JP2001503385A - ポリヌクレオチド送達のための組成物および方法 - Google Patents

ポリヌクレオチド送達のための組成物および方法

Info

Publication number
JP2001503385A
JP2001503385A JP50831998A JP50831998A JP2001503385A JP 2001503385 A JP2001503385 A JP 2001503385A JP 50831998 A JP50831998 A JP 50831998A JP 50831998 A JP50831998 A JP 50831998A JP 2001503385 A JP2001503385 A JP 2001503385A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
polynucleotide
polycationic
polycationic agent
agent
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP50831998A
Other languages
English (en)
Other versions
JP4320054B2 (ja
Inventor
ズカーマン，ロナルド
デュボワ―ストリングフェロウ，ナタリー
ドワルキ，バラバニ
エイ． イニス，マイケル
イー． マーフィ，ジョン
コーヘン，フレッド
ウノ，テツオ
Original Assignee
カイロン コーポレイション
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by カイロン コーポレイション filed Critical カイロン コーポレイション
Publication of JP2001503385A publication Critical patent/JP2001503385A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4320054B2 publication Critical patent/JP4320054B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/2264—Obesity-gene products, e.g. leptin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1816—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/80—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates
    • C12N2810/85—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian
    • C12N2810/858—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian from apolipopeptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dermatology (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞中へのポリヌクレオチドの取り込みを増加させるための組成物および方法に関する。詳細には、本発明は、ベクター、標的化リガンド、およびポリカチオン性薬剤に関する。ポリカチオン性薬剤は、(1)細胞中へのポリヌクレオチドの取り込みの頻度を増加し得、(2)ポリヌクレオチドを縮合し得、そして(3)ポリヌクレオチドの血清および／またはヌクレアーゼ分解を阻害し得る。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリヌクレオチド送達のための組成物および方法 説明 発明の分野 本発明は、細胞中へのポリヌクレオチドの取り込みを増加させるための組成物 および方法に関する。詳細には、本発明は、ベクター、標的リガンド、およびポ リカチオン性薬剤に関する。ポリカチオン性薬剤は、(1)細胞中へのポリヌクレ オチドの取り込みの頻度を増加し得、(2)ポリヌクレオチドを縮合し得、そして( 3)ポリヌクレオチドの血清および／またはヌクレアーゼ分解を阻害し得る。発明の背景 ポリカチオン（例えば、ポリリジン）は、核酸の細胞内への送達を容易にする ために使用されてきている。インビトロおよびインビボの両方の適用は、この特 性の利点を得ている。例えば、Gaoら，1996，Biochem．35:1027-1036を参照のこ と。 ポリヌクレオチド（代表的には、DNA）は、レセプター媒介エンドサイトーシ ス経路（特定の巨大分子を内部移行する細胞機構）によって、細胞中へ取り込ま れ得る。一般に、この様式で送達されるように設計された複合体は、目的の遺伝 子をコードする核酸およびポリカチオン性薬剤を含み、これはDNA結合キャリア として作用し、そして核酸上の電荷を中和し、かつそれを縮合する。 縮合は、巨大分子構造を刺激することによって、核酸の細胞ベシクル系への侵 入を容易にする。例えば、ポリリジンは、DNAを、トロイドまたはドーナッツ様 構造に縮合する。(Wagnerら，1991，Proc．Natl．Acad．Sci．88:4255-4259)。 細胞内への核酸送達のために以前に利用されたポリカチオンは、ポリリジン、 プロタミン、ヒストン、スペルミン、スペルミジン、ポリオルニチン、ポリアル ギニン、およびプトレシンを含む。 本明細書中で言及されるすべての刊行物は、刊行物がそれに関連して引用され る本発明の特徴を開示および記載する目的のために本明細書中で参考として援用 される。発明の要旨 本発明の１つの実施態様は、ポリペプチドの発現のためのベクターである。本 発明のベクターは以下を含む：(i)エプスタイン・バーウイルス(EBV)の複製起点 ；(ii)EBV起点結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド；(iii)エンハンサ ー；(iv)プロモーター；および(v)ターミネーター。所望のポリペプチド（例え ば、エリスロポエチンまたはレプチン）をコードするポリヌクレオチドは、ベク ターに挿入され得る。また、リボザイムおよびアンチセンスポリヌクレオチドは また、ベクターに挿入され得る。 本発明の一つの実施熊様は、ポリヌクレオチドを特定の細胞型に標的化し得る 組成物である。組成物は以下を含む：(i)リポタンパク質；(ii)ポリヌクレオチ ド結合分子；および(iii)ポリヌクレオチド。 本発明の別の実施態様は、細胞を以下を含む組成物と接触させることによって 、細胞へのポリヌクレオチドの取り込みの頻度を増加させる方法である：(i)リ ポタンパク質；(ii)ポリヌクレオチド結合分子；および(iii)ポリヌクレオチド 。 本発明のさらに別の実施態様は、細胞の集団を以下を含む組成物と接触させる ことによって、特定の細胞型へのポリヌクレオチドの取り込みの頻度を増加させ る方法である：(i)リポタンパク質、(ii)ポリヌクレオチド結合分子；および(ii i)ポリヌクレオチド。 本発明の一つの実施態様は、以下の式を有する生理学的pHにて正味の正電荷を 示すポリカチオン性薬剤である： ここで、TaおよびTcは末端基である。これらの化合物の好ましいサブセットは、 Ｒ2が水素であるセットである。さらにより好ましくは、少なくとも１つの非天 然アミノ酸を含むポリマーである。さらに好ましくは、Ｒ2およびＲ3が水素で あり、そしてＲ1が水素ではないポリマー（ポリN-置換グリシンまたは「ポリNSG 」ともいわれる）である。 別の実施態様は、以下の式を有する、生理学的pHにて正味の正電荷も負電荷も 示さない中性のポリマーである。 ここで、TaおよびTcは末端基である。これらの化合物の好ましいサブセットは、 Ｒ2が水素である七ットである。さらにより好ましくは、少なくとも１つの非天 然アミノ酸を含むポリマーである。また好ましくは、Ｒ2およびＲ3が水素であり 、そしてＲ1が水素でないポリマー（ポリN-置換グリシンまたは「ポリNSG」とも いわれる）である。 本発明のポリカチオン性薬剤および中性ポリマーは、核酸の電荷を中和し得る 。これらの化合物のサブセットは、(1)ポリヌクレオチドの構造を縮合し得、そ して／または(2)血清および／もしくはヌクレアーゼ分解からポリヌクレオチド を保護し得る。 本発明のさらに別の実施態様は、(1)核酸の細胞表面への結合を標的化するか 、(2)細胞膜の不安定化を誘発するか；(3)エンドソーム緩衝能を示すか；(4)エ ンドサイトーシスを誘発するか；(5)エンドソームからのポリヌクレオチド／脂 質複合体の放出の誘発を助けるか：または(6)核屈性(nuclear tropism)をするポ リカチオン性薬剤および中性ポリマーである。 本発明の別の実施態様は、目的のポリヌクレオチド、およびポリヌクレオチド の電荷を中和するに有効な量のポリカチオン性薬剤を含む組成物である。必要に 応じて、組成物は、リガンド結合パートナーを発現する特定の細胞に複合体を指 向するリガンド、および／またはエンドソーマル薬剤を含み、それは、複合体を 含むエンドソームの破壊を引き起こすように作用する。 本発明の別の実施熊様は、有効量のポリカチオン性薬剤または本発明の中性ポ リマーを提供する工程、および薬剤を所望のポリヌクレオチドと接触させる工程 によって、核酸を縮合する方法である。 本発明の実施態様はまた、有効量のポリカチオン性薬剤または本発明の中性ポ リマーを提供し、そして薬剤を所望の核酸と接触させることによって、核酸の血 清および／またはヌクレアーゼ分解を阻害する方法である。図面の簡単な説明 図１は、２工程のモノマーアセンブリ反応スキームの模式図である。 図２は、３工程のモノマーアセンブリ反応スキームの模式図である。 図３は、ベクターpCMVKmITR-EPIのプラスミドマップである。 図４は、ベクターCMVkm2のプラスミドマップである。 図５は、ベクターpCMV-KM-cmEPOのプラスミドマップである。 図６は、ベクターCMVKmLeptinWtのプラスミドマップである。 図7Aは、ポリカチオン性薬剤の多様なセットについてのトランスフェクション 効率を示す。ポリカチオン性薬剤を、２：１の＋対−の電荷比でDNAとともに処 方し、そして10％血清の存在下で、HT1080（実線）またはCOS（点線）のいずれ かに添加した。ルシフェラーゼ活性を、トランスフェクションの48時間後に分析 した。全細胞タンパク質を、Pierce BCAアッセイを用いて測定し、そしてルシフ ェラーゼ活性を、全細胞タンパク質に対して規準化した。 図7Bは、異なる数の同じ繰り返しトリマーモチーフを有するポリカチオン性薬 剤についてのトランスフェクション効率に対するオリゴマーの長さの効果を示す 。ＡおよびＢの両方について、各データの点は、２つの実験の平均を示す。 図8(A〜C)は、RZ145-1ペプハイド媒介トランスフェクション、および市販のカ チオン性リポソーム調製物によって媒介されるトランスフェクションを示す。RZ 145-1または示される脂質を処方し、そして10％血清の存在下（実線）または非 存在下（点線）で細胞に添加した。ルシフェラーゼおよび全細胞タンパク質活性 を、初期のトランスフェクションの48時間後に測定した。細胞株は、(図8A)293 ヒト胚腎臓細胞、（図8B）HT1080ヒト線維肉腫細胞、および（図8C）NIH03T3マ ウス線維芽細胞である。各データの点は、３つのトランスフェクションの平均の 平均＋標準誤差を示す。 図９は、(A)293細胞および(B)HT1080細胞におけるRZ145-1でのトランスフェ クションに対するクロロキンの効果を示す。細胞を、100μＭのクロロキンの存 在下（黒線）または非存在下（点線）でトランスフェクトした。細胞を、トラン スフェクションの48時間後に溶解し、そしてルシフェラーゼ活性および全タンパ ク質内容物を測定した。詳細な説明 定義「リポタンパク質」は、血流中の脂質と非共有結合し、そして細胞レセプターに 結合し得るポリペプチドをいう。好ましくは、リポタンパク質は、脂質の輸送お よび貯蔵と関係するものである。このようなタンパク質には、例えば、キロミク ロン、低密度リポタンパク質(LDL)、超低密度リポタンパク質(VLDL)、中間密度 リポタンパク質(IDL)、および高密度リポタンパク質が含まれる。また、この用 語には、天然に存在するリポタンパク質の変異体、フラグメント、または融合体 が含まれる。また、天然に存在するリポタンパク質の改変体(例えば、アセチル 化LDL)もまた、使用され得る。 天然に存在するリポタンパク質の変異体、フラグメント、融合体、または改変 体は、天然に存在するリポタンパク質またはそのフラグメントに対して実質的な 配列同一性を示すアミノ酸配列である。これらポリペプチドは、約80％を超える 、より代表的には、約85％を超える、なおより代表的には、少なくとも90％の、 アミノ酸同一性保持する。これらポリペプチドは、天然に存在するリポタンパク 質またはそのフラグメントと、好ましくは約92％を超える、より好ましくは約94 ％を超える、なおより好ましくは約96％を超える、なおより好ましくは約98％を 超える、なおより好ましくは約99％を超える、アミノ酸配列同一性を示す。これ らポリペプチドのすべてが、天然に存在するリポタンパク質のレセプター結合特 性を示す。通常、このようなポリペプチドは、天然に存在するリポタンパク質の 少なくとも約20％のレセプター結合を示す。より代表的には、ポリペプチドは、 天然に存在するリポタンパク質のレセプター結合の少なくとも約40％を示し、ポ リペプチドは、なおより代表的には、少なくとも約60％、なおより代表的には少 なくとも約70％、なおより代表的には少なくとも約80％、なおより代表的には少 な くとも約85％、なおより代表的には少なくとも約90％、なおより代表的には少な くとも約95％を示す。 「ポリヌクレオチド結合分子」は、ポリヌクレオチドと結合する(この結合は配 列特異的ではない)化合物をいう。例えば、このような分子は、(１)ポリヌクレ オチドの電荷の中和を助け得るか、または(２)ヌクレオチドの縮合を容易にし得 るか、あるいは(３)血清もしくはヌクレアーゼ分解を阻害し得る。 「ポリカチオン性薬剤」は、一般に、正に荷電した単一の単位を含むポリマーを いう。しかし、いくつかの正に荷電していない単位がそのポリマー中に存在し得 る。この薬剤は、生理学的に適切なpH下で正味の正電荷を示す。このような薬剤 は核酸の電荷を中和し得、そしてさらなる特性(例えば、核酸の縮合および/また は血清保護)を示し得る。好ましくは、この薬剤は、モノマー単位として、アミ ノ酸およびNSGの両方を含む。モノマー単位としてNSGを含む薬剤もまた好ましい 。 「生理学的に適切なpH」は、インビトロ適用とインビボ適用との間でいくらか変 化する。生理学的pHは、代表的には少なくとも5.5；より代表的には少なくとも6 .0；なおより代表的には少なくとも6.5である。生理学的に適切なpHは、通常8.5 を超えず、より通常には8.0を超えず、なおより通常には7.5を超えない。 「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、DNA、RNA、それらのアナログ、ペプチド −核酸、およびリン酸を含まないヌクレオチドを有するDNAまたはRNAをいう。さ らに、これら核酸は、一本鎖分子、二本鎖分子、またはキメラの一本鎖分子もし くは二本鎖分子であり得る。 用語「オリゴマー」は、本明細書中に記載され、そしてまたZuckermannら(前出) にも記載されたサブモノマープロセスにより生成される、ポリNSGのようなポリ マーを含み、任意の長さのポリマー、コポリマー、およびインターポリマーを含 む。より詳細には、オリゴマーは、単一の反復モノマー、２つの択一的モノマー 単位、互いに対して無作為および/または故意に間隔を開けた２以上のモノマー 単位を含み得る。生成されるポリアミドのタイプに関わらず、本発明のポリアミ ドは、２工程または３工程サイクルの繰り返し(ここで、新しいモノマー単位が 、所望の長さのオリゴマーが得られるまで、各サイクルにおいて添加される)を 含む同じ一般的な手順によって生成され得る。オリゴマーは、長さが、好ましく は ２〜100モノマー、より好ましくは２〜50モノマー、または18〜28モノマー、あ るいは24〜48モノマーである。 用語「細胞へのポリヌクレオチドの取り込み頻度」は、細胞に実際に投与された 量に対する、その細胞によって実際に取り込まれるポリヌクレオチドの量の増加 をいう。細胞へのポリヌクレオチドの取り込み頻度が、裸のポリヌクレオチドの 取り込み頻度より多い場合、細胞へのポリヌクレオチドの取り込み頻度は増大し ている。例えば、インビトロトランスフェクション法を使用すると、哺乳動物細 胞への裸のポリヌクレオチドの取り込みは、通常、バックグランドを超えて検出 され得ない。しかし、裸のポリヌクレオチドがインビボで送達される場合、いく らかの取り込み頻度が検出され得る。インビボおよびインビトロでの取り込み頻 度は、組織タイプに依存する。取り込み頻度は、ポリヌクレオチドの存在を検出 するための公知の方法(例えば、ノーザン技術、サザン技術、またはポリメラー ゼ連鎖反応(PCR)技術)によって測定され得る。 通常、組成物または化合物は、裸のポリヌクレオチド取り込みの頻度より、少 なくとも10％高く；より通常には少なくとも15％高く；なおより通常には20％高 く；なおより通常には少なくとも30％；そして40％高い〜100％高く(1,000％、 そして10,000％高くさえ)まで取り込み頻度を誘導する場合、細胞へのポリヌク レオチド取り込み頻度を増大させ得る。 「裸のポリヌクレオチド」は、細胞への進入を容易にするように作用し得るいか なる送達ビヒクルも実質的にないポリヌクレオチドをいう。例えば、ポリヌクレ オチドは、トランスフェクションを促進するいかなる物質(例えば、リポソーム 場合、裸である。 「細胞へのポリヌクレオチド取り込みの頻度を増大させるに有効な量」は、裸の ポリヌクレオチド取り込みの頻度より、少なくとも10％高い、より通常には少な くとも15％高い、なおより通常には20％高い、なおより通常には少なくとも30％ 高い、なおより通常には少なくとも40％高い、細胞へのポリヌクレオチド取り込 みの頻度を誘導する量をいう。 「核酸を中和するに有効な量」は、核酸組成物の電荷の少なくとも10％を中和す るために使用される量をいい、この量は、より好ましくは目的の核酸組成物の電 荷の少なくとも40％を中和するために使用される量を、なおより好ましくは電荷 の50％を中和する量を、なおより好ましくは電荷の60％を中和する量を、なおよ り好ましくは電荷の70％を中和する量を、なおより好ましくは電荷の80％を中和 する量を、そして最も好ましくは少なくとも90％を中和する量をいう。 「核酸の縮合」は、核酸と組み合わされたポリカチオン性薬剤が、その核酸の電 荷を中和し、そしてそれに、複合体化されていない核酸に対して縮小した構造を 取らせる場合に生じる。好ましくは、縮合は、核酸の構造を、細胞表面膜上に存 在する構造によって内部移行され得るサイズにまで縮小させる。縮合は、例えば 、ゲル電気泳動により、核酸/ポリカチオン性薬剤の電荷を決定することによっ て測定され得る。あるいは、核酸を縮合するに有効な量はまた、ポリカチオン性 薬剤/核酸複合体の最終サイズによって測定され得る。 「核酸の血清もしくはヌクレアーゼ分解を阻害するに効果的な量」は、血清およ び/またはヌクレアーゼに曝された場合、複合体化されていない核酸と比較して 、少なくとも５分、ポリヌクレオチドの半減期を増大させるために使用される量 を、より好ましくは少なくとも10分分解を阻害するために使用される量を、なお より好ましくは少なくとも30分分解を阻害するために使用される量を、なおより 好ましくは少なくとも45分分解を阻害するために使用される量を、なおより好ま しくは少なくとも60分分解を阻害するために使用される量を、なおより好ましく は少なくとも90分分解を阻害するために使用される量を、そしてより好ましくは 少なくとも120分分解を阻害するために使用される量をいう。 Ａを含む組成物は、その組成物においてＡ＋Ｂの合計の少なくとも85重量％が Ａである場合、Ｂを「実質的に含まない」。Ａは、その組成物においてＡ＋Ｂの合 計の、好ましくは少なくとも約90重量％、より好ましくは少なくとも約95重量％ (または99重量％でさえ)を含む。 「免疫原性」は、所定の分子またはその決定基の、インビボでの投与の際に、そ の分子に対して結合能を有する抗体の産生を誘導し、細胞傷害性応答を誘導し、 補体系を活性化し、アレルギー反応を誘導するなどの能力をいう。免疫応答は、 血清中の特異抗体のレベルを決定するアッセイ、ポリカチオン性薬剤/核酸複合 体もしくは結合された遺伝子送達ビヒクルを不活化する血清成分の存在を決定す るアッセイ、または免疫系の特定の成分もしくは活性を測定する他のアッセイに よって測定され得る。下記でより詳細に考察されるように、低い免疫原性は、こ れらのアッセイによって確立され得る。用語「低い免疫原性」、「減じられた免疫 原性」、「低下した免疫原性」および同様な用語は、等価な用語と意図される。 「複製起点」は、発現ベクターのようなポリヌクレオチドの複製を開始および調 節するポリヌクレオチド配列である。複製起点は、細胞内で、その独自の制御下 で複製し得る、ポリヌクレオチド複製の自律単位として振る舞う。特定の複製起 点を有することで、発現ベクターは、細胞内において、適切なタンパク質の存在 下で、高コピー数で再生産され得る。起点の例は、酵母において有効な２μおよ び自律複製配列、ならびにCOS-7細胞において有効なウイルス性Ｔ抗原である。一般的な方法および詳細な説明 ポリヌクレオチド 本発明において使用されるポリヌクレオチドは、所望のポリペプチドを発現さ せるために使用され得るか、またはそれ自身が治療薬(例えば、リボザイムまた はアンチセンスポリヌクレオチド)であり得る。このようなポリヌクレオチドは 、インビトロ、エキソビボ、およびインビボでの適用において使用され得る。 また、本発明のポリヌクレオチドは、ポリペプチド、リボザイム、またはアン チセンス分子を発現させるベクターであり得る。ベクターは、コード領域、リボ ザイムまたはアンチセンス分子に作動可能に連結された、転写を開始するプロモ ーターを少なくとも含む。ベクターに含まれ得る他の成分は、例えば、(１)終結 配列、(２)分泌を導くためのリーダーペプチドをコードする配列、(３)選択マー カー、および(４)複製起点である。複製起点は必須ではない。送達されるべきポ リヌクレオチドは、複製性または非複製性のいずれかであり得る。他の成分は、 所望でありそして利便であれば、加えられ得る。 本発明のポリヌクレオチドおよび方法は、任意のタイプの宿主細胞と共に利用 され得る。プロモーター、ターミネーター、および発現ベクターの他の随意のエ レメントの選択は、選択された宿主細胞に依存する。本発明は、選択された宿主 細胞に依存しない。利便性およびタンパク質発現の所望のレベルは、最適な宿主 細胞を指図する。発現のための種々の宿主が、当該分野において公知であり、そ してAmerican Type Culture Collection(ATCC)(Rockville，Maryland，U.S.A.) から入手可能である。適切な細菌宿主には、Campylobacter、Bacillus、Escheri chia，Lactobacillus、Pseudomonas、Staphylococcus、およびStreptococcusが 含まれるが、これらに限定されない。以下の属の酵母宿主が利用され得る；Cand ida、Hansenula、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、Schizosaccharomyce s、およびYarrowia。Aedes aegypti、Bombyx mori，Drosophila melanogaster、 およびSpodoptera frugiperda(PCT特許公開第WO 89/046699号；Carbonellら、19 85，J.Virol．56:153；Wright、1986，Nature 321:718；Smithら、1983，Mol.Ce ll.Biol．3:2156；および一般には、Frasterら、1989，In Vitro Cell.Dev.Biol .25:225を参照）。 インビトロ適用に有用な哺乳動物細胞タイプには、例えば、American Type Cu lture Collection(ATCC)から入手可能な細胞株、チャイニーズハムスター卵巣(C HO)細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、サル腎臓細胞(COS)、ヒ ト肝細胞ガン細胞(例えば、Hep G2)、ヒト胚腎臓細胞、ベビーハムスター腎臓細 胞、マウスセルトーリ細胞、イヌ腎臓細胞、バッファローラット肝臓細胞、ヒト 肺細胞、ヒト肝臓細胞、マウス乳腺ガン細胞、ならびにその他が含まれる。 インビボまたはエキスビボ適用に有用な細胞タイプには、任意の組織タイプ、 例えば、筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓(liter)、脾臓、血液、骨髄、胸腺、心臓、 リンパ、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経 系、眼、腺、および結合組織が含まれるが、これらに限定されない。 Ａ．インビトロおよびエキソビボベクター 所望のポリペプチドもしくはリボザイムをコードするポリヌクレオチド、また はアンチセンスポリヌクレオチドは、例として以下のプロモーターおよびエンハ ンサーを使用して、転写および/または翻訳され得る。この例には、Christyら、 1989，Genes Dev．3:1323-1335に記載されるような422(aP2)遺伝子およびステア ロイルCoAデサチュラーゼ１(SCD1)遺伝子（適切な脂肪細胞特異的プロモーター を 含む）が含まれるが、これらに限定されない。合成非天然プロモーターまたはハ イブリッドプロモーターもまた、本明細書中で使用され得る。例えば、T7T7/T7 プロモーターは、Chenら、1994，Nucielc Acids Res．22:2114-2120に従って構 築され、そして使用され得る。ここで、T7ポリメラーゼはその自身のプロモータ ーの調節制御下にあり、そして別のT7プロモーターの制御下に配置されるポリヌ クレオチド配列の転写を駆動する。脂肪特異的発現のための主要な決定基は、Ro ssら、1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:9590-9594、およびGravesら、1991，G enes Dev．5:428-437に記載されるような、転写開始部位の約＞5kb上流に位置す るエンハンサーである。CCAAT/エンハンサー結合タンパク質C/EBPαの遺伝子も また、本明細書中での使用に適切である。これは、Birkenmeierら、1989，Gene Dev．3:1146-1156に記載されるように、3T3-L1アジオブラスト(adioblast)が分 化経路に方向付けられた場合および成熟した有糸分裂後の脂肪細胞において、高 度に発現される。最近単離された転写因子PPARγ2(Tontonozら、1994，Cell 79: 1147-1156に記載されるように、脂肪細胞組織において専ら発現される)もまた、 本明細書中で使用され得る。 哺乳動物細胞発現のための代表的なプロモータには、とりわけ、SV40初期プ口 モーター、CMVプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスLTRプロモーター、アデノ ウイルス主要後期プロモーター(Ad MLP)、および単純ヘルペスウイルスプロモー ターが含まれる。他の非ウイルスプロモーター、例えば、マウスメタロチオネイ ン遺伝子に由来するプロモーターもまた、哺乳動物構築物における使用を見出す 。発現は、プロモーターに依存して、構成的または調節性(誘導性)のいずれかで あり得る。代表的には、転写終結およびポリアデニル化配列もまた、存在し、翻 訳停止コドンの３'側に位置する。好ましくは、翻訳開始の最適化のための配列( コード配列の５'側に位置する)もまた存在する。転写終結/ポリアデニル化シグ ナルの例には、Sambrookら、1989，「Molecular Cloning，A Laboratory Manual」 第２版、Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New Yorkに記載され るような、SV40に由来するものが含まれる。イントロン(スプライスドナーおよ びアクセプター部位を含む)もまた、本発明の構築物中に設計され得る。 エンハンサーエレメントもまた、哺乳動物構築物の発現レベルを増大させるた めに、本明細書中で使用され得る。例には、Dijkemaら、1985，EMBO J．4:761に 記載のようなSV40初期遺伝子エンハンサー、ならびにGormanら、l982b，Proc.Na tl.Acad.Sci.USA 79:6777に記載されるような、ラウス肉腫ウイルスの、およびB oshartら、1985，Cell 41:521に記載されるようなヒトサイトメガロウイルスの 長末端反復(LTR)由来のエンハンサー/プロモーターが含まれる。リーダー配列も また存在し得、これには、哺乳動物細胞において外来タンパク質の分泌を提供す るためのシグナルペプチドをコードする配列が含まれる。好ましくは、リーダー フラグメントと目的の遺伝子との間にコードされるプロセシング部位が存在し、 その結果、リーダー配列が、インビボまたはインビトロでのいずれかで切断され 得る。 ウイルス由来の他の調節領域が、転写および翻訳のレベルを増大させるためか 、または転写および翻訳の持続時間を増大させるために、本発明のポリヌクレオ チドに含まれ得る。例えば、HIVの長末端反復が含まれ得る。あるいは、エプス タインバーウイルスの逆方向末端反復が使用され得る。 哺乳動物細胞における標的ポリペプチドをコードするDNAの一過性発現を提供 する発現ベクターが存在する。一般に、一過性発現は、宿主細胞において効率的 に複製し得、その結果、宿主細胞が発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、次い で、その発現ベクターによりコードされる所望のポリペプチドを高レベルで合成 する発現ベクターの使用を包含する。一過性発現系は、適切な発現ベクターおよ び宿主細胞を含み、クローンされたDNAによりコードされるポリペプチドの簡便 なポジティブの同定、ならびに所望の生物学的または生理学的特性についてのこ のようなポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。したがって、一過 性発現系は、標的ポリペプチド様活性を有する、標的ポリペプチドのアナログお よび改変体を同定する目的に特に有用である。 Ｂ．インビボベクター ウイルスベクターを使用する送達には、Jolly、1994，Cancer Gene Therapy 1 :1-64に記載のような、多くのウイルスベクターのうちの任意のものが使用され 得る。例えば、所望のポリペプチドもしくはリボザイムのコード配列、またはア ンチセンス分子は、Kimuraら、1994，Human Gene Therapy 5:845-852に記載のよ うなレトロウイルスベクター、Connellyら、1995，Human Gene Therapy 6:185-1 93に記載のようなアデノウイルスベクター、Kaplittら、1994，Nature Genetics 6:148-153に記載のようなアデノ随伴ウイルスベクター、およびシンドビスベク ターにおける転写および/または翻訳のために設計されるプラスミドに挿入され 得る。これらベクターとの使用に適切であるプロモーターには、モロニーレトロ ウイルスLTR、CMVプロモーター、およびマウスアルブミンプロモーターが含まれ る。複製能がないウイルスが作製され得、そして動物もしくはヒトに直接注入さ れ得るか、またはZastloukalら、1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:5148-5152 に記載されるように、エキソビボでの自己の細胞の形質導入、続いてインビボで の注入によって注入され得る。 所望のポリペプチドもしくはリボザイムをコードするポリヌクレオチド、また はアンチセンスポリヌクレオチドはまた、インビボでの所望のポリペプチドの発 現のために、プラスミドに挿入され得る。インビボ治療のために、コード配列は 、組織への直接注入によって、またはエアロゾルとして経口投与を介して、送達 され得る。この様式での使用に適切なプロモーターには、内因性および異種のプ ロモーター(例えば、CMV)が含まれる。さらに、合成T7T7/T7プロモーターが、Ch enら、1994，Nucleic Acids Res．22:2114-2120に従って構築され得る。ここで 、T7ポリメラーゼは、その自身のプロモーターの調節制御下にあり、そしてポリ ヌクレオチド配列の転写を駆動する。このポリヌクレオチド配列はまた、T7プロ モーターの制御下に配置される。このポリヌクレオチドは、Zhuら、1993，Scien ce 261:209-211に記載のように、コード配列を安定化し得、そして細胞中へのそ の形質導入を容易にし得、そして/または標的化を提供し得る処方物において注 入され得る。 ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターのいずれかによる遺伝子治療目的 の送達に際して、インビボでの所望のポリペプチドのコード配列の発現またはリ ボザイムもしくはアンチセンスポリヌクレオチドの複製は、Gossenら、1992，Pr oc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551に記載のような、調節された遺伝子発現プ ロモーターの使用によって、最大限の効力および安全性のために調節され得る。 例えば、ポリヌクレオチドの転写および/または翻訳は、テトラサイクリン応答 性プロモーターによって調節され得る。これらのプロモーターは、レギュレータ ー分子での処理によってポジティブ様式またはネガティブ様式で調節され得る。 所望のポリペプチドのコード配列の非ウイルス送達のために、この配列は、高 レベル発現のための従来の制御配列を含む従来のベクター中に挿入され得る。 Ｃ．好ましいベクター 好ましいベクターは以下を含む：（１）（EBV）複製起点またはパルボウイル スであるBKV（BKウイルス）複製起点；（２）EBVまたはBKV複製開始点結合タン パク質に対するコード領域；（３）少なくとも１つの逆方向末端反復；（４）プ ロモーター；（５）エンハンサー；（６）ターミネーター；（７）必要に応じて 、選択マーカー。 好ましくは、複製起点は、EBV ori pであり；より好ましくは、配列番号１の ヌクレオチド2623〜4559が利用される。この配列は、Invitrogen，San Diego，C alifornia，USAから市販されているベクターpCEP4から入手可能である。 好ましくは、コード領域は、EBV ori pに結合するEBV核抗原Ａをコードし；よ り好ましくは、配列番号１のヌクレオチド14〜2594であるポリヌクレオチド配列 が利用される。この配列は、Invitrogen，San Diego，California，USAから市販 されているベクターpCEP4から入手可能である。 所望される宿主細胞中におけるベクターの複製を開始し得る好ましい複製開始 点および結合タンパク質のフラグメントおよび変異体が利用され得る。好ましく は、フラグメントおよび変異体は、配列番号１のヌクレオチド14〜2594または26 23〜4559またはそのフラグメントとの約80％より高い；より代表的には約85％よ り高い；なおより代表的には少なくとも90％の配列同一性を保持する。好ましく は、これらのポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド14〜2594または26 23〜4559またはそのフラグメントとの約92％より高い；より好ましくは約94％よ り高い；なおより好ましくは約96％より高い；なおより好ましくは、約98％より 高い；なおより好ましくは、約99％より高い配列同一性を示す。 好ましくは、逆方向末端反復は、アデノウイルス（AV）またはアデノ随伴ウイ ルス（AAV）において見出される配列であり；より好ましくは、逆方向末端反復 は、AAVにおいて見出される配列であり；なおより好ましくは、ポリヌクレオチ ド配列は、配列番号１の4938〜5104または7189〜7355である。AAVの配列は、Sam ulskiら、1987，J．Viol．61:3096-3101に記載されている。 所望される宿主細胞中におけるベクターの複製を開始し得る好ましい逆方向末 端反復のフラグメントおよび変異体が利用され得る。好ましくは、フラグメント および変異体は、配列番号１のヌクレオチド4938〜5104または7189〜7355または そのフラグメントとの約80％より高い；より代表的には、約85％より高い；なお より代表的には、少なくとも90％の配列同一性を保持する。好ましくは、これら のポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド4938〜5104または7189〜7355 またはそのフラグメントとの約92％より高い；より好ましくは約94％より高い； なおより好ましくは約96％より高い；なおより好ましくは、約98％より高い；な おより好ましくは、約99％より高い配列同一性を示す。 好ましくは、サイトメガロウイルスのエンハンサー／プロモーターが利用され ；より好ましくは、CMVプロモーター配列は、配列番号１のヌクレオチド配列511 2〜6734である。 転写および／または翻訳を開始し得る好ましいエンハンサーおよびプロモータ ーの変異体およびフラグメントが利用され得る。好ましくは、フラグメントおよ び変異体は、配列番号１のヌクレオチド5112〜6734またはそのフラグメントとの 約80％より高い；より代表的には、約85％より高い；なおより代表的には、少な くとも90％の配列同一性を保持する。好ましくは、これらのポリヌクレオチドは 、配列番号１のヌクレオチド5112〜6734またはそのフラグメントとの約92％より 高い；より好ましくは約94％より高い、なおより好ましくは約96％より高い；な おより好ましくは、約98％より高い；なおより好ましくは、約99％より高い配列 同一性を示す。 好ましいターミネーターはウシ成長ホルモンポリＡ配列であり；より好ましく は、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド6818〜7050である。 転写および／または翻訳を終結し得る好ましいターミネーターの変異体および フラグメントが利用され得る。好ましくは、フラグメントおよび変異体は、配列 番号１のヌクレオチド6818〜7050またはそのフラグメントとの約80％より高い； より代表的には、約85％より高い；なおより代表的には、少なくとも90％の配列 同一性を保持する。好ましくは、これらのポリヌクレオチドは、配列番号１のヌ クレオチド6818〜7050またはそのフラグメントとの約92％より高い；より好まし くは約94％より高い；なおより好ましくは約96％より高い；なおより好ましくは 、約98％より高い；なおより好ましくは、約99％より高い配列同一性を示す。 好ましいベクターの配列が配列番号１に示される。ポリペプチド（例えば、エ リスロポエチンまたはレプチン）、ならびにリボザイムおよびアンチセンスポリ ヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドが、ベクター中に挿入され得る。 Ｄ．コード領域、リボザイム、およびアンチセンス分子の例 以下は、哺乳動物における種々の適応症を処置するために使用され得る、コー ド領域、リボザイム、およびアンチセンス分子の例である。目的の遺伝子のヌク レオチド配列は、例えば、Genbankのような公的に利用可能なデータベースにお いて見出され得る。送達されるべきポリヌクレオチドは、ウイルス感染または慢 性病原体感染を処置するために使用され得る。 １．血友病 ポリヌクレオチドのインビボ送達による遺伝子置換は、血友病の処置において 有効であり得る。以下は、送達されるべきポリヌクレオチドによってコードされ 得るポリペプチドの例である：第VIII:C因子、第VIII:C因子の変異体、好ましく は切断不能であるもの。また、組織因子プラスミノーゲンインヒビター（Tissue Factor Plasminogen Inhibitor）（TFPI）のインヒビターとしてのリボザイム およびアンチセンスポリヌクレオチドが、血友病を処置するために有用である。 血友病を処置するための送達の経路としては、例えば、静脈内／肝臓内注射、 レトロウイルスベクターを使用する幹細胞またはリンパ球のエクスビボ形質導入 が挙げられる。 ２．対宿主性移植片病の処置 プロドラッグをコードするポリヌクレオチドのインビボ送達は、例えば、白血 病骨髄移植における対宿主性移植片病を処置するための直接的消散のために使用 され得る。ガンシクロビルとの組み合わせでのヘルペスチミジンキナーゼが、こ の目的のために利用され得る。プロドラッグのその他の例は、ガンの節において 記載される。 対宿主性移植片病を処置するための送達の経路としては、例えば、レトロウイ ルスベクターを使用するＴリンパ球のエクスビボ形質導入が挙げられる。 ３．ワクチン 所望される抗原をコードするポリヌクレオチドのインビボ送達は、免疫応答を 誘導するために利用され得る。この応答は、細胞性応答および体液性応答の両方 を含み得る。この型のワクチンは、ガンおよび感染性疾患を処置するために使用 され得る。さらに、そのような処置は、予防的または治療的のいずれかの免疫療 法であり得る。 感染性疾患の例としては、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝 炎、Ｃ型肝炎など（HAV、HBV、HCVなど）、ヒト乳頭腫ウイルス（HPV）、サイト メガロウイルス（CMV）、単純ヘルペス１および２（HSV）などが挙げられる。好 ましい抗原としては、HCVの非構造タンパク質３、4a、および5b（NS3、NS4、お よびNS5b）；HSVのgB2およびgD2；HIVのenvおよびrevタンパク質が挙げられる。 また、ガン抗原が、ワクチンにおいて、治療的および予防的の両方の目的のた めに使用され得る。 抗原は、クラスＩ主要組織適合性抗原に関連して、または細胞性細胞傷害性Ｔ 細胞応答を誘導するために、または抗体の合成を含む体液性応答を誘導するため に提示され得る。 さらに、例えば、免疫抑制分子、IL-10、TGF-β、およびCTLA-4に対するアン チセンスまたはリボザイム標的は、ワクチンとともに投与されることが有用であ り得る。 ワクチンのための送達の経路としては、例えば、筋肉内注射、樹状細胞に基づ く免疫、またはウイルスベクターおよび非ウイルスベクターの両方による経口免 疫が挙げられる。 ４．糖尿病 糖尿病は、置換遺伝子のインビボ送達によって処置され得る別の適応症である 。 以下は、置換遺伝子によってコードされるべき有用なポリペプチドの例である： インスリン、インスリン様増殖因子ＩおよびII（IGF-IおよびII）。 膵臓中のＢ細胞の表面上に見出され、細胞を免疫破壊から防御するIAS-Lをコ ードするポリヌクレオチドはまた、糖尿病を処置するために有用である。 糖尿病を処置するための送達の経路としては、例えば、ウイルスベクターおよ び非ウイルスベクターの両方を使用する、肝臓指向性、耳下腺指向性、膵臓指向 性、唾液腺指向性が挙げられる。 ５．高脂血症 高脂血症は、アポタンパク質またはリポタンパク質レセプターをコードする以 下のポリヌクレオチドのインビボ送達によって処置され得る。リポタンパク質お よびアポタンパク質のより広範な説明は以下に提供される。 高脂血症を処置するための送達の経路としては、例えば、ウイルスベクターお よび非ウイルスベクターの両方による肝臓指向性静脈内投与が挙げられる。 ６．心筋虚血または梗塞 以下は、インビボで送達される場合に、心筋虚血または梗塞を処置するために 有用であるポリヌクレオチドの例である。 塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、線維芽細胞増殖因子５（FGF-5）、およ びIGF-Iをコードするポリヌクレオチド。 心筋虚血または梗塞を処置するための送達の経路としては、例えば、ウイルス ベクターまたは非ウイルスベクターの心膜内送達が挙げられる。 ７．腸疾患 以下は、腸疾患を処置するためにインビボで送達され得るポリヌクレオチドの 例である。 （ｉ）マクロファージ／炎症細胞の補充（recruitment）または活性化のイン ヒビター（例えば、NFκB）としてのリボザイムまたはアンチセンスポリヌクレ オチド； （ii）抗アポトーシス剤（例えば、インターロイキン1b変換酵素ファミリーの インヒビター）として作用するリボザイムまたはアンチセンスポリヌクレオチド ； （iii）補体ブロッカー（例えば、崩壊促進因子（DAF）、メンブレンコファク タープロテイン（MCP）；およびCAB-2としても知られるDAFおよびMCPの融合体を コードするポリヌクレオチド； （iv）シクロオキシゲナーゼインヒビター； （v）抗増殖剤（例えば、c-myb、ras／raf、PI3キナーゼ、サイクリンに対す る、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、タンパク質、または ペプチド）； （vi）自殺タンパク質／遺伝子（例えば、ヘルペスチミジンキナーゼ）をコー ドするポリヌクレオチド； （vii）炎症性腸疾患の発達の間に欠損し得るまたはダウンレギュレートされ 得る置換遺伝子またはタンパク質をコードするポリヌクレオチド； （Viii）IκBをコードするポリヌクレオチド。 ８．前立腺ガンおよび良性前立腺過形成 以下のポリヌクレオチドは、前立腺ガンおよび良性前立腺過形成を処置するた めに送達され得る。 （ｉ）プロアポトーシス因子（例えば、fas、fasリガンド、fadd、fap-1、tra dd、faf、rip、reaper、アポプチン（apoptin）、インターロイキン２変換酵素 を含む）をコードするポリヌクレオチド； （ii）抗脈管形成因子（例えば、bFGF可溶性レセプターおよびフラグメント、 アンギオスタチン（angiostatin）、トランスフォーミング増殖因子β（TGF-β ）、インターフェロンα（IFNα）、プロリフェリン関連タンパク質、ウロキ ナーゼプラスミノーゲンアクチベータレセプターアンタゴニスト、血小板因子４ (PF4)、トロンボスポンジン、メタロプロテイナーゼの組織インヒビター、およ びプロラクチンを含む）をコードするポリヌクレオチド； （iii）免疫調節因子（例えば、インターロイキン２（IL-2）、IFNα、IFNβ 、IFNγ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、およびマクロフ ァージコロニー刺激因子（M-CSF）を含む）をコードするポリヌクレオチド； （iv）抗増殖因子（例えば、シグナル伝達経路のインヒビター（例えば、myb 、ras、rasスーパーファミリー、raf、ホスホイノシトール（PI3キナーゼ）、ホ スホチロシン結合（PTB）ドメイン、SRC相同２（SH2）ドメイン、SRC相同３（SH 3）ドメイン、プレキシトリン相同（plextrin homology）ドメイン、JUNキナー ゼ、およびストレス活性化キナーセ、シグナリングイノシトールホスファターゼ (signaling inositol phosphatase)によって媒介されるシグナル伝達経路のイン ヒビター）；ならびにサイクリンのインヒビターを含む）としてのリボザイムま たはアンチセンスポリヌクレオチド； （ｖ）増殖因子（例えば、上皮増殖因子（EGF）、TGF-α、FGF、TGF-β、血小 板由来増殖因子（PDGF）、角質細胞増殖因子（KGF）、または任意の前立腺細胞 特異的増殖因子を含む）のインヒビターまたは増殖因子のレセプターのインヒビ ターとしてのリボザイムまたはアンチセンスポリヌクレオチド； （vi）腫瘍サプレッサー遺伝子または前立腺における過形成状態の発症の間に ダウンレギュレートされる遺伝子をコードするポリヌクレオチド；および （Vii）免疫抑制分子（例えば、IL-10、TGF-β、およびCTLA-4）に対するアン チセンスまたはリボザイム標的。 ９．貧血、白血球減少症、および血小板減少症 貧血は、例えば、エリスロポエチン、GM-CSF-、G-CSF、M-CSF、およびトロン ボポエチンをコードするポリヌクレオチドのインビボ送達によって処置され得る 。この適応症のための送達経路の例としては、以下が挙げられるがそれらに限定 されない：ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターの肝臓標的化静脈内投与 。以下の実施例を参考のこと。 10．心筋症 以下は、心筋症を処置するためにインビボで送達され得るポリヌクレオチドの 例である：IGF-1、L-アミノ酸デカルボキシラーゼ、βアドレナリンレセプター キナーゼ（BARK）のインヒビター、トロポニン、およびβアドレナリンレセプタ ーをコードするポリヌクレオチド。 この適応症のための送達経路の例としては、IGF-1の心膜発現、およびその他 の遺伝子については、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターの冠状動脈内 注射もしくは心膜内投与を介する心筋内注射もしくは心筋標的化が挙げられるが それらに限定されない。 11．慢性関節リウマチ 以下は、慢性関節リウマチを処置するためにインビボで送達され得るポリヌク レオチドの例である：プロドラッグ（例えば、ヘルペスチミジンキナーゼ）、MM Pインヒビター、fas、およびプロアポトーシスタンパク質（上記）、ならびにイ ンターロイキン１レセプターＡ、インターロイキン10、IκBをコードするポリヌ クレオチド。 また、NFκBのインヒビターとしてのアンチセンスおよびリボザイムポリヌク レオチド。 この適応症のために送達経路の例としては、ウイルスベクターおよび非ウイル スベクターの関節内注射が挙げられるが、それらに限定されない。 12．変形性関節症および乾癬 以下は、変形性関節症および乾癬を処置するためにインビボで送達され得るポ リヌクレオチドの例である：IGF-1をコードするポリヌクレオチド；メタロプロ テイナーゼインヒビターのインヒビターとしてのリボザイムおよびアンチセンス ポリヌクレオチド。 また、以下は、変形性関節症および乾癬を処置するためにインビボで送達され 得るポリヌクレオチドの例である：プロドラッグ（例えば、ヘルペスチミジンキ ナーゼ）、MMPインヒビター、fas、およびプロアポトーシスタンパク質（上記） 、ならびにインターロイキン１レセプターＡ、インターロイキン10、IκBをコー ドするポリヌクレオチド。 また、NFκBのインヒビターとしてのアンチセンスおよびリボザイムポリヌク レオチド。 この適応症のために送達経路の例としては、関節内注射が挙げられるが、それ らに限定されない。 13．再狭窄 以下は再狭窄を処置するためにインビボで送達され得るポリヌクレオチドの例 である： （ｉ）プロドラッグ（例えば、チミジンキナーゼ、その他の例は、ガンの節に おいて記載される）をコードするポリヌクレオチド； （ii）組織因子プラスミノーゲンインヒビター（TFPI）をコードするポリヌク レオチド； （iii）c-myb rbz、c-ras rbzをコードするポリヌクレオチド； （iv）プロアポトーシス因子（上記）をコードするポリヌクレオチド； （ｖ）IκBをコードするポリヌクレオチド。 この適応症のための送達経路の例としては、ウイルスベクターおよび非ウイル スベクターの冠状動脈内送達が挙げられるが、それらに限定されない。 14．ガン 本発明の遺伝子送達ベクターは、過増殖性障害（悪性腫瘍を含む）の処置、感 染性疾患の処置、および炎症性疾患（自己免疫疾患を含む）の処置のための治療 用遺伝子の送達において有用である。例えば、遺伝子治療ベクターは、サイトカ イン、または不活性のもしくは部分的に活性なプロドラッグを、活性な薬物に転 換するタンパク質を発現させるために使用され得る。多くの場合において、プロ ドラッグのその活性形態への転換は、細胞溶解性活性を有する化合物を生じる。 ａ．プロドラッグ転換酵素 プロドラッグ転換において有用な異なるタンパク質をコードする多数の「自殺 遺伝子」が、本発明において使用され得る。例えば、チミジンキナーゼのような ヌクレオシドキナーゼは特に有用である。特に、HSV-TK系は、抗腫瘍細胞治療の ための重要な利点を有する。チミジンキナーゼおよびその他のプロドラッグ転換 酵素を発現する遺伝子送達ベクターによるガンおよびその他の疾患の処置の説明 については、「ベクター構築物を標的細胞へ送達する組換えレトロウイルス」と 題されたPCT公開公報第WO 91/02805号および「条件的致死遺伝子を利用するため の組成物および方法」と題されたPCT公開公報第WO 95/14014091号を参照のこと 。HSV-TK形質導入腫瘍細胞は、インビトロおよびインビボにおいて、非形質転換 隣接細胞に対する有意な傍観者傷害効果（bystander killing effect）を（Mool tenら、前出、Freemanら、1993，Cancer Res．53:5274）、最も一般的には、隣 接細胞間での、細胞間ギャップ結合を介する毒性ガンシクロビル代謝物であるGC V三リン酸への移行の結果として（Biら、1993，Human Gene Therap．4:725）媒 介し得る。毛細血管壁中の内皮細胞はギャップ結合によって連結されており、そ れで劇的な傍観者効果が、隣接内皮細胞間のGCV三リン酸移行によってもたらさ れ、そして、大きな、凝固カスケードの増幅効果および腫瘍対内皮細胞比が結果 として生じ得る（Denekampら、1986，Cancer Topics 6:6；Denekampら、1984，P rog ．Appl．Microcir．4:28）。最近の証拠は、HSV-TKレトロウイルスベクター での病巣内治療の間の腫瘍内皮細胞の時折の形質導入が、ベクターの抗腫瘍活性 の重要な成分を説明し得ることを示唆する（Ramら、1994，J．Neurosurg．81:25 6）。さらに、自殺遺伝子は、標的細胞に対して、条件的にのみ（すなわち、GCV が与えられる場合にのみ）細胞毒性である。その結果として、エクスビボ投与方 法が利用され得る。例えば、この型のプロトコルにおいて、内皮細胞は腫瘍バイ オプシーから単離され得（Medzelewskiら、1994，Cancer Res．54:336）、適切 なマイトジェンを用いて増殖するように誘導され得（Ferraraら、前出）、そし てTKでインビトロにおいて形質導入され得る。移植されたECは、腫瘍内注射後数 日から数週間で新生脈管構造中に組み込まれるようになり（Lalら、1994，Cance r Gene Therap．1:322）、それでGCV処置は、形質導入されたECを機能的に腫瘍 脈管 構造中に組み込ませるための適切な「遅滞期」の後に続く。２段階酵素−プロド ラッグ系は、きめ細かい臨床管理のより大きな柔軟性を提供する。なぜなら、正 常ECに対する損傷から生じる（潜在的に非常に重篤な）合併症の場合のGCV注入 の中止は、インサイチュでトランスジーンの活性をブロックすることの必要性な しに、毒性をブロックするからである。 チミジンキナーぜに加えて多数の別の「自殺遺伝子」もまた、ガン遺伝子治療 に有用である（Mooltenら、前出）。細菌シトシンデアミナーゼ遺伝子（Huberら 、1993,Cancer Res．53:4619)の腫瘍細胞への導入は、抗真菌剤５-フルオロシト シン（5-FC）への感受性を与える。シトシンデアミナーゼは、5-FCを５-フルオ ロウラシル（5-FU,Nishiyamaら、1985,Cancer Res．45:1753）に変換する。5-FU は、乳ガンに対して通常使用される化学治療薬であるので、いくつかのグループ が、この疾患のためにシトシンデアミナーゼに基づく「自殺遺伝子」治療モデル を開発した。腫瘍特異性は、c-erbB2プロモーター/エンハンサーエレメントをシ トシンデアミナーゼ遺伝子の5'に導入することによりさらに増加され得、その結 果、治療トランス遺伝子（transgene）はc-erbB2過剰発現乳ガン腫瘍細胞におい て優先的に転写される（Harrisら、1994,Gene Therap．1:170）。アルカリホス ファターゼは、プロドラッグ活性化酵素として、抗体指向酵素-プロドラッグ治 療（ADEPT）の関連分野において広範に調べられている。この酵素は、抗ガン剤 （例えば、マイトマイシンC、エトポシドなど；荷電したリン酸基が切断される まで細胞膜を通過出来ない）の広範なリン酸化誘導体を活性化し得るという利点 を有、従って単一酵素は、腫瘍細胞塊内で化学治療剤のカクテルをデノボ生成し 得る（Senterら、1993,Bioconjugate Chem．4:3）。他の自殺遺伝子は、単純ヘ ルペスウイルスチミジンキナーゼ（ガンシクロビルまたはアシクロビル）、Vari cella Zosterウイルスチミジンキナーゼ（６メトキシプリンアラビノヌクレオシ ド；Huberら、1991，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:8039）、E．coilシトシン デアミナーゼ（フルオロウラシル；Mullenら、1992，Proc．Natl．Acad．Sci．U SA ．89：33)、E．coliキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ （チオキサンチン；Beshardら、1987，Mol．Cell Biol．7:4139）、E．coliまた はLeishmaniaプリンヌクレオチドホスホリラーゼ（種々の非毒性プリンデオ キシアデノシン、アデノシン、デオキシグアノシン、またはグアノシン誘導体(K oszalkaおよびKrenitsky,1979，J．Biol Chem 254:8185，1979；Sorscherら、19 94，Gene Therapy 1:233)、シトクロムpla50 2B1またはシトクロムp450レダクタ ーゼ（例えば、３アミノ-1,2,4ベンゾトリアジン1,4-ジオキシド（Waltonら、19 92，Biochem．Pharmacol．44:251））、細胞表面アルカリホスファターゼ（例え ば、エトポシド1リン酸；Senterら、1988，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:484 2，1988）、ニトロレダクターゼ（例えば、メトロニダゾールまたはニトロフラ ントイン；Hofら、1988，Immunitat und Infektion 16:220）、N-デオキシリボ シル（deoxyribosy）トランスフェラーゼ（1-デアザプリン；Betbederら、1989 、Nucleic Acids Res 17:4217）、ピルビン酸フェロドキシンオキシドレダクタ ーゼ（メトロニダゾール；Upcroftら、1990，Int．J．Parasitolog，20:489）、 カルボキシペピダーゼG2（アミノアシル酸ナイトロジェンマスタード；Antoniw ら、1990，Brit J.Cancer 62:909）、カルボキシペプチダーゼＡ（メトトレキセ ートαアラニン；Haenselerら、1992，Biochemistry 31:891）、ラクタマーゼ（ セファロスポリン誘導体；Meyerら、1993，Cancer Res．53:3956；およびVradhu laら、1993，Bioconjugate Chemistry 4:334）、アクチノマイシンDシンセター ゼ複合体（合成ペンタペプチドラクトン前駆体；Katzら、1990,J．Antibiotics 43 :231）、および-グルクロニダーゼ（デオキソルビシンのような毒薬の種々の グルクロニド誘導体；Bossletら、1994,Cancer Res．54:2151；Haeberlinら、19 93,Pharmaceutical Res．10:1553）のような（対応する非細胞毒性因子を有する ）ポリペプチド（単数または複数）をコードし得る。 不活化プロドラッグを活性薬に変換し、そして当業者に公知である任意の種々 の他の酵素もまた、本発明の遺伝子送達ビヒクルにおいて使用され得る。例えば 、「Compositions and Methods for Utilizing Conditionally Lethal Genes」 と題されたPCT公開番号WO 95/14014091、および遺伝子治療に有用なさらなるプ ロドラッグ/酵素系の記載についての「Molecular Chimeras Useful for Cancer Therapy--Comprising Regulatory Sequences and heterologous enzyme、例えば 、Varicella Zoster Virus Thymidine Kinase」と題された欧州特許公開第EP903 09430号、を参照のこと。さらなる例として、「New Prodrugs and Enzyme Targe ti ng Molecule Conjugates--Useful in Antibody Direct Enzyme Prodrug Therapy of e.g．Viral Infections」と題されたPCT特許公開第WO 95/13095号を参照の こと。 種々の腫瘍が、本発明の遺伝子送達ビヒクルにより、処置のために標的化され 得る。一般には、固形腫瘍が好ましいが、白血球およびリンパ球が固体塊を発達 させる場合、または腫瘍細胞が非病原性正常細胞から物理的に分離され得るよう な適切な腫瘍結合マーカーが存在する場合、白血球およびリンパ球もまた処置さ れ得る。適切な腫瘍の代表的な例には、メラノーマ、大腸ガン、肺ガン（大きな 細胞ガン、小さな細胞ガン、扁平上皮ガン、および腺癌を含む）、腎臓細胞ガン 、および胸部腺癌が挙げられる。チミジンキナーぜおよび他のプロドラッグ変換 酵素を発現する遺伝子送達ビヒクルがまた、慢性関節リウマチ、骨関節炎、およ び移植片対宿主疾患を含む自己免疫疾患の処置において有用である。例えば、プ 口ドラッグ変換酵素を発現する遺伝子治療ベクターでの疾患の処置の記載につい ての「Compositions and Methods for Utilizing Conditionally Lethal Genes 」と題されたPCT特許公開第WO 95/14091号を参照のこと。 ｂ．サイトカイン サイトカインおよび免疫系モジュレーターをコードする種々のポリヌクレオチ ドは、多くの異なる障害の処置のために本発明の遺伝子送達ビヒクルにより送達 され得る。代表的な例には、IL-1、IL-2（Karupiahら、1990,J．Immunology 144 :290-298;Weberら、1987，J．Exp．Med．166:1716-1733；Gansbacherら、1990，J ．Exp．Med．172:1217-1224；米国特許第4,738,927号）、IL-3、IL-4（Tepper ら、1989，Cell 57:503-513;Golumbekら、1991，Science 254:713-716，1991； 米国特許第5,017,691号）、IL-5、IL-6（Brakenhofら、1987,J．Immunol．139:4 116-4121；WO 90/06370）、IL-7（米国特許第4,965,195号）、IL-8、IL-9、IL-1 0、IL-11、IL-12、IL-13（Cytokine Bulletin，Summer 1994）、IL-14およびIL- 15、特にIL-2、IL-4、IL-6、IL-12、およびIL-13、αインターフェロン（Finter ら、1991,Drugs 42(5):749-765；米国特許第4,892,743号；米国特許第4,966,843 号；WO 85/02862;Nagataら、1980，Nature 284:316-320；Famillettiら、1981,M ehods in Enz．78:387-394；Twuら、1989，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:204 6-2050；Faktorら、1990，Oncogene 5:867-872）、βインターフェロン（Seifら 、1991，J．Virol．65:664-671）、γインターフェロン（Radfordら、The Ameri can Society of Hepatology 2008-2015,1991；Watanabeら、PNAS 86:9456-9460 ，1989；Gansbacherら、1990，Cancer Research 50:7820-7825；Maioら、1989，Can ．Immunol．Immunother．30:34-42；米国特許第4,762,791号；米国特許第4,7 27,138号）、G-CSF（米国特許第4,999,291号および第4,810,643号）、GM-CSF（W O 85/04188）、腫瘍壊死因子（TNF）（Jayaramanら、1990，J．Immunology 144: 942-951）、CD3（Krissanenら、1987，Immunogenetics 26:258-266,1987）、ICA M-1（Altmanら、1989，Nature 338:512-514；Simmonsら、1988，Nature 331:624 -627）、ICAM-2、LFA-1、LFA-3（Wallnerら、1987，J．Exp．Med．166(4):923-9 32）、MHC I型分子、MHC II型分子、B7.1-3、2-ミクログロブリン（Parnesら、1 981、Proc．Natl．Acad．Sci．78:2253-2257）、カルネキシン、MHC結合トラン スポータータンパク質またはそのアナログのようなシャペロン（Powisら、1991,Nature 354:528-531,1991）のようなサイトカインが挙げられる。 本明細書中に記載の任意のサイトカインおよび免疫調節タンパク質をコードす る遺伝子は本発明の遺伝子送達ビヒクルにおいて発現され得る。当業者に公知の これらのサイトカインの他の形態もまた使用され得る。例えば、天然のIL-2およ びγ-インターフェロンをコードする核酸配列は、それぞれ米国特許第4,738,927 号および第5,326,859号に記載されるように得られ得、一方これらのタンパク質 の有用なムテインは米国特許第4,853,332号に記載されるように得られ得る。さ らなる例として、mCSFの短いおよび長い形態をコードする核酸配列は、それぞれ 米国特許第4,847,201号および第4,879,227号に記載されるように得られ得る。 サイトカインをコードする他の核酸分子、ならびに本発明内の使用に有利な他 の核酸分子は、例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC,Rockv ille,Maryland）のような寄託機関を含む種々の供給源から、またはBritish Bio Technology Limited（Cowley,Oxford England）のような商業供給元から容易に 得られ得る。代表的な例には、BBG 12（127アミノ酸の成熟タンパク質をコード するGM-CSF遺伝子を含む）、BBG 6（これはγインターフェロンをコードする配 列を含む）、ATCC番号39656（これはTNFをコードする配列を含む）ATCC番号2066 3（これはαインターフェロンをコードする配列を含む）、ATCC番号31902、3190 2、および39517（これはβインターフェロンをコードする配列を含む）、ATCC番 号67024（これはインターロイキン-1bをコードする配列を含む）、ATCC番号3940 5、39452、39516、39626、および39673（これはインターロイキン-2をコードす る配列を含む）、ATCC番号59399、59398、および67326（これはインターロイキ ン-3をコードする配列を含む）、ATCC番号57592（これはインターロイキン-4を コードする配列を含む）、ATCC番号59394および59395（これらはインターロイキ ン-5をコードする配列を含む）、およびATCC番号67153（これはインターロイキ ン-6をコードする配列を含む）が挙げられる。 上記のサイトカインを発現する遺伝子送達ビヒクルは、種々の障害の処置にお いて有用である。例えば、悪性の遺伝子治療処置の記載についての「Compositio ns and Methods for Cancer Immunotherapy」と題されたPCT公開番号US94/02951 を参照のこと。 15．神経障害および神経疾患 チロシンヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチドは、パーキンソン病 の処置において有用であり得る。 発作または任意の急性脳損傷のために、IGF-1、bFGF、血管内皮増殖因子（VEG F）をコードするポリヌクレオチドが有用である。 16．肺障害 気腫を処置するためには、α1-抗トリプシンをコードするポリヌクレオチドが 有用である。 肺繊維症を処置するためには、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）をコー ドするポリヌクレオチドが有用である。 嚢胞性繊維症を処置するためには、CFTRをコードするポリヌクレオチドが有用 である。 さらなる薬剤 さらなる薬剤が、送達されるべき所望のポリヌクレオチドとともに含まれ得る 。これらのさらなる薬剤は、例えば、所望の核酸のエンドサイトーシスを容易に し得るか、または核酸の細胞表面への結合を援助し得るか、もしくはその両方で ある。 Ａ．ポリペプチド １つの例は、限定されないが、以下を含むポリペプチドである：アシアロオ口 ソムコイド（ASOR）；トランスフェリン；アシアロ糖タンパク質；抗体；抗体フ ラグメント；フェリチン；インターロイキン；インターフェロン、顆粒球、マク ロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、 マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、幹細胞因子、およびエリスロポイ エチン。エンベロープタンパク質のようなウイルス抗原もまた使用され得る。ま た、RIIとして知られるplasmodium falciparumのcircumsporozoiteタンパク質か らの17アミノ酸ペプチドのような、他の侵入生物からのタンパク質。 Ｂ．ホルモン、ビタミンなど 含まれ得る他の群は、例えば：ホルモン、ステロイド、アンドロゲン、エスト ロゲン、甲状腺ホルモン、またはビタミン、葉酸である。 C．ポリアルキレン、ポリサッカライドなど ポリアルキレングリコールが、所望のポリヌクレオチドとともに含まれ得る。 好ましい実施態様において、ポリアルキレングリコールはポリエチレングリコー ルである。さらに、モノ-、ジ-、またはポリサッカライドが含まれ得る。この局 面の好ましい実施態様において、ポリサッカライドはデキストランまたはDEAE- デキストランである。また、キトサンおよびポリ（ラクチド-コ-グリコリド）。 D．脂質およびリポソーム 所望のポリヌクレオチドはまた、被検体またはそれ由来の細胞へ送達する前に 、脂質中にカプセル化され得るか、またはリポソーム中にパッケージングされ得 る。 脂質カプセル化は、一般には、核酸の結合を安定化するかまたは捕獲し、そし てこれを保持し得るリポソームを使用して達成される。縮合されたポリヌクレオ チドの脂質調製物に対する比は変化し得るが、一般には１：１（1mgのDNA：１μ ｍｏｌの脂質）付近、またはより脂質が多い。核酸の送達のためのキャリアーと してのリポソームの使用の概説については、HugおよびSleight,1991,Biochim．B iophys ．Acta．1097:1-17;Straubingerら、METHODS OF ENZYMOLOGY(1983),第101 巻、512-527頁を参照のこと。 本発明における使用のためのリポソーム調製物には、カチオン性（正に荷電） 、アニオン性（負に荷電）、および中性調製物が挙げられる。カチオン性リポソ ームは、プラスミドDNA（Felgnerら、1987,Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:741 3-7416）；mRNA（Maloneら、1989，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:6077-6081 ）；および精製転写因子（Debsら、1990,J．Biol．Chem．265:10189-10192）の 細胞内送達を、機能形態において媒介することが示されている。 カチオン性リポソームは、容易に入手可能である。例えば、N[1-2,3-ジオレイ ルオキシ）プロピル］-N,N,N-トリエチルアンモニウム（DOTMA）リポソームは、 G （例えば、また、Felgnerら、1987,Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:7413-7416 を参照のこと）。他の市販のリポソームには、トランスフェクテース（DDAB/DOP E）およびDOTAP/DOPE（Boerhinger）が挙げられる。他のカチオン性リポソーム は、当該分野に周知の技術を使用して容易に入手可能な物質から調製され得る。 DOTAP（1,2-ビス（オレオイルオキシ）-3-（トリメチルアンモニオ）プロパン） リポソームの合成の記載については、例えば、Szokaら、1987,Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 75:4194-4198；PCT公開番号WO 90/11092を参照のこと。 同様に、アニオン性および中性リポソームは、例えば、Avanti Polar Lipids( Birmingham,AL)から容易に入手可能であるか、または容易に入手可能な物質を使 用して簡単に調製され得る。このような物質には、ホスファチジルコリン、コレ ステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコ リン（DOPC）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（DOPG）、ジオレオイ ルホスファチジル（dioleoylphoshatidyl）エタノールアミン（DOPE）など が挙げられる。これらの物質はまた、適切な比で、DOTMAおよびDOTAP出発物質と 混合され得る。これらの物質を使用するリポソームの作製の方法は、当該分野に 周知である。 リポソームは、多層状小胞（MLV）、小さな単層小胞（SUV）、または大きな単 層小胞（LUV）を含み得る。種々のリポソーム-核酸複合体は、当該分野で公知の 方法を使用して調製される。例えば、Straubingerら、METHODS OF IMMUNOLOGY(1 983),第101巻,512-527頁；Szokaら、1987，Proc．Natl Acad．Sci．USA 75:4194 -4198；Papahadjopoulosら、1975，Biochim．Biophys．Acta 394:483；Wilsonら 、1979，Cell 17:77；DeamerおよびBangham，1976，Biochim．Biophys．Acta 44 3 :629；Ostroら、1977，Biochem．Biophys．Res．Commun．76:836；Fraleyら、1 979，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 76:3348）；EnochおよびStrittmatter，1979 ，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 76:145）；Fraleyら、1980，J．Biol．Chem．25 5 :10431；SzokaおよびPapahadjopoulos，1978，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 75 :145；およびSchaefer-Ridderら、1982，Science 215:166を参照のこと。 Ｅ．リポタンパク質 さらに、リポタンパク質は、送達されるポリヌクレオチドとともに含まれ得る 。利用されるリポタンパク質の例には：カイロミクロン、HDL、IDL、LDLおよびV LDLが含まれる。これらのタンパク質の変異体、フラグメント、または融合体も また使用され得る。また、アセチル化LDLのような天然に存在するリポタンパク 質の改変体も使用され得る。これらのリポタンパク質は、リポタンパク質レセプ ターを発現する細胞へのポリヌクレオチドの送達を標的化し得る。好ましくは、 リポタンパク質が送達されるべきポリヌクレオチドとともに含まれる場合、他の 標的リガンドは組成物中に含まれない。 リポタンパク質は、送達される所望のポリヌクレオチド、好ましくは以下を含 む組成物とともに含まれる：（1）リポタンパク質；（2）ポリヌクレオチド；お よび（3）ポリヌクレオチド結合分子。 天然に存在するリポタンパク質は、脂質部分およびタンパク質部分を含む。タ ンパク質部分は、アポタンパク質として知られる。現在では、アポタンパク質Ａ 、 Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥが単離され、そして同定されている。これらの少なくとも ２つは、ローマ数字により命名されるいくつかのタンパク質、AI、AII、AIV；CI 、CII、CIIIを含む。 リポタンパク質は、１つより多いアポタンパク質を含み得る。例えば、天然に 存在するカイロミクロンは、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＥを含み、経時的に、これらの リポタンパク質はAを喪失し、そしてCおよびEアポタンパク質を獲得する。VLDL は、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＥアポタンパク質を含み、LDLはアポタンパク質Ｂを含 み；そしてHDLはアポタンパク質Ａ、ＣおよびＥを含む。 これらのアポタンパク質のアミノ酸は公知であり、そして例えば、Breslow,19 85，Annu Rev．Biochem 54:699；Lawら、1986，Adv．Exp Med．Biol．151:162； Chenら、1986，J Biol Chem 261:12918；Kaneら、1980，Proc Natl Acad Sci US A 77:2465；およびUtermannら、1984，Hum Genet 65:232に記載されている。 リポタンパク質は、トリグリセリド、コレステロール（遊離およびエステル） 、およびリン脂質を含む、種々の脂質を含む。脂質の組成は、天然に存在するリ ポタンパク質において変化する。例えば、キロミクロンは、主にトリグリセリド を含む。天然に存在するリポタンパク質の脂質内容のより詳細な説明は、例えば 、Meth.Enzym.128(1986)に見い出され得る。脂質の組成は、レセプター結合活性 についてのアポタンパク質のコンホメーションを補助するように選択される。脂 質の組成はまた、ポリヌクレオチド結合分子との疎水性相互作用および会合を容 易にするために選択され得る。 天然に存在するリポタンパク質は、例えば、超遠心分離により血清から単離さ れ得る。このような方法は、Meth.Enzym.、前出；Pitasら、1980、J.Biochem.25 5:5454-5460；およびMaheyら、1979,J.Clin.Invest.64:743-750に記載されてい る。 リポタンパク質はまた、インビトロで、すなわち所望の宿主細胞におけるアポ タンパク質遺伝子の発現による組換え方法により生成され得る。例えば、Atkins onら、1986、Annu.Rev.Biophys.Chem.15:403、およびRaddingら、1958，Biochim .Biophys.Acta 30:443を参照のこと。 リポタンパク質はまた、商業供給元（例えば、Biomedical Technologies，In c.，Stoughton，Massachusetts，USA）から購入し得る。 天然に存在するアポタンパク質の変異体、フラグメント、および融合体は、ポ リヌクレオチドの送達に有用である。これらのポリペプチドは、約80％を超える アミノ酸同一性；より代表的には約85％を超える；さらにより代表的には少なく とも90％の同一性を有する。好ましくは、これらのポリペプチドは、天然に存在 するリポタンパク質またはそれらのフラグメントと約92％を超えるアミノ酸配列 同一性；より好ましくは、約94％を超える；さらにより好ましくは約96％を超え る；さらにより好ましくは約98％を超える；さらにより好ましくは、約99％を超 える配列同一性を示す。 このような変異体、フラグメント、および融合体は、組換えDNA技術により所 望のリポタンパク質をコードするポリヌクレオチドを改変することにより構築さ れ得る。例えば、Sambrookら（1989）Molecular Cloning，A Laboratory Manual ，第２版（Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York）を参照 のこと。これらのポリヌクレオチドは、発現ベクターに挿入され得、そして宿主 細胞が、所望のアポタンパク質を産生するために利用され得る。 さらに、天然に存在するリポタンパク質、変異体、フラグメント、および融合 体は、化学的に改変され得る。例えば、アセチル化LDLは、生物学的活性を有す る。例えば、Nagelkerkeら、1983、J.Biol.Chem.258(20):12221-12227；Weisgra berら、1978、J.Biol.Chem.253;9053-9062；Voytaら、1984、J.Cell Biol.99:20 34-2040；Goldsteinら、1979；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:333-337；およびPit as,1981,Arterosclerosis 1:177-185を参照のこと。 化学的に改変されたリポタンパク質はまた、商業供給元（例えば、Biomedical Technologies，Inc.，Stoughton，Massachusetts，USA）から購入し得る。 これらのポリペプチドのすべてが、天然に存在するリポタンパク質のレセプタ ー結合特性を示す。通常、このようなポリペプチドは、天然に生じるリポタンパ ク質の少なくとも約20％のレセプター結合を示す。より代表的には、このポリペ プチドは、天然に存在するリポタンパク質の少なくとも約40％、さらにより代表 的には、このポリペプチドは、少なくとも約60％、さらにより代表的には、少な くとも約70％、さらにより代表的には、少なくとも約80％、さらにより代表的に は、少なくとも約85％、さらにより代表的には、少なくとも約90％、さらにより 代表的には、少なくとも約95％のレセプター結合を示す。 代表的には、リポタンパク質は、細胞中へのポリヌクレオチドの組み込みの頻 度を増大させるのに有効な量で存在する。このような量は、細胞中へのポリヌク レオチドの組み込みの頻度を、裸のポリヌクレオチドの組込みの頻度と比較して 少なくとも10％；より通常には少なくとも15％；さらにより通常には20％；さら により通常には少なくとも30％、増大させるのに充分である。増大は、40〜100 ％の間であり得、そして1000％および10000％の増大でさえあり得る。 「ポリヌクレオチド結合分子」とは、ポリヌクレオチドと会合する化合物をい い、そしてこの会合は、配列特異的ではない。例えば、このような分子は、（１ ）ポリヌクレオチドの電荷の中和を補助するか、または（２）ヌクレオチドの縮 合を容易にするか、または（３）血清もしくはヌクレアーセ分解を阻害し得る。 必要に応じて、ポリヌクレオチド結合分子は、疎水性結合または電荷のいずれか によりリポタンパク質と相互作用し得る。ポリヌクレオチド結合分子は、ポリペ プチド、無機化合物、ビタミンなどを含むが、これらに限定されない。 ポリヌクレオチド結合分子の例には：ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオル ニチン、およびプロタミンが挙げられる。有機ポリカチオンの例には：スペルミ ン、スペルミジン、およびプトレッシン(purtrescine)を含む。他の例としては 、ヒストン、プロタミン、ヒト血清アルブミン、DNA結合タンパク質、非ヒスト ン染色体タンパク質、DNAウイルス由来外被タンパク質（例えば、φX174）が挙 げられ、転写因子はまた、DNAに結合するドメインを含み、それゆえ核酸縮合剤 として有用であり得る。手短には、転写因子（例えば、C/CEBP,c-jun,c-fos,AP- 1,AP-2,AP-3,CPF,Prot-1,Sp-1,Oct-1,Oct-2,CREP,およびTFIID）は、DNA配列に 結合する塩基性(basic)ドメインを含む。 他の正に荷電した部分の例は、ポリブレン、DEAE-デキストラン、およびカチ オン性脂質を含む。有用なカチオン性脂質およびリポソームは上記に記載されて いる。脂質およびリポソームは、ポリヌクレオチドおよびリポタンパク質の両方 をカプセル化するために、本発明のこの局面では使用されない。リポタンパク質 は、細胞表面レセプターに結合するように曝露されなければならない。 負に荷電したポリヌクレオチドに結合し得る他の合成化合物、例えば、Ｎ置換 グリシンおよびその他のポリマーは、以下に記載されるように有用である。 リポタンパク質を有する組成物において、ポリヌクレオチド結合分子はまた、 ポリヌクレオチドを中和するのに有効な量で存在し得る。しかし、ポリヌクレオ チド結合分子はまた、送達されるポリヌクレオチドを中和するのに有効な量より 過剰で存在し得る。このような過剰は、送達されるポリヌクレオチドと複合体化 された場合、正味の正の電荷を生じ得る。次いで、正に荷電した複合体は、リン 脂質のような負に荷電した脂質を含むリポタンパク質と相互作用し得る。 代表的には、ポリヌクレオチド結合分子は、以下の場合に過剰である：量が、 ポリヌクレオチド電荷を中和する量より10％多い；より代表的には、所望のポリ ヌクレオチドの電荷を中和するに有効な量より50％多い、さらにより代表的には 100％より多い、さらにより代表的には、150％より多い、さらにより代表的には 200％より多い、さらにより代表的には、500％より多い、さらにより代表的には 、20,000％より多い、さらにより代表的には、22,000％より多い、さらにより代 表的には、25,000％より多い、さらにより代表的には、30,000％より多い、さら により代表的には、40,000％より多い。 ポリカチオン性薬剤 ポリカチオン性薬剤は、リポタンパク質を伴うかまたは伴わずに、所望の送達 されるポリヌクレオチドを伴う組成物中に含まれ得る。 機能特性 Ａ．正味の正電荷 ポリカチオン性薬剤は、代表的に、生理的に関連のあるpHにおいて正味の正荷 電を示し、そして所望の場所への送達を容易にする核酸の電荷を中和し得る。こ れらの因子は、インビトロ、エキソビボ、およびインビボの両方の適用を有する 。例えば、これらのポリカチオン性薬剤を使用して、組換えタンパク質を産生す るのに使用される細胞をトランスフェクトし得る。あるいは、本発明のポリカチ オン性薬剤を使用して、核酸を生きた被験体に筋肉内、皮下などのいずれかで送 達 し得る。 生理学的に関連のあるpHは、インビトロとインビボ適用との間でいくらか変動 する。代表的には、生理学的pHは、少なくとも5.5であり；より代表的には少な くとも6.0であり；さらにより代表的には、少なくとも6.5である。通常、生理学 的に関連のあるpHは、8.5は超えず；より通常には、8.0を超えず；さらにより通 常には、7.5を超えない。 好ましくは、核酸を中和するための本発明のポリカチオン性薬剤の等電点は、 少なくとも９である。 Ｂ．非毒性特性および非免疫原性特性 本発明のポリカチオン性薬剤の組成物は、所望の毒性特性および免疫原性特性 を示す。インビトロ細胞培養は、インビボ哺乳動物適用とは異なる免疫原性制限 を有する。 本発明のポリカチオン性薬剤は、毒性について容易に試験され得る。例えば、 薬剤は、インビトロアッセイ（例えば、cos-7、チャイニーズハムスター卵巣細 胞など）において使用される細胞のための培地に添加され得る。あるいは、薬剤 は、安全性についての標準的な動物試験において試験され得る。 Ｃ．縮合特性 電荷に起因して、これらのポリカチオン性薬剤のサブセットは、送達を容易に するために緻密なサイズへと所望の核酸を縮合し得る。代表的には、縮合は、ポ リヌクレオチドまたは核酸を巨大分子構造（通常、トロイド形態）へと「崩壊」 させる。縮合核酸のより小さなサイズは、例えば、核酸をリポソーム中にパッケ ージングするか、ならびに／またはプロテアーゼおよび／もしくはヌクレアーゼ への曝露を低減することを容易にすることにより送達を容易にさせる。 縮合核酸は、「弛緩」核酸と比べて異なる特性を示す（例えば、（１）エチジ ウムブロマイドまたは他のインターカレート染料のインターカレーションにおけ る減少、または（2）ゲル電気泳動における移動度の減少）。従って、縮合は、 少なくとも２つの異なるアッセイ、インターカレート染料アッセイ、またはバン ドシフトアッセイにより測定され得る。 インターカレート染料アッセイの１つの型は、エチジウムブロミドを使用する 。このアッセイにおいて、試験核酸（簡便にはプラスミドDNA）は、ポリカチオ ン性薬剤と約１：１〜１：５０（重量／重量、プラスミド対縮合剤の比）の比で 混合され得る。インキュベーション後、エチジウムブロマイドを反応物に最終濃 度１μｇ/mLで添加する。RNAのような核酸が試験核酸として使用される場合、ア クリジンオレンジが、インターカレート染料として使用され得る。反応混合物を 、１％のアガロースゲルでスポットしたUV透過プラスチックチューブに移すか、 またはUV透過プラスチックc上に配置し、そして260nm光で照射する。DNA−エチ ジウムブロマイド複合体からの放射をフィルム上に、適切なUVフィルターを備え るカメラにより記録する。薬剤のDNAを縮合する能力は、各反応混合物における 蛍光の強度により反比例する。 より詳細な試験はバンドシフトアッセイである。手短には、このアッセイは、 核酸（標識されているかまたはされていない）を種々の濃度の候補縮合剤とイン キュベートすることにより実施される。試験核酸（簡便にはプラスミドDNA）お よび縮合剤は、１：１〜１：５０ｗ／ｗの比で混合される。インキュベーション 後、各サンプルを１％アガロースゲルにロードし、そして電気泳動し、次いでゲ ルをエチジウムブロマイドで染色するかまたは乾燥させて、そしてオートラジオ グラフを取る。DNA縮合は、非縮合標準と比べてゲルに入ることができないこと により決定される。充分な縮合は、少なくとも90％のDNAが有意な程度にゲルに 入り得ない場合に達成される。 縮合はまた、例えば、光散乱装置（例えば、Coulter N4MDサブミクロン分析器 ）を用いて複合体のサイズを直接決定することにより測定され得る。ポリヌクレ オチドおよび縮合剤を適切な比で、それだけでかまたは２％のPEG-2000（Fisher Scientific）および0.6MのNaClの存在下でインキュベートし、次に3mlの水に希 釈する。この希釈溶液は、Coulter計数器により分析する。この計数器は０〜1， 000ナノメーター（nm）の平均サイズを有する粒子を検出する。縮合剤（例えば 、ポリ-L-リジン）は、代表的に平均径が約50〜200nmの粒子を得る。Leeら、199 6，J.Biol.Chem.271:8481-8487を参照のこと。 Ｄ．血清および／またはヌクレアーゼ保護特性 本発明のポリカチオン性薬剤は、核酸を血清における分解またはヌクレアーゼ （生物学的溶液（例えば、血清、前立腺液、関節液など）に存在するヌクレアー ゼを含む）から保護し得る。この型の保護の１つの利点は、より少量の所望の核 酸が有効な投与に必要であることである。 有効量で存在する場合、これらのポリカチオン性薬剤は、複合体化していない 核酸と比較して血清分解を少なくとも５分間阻害し得る；より通常には、使用さ れる量は、少なくとも10分間分解を阻害するのに十分である；さらにより通常に は、使用される量は、少なくとも30分間分解を阻害するのに十分である；さらに より通常には、少なくとも45分間分解を阻害するのに十分である；さらにより通 常には、少なくとも60分間分解を阻害するのに十分である；さらにより通常には 、少なくとも90分間分解を阻害するのに十分である；より通常には、少なくとも 120分間分解を阻害するのに十分である。 血清保護の増大は、例えば、単に、ポリカチオン／ポリヌクレオチド複合体の マウス血清とのインキュベーションにより測定され得る。好ましくは、血清は、 熱不安定化される。インキュベーション後、混合物をゲル電気泳動で分析して、 インキュベーション後に残留するポリヌクレオチドの量を決定し得る。 あるいは、ヌクレアーゼをポリカチオン性薬剤／核酸複合体に添加し得る。得 られる混合物をゲル電気泳動で分析して、分解の量を決定し得る。他の生物学的 溶液（例えば、前立腺液）もまた、試験され得る。 Ｅ．細胞へのポリヌクレオチドの進入の媒介 ポリカチオン性薬剤は、ポリヌクレオチドの細胞への進入を媒介し得る。ポリ ヌクレオチドの細胞への組込みは、例えば、タンパク質発現アッセイまたはポリ ヌクレオチドハイブリダイゼーション技術のいずれかにより測定され得る。 組込みの頻度を検出する１つの方法は、マーカータンパク質（例えば、ルシフ ェラーゼ）をコードする遺伝子を含むことである。送達されるポリヌクレオチド を組み込んだ細胞は、マーカータンパク質を発現する。タンパク質は、標準的な 免疫アッセイによるか、またはルシフェラーゼの場合のように生物学的活性もし くは酵素活性により検出され得る。 あるいは、標準的なハイブリダイゼーション技術（例えば、サザンブロットま たはノーザンブロット、あるいはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術）を使用し て所望のポリヌクレオチドの存在を検出し得る。 Ｆ．さらなる特性 細胞の内部への核酸の進入を容易にするために、本発明の薬剤は、以下のこと が可能であり得る： （a）細胞表面へのポリヌクレオチドの結合； （b）細胞膜の不安定化； （c）エンドサイトーシスを開始させる； （d）エンドソーム緩衝化能力； （e）エンドソームからのDNA／脂質複合体の放出；または （f）核屈性。 これらの特徴を検出するためのアッセイは、標準的であり、当業者に公知であ る。物理的特性 以下の物理的特性は、ポリカチオン性薬剤の組成物を決定する場合、考慮され るべき要因である： （a）置換基とバックボーンとの距離； （b）鎖の全長； （b）疎水性および／または芳香性； （c）水素結合基の数；および （c）以下を含む電荷 （i）荷電基の型、（ii）荷電密度、および（iii）位置。 他の関連する特徴は、構造的可撓性を含む。例えば、ポリカチオン性薬剤のヘ リックス構造は、いくつかの適用において好ましくあり得る。 考慮されるべき特定の寸法は以下を含む： （a）目的のポリヌクレオチドにおけるリン酸基の距離；および （b）目的の薬剤におけるモノマー基の距離。ポリペプチドポリカチオン性薬剤 以下は、ポリカチオン性薬剤として有用なポリペプチドの例である：ポリリジ ン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、およびプロタミン。他の例は、ヒストン 、プロタミン、ヒト血清アルブミン、DNA結合タンパク質、非ヒストン染色体タ ンパク質、DNAウイルスの外被タンパク質（例えば、φX174）を含み、転写因子 はまた、DNAに結合するドメインを含み、それゆえ核酸縮合剤として有用であり 得る。手短には、転写因子（例えば、C/CEBP,c-jun,c-fos,AP-1,AP-2,AP-3,CPF, Prot-1,Sp-1,Oct-1,Oct-2,CREP,およびTFIID）は、DNA配列に結合する塩基性ド メインを含む。 有機ポリカチオン性薬剤は、スペルミン、スペルミジン、およびプトレッシン を含む。 ポリカチオン性薬剤の寸法および物理的特性は、上記のリストから推定され得 、他のポリペプチドポリカチオン性薬剤を構築し得るかまたは合成ポリカチオン 性薬剤を生成し得る。合成ポリカチオン性薬剤 有用である合成ポリカチオン性薬剤は、例えば、DEAEデキストラン、ポリブレクレオチドと合わせた場合、ポリカチオン性複合体を形成するモノマーである。 本発明のポリカチオン性薬剤の好ましい基は、以下の一般式(I)を有する： これらの化合物の好ましいサブセットは、式(I)を有する化合物であって、こ こでR2が水素である、化合物を含む。さらにより好ましくは、少なくとも１つの 天然アミノ酸を含むポリマーである。また、好ましいのは、ポリマーであって、 ここでR2およびR3の両方が水素であり、これらはまた、ポリＮ置換グリシンまた はポリNSGといわれる。 Ａ．モノマー 本発明のポリカチオン性薬剤は、以下の構造(II)を有するモノマーを含む： 一般に、R1,R2およびR3は、それぞれ１から250ダルトンの分子量を有する部分 である。最も代表的には、分子量は200を超えず；さらにより代表的には、175を 超えない。 代表的には、各々のモノマーは、R1,R2またはR3に１つの水素を含む。より代 表的には、R1およびR3が共に水素であって、Ｌ−アミノ酸の構造であるか；また はR2およびR3が共に水素であって、NSGの構造であるかのいずれかである。 ポリカチオン性薬剤において利用されるモノマーは、正または負のいずれかに 荷電され得る。また、中性の置換基もまた、利用され得る。 分解部位は、例えば、R1およびR2が水素である場合、天然アミノ酸由来の置換 基を含めることによりポリマーに組み込まれ得る。これらのモノマーは、正また は負に荷電され得るか、あるいは中性であり得る。 一般的規則として、塩基性に(basically)荷電したモノマーは、側鎖について 少なくとも7.5のpKa値を有する。正に、または塩基性に荷電されたモノマーは、 これらに限定されることなく、以下の官能基を含有するモノマーを含む：アミノ 、グアニジノ、ヒドラジド、およびアミジノ。これらの官能基は、芳香族または 脂肪族であり得る。 R3およびR1に水素を含む正に荷電したモノマーは、ポリカチオン性薬剤中に例 えば分解部位として含められ得る。このような分解部位は、ポリヌクレオチドか らのポリカチオン性薬剤の分離を補助し得、さらなるプロセシングを可能にする 。 モノマーのようなL-アミノ酸について、有用なR2置換基は、例えば、天然に存在 するアミノ酸（例えば、リジンまたはアルギニン）に見い出されるもの由来であ る。また、アミノ酸アナログの側鎖、例えば、オルニチンおよびカナリン；また は塩基性アミノ酸の改変（例えば、ホモアルギニン）、および他のアミノ酸の改 変（例えば、グアニジノバリネートおよびアミノエチルシステイン）が使用され 得る。L-アミノ酸に見い出される置換基はまた、本発明のポリカチオン性薬剤の R1位およびR3位に組み込まれ得る。 天然に存在するアミノ酸およびアナログは、これらの分子の鏡像異性を示すよ うにD-アミノ酸と命名される。L-アミノ酸もまた、モノマーとしてポリカチオン 性薬剤へ組み込まれ得る。L-アミノ酸の置換基は、例えば、D-アミノ酸について 命名されるように同一であり得る。 好ましいモノマーは、Ｎ置換グリシンモノマーを含む。例示的なＮ置換は、ア ルキルフェニル(alklphenyl)、インドリルアルキル、アルコキシフェニル、ハロ フェニルアルキル、ヒドロキシフェニルアルキル、ならびに下記に示されるＮ置 換を含む。 ポリカチオン性薬剤は、負に荷電したモノマーまたは中性のモノマーを含み得 る。正に荷電したモノマーに関して、D-アミノ酸、L-アミノ酸、およびNSGが、 モノマーとして組み込まれるのが好ましい。 以下は、このようなモノマーの例である： Ｂ．ポリカチオン性ポリマー 代表的に、ポリカチオン性薬剤は、末端基を除き、少なくとも９の推定等電点 を示す。さらに、薬剤は、末端基を除き、少なくとも20％の正に荷電したモノマ ー；より代表的には、少なくとも25％；より代表的には30％、および好ましくは 少なくとも33％の正に荷電したモノマーを含む。代表的には、薬剤は、５％を超 えない酸性モノマーを含み、好ましくは全く含まない。 ポリカチオン性薬剤の荷電密度および組成を変換して、特定の核酸配列、型、 および核酸とポリカチオン性薬剤との複合体とともに含まれる他の成分に適応さ せ得る。 通常、ポリマーの長さは、少なくとも８モノマーであり；さらにより通常には 、12モノマーであり；さらにより通常には18モノマーである。より代表的には、 本発明のポリカチオン性薬剤は、長さが少なくとも24モノマー単位であり；より 代表的には、30モノマー単位であり；さらにより代表的には、36モノマー単位で あり；さらにより代表的には48モノマー単位である。ポリカチオン性薬剤は、長 さが50まで、75まで、100までのモノマー単位であり得る。 好ましくは、ポリカチオン性薬剤は、すべてのR2およびR3が水素であるモノマ ーを含む。さらにより好ましくは、すべてのR2およびR3が水素である場合、ポリ カチオン性薬剤が、（アミノ末端からカルボキシ末端に向かって）以下のモノマ ー配列を有する反復トリマー単位を含む：（1）中性モノマー、（2）中性モノマ ー、および（3）正に荷電したモノマー。 好ましくは、中性モノマーは、R1位に芳香族基を含み；より好ましくは、芳香 族基が単環を含む；さらにより好ましくは、芳香族基が６員環である。 代表的には、正に荷電したモノマーは、R1位がアミノアルキルであり；より代 表的には、アミノアルキルは、1-6炭素分子を含み；さらにより代表的には、ア ミノアルキルはアミノエチルである。 代表的には、ポリカチオン性薬剤は、３〜20の反復トリマーを含み、２つの中 性および１つの正に荷電したR1基を有するトリマー（例えば、配列、中性モノマ ー、中性モノマー、正に荷電したモノマーを有するトリマー）が好ましい。より 好ましくは、ポリカチオン性薬剤は、５〜18のトリマーを含み；好ましくは８〜 16トリマーを含み；そしてさらにより好ましくは、12〜16のトリマーを含む。 必要に応じて、ポリカチオン性薬剤は、末端基を除いて、正に荷電したモノマ ーのみを含む。代表的には、このようなポリカチオン性薬剤は、24〜48のモノマ ーを含み；より代表的には、30〜40のモノマーを含み；さらにより代表的には、 36モノマーを含む。 正に荷電したモノマーのみを含む本発明のポリカチオン性薬剤は、代表的には グアニジノアルキル側鎖を有する。代表的には、グアニジノアルキル側鎖は、１ 〜６個の炭素分子を含む。好ましくは、側鎖は、グアニジノエチルである。 Ｃ．中性ポリマー 本発明の中性ポリマーの好ましい基は、一般式(I)を有する： 好ましくは、R2は水素である。少なくとも１つの天然アミノ酸を含むポリマー がさらにより好ましい。また、好ましいのは、式(I)を有するポリマーであって 、ここでR2およびR3が水素であり、これはまたポリＮ置換グリシンまたはポリNS Gといわれる。 本発明の中性ポリマーにおいて使用されるポリマーは、本発明のカチオン性ポ リマーにおいて使用されるモノマーと同一の一般式を有する。すなわち： 一般に、R1,R2およびR3は、それぞれ１から250ダルトンの分子量を有する部分 である。より代表的には、分子量は200を超えず；さらにより代表的には、175を 超えない。 代表的には、各々のモノマーは、R1,R2またはR3に１つの水素を含む。より代 表 的には、R1およびR3が共に水素であって、Ｌ−アミノ酸の構造であるか；または R2およびR3が共に水素であって、NSGの構造であるかのいずれかである。 中性薬剤において利用されるモノマーは、正または負のいずれかに荷電され得 る。また、中性の置換基もまた、利用され得る。中性ポリマーは、末端基を除い て、正味の正または負の電荷を示さない。 分解部位は、R1およびR3が水素である場合、モノマーにおいて天然アミノ酸置 換基を用いることによりポリマーに組み込まれ得る。 天然に存在するアミノ酸およびアナログは、これらの分子の鏡像異性を示すよ うにD-アミノ酸と命名される。L-アミノ酸もまた、モノマーとして中性ポリマー へ組み込まれ得る。L-アミノ酸の置換基は、例えば、D-アミノ酸について命名さ れるのと同一であり得る。 好ましいモノマーは、Ｎ置換グリシンモノマー、ならびに送達されるポリヌク レオチドと水素結合および／またはイオン結合を形成し得るモノマーを包含する 。 中性ポリマーのためのモノマーの例は、上記および以下の実施例に記載のモノ マーを含む。 Ｄ．ポリマーどうしを連結する 複数のポリマーは、ポリマーの架橋が可能である末端基または側鎖を互いに結 合することによって、連結され得る。例えば、ポリマーはジスルフィド結合によ って連結され得る。ポリマーをカップリングするために有用な他の末端基は、炭 酸塩、尿素などを含む。 Ｅ．ポリマーに組み込まれるさらなる基 さらなる成分が本発明のポリカチオン性薬剤（例えば、標的化リガンド）に含 まれ得る。このようなさらなる基は、所望の核酸のエンドサイトーシスを容易に し得るか、または細胞表面への核酸の結合を補助し得る。 ポリペプチドは、ポリカチオン性薬剤中に組み込まれ得る。例には、限定する ことなしに、以下が含まれる：アシアロオロソムコイド（ASOR）；トランスフェ リン；アシアロ糖タンパク質；抗体；抗体フラグメント；フェリチン；インター ロイキン；インターフェロン；顆粒球；マクロファージコロニー刺激因子（GM-C SF）；顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)；マクロファージコロニー刺激因子（M-C SF）；幹細胞因子；およびエリスロポエチン。ウイルス抗原（例えば、エンベロ ープタンパク質）もまた使用され得る。また、他の侵襲性生物由来のタンパク質 （例えば、RIIとして知られるPlasmodium falciparumのサーカムスポロゾイト（ circumsporozoite）タンパク質由来の17アミノ酸ペプチド）も有用である。 さらに、リポタンパク質が、ポリカチオン性薬剤（例えば、低密度リポタンパ ク質、高密度リポタンパク質、または非常に低密度のリポタンパク質）中に組み 込まれ得る。これらのタンパク質の変異体、フラグメント、または融合物もまた 使用され得る。 組み込まれ得る他の基には、限定することなしに、以下が含まれる：ホルモン 、ステロイド、アンドロゲン、エストロゲン、甲状腺ホルモン、またはビタミン 、葉酸。葉酸は、例えば、Mislickら、1995，T.J．Bioconjugate Chem．6:512に 従って、ポリカチオン性薬剤に組み込まれ得る。 また、本発明のポリカチオン性薬剤は、ポリアルキレングリコールと化学的に 結合され得る。好ましい実施態様において、ポリアルキレングリコールは、ポリ エチレングリコールである。PEGは、例えば、Luら、1994，Int．J．Pept．Prote in Res．43:127に従って、ポリカチオン薬剤とともに組み込まれ得る。 さらに、ポリカチオン性薬剤は、化学的にモノ、ジ、またはポリサッカライド と結合され得る。この局面の好ましい実施態様において、ポリサッカライドは、 デキストランである。 これらのさらなる基は、ポリカチオン性薬剤中に組み込まれ得る。例えば、R1 、R2、およびR3は、上記の基のいずれか１つと架橋するように活性化され得る置 換基であり得る。例えば、チオール基は、別の基と架橋してジスルフィド結合を 形成するために含まれ得る。 Ｆ．末端基 本発明のポリカチオン性薬剤の末端基は、適宜選択され得る。適切な末端基（ すなわち、TaおよびTc）には、例えば-NH2、-OH、-SH、および-COOHが含まれ る。末端基は、ポリカチオン性薬剤の標的化特性を増強するように選択され得、 そして上記のさらなる基のいずれかであり得る。 上記のさらなる基は、ポリカチオン性薬剤の末端に組み込まれ得る。例えば、 ポリカチオン性薬剤は、（１）種々のカルボン酸でアシル化され得るか；（２） スルホニルクロライドでスルホニル化され得るか；または（３）イソシアネート またはイソチオシアネートで誘導体化され得る。一旦活性化されると、末端は、 上記の基のいずれか（例えば、ポリペプチド（例えば、低密度リポタンパク質） または葉酸）と反応され得る。 末端基をポリカチオン性薬剤に付加する１つの手段は、例えば、（１）アミノ 末端をFmoc-アミノ-ヘキサン酸でアシル化すること；および（２）保護基Fmocを 除去して一級アミン（これは、さらに官能化され得る）を生成することである。 あるいは、アミノ末端基には、限定することなしに以下が含まれる：アシル（ 例えば、アセチル、ベンゾイル）；またはスルホニル（例えば、ダンシル）。 カルボキシ末端基には、例えば、アミドまたはアルキルアミドが含まれ得る。ポリカチオン性薬剤の合成 本発明のポリカリオン性薬剤は、固相または液相法のいずれかによって合成さ れ得る。以下は、NSGの合成のための固相法であり、これは一般に広範な種々の 側鎖の置換基について使用され得る。この方法は、自動化ペプチド合成装置を利 用して行われ、目的のポリカチオン性薬剤の迅速な合成を可能にし得る。このよ うな装置は、例えば、Applied BiosystemsおよびMilligenから市販されている。 Ａ．２工程モノマーアセンブリ 合成の方法は、NSGモノマーを含むポリマーを拡張する過程で、２つのサブモ ノマーからモノマーをアセンブリすることである。この技術は、Zuckermannら、 1992，J．Amer Chem Soc 114(26):10646-10647、およびZuckermannら、PCT特許 公報第WO94/06451に記載される。NSGはまた、アシル化剤およびアミンのコポリ マーの交互の縮合であると考えられ得る。 サブモノマーでのポリマー合成の方向は、カルボキシからアミノの方向に起こ る。ポリマー形成の経過における各モノマーについての固相アセンブリは、反応 性側鎖官能性が保護される必要があるだけなので、Nα保護モノマーに対する必 要性を排除する。 各モノマーの付加は、図１に示されるように、アシル化工程および求核置換工 程の２工程を含む。 詳細には、モノマー付加の各サイクルは、２工程からなる： （１）アミンおよびカルボニル基（好ましくはカルボキシル基）による求核置 換の可能な脱離基を含むアシル化剤での、支持体に結合した二級アミンのアシル 化。例は、ハロ酢酸である；および （２）側鎖を導入するための、一級アミノ基を含む十分な量のサブモノマーで の脱離基の求核置換。サブモノマーを含むアミノ基は、アルコキシアミン、セミ カルバジド、アシルヒドラジド、置換ヒドラジンなどであり得る。 アシル化は、カルボジイミドまたは他の適切なカルボキシレート活性化法で活 性化され得る。 置換の効率は、ハロゲン化物（例えば、I>Cl）の選択によって調節される。脂 肪族ヒドロキシル基、カルボン酸、カルボキシ、チオール、アミノ、いくつかの ヘテロ環、および他の反応性側鎖の官能性の保護が、所望でない側鎖反応を最小 化するために好ましい。しかし、いくつかの側鎖部分の置換またはアシル化に対 する穏やかな反応性は、保護（例えば、インドール、イミダゾール、およびフェ ノール）なしでのそれらの使用を可能にし得る。 Ｂ．３工程モノマーアセンブリ NSGはまた、ポリマーが拡張するにつれて各モノマーをアセンブリするための ３工程法を使用して構築され得る。最初のモノマーの骨格は、アシル化工程によ って拡張され、その後求核置換される。側鎖は、第二のアシル化工程によって導 入される。反応スキームは、図２に示される。 モノマーの骨格は、合成サイクルの最初の２つの工程においてアセンブリされ る。第一の反応は、アシル化剤のカルボニル基がアミンと反応するアシル化工程 である。アシル化剤は、カルボニル基；骨格、Ra；および脱離基、Ｌを含む。好 ましくは、カルボニル基は、カルボキシルである。 第二の工程は、置換剤の第一のアミノ基による脱離基の求核置換である。置換 剤は、第一および第二アミノ基ならびに骨格Rdを含む。第一のアミノ基は、一級 アミンであり、そして第二の工程は、二級アミンを生成する。 第三の工程は、別のアシル化サブモノマーが、置換剤の第一のアミノ基と反応 して第三のアミドを生成する別のアシル化である。アシル化剤は、カルボニル基 ；必要に応じてリンカー；および側鎖を含む。好ましくは、カルボニル基は、カ ルボキシルである。薬学的組成物 ポリカチオン性薬剤/ポリヌクレオチド複合体は、リポソームにカプセル化さ れていようとなかろうと、薬学的組成物中にて投与され得る。薬学的組成物は、 治療有効量の核酸を含む。 本明細書中で使用される用語「治療有効量」は、特定の疾患または症状を検出 可能に処置、改善、または予防するのに十分な治療薬剤の量（すなわち、検出可 能な治療的または予防的効果を誘導するのに十分な量）をいう。効果は、例えば 、化学的マーカーまたは抗原レベルを含み得る。治療的効果はまた、物理的徴候 の低減（例えば、体温の低下）を含む。被験体にとっての正確な有効量は、被験 体のサイズおよび健康、心臓血管症状の性質および程度、ならびに投与のために 選択された治療または治療法の組合せに依存する。従って、正確な有効量を前も って特定することは有用ではない。しかし、所与の状況にとっての有効量は、日 常的な実験によって決定され得、そして臨床医の判断内にある。本発明の目的の ために、有効用量は、投与される個体において、約0.01mg/kg〜50mg/kgまたは0. 05mg/kg〜約10mg/kgのDNA構築物である。 薬学的組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。用語「薬学的 に受容可能なキャリア」は、治療薬剤（例えば、抗体またはポリペプチド、遺伝 子、および他の治療薬剤）の投与のためのキャリアをいう。この用語は、組成物 を受ける個体に有害な抗体の産生をそれ自体誘導しない任意の薬学的キャリアを いい、そしてそれは過剰な毒性なしに投与され得る。適切なキャリアは、大きく 、 ゆっくり代謝される巨大分子（例えば、タンパク質、ポリサッカライド、ポリ乳 酸、ポリグリコール酸、重合体のアミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性 のウイルス粒子）であり得る。このようなキャリアは、当業者に周知である。 薬学的に受容可能な塩（例えば、無機酸塩（例えば、ハイドロクロリド、ハイ ドロブロミド、ホスフェート、スルフェートなど）；および有機酸の塩（例えば 、アセテート、プロピオネート、マロネート、ベンゾエートなど））が、本明細 書中で使用され得る。薬学的に受容可能な賦形剤の詳細な議論は、Remington's Pharmaceutical Sciences（Mack Pub．Co.，NJ．1991）において得られる。 治療的組成物における薬学的に受容可能なキャリアは、水、生理食塩水、グリ セロール、およびエタノールのような液体を含み得る。さらに、湿潤剤または乳 化剤のような補助的な物質、pH緩衝物質などは、このようなビヒクル中に存在し 得る。代表的には、治療的組成物は、注射可能な物質として、液体溶液または懸 濁液のいずれかとして調製される；注射の前の液体ビヒクル中での溶液または懸 濁液に適切な固体形態もまた調製され得る。リポソームは、薬学的に受容可能な キャリアの定義内に含まれる。送達方法 一旦処方されると、本発明の組成物は、（１）被験体に直接投与され得るか； （２）被験体由来の細胞にエクスビボで送達され得るか、または（３）インビト ロで組換えタンパク質の発現のために投与され得る。処置される被験体は、哺乳 動物または鳥類であり得る。また、ヒト被験体も処置され得る。 組成物の直接送達は、一般に、皮下、腹腔内、静脈内、または筋肉内のいずれ かでの注射によって達成されるか、または組織の間質性空間に送達される。組成 物はまた、腫瘍または病変に投与され得る。投与の他の態様には、経口投与およ び肺への投与、座剤、および経皮塗布、針、および遺伝子銃またはハイポスプレ ーが含まれる。投薬処置は、単回投与スケジュールまたは多数回投与スケジュー ルであり得る。 エキソビボ送達のための方法および形質転換された細胞の被験体への再移植は 、当該分野で公知であり、そして例えば、国際出願第WO93/14778（1993年８月５ 日 出願）に記載されている。エキソビボ適用に有用な細胞の例には、例えば、幹細 胞、特に造血細胞、リンパ細胞、マクロファージ、樹状細胞、または腫瘍細胞が 含まれる。 一般に、エキソビボおよびインビトロ適用の両方のための核酸の送達は、以下 の手順で達成され得る：例えば、デキストラン媒介トランスフェクション、リン 酸カルシウム沈澱、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合 、エレクトロポレーション、リポソーム中へのポリヌクレオチドのカプセル化、 およびDNAの核への直接的マイクロインジェクション。これらは全て当該分野で 周知である。 以下に示される実施例は、当業者に対するさらなる指針として提供され、そし ていかなる様式においても発明を限定するものとして解釈されるべきではない。 実施例１ ポリカチオン性薬剤の合成 この実施例は、以下の構造を有するポリカチオン性薬剤の合成を記載する： ここで、R3およびR2は、全てのモノマーについて水素である。本実施例で記載さ れる全てのポリマーは、特に示されない限り（例えば、葉酸終結基）、アミノお よびカルボキシル基で終結する。 以下に記載されるポリカチオン性薬剤を、Figliozziら、1996，Meth．Enzy．2 67:437-447およびZuckermannら、1992，J．Amer．Chem．Soc．114(26):10646-10 647に記載される手順に従って合成した。 全てのポリマーを、ブロモ酢酸および一級アミンを用いて合成した。以下は、 R1に配置されてポリカチオン性薬剤を構築する一級アミンの置換体である： ＊精製された 方法を要約するために、Fmoc-Rinkアミド樹脂（NovaBiochem，San Diego，Cal ifornla，USA）を固体支持体として使用する。これは、ペプチドＣ末端アミドの Fmoc合成のために使用されるものと同じ樹脂である。ポリカチオンの合成は、樹 脂上のFmoc基の20％（v/v）ピペリジンジメチルホルムアミド（DMF）での脱保護 で開始する。次いで、アミノ樹脂を、ブロモ酢酸でアシル化する。これに次いで 、NSGモノマーを構築するためにブロミドの一級アミンでの求核置換を行う。次 いで、後の２つの工程を、繰り返し様式で継続し、所望のオリゴマーを合成する 。 全ての反応および洗浄は、そうでないと示されない限り室温で行った。樹脂の 洗浄とは、洗浄溶媒（通常DMFまたはジメチルスルホキシド（DMSO））の樹脂へ の添加、均一のスラリーを得るためのその樹脂の撹拌（代表的には約20秒間）、 続いて樹脂からの溶媒の十分な排水をいう。溶媒を、樹脂が乾燥したように見え るまで（代表的には、約５秒間）、反応容器のフリット底を介した減圧濾過によ って除去した。全ての合成において、樹脂スラリーを、フリットされた容器の底 を介してアルゴンで泡立てることにより撹拌した。 フリットされた反応容器を、約0.50mml/g樹脂の置換レベルを有する100mg(50 μｍｏｌ)のFmoc-Rinkアミド樹脂で充填した。DMFの２ミリリットルを樹脂に添 加し、そしてこの溶液を１〜２分間撹拌して樹脂を膨潤させた。次いで、DMFを 排水した。次いで、DMF中の2.0mlの20％ピペリジンを樹脂に添加することにより 、Fmoc基を除去した。これを、１分間撹拌し、次いで排水した。さらにDMF中の ２mlの20％ピペリジンを樹脂に添加し、そして15分間撹拌し、次いで排水した。 次いで、２mlのDMFで樹脂を６回洗浄した。 次いで、DMF中の850μｌの0.6Mブロモ酢酸を樹脂に添加し、その後DMF中の200 μｌの3.2M N.N'-ジイソプロポリカルボジイミド(diisoprooplycarbodiimide)(D IC)を添加することによって、脱ブロック（deblock）したアミンをアシル化した 。この溶液を30分間室温で撹拌し、次いで排水した。この工程を２回繰り返した 。次いで、樹脂を２mlのDMFで２回、２mlのDMSOで１回洗浄した。これで、１回 の反応サイクルを完了した。 ２回目のサイクルを、ブロモ酢酸およびDICでのアシル化工程によって開始し 、その後第二のアミンで置換した。このアシル化/置換サイクルを、所望のオリ ゴマーが得られるまで繰り返した。 ポリカチオン性薬剤からの樹脂の切断は、以下の通りである。乾燥樹脂を、テ フロンコートした微量撹拌棒を含むガラスシンチレーションバイアル中に置き、 そして水中の約５mlの95％トリフルオロ酢酸（TFA）を添加した。溶液を20分間 撹拌し、次いで20μｍポリエチレンフリットを据えた８mlの固相抽出（SPE）カ ラムを通して50mlポリプロピレンコニカル遠心管中に濾過した。 樹脂を１mlの95％TFAで洗浄した。次いで、組み合わせた濾液を、１：１アセ トニトリル：水から３回凍結乾燥させた。材料を水中の５％アセトニトリル中に ５mMの濃度に再溶解した。グアニジノアルキル含有ポリマーの調製 グアニジノアルキル側鎖を、アミノアルキル側鎖の合成後改変によってポリマ ー中に導入した。従って、ポリマーを、メトキシベンズヒドリルアミン（MBHA） 樹脂がRikn樹脂の替わりに使用されたことを除けば、上記のようにサブモノマー 法によって合成した。グアニジノアルキル側鎖が所望である場合にはいつでも、 モノBocアルカンジアミンを置換工程に組み込んだ。ポリマーの合成の後、側鎖B oc基を95％TFA/水での20分間室温での処理によって除去した。（これは、固体（ soliud）支持体からオリゴマーを除去しない）。次いで、遊離のアミノ基を、1H -ピラゾール-1-カルボキサミジン（DMF中に1M、２×１時間、40℃）での処理に よって、グアニジニル化（guanldinylated）した。DMFおよびメチレンクロライ ドでの洗浄後、オリゴマーをフッ化水素酸で樹脂から切断し、そして凍結乾燥し た。葉酸-ポリマー結合体の調製 葉酸-ポリマー結合体を、樹脂結合ポリマーのＮ末端にリンカーを付加するこ とによって調製した。これを、次いで葉酸によってアシル化した。詳細には、ポ リマーの合成の後、Ｎ末端をFmocアミノヘキサン酸（aminohexanoic acid）(DMF 中に0.5M、0.5Mヒドロキシベンゾトリアゾール、0.5Mジイソプロピルカルボジイ ミド（DIC）、１×１時間、室温）でアシル化した。Fmoc基を除去（20％ピペリ ジン/DMF、１×20分、室温）した後、遊離の一級アミノ基を葉酸でアシル化した （DMSO中に0.1M、0.1M DIC、１×２時間、50℃）。樹脂の洗浄の後、結合体を95 ％TFA/水で通常の様式で切断した。 実施例２ ポリヌクレオチドの縮合 実施例１に記載のように、ポリカチオン性薬剤を合成し、そして５mMの最終濃 度まで単離した。ポリヌクレオチドを、以下の手順に従って、RZ110、RZ112、お よびRZ120シリーズの化合物で縮合した。 （１）全てのポリカチオン性薬剤を１マイクロリットルあたり３ナノモルの正 電荷の最終濃度まで希釈する。 （２）１μｇのDNAを１〜２μｌの希釈されたポリカチオン性薬剤に添加する 。 （３）10μｌに容量を調整する。この混合物は、４℃で一晩保存され得る。 （４）５μｌのDNA/ポリカチオン性混合物を２μｌの５×緩衝液（これは、複 合体を維持するためにSDSを含まない）中に添加する。（５×緩衝液＝40％スク ロース、0.25％ブロモフェノールブルー、および200mM Tris酢酸、４mM EDTA(pH 7.8))。 （５）10μｌに容量を調整する。 （６）サンプルを、75ボルトを1.5時間印加して、１％アガロースゲル上で泳 動する。１〜２μｌの間で、全てのポリカチオン性薬剤が、アガロースゲル中で のDNAの移動を遅らせると判断した。実施例３ 血清分解の阻害 RZ110、RZ112、およびRZ120シリーズの化合物を実施例２に記載のようにポリ ヌクレオチドと混合した。一晩の混合物の５マイクロリットルを、５μｌのBalb Cマウス血清に添加した。血清を熱処理せずに、凍結融解した。血清、ポリカチ オン性薬剤、およびポリヌクレオチドの混合物を、代表的には、37℃にて30分間 インキュベートした。インキュベーションの時間を５〜60分の間で変化させた。 次に、0.5％（wt/v）SDSを含む５×緩衝液の２μｌを、インキュベートした混 合物に添加した。この最終溶液を１％アガロースゲルにロードし、そして75ボル トで1.5時間電気泳動した。 試験した化合物の全て（すなわち、全てのRZ110、RZ112、およびRZ120シリー ズ）は、直接的な比較において有意な保護を提供した。全てのRZ112シリーズな らびにRZ110-3およびRZ110-8は、ポリ-L-リジンよりも良好に血清分解を阻害し た。 実施例４ ペプトイド媒介性インビトロ送達 ルシフェラーゼ遺伝子を含むDNA１μｇ/μｌを無エンドトキシン水中で希釈し た。プラスミドDNAはCMVKmルシフェラーゼであった。これは実施例５においてよ り詳細に記載される。 インビトロ送達のためのトランスフェクションプロトコールは以下のようであ った： （Ａ）HT1080細胞を使用した。これらの細胞は、アメリカンカルチャーコレク ション、Rockville、Maryland、USA、受託番号CCL121から入手可能である。これ は線維肉腫である。増殖培地は10％熱不活化ウシ胎児血清を有するダルベッコの 改変イーグル培地（DME）であった。 （Ｂ）トランスフェクションの24時間前に、細胞を１mlの培地中で24-ウェル プレートの１ウェル当たり５×104個でプレートした。 Maryland，USAから購入され得る。 ４．２μｌの１μｇ/μｌルシフェラーゼDNAを添加し、混合する。 ５．混合物を室温にて５分間インキュベートする。 ６．100μｌのポリカチオン性薬剤／DNA混合物をDME-FCSを有するプレートに 添 ７．細胞およびポリカチオン性薬剤／DNA混合物を37℃にて約４時間インキュ ベートする。 ８．全ての細胞について培地をDME-FCSに交換する。 ９．DME-FCSを陽性コントロールとして使用した。 コントロールとして、Panvera,Inc.，Madison，Wisconsin，USAからのトランス ランスフェクトした。 １０．細胞を、Promega，Madison，Wisconsin，USAからのPromega Luciferase Assay Systemを製造業者の指示に従って使用して、ルシフェラーゼ活性につい て試験した。 結果： 実施例５ 標的化リガンド Ａ．使用した細胞、ベクター、および組成物。 第１の実験では、高レベルのアセチル化LDLレセプターを発現するマウス内皮 細胞（Py-4-1）。細胞およびLDLレセプターは、Duboisら、1991，Exp．Cell Res ．196:302-313に記載される。 ルシフェラーゼ含有プラスミド（pCMVkmLUC）を使用して、ポリヌクレオチド をアセチル化LDL（Ac-LDL）と共に実施例１に記載されるポリカチオン性薬剤と 結合させた場合、ポリヌクレオチドが内皮細胞に送達され、そして発現されるか 否か決定した。アセチル化低密度リポタンパク質の内皮細胞の増大した取り込み に基づく内皮細胞の同定および単離の説明は、Voytaら、1984，J．Cell Biol．9 9:2034-2040にある。 これらの実験において使用したプラスミドpCMVkmLUCを、pSP-luc+（Promega C orporation，Madison，WI）由来のluc+遺伝子を発現ベクターpCMVkm2に挿入する ことによって構築した。簡略には、pSP-luc+を制限酵素NheI-EcoRV（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）で消化し、そして1691bpのフラグメントを標準 的方法によって単離した。このフラグメントを、Rapid Ligation Kit（Boehring er Mannheim，Indianapolis，IN）を使用してpCMVkm2（これを、XbaIおよびEcoR Vで消化しておいた）に挿入した。pCMVkm2の配列を配列番号２に示し、そして以 下に記載する。luc+遺伝子を、発現がCMV前初期エンハンサープロモーターによ よって駆動され、そしてウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルによって終結 されるように、pCMVkm2にクローン化した。 ルシフェラーゼ発現を、リポフェクトアミン（インビトロで細胞をトランスフ ェクトするために通常使用される薬剤）（Hawley-Nelsonら、1993，Focus 15:73 ）と結合させて送達させた同一のベクターを用いて得られたレベルと比較した。 結果を、以下の表に示す。 Ｂ．トランスフェクションの方法： 簡略には、細胞を24ウェルディッシュにプレートし、およそ80％のコンフルー エンスまで増殖させ、トランスフェクトし、そしてルシフェラーゼ活性について 24時間後にアッセイした。全てのトランスフェクションを血清含有培地中で行っ た。トランスフェクション混合物調製の間、pCMVkmLUCをRZ112と最初に混合し、 次いでDNA-カチオン性ポリカチオン性薬剤複合体をAc-LDLに添加した。次いで、 血清含有培地を混合物に添加し、各ウェルに送達される体積を0.5mlに調整した 。 リポフェクトアミンを陽性コントロールとして使用した。この陽性コントロー ルにはリポタンパク質を添加しなかった。リポフェクトアミンは、メンブレン濾 過水中のポリカチオン性脂質2,3-ジオレイルオシル-N-[2(スペルミン−カルボキ サミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ DOSPA）および中性脂質ジオレオイルホスファチジル-エタノールアミン（DOPE） の3:1（w/w）リポソーム処方物である。リポフェクトアミンを、Llfe Technolog ies，Gaithersburg，Maryland，USAから購入し得る。 Ｃ．ルシフェラーゼアッセイ ルシフェラーゼ活性をPromega Luciferase Assay System，Madison，Wisconsi nを使用してアッセイした。 Ｄ．結果 表１は、ポリカチオン性薬剤であるRZ-112-2をリポフェクトアミンと、アセチ ル化LDLレセプターを含む細胞へのルシフェラーゼ遺伝子の送達について比較し た場合の実験結果を示す。 表１ ルシフェラーゼ活性 ＊各数字は３つのウェルの平均を示す。 実施例６ アセチル化LDLレセプターを有する細胞と アセチル化LDLレセプターを有さない細胞の比較 Ａ．アセチル化LDLレセプターを有する細胞 この実験のために、K1735マウス上皮メラノーマ細胞を使用した。これらの細 胞は低いレベルまたは存在しないレベルのAc-LDLレセプターを発現する。この細 胞の説明は、J．Natl．Cancer．Inst．69(4):(1982)中に存在する。 Ｂ．方法 簡略には、細胞を24ウェルディッシュに、２mM L-グルタミンを補充した10％F CSを有するDME中で１ウェル当たり10,000細胞でプレートした。Py-4-1細胞を、3 7℃にて10% CO2中で培養した。K1735細胞を、37℃にて５% CO2中で培養した。細 胞をおよそ50％のコンフルエンスまで増殖させ、トランスフェクトし、そして24 時間後にルシフェラーゼ活性についてアッセイした。全てのトランスフェクショ ンを血清含有培地中にて行った。 トランスフェクション混合物調製の間、pCMVkmLUCをRZ112-2と最初に混合し、 次いでDNA-ポリカチオン性薬剤複合体をAc-LDLに添加した。次いで、血清含有培 地を混合物に添加し、各ウェルに送達される体積を0.5mlに調整した。 Ｃ．結果 表２ ルシフェラーゼ活性 ＊各数字は３つのウェルの平均を示す。 実施例７ エリスロポエチンをコードするポリヌクレオチドの注射 Ａ．ポリヌクレオチド CMVkm2はこれらの研究において使用した標準的なベクターである。CMVkm2は哺 乳動物における発現について最適化されたベクターである。目的の遺伝子を、ヒ トCMV発現カセットの3'に挿入されているポリリンカー中にクローン化する。こ のカセットは、ヒトCMV前初期プロモーター／エンハンサー、続いてヒトCMV前初 期領域のイントロンＡを含む（Chapmanら、1991，Nucl．Acids Res．19:3937-39 86）。転写は、ポリリンカーの直ぐ3'側にクローン化されている、ウシ成長ホル モン遺伝子由来のポリアデニル化部位によって終結される。CMVkm2ベクターにつ いては配列番号２を参照のこと。 CMV-km-cmEPOベクターを以下のようにCMVkm2から構築した。カニクイザルEPOc DNAを、ATCC（受託番号67545、Rockville，MD）から入手した。このプラスミド をAvrIIおよびBglIIで消化し、そしてCMVkm2ベクターのXbaIおよびBamHI部位に 挿入した。挿入された配列はcmEPOの全コード領域（Genbank登録番号M18189）を 含む。配列番号３を参照のこと。 Ｂ．マウス 免疫不全重症複合免疫不全（SCID）マウスを、Charles River Labs，Wilmingt on，Massachusetts，USAから入手した。 筋肉内注射を以下のように行った：マウスを80mg/mlケタミンおよび４mg/mlキ シラジンを含む50μｌの溶液で麻酔した。前脛骨筋を囲む領域を剃った。50μｌ のDNA（9%生理食塩水中の2.7μｇ/μｌの濃度）を、両足の前脛骨筋に28ゲージ の針を使用して注射した。最初の注入後24時間目に、第２の注射を同一のプロト コールを使用して行った。血液を眼窩洞から採取し、週一回の基準でヘマトクリ ット値を測定した。 Ｃ．結果 プラスミドCMVkm-cmEpo（これは、カニクイザルのEPO cDNAを発現する）を注 射した６匹のマウスについてのヘマトクリット値の読み取りを、以下の表３に示 す。コントロールと記した列は３匹の注射していないマウスについての平均の読 み取りを示す。３匹のコントロールマウスについての生データを表３の下部に示 す。注射した群のマウス２は注射後４週と５週の間に死亡した。 実施例８ レプチンをコードするポリヌクレオチドの注射 Ａ．ポリヌクレオチド 上記のCMV-km2ベクターをこれらの実験のために使用した。野生型のレプチン コード領域またはHAバージョンのレプチンコード領域のいずれかをベクターに挿 入した。プラスミドのマップを図４に示し、そして野生型レプチンを有するベク ターの配列を配列番号４に示す。 Ｂ．マウス ob/obマウスをJackson Labs，Bar Harbor，Maine，USAから入手した。最初の 劣性肥満症変異である、obese変異（ob）はIngallら、1950，J．Hered．41:317- 318によって1950年に同定され、そして記載された。続いて、Friedmanら、1990C ell 69:217-220に記載のように、マウスにおいて５つの単一遺伝子変異が肥満表 現型を生じることが観察された。（より最近では、マウスobese遺伝子およびそ のヒトホモログが、Zhangら、1994，Nature 372:425に記載のように、クローン 化された）。 Ｃ．方法 筋肉内注射を以下のように行った：マウスを実施例７に上記されるのと同一の ケタミン溶液で麻酔し、そして前脛骨筋を囲む領域を剃った。 0.9％生理食塩水中の3.3μｇ/μｌの濃度のDNAの50μｌを、両足の前脛骨筋に 28ゲージの針を使用して注射した。 最初の注入後72時間目に、第２の注射を同一のプロトコルを使用して行った。 群１のob/obマウスに、野生型マウスレプチンタンパク質をコードするプラス ミド（pCMVkMレプチン-wt）を注射した。 群２のob/obマウスに、抗体12CA5によって認識されるエピトープを用いて改変 された形態のマウスレプチンをコードするプラスミド（pCMVkm-レプチンHA）を 注射した。エピトープのアミノ酸配列はSYPYDVPDYASLGGPS（Wilsonら、1984，Ce ll 37:767-778）である。 群３のob/obマウスに0.9％生理食塩水の溶液を注射した。 マウスを毎日秤量し（表４を参照のこと）、そして最初の８日間各マウスにつ いての体重増加比を計算した。結果を表５に示す。任意の所定の日について、体 重を０日目の個々のマウスの体重から引き、そして差を０日目の体重で割った、 ８日目からの体重比変化データを、片側ｔ検定を使用して分析した。群３のコン トロールマウスと比較した場合、群２のマウスからのｐ値は、0.004であった。 群３のコントロールマウスと比較した場合、群１のマウスについてのｐ値は0.00 38であった。 注：マウスを１日目および２日目には秤量しなかった。これらの日の値は３日 目から外挿した。 実施例９ COS 細胞株、HT1080細胞株、および293細胞株での ペプトイド媒介性インビトロ送達 COS細胞（受託番号CRL1651の下でアメリカンタイプカルチャーコレクション、 Rockville，MD，から入手可能）およびHT1080細胞（受託番号CCL121の下でアメ リカンタイプカルチャーコレクション、Rockville，MD,から入手可能）を培養し 、そして実施例４に記載のトランスフェクションプロトコルに従ってpCMVkmLUC および本発明の種々のポリカチオン性薬剤（実施例１に記載）でトランスフェク トした。ルシフェラーゼ活性を実施例４に記載の方法に従ってアッセイした。総 細胞タンパク質を製造業者の指示に従ってPierce BCAキットを使用して測定した 。 図7Aに示す結果は、ポリカチオン性薬剤のトランスフェクションを媒介する能 力は細胞株型に依存しないことを示す。中性側鎖およびカチオン性側鎖の繰り返 し三量体モチーフを有するポリカチオン性薬剤は、トランスフェクションを媒介 するに特に効果的であった。 カチオン性ペプトイドの相同なシリーズのトランスフェクション効率を評価し た。詳細には、カチオン性ペプトイドRZ-110-1（18マー）、RZ-120-3（24マー） 、RZ120-7（36マー）、およびRZ120-11（48マー）（これらは、同一の繰り返し （HHP）モチーフを有する）を、COS細胞およびHT1080細胞をトランスフェクトす るそれらの能力について評価した。これらのポリカチオン性薬剤をPCMVkmLUCと2 :1（＋対−の電荷比）で複合体化させた。DNA上の陰性電荷の濃度を、各ヌクレ オチドについて330の平均分子量に基づいて、DNAの１μｇ当たり3.03nmolのリン 酸を使用して計算した。ポリカチオン性薬剤の式量を、半トリフルオロ酢酸塩（ アミノ基の50%がTFAと塩を形成する）として計算し、そしてポリカチオン性薬剤 の濃度を凍結乾燥させたペプトイドの重量に基づいて決定した。アミノ基を、形 式的に十分にプロトン化されているとみなし、＋対−の電荷を計算する場合、目 的のポリカチオン性薬剤上の陽性電荷の数を得た。 図7Bに示すように、カチオン性ペプトイドのこの特定のシリーズについてのト ランスフェクション効率は、24以上のモノマー単位を有するペプトイドについて は、オリゴマー長に大部分依存しなかった。 ポリカチオン性薬剤RZ145-1および市販のカチオン性脂質DMRIE-CTM、Lipofect これらの実験において、RZ145-1をpCMVkmLUCと2:1（＋対−の電荷比）で複合体 ョンを、製造業者の指示に従って行った。カチオン性脂質をまた、2:1（＋対− の電荷比）で用いた。293ヒト胎児腎臓細胞（Microbix，Toronto，Ontario，Can ada）、HT1080細胞、およびNIH-3T3細胞（受託番号CRL 1658の下でアメリカンタ イプカルチャーコレクション、Rockville，MD，から入手可能）をトランスフェ クトし、10％血清の存在下または非存在下のいずれかで培養し、次いで実施例４ に記載されるプロトコルと同一のプロトコルを使用してルシフェラーゼ生成につ いてアッセイした。ルシフェラーゼを、実施例４に記載のように、最初のトラン スフェクション後48時間目に測定した。総細胞タンパク質を製造業者の指示に従 ってPierce BCAキットを使用して測定した。 血清存在下において10倍および100倍効率が低い）とは対照的に、ポリカチオン 性薬剤RZ145-1によって媒介される遺伝子移入は血清の存在に対して非感受性で あったことを示す。 ポリカチオン性ポリマー（例えば、ポリリジンおよびヒストン）によって媒介 されるトランスフェクションは、トランスフェクション培地へのクロロキンの添 加によって大いに増強される。クロロキンが本発明のポリカチオン性薬剤によっ て媒介されるトランスフェクションに影響するか否か決定するために、HT1080細 胞および293細胞を、クロロキンの存在下および非存在下でRZ145-1を使用してト ランスフェクトした。コントロールとして、同じ細胞株をクロロキンの存在下お よび非存在下の両方でポリリジンでトランスフェクトした。図９に示す結果は、 ポリカチオン性薬剤RZ145-1は、等しく、クロロキンを伴うおよびこれを伴わな い両方のトランスフェクションを媒介することにおいて効果的であったことを示 す。対照的に、クロロキンの非存在下におけるポリリジン媒介性トランスフェク ションは、クロロキンの存在下におけるポリリジン媒介性トランスフェクション より100倍低かった。さらに、結果は、カチオン性ペプトイド媒介性トランスフ ェクションがポリリジン媒介性形質転換より効率的であることを示す。 実施例10 DNA/ ポリカチオン性薬剤複合体の安定な処方物の調製 Ａ．DNA/ ポリカチオン性薬剤複合体処方物（2:1、＋対−電荷比） 全ての操作を、室温で行った。DGPW（診断用精製水）を使用してストック溶液 を調製した。ポリカチオン性薬剤およびDNAサンプルの両方が、沈澱を避けるた めに低塩濃度（すなわち、<1mM）を有した。 （１）バッチ法 250μｇまでDNAについて、以下のようなポリカチオン性薬剤RZ145-1およびpCM VkmLUCの複合体。DNA（すなわち、pCMVkmLUC）を、151μＭの陰性電荷に対応す る50μｇ/mlの濃度まで水中の30％（v/v）エタノールで希釈した。RZ145-1を水 中の30％エタノールで23.2μＭまで希釈した。ポリカチオン性薬剤の１部に対し て、DNA溶液の１部を穏やかに撹拌しながら可能な限り迅速に添加した。沈澱を 避けるために、DNA溶液を、ポリカチオン性薬剤の溶液に添加した（逆ではなく ）。２つの溶液の緩徐な添加を、沈澱および大きな複合体の形成を避けるために 避けた。 （２）連続法 250μｇより多いDNAについては、ポリカチオン性薬剤/DNA複合体の濃縮処方物 を調製するための連続法が好ましい。DNA溶液およびペプトイド溶液を上記のよ うに調製し、そして別々のボトルに入れた。各ボトルを混合Ｔ字管（mixing tee ）の１つの口に連結した。ボトルに２psi〜３psiで同時に圧力をかけ、同じ流速 （例えば、20ml/分以上）で混合Ｔ字管へ２つの流れを送達した。 Ｂ．濃縮工程 パートＡ由来のDNA-ポリカチオン性薬剤複合体の２ミリリトッルを、Centrico るか、またはポリカチオン性薬剤DNA複合体を含む濃縮物の容積がおよそ50μｌ になるまで遠心分離した。濾液をボトムレシーバーから除去した。濃縮物を２ml の５％グルコースで希釈し、そして再び50μｌまで濃縮した。この操作を再び繰 り返し、５％グルコース中の１mg/ml DNAを含有する濃縮複合体溶液を生成した 。 この濃縮工程を、４℃または室温のいずれかで行い得る。最終濃縮溶液のエタノ ール含有量は0.1％未満であった。濃縮溶液に沈澱は観察されなかった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/06 Ａ６１Ｐ 3/10 3/10 7/00 7/00 7/06 7/06 9/10 9/10 29/00 29/00 31/00 31/00 31/12 31/12 35/00 35/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 ドワルキ，バラバニ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94502, アラメダ，オールド アラメダ ポイント 1177 (72)発明者 イニス，マイケル エイ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94556, モラガ，コンスタンス プレイス 315 (72)発明者 マーフィ，ジョン イー. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94618, オークランド，アワーボード コート 49 (72)発明者 コーヘン，フレッド アメリカ合衆国 カリフォルニア 94662 ―8097，エミリービル，ピー．オー．ボッ クス 8097，インテレクチュアル プロパ ティ―アール440，カイロン コーポレイ ション (72)発明者 ウノ，テツオ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94131, サンフランシスコ，ワレン ドライブ ナ ンバー530 480

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．以下の式： を有するポリカチオン性薬剤であって、ここで、 ｎは、10〜100の整数であり； 以下の各モノマーについてのＲ1、Ｒ2、およびＲ3は、 １〜200ダルトンの分子量を有する部分から独立して選択され； TaおよびTcは末端基であり； Ｒ1は、少なくとも１つのモノマーについて水素ではなく； ここで、該ポリカチオン性薬剤は、末端基を除いて、少なくとも25％の正に荷 電したモノマーを含み、そして ここで、該ポリカチオン性薬剤は、生理学的pHにて、正味の正電荷を示す、薬 剤。 ２．前記ポリカチオン性薬剤が繰り返しのトリマーを含む、請求項１に記載のポ リカチオン性薬剤。 ３．各トリマー中の２つのＲ1基が中性部分であり、そして各トリマー中の１つ のＲ1基がカチオン性部分である、請求項２に記載のポリカチオン性薬剤。 ４．Ｒ1が正に帯電した部分、負に帯電した部分、および中性部分からなる群か ら選択される、請求項１に記載のポリカチオン性薬剤。 ５．Ｒ1が、アミノ酸上で見出される置換基から選択される、請求項１に記載の ポリカチオン性薬剤。 ６．Ｒ1が、芳香族および脂肪族基からなる群から選択される、請求項１に記載 のポリカチオン性薬剤。 ７．少なくとも１つのＲ1が、アルキルアンモニウム、アミノアルキル、グアニ ジノアルキル、アミジノアルキル、アミノシクロヘキシル、ピペリジル、グアニ ジノベンジル、アミジノベンジル、ピリジルメチル、アミノベンジル、アルキル フェニル(alkyphenyl)、インドリルアルキル、アルコキシフェニルアルキル、ハ ロフェニルアルキル、およびヒドロキシフェニルアルキルからなる群より選択さ れる、請求項１に記載のポリカチオン性薬剤。 ８．前記カチオン性部分がアミノエチルである、請求項３に記載のポリカチオン 性薬剤。 ９．前記中性部分が、フェネチル、ベンジル、フェニルプロピル、(R)α-メチル ベンジル、(S)α-メチルベンジル、メトキシフェネチル、およびクロロフェネチ ルからなる群より選択される、請求項８に記載のポリカチオン性薬剤。 １０．Ｒ1およびＲ3が少なくとも１つのモノマーについて両方水素である、請求 項１に記載のポリカチオン性薬剤。 １１．ｎが36である、請求項１０に記載のポリカチオン性薬剤。 １２．ｎが24である、請求項１０に記載のポリカチオン性薬剤。 １３．ｎが18である、請求項１０に記載のポリカチオン性薬剤。 １４．ｎが12である、請求項１０に記載のポリカチオン性薬剤。 １５．TaおよびTcが、ポリペプチド、脂質、リポタンパク質、ビタミン、ホルモ ン、ポリアルキレン(polyakylene)グリコール、およびサッカライドからなる群 より選択される末端基である、請求項８に記載のポリカチオン性薬剤。 １６．以下： (i)ポリヌクレオチド；および (ii)前記ポリカチオン性薬剤が、ポリヌクレオチドの細胞への侵入を媒介し得 る、請求項１に記載のポリカチオン性薬剤、 を含む、組成物。 １７．以下： (i)薬学的に受容可能なキャリア； (ii)治療有効量のポリヌクレオチド；および (iii)請求項１に記載のポリカチオン性薬剤の前記ポリヌクレオチドを中和す るに有効な量、を含む薬学的組成物であって、ここで該ポリカチオン性薬剤は、 ポリヌクレオチドの細胞への侵入を媒介し得る薬剤である、薬学的組成物。 １８．ポリヌクレオチドをポリカチオン性薬剤と複合体化する方法であって、以 下： (i)ポリヌクレオチドを提供する工程；および (ii)該ポリヌクレオチドを、請求項１に記載のポリカチオン性薬剤と接触させ る工程であって、ここで該ポリカチオン性薬剤は、ポリヌクレオチドの細胞への 侵入を媒介し得る、工程、 を包含する、方法。 １９．ポリヌクレオチドを縮合させる方法であって、以下： ポリヌクレオチドを、縮合する量の請求項１に記載のポリカチオン性薬剤と接触 させる工程であって、該縮合する量が、該ポリヌクレオチドのサイズを減少させ るに十分なポリカチオン性薬剤の量である、工程、 を包含する、方法。 ２０．ポリヌクレオチドの血清分解を阻害する方法であって、ポリヌクレオチド を、請求項１に記載のポリカチオン性薬剤と接触させる工程であって、該ポリカ チオン性薬剤が、少なくとも10分で血清分解を阻害するに有効な量で存在する工 程、を包含する、方法。 ２１．以下： (i)リポタンパク質； (ii)ポリヌクレオチド結合分子；および (iii)ポリヌクレオチド を含む組成物であって、ここで該組成物は、細胞へのポリヌクレオチド取り込み の頻度を増加させ得る、組成物。 ２２．前記リポタンパク質が、高密度リポタンパク質、中間密度リポタンパク質 、低密度リポタンパク質、および非常に低密度なリポタンパク質からなる群より 選択される、請求項２１に記載の組成物。 ２３．前記リポタンパク質が、高密度リポタンパク質、中間密度リポタンパク質 、低密度リポタンパク質、および非常に低密度なリポタンパク質からなる群より 選択されるタンパク質の変異体、フラグメント、または融合物である、請求項２ １に記載の組成物。 ２４．前記リポタンパク質がアセチル化された低密度リポタンパク質である、請 求項２１に記載の組成物。 ２５．以下： (a)のポリヌクレオチド； (b)該ポリヌクレオチドの負電荷を中和するに有効な量のポリヌクレオチド結 合分子；および (c)治療有効量のリポタンパク質 を含む、薬学的組成物。 ２６．前記ポリヌクレオチドがポリカチオン性薬剤である、請求項２５に記載の 薬学的組成物。 ２７．ポリヌクレオチドの細胞への侵入を容易にするための組成物を生成する方 法であって、以下： (i)ポリヌクレオチドを提供する工程 (ii)該ポリヌクレオチドを中和するに有効な量で、ポリヌクレオチド結合分子 を提供する工程； (ii)該ポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチド結合分子を接触させ、複合体 を形成する工程； (iii)リポタンパク質を提供する工程；次いで (iv)該複合体を、該リポタンパク質と接触させる工程 を包含する、方法。 ２８．細胞へのポリペプチド取り込みの頻度を増加させる方法であって、以下： (i)(a)治療有効量のポリヌクレオチド； (b)該ポリヌクレオチドを中和するに有効な量のポリヌクレオチド結合分子 ；および (c)有効量のリポタンパク質 を含む組成物を提供する工程；次いで (ii)該組成物を該細胞に接触させる工程 を包含する、方法。 ２９．細胞へのポリヌクレオチド取り込みの頻度を増加させる方法であって、以 下： (i)(a)ポリヌクレオチド；および (b)該ポリヌクレオチドの負電荷を中和するに有効な量の請求項１に記載の ポリカチオン性薬剤 を含む組成物を提供する工程；次いで (ii)該組成物を該細胞に接触させる工程 を包含する、方法。
JP50831998A 1996-08-13 1997-08-13 ポリヌクレオチド送達のための組成物および方法 Expired - Fee Related JP4320054B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US2386796P 1996-08-13 1996-08-13
US60/023,867 1996-08-13
PCT/US1997/014465 WO1998006437A2 (en) 1996-08-13 1997-08-13 Compositions and methods for polynucleotide delivery

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2006086765A Division JP2006257088A (ja) 1996-08-13 2006-03-27 ポリヌクレオチド送達のための組成物および方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2001503385A true JP2001503385A (ja) 2001-03-13
JP4320054B2 JP4320054B2 (ja) 2009-08-26

Family

ID=21817661

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP50831998A Expired - Fee Related JP4320054B2 (ja) 1996-08-13 1997-08-13 ポリヌクレオチド送達のための組成物および方法
JP2006086765A Withdrawn JP2006257088A (ja) 1996-08-13 2006-03-27 ポリヌクレオチド送達のための組成物および方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2006086765A Withdrawn JP2006257088A (ja) 1996-08-13 2006-03-27 ポリヌクレオチド送達のための組成物および方法

Country Status (7)

Country Link
US (3) US6251433B1 (ja)
EP (1) EP0941122B1 (ja)
JP (2) JP4320054B2 (ja)
AT (1) ATE252914T1 (ja)
CA (1) CA2264012C (ja)
DE (1) DE69725878T2 (ja)
WO (1) WO1998006437A2 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2006001122A1 (ja) * 2004-06-24 2008-04-17 株式会社ディナベック研究所 Ｒｎａウイルスが導入された樹状細胞を含む抗癌剤
JP2011504874A (ja) * 2007-11-28 2011-02-17 国立大学法人 東京医科歯科大学 内因性カイロミクロンを利用した、標的遺伝子の発現を抑制する核酸のデリバリーシステム
WO2012147370A1 (ja) * 2011-04-28 2012-11-01 国立大学法人山口大学 ターミネータ配列を含む高発現用リバースプライマー及びリニアｄｎａ

Families Citing this family (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0872552A1 (en) * 1997-04-15 1998-10-21 Leadd B.V. A gene delivery vehicle expressing the apoptosis-inducing proteins VP2 and/or Apoptin
US20020052310A1 (en) * 1997-09-15 2002-05-02 Massachusetts Institute Of Technology The Penn State Research Foundation Particles for inhalation having sustained release properties
US6652837B1 (en) 1996-05-24 2003-11-25 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of novel particles for inhalation
CN1177934C (zh) * 1997-04-28 2004-12-01 阿文蒂斯药物股份有限公司 腺病毒介导的肿瘤内投送血管生成拮抗剂用于肿瘤的治疗
US6197332B1 (en) 1997-08-13 2001-03-06 Chiron Corporation Lipid-conjugated polyamide compounds and related compositions and methods thereof
US6818627B1 (en) * 1997-08-14 2004-11-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Functional fragments of HIV-1 Vpr protein and methods of using the same
US7135191B2 (en) * 1997-09-04 2006-11-14 Zsolt Istvan Hertelendy Urogenital or anorectal transmucosal vaccine delivery system
US7052678B2 (en) 1997-09-15 2006-05-30 Massachusetts Institute Of Technology Particles for inhalation having sustained release properties
WO1999056784A2 (en) * 1998-05-06 1999-11-11 Transgene S.A. Inprovements in gene therapy using compositions comprising a polynucleotide and a nuclease inhibitor or interleukin-10
EP0967289A1 (en) * 1998-05-06 1999-12-29 Transgene S.A. Improvements in gene therapy using compositions comprising a polynucleotide and a nuclease inhibitor
ATE274923T1 (de) * 1998-06-10 2004-09-15 Biognostik Ges Stimulierung des immunsystems
US20070010004A1 (en) * 1998-07-20 2007-01-11 Monahan Sean D Micellar systems
DE19858005B4 (de) * 1998-12-16 2007-02-08 november Aktiengesellschaft, Gesellschaft für Molekulare Medizin Synthetisches Nucleinsäure-Partikel
US7368261B1 (en) 1999-04-30 2008-05-06 Novartis Vaccines And Diagnostics Srl Conserved Neisserial antigens
GB9911683D0 (en) 1999-05-19 1999-07-21 Chiron Spa Antigenic peptides
GB9916529D0 (en) 1999-07-14 1999-09-15 Chiron Spa Antigenic peptides
US6677445B1 (en) 1999-08-27 2004-01-13 Chiron Corporation Chimeric antisense oligonucleotides and cell transfecting formulations thereof
ES2559317T3 (es) 1999-10-29 2016-02-11 Glaxosmithkline Biologicals Sa Péptidos antigénicos de Neisseria
DE60142772D1 (de) 2000-01-17 2010-09-23 Novartis Vaccines & Diagnostic Membranvesikel (omv) impfstoff, der n. meningitidis serogruppe b membranproteine enthält
WO2001062144A1 (en) * 2000-02-25 2001-08-30 Health Research, Inc. Method for transdermal sampling of analytes
EP1950297A2 (en) 2000-05-31 2008-07-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Compositions and methods for treating neoplastic disease using chemotherapy and radiation sensitizers
CA2410516A1 (en) 2000-05-31 2001-12-06 Chiron Corporation Compositions and methods for treating neoplastic disease using chemotherapy and radiation sensitizers
EP1953243B1 (en) 2000-06-15 2012-12-26 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Polynucleotides related to colon cancer
EP2277894A1 (en) 2000-10-27 2011-01-26 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Nucleic acids and proteins from streptococcus groups A & B
JP2005502309A (ja) * 2000-12-23 2005-01-27 カイロン コーポレイション オリゴヌクレオチドトランスフェクションスクリーニング方法
AU2002230993B2 (en) * 2000-12-29 2006-02-02 Alkermes, Inc. Particles for inhalation having sustained release properties
GB0107658D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Streptococcus pneumoniae
GB0107661D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Staphylococcus aureus
WO2002094871A1 (en) * 2001-05-24 2002-11-28 Human Dna Technology Inc Novel keratinocyte growth factor-2 analogue in hair follicle
JP2004537596A (ja) * 2001-08-03 2004-12-16 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ オリゴグアニジン輸送因子の二方向合成
US20060264608A1 (en) * 2001-08-03 2006-11-23 Wender Paul A Bi-directional synthesis of oligoguanidine transport agents
JP2005538035A (ja) * 2001-12-11 2005-12-15 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ グアニジニウム輸送試薬および結合体
MXPA04005713A (es) * 2001-12-11 2005-06-06 Baylor College Medicine Complemento de la hormona de liberacion de la hormona de crecimiento para tratar sujetos cronicamente enfermos.
US6899892B2 (en) * 2001-12-19 2005-05-31 Regents Of The University Of Minnesota Methods to reduce body fat
US20040043003A1 (en) * 2002-01-31 2004-03-04 Wei Chen Clinical grade vectors based on natural microflora for use in delivering therapeutic compositions
US20040009937A1 (en) * 2002-01-31 2004-01-15 Wei Chen Methods and composition for delivering nucleic acids and/or proteins to the respiratory system
US20050075298A1 (en) * 2002-01-31 2005-04-07 Wei Chen Methods and composition for delivering nucleic acids and/or proteins to the intestinal mucosa
KR20030068337A (ko) * 2002-02-15 2003-08-21 사회복지법인삼성생명공익재단(삼성서울병원) 유전자치료용 진핵발현벡터
WO2003078576A2 (en) * 2002-03-12 2003-09-25 Nitto Denko Corporation Vector for transfection of eukaryotic cells
EP1485196A1 (en) * 2002-03-20 2004-12-15 Rhodia Inc. Vesicles comprising an amphiphilic di-block copolymer and a hydrophobic compound.
AU2003221733A1 (en) * 2002-04-17 2003-11-03 University Of Florida Research Foundation, Inc. Improved raav vectors
KR100505434B1 (ko) * 2002-08-31 2005-08-05 한국과학기술연구원 생리활성물질을 효과적으로 전달하기 위한 요오드화 오일과 양이온성 고분자를 이용한 제제 및 이들의 제조방법
EP1562982B1 (en) 2002-11-15 2010-05-05 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Unexpected surface proteins in neisseria meningitidis
US7682626B2 (en) * 2003-02-07 2010-03-23 Roche Madison Inc. Polyvinylethers for delivery of polynucleotides to mammalian cells
GB0308198D0 (en) 2003-04-09 2003-05-14 Chiron Srl ADP-ribosylating bacterial toxin
US20050031579A1 (en) * 2003-06-30 2005-02-10 Canji, Inc. Polymer encapsulation of adenoviruses
US20060035242A1 (en) * 2004-08-13 2006-02-16 Michelitsch Melissa D Prion-specific peptide reagents
WO2005069791A2 (en) * 2004-01-08 2005-08-04 Cedars-Sinai Medical Center Compositions and methods for enhancing the th1 response in connection with dendritic cell vaccines
WO2006076342A2 (en) * 2005-01-11 2006-07-20 Heart Failure Technologies, Inc. Method and system for treating heart failure
MX2007008497A (es) * 2005-01-13 2007-09-14 Novartis Vaccines & Diagnostic Ensayos inmunosorbentes enlazados a enzimas usando reactivos de peptidos especificos de prion.
WO2006076683A2 (en) * 2005-01-13 2006-07-20 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Isolation and detection of pathogenic prions
EP1848830A4 (en) * 2005-01-13 2009-05-06 Novartis Vaccines & Diagnostic ISOLATION OF PATHOGENIC PRIONS
US20070031512A1 (en) * 2005-08-03 2007-02-08 Amcol International Corporation Virus-interacting layered phyllosilicates and methods of inactivating viruses
US20080184618A1 (en) * 2005-08-03 2008-08-07 Amcol International Virus-Interacting Layered Phyllosilicates and Methods of Use
US20100272769A1 (en) * 2005-08-03 2010-10-28 Amcol International Virus-, Bacteria-, and Fungi-Interacting Layered Phyllosilicates and Methods of Use
NZ594844A (en) 2005-09-09 2013-04-26 Novartis Ag Prion-specific peptoid reagents
CA2628300C (en) 2005-11-02 2018-04-17 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified sirna molecules and uses thereof
US20080090760A2 (en) * 2005-12-09 2008-04-17 Todd Hembrough Compositions and Methods for Inhibiting Cellular Proliferation
US9494593B2 (en) * 2005-12-14 2016-11-15 Chung Yuan Christian University Method for separating nanoparticles with a controlled number of active groups
WO2007095152A2 (en) * 2006-02-10 2007-08-23 The Regents Of The University Of California TRANSDUCIBLE DELIVERY OF sIRNA BY dsRNA BINDING DOMAIN FUSIONS TO PTD/CPPS
PL2054431T3 (pl) 2006-06-09 2012-07-31 Novartis Ag Konformery adhezyn bakteryjnych
CN101506368B (zh) * 2006-07-12 2017-02-08 加利福尼亚大学董事会 通过可逆的磷酸三酯电荷中和保护基转导运输核酸
ATE544869T1 (de) * 2006-08-30 2012-02-15 Bioventures Inc Verfahren und substanzen zur isolierung und erkennung kleiner polynukleotide
WO2009009441A2 (en) * 2007-07-06 2009-01-15 Cedars-Sinai Medical Center Self-assembling complex for targeting chemical agents to cells
WO2009006680A1 (en) * 2007-07-06 2009-01-15 Sydney West Area Health Service Epitopes of herpes simplex virus
US9006191B2 (en) 2007-12-27 2015-04-14 Protiva Biotherapeutics, Inc. Silencing of polo-like kinase expression using interfering RNA
AU2009236219B8 (en) 2008-04-15 2015-06-25 Arbutus Biopharma Corporation Silencing of CSN5 gene expression using interfering RNA
BRPI0910550A2 (pt) * 2008-04-30 2015-09-29 Novartis Ag ensaio para confôrmeros patogênicos
US8840881B2 (en) * 2008-08-28 2014-09-23 Aduro Gvax Inc. Methods and compositions for treating prostate cancer or inducing a humoral immune response against prostate cancer
WO2010129853A2 (en) * 2009-05-07 2010-11-11 The Regents Of The University Of California TRANSDUCIBLE DELIVERY OF NUCLEIC ACIDS USING MODIFIED dsRNA BINDING DOMAINS
EP2446034A4 (en) * 2009-06-22 2013-11-27 Ipca Lab Ltd NOVEL POLYNUCLEOTIDE MOLECULES FOR IMPROVED GENE EXPRESSION
EP2582387A2 (en) 2010-06-17 2013-04-24 The United States Of America As Represented By The Secretary, National Institutes Of Health Compositions and methods for treating inflammatory conditions
US8981025B2 (en) 2011-02-10 2015-03-17 Corning Incorporated Polymerizable catonic peptide monomers and polymers
WO2013075132A1 (en) 2011-11-17 2013-05-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Therapeutic rna switches compositions and methods of use
US9035039B2 (en) 2011-12-22 2015-05-19 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing SMAD4
MX367842B (es) 2012-02-07 2019-09-09 Global Bio Therapeutics Inc Método compartimentado de administración de ácidos nucleicos y composiciones y usos del mismo.
AU2013204327B2 (en) 2012-04-20 2016-09-01 Aviagen Cell transfection method
IN2015DN01765A (ja) 2012-08-20 2015-05-29 Univ California
US20140256639A1 (en) * 2013-02-14 2014-09-11 The Regents Of The University Of California Peptoid neutralizing agents
JP6293892B2 (ja) 2013-08-08 2018-03-14 グローバル・バイオ・セラピューティクス・インコーポレイテッドＧｌｏｂａｌ Ｂｉｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 低侵襲処置用インジェクションデバイスおよびその使用
DK3030163T3 (da) 2013-08-08 2019-07-01 Global Bio Therapeutics Inc Klemmeindretning til minimalt invasive procedurer
US10415037B2 (en) 2014-10-02 2019-09-17 Arbutus Biopharma Corporation Compositions and methods for silencing hepatitis B virus gene expression
US20180245074A1 (en) 2015-06-04 2018-08-30 Protiva Biotherapeutics, Inc. Treating hepatitis b virus infection using crispr
WO2017019891A2 (en) 2015-07-29 2017-02-02 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing hepatitis b virus gene expression
JP7011830B2 (ja) 2015-10-14 2022-01-27 エックス－サーマ インコーポレイテッド 氷晶形成を低減するための組成物および方法
US9758786B2 (en) 2016-02-09 2017-09-12 Autotelic, Llc Compositions and methods for treating pancreatic cancer
JP2019532027A (ja) 2016-08-17 2019-11-07 ソルスティス バイオロジクス，リミティッド ポリヌクレオチド構築物
EP3645546A4 (en) 2017-06-30 2021-12-01 Solstice Biologics, Ltd. CHIRAL PHOSPHORAMIDITIS AUXILIARIES AND THEIR METHODS OF USE

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235886A (en) * 1979-10-31 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Cyclic hexapeptide somatostatin analogs
US5041497A (en) * 1989-04-10 1991-08-20 Allied-Signal Inc. Process for preparing co-poly(amides/peptides)
IE66205B1 (en) 1990-06-14 1995-12-13 Paul A Bartlett Polypeptide analogs
NZ244306A (en) 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
DE4139001A1 (de) 1991-11-27 1993-06-03 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur einschleusung von nukleinsaeuren in zellen
US5334761A (en) * 1992-08-28 1994-08-02 Life Technologies, Inc. Cationic lipids
BR9307092A (pt) 1992-09-24 1999-03-30 Chiron Corp Processo para sintetizar monômero de poliamida n-substituida oligômero mistura de pelo menos dois oligômeros diferentes poli (n-substituida glicina) processo de tratamento anti-sentido composição processo de sintetizar composto de poliamida composto e processo para preparar mistura de compostos de amida
CA2163364C (en) * 1993-07-14 2009-10-27 Francis C. Szoka, Jr. Self-assembling polynucleotide delivery system comprising dendrimer polycations
JPH10501963A (ja) 1994-04-15 1998-02-24 ターゲテッド ジェネティクス コーポレイション 遺伝子送達融合タンパク質
US5670347A (en) 1994-05-11 1997-09-23 Amba Biosciences Llc Peptide-mediated gene transfer
US6071890A (en) 1994-12-09 2000-06-06 Genzyme Corporation Organ-specific targeting of cationic amphiphile/DNA complexes for gene therapy
US5635487A (en) * 1994-12-29 1997-06-03 Wolff; Jon A. Amphipathic, micellar delivery systems for biologically active polyions
US5795587A (en) 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
EP0827406A1 (en) 1995-03-08 1998-03-11 The Scripps Research Institute Carbopeptoids and carbonucleotoids
US6120794A (en) 1995-09-26 2000-09-19 University Of Pittsburgh Emulsion and micellar formulations for the delivery of biologically active substances to cells
WO1997012052A1 (en) 1995-09-28 1997-04-03 Targeted Genetics Corporation Transduction of hematopoietic cells by viral vector and a cationic lipid
US5925333A (en) * 1995-11-15 1999-07-20 Massachusetts Institute Of Technology Methods for modulation of lipid uptake
DE19547648A1 (de) * 1995-12-20 1997-06-26 Hoechst Ag Zubereitung, enthaltend High Density Lipoproteine und Crotonsäureamidderivate
US5679559A (en) * 1996-07-03 1997-10-21 University Of Utah Research Foundation Cationic polymer and lipoprotein-containing system for gene delivery

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2006001122A1 (ja) * 2004-06-24 2008-04-17 株式会社ディナベック研究所 Ｒｎａウイルスが導入された樹状細胞を含む抗癌剤
JP2013151523A (ja) * 2004-06-24 2013-08-08 Dnavec Research Inc Ｒｎａウイルスが導入された樹状細胞を含む抗癌剤
JP5296983B2 (ja) * 2004-06-24 2013-09-25 株式会社ディナベック研究所 Ｒｎａウイルスが導入された樹状細胞を含む抗癌剤
US8889118B2 (en) 2004-06-24 2014-11-18 Dna Vec Research Inc. Anticancer agent containing dendritic cell having RNA virus transferred thereinto
JP2011504874A (ja) * 2007-11-28 2011-02-17 国立大学法人 東京医科歯科大学 内因性カイロミクロンを利用した、標的遺伝子の発現を抑制する核酸のデリバリーシステム
WO2012147370A1 (ja) * 2011-04-28 2012-11-01 国立大学法人山口大学 ターミネータ配列を含む高発現用リバースプライマー及びリニアｄｎａ
US9796973B2 (en) 2011-04-28 2017-10-24 Yamaguchi University Terminator sequence-containing reverse primer for overexpression and linear DNA

Also Published As

Publication number Publication date
WO1998006437A3 (en) 1998-08-27
US20080089938A9 (en) 2008-04-17
DE69725878D1 (de) 2003-12-11
CA2264012A1 (en) 1998-02-19
CA2264012C (en) 2011-04-26
US6468986B1 (en) 2002-10-22
US20030185890A1 (en) 2003-10-02
WO1998006437A2 (en) 1998-02-19
US6251433B1 (en) 2001-06-26
ATE252914T1 (de) 2003-11-15
DE69725878T2 (de) 2004-07-29
EP0941122A2 (en) 1999-09-15
US7462592B2 (en) 2008-12-09
EP0941122B1 (en) 2003-10-29
JP2006257088A (ja) 2006-09-28
JP4320054B2 (ja) 2009-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4320054B2 (ja) ポリヌクレオチド送達のための組成物および方法
US8569065B2 (en) Compositions and methods for the delivery of biologically active RNAs
US7772201B2 (en) Highly branched HK peptides as effective carriers of siRNA
US7070807B2 (en) Branched histidine copolymers and methods for using same
US20060074045A1 (en) Vector for transfection of eukaryotic cells
US7820624B2 (en) Peptide ligands
US6372720B1 (en) Liposome fusion and delivery vehicle
Kim et al. Basic peptide system for efficient delivery of foreign genes
CA2241923C (en) Receptor-mediated gene transfer system for targeting tumor gene therapy
Min et al. Gene delivery using a derivative of the protein transduction domain peptide, K-Antp
US20070098702A1 (en) Recombinant protein polymer vectors for systemic gene delivery
WO2007061762A2 (en) Non-viral gene delivery complex
US20070264191A1 (en) Materials and Methods Relating to the Treatment of Glioblastomas
MXPA01012802A (es) Copolimeros para el transporte de acidos nucleicos a las celulas.
RU2408607C2 (ru) Способ направленной доставки днк в опухолевые и стволовые клетки
WO1997041243A9 (en) A cytoplasmic gene expression system which utilizes a prokaryotic rna polymerase autogene
JP2007514429A (ja) 細胞表面に連結され得る物質を連結するためのアダプター
RU2537262C2 (ru) Молекулярные конъюгаты с поликатионным участком и лигандом для доставки в клетку и ядро клетки днк и рнк
EP1178117A1 (en) Targeting through integrins
JP2001309790A (ja) 腫瘍指向性ペプチドベクター
EP1132099A1 (en) Nucleic acid transporters and medicinal compositions for gene therapy

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20050927

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20051226

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20060220

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20060327

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20000913

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20080318

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20080610

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20080724

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A132

Effective date: 20090129

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20090414

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20090519

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20090601

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120605

Year of fee payment: 3

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120605

Year of fee payment: 3

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130605

Year of fee payment: 4

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees