CN110072593A - 适用于肾癌治疗的方法和药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种适用于肾癌治疗的方法和药物组合物。发明人表示，尽管Elabela激素(ELA)主要在肾中表达，但在人体人肾癌中表达降低。在异种移植物动物模型(皮下或子囊注射)中，Ela抑制肿瘤进展。尤其是，本发明涉及治疗有需求受试者肾癌的方法，包括向受试者施用ELA多肽或其编码核酸的治疗有效剂量，其中ELA多肽包含具有至少90％与SEQ ID NO:1(QRPVNLTMRRKLRKHNCLQRRCMPLHSRVPFP)相同的氨基酸序列，其中在位置9、10、20或21处的精氨酸残基(R)可选择性突变。

Description

适用于肾癌治疗的方法和药物组合物
技术领域
本发明涉及适用于肾癌治疗的方法和药物组合物。
背景技术
肾癌占所有实性肿瘤的比例约为3％。约85％的肾肿瘤归类为肾细胞癌(RenalCell Carcinoma,RCC)。大约80％确诊RCC起源于肾脏形成管道(肾小管)近端形成尿管的上皮细胞。根据其在显微镜下的外观，这种癌症类型被称为肾透明细胞癌(Renal Clear CellCarcinoma，RCCC,65％)或肾乳头状细胞癌(Renal Papillary Cell Carcinoma，RPCC,15％)。肾细胞癌(RCC)是美国第八大最常见的恶性肿瘤，预计2016年的新增病例为62,700例，死亡病例为14,240例。在过去十年中，由于对RCC的遗传和代谢基础有了更深的了解，从而开发出了治疗转移性RCC(metastatic RCC，mRCC)的数种靶向治疗方法。在转移性疾病中，连续使用以血管生成和/或雷帕霉素哺乳动物靶标(mammalian target of rapamycin，mTOR)抑制剂为靶点的络氨酸激酶抑制剂(Tyrosine Kinase Inhibitors，TKIs)可导致延长无进展生存期和40个月的整体生存期。尽管取得了这些进展，对这些药物的持久反应仍较为少见。因此，需要找到替代的治疗策略。Elabela(ELA)，也称Toddler或Apela，是一种肽类激素，最近被确定为APJ的第二个配体，即爱佩琳受体(apelin receptor)。作为32种氨基酸(amino-acids，aa)的前体，ELA也被发现为21氨基酸(aa)和11氨基酸(aa)。ELA在人类多功能干细胞和成人肾和前列腺中限制表达。
发明摘要：
本发明涉及适用于肾癌治疗的方法和药物组合物。尤其是，本发明由权利要求所定义。
发明内容
发明人表明，虽然Elabela(ELA)主要在肾中表达，但在人体肾癌中其表达会减少。在异种移植物动物模型(皮下或子囊注射)中，Ela会抑制肿瘤的进展。这些发现将Ela确定为新的肾脏肿瘤抑制基因。
因此，本发明的第一个目的涉及治疗有此新要求的受试者肾癌的方法，包括向受试者施用包含具有至少90％与SEQ ID NO：1(QRPVNLTMRRKLRKHNCLQRRCMPLHSRVPFP)相同的氨基酸序列的ELA多肽的治疗有效剂量，其中在位置9、10、20或21处的精氨酸残基(R)可选择性突变。
在本发明中，术语“肾癌”具有其在本领域中的一般含义，且指由肾引起的癌症。在一些实施例中，肾癌即肾细胞癌。本文所用术语“肾细胞癌”或“肾细胞肿瘤”(RCC)是指源自近曲小管内壁的癌症。更具体地说，RCC包括几种相对常见的组织学亚型：透明细胞肾细胞癌、乳头状细胞癌(易染细胞)、嫌色细胞癌、集合管癌和髓样癌。透明细胞肾细胞癌(clearcell renal cell carcinoma，ccRCC)是最常见的RCC亚型。
在本发明中，术语“治疗”是指预防或预防治疗以及疾病修正治疗，包括有感染疾病或怀疑感染疾病风险的患者以及正在病中或确诊患有疾病或病情的患者的治疗，以及包括临床复发的抑制。治疗可施用于患有医学病症或最终可能患该病症的受试者，以便预防、治愈、延迟发病、减轻或改善一种或多种病症或复发性病症，或为延长受试者存活期，使其超出在无该类治疗情况下的预期存活期。“治疗方案”系指一种疾病的治疗模式，例如：治疗期间所使用的剂量模式。治疗方案可能包括诱导方案和维持方案。“诱导方案”或“诱导期”系指用于疾病初始治疗的治疗方案(或治疗方案的一部分)。诱导方案的一般目标是在治疗方案的初始阶段向患者提供高剂量药物。诱导方案可采用(部分或全部)“加载方案”，其中所述加载方案可包括施用比医生在维持方案期间使用更大剂量的药物，也可以施用药物频率比医生在维护方案期间施用频率更高，或两者兼而有之。“维持方案”或“维持期”系指用于在疾病治疗期间患者维持的治疗方案(或治疗方案的一部分)，例如，使患者长期保持缓解一段时间(几个月或几年)。维持方案可采用持续治疗(例如，定期给药，数周、数月、数年等)或间歇性治疗(例如，中断治疗、间歇性治疗、复发时的治疗，或特定标准实现即时治疗[例如，疾病表现等])。
根据本发明，与第二氨基酸序列具有至少90％的同一性的第一氨基酸序列，即指第一序列具有与第二氨基酸序列90；91；92；93；94；95；96；97；98；99或100％的同一性。序列的同一性经常用百分比的同一性(或相似性或同源性)来衡量；百分比越高，则两个序列就越相似。用于比较的序列比对方法是本领域所熟知的。各种程序和比对算法在下述文章中描述：Smith和Waterman，《应用数学进展》，2：482,1981(Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.,2:482,1981)；Needleman和Wunsch，《分子生物学杂志》，48：443,1970(Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.,48:443,1970)；Pearson和Lipman，《美国国家科学院的会议记录》，85：2444,1988(Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:2444,1988)；Higgins和Sharp《基因》73：237-244,1988(Higgins and Sharp,Gene,73:237-244,1988)；Higgins和Sharp，CABIOS，5：151-153,1989(Higgins and Sharp,CABIOS,5:151-153,1989)；Corpet等人，《核酸研究》16:10881-10890,1988(Corpet et al.Nuc.AcidsRes.,16:10881-10890,1988)；Huang等人，《比较应用生物科学》,8:155-165,1992(Huanget al.,Comp.Appls Biosci.,8:155-165,1992)；和Pearson等人，《分子生物学方法》，24：307-31,1994(Pearson et al.,Meth.Mol.Biol.,24:307-31,1994)。Altschul等人，在《自然遗传学》，6：119-129,1994(Altschul et al.,Nat.Genet.,6:119-129,1994)中详细描述了序列比对方法和同源性计算。举例来说，可使用比对工具ALIGN(Myers和Miller，CABIOS4：11-17,1989)或LFASTA(Pearson和Lipman，1988)进行序列比较(Internet Pologram，W.R.Pearson和弗吉尼亚州大学，fasta20u63版本2.0u63，发布日期1996年12月)。ALIGN将整个序列相互比较，而LFASTA比较了局部相似性的区域。这些比对工具和其各自的教程，可在例如NCSA网站上在线获取。或者，为了比较大于30个左右氨基酸的氨基酸序列，可使用设置为默认参数的默认BLOSUM62矩阵，来采用Blast 2序列函数(缺口存在成本为11，每个残基缺口成本为1)。当比对短肽(少于30个氨基酸)时，应使用Blast 2序列函数进行比对，采用设置为默认参数的PAM30矩阵(开放缺口9，延伸缺口1罚分)。BLAST序列比较系统是可用的，例如，通过NCBI网站所获得的；另见Altschul等人，《分子生物学杂志》，215：403-410,1990(Altschul et al.,J.Mol.Biol.,215:403-410,1990)；Gish.&States，《自然遗传》,3:266-272,1993(Gish.&States,Nature Genet.,3:266-272,1993)；Madden等人，《酶学方法》266:131-141,1996(Madden et al.Meth.Enzymol.,266:131-141,1996)；Altschul等人，《核酸研究》，25:3389-3402,1997(Altschul et al.,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402,1997)；和Zhang&Madden，《基因组研究》，7：649-656,1997(Zhang&Madden,Genome Res.,7:649-656,1997)。
在本文中，术语“突变”具有其在本领域中的一般含义，且指取代、缺失或插入。术语“取代”是指去除在特定位置的特定氨基酸残基，将另一个氨基酸残基插入在相同的位置。术语“缺失”是指去除特定的氨基酸残基。术语“插入”是指在将一个或多个氨基酸残基插入在特定氨基酸残基之前或之后，更具体地说，一个或多个，优选一个或数个氨基酸残基与a-羧基结合或与特定氨基酸残基的a,-氨基结合。
在一些实施例中，在位置9、10、20或21处的精氨酸残基突变，被取代，使得pH＝7.4的侧链电荷被逆转(例如，从负电荷到正电荷)或者变为中性。在一些实施例中，重量和水疗指数保持在相同范围内。
在一些实施例中，在位置9、10、20或21处的精氨酸残基(R)被从由丙氨酸(A)和/或丝氨酸(S)组成的基团中选出的氨基酸残基所取代。
根据本发明，本发明的ELA多肽是通过常规自动肽合成方法或通过重组表达来产生。设计和制备蛋白的常规原理为本领域技术人员所熟知。本发明的ELA多肽可根据常规技术在溶液中或在固体载体上进行合成。市场可提供各种自动合成仪，该仪器可根据已知协议来使用，如Stewart和Young；Tam等人，1983；Merrifield，1986和Barany和Merrifield，Gross和Meienhofer，1979所描述的。本发明的ELA多肽也可通过采用示例性肽合成仪(例如Applied Biosystems Inc.的Model 433A)的固相技术来进行合成。通过自动肽合成或通过重组方法所产生的任何给定蛋白的纯度，都可使用反相HPLC分析来确定。可通过本领域技术人员所熟知的任何方法来确定每种肽的化学真实性。作为自动肽合成的替代方法，可使用重组DNA技术，其中对所选蛋白编码的核苷酸序列插入表达载体中，转化或转染到合适的宿主细胞中，并在适合下文所述表达的条件下进行培养。重组方法特别优选用于产生更长的多肽。可利用多种表达载体/宿主系统来包含和表达肽或蛋白编码序列。这些系统包括但不限于微生物，例如用重组噬菌体转化的细菌，质粒或粘粒DNA表达载体；菜农酵母表达载体转化的酵母(Giga-Hama等人,1999)；采用病毒表达载体感染的昆虫细胞系统(例如，杆状病毒，见Ghosh等人,2002)；采用病毒表达载体转染的植物细胞系统(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)或采用细菌表达载体转化的植物细胞系统(例如，Ti或pBR322质粒；参见例如Babe et al.,2000)；或动物细胞系统。本领域技术人员了解优化哺乳动物蛋白表达的各种技术，参见例如Kaufman，2000；Colosimo等人，2000。重组蛋白生产中有用的哺乳动物细胞包括但不限于VERO细胞，HeLa细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，COS细胞(如COS-7)、W138、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562和293细胞。用于细菌、酵母和其他无脊椎动物中肽底物或融合多肽重组表达的示例性协议是本领域技术人员所熟知的，下文将简要描述。用于重组蛋白表达的哺乳动物宿主系统也是本领域技术人员所熟知的。宿主细胞株可以被选择特定的能力来处理表达的蛋白或产生某些翻译后修饰，这将有助于提高蛋白质活性。多肽的这种修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。切割蛋白“前原”形式的翻译后处理，对于正确插入、折叠和/或功能也都很重要。诸如CHO、HeLa、MDCK、293、WI38等不同宿主细胞对于翻译后的活性也有特定的细胞机制和特征机制，可选择该类机制，确保引入外源蛋白的正确修饰和处理。
在一些实施例中，预期可对本发明治疗方法中使用的本发明ELA多肽进行修饰，以改善其治疗功效。治疗化合物的这种修饰可用于降低毒性、增加循环时间或改变生物分布。例如，通过与改变生物分布的多种药物载体相结合，可显著降低潜在重要治疗化合物的毒性。改善药物活力的策略是水溶性聚合物的使用。各种水溶性聚合物已显示可改变生物分布、改善细胞摄取模式，改变通过生理屏障的渗透性；改变从体内排出的速度。为了实现靶向效果或持续释放效果，已合成了水包含以药物基团为末端基团、骨架的一部分或聚合物链上的侧基的溶性聚合物。聚乙二醇(PEG)因其高度生物相容性和易于改性的特点，广泛用作为药物载体。与各种药物、蛋白质和脂质体附着显示可改善停留时间并降低毒性。PEG可通过链末端羟基和其他化学方法与活性剂偶联；但是，PEG本身限于每个分子至多两种活性剂。在不同方法中，曾探索将PEG和氨基酸的共聚物作为新的生物材料，其将保留PEG的生物相容性，但具有每分子许多附着点的附加优点(提供更大的药物负载)，且可通过合成方式设计以适应各种应用。
本发明的第二个目的涉及治疗有需求受试者肾癌的方法，包括给受试者施用适合对本发明ELA多肽进行编码的核酸分子的治疗有效量。
在本文中，术语“核酸分子”具有其在本领域中的一般含义，且指DNA或RNA分子。但是，该术语捕获包括任何已知DNA和RNA碱基类似物的序列，例如但不限于4-乙酰基胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮丙啶基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟基乙酸、氧丁氧嘧啶、假尿嘧啶、奎索因、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、-尿嘧啶-5-羟基乙酸甲酯r、尿嘧啶-5-羟基乙酸、假尿嘧啶、肌氨酸、2-硫胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。
在一些实施例中，本发明的核酸分子包含在合适载体中，例如：质粒、粘粒、附加体、人工染色体、噬菌体或病毒载体。因此，本发明另一个目的涉及包含对本发明ELA多肽核酸进行编码的载体。通常，载体是病毒载体，其为腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)、逆转录病毒、牛乳头瘤病毒、腺病毒载体、慢病毒载体、痘苗病毒、多瘤病毒或感染性病毒。在一些实施例中，载体是AAV载体。在本文中，术语“AAV载体”是指从腺相关病毒血清型衍生的载体，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9及其突变形式。AAV载体可以具有一个或多个全部或部分缺失的AAV野生型基因，优选rep和/或cap基因，但保留功能性旁侧ITR序列。因为逆转录病毒具备将基因整合到宿主基因组中的能力，从而转移大量的外来基因材料，感染广谱物种和细胞类型，并被包装在特殊细胞系中，因此逆转录病毒可被选为基因递送载体。为了构建逆转录病毒载体，将编码相关基因的核酸插入在某些病毒序列位置的病毒基因组中，以产生具有复制缺陷的病毒。为了产生病毒体，构建包含gag、pol和/或env基因但不含LTR和/或包装组分的包装细胞系。当将含有cDNA的重组质粒与逆转录病毒LTR和包装序列一起引入该细胞系时(例如：通过磷酸钙沉淀)，包装序列允许重组质粒的RNA转录包装到病毒颗粒中，随后分泌到培养基中。然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，选择性地浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染多种细胞类型。慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，还含有其他具有调节或结构功能的基因。较高的复杂性使病毒能够调节其生命周期，如在潜伏感染过程中。一些慢病毒实例包括人免疫缺陷病毒(HIV 1，HIV 2)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。慢病毒载体是通过HIV致病基因的多次减弱而产生的，例如，删除基因env、vif、vpr、vpu和nef，让载体具有生物学安全性。慢病毒载体是本领域已知的，例如美国6,013,516号专利和5,994,136号专利，两者都通过引用并入本文。通常，载体是基于质粒的或基于病毒的，均被配置为携带必要序列，以合并外来核酸，进行选择和将核酸转移到宿主细胞中。相关载体的gag，pol和env基因也是本领域已知的。因此，将相关基因克隆到所选载体中，然后用于转化目标靶细胞。能够感染非分裂细胞的重组慢病毒，在美国5,994,136号专利中被描述，通过引用并入本文，其中用两种或多种携带包装功能的载体转染合适的宿主细胞，即gag、pol和env，以及rev和tat。这描述了可以提供编码病毒gag和pol基因的核酸、以及另一种可以提供编码病毒env核酸的第一载体，以产生包装细胞。在包装细胞中引入提供异源基因的载体，产生释放携带目标靶外源基因的感染性病毒颗粒的生产细胞。env优选地为兼嗜性包膜蛋白，其允许人和其他物种细胞的转导。通常情况下，本发明的核酸分子或载体包括“控制序列”，其共同指启动子序列、多腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调节结构域、复制起点、内部核糖体进入位点(internal ribosome entry sites，“IRES”)、增强子等等，其共同提供受体细胞中编码序列的复制、转录和翻译。只要所选择的编码序列能够在合适的宿主细胞中被复制、转录和翻译，并非所有这些控制序列都需要始终存在。另一种核酸序列是“启动子”序列，其常规含义是指包含DNA调节序列的核苷酸区域，其中调节序列源自能够结合RNA聚合酶并启动下游(3'方向)编码序列转录的基因。转录启动子可以包括“诱导型启动子”(其中与启动子可操作链接的多核苷酸序列的表达，由分析物、辅因子、调节蛋白等诱导)、“可抑制的启动子”(其中与启动子可操作链接的多核苷酸序列的表达，由分析物、辅因子、调节蛋白等诱导)和“组成型启动子”。
“治疗有效剂量”是指ELA多肽或编码的核酸分子的足够量，以避免在适用于任何医疗治疗的合理利弊比的疾病(例如肾癌)治疗方法中使用。应理解的是，本发明的化合物和组合物的每日总用量，由主治医师在合理的医学判断范围内来决定。任何特定受试者的特定治疗有效剂量水平，将取决于多种因素，包括受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的给药时间、给药途径和所用特定化合物的排泄率；治疗的持续时间；与所用特定多肽组合或配合使用的药物；以及医学领域众所周知的因素。例如，本领域技术人员所熟知的，各级别的化合物起始剂量低于实现所需治疗效果所需剂量，逐渐增加剂量直至达到所需效果。但是，产品的每日剂量可在0.01至1,000mg/每成人/每天的大的范围内变化。优选地，组合物含有0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、250和500mg的活性成分，用于按症状对即将接受治疗的受试者的剂量进行调整。药物通常含有约0.01mg至约500mg的活性成分，优选1mg至约100mg的活性成分。通常以每天0.0002mg/kg至约20mg/kg体重的剂量水平提供有效量的药物，尤其是每天约0.001mg/kg至7mg/kg体重的剂量。
根据本发明，本发明的ELA多肽或核酸分子(插入或不插入载体中)以药物组合物的形式施用至受试者。通常，本发明的ELA多肽或核酸分子(插入或不插入载体中)可与药学上可接受的赋形剂和任选的缓释基质，例如可生物降解的聚合物，形成药物组合物。“药学上”或“药学上可接受”是指施用至哺乳动物，尤其是人体(如合适)时，没有产生不利、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体或赋形剂是指无毒的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或任何类型的制剂助剂。在用于口服、舌下、皮下、肌内、静脉内、透皮、局部或直肠给药的本发明的药物组合物中，单独的活性成分或与另一种有效成分组合，可以单位给药形式向动物和人体施用，作为与常规药物支持物的混合物。合适的单位给药形式包括片剂、凝胶胶囊、粉末、颗粒和口服悬浮液或溶液等口服途径形式，舌下和口腔给药形式，气溶胶、植入物、皮下、透皮、局部、腹膜内，肌肉内、静脉内、真皮下、经皮、鞘内和鼻内给药形式，和直肠给药形式。通常，药物组合物含有药学上可接收用于能被注射的制剂的载体。这些可以特别是等渗、无菌、盐溶液(磷酸二钠或磷酸二钠、氯化钠、钾、氯化钙或氯化镁等或这些盐类的混合物)，或干燥，尤其是冷冻干燥的组合物，其在无菌水或生理盐水情况下，添加时允许可注射溶液的构成。适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液；包括芝麻油，花生油或丙二醇水溶液的制剂；和用于无菌注射溶液或分散液临时制备的无菌粉末。在所有情况下，该形式必须是无菌的，并且必须是液体的，以便于注射。在制造和储存条件下必须稳定且应进行保护，避免微生物如细菌和真菌的污染作用。包含本发明化合物的溶液作为游离碱或药理学上可接受的盐可在与如羟丙基纤维素的表面活性剂适当混合的水中制备。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备分散剂。在常规储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。本发明的ELA多肽或核酸分子(插入或不插入载体)可以以中性或盐的形式形成组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质游离氨基形成)，且采用盐酸或磷酸等无机酸形成，或采用乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等有机酸形成。采用游离羧基形成的盐，可衍生自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁等无机碱，和异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等有机碱。载体也可以是含有水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，合适混合物和植物油的溶剂或分散介质。例如，可通过卵磷脂等涂层、在分散情况下保持所需粒度、以及使用表面活性剂等方式来保持适当的流动性。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，来防止微生物的作用。在诸多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在延长吸收试剂组成中使用而实现，例如：单硬脂酸铝和明胶。将所需容量活性化合物与含有上述所列几种其它成分(如有需要)的相应溶剂混合，随后进行过滤灭菌，以制备无菌可注射溶液。通常，将各种灭菌活性成分掺入无菌载体，以制备分散剂，其中所述无菌载体含有基础分散介质和上述列举的所需其他成分。如为用于无菌可注射溶液制备的无菌粉末，常规制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，两种技术都会产生活性成分加上已无菌过滤溶液中产生的额外所需成分的粉末。还考虑直接注射用较多或高浓度溶液的制备，其中设想DMSO用作溶剂，会导致极快速渗透，将高浓度的活性剂释放到小肿瘤区。配制后，溶液将采用与剂量配方相容的方式以及治疗有效剂量来施用。该制剂易采用多种剂型使用，例如：上述可注射溶液类型，但也可使用药物释放胶囊等。例如，在水溶液中进行肠胃外给药时，如有所需，溶液应适当缓冲，且液体稀释剂应首先用足够盐水或葡萄糖等渗。这些特定水溶液特别适用于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内给药。有鉴于此，根据本发明公开的内容，可以采用的无菌含水介质将会被本领域技术人员了解。根据接收治疗受试者的状况，剂量必然会发生一些变化。在任何情况下，负责给药人员确定个别受试者的适当剂量。
本发明的另一目的涉及一种诊断受试者肾癌的方法，包括以下步骤：
i)测量从所述受试者所得样本中Elabela激素(ELA)的表达水平；
ii)将步骤i)中实测表达与其预定参考值进行比较；
iii)得出结论：当Elabela激素(ELA)的表达水平低于其预定参考值时，受试者会患有胃癌，或当Elabela激素的表达水平高于预定参考值时，受试者没有患有肾癌。
本文中使用的术语“诊断”是指评估受试者是否患有胃癌。
通过以下附图和实施例进一步说明本发明。但是，这些实施例和附图不应采用任何限制本发明范围的方式进行解释。
附图说明
图1.人体肾癌中Elabela激素的减弱表达。实时PCR分析显示，与同一患者假正常组织相比，肾肿瘤组织中的Elabela激素向下调节。
图2.肾肿瘤细胞(Renca)中Elabela激素表达对皮下肿瘤恶化的影响。使用Elabela激素野生型(ela wt)、突变体(Ela mut)或对照慢病毒，在同系小鼠中接种前于Renca细胞中表达Ela wt，ela mut。
图3.肾肿瘤细胞(Renca)中Elabela激素表达对肾肿瘤恶化的影响。使用Elabela激素野生型(ela wt)或对照慢病毒，在同系小鼠中包膜下接种前于Renca细胞中表达elawt。
图4.ProEla处理。对其中两个切割位点R31/R32和R42/R43分别被S31/S32和S42/S43取代的野生型proEla 32肽和mut proEla 32进行合成，并于弗林蛋白酶(0.2×10-4U)中孵育4h。通过使用抗-Ela抗体的蛋白质印迹进行评估，弗林蛋白酶在相应生理学切割位点处理野生型proEla 32。采用弗林蛋白酶对这种肽进行孵育，仅产生Ela 11aa，这表明proEla 32在两个切割位点进行了有效的切割。用弗林蛋白酶孵育mut proEla 32未能产生任何产物。
图5.Ela、弗林蛋白酶和APJ在小鼠成体组织中的表达分析。从指定组织中提取总RNA，使用针对鼠Ela(A)、弗林蛋白酶(B)和APJ(C)的特异引物进行实时PCR分析。将每个样本中评估的管家基因的表达，在本文所述条件下用作内源对照。所示结果是3个实验的代表。为进行比较，指定肝脏(Ela和APJ)或肠(弗林蛋白酶)数值为1，具体取决于已分析基因表达的水平。数据是平均值±SD(每组n＝3)。
图6.肾癌患者中Ela、弗林蛋白酶和APJ的表达。从n＝7例患者的肾临床样本的肿瘤和周围非肿瘤组织中提取总RNA，使用特异引物对人体Ela、弗林蛋白酶和APJ进行实时PCR分析。将每个样本中评估的管家基因的表达，在本文所述条件下用作内源对照。图表显示了正常组织指定数值为1的指定转录物表达的倍数差异。注意，与正常对应物相比，肿瘤组织中Ela mRNA的表达减弱。
图7.野生型和mut proEla对肿瘤生长的抑制作用。采用空慢病毒载体(对照)或含有野生型或突变体proEla人构建体的相同载体，对肾脏Renca癌症细胞(缺乏Ela表达)稳定感染。利用实时PCR和人引物，在ARN水平上证实了细胞中人野生型和mut proEla的表达。使用鼠Ela引物进行比较(A)。以1×105密度的对照Renca细胞皮下接种三组雄性同源Balb/c小鼠，相同细胞表达野生型proEla 32或突变体proEla 32。在指定时期监测动物的肿瘤形成。注意由表达野生型proEla或mut ProEla的肿瘤细胞诱导的较小尺寸的肿瘤。与突变体pro Ela 32相比，野生型proEla 32更有效地抑制肿瘤生长。结果是采用Renca细胞进行2次实验的代表，其中Renca细胞采用指定慢病毒载体单独感染。数值是平均值±SEM(每组n＝6)。***P<0.001。
图8.RENCA(20,000个细胞，4个细胞/孔)细胞被置于96孔板中，采用IncuCyteZOOMTM活细胞成像系统(Essen BioScience，MI USA)进行增殖测定。该系统测量细胞密度。通常在2％胎牛血清中，在37℃温度条件下，于RPMI 1640培养基(Life Technologies)中繁殖细胞。定期筛选细胞的支原体(ATCC)。将板置于IncuCyte ZOOMTM装置中，每2小时记录聚汇细胞扩散的图像，持续总时间为50小时。
具体实施方式
示例1:
Elabela激素(ELA)，也称Toddler或Apela，是一种肽类激素，最近被确定为APJ的第二个配体，即爱佩琳(apelin)受体。作为32种氨基酸(aa)的前体产生，ELA也被发现为21氨基酸和11氨基酸中也发现了。我们的研究结果表明：Ela主要在肾脏种表达，在人类肾癌中表达降低(图1)。在异种移植动物模型(皮下或子囊注射)中，Ela抑制肿瘤恶化(图2和3)。此外，我们已产生了突变体ELA多肽，其中，在位置9、10、20或21处的精氨酸残基被半胱氨酸残基所取代。我们显示：突变体ELA多肽也能够抑制肿瘤恶化(图2)。这些发现将Ela确定为全新的肾脏肿瘤抑制基因。
示例2:
材料和方法
患者样本
从人体肾肿瘤中获得新鲜样本及其相应的正常组织。所有患者均提供了书面知情同意书。患者的材料已被识别，且法国国家研究伦理审查委员会批准了研究方案。手术后，组织标本被立即转移到冰上，并在液氮中快速冷冻，直至用于RNA提取。
慢病毒载体的产生，细胞感染和培养
在骨髓增生性肉瘤病毒增强剂的控制下，将野生型和突变体proEla(处理位点R31/R32和R42/R43替换为S31/S32和S42/S43aa)克隆到含有tdTomato报告基因(pRRLsin-MND-hPGK-tdTomato-WPRE)的多顺反子自失活慢病毒载体中。所有结构都通过测序进行了验证。在波尔多大学TMB-Core的“Vect'Ube”机构实施慢病毒载体的构建和生产。通过HEK293T细胞中三重瞬时转染产生VSV-G假型化慢病毒载体，并通过超滤(Vivaspin 20，SartoriusBiotech SA，USA)浓缩。通过连续稀释的病毒上清液转染HEK293T细胞，测定pLV慢病毒载体的病毒滴度，5天后采用流式细胞术分析方法测定tdTomato表达量。在感染当天，小鼠肾腺癌Renca细胞(5x104细胞/孔)被接种在具有8μg/ml的聚凝胺的二十四孔板中。将编码野生型proEla、突变体proEla或仅编码tdTomato的慢病毒，在MOI 10(感染复数)时添加到培养基中。72小时后，使用荧光显微镜观察细胞感染率。在添加有10％FCS、100单位/ml青霉素/链霉素和2mML-谷氨酰胺的RPMI1640培养基中保存Renca细胞。
实时聚合酶链反应分析
根据制造商的指示，使用NucleoSpin RNA试剂盒(Macherey-Nagel)提取人体样本的总RNA。根据制造商的指示，使用TRI试剂(MRC Inc.，US)提取小鼠样本的总RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems，Courtaboeuf，France)，对总RNA的1μg进行cDNA合成。根据制造商(Agilent)的指示，使用Agilent RNA 6000Nano试剂盒检测人体样本的RNA质量。根据制造商指示，通过使用StepOnePlusTM实时PCR系统(Applied Biosystems，Courtaboeuf，France)，PCR Master Mix(Eurogentec)和特异引物的实时PCR，对特定mRNA进行相对定量检测。对于SYBR Green qPCR，其反应条件如下：95℃下持续10分钟，循环40个周期，95℃下持续15秒，60℃下持续60秒，随后95℃下持续15分钟，60℃下持续60秒，随后95℃下持续15分钟；对于Taqman qPCR：50℃下持续2分钟，95℃下持续10分钟，循环40个周期，95℃下15秒，60℃下60秒。GAPDH，HPRT1或S16管家基因被用作人体或小鼠细胞和组织的内源对照，如前所述(Scamuffa等人，2008)。
肽合成和体外酶消化
Ela 11、野生型proEla 32和突变体proEla 32肽通过Clinisciences进行合成。如前所述，采用弗林蛋白酶消化Ela肽持续4小时(Sfaxi等人，2014，Scamuffa等人，2008)，并对其进行蛋白质印迹分析。
蛋白质印迹分析
用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法对产生的体外酶解产物进行13％凝胶电泳。使用的主要抗体是抗Ela 11(Eurogentec)。根据制造商的指示，使用化学发光成像系统(GeneGnome，Syngene)，将辣根过氧化物酶偶联的二级抗体和增强化学发光(ECL+Plus，Amersham)用于一级抗体显示(Sfaxi等人,2014.,Scamuffa等人,2008)。
受体内化测定
将稳定表达人类GFP-APJ融合蛋白的HEK293A细胞，通过血清饥饿24小时，并且用1μM的Ela 11、野生型proEla 32或突变体proEla 32肽治疗30分钟。在室温条件下，采用4％多聚甲醛固定细胞10分钟，采用Nikon落射荧光显微镜分析APJ受体内化。
ERK,AKT和P70活化分析
将过量表达人体GFP-APJ融合蛋白的HEK293A，在无血清培养基条件下保存24小时，并采用(1μM)或不采用Ela 11、野生型proEla或突变体proEla，在37℃温度条件下培育5、15和30分钟。细胞在RIPA缓冲液(150mM NaCl，50mM Tris，1mM EDTA，1％NP40,0.25％脱氧胆酸钠，pH8)中裂解，并在12％凝胶上进行SDS-PAGE。分别使用抗磷酸化ERK、抗磷酸化AKT和抗磷酸化P70(细胞信号传导)，针对ERK、AKT和P70磷酸化，通过蛋白质印迹(westernblotting)分析细胞裂解物。剥离印迹，并采用ERK、AKT或P70(细胞信号传导)重新探测以进行数据标准化处理。使用辣根过氧化物酶偶联的二级抗体(Amersham)进行一级抗体可视化，根据制造商(Amersham)的指示，使用ECLPlus化学发光系统来检测信号。
mTOR信号通路
对编码野生型proEla、突变体proEla或仅编码tdTomato的过表达慢病毒的RENCA细胞，在无血清培养基中保存不同时间。细胞在RIPA缓冲液(150mM NaCl，50mM Tris，1mMEDTA，1％NP40,0.25％脱氧胆酸钠，pH8)中裂解，并在12％凝胶上进行SDS-PAGE。使用抗磷光体NFkB、抗磷酸化ERK、抗磷酸化AKT和抗磷酸化S6K，针对LC3、NFkB、Erk1/2、AKT、S6K或肌动蛋白通过蛋白质印迹(western blotting)分析细胞裂解物。剥离印迹，并采用ERK、AKT或P70(细胞信号传导)重新探测以进行数据标准化处理。使用辣根过氧化物酶偶联的二级抗体(Amersham)进行一级抗体可视化，根据制造商(Amersham)的指示，使用ECLPlus化学发光系统来检测信号。
致瘤性测定
将来自Janvier Laboratories的7至8周龄的Balb/c小鼠安置在通风的转盘架中，并提供无菌食物和饮用水。法国政府的动物居所和实验委员会批准了本文中报告的所有小鼠实验。为了评估野生型proEla和突变体proEla表达对Renca细胞诱导肿瘤生长能力的影响，将1x105个稳定表达的野生型proEla或突变体proEla的Renca细胞或相同细胞，通过皮下方式注射到同系Balb/c小鼠中。每2-3天监测肿瘤形成，并在实验结束时处死小鼠。如前所述，计算肿瘤体积(Sfaxi等人，2014)。
伤口愈合测定
培养Renca细胞，直至亚融合。通过每个孔上的尖端实现抓痕，在血清饥饿后8或24小时观察伤口愈合。
统计
所有数据均采用平均值±标准偏差(SD)的形式来表示，采用Graphpad Prism 5.0(GraphPad Software Inc.,San Diego,CA)进行统计分析。p值<0.05确认为具有统计学意义。
结果
由前蛋白转化酶弗林蛋白酶处理的ProEla 32
人体ELA的cDNA结构，预测54个氨基酸(aa)的前proEla。去除信号肽的22个aa后，激素释放32aa个proEla。proEla 32中存在两个碱性氨基酸基序R31/R32和R42/R43表明，PC参与其处理(数据未示出)。通过Genbank数据库，我们发现proEla序列高度保守，特别是在PC样切割位点RX(K/R)RQ的附近(数据未示出)。为了研究通过PC的preEla 32的蛋白水解成熟在其功能调节中的重要性，我们首先使用体外消化测定法，通过弗林蛋白酶实验性地评估proEla 32的处理过程。为此，我们合成了野生型proEla 32aa，其含有proEla(R31/R32和R42/R43)和突变肽proEla32的处理位点，其处理位点分别突变为S31/S32和S42/S43。如图4所示，采用重组人体弗林蛋白酶(0.2×10-4U)对野生型proEla进行培育，主要产生成熟的Ela 11aa，这表明R31/R32和R42/R43位点被弗林蛋白酶同时有效切割，避免了在这些条件下中间体ELA22aa形式的产生。相比之下，采用弗林蛋白对突变肽ProEla 32(S31/S32和S42/S43)进行培育，未能产生任何成熟的Ela产物，支持通过在R31/R32和R42/R43生理切割位点对proEla的特异性处理。
Ela、弗林蛋白酶和APJ在成年小鼠和肾癌组织中的表达分析
对各种成年小鼠组织实施实时PCR分析，结果显示，虽然在所有分析组织中均表达弗林蛋白酶和APJ，但Ela主要在肾脏中表达(图5)。Ela、其受体APJ及其转化酶弗林蛋白在正常小鼠肾上皮细胞中的协调表达，引导我们研究基因在人类肾癌中的表达水平，并评估Ela的作用以及其在该疾病中的处理情况。因此，通过对肾癌患者组织实施实时PCR分析，结果显示了Ela、APJ和弗林蛋白酶的无处不在表达(图6)。与正常组织相比，在分析的肾癌组织患者中检测到Ela和弗林蛋白酶的表达降低。在分析的7个患者组织中，Ela在6例患者中下调。
APJ内化和Ela肽
配体诱导的受体内化是APJ对配体结合及其活化的细胞反应。为了研究成熟ELA11、野生型和突变体pro Ela 32是否会诱导APJ内化，我们通过HEK293细胞中慢病毒感染，采用稳定方式将APJ表达为具有增强的绿色荧光蛋白(GFP-APJ，数据未示出)的融合蛋白，并检测其响应指定Ela肽的细胞内定位。在基础水平上，融合蛋白主要位于细胞表面。在Ela肽治疗后，在30分钟后在细胞质中形成大囊泡，表明所有Ela肽形式都能够激活APJ受体并介导其内化。同样，采用Ela 11和mut proEla 32或野生型proEla和mut proEla对细胞进行的治疗，也会诱导APJ内化。
ERK、AKT和p70活化分析
为了评估proEla处理在ERK、AKT和p70信号传导调节中的重要性，我们用野生型、mut proEla 32或成熟Ela 11处理表达APJ的HEK293细胞。所有这些Ela肽(1μM)能够在治疗5分钟内诱导ERK的磷酸化(数据未示出)。如Western分析显示，持续15分钟后该效果降低。有趣的是，在相同条件下，与mut proEla和Ela 11影响相比，野生型proEla对ERK活化的影响更高(数据未示出)。对AKT活化的分析显示，与其对ERK活化的影响相比，所有受测肽诱导的AKT活化较低。在5分钟后观察到较弱的AKT可见磷酸化，约15分钟达到峰值，并在此后降低(数据未示出)。同样，对AKT下游效应器P70s6K的分析显示，在相同条件下，1μM的所有测试的肽未能产生显著效果(数据未示出)。
mTOR信号通路
为了评估Elabela激素对肾癌进展的作用，我们使用表达Elabela激素或在弗林蛋白酶位点突变的Elabela激素的RENCA细胞。对细胞进行血清饥饿处理1、3、6、12或24小时，通过查看磷酸化或nfkB、Erk1/2、akt或S6K，观察Elabela激素对mTOR通路的影响。
在血清饥饿过程中，RENCA细胞中Elabela激素WT和MUT版本的表达诱导：
1.自噬诱导的阻滞，由降低LC3II水平估计。
2.mTORC1通路的持续激活，由持续的S6K和S6磷酸化确定。
3.ERK信号的增强抑制，由ERK磷酸化的增加确定。
4.对mTORC2信号传导没有影响，由P(473)AKT确定。
5.对PI3K信号传导没有影响，由P(308)AKT确定。
6.对NFkB信号传导没有影响。
Ela和proEla处理在肿瘤发生中的作用
为了研究野生型和突变体proEla 32在肿瘤进展中的作用，我们利用了缺乏Ela表达的鼠肾Renca癌症细胞的优点，并使用慢病毒载体pRRLsin-MND-hPGK-tdTomato-WPRE来传递和稳定表达这些细胞中的野生型和突变体proEla 32。在分析前，针对稳定表达野生型和突变型人体proEla的Renca癌症细胞，使用实时PCR(图7A)和在tdTomato荧光蛋白存在(数据未示出)时，评估这些构建体的表达。三组雄性同源Balb/c小鼠皮下接种1×105密度的对照细胞以及表达野生型proEla 32或突变体proEla 32的相同细胞。如图7B所示，这些肿瘤细胞中的野生型或突变体proEla的表达，与表达空载体的对照细胞相比，明显减少了肿瘤生长。与突变体proEla 32相比，野生型proEla 32的表达似乎更能有效地抑制肿瘤生长。通过伤口愈合实验证实了这些数据(数据未示出)。Elabela激素在体外抑制Renca细胞的伤口愈合，也用于细胞增殖测定，如图8所示。Elabela激素抑制了renca细胞增殖。
讨论
弗林蛋白酶的泛素化表达以及Ela前体(proEla 32)中二元切割基序的存在表明，PC是proEla处理的蛋白酶候选物(数据未示出)。在当前研究中，我们证明了，在两个切割位点，即：R31/R32和R42/R43，PC(弗林蛋白酶)参与了proEla蛋白水解过程。在我们的模型中，通过诱变和野生型和突变体proEla肽的体外酶促消化来确认proEla的切割位点(图4)。但是，虽然在这两个切割位点proEla(32aa)的切割可能产生Ela 22和Ela 11肽，但在这些条件下仅检测到Ela 11形成，表明在弗林蛋白酶存在的情况下Ela 22可快速转化为Ela 11(图4)。对各种成年小鼠组织的分析显示，Ela、其受体APJ和弗林蛋白酶mRNA(图5)的共同表达增强三者间功能联系。这些数据进一步证实了Ela、APJ和弗林蛋白酶在胚胎发育期间表达的惊人的时间相关性(Scamuffa等人，2006，Helker等人，2015)，表明这些基因在这些过程中发挥了关键作用。因此，先前的报道表明，ELA突变体表型与斑马鱼中APJ突变体相似，通过小鼠中的同源重组，使得毛发基因座失活，导致在e10.5后不久胚胎死亡(Scamuffa等人，2006)。因此，这表明ELA、其转化蛋白酶弗林蛋白酶和受体APJ参与正常胚胎移植所需的生物学功能。但是，在本研究中我们发现，proEla前体处理的抑制并不能显著影响其生物学功能。实际上，ELA最初在脊椎动物中被发现保存得非常好(Pauli等人，2014，Chng等人，2013)，特别是在PC切割位点附近(数据未示出)，并被描述为APJ的特异性配体，表明在哺乳动物中ELA-APJ通路的功能保存。最近，据报道，通过与非均质核核糖核蛋白L(hnRNPL)、一种p53的抑制性调节因子(Li等人，2015)的相互作用，Ela介导了其他功能，引发了对确定Ela体外和体内明显作用机制的质疑。为了研究proEla处理和功能的重要性及其与APJ信号传导的关系，我们生成了稳定表达GFP-APJ的HEK细胞。我们证明，合成的人体成熟ELA、野生型proEla和突变体proEla肽会引起人体APJ的内化(数据未示出)，且这些肽对APJ的激活导致ERK的显著激活(数据未示出)，从而确定处理或未处理的ELA能够在这些条件下激活APJ。与ERK活化相比，所有受测Ela肽未能显著诱导AKT及其下游效应物P70活化(数据未示出)。以前，APJ和弗林蛋白酶过度表达与各种癌症和转移性肿瘤有关。对7例肾癌患者的正常组织和肿瘤组织样本中Ela表达水平的分析表明，有6/7例患者Ela表达下调，表明Ela具有潜在的肿瘤抑制作用(图6)。因此，为了直接研究Ela和proEla处理在肿瘤生长中的生物学作用，我们利用缺乏Ela表达的鼠肾Renca细胞诱导Balb/c小鼠肿瘤。我们发现，野生型或突变体proEla在这些细胞中的表达，抑制了肿瘤细胞诱导小鼠肿瘤生长的能力(图7B)。目前我们对Ela如何参与肿瘤生长抑制的方式尚不清楚，但可以假设几种机制。Ela肽诱导AKT和ERK活化能力差异，可能是一个因素。以前，发现ERK活化效果取决于其表达水平和活性。而在正常细胞中，高水平的ERK活化诱导细胞衰老，发现减弱的ERK活性可以使细胞免于衰老并通过ras致癌基因促进细胞转化，这表明对ERK信号传导的肿瘤抑制作用(Deschênes-Simard等人,2013)。据报道，ERK介导的衰老包括不同生物功能所需的各种蛋白质的蛋白酶体降解，其中所述生物功能包括细胞增殖和迁移，RNA代谢和细胞信号传导。因此，在各种人类癌症中磷酸-ERK水平非常低，包括乳腺癌(Milde-Langosch等人，2005)、脑癌(Mawrin等人，2003，Mawrin等人，2005)、前列腺癌(Malik等人，2002)、胰腺癌(Yip-Schneider等人，2001)和肾肿瘤(Lee等人，2009，Svensson等人，2009)。同样，ERK水平高的患者预后良好，侵袭性表型较低(Milde-Langosch等人，2005；Lee等人，2009，Svensson等人，2009)，生存率更高，对治疗的响应性更好(Chadha等人，2006)。相反，一些晚期癌症被发现与低磷酸化ERK和高AKT水平相关(Malik等人，2002，Deng等人，2015)。事实上，AKT通路是人类癌症中最常见被破坏的信号传导途径(Millis等人，2016)，在所有的肿瘤类型中AKT通路的异常已被发现高达40％。许多在所有水平上抑制AKT通路的化合物，目前仍处于临床开发阶段，包括直接针对AKT的化合物(Yap等人，2008)。这些研究表明，ERK通路的一些肿瘤抑制功能，可能会在癌症患者中重新激活，但AKT不能。基于Ela诱导高ERK和低AKT活性的能力，可能构成肾癌治疗的潜在策略。总之，我们确定Ela为潜在的新肿瘤抑制基因，并描述了将Ela具有的ERK活化能力与肿瘤生长抑制相关联的合理机制。
在RENCA细胞中，Elabela激素(WT和MUT)通过抑制S6K磷酸化，参与mTORC1通路,ans作为mTORC1是mTOR的直接抑制剂，这种影响也作用于ERK通路(数据未示出)。
我们得出结论，Elabela激素通过mTOR作为肿瘤抑制因子发挥作用。
参考文献:
在整个申请中，各种参考文献描述了本发明所属领域的现有技术。这些参考文献的公开内容，通过引用成为本公开的内容。
序列表
<110> 法国国家健康和医学研究院（INSERM）
<120> 适用于肾癌治疗的方法和药物组合物
<130> BIO16377 SIEGFRIED / MC
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Gln Arg Pro Val Asn Leu Thr Met Arg Arg Lys Leu Arg Lys His Asn
1 5 10 15
Cys Leu Gln Arg Arg Cys Met Pro Leu His Ser Arg Val Pro Phe Pro
20 25 30

Claims (8)

1.一种对需求受试者治疗肾癌的方法，包括向受试者施用ELA多肽或其编码核酸的治疗有效剂量，其中ELA多肽包含具有至少90％与SEQ ID NO:1(QRPVNLTMRRKLRKHNCLQRRCMPLHSRVPFP)相同的氨基酸序列，其中在位置9、10、20或21处的精氨酸残基(R)可选择性突变。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述受试者患有肾细胞癌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述在位置9、10、20或21处的精氨酸残基(R)被丙氨酸残基(A)或丝氨酸残基(S)替代。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸分子包含在合适载体中，例如质粒、粘粒、附加体、人工染色体、噬菌体或病毒载体。
5.多肽，包含具有至少90％与SEQ ID NO:1(QRPVNLTMRRKLRKHNCLQRRCMPLHSRVPFP)相同的氨基酸序列，其中在位置9、10、20或21处的精氨酸残基(R)可突变。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述在位置9、10、20或21处的精氨酸残基(R)被丙氨酸残基(A)或丝氨酸残基(S)替代。
7.核酸分子，其编码权利要求5所述的多肽。
8.根据权利要求5所述的多肽，或根据权利要求7所述的核酸分子，用于肾癌治疗的方法。
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