CN1177934C - 腺病毒介导的肿瘤内投送血管生成拮抗剂用于肿瘤的治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于肿瘤治疗的基因疗法。本发明更特别涉及向肿瘤的细胞内引入编码一种抗血管生成因子的基因，例如利用一种腺病毒载体，从而抑制肿瘤的生长或转移，或者两者均有。在一特定的实施方案中，一种表达尿激酶氨基末端片段(ATF)的缺陷型腺病毒的转移抑制肿瘤的生长和转移。这些效应同在注射部位内和其紧密邻近处血管生成化的显著抑制相关。一种表达制管张素的铰链结构区1至3的缺陷型腺病毒载体的转移抑制肿瘤生长和致肿瘤性，并诱导肿瘤细胞的凋亡。本发明进一步提供用于本发明方法中的病毒载体。

Description

腺病毒介导的肿瘤内投送血管生成拮抗剂用于肿瘤的治疗
                     本发明的领域
本发明涉及肿瘤治疗的基因疗法。本发明更特别涉及向肿瘤的细胞内引入编码一种抗血管生成因子的基因，例如利用一种腺病毒载体，从而抑制肿瘤的生长或转移，或者两者均有。
                     本发明的背景
细胞迁移是一种桥联细胞活化和粘附而细胞周蛋白水解和其抑制之间的平衡被打破(如，由纤溶酶原激活剂抑制剂以及金属蛋白酶的组织抑制剂引发)的协调过程(1-3)。尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)因通过结合至其细胞表面受体(uPAR)而在迁移细胞的表面启动一个蛋白水解的级联放大过程，因而在这一过程中是一个关键的驱动者(4，5)。uPA对其受体的结合大大加强了细胞表面纤溶酶原/纤溶酶的转化(6)。纤溶酶是一种能直接降解如纤连蛋白、玻连蛋白或层粘连蛋白等细胞外基质成分的广泛特异的丝氨酸蛋白酶。纤溶酶还通过将无活性的酶原转化为有活性的金属蛋白酶而间接促进基质的局部降解(7)。uPAR在迁移细胞(invadopodes)引导边缘的选择性分布明显富集了由它们自身或附近基质细胞分泌的uPA(8)。通过细胞uPA依赖的对玻连蛋白的结合(9)而且因为uPAR调节几种整联蛋白分子的结合特性(10)表明uPAR还直接参与细胞对细胞外基质的粘附。最后，uPA和纤溶酶通过活化或诱导形态发生因子如血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和转化生长因子β(TGFβ)的释放而在一定程度上参与细胞的形态发生(11，12)。
综上所述，这些观察表明uPA/uPAR系统通过协调细胞活化、粘附和运动来控制细胞迁移。临床观察支持在肿瘤侵入边缘存在增强的uPA活性这一观点(13，14)。由DMBA和巴豆油诱导的黑色素瘤在uPA缺陷的小鼠中不能进展为恶性阶段也支持在肿瘤的建立和进展中uPA的作用(15)。
uPA通过其轻链片段亦称为氨基末端片段(ATF，氨基酸1-135)结合至uPAR。这种相互作用是种属限制性的(16)而且涉及ATF的EGF样结构域(残基1-46)，其中在小鼠和人之间非保守的氨基酸19-32是关键的(17，18)。在体外ATF介导的uPA/uPAR复合体的破坏抑制肿瘤细胞迁移以及侵入(19)。腹膜内团状注射一种嵌合的基于人ATF的拮抗剂已被用来抑制植入无胸腺小鼠的人肿瘤细胞的肺转移，而对原发肿瘤生长无显著影响(20)。进一步的一项研究报道腹膜内注射衍生自小鼠ATF的合成肽对于抑制原发肿瘤生长和肺转移均有效(21)。这些结果同uPA/uPAR复合物在控制肿瘤和内皮细胞的运动性中的作用是一致的(22)。一种嵌合的基于小鼠ATF的拮抗剂在一人工的富含bFGF的细胞外基质中能够抑制血管生长(23)进一步支持uPA/uPAR参与控制体内血管生成。
血管的形成，或血管生成，是已存在血管的毛细血管生长的结果。血管生成对于许多生理过程是至关重要的，如胚胎发育、创伤愈合以及组织或器官再生。在病理情况下发生异常的新生血管生长如糖尿病性视网膜病和肿瘤生长，以及肿瘤播散至远隔位点〔38，24〕。实验和临床研究均已表明由于平衡的增殖和凋亡率，原发肿瘤以及转移仍然是静止的，除非血管生成过程被启动(39)。
内皮细胞的生长是由正性和副性因子共同紧密调节的。肿瘤血管生成的开始可以由肿瘤释放的血管生成因子如血管内皮细胞生长因子(VEGF)和酸性或/和碱性成纤维细胞生长因子(bFGFs)的上调或由血管抑制因子如血小板反应蛋白和制管张素的下调启动(39)。因而血管抑制因子的重建和血管生成刺激因子的清除都是抑制肿瘤血管生成的合理的临床策略〔40，41〕。因为不同肿瘤类型间内皮细胞并无改变，所以基于血管抑制的治疗也可用于所有实体瘤，进一步突出了这种抗肿瘤方法的临床适用性。因此，针对血管生成的疗法对于临床实践似乎是非常适用的。
许多生理性血管抑制因子衍生于循环蛋白的蛋白水解。制管张素〔32〕、内皮抑素〔42〕、催乳素的16kDa片段〔43〕或血小板因子4〔44〕均是如此。制管张素最初是从荷有刘易斯肺癌(LLC)的小鼠中分离出来的，并被鉴定为纤溶酶原(Plg)的一个38kDa的内部片段(aa98-440)，其包括该分子的前4个铰链结构区〔32；WO95/29242；US 5,639,725〕。已证明制管张素是由GM-CSF刺激的肿瘤浸润性巨噬细胞分泌的一种金属弹性蛋白酶水解Plg而产生的〔45〕。在6个不同的肿瘤模型中腹膜内团状注射纯化的制管张素已证实对抑制原发肿瘤生长是非常有效的，而没有明显的毒性〔46〕。制管张素介导的肿瘤血管生成抑制明显地使肿瘤细胞具有一种较高的凋亡率，抵消了它们的增殖率。在此研究中，在去除制管张素分子后肿瘤生长通常恢复，这强调了为获最佳的临床收益实现长期投送的重要性〔46〕。利用重组蛋白的体外研究提示制管张素的血管抑制活性主要是由铰链结构区1-3介导的，而铰链结构区4仅余有很小的活性〔47〕。至于大多数血管抑制因子，关于制管张素发挥效应的分子途径还知之甚少。
由于血管抑制疗法需要体内长期维持治疗水平，所以重组蛋白的不断输入将是昂贵而麻烦的。利用病毒载体直接体内投送相应的基因是解决这一问题令人关注的办法。因为目前大部分肿瘤基因治疗依赖于针对肿瘤细胞的破坏策略〔48〕，所以病毒介导的一种血管抑制因子的基因投送代表一个对抗肿瘤的概念上不同而且可能协同的方法。
尽管有这些结果，但仍需要发展对肿瘤，特别是化疗抗性肿瘤的有效治疗方法。
本发明通过建立一种治疗肿瘤的有效方式了满足这一需要。
在本说明书中通过数字注明各参考文献，其全部罗列在实施例后。此中引用的参考文献均不能被解释为描述或暗示此中所公布的发明。
                        发明概述
本发明有利地提供一种非常有效的肿瘤基因疗法。实际上，在本发明的一个特定的实施方案中在一无胸腺小鼠模型中由人肿瘤细胞表达的小鼠尿激酶ATF意外地有效抑制肿瘤发生。在另一实施方案中，在一小鼠模型中肿瘤细胞表达的制管张素除阻断血管生成外还抑制肿瘤生长和肿瘤发生，并诱导肿瘤细胞凋亡。
广义上，本发明提供一种通过向肿瘤细胞中引入含有可操作地同一提供抗血管生成因子表达的表达控制序列相联的编码一抗血管生成因子之基因的载体来抑制肿瘤生长或转移或者两者均有的方法。载体优选为一病毒载体；病毒载体更优选为一种腺病毒载体。在下文举例的一特定实施方案中，腺病毒载体为一种缺陷型腺病毒载体。
如此中所详细陈述的，本发明的方法在许多肿瘤的治疗中是有用的。例如，在特定的实施方案中，肿瘤为一种肺癌或一种乳腺癌。
另外，本发明首次证明由转导的肿瘤细胞表达抗血管生成因子的优点。相应地，编码任何抗血管生成因子的基因，如一种血管生成蛋白的可溶性受体或一种血管生成拮抗剂的基因，均可用来在本发明的实施中进行投送。在一特定的实施方案中，以该因子不是尿激酶为条件，抗血管生成因子含有尿激酶的具有EGF样结构域的氨基末端片段的一段序列。例如，抗血管生成因子可以是一种包括ATF-免疫球蛋白或ATF-人血清白蛋白的嵌合蛋白。在下文举例的一优选的实施方案中，抗血管生成因子为具有尿激酶从大约氨基酸残基1至大约残基135的氨基酸序列的尿激酶氨基末端片段。在一特定的方面，尿激酶为小鼠的尿激酶。在一更优选的方面，尿激酶为人的尿激酶。
在另一实施方案中，抗血管生成因子是制管张素，特别是制管张素的铰链结构区1至3。在一特别优选的实施方案中，抗血管生成因子是具有纤溶酶原中大约氨基酸残基1至约残基333氨基酸序列的纤溶酶原(plg)氨基末端片段。在另一优选实施方案中，抗血管生成因子是人纤溶酶原的氨基末端片段(制管张素)。
在一相关的实施方案中，本发明涉及如下载体在制造用于抑制肿瘤生长或转移或两者的药物中的应用，该载体含有编码一种抗血管生成因子的基因，该基因有效地与支持该抗血管生成因子表达的表达控制序列连接。更具体地，本发明提供本发明的病毒载体(如下所述)在制造用于抑制肿瘤生长或转移或两者的药物中的应用。
当然除上述方法和应用外，本发明提供一种新的病毒载体，其含有与表达控制序列有效相连的编码一种抗血管生成因子的基因。在一优选实施方案中，所述病毒载体是一种腺病毒载体。在另一实施方案中，病毒载体是一种缺陷型腺病毒载体。本发明的病毒载体可提供如上所述的编码任何抗血管生成因子的基因。例如，抗血管生成因子可含有具EGF样结构域的尿激酶氨基末端片段的序列，条件是该因子不是尿激酶。在一优选实施方案中，抗血管生成因子是具有尿激酶中氨基酸残基1至约残基135的氨基序列的尿激酶氨基末端片段。在该实施方案中，尿激酶可以是鼠尿激酶或优选地是人尿激酶。
本发明进而提供一种含本发明的任何病毒载体以及一种药学上可接受的载体的药物组合物。
因而，本发明的一个目的是通过投送抗血管生成因子用于治疗肿瘤提供基因疗法。
本发明的另一目的是提供一种用于投送一抗肿瘤发生因子的病毒载体。
本发明还有另一目的是通过基因疗法提供尿激酶的一个氨基末端片段(ATF)用于肿瘤治疗。
此外，本发明的另一目的是通过基因疗法提供制管张素用于治疗肿瘤。
本发明还有另一目的是通过基因疗法提供制管张素，特别是制管张素的铰链结构区1至3用于肿瘤治疗。
本发明的这些和其它目的在下面的详细描述和实施例以及附图中作进一步详尽阐述。
                     图的描述
图1.病毒AdmATF的分子鉴定。图案A：AdmATF和AdCO1的结构。Ad5染色体36kb长并以倒置末端重复序列为界。Y指包装信号。由于缺少Ad5 E1基因所以病毒均是生长缺陷的。它们在E3区内还载有一1.9kbXbaI缺失。在Ad5染色体下标出病毒AdmATF的mATF表达框的图示(未按比例绘制)。对于腺病毒载体的综述见(38)。图案B：mATF表达的分析。MDA-MB-231细胞被AdCO1(泳道2)或AdmATF(泳道3)、或模拟感染(泳道1)24小时，并将总多聚(A+)RNA用于RNA印迹分析。编码ATF的RNA(0.5kb)被标示出(箭头)。还检测出一1.7kb的分子(星号)，其大小同利用来自腺病毒pIX基因的多聚腺苷酸信号一致。图案C：293感染细胞ATF分泌的分析。用一多克隆抗小鼠uPA抗体对模拟感染细胞的(泳道1)、或者AdCO1(泳道2)或AdmATF(泳道3)感染细胞的培养基进行蛋白质印迹分析。
图2.病毒AdmATF的功能鉴定。图案A：AdmATF感染细胞的培养基抑制LLC细胞表面的纤维蛋白溶酶转化(见实施例的方法部分)。293指非感染细胞的上清。图案B：同AdCO1感染的LLC细胞(左侧图案)相比，用AdmATF感染LLC细胞(右侧图案)特异性抑制细胞侵入。膜的1.2mm孔是可见的。
图3.AdmATF的肿瘤内注射抑制在同系小鼠中LLC肿瘤的生长。将肿瘤细胞(2×106细胞)皮下注射到C57BL/6小鼠中。6天后，动物接受一次肿瘤内注射PBS、或者109PFU的AdCO1或AdmATF，并监测肿瘤的生长。用它们的标准偏差描述平均值(n＝10)。利用学生检验进行统计学分析。
图4.AdmATF的肿瘤内注射抑制LLC肿瘤的血管化。图案A：展示在注射后第10天取自AdCO1处理组(左)和AdmATF处理组的一个代表性肿瘤。在图案B(注射AdCO1)和图案C(注射AdmATF)中展示于注射后第20天取出的代表性肿瘤。所有照片均在相同放大下拍摄。注意AdmATF注射肿瘤比它们注射AdCO1的对照小得多，特别是在最后一次注射后(比较图案B和C)。
图5.AdmATF的肿瘤内注射抑制在裸鼠体内MDA-MB-231肿瘤的生长。通过皮下注射3×106个MDA-MB-231细胞植入肿瘤。在植入后11天，小鼠接受肿瘤内注射PBS、或者109PFU的AdCO1或AdmATF，并监测肿瘤的生长。用它们的标准偏差描述平均值。
图6.AdmATF的肿瘤内注射抑制肿瘤内和肿瘤周围的血管生成。图案A和B：肿瘤切片的vWF免疫染色。在注射后52天，用一多克隆抗vWF血清显示由AdCO1(A)和AdmATF处理组(B)制备的石蜡包埋MDA-MB-231肿瘤切片。图案C和D：显微镜下评价在注射后20天时注射AdCO1(C)或AdmATF(D)肿瘤的皮肤内肿瘤周围的血管化。
图7.(A)重组腺病毒。Ad5基因组是一36kb长的染色体。通过致死性缺失E1基因(核苷酸位点382至3446)而获得病毒AdK3和AdCO1；它们还载有一非致死性的E3区内1.9kb XbaI缺失(综述见〔37〕)。在Ad5染色体下标出制管张素的表达框。纤溶酶原分泌信号由一黑盒代表；+1指CMV驱动的转录起始；AATAAA指SV40的晚期多聚腺苷酸信号。(B)感染细胞制管张素分泌的分析。将100ng人Plg(泳道1)、来自感染AdK3(泳道2)或AdCO1(泳道3)的HMEC-1、感染AdK3(泳道4)或AdCO1(泳道5)的C6、以及来自感染AdK3(泳道6)或AdCO1(泳道7)的MDA-MB-231的培养液进行蛋白质印迹分析。(C)C6肿瘤抽提物中制管张素的免疫检测；在裸鼠中建立肿瘤并给予109PFU的AdCO1(泳道1)或AdK3(泳道2)，在注射后第10天是进行蛋白质印迹分析。同制管张素(36-38kDa)和Plg(92kDa)相对应的信号被标明(分别为箭头和星号)。
图8.(A)内皮细胞增殖的抑制。将AdK3(◆)或Ad-CO1(□)注入C6(图案1)、MDA-MB-231(图案2)和HMEC-1(图案3)中。用来自AdK3(◆)或Ad-CO1(□)感染的C6神经胶质瘤细胞的上清培养HMEC-1细胞(图案4)。(B)HMEC-1细胞中MPM-2磷酸表位的检测。模拟感染的细胞(泳道1)、AdCO1感染的细胞(泳道2)和AdK3感染的细胞(泳道3)。(C)通过间接免疫染色在感染AdCO1(图案1)或AdK3(图案2)的HMEC-1细胞中检测到MPM-2表位，并通过碘化丙锭染色检测DNA含量并通过流式细胞术定量(见方法)。学生t检验用于进行统计学分析。
图9.AdK3抑制肿瘤生长。将C6神经胶质瘤(图案A)和MDA-MB-231肿瘤(图案B)皮下植入无胸腺小鼠(见方法)。当肿瘤体积达到20mm3(0天)时，小鼠接受一次肿瘤内注射PBS(□)、或者109PFU的AdK3(●)或AdCO1(◆)。用它们的标准偏差描述平均值。
图10.AdK3抑制C6肿瘤生长和血管生成。展示了注射后10天取自AdCO1处理组(图案A)和AdK3处理组(图案B)的肿瘤。展示了注射后第5天在注射AdCO1(图案C)或AdK3(图案D)的代表性肿瘤周边血管化的程度。在注射后第10天将取自注射AdCO1(图案E)或AdK3(图案F)肿瘤的石蜡包埋C6切片进行vWF免疫染色。通过TUNEL方法检测在取自AdCO1注射(图案G)或AdK3(图案H)注射肿瘤的切片内凋亡细胞的比例。AdCO1和AdK3注射的肿瘤使用同等放大。
图11.AdK3的剂量依赖效应。在C6细胞植入无胸腺小鼠前，体外用AdCO1(图案A)或AdK3(图案B)感染C6细胞24小时，并以1(□)、1∶2(◆)和1∶4(●)的比例同未感染的C6细胞混合。在20天内测定肿瘤体积。用它们的标准偏差描述平均值。
                       本发明的详细
如上所述，本发明针对用于肿瘤基因治疗的方法和载体。本发明的方法和载体抑制肿瘤生长或肿瘤转移，或者两者均有。这些方法和载体在一种出人意料地有利的程度上通过抑制肿瘤的血管生成发挥作用。
本发明部分基于尿激酶氨基末端片段(ATF)和制管张素基因治疗性转移的实验。ATF是一种尿激酶(uPA)的拮抗剂，结合至其细胞表面受体(uPAR)，还是一种内皮细胞迁移的抑制剂。为评价uPA/uPAR相互作用对肿瘤生长和播散的重要性，构建了一种由CMV启动子表达小鼠ATF的缺陷型腺病毒(AdmATF)。在两个不同小鼠模型中，单次肿瘤内注射AdmATF抑制已建立肿瘤的生长，并延迟肿瘤播散。这些效应同在注射部位内以及其紧密邻近部位新生血管化的显著抑制相关。这种效应的程度在小鼠ATF抑制一源于人的肿瘤的血管生成的能力中特别显著。在一特定的实例中，构建了一表达人Plg的N末端片段(aa1-333)-其中包括预活化肽和铰链结构区1至3〔47〕-的缺陷型腺病毒(AdK3)，并评价其在不同小鼠肿瘤模型中的体外和体内活性。AdK3载体抑制肿瘤生长、肿瘤血管生成和肿瘤发生，并诱导肿瘤细胞凋亡。
腺病毒介导的拮抗剂肿瘤内投送通过靶向血管生成表现出有效的抗肿瘤特性。
                         定义
在本说明书中使用下面定义的术语，并且可能对理解本发明的范围和实践有帮助。
在一特定的实施方案中，术语“约”或“大约”意指在给定值或范围的20％以内，优选10％以内，而更优选5％以内。
“抗血管生成”因子是一种抑制血管生成，特别是通过阻断内皮细胞迁移来抑制的分子。这种因子包括抑制性的血管生成蛋白的片段(如尿激酶的ATF)、血管生成抑制因子，如制管张素和内皮抑素；以及血管生成因子的可溶性受体，如尿激酶受体或FGF/VEGF受体。术语“制管张素”，其衍生自纤溶酶原的氨基末端片段，包括具有铰链结构区1至3的制管张素的抗血管生成片段。通常，在本发明中所用的抗血管生成因子为一种由利用本发明的载体转入肿瘤的一种基因所编码的蛋白或多肽。
一种多肽或蛋白的“变体”是衍生自多肽或蛋白的并保留该多肽或蛋白至少一个生物学特性的任何类似物、片段、衍生物、或突变体。天然可能存在该多肽或蛋白的不同变体。这些变体可以是以编码该蛋白的结构基因核苷酸序列中的不同为特征的等位基因变异，或者可以包括不同的剪接或翻译后修饰。技术人员可以制备具有单个或多个氨基酸取代、缺失、插入或置换的变体。这些变体可以特别包括(a)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸取代的变体，(b)将一个或多个氨基酸加入到该多肽或蛋白中的变体，(c)一个或多个氨基酸包括一个取代基团的变体，以及(d)多肽或蛋白同另一多肽如血清白蛋白融合的变体。获得这些变体的技术，包括遗传学(抑制、删除、突变等)、化学和酶学的技术，对于本领域的普通技术人员是已知的。
如果这种等位基因变异、类似物、片段、衍生物、突变体和包括不同的mRNA剪接形式和不同的翻译后修饰形式的修饰产生的多肽衍生物保留有该多肽的任何生物学特性，则应将它们包括于本发明的范围之中。
                     普通分子生物学
依据本发明，在本领域的技术中应包括传统的分子生物学、微生物学、以及重组DNA技术。这些技术在文献中有详细的解释。见，例如，Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆：实验室手册(MolecularCloning：A Laboratory Manual)，第二版(1989)冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(此中称为“Sambrook等，1989”)；DNA克隆：一种操作方法(DNA Cloning：A Practical Approach)，I和II卷(D.N.Glover编，1985)；寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)(M.J.Gait编，1984)；核酸杂交(Nucleic AcidHybridization)〔B.D.Hames和S.J.Higgins编，(1985)〕；转录和翻译(Transcription And Translation)〔B.D.Hames和S.J.Higgins编，(1984)〕；动物细胞培养(Animal Cell Culture)〔R.I.Freshney编(1986)〕；固定化细胞和酶(Immobilized Cells AndEnzymes)〔IRL出版社，(1986)〕；B.Perbal，分子克隆实用指南(A Practical Guide To Molecular Cloning)(1984)；F.M.Ausubel等(编)，现代分子生物学方法(Current Protocols in MolecularBiology)，John Wiley和Sons公司(1994)。
因此，如果此中出现，随后的术语应该具有下面给出的定义。
“载体”是用于将根据本发明的一种核酸转移入一宿主细胞的任何工具。术语“载体”包括用于体外、离体或体内将核酸引入一细胞中的病毒和非病毒工具。非病毒载体包括质粒、脂质体、带电荷脂质(cytofectins)、DNA-蛋白质复合物和生物多聚体。病毒载体包括逆转录病毒、腺相关病毒、痘病毒、杆状病毒、痘苗病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒和腺病毒载体，这在下面更加详细地列出。除了根据本发明的核酸外，载体还可以含有一个或多个调节区域，和/或便于筛选、检测和监测核酸转移结果(转移至何种组织，表达持续时间等)的筛选标志。
“调节区域”意指调节另一核酸序列表达的一种核酸序列。一个调节区域可以包括天然负责一特殊核酸表达的序列(同源区域)或者可以包括不同来源的序列(负责表达不同蛋白或者甚至为合成蛋白)。特别地，序列可以是真核或病毒基因的序列或衍生序列，其以一种特定或非特定的方式以及一种诱导性或非诱导性方式刺激或抑制基因转录。调节区域包括复制起点、RNA剪接位点、增强子、转录终止序列、指导多肽进入靶细胞分泌路径的信号序列以及启动子。
来自“异源”的调节区域是一个同所表达的核酸并非天然相联的调节区域。异源调节区域中包括来自不同物种的调节区域、来自不同基因的调节区域、杂合的调节序列以及天然中不存在但由本领域普通技术人员设计的调节序列。
“盒”指能在特定限制性位点被插入一载体的DNA片段。该DNA片段编码一种目的多肽，而且设计该盒和限制性位点以保证该盒插入在对转录和翻译适当的阅读框中。
当外源或异源DNA被引入细胞内时，这个细胞被这种DNA“转染”。当转染的细胞出现表型改变时，这个细胞被外源或异源DNA“转化”或“转导”。
“异源”DNA指天然并非位于细胞内或细胞的一个染色体位点上的DNA。异源DNA优选包括一种对细胞为外来的基因。
“核酸”是一种由称为核苷酸的亚单位共价连接组成的多聚化合物。核酸包括多聚核糖核酸(RNA)和多聚脱氧核糖核酸(DNA)，它们均可以是单链或双链。DNA包括cDNA、基因组DNA、合成DNA以及半合成DNA。编码蛋白的核苷酸序列或核酸序列被称为有义序列。“重组的DNA分子”是一种经过分子生物学操作的DNA分子。
DNA“编码序列”是一种当置于适当的调节序列控制下时，在体内或体外于细胞中转录并翻译为一多肽的双链DNA序列。由一在5’(氨基)末端的起始密码子和一在3’(羧基)末端的翻译终止密码子决定编码序列的边界。多聚腺苷酸信号和转录终止序列通常位于该编码序列的3′。
转录和翻译控制序列为保证编码序列在一宿主细胞中表达的DNA调节序列，如启动子、增强子、终止子等等。在真核细胞中，多聚腺苷酸信号为控制序列。
“启动子序列”为在细胞中能够结合RNA聚合酶并启动下游(3’方向)编码序列转录的一种DNA调节区域。出于定义本发明的目的，将启动子序列界定为其3’末端在转录起始位点处，向上游(5’方向)延伸包括在高于背景可检出水平启始转录所必需的最小数目的碱基或元件。在启动子序列内可发现一转录起始位点(例如，通过核酸酶S1作图方便地确定)、以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合结构域(保守序列)。
在细胞中当RNA聚合酶将编码序列转录为mRNA时，编码序列是由转录和翻译控制序列“控制”的，然后mRNA任选性地被转运RNA剪接并翻译为由编码序列编码的蛋白。
“信号序列”被包括在一种将表达在细胞表面的蛋白的编码序列的开始处。该序列编码一信号肽，处于成熟多肽的N末端，其引导宿主细胞转位该多肽。此中术语“转位信号序列”用来指这类信号序列。可发现转位信号序列同多种真核和原核细胞的固有蛋白相关，并且通常在这两类生物中均有功能。
术语“相应”此中用来指相似或同源序列，无论精确的位置同测定相似性或同源性的分子相同或不同。核酸或氨基酸序列排列可能包括间隔。因而，术语“相应”指序列相似性，而不是氨基酸残基或核苷酸碱基的计数。
本发明的各个方面将在随后的部分中针对合适的基因治疗载体和启动子、抗血管生成蛋白以及治疗策略更加详细地提出。这种分为各个部分的描述意在便于理解本发明，因而决非意在局限之。
                       基因治疗载体
如上所述，“载体”是用于将根据本发明的一种核酸转移入一宿主细胞的任何工具。优选的载体为病毒载体，如逆转录病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒和腺相关病毒。因而，利用病毒载体或通过DNA的直接引入便将编码一抗血管生成蛋白或多肽结构域片段的基因或核酸序列在体内、离体或体外引入。通过将转基因载体靶向于特定的细胞，例如利用病毒载体或受体配体，或者通过利用一组织特异性启动子或者两者皆有，可以实现在靶向组织中的表达。
通常用于体内或离体靶向和治疗程序的病毒载体是基于DNA的载体和逆转录病毒载体。构建和利用病毒载体的方法在本领域是已知的〔见，如Miller和Rosman，生物技术(BioTechniques)7：980-990(1992)〕。优选病毒载体为复制缺陷的，即它们在靶细胞中不能自主复制。大体上，在本发明范围内所用的复制缺陷病毒载体的基因组缺少至少一个对于病毒在所感染的细胞内复制是必需的区域。这些区域或者被清除(全部或部分)，或者通过本领域的技术人员所知的任何技术使之无功能。这些技术包括全部去除、取代(被其它序列，特别由插入的核酸)、部分缺失或在一关键区域(对于复制)加入一个或多个碱基。利用遗传学操作技术或通过诱变剂处理可以在体外(在分离的DNA上)或原位进行这些技术。优选复制缺陷病毒保留有其对于病毒颗粒的包装是必需的基因组序列。
DNA病毒载体包括减毒的或缺陷的DNA病毒，例如但并不限于单纯疱疹病毒(HSV)、人乳头状瘤病毒、EB病毒(EBV)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)等等。优选缺陷病毒，其完全或几乎完全缺少病毒基因。缺陷病毒在引入细胞后无感染性。利用缺陷病毒载体允许施予特定的局部区域中的细胞，而不用担心载体能够感染其它细胞。因此，可以特异性地靶向特定的组织。特殊载体的例子包括但并不限于缺陷的疱疹病毒1(HSV1)载体〔Kaplitt等，分子细胞神经科学(Molec.Cell.Neurosci.)2：320-330(1991)〕、缺少糖蛋白L基因的缺陷的疱疹病毒载体〔专利公开RD 371005 A〕、或其它缺陷的疱疹病毒载体〔国际专利公开WO 94/21807号，1994年9月29日出版；国际专利公开WO 92/05263号，1994年4月2日出版〕；减毒腺病毒载体，例如由Stratford-Perricaudet等描述的载体〔临床研究杂志(J.Clin.Invest.)90：626-630(1992)；还见La Salle等，科学(Science)259：988-990(1993)〕；以及缺陷的腺相关病毒载体〔Samulski等，病毒学杂志(J.Virol.)61：3096-3101(1987)；Samulski等，病毒学杂志(J.Virol.)63：3822-3828(1989)；Lebkowski等，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)8：3988-3996(1988)〕。
对于体内给药，优选同病毒载体例如腺病毒载体一起使用一种适当的免疫抑制治疗，以避免病毒载体和所转染细胞的免疫灭活。例如，免疫抑制细胞因子，如白细胞介素-12(IL-12)、干扰素-γ(IFN-γ)或抗CD4抗体可以用来阻断对病毒载体的体液或细胞免疫反应〔见，例如Wilson，自然医学(Nature Medcine)(1995)〕。另外，利用表达最小数量抗原的工程病毒载体是有益的。
腺病毒载体。在一优选的实施方案中，载体为一种腺病毒载体。如在实施例中所示，缺陷的腺病毒载体已经表明它们对于血管生成抑制剂ATF和制管张素的投送特别有效，这表现为出人意料地高效抑制肿瘤生长和肿瘤发生。腺病毒为真核DNA病毒，其可以被修饰来将本发明的一种核酸有效地转移入多种类型的细胞中。存在腺病毒的多种血清型。在这些血清型中，在本发明的范围中优选的是利用2型或5型人腺病毒(Ad2或Ad5)或者动物来源的腺病毒(见WO94/26914)，那些在本发明的范围内可用的动物来源的腺病毒包括犬、牛、小鼠(例：Mavl、Beard等，病毒学(Virology)75(1990)81)、绵羊、猪、禽和猿(例：SAV)来源的腺病毒。优选动物来源的腺病毒为犬腺病毒，更优选为CAV2腺病毒(例如，Manhattan或A26/61株(ATCC VR-800))。
优选本发明的复制缺陷腺病毒载体包括ITR、包装序列以及目的核酸。更优选至少腺病毒载体的E1区是无功能的。E1区中的缺失优选在Ad5腺病毒的序列中从455扩展至3329位核苷酸(PvuII-BglII片段)或382至3446位(HinfII-Sau3A片段)。其它区域也可以被修饰，特别是E3区(WO95/02697)、E2区(WO94/28938)、E4区(WO94/28152、WO94/12649和WO95/02697)，或者在晚期基因L1-L5的任何一个中。
在一优选的实施方案中，腺病毒载体在E1区具有一缺失(Ad1.0)。E1缺失腺病毒的例子公布在EP 185,573中，其内容并入此中作为参考。在另一优选的实施方案中，腺病毒载体在E1和E4区具有一缺失(Ad3.0)。E1/E4缺失腺病毒的例子公布在WO95/02697和WO96/22378中，其内容并入此中作为参考。在另一优选的实施方案中，腺病毒载体在E1区有一缺失，而E4区和核酸序列插入其中(见FR94 13355，其内容并入此中作为参考)。
根据本发明的复制缺陷重组腺病毒可通过本领域的技术人员所知的任何技术制备(Levrero等，基因(Gene)101(1991)195，EP 185 573；Graham，欧洲分子生物学组织杂志(EMBO J.)3(1984)2917)。特别是，可以通过在一腺病毒和一其中载有目的DNA序列的质粒间的同源重组制备它们。在所说的腺病毒和质粒共转染入一合适的细胞系后发生同源重组。所用的细胞系优选(i)可为所说元件转化的，并(ii)含有能够补偿复制缺陷腺病毒基因组部分的序列，为避免重组的风险优选以整合形式存在。可以利用的细胞系的例子是含有Ad5腺病毒基因组的左臂部分(12％)并整合在其基因组中的人胚肾细胞系293(Graham等，普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)36(1977)59)，以及如在专利申请WO94/26914和WO95/02697中所描述的，能够补偿E1和E4功能的细胞系。利用标准的分子生物学技术回收和纯化重组腺病毒，这对于本领域的普通技术人员是众所周知的。
腺相关病毒。腺相关病毒(AAV)是相对较小的DNA病毒，其能够以一种稳定且位点特异性的方式整合在它们感染细胞的基因组中。它们能够感染广泛的细胞而对细胞生长、形态学或分化不引起任何效应，而且它们似乎不参与人类疾病。AAV基因组已经被克隆、测序和鉴定。其包括大约4700个碱基并在两端各含有一大约145个碱基的倒置重复序列(ITR)区，其用作病毒复制的起点。基因组的其余部分被分为两个具有包装功能的基本区域：基因组的左臂部分，其含有参与病毒复制和病毒基因表达的rep基因；以及基因组的右臂部分，其含有编码病毒包壳蛋白的cap基因。
在体外和体内应用衍生自AAV的载体来转移基因已有描述(见WO91/18088；WO 93/09239；US 4,797,368，US 5,139,941，EP 488 528)。这些出版物描述了各种AAV衍生的构建物，其中rep和/或cap基因被删除并由目的基因取代，以及这些构建用于体外(转入培养的细胞)或体内(直接转入生物体)转移所说目的基因的应用。根据本发明的复制缺陷重组AAV可以通过将一含有由AAV的倒置重复序列(ITR)区域作为侧翼的目的核酸序列的质粒和一载有AAV包装基因(rep和cap基因)的质粒共转染入一被人辅助病毒(例如腺病毒)感染的细胞系。然后利用标准的技术纯化所产生的AAV重组体。
因而本发明还涉及一种AAV衍生的重组病毒，其基因组含有由AAV的ITR作为侧翼的编码一种抗血管生成因子的核酸编码序列。本发明还涉及一种含有由AAV的ITR作为侧翼的编码一种抗血管生成因子的核酸编码序列的质粒。这种质粒本身可用于转移核酸序列，适当时可将质粒掺入一脂质体载体(假病毒)中。
逆转录病毒载体。在另一实施方案中，基因可被引入一逆转录病毒载体，例如在Anderson等，美国专利5,399,346号；Mann等，1983，细胞(Cell)33：153；Temin等，美国专利4,650,764号；Temin等，美国专利4,980,289号；Markowitz等，1988，病毒学杂志62：1120；Temin等，美国专利5,124,263号；EP 453242，EP178220；Bernstein等，遗传学工程(Genet.Eng.)7(1985)235；McCormick，生物技术(BioTechnology)3(1985)689；国际专利公开第WO 95/07358号，1995年3月16日出版，Dougherty等；以及Kuo等，1993，血液(Blood)82：845中所描述的。逆转录病毒为整合病毒，其感染分裂细胞。逆转录病毒基因组包括两个LTR、一种包装序列和3个编码区域(gag、pol和env)。在重组逆转录病毒载体中，通常全部或部分删除gag、pol和env基因，并用异源的目的核酸序列置换。这些载体可由不同类型的逆转录病毒构建，例如HIV、MoMuLV(“小鼠莫洛尼白血病病毒”)、MSV(“小鼠莫洛尼肉瘤病毒”)、HaSV(“哈维肉瘤病毒”)、SNV(“脾坏死病毒”)、RSV(“劳斯肉瘤病毒”)以及弗兰德病毒。缺陷的逆转录病毒载体公布于WO95/02697中。
总体上，为了构建含有一核酸序列的重组逆转录病毒，先构建一含有LTR、包装序列和编码序列的质粒。将该构建用于转染一包装细胞系，其能够反式提供在质粒中缺陷的逆转录病毒的功能。通常，于是包装细胞系能够表达gag、pol和env基因。此类包装细胞系在本领域中已有描述，特别是细胞系PA317(US4,861,719)；PsiCRIP细胞系(WO90/02806)和GP+envAm-12细胞系(WO89/07150)。此外，重组逆转录病毒载体在LTR内可以含有修饰以抑制转录活性以及可能包括部分gag基因的广泛的包装序列(Bender等，病毒学杂志61(1987)1639)。利用本领域的普通技术人员所知的标准技术纯化重组逆转录病毒载体。
可以构建逆转录病毒载体发挥感染颗粒的功能或进行单轮转染。在前例中，将病毒修饰为保留除那些负责致瘤转化特性基因外的所有基因，并表达外源基因。制备非感染性病毒载体以破坏病毒包装信号，但保留包装共同引入的经改造含有外源基因的病毒所需的结构基因以及包装信号。因此，所制备的病毒颗粒不能产生另外的病毒。
在1995年10月出版的国际专利公开WO95/28494中描述了靶向基因转移。
非病毒载体。载体也可以以无转染辅剂的核酸形式或同转染促进剂如脂质体一起体内引入。在过去的十年越来越多地利用脂质体体外包装和转染核酸。设计来限制脂质体介导的转染中所遇到的困难和危险的合成阳离子脂质可被用来制备用于体内转染编码标志物基因的脂质体〔Felgner等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)84：7413-7417(1987)；见Mackey等，美国国家科学院院报85：8027-8031(1988)；Ulmer等，科学259：1745-1748(1993)〕。阳离子脂质的应用可以促进带负电荷核酸的包装，并促进其同带负电荷细胞膜的融合〔Felgner和Ringold，科学337：387-388(1989)〕。在国际专利公开WO95/18863和WO96/17823以及在美国专利5,459,127号中描述了用于核酸转移的特别有用的脂质化合物和组合物。体内利用脂质体将外源基因引入特定的器官具有某些实际优点。脂质体对特定细胞的分子靶向代表一方面益处。很明显，对特殊细胞类型的针对性转染在一具有细胞异质性的组织中特别有利，例如胰腺、肝脏、肾脏以及脑。为了靶向的目的，可以将脂质化学偶联至其它分子上〔见Mackey等，同前〕。靶向肽，例如激素或神经递质，以及蛋白如抗体，或非肽分子可以化学偶联至脂质体上。
其它分子对便于体内核酸的转染也是有用的，如一种阳离子寡肽(例如，国际专利公开WO95/21931)、衍生自DNA结合蛋白的肽(例如，国际专利公开WO96/25508)、或一种阳离子多聚体(例如，国际专利公开WO95/21931)。
体内以一种裸DNA质粒引入载体也是可能的。用于基因治疗的裸DNA载体可通过本领域已知的方法引入目的宿主细胞，例如转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、基因枪的使用、或者DNA载体转运剂的使用〔见，例如Wu等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)267：963-967(1992)；Wu和Wu，生物化学杂志263：14621-14624(1988)；Hartmut等，加拿大专利申请2,012,311号，1990年3月15日提交；Williams等，美国国家科学院院报88：2726-2730(1991)〕。受体介导的DNA转移方法也可以使用〔Curiel等，人类基因治疗(Hum.Gene Ther.)3：147-154(1992)；Wu和Wu，生物化学杂志262：4429-4432(1987)〕。
核酸也可以以裸DNA形式给药。在美国专利5,580,859和5,589,466中公布了向哺乳动物肌肉组织给予裸DNA的方法，其内容并入此中作为参考。
调节区域。本发明载体对抗血管生成因子的表达可以由任何调节区域控制，即本领域已知的启动子/增强子元件，但这些调节元件必需在选择用来表达的宿主靶肿瘤中有功能。
调节区域可以包括一用于在肿瘤中功能性转录的启动子区域、一位于目的基因3’端显示转录终止信号的区域，以及一多聚腺苷酸位点。所有这些元件组成表达盒。
在本发明中可以利用的启动子包括组成型启动子和调节(可诱导)型启动子。启动子可以是天然负责核酸的表达。也可以是来自不同来源的。特别是，其可以为真核或病毒基因的启动子序列。例如，其可能是衍生自预期感染的细胞基因组的启动子序列。类似地，其可能是来自病毒(包括所用的腺病毒)的基因组启动子序列。在这点上，应该提到例如E1A、MLP、CMV和RSV基因等的启动子。
另外，可以通过添加活化或调节序列或允许组织特异性或优势表达的序列来修饰启动子(烯醇酶和GFAP启动子等)。此外，当核酸不含有启动子序列时，其可以插入在这类基因下游的病毒基因组中。
一些对于本发明的实施有用的启动子是普遍存在的启动子(例如HPRT、波形蛋白、肌动蛋白、微管蛋白)、中间纤维启动子(例如肌纤维蛋白、神经丝、角蛋白、GFAP)、治疗性基因启动子(例如MDR型、CFTR、因子VIII)、组织特异性启动子(例如在平滑肌细胞中的肌动蛋白启动子)、优选在分裂细胞中活化的启动子、对某种刺激有反应的启动子(例如类固醇激素受体、视黄酸受体)、四环素调节的转录调节子、巨细胞病毒立即早期蛋白、逆转录病毒LTR、金属硫蛋白、SV-40、E1a和MLP启动子。在WO96/01313、US5,168,062和5,385,839中描述了四环素调节的转录调节子和CMV启动子，其内容并入此中作为参考。
因此，可用来控制基因表达的启动子包括但并不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40早期启动子区域(Benoist和Chambon，1981，自然(Nature)290：304-310)、在劳斯肉瘤病毒的3’长末端重复序列中所含的启动子(Yamamoto等，1980，细胞(Cell)22：787-797)、疱疹病毒胸苷激酶启动子(Wagner等，1981，美国国家科学院院报78：1441-1445)、金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等，1982，自然296：39-42)；原核表达载体如b-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等，1978，美国国家科学院院报75：3727-3731)、或tac启动子(DeBoer等，1983，美国国家科学院院报80：21-25)；还见“科学美国人”(Scientific American)，1980，2452：74-94中的“来自重组细菌的有用蛋白”；来自酵母或其它真菌的启动子元件如Gal4启动子、ADC(乙醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子；以及表现出组织特异性并已用在转基因动物中的动物转录控制区域：在胰腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区域(Swift等，1984，细胞38：639-646；Ornitz等，1986，Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.50：399-409；MacDonald，1997，肝脏病学(Hepatology)7：425-515)；在胰岛β细胞中有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan，1985，自然315：115-122)、在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedle等，1984，细胞38：647-658；Adames等，1985，自然318：533-538；Alexander等，1987，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)7：1436-1444)、在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳房肿瘤病毒控制区(Leder等，1986，细胞45：485-495)、在肝脏中有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert等，1987，基因和发育(Genes and Devel.)1：268-276)、在肝脏中有活性的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf等，1985，分子细胞生物学5：1639-1648；Hammer等，1987，科学235：53-58)、在肝脏中有活性的α1抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等，1987，基因和发育1：161-171)、在髓系细胞中有活性的β球蛋白基因控制区(Mogram等，1985，自然315：338-340；Kollias等，1986，细胞46：89-94)、在脑少突胶质细胞中有活性的髓磷脂碱蛋白基因控制区(Readhead等，1987，细胞48：703-712)，在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链2基因控制区(Sani，1985，自然314：283-286)、以及在下丘脑中有活性的促性腺激素释放激素基因控制区(Mason等，1986，科学234：1372-1378)。
            编码抗血管生成蛋白的基因
根据本发明，本发明的载体可用来将一编码抗血管生成蛋白的基因转移入肿瘤中。在一优选的实施方案中，抗血管生成因子为含有EGF样结构域的尿激酶氨基末端片段(ATF)。该片段对应ATF的大约1至135位氨基酸残基。
在另一实施方案中，可以一种融合蛋白的形式提供ATF，例如同免疫球蛋白或人血清白蛋白〔WO93/15199〕，其全部内容特别并入此中作为参考。
虽然优选人尿激酶ATF，但在本发明中用的有效ATF可衍生自任何尿激酶，例如小鼠尿激酶。另外，本发明考虑给予一种通过用人ATF相应的残基置换特定氨基酸残基来修饰的非人尿激酶ATF。例如，可以在以下一个或多个，优选全部氨基酸残基处修饰小鼠ATF：23位酪氨酸改为天冬酰胺；28位精氨酸改为天冬酰胺；30位精氨酸改为组氨酸；以及31位精氨酸改为色氨酸。因此，来自任何来源的尿激酶ATF均可人源化。这利用常规分子生物学技术通过修饰编码序列可以很容易完成。
根据本发明也可利用编码其它抗血管生成蛋白的基因。这种基因包括但并不限于编码包括含有1至3铰链结构区的制管张素的基因
〔O’Reilly等，细胞79：315-328(1994)；WO97/29242；US5,639,725〕；金属蛋白酶的组织抑素〔Johnson等，细胞生理学杂志(J.Cell.Physiol.)160：194-202(1994)〕；FGF或VEGF的抑制剂；以及内皮抑素的基因〔WO97/15666〕。在一优选的实施方案中，抗血管生成因子为制管张素，特别是制管张素的1至3铰链结构区。在一特别优选的实施方案中，抗血管生成因子为具有从大约氨基酸残基1至残基333的纤溶酶原氨基酸序列的纤溶酶原(Plg)氨基末端片段。在另一优选的实施方案中，纤溶酶原/制管张素的氨基末端片段来自人纤溶酶原(制管张素)。
在另一实施方案中，本发明施予编码血管生成因子受体的可溶形式-包括但并不限于可溶VGF/VEGF受体和可溶尿激酶受体〔Wilhem等，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters)337：131-134(1994)〕-的基因。
总之，任何参与血管生成的编码一拮抗内皮细胞活化或迁移的蛋白或可溶受体的基因可以用于本发明的基因治疗载体和方法。但出于上面指出并在下面展示的原因，仍特别值得注意的是ATF或制管张素的基因治疗转移在这点上非常有效，
可以从任何来源分离编码抗血管生成因子的基因，不论是基因组DNA或cDNA，特别是从人cDNA或基因组文库。如上所述〔见，例如Sambrook等，1989，同前〕，用于获得此类基因的方法在本领域是众所周知的。
由于核苷酸编码序列的简并性，编码相同氨基酸序列的其它核酸序列作为抗血管生成因子的基因可以用在本发明的实践中，而且应认为它们属于本发明的范围。这些包括但并不限于等位基因、来自其它物种的同源基因，以及包括抗血管生成因子基因的全部或部分的核苷酸序列，其通过编码该序列内同一氨基酸残基的不同密码子的置换而改变，因而产生一沉默突变。类似的，本发明的抗血管生成因子衍生物包括但并不限于那些作为一级氨基酸序列，含有包括通过功能等价氨基酸残基置换序列内残基导致保守氨基酸置换而改变的序列的抗血管生成因子蛋白的全部或部分氨基酸序列。例如，序列内的一个或多个氨基酸残基可以由类似极性的作为一个功能等价体的另一氨基酸置换导致一沉默突变。序列内一个氨基酸的置换物可以选自该氨基酸所属类的其它成员。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。含有芳香环结构的氨基酸为苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷胺酰胺。带正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。此类变化预期不会影响通过聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的表观分子量或等电点。
特别优选的置换为：
-Lys对Arg和反之以便可以保持一正电荷；
-Glu对Asp和反之以便可以保持一负电荷；
-Ser对Thr以便可以保持一自由的-OH；以及
-Gln对Asn以便可以保持一自由的CONH2。
本发明的编码抗血管生成因子衍生物和类似物的基因可以通过本领域已知各种方法制备。导致它们制备的操作可以发生在基因或蛋白质水平。例如，可以通过众多本领域已知策略中的任何策略修饰所克隆的抗血管生成因子基因序列(Sambrook等，1989，同前)。序列可以在适当的位点用限制性核酸内切酶切开，随后如果需要通过进一步酶促修饰，分离并体外连接。在编码一抗血管生成因子的衍生物或类似物的基因的制备中，应小心以保证所修饰的基因在编码预期活性的基因区域中仍然在同抗血管生成因子基因一样的翻译阅读框中，且未被翻译终止信号打断。
此外，编码抗血管生成因子的核酸序列可以在体外或体内诱变来产生和/或破坏翻译、启动、和/或终止序列，或者产生编码区中的改变和/或形成新的限制性核酸内切酶位点或破坏已存在的位点，以便于进一步体外修饰，如形成一嵌合基因。优选这些突变提高突变的抗血管生成因子基因产物的功能活性。可以利用任何本领域已知的诱变技术，包括但并不限于体外定点诱变(Hutchinson，C.等，1978，生物化学杂志253：6551；Zoller和Smith，1984，DNA 3：479-488；Oliphant等，1986，基因(Gene)44：177；Hutchinson等，1986，美国国家科学院院报83：710)、TAB接头(Pharmacia)的应用等等。优选PCR技术用于定点诱变(见Higuchi，1989，“利用PCR来加工DNA”，见PCR技术：DNA扩增的原则和应用(PCR Technology：Principles andApplications for DNA Amplification)，H.Erlich，编，Stockton出版社，第6章61-70页)。
                    治疗靶和策略
本发明的方法使人能够治疗肿瘤。根据本发明，现可以通过各种注射、输注、直接应用等中的一个合理选择来特异性并单方面感染大量的肿瘤细胞。
药物组合物。对于本发明的应用，载体，无论以病毒载体、核酸脂质复合物的形式，或者裸DNA的形式，优选同一种或多种药学可用的载体联合以形成可注射的配制品。短语“药学可用”指分子和组合物是生理上可耐受的，并且用于人时不产生典型的过敏或类似的不适反应，如反胃、眩晕等等。如此中所用的，优选术语“药学可用”意指由联邦或一州政府的或者在美国药典或其它用于动物且特别是人的大众公认的药典中所列的管理机构批准。术语“载体”指同化合物共同施予的一种稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。此类药学载体可以为无菌液体，例如水和油，包括来自石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油及类似的。优选使用水或盐水溶液以及葡萄糖水溶液和甘油溶液作为载体，特别是用于注射溶液。在E.W.Martin的“Remington药剂科学”(Remington PharmaceuticalSciences)中描述了适当的药学载体。这些特别可以是等渗、无菌盐溶液(磷酸一钠或二钠盐、钠、钾、钙、镁的氯化物及类似的，或者这些盐的混合物)，或者干的，特别是冻干的组合物，其根据情况通过加入无菌水或生理盐水来形成可注射的溶液。
优选的无菌可注射制剂可以为在无毒的非肠道可用的溶剂或稀释剂中的溶液或悬液。药学可用的载体的例子是盐水、缓冲盐水、等渗盐水(例如，磷酸一钠或二钠盐、钠、钾、钙、镁的氯化物及类似的，或者这些盐的混合物)、林格氏液、葡萄糖、水、无菌水、甘油、乙醇以及它们的组合。可以方便地利用1，3-丁二醇和无菌脂肪油作为溶剂或悬浮介质。任何温和的脂肪油均可利用，包括合成的甘油单酸或二酸酯。脂肪酸如油酸也可用于可注射制剂的制备。
短语“治疗有效量”此中用来指足够减少至少15％，优选至少50％，更优选至少90％，而最优选阻止在活性、功能和宿主的反应方面的临床重要缺陷的量。或者，治疗有效量是足够引起宿主临床重要条件改善的量。
用于给药的病毒剂量可作为多种参数的一种函数来调节，特别是作为所考虑的给药位点(肿瘤)、注射次数、所表达基因或预期的治疗时间的函数来调整。大体上，配制本发明的重组腺病毒并以在104和1014pfu之间，优选106至1011pfu的剂量形式施予。术语pfu(噬斑形成单位)相当于病毒溶液的感染性，其是通过感染合适的细胞培养物并测定通常15天后感染细胞的噬斑数来确定。用于测定病毒溶液pfu滴度的技术在文献中有详细报道。
在一优选的实施方案中，组合物包括浓度大约1×109pfu/100ul的含有抗血管生成因子基因，例如，ATF基因(AdATF)或制管张素(AdK3)的腺病毒。
根据本发明的组合物对于向肿瘤给药非常有用。
肿瘤。本发明是针对肿瘤特别是实体瘤的治疗。根据本发明可以治疗的实体瘤的例子包括肉瘤和癌，例如但并不限于：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、Ewing瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管源性癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、Wilms癌、宫颈癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、以及视网膜母细胞瘤。
在另一实施方案中，在如那些在宫颈、食管和肺中的上皮组织中治疗或预防增生不良性变化(例如化生和发育不良)。因此，本发明提供用于已知或可疑进展为瘤或癌的状态的治疗，特别是已发生由增生、化生或者最特别是增生不良组成的非增生细胞生长的部位(对于此类异常生长状况的综述，见Robbins和Angell，1976，基础病理学(BasicPathology)，第二版，W.B.Saunders公司，费城，68-79页)。
增生是一种受控的细胞增殖形式，涉及组织或器官中细胞数目的增加，而在结构或功能上却无明显改变。作为一个例子，子宫内膜增生通常进展为子宫内膜癌。化生是一种受控细胞生长的形式，其中一种类型的成熟或完全分化细胞置换另一种类型的成熟细胞。化生可以发生在上皮或结缔组织细胞中。不典型化生包括略微异常化生的上皮。增生不良常常是肿瘤的前兆，并且主要发生在上皮；其为非肿瘤细胞生长的最主要的异常形式，包括个体细胞一致性以及细胞结构定位的丧失。增生不良细胞通常具有异常大的、深染的核，并表现出多形性。增生不良典型地发生在存在慢性刺激或炎症的部位，且通常出现在宫颈、呼吸道、口腔和胆囊中。此类异常的综述见Fishman等，1985，医学(Medicine)，第2版，J.B. Lippincott公司，费城。
本发明还涉及通过向不适当生长的组织给予治疗有效剂量的本发明载体，对非恶性肿瘤以及其它涉及通过血管生成而扩大的不适当细胞或组织生长的异常进行治疗。例如，考虑本发明对于动静脉畸形的治疗是有用的，特别是在颅内位置中的。本发明还可以用于治疗银屑病，一种以炎症和血管增生为特征的皮肤疾病；以及良性前列腺增生，一种同炎症和可能的血管增生相关的疾病。也考虑其它高度增殖性疾病的治疗。
给药方法。根据本发明，对肿瘤的优选给药途径为直接注射入肿瘤。例如，可以用任何本领域可用的技术显示肿瘤，如磁共振成象或计算机辅助断层摄影，并通过立体定位注射给予该治疗组合物。
或者，如果通过一特殊抗原鉴定了肿瘤靶，则本发明的载体可以靶向于如上所述的抗原，并系统地或亚系统地适当施予，例如，静脉内、动脉内、腹膜内、心室内等。
联合治疗。虽然本发明的方法在抑制肿瘤生长和转移中是有效的，但本发明的载体和方法可有利地同其它治疗形式一同使用，包括但并不限于外科、辐射、化疗以及其它基因治疗。
例如，本发明的载体可以同具有收缩血管活性并减少肿瘤血流的一氧化氮抑制剂联合给予。
在另一实施方案中，本发明的载体可以同化疗药一起给药，例如但并不限于紫杉醇、泰索帝(taxotere)以及其它紫杉类化合物〔例如，如在美国专利4,857,653；4,814,470；4,924,011；5,290,957；5,292,921；5,438,072；5,587,493号中；欧洲专利0 253 738号中；以及国际专利公开号WO91/17976，WO93/00928，WO93/00929，和WO96/01815中公布的〕，或者其它化疗药，例如顺铂(和其它铂嵌合化合物)、依托泊甙和磷酸依托泊甙、博来霉素、丝裂霉素C、CCNU、阿霉素、柔红霉素、伊达比星、异环磷酰胺以及诸如此类。
在另一实施方案中，如上所述本发明的载体可以联合其它肿瘤基因疗法施予，例如但决不限于p53或其类似物如CTS-1〔WO97/04092〕、胸苷激酶(TK)、抗RAS单链抗体、α干扰素或γ干扰素等等。用于基因治疗的任何载体均可联合本发明使用，例如一种病毒载体或裸DNA。在一优选的实施方案中，单一一种载体(病毒或DNA)用来转移编码抗血管生成因子的基因和另一肿瘤治疗基因。
在另一方面，本发明在异源基因编码一靶向标志或提高宿主免疫系统机制对肿瘤细胞靶向的免疫调节性细胞因子时，提供抗血管生成因子基因的调节表达，使其同用于增殖性异常如肿瘤和癌的治疗中有用蛋白的表达一致。此类免疫调节分子(或免疫效应剂)的异源性基因的例子包括，但并不限于，α干扰素、γ干扰素、β干扰素、ω干扰素、τ干扰素、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、白介素2、白介素7、白介素12、白介素15、B7-1 T细胞共刺激分子、B7-2 T细胞共刺激分子、免疫细胞粘附分子(ICAM)-1 T细胞共刺激分子、粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、及它们的联合。
参考下面的实施例将更好地理解本发明，提供这些实施例以求举例说明而并非限制本发明。
实施例1：利用ATF的基因治疗抑制肿瘤生长和转移
实施例1表明uPA/uPAR拮抗剂ATF(尿激酶氨基末端片段)的表达抑制肿瘤生长和转移。构建了一由CMV启动子表达小鼠ATF的缺陷型腺病毒(AdmATF)。在两个不同的小鼠模型中AdmATF的单次肿瘤内注射抑制已建立肿瘤的生长，并延迟了肿瘤的播散。这些效应同在注射部位内及其紧密邻近处新生血管化的显著抑制相关。该效应的强度在小鼠ATF抑制人源肿瘤血管生成的能力中非常显著。
                         方法
重组腺病毒。AdmATF为一种由CMV启动子表达小鼠ATF基因的E1缺陷型重组腺病毒。利用质粒pDB1519 16作为起始材料来在成熟uPA的残基135后引入一终止密码子。简单地讲，分离了uPA编码序列(包括其信号肽)，用NsiI酶切，并将跟随有一终止密码子的残基128至135作为一合成片段再次引入。然后将ATF开放阅读框插在CMV启动子和SV40晚期多聚腺苷酸信号序列之间，产生质粒pEM8-mATF。该质粒除了将ATF表达编码框插在位点382和3446之间代替E1基因外，还带有Ad5基因组的前6.3kb(图1A)。在293细胞中通过在pEM8-mATF和ClaI酶切的AdRSVbGal DNA之间的同源重组构建AdmATF 25。在生长于软琼脂中的293来源的细胞单层上分离单个病毒噬斑，在新鲜293细胞上扩增并抽提病毒DNA(26)。EcoRI、EcoRV和AvrII+NdeI限制性酶切分析证实重组腺病毒的同一性和克隆性。AdCO1为一缺陷型对照腺病毒，其除不携带任何转基因表达编码框代替E1外同AdmATF是相同的。两种病毒均在组成性表达Ad5 E1基因的一种人胚肾细胞系293中放大(27)。按已描述方法制备病毒原种并测定滴度(25)。除非另外说明，以300PFU/细胞的感染复数(MOI)感染MDA-MB-231细胞和刘易斯肺癌(LLC)细胞。以前已表明当使用病毒AdRSVbGal(25)时，这些感染条件分别翻译为80和65％的b-半乳糖苷酶表达细胞。
RNA印迹分析。用AdmATF或AdCO1感染中度汇合的MDA-MB-231细胞，并在感染后(p.i.)24hr通过RNAZOL步骤(Biogentex公司)抽提总RNA，并且纯化多聚腺苷酸化的RNA。将样品在1％的甲醛琼脂糖凝胶中电泳，并转移至Hybond N膜(Amersham)上。在10ml 50％去离子甲酰胺、0.2％SDS、5×Denhardt液中将膜用变性的超声处理的鲑鱼精DNA(100ug/ml)于42℃预杂交1hr，并同一由小鼠uPA cDNA用随机引物(32P)标记的1.2kb XbaI-HindIII片段孵育过夜(16)。将膜在2×SSC/0.1％SDS中于50℃ 1hr洗两次，于0.1×SSC中30min洗一次，并于室温用柯达XAR-5底片曝光1hr。
蛋白质印迹分析。收集感染后24hr的病毒感染细胞的上清，在转移至一硝酸纤维素膜上之前，于一12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳(每个泳道400ug蛋白)(Schleicher & Schuell)。在封闭缓冲液中孵育1hr后，将膜用一抗小鼠uPA的多克隆抗血清孵育1hr(Pr.RLijnen，Leuven，比利时)，随后用一辣根过氧化物酶连接的山羊抗兔血清(Dako)再孵育1hr。将膜在PBS-Tween缓冲液中洗3次，并同3-氨基-9-乙基-咔唑(AEC)孵育5min。
细胞结合蛋白水解的抑制。首先通过将LLC细胞单层在甘氨酸-HCl(pH3)中酸化3min，使天然的uPA从其细胞表面受体上脱离，随后在0.5M HEPES缓冲液中孵育。然后将细胞同AdCO1-和AdmATF-感染293细胞的上清于37℃孵育20min。在PBS/0.1％BSA中洗涤3次后，将细胞同1nM的小鼠uPA(Pr.R Lijnen，Leuven，比利时)于37℃孵育20min。然后通过在PBS中洗涤去除未结合的uPA，并通过加入0.4uM的人纤溶酶原和纤溶酶底物S-2251(Kabi Vitrum，瑞典)对细胞结合的uPA定量。
体外侵入试验。注射后24hr，用1mM EDTA解离LLC细胞，PBS中洗涤，并重悬于补有0.1％BSA的无FCS DMEM培养基中。按照已描述的方法在一Transwell单元中进行侵入试验(19)。简言之，用160ugMatrigel(Becton Dickinson)包被1.2um孔径的多聚碳酸酯滤膜(Transwell，Costar)，并干燥。将Transwell单元的底层盒充满含10ng/ml EGF的人成纤维细胞条件培养液，并在上层盒中接种3×105感染细胞。37℃孵育24hr后，吉姆萨染色后在一光学显微镜下确定到达下层盒中的细胞数。
同系肿瘤模型。将刘易斯肺癌在C57BL/6同系小鼠中顺序传代。简言之，在肿瘤达到600-1200mm3的体积时，将皮下植入一LLC肿瘤的C57BL/6处死。在用一棉花筛滤过后将肿瘤细胞重悬在0.9％盐溶液中，并将2×106细胞(0.5ml)皮下植入6-7周龄C57BL/6雌性小鼠的背部。5天后，肿瘤达到大约20mm3的大小，向它们注射0.2ml PBS(n-8)、或109PFU(0.2ml)的AdCO1(n＝10)或AdmATF(n＝10)。在注射后第5、10和15天测定原发肿瘤的大小。在注射后第16天，腹膜内注射65mg BrdU后3hr评价肺转移癌的数量。取出肺组织，在乙酰甲醛酸(AFA)中固定过夜，并将石蜡切片在4N HCl中孵育15min，通过在PBS/0.5％BSA/0.1％Tween20中洗两次15min中和并饱和，随后于37℃同过氧化物酶标记的小鼠抗BrdU单克隆抗体(Boehringer)孵育45min，并同AEC孵育。在一光学显微镜下以25倍放大计数BrdU阳性灶。
无胸腺小鼠模型。将培养的MDA-MB-231细胞(ATCC HTB 26)收集、洗涤、以1.5×107细胞/ml重悬在PBS中，并将3×106细胞皮下注入6-7周龄裸鼠的背部。当肿瘤达到15-20mm3体积时(即11天后)，动物接受一次肿瘤内注射109PFU的AdmATF(n＝5)或AdCO1(n＝5)，或者PBS(n＝5)，监测肿瘤的大小直至注射后52天，其后处死动物并按照已描述的方法评价肿瘤内血管化的程度(28)。简言之，将肿瘤组织在AFA中固定过夜，转移至100％乙醇，石蜡包埋并制备5um厚切片。甲苯处理和再水化后，将切片于37℃用2ug/ml蛋白酶K浸透15min。用0.3％H2O2淬灭内源性过氧化物酶活性15min。将切片用PBS洗涤，在7.5％BSA中孵育15min，并用一抗人vWF的兔多克隆血清(Dako)孵育30min。在PBS中洗涤两次后，将切片用生物素化山羊抗兔IgG抗体孵育30min，洗涤并在加入AEC前用链亲和素-过氧化物酶孵育15min。首先以低放大倍数鉴定新生血管热点并对vWF阳性微血管定量。按照已述方法用Meyer苏木素复染(28)。
为了评价在肿瘤上AdmATF的感染，首先用AdmATF或AdCO1以50PFU/细胞的MOI感染汇合的MDA-MB-231细胞。感染后24hr洗涤细胞，重悬于120ul PBS中，用80ul冰冷的Matrigel固定，并将1.3×106细胞皮下植入裸鼠的背部。跟踪肿瘤的建立和生长直至植入后第51天。
结果
AdmATF的分子和功能鉴定。AdmATF为一种由CMV启动子表达小鼠ATF的缺陷型重组腺病毒，而AdCO1为一“空”对照腺病毒(图1A)。考虑其感染后表达功能性uPA拮抗剂的能力，首先进行体外研究来鉴定AdmATF。通过对由AdmATF感染24hr的MDA-MB-231细胞抽提的poly(A+)RNA的RNA印迹分析证实了ATF基因的表达，但在AdCO1则没有(图1B)。在293、LLC和MDA-MB-231细胞中均通过蛋白质印迹分析证实了AdmATF感染细胞的ATF分泌。例如，仅在来自AdmATF感染后24hr的293细胞的培养基中检测到与成熟肽(15.3kDa)分子量相应的ATF特异性多肽(图1C)。
ATF为一种有效的uPA拮抗剂，其结合至其细胞表面受体(uPAR)，而且已知该复合物的破坏大大抑制无活性的纤溶酶原向纤溶酶的转变。因此测定LLC细胞相关纤溶酶转变来评价由AdmATF感染细胞分泌的ATF的功能性。作为一前提条件，我们检测到LLC细胞表现出显著水平的细胞相关uPA活性(资料未示)，表明它们分泌uPA并表达uPAR。在同AdmATF感染293细胞上清孵育并加入1nM小鼠uPA前，通过一种温和酸处理预先从细胞表面清除内源性uPA，纤溶酶转变/活性显著降低(图2A)。
uPA/uPAR复合物对于细胞运动性也是关键的。利用一体外细胞侵入试验证实AdmATF的功能性。将LLC细胞用AdmATF或AdCO1感染，并在24hr后确定迁移通过一基质包被膜的细胞的数量(图2B)。资料的定量证明同AdCO1对照感染相比，AdmATF感染抑制65％的LLC侵入性(n＝5)。
AdmATF的肿瘤内注射抑制肿瘤生长和播散。我们首先利用刘易斯肺癌-C57BL/6同系模型来评价同AdmATF的单次肿瘤内给予相关的抗肿瘤效应。皮下植入5天后，向肿瘤注射109PFU的AdmATF、109PFU的AdCO1或PBS，并监测肿瘤的生长直至注射后15天。如在图3中所示，在AdmATF处理组中特异性观察到总体抑制。然后在注射后第16天处死动物，并通过计数BrdU阳性灶对肺转移计数。虽然在注射PBS的所有动物(n＝8)中转移均很明显，但在AdCO1和AdmATF处理组中在分别为9只中7只和9只中仅3只计数阳性。同AdCO1处理(6.3)和PBS处理组(6.6)相比，在AdmATF处理组中每张肺切片BrdU阳性灶的平均数也减少(2.7)。因而，AdmATF的单次肿瘤内给予显著抑制肿瘤生长以及在此高度进展模型中的肺转移。在另一独立的实验中，用AdCO1或AdmATF感染荷瘤动物，并在感染后第10和20天取出肿瘤进行放大观察。AdCO1注射的肿瘤在两个时间点均表现出强烈的血管化，而来自AdmATF处理组的肿瘤仅表现出边缘的血管化(图4)。
AdmATF的抗肿瘤效应发挥在血管生成水平。为了特异地评价肿瘤生长血管生成的唯一抑制，我们研究了腺病毒介导的小鼠uPA/uPAR拮抗剂向植入无胸腺小鼠中的人来源MDA-MB-231乳腺癌模型中的投送。由于小鼠uPA结合人uPAR比对小鼠uPAR效率低200倍，因此在此模型中小鼠ATF在肿瘤细胞上的直接作用应很小。皮下肿瘤细胞接种后11天，动物接受单次109PFU的AdmATF、109PFU的AdCO1或PBS的肿瘤内注射，并监测肿瘤的生长直至注射后52天。虽然直至注射后32天未出现显著效应，此后在AdmATF注射组而非AdCO1注射组中出现明显肿瘤生长停滞(图5)。在注射后第52天处死小鼠，并通过冯威利布兰德因子(vWF)免疫反应性血管的可视化评价肿瘤内血管生成(图6A)。同来自AdCO1注射肿瘤的切片中的18到20个相比，在来自AdmATF处理肿瘤的切片中检测到平均4到6个血管。同对应的AdCO1处理组相比，AdmATF注射肿瘤还几乎未表现出周围新血管化(图6B)。当在有Matrigel存在下于皮下接种前首先体外感染MDA-MB-231细胞时，AdCO1处理组中早在植入后7天肿瘤变明显。同在来自AdCO1处理组的5只动物中的4只中存在大的肿瘤鲜明对照，在AdmATF处理组(n＝5)中仅一个动物中出现一有限大小的肿瘤。而且，AdmATF感染的肿瘤细胞接种后所发展的肿瘤比那些AdCO1感染细胞接种后发展的肿瘤较低血管化(资料未示)。
                           讨论
我们已研究了同尿激酶氨基末端非催化性片段(ATF)(一种结合至其在肿瘤(19，20)和内皮细胞(22，23)表面上的受体(uPAR)的尿激酶有效拮抗剂)的局部投送相关的抗肿瘤效应。通过一种由CMV启动子表达小鼠来源的分泌性ATF分子的缺陷型腺病毒(AdmATF)的肿瘤内施予实现了体内ATF的投送。为排除继病毒感染后的非特异性细胞毒效应(29)，在本研究中一“空的”其它同基因腺病毒(AdCO1)用作对照病毒。这是一重要的对照也因为重组腺病毒可以利用aVb3整联蛋白来感染(30)，其为一种以某种方式参与肿瘤生长和血管生成的细胞表面受体(31)。
AdmATF的单次肿瘤内注射在减少肿瘤生长(图3)和在侵袭性LLC-C57BL/6同系小鼠模型中推迟肺转移上是有效的。小鼠ATF明显通过抑制肿瘤细胞本身的侵入部分发挥这些效应(图2B)，这一结果同AdmATF感染后细胞相关蛋白水解的抑制相一致(图2A)。ATF为基础的拮抗剂也是有效的内皮细胞运动抑制剂(22，23)，表明肿瘤血管生成的抑制可能也对在此模型中观察到的效应起作用。事实上，同AdCO1注射的对照肿瘤相比，AdmATF注射的LLC肿瘤表现出极小的血管化(图4)。特异性的AdmATF介导的肿瘤生长抑制在注射后晚些时候变明显，但在早些时候却并非如此，这可能是小肿瘤(典型地小于300mm3，见图3和图5)对新血管化来提供生长营养的要求较小的结果(综述见24)。
由于同AdCO1处理组的存活率(低于25天)相比AdmATF处理组的存活率仅有稍微延长(肿瘤移植后低于30天)，所以LLC细胞向肺播散的抑制仅仅是短暂的。AdmATF注射对肿瘤细胞播散的效应可以解释为由于在AdmATF感染后肿瘤细胞冻结，和/或由于很少血管可以提供用于进入血管系。播散最终出现表明一些肿瘤细胞在AdmATF注射时可能已经到达血管系。另外，E1缺失腺病毒的感染也典型地同在对转基因产物免疫耐受的C57BL/6小鼠中被感染细胞的快速清除相关(29)，而且ATF是一种在体内表现出很短半衰期的小分子。
临床前资料表明uPA/uPAR复合物密切参与控制细胞迁移，包括内皮细胞的迁移。例如，一种具有延长的体内半衰期的ATF-IgG融合蛋白在一富含bFGF的Matrigel小鼠模型中已经表现出抑制新血管和肿瘤的生长(23)。本研究提供uPA/uPAR拮抗剂基本上通过控制肿瘤内和周围血管生成发挥抗肿瘤作用的证据：由于在同系肿瘤模型中肿瘤和内皮细胞均是潜在的靶，所以AdmATF介导基因转移的抗瘤效应可能是多因素的，而由于mATF是在包括MDA-MB-231的人细胞表面uPA/uPAR复合物形成的弱拮抗剂，所以在MDA-MB-231/无胸腺小鼠模型中却并非如此(32)。在MDA-MB-231模型中表现出的显著特征是AdmATF在阻止肿瘤生长以及在肿瘤内和附近的新血管化中的效率(图6)。相反，对照腺病毒感染的肿瘤仍然能够“吸引”邻近的血管。在此模型中通过感染后肿瘤建立效率的降低进一步证实了AdmATF的抗肿瘤特性。
恶性肿瘤由于它们侵入并破坏远处位点上致命器官的功能因而是威胁生命的，这强调了针对新血管化来对抗肿瘤的重要性(33；还见34)。首先，原发肿瘤的生长依赖于新血管化来提供所需的营养。第二，据报道缺少新血管化时转移癌发生凋亡(35)。此外，在肿瘤内生长中的毛细血管是“漏的”：它们表现出分段的基底膜(36)，这是肿瘤细胞有效穿透进入血管系的前提条件(37)。本研究的总的结果证明通过单次肿瘤内给予一种表达细胞表面uPA/uPAR功能强拮抗剂的重组腺病毒可以实现显著的抗肿瘤作用，并且这些效应大部分是血管生成抑制的结果。由于在抑制肿瘤血管生成后预期的多效性临床效应，所以侵入性实体瘤应用此方法对于肿瘤基因治疗当然是吸引人的。
         实施例2：体内制管张素基因治疗抑制肿瘤
实施例2证明人纤溶酶原氨基末端片段(制管张素K3)的表达在体内通过同有丝分裂阻滞相关的阻断内皮细胞增殖来抑制肿瘤生长。已经在2个异种移植小鼠模型中研究了人纤溶酶原N末端片段(制管张素K3)局部投送后的抗肿瘤效应。通过一种由CMV启动子表达可分泌制管张素K3分子的缺陷型腺病毒(AdK3)实现制管张素转移。在体外研究中，AdK3选择性抑制内皮细胞增殖并干扰M期启动因子诱导的G2/M转换。AdK3感染的内皮细胞表现出明显的同M期磷酸蛋白的下调相关的有丝分裂阻滞。向生长在无胸腺小鼠中预先建立的大鼠C6神经胶质瘤或人MDA-MB-231乳腺癌中单次肿瘤内注射AdK3后出现显著的肿瘤生长阻滞，其同肿瘤内和其邻近处新血管化的抑制有关。同对照腺病毒相比，AdK3治疗还诱导凋亡肿瘤细胞增加10倍。资料支持这样一个概念：由于抗血管生成蛋白的大丸注射仍存在未解决的药理学问题，所以利用腺病毒介导的基因转移进行靶向性抗血管生成代表一种投送血管生成因子的有希望的策略。
                         方法
AdK3的构建。AdK3为一种E1缺陷的重组腺病毒，其由CMV启动子表达人纤溶酶原的N末端片段(直到残基333)。人Plg cDNA获自质粒PG5NM119。首先将编码Plg的18个氨基酸的信号肽和其后的成熟Plg的前326个残基的片段亚克隆至质粒pXL2675的BamHI和ScaI位点之间。然后在插入CMV启动子和SV40晚期多聚腺苷酸信号间之前，加入一其后带有终止密码子的编码残基327至333的合成寡脱氧核苷酸。然后将该表达盒插入到质粒pCO5的EcoRV和BamHI位点之间，产生质粒pCO5-K3。在293细胞中通过pCO5-K3和ClaI酶切的AdRSVβGal DNA之间的同源重组构建AdK3〔25〕。按照所描述的方法在293来源的单细胞层上分离各噬斑，在新鲜293细胞上扩增并制备病毒原种〔25〕。AdCO1为一种除不携带任何表达盒外同AdK3相同的对照病毒。
细胞维持和感染。将C6神经胶质瘤细胞(ATCC CCL-107)和MDA-MB-231细胞(ATCC HTB 26)培养于含10％胎牛血清(FCS)的DMEM中。含5％FCS下进行病毒感染。在补充有20％FCS、1mM L-谷胺酰胺、1ug/ml氢化可的松、10ng/ml表皮生长因子的MCDB 131中培养人微毛细血管内皮细胞(HMEC-1)〔49〕，并在含有10％FCS和3ng/ml重组人bFGF(R&D系统)的相同培养基中进行感染。选择感染复数(MOI)以获得80％至100％的感染细胞，其通过病毒AdRSVβGal感染后X-GAL染色判断。
蛋白质印迹分析。用AdK3或AdCO1以300噬斑形成单位(PFU)/细胞的MOI感染亚汇合细胞。感染后(p.i.)48至96hr，收集细胞培养上清。为了体内K3制管张素分子的免疫学分析，在感染后10天收集肿瘤，液氮中冻结，研磨成粉，用裂解缓冲液(10mM NEM、1％TritonX100、1mM PMSF、0.1M NH4OH)抽提并在4℃以12000rpm离心。在转移至一硝酸纤维素膜(Schleicher & Schuell)上前，将含300ug蛋白质的样品在一10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳。电泳100ng人Plg(Stago)作为对照。在封闭缓冲液(TBS-5％牛奶-0.05％Tween20)中孵育2hr后，将膜同抗人Plg Mab A1D12孵育1hr〔50〕。同辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠血清(Biosys)孵育1hr。洗涤后，将膜用ECL生物发光试剂盒(Amersham，UK)检测。为检测MPM-2磷酸表位，感染后96hr从HMEC-1细胞制备抽提物并用特定的有丝分裂MPM-2 MAb(DAKO)检测。
增殖试验。用AdK3或AdCO1以所示的MOI感染肿瘤或HMEC-1细胞12hr。用1mM EDTA收集细胞，以PBS洗2次并重悬。将它们接种于96孔培养板(500细胞/孔)中，并培养72hr。另外，将HMEC-1细胞培养于含有40、20或10％AdK3或AdCO1转导的C6神经胶质瘤细胞上清的MCDB131培养基中。在感染后96hr收集病毒感染C6细胞的上清，于56℃加热30分钟以灭活病毒，浓缩10倍并以PBS透析。以一种利用MTS四唑鎓复合物的细胞增殖检测试剂盒(Promega)定量细胞。
在一纤维蛋白基质模型中毛细血管的形成。根据Pepper等〔51〕的方法利用AdK3或AdCO1以600的MOI感染12hr的牛肺动脉内皮细胞(CPAE)(ATCC CCL209)制备此模型。
全血裂解试验。通过混合80U/ml组织纤溶酶原激活物、250ul AdK3或AdCO1感染后4天所获的培养上清、以及500ul取自健康供者的经枸橼酸盐抗凝的全血进行全血凝块裂解。通过加入1U/ml的凝血酶和12mM Ca2+引发凝结。按照所述的方法，通过裂解时间以及可溶性D-二聚体的动力学判定凝块的裂解程度〔52〕。
免疫流式细胞术。将HMEC-1用AdK3或AdCO1以300PFU/细胞的MOI感染96hr。按照所描述的方法〔53〕在同有丝分裂MPM-2抗体孵育前，收集细胞，用triton X100通透，在室温同碘化丙锭(20ug/ml)和核糖核酸酶A(100ug/ml)孵育30min来标记DNA。将FITC联接的抗小鼠IgG抗体用于检测MPM-2磷酸表位。在一Coulter EPICS Profile II流式细胞仪中进行实验并通过Multicycle软件(Phoenix FlowSystems，圣迭哥，美国)分析资料。
无胸腺小鼠模型。将培养的C6神经胶质瘤细胞和MDA-MB0231细胞收获、洗涤、分别以1.5×107和0.25×107细胞/ml重悬于PBS中并将200ul皮下注射于6-7周龄裸鼠的背部。当肿瘤达到20mm3时，动物接受一次肿瘤内注射109PFU的AdK3(n＝6)、或AdCO1(n＝6)、或者PBS(n＝6)。对于C6神经胶质瘤模型监测肿瘤大小直至注射后第10天，而对于MDA-MB-231模型则至注射后第42天。
为评价AdK3感染在肿瘤建立和进展上的效应，将MDA-MB-231和C6细胞在皮下接种于裸鼠背部(n＝6)前分别以50和100PFU/细胞的MOI感染24hr。感染的MDA-MB-231细胞的致肿瘤性弱于感染的C6细胞，所以在皮下植入前(106MDA-MB-231或0.25×106C6细胞)必需将80ul冰冷的Matrigel(Becton Dickinson)加入到120ul PBS中。跟踪肿瘤建立和生长直到感染后第25天(MDA-MB-231)或第22天(C6)。
学生t检验用于统计学分析。
免疫组织化学。将肿瘤组织固定在乙醇福尔马林乙酸中，石蜡包埋并制备5um的切片。甲苯处理和再水化后，于一微波炉中将切片在10mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)中预处理3次5分钟，3％H2O2淬灭5分钟来清除内源性过氧化物酶活性，PBS中洗涤，然后同兔抗人冯威利布兰得因子(vWF；Dako，1∶200稀释)多克隆抗血清孵育60分钟。洗涤3次后，在加入3-氨基-9-乙基-咔唑前，将切片同生物素化的山羊抗兔IgG抗体孵育30分钟，洗涤，并同链亲和素-过氧化物酶孵育30分钟。Meyer苏木素用于复染。通过利用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP-生物素缺口末端标记方法(TUNEL)的试剂盒(BoehringerMannheim)检测切片中的凋亡细胞。增殖细胞核抗原(PCNA)染色步骤包括一种生物素化的小鼠抗PCNA抗体(Pharmingen，1∶100稀释)随后链亲和素过氧化物酶和底物显色。
                          结果
AdK3的分子特征。重组AdK3载有一CMV驱动的人Plg的N末端片段，其包括制管张素分子的前3个铰链结构域〔47〕，而AdCO1是一种不含任何表达盒的“同基因”对照腺病毒(图7A)。通过Mab A1D12免疫印迹证实了HMEC-1、C6和MDA-MB-231细胞AdK3感染后2-3天在培养基中K3分子的分泌，而在AdCO1感染后却未检测到信号(图7B)。分泌的免疫反应肽表现为具有36和38kDa分子量的一种二联体，最可能反映如对Plg所描述的在Asn289处不同程度N糖基化〔54，55〕。
AdK3的功能鉴定。同AdCO1感染细胞构成鲜明对比，AdK3转导HMEC-1导致在感染后第3天以一种剂量依赖方式抑制bFGF刺激的增殖反应：在50的MOI时抑制30％，在150的MOI时74％，以及在300的MOI时97％(P＜0.005)。AdK3并不影响MDA-MB-231和C6细胞的增殖(图8A)。为评价K3分子引起此效应的旁分泌潜能，将来自病毒感染C6神经胶质瘤细胞的无病毒培养基加至HMEC-1细胞中。如在图8A中所示，我们的确观察到了一剂量依赖性的C6细胞分泌的制管张素对HMEC-1细胞增殖的抑制(P＜0.001)。AdK3的加入还以平均降低55％的水平显著抑制CPAE细胞在纤维蛋白凝胶中毛细血管的形成(未示)。此外，tPA诱导的全血凝块溶解未被来自AdK3感染C6细胞培养上清的加入所抑制，D-二聚体的产生在头3个小时内基本上无变化(1200ng/ml对1150ng/ml)。
AdK3抑制内皮细胞的有丝分裂。为确定制管张素是否能够阻断HMEC-1的有丝分裂，用标记了Mab MPM-2-其结合至特异性在M期存在的磷酸化蛋白-的细胞同并行的DNA染色一起进行流式免疫细胞术。结果表明AdK3感染的HMEC-1细胞的有丝分裂相对AdCO1的感染降低82％：同AdCO1对照感染后的27％相比，AdK3感染后仅有5％在G2/M中的HMEC-1细胞MPM-2计数阳性(图8C)。由于MPM-2通常揭示至少16种表观分子量从40至大于200kDa的有丝分裂磷酸蛋白，所以为了检测MPM-2阳性蛋白，由HEMC-1抽提物进行蛋白质印迹分析。同来自未感染或AdCO1感染的HMEC-1细胞的对照抽提物相比，来自AdK3感染细胞的抽提物表现出一种显著降低水平的MPM-2反应性磷酸蛋白(图8B)。
AdK3抑制肿瘤生长。为诱导制管张素的局部分泌，将单剂109PFU的AdK3注射至生长在无胸腺小鼠中的20mm3预建立的人MDA-MB-231乳腺癌和大鼠C6神经胶质瘤中，并监测肿瘤生长。如在图9A中所示，来自AdK3注射组的C6肿瘤显著小于那些来自AdCO1或PBS对照组中的肿瘤：在注射后第10天，AdK3注射肿瘤已达到了278±14mm3的平均体积，而AdCO1和PBS注射的肿瘤分别为1403±142mm3或1583±259mm3(P＜0.05)。这种80％的抑制同制管张素免疫反应物质的检测相关(图7C)。如在图9B中所示，在MDA-MB-231肿瘤模型中在感染后第42天肿瘤生长有相似的抑制(85％)：AdK3处理的肿瘤为80±4mm3，而AdCO1注射的肿瘤为563±137mm3和PBS注射肿瘤为530±69mm3(P＜0.05)。
体内AdK3抑制血管生成并诱导肿瘤细胞凋亡。AdCO1感染的C6肿瘤出现比它们AdK3感染的对应肿瘤多得多的血管化(图10，图案A-B)。因而按照所描述的方法通过肿瘤切片的vWF免疫染色评价肿瘤内血管生成〔28〕。首先在低放大下定位vWF阳性热区，然后在200×放大下计数vWF阳性血管(图10，图案E-F)。结果显示同AdCO1注射的对照相比(14±4个；n＝5，p＜0.005)，在AdK3注射肿瘤中肿瘤内血管化显著降低(每个视野5±2个vWF阳性血管)。在PBS注射组中的肿瘤展现出相同数量的血管(14±3)，表明所用的感染条件并不干扰肿瘤血管生成。在放大镜水平，同AdCO1处理的对照相比，AdK3注射的C6肿瘤表现很少的周围新血管生成(图10，图案C-D)。在MDA-MB-231肿瘤切片中获得了相似的结果(对于AdK3为4.8±1.2个vWF免疫反应血管/视野，而AdCO1为15.6±3，p＝0.02)。
然后通过TUNEL方法用C6肿瘤标本原位定量肿瘤细胞凋亡(见方法)。结果表明感染后10天在AdK3注射的C6肿瘤中凋亡细胞显著增加(每个视野20±9个，而对照肿瘤为1-2个凋亡细胞，p＜0.001)(图10，图案G-H)。相反，如通过PCNA免疫染色所评价的，肿瘤细胞增殖率在三个动物组中没有不同(未示)。Ad-制管张素治疗诱导凋亡肿瘤细胞10倍的增加而不影响这些细胞的增殖，这同通过每日注射纯化的制管张素获得的结果相似。
AdK3抑制肿瘤发生。为确定是否肿瘤血管生成的抑制削弱肿瘤发生，在注射入裸鼠的背部前首先将MDA-MB-231和C6细胞感染24小时。5天后，AdCO1注射组的所有老鼠发展为平均大小为27.4±3.41mm3的高度血管化的C6肿瘤，而20％的AdK3感染组动物12天后仍然无肿瘤(图11)。其余的动物表现出几乎未血管化的很小的肿瘤(平均大小0.42±0.05mm3)。22天后，在AdK3组中观察到的肿瘤至少比AdCO1组的小5倍(n＝5，p＜0.005；图11)。用MDA-MB-231肿瘤模型获得了相似的观察(未示)。
                         讨论
制管张素已被表明是一种由原发肿瘤分泌的血管生成的病理生理抑制剂，其驱动转移癌进入一种休眠状态。因而评价制管张素在原发肿瘤上的治疗潜能是吸引人的。然而，因为制管张素从循环中被快速清除〔46〕，所以人制管张素的系统性和腹膜内大丸注射具有困难的药理学问题。的确需要纯化的制管张素以高剂量延长暴露来维持制管张素的细胞抑制性肿瘤内浓度〔46〕。还不清楚利用编码制管张素cDNA的重组病毒直接转导肿瘤和周围组织可能代表一种更有效的实现恒定的肿瘤内制管张素浓度的方法。腺病毒因为它们在增殖和非增殖细胞中均可以在治疗水平有效表达其转基因(综述见〔37〕)，所以在这样一种策略中是合适的载体，这允许靶向广大的范围产生制管张素。因此，构建了一种表达人Plg的N末端片段(氨基酸1-333)-包括其预活化肽和铰链结构区1至3-的缺陷型腺病毒(AdK3)。
特异性针对人Plg的Mab A1D12〔50〕的应用，首先证明了制管张素在AdK3感染细胞培养基中的有效分泌。在制管张素分子中包括N末端预活化肽并不影响其抗血管生成活性，因为AdK3而非AdCO1感染的内皮细胞体外表现出显著的、剂量依赖的增殖阻滞(图8A)。另外，MDA-MB-231或C6肿瘤细胞的增殖并未被AdK3感染所影响，这表明制管张素对内皮细胞的有限作用。AdK3感染肿瘤细胞的无病毒上清也抑制内皮细胞增殖，证明由转导的肿瘤细胞分泌的制管张素的旁分泌效应。
由于铰链结构域对于Plg结合至纤维蛋白和纤维蛋白降解是重要的，所以分析该疗法在血栓溶解、体内抗血栓形成的生理保护中的效应是关键的。分泌于培养基中的制管张素不能抑制tPA诱导的体外全血凝块溶解。虽然该实验还未排除体内在血栓溶解期间制管张素同Plg结合至纤维蛋白时的有害的竞争，但其表明可以以一远远低于废止体内纤溶酶原依赖的血栓溶解所需的浓度实现一种血管抑制效应。这可能也表明内皮细胞表达一种识别制管张素而非完整Plg的受体。
AdK3感染的内皮细胞的流式细胞术分析表明了MPM-2 MAb阳性有丝分裂群的完全消失〔56〕。免疫印迹分析揭示了同对照内皮细胞明显相反，与MPM-2 MAb有反应的M期磷酸蛋白在制管张素处理的内皮细胞中实际上下调了。这个观察结果对于确定制管张素废止内皮细胞增殖机制可能是有帮助的。我们还表明制管张素打乱由cdc2和其相关调节亚单位细胞周期蛋白B组成的M期启动因子(MPF)〔57〕诱导的G2/M转换。同MPM-2 MAb有反应的MPF磷酸化蛋白参与用于有效进展为有丝分裂所需细胞结构以及活性的主要改变。必需进一步研究在AdK3转导的内皮细胞中缺乏有活性MPF的原因。
在两个预建立的异种移植小鼠模型中表明AdK3而非AdCO1的单次肿瘤内注射显著抑制原发肿瘤的生长。这种对肿瘤生长的抑制效应同肿瘤内和其邻近的血管化明显降低(图10)以及在肿瘤抽提物中制管张素免疫反应物质的检出(图7C)密切相关。C6神经胶质瘤因其VEGF的过表达而是一种高度血管化的肿瘤〔58〕。有趣的是，AdK3转导的C6神经胶质瘤明显难以在肿瘤块内建立血管网络来支持快速和广泛的生长(图10)，而且这种障碍转化为高于80％的肿瘤生长抑制。肿瘤切片的vWF免疫染色也揭示了在AdK3处理的肿瘤中血管生成的显著减少：在对照C6肿瘤中经常观察到具有成熟内腔的形成较好的血管，而在AdK3处理的C6神经胶质瘤中则没有(图10)。这种在血管密度上的降低伴有肿瘤细胞凋亡10倍的增加，而肿瘤细胞增殖指数无明显改变，可能是因为(i)缺乏内皮细胞衍生的旁分泌因子，(ii)营养支持的减少，以及(iii)缺氧引发的肿瘤细胞p53依赖的凋亡〔59，60〕。在MDA-MB-231乳腺癌模型中，单次肿瘤内AdK3注射类似地诱导肿瘤血管生成和生长的显著抑制。
在本研究的过程中，如由AdK3感染细胞在植入后延迟发展为可见的肿瘤所反映的，AdK3转导的C6和MDA-MB-231细胞表现出较低的致肿瘤潜能。
已经表明利用重组腺病毒的制管张素治疗实验上为合理而有效的。投送一种以上血管抑制因子的可能性也可能协同阻滞肿瘤生长。还预期其同细胞毒方法联用可能对于改善恶性疾病的临床后果特别有效。
                       参考文献
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本发明并不限于此中所描述的特定实施方案的范围。实际上，除了那些此中所描述的外，本发明的各种修饰对那些本领域的技术人员将由前述的描述和所附的图而变得清楚。这些修饰应属于所附权利要求的范围。
进一步应该理解所提供核酸或多肽的所有碱基大小和氨基酸大小，以及所有的分子量或分子质量均是大约的，并且仅供用于描述。
此中引用的各种出版物，它们的公开内容以其整体并入作为参考。

Claims (7)

1.一种复制缺陷型腺病毒载体的用途，所述载体包括编码一种抗血管生成因子的DNA序列，该序列有效地同支持其在肿瘤细胞中表达的表达控制序列相连，其中抗血管生成因子包含尿激酶从氨基酸残基1至残基135的氨基酸序列的尿激酶氨基末端片段，条件是该抗血管生成因子不是全长尿激酶，所述载体用于制备用来抑制肿瘤生长的药物组合物。
2.权利要求1的用途，其中表达控制序列含有CMV启动子。
3.权利要求1的用途，其中腺病毒载体含有E1区的缺失。
4.一种复制缺陷型腺病毒载体，其含有与表达控制序列有效连接的编码抗血管生成因子的基因，其中抗血管生成因子含有尿激酶从氨基酸残基1至残基135的氨基酸序列的尿激酶之氨基末端片段，条件是该抗血管生成因子不是全长尿激酶。
5.权利要求4的载体，其中表达控制序列含有CMV启动子。
6.权利要求4的载体，其中腺病毒载体含有E1区的缺失。
7.一种药物组合物，其含有权利要求4的复制缺陷型腺病毒载体和一种药学可接受的载体。
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