなどでの活性化処理の工程が省略可能で、細胞のviabilityの維持やコスト削減、さらなるex vivoでの操作時間の削減に寄与するものと考えられる。本発明は、RNAウイルスと樹状細胞を組み合わせた新たなウイルス療法を可能にする。

Claims (24)

1. ゲノム複製能を持つセンダイウイルスを未成熟樹状細胞に導入することにより成熟化が誘導されて製造された成熟樹状細胞を含む抗癌剤であって、該センダイウイルスは下記（１）から（７）からのいずれかである抗癌剤。
   （１）実施例Ａの実験２に記載のSeV-GFP、
   （２）（１）からGFP遺伝子を除去したウイルス、
   （３）（２）に所望の外来遺伝子を導入したウイルス、
   （４）（１）〜（３）において少なくとも１つのセンダイウイルス遺伝子を欠失および/または変異させたウイルス、
   （５）実施例Ｂの実験５に記載のSeV-dFM^tsHN^tsPLmut-GFP、
   （６）（５）からGFP遺伝子を除去したウイルス、または、
   （７）（６）に所望の外来遺伝子を導入したウイルス。
2. 該センダイウイルスが、前記（２）または（６）のウイルスである、請求項１に記載の抗癌剤。
3. 該センダイウイルスが、前記（３）または（７）のウイルスである、請求項１に記載の抗癌剤。
4. 該欠失が、F遺伝子および/またはHN遺伝子の欠失である、請求項１に記載の抗癌剤。
5. 該変異が、温度感受性変異である、請求項１に記載の抗癌剤。
6. 該センダイウイルスが、前記（１）〜（３）のウイルスにおいて、M蛋白質の69番目のGly、116番目のThr、183番目のAla、HN蛋白質の262番目のAla、264番目のGly、461番目のLys、P蛋白質の86番目のGlu、511番目のLeu、L蛋白質の1197番目のAsn、1795番目のLysの変異、F遺伝子欠失、およびHN遺伝子欠失からなる群より選択される欠失および/または変異を導入したウイルスである、請求項１に記載の抗癌剤。
7. 該M蛋白質の69番目のGly、116番目のThr、183番目のAla、HN蛋白質の262番目のAla、264番目のGly、461番目のLys、P蛋白質の86番目のGlu、511番目のLeu、L蛋白質の1197番目のAsn、1795番目のLysの変異が、それぞれM蛋白質の69番目のGlyがGlu、116番目のThrがAla、183番目のAlaがSer、HN蛋白質の262番目のAlaがThr、264番目のGlyがArg、461番目のLysがGly、P蛋白質の86番目のGluがLys、511番目のLeuがPhe、L蛋白質の1197番目のAsnがSer、1795番目のLysがGluに置換される変異である、請求項６に記載の抗癌剤。
8. 該センダイウイルスが、前記（１）〜（３）のウイルスにおいて、F遺伝子を欠失し、かつM蛋白質の69番目のGlyがGlu、116番目のThrがAla、183番目のAlaがSer、HN蛋白質の262番目のAlaがThr、264番目のGlyがArg、461番目のLysがGly、P蛋白質の86番目のGluがLys、511番目のLeuがPhe、L蛋白質の1197番目のAsnがSer、1795番目のLysがGluに置換されたウイルスである、請求項１に記載の抗癌剤。
9. 該センダイウイルスが癌抗原をコードしない、請求項１から８のいずれかに記載の抗癌剤。
10. 該センダイウイルスが感染性ウイルス粒子を形成しないウイルスである、請求項１から９のいずれかに記載の抗癌剤。
11. 該センダイウイルスが感染性または非感染性ウイルス粒子である、請求項１から１０のいずれかに記載の抗癌剤。
12. 該センダイウイルスがゲノムRNA−蛋白複合体である、請求項１から１０のいずれかに記載の抗癌剤。
13. 該センダイウイルスが可溶性FGF受容体またはIFN-βをコードする、請求項１、３〜１２のいずれかに記載の抗癌剤。
14. 該センダイウイルスが外来遺伝子をコードしない、請求項１〜２、４〜１２のいずれかに記載の抗癌剤。
15. ゲノム複製能を持つセンダイウイルスを未成熟樹状細胞に導入する工程を含む、該導入により成熟化が促進された樹状細胞を含む抗癌剤の製造方法であって、該センダイウイルスは下記（１）から（７）からのいずれかである方法。
    （１）実施例Ａの実験２に記載のSeV-GFP、
    （２）（１）からGFP遺伝子を除去したウイルス、
    （３）（２）に所望の外来遺伝子を搭載させたウイルス、
    （４）（１）〜（３）において少なくとも１つのセンダイウイルス遺伝子が欠失および/または変異したウイルス、
    （５）実施例Ｂの実験５に記載のSeV-dFM^tsHN^tsPLmut-GFP、
    （６）（５）からGFP遺伝子を除去したウイルス、または、
    （７）（６）に所望の外来遺伝子を導入したウイルス。
16. 該センダイウイルスが前記（２）または（６）のウイルスである、請求項１５に記載の方法。
17. 該センダイウイルスが、前記（３）または（７）のウイルスである、請求項１５に記載の方法。
18. 該欠失が、F遺伝子および/またはHN遺伝子の欠失である、請求項１５に記載の方法。
19. 該変異が、温度感受性変異である、請求項１５に記載の方法。
20. 該センダイウイルスが、前記（１）〜（３）のウイルスにおいて、M蛋白質の69番目のGly、116番目のThr、183番目のAla、HN蛋白質の262番目のAla、264番目のGly、461番目のLys、P蛋白質の86番目のGlu、511番目のLeu、L蛋白質の1197番目のAsn、1795番目のLysの変異、F遺伝子欠失、およびHN遺伝子欠失からなる群より選択される欠失および/または変異を導入したウイルスである、請求項１５に記載の方法。
21. 該M蛋白質の69番目のGly、116番目のThr、183番目のAla、HN蛋白質の262番目のAla、264番目のGly、461番目のLys、P蛋白質の86番目のGlu、511番目のLeu、L蛋白質の1197番目のAsn、1795番目のLysの変異が、それぞれM蛋白質の69番目のGlyがGlu、116番目のThrがAla、183番目のAlaがSer、HN蛋白質の262番目のAlaがThr、264番目のGlyがArg、461番目のLysがGly、P蛋白質の86番目のGluがLys、511番目のLeuがPhe、L蛋白質の1197番目のAsnがSer、1795番目のLysがGluに置換される変異である、請求項２０に記載の方法。
22. 該センダイウイルスが、前記（１）〜（３）のウイルスにおいて、F遺伝子を欠失し、かつM蛋白質の69番目のGlyがGlu、116番目のThrがAla、183番目のAlaがSer、HN蛋白質の262番目のAlaがThr、264番目のGlyがArg、461番目のLysがGly、P蛋白質の86番目のGluがLys、511番目のLeuがPhe、L蛋白質の1197番目のAsnがSer、1795番目のLysがGluに置換されたウイルスである、請求項１５に記載の方法。
23. 該センダイウイルスが癌抗原をコードしない、請求項１５から２２のいずれかに記載の方法。
24. 該センダイウイルスが外来遺伝子をコードしない、請求項１５〜１６、１８〜２３のいずれかに記載の方法。