CN116655773B - 一种肽类激素Elabela突变体及其在心肾综合征中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种肽类激素Elabela突变体，所述Elabela突变体是对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型Elabela多肽进行了突变，将第5位和第16位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，所述Elabela突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。将肽类激素Elabela突变体通过尾静脉注射小鼠之后，有效缓解了心肾综合征模型小鼠的血尿肌酐失衡、尿蛋白、尿氮素、血钠尿肽升高以及心功能EF值降低的症状，说明Elabela突变体能够有效治疗心肾综合征，且治疗效果明显优于野生型Elabela，有希望将Elabela突变体应用于心肾综合征及其预后治疗中。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质工程领域，具体而言，涉及一种肽类激素Elabela突变体及其在心肾综合征中的应用。
背景技术
APJ是一种G蛋白偶联受体，是1993年由O’Dowd教授团队发现的一类与血管紧张素1型受体（angiotensin type 1 receptor，AT1R）同源性高达30%的新型跨膜受体。APJ虽然与AT1R高度相似，但血管紧张素Ⅱ并不与其结合，故此类受体一直被认为是孤儿受体。直至1998年，Tatemoto等在牛胃中提取出一种肽类激素apelin，并发现该激素可以与APJ结合，是体内天然存在的APJ配体。自此之后，apelin/APJ系统，又称为apelinergic系统，在生物体内表达分布及其调控作用受到了研究学者们的极大关注。
Apelin一直被认为是体内可以与APJ结合的唯一配体，2013年末到2014年初，两个完全独立的研究团队相继发现同一种短小的分泌肽，它可以与APJ结合，具有Elaabela缺失的斑马鱼表现出胚胎发生性低下且致死率高，这与APJ缺失的表型一致，其被认为是APJ的新型内源性配体，该分泌肽命名为Elabela（Ela）或Toddler。Apelin和APJ广泛表达于脑、心、肺、肝、肾、胃肠道、内皮和脂肪等组织器官。Apelin系统具有广泛的生物学性能，特别是在维持心血管系统和体液代谢的动态平衡中发挥着重要作用。与Apelin一样，Elabela也在心脏内皮细胞和各种血管中大量表达。由于Elabela与Apelin都可以与APJ受体结合，所以其作用也有相似之处，具有强心、利尿、降压、心肾保护等作用。
新的研究发现，Elabela在保护急性心力衰竭、拮抗RAS系统、减轻心脏损伤、改善肾功能障碍等过程中发挥着重要作用。心力衰竭发生时，射血分数下降，肾脏灌注不足，肾小球滤过率下降，导致液体潴留从而加重心功能不全。Elabela与APJ结合，一方面可拮抗RAS系统、激活Gi信号增加利尿，调节体液平衡、增加心肌收缩力；另一方面Elabela可以抑制缺血再灌注所致的肾小管上皮细胞损伤，具有保护肾小球结构，改善肾脏功能的作用。
我们通过对比心肾综合征患者与正常患者血清Elabela水平，前者血清Elabela水平更高。这也为Elabela在心肾综合征的治疗提供了新思路。
发明内容
本发明提供了一种肽类激素Elabela突变体，所述Elabela突变体是对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型Elabela多肽进行了突变，将第5位和第16位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，所述Elabela突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种药物组合物，其中包含了所述Elabela突变体和药学上可接受的载体。
本发明还提供了一种Elabela突变体在制备用于治疗心肾综合征的药物中的应用。
本发明还提供了一种Elabela突变体在制备缓解由心肾综合征导致的血肌酐升高的药物中的应用。
本发明还提供了一种Elabela突变体在制备缓解由心肾综合征导致的尿肌酐降低的药物中的应用。
本发明还提供了一种Elabela突变体在制备缓解由心肾综合征导致的尿蛋白升高的药物中的应用。
本发明还提供了一种Elabela突变体在制备缓解由心肾综合征导致的尿氮素升高的药物中的应用。
本发明还提供了一种Elabela突变体在制备缓解由心肾综合征导致的血钠尿肽升高的药物中的应用。
本发明还提供了一种Elabela突变体在制备用于治疗心力衰竭的药物中的应用。
本发明还提供了一种Elabela突变体在制备用于治疗肾功能衰竭的药物中的应用。
本发明还提供了一种心肾综合症的生物标记物，该生物标记物为肽类激素Elabela，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的有益效果为：
1）本发明意外的获得了一种肽类激素Elabela突变体，其是将野生型Elabela的第5位和第16位的天冬酰胺突变为天冬氨酸得到的，将该突变体通过尾静脉注射心肾综合症模型小鼠之后，显示该突变体有效缓解了心肾综合征模型小鼠的血尿肌酐失衡、尿蛋白、尿氮素、血钠尿肽升高以及心功能EF值降低的症状，说明Elabela突变体能够有效治疗心肾综合征，且治疗效果明显优于野生型Elabela，有希望将Elabela突变体应用于心肾综合征及其预后治疗中。
2）本申请发现心肾综合征患者与正常患者血清Elabela水平，前者血清Elabela水平更高，因此，Elabela能够作为生物标记物来检测是否患有心肾综合症。
附图说明
图1：Elabela在心肾综合征患者和正常人群中的表达水平差异。
图2：小鼠尿肌酐含量。A组尾静脉注射Elabela突变体，注射量为0.1μg/kg/天小鼠；B组尾静脉注射Elabela突变体，注射量为0.2μg/kg/天小鼠；C组尾静脉注射Elabela突变体，注射量为0.3μg/kg/天小鼠；D组尾静脉注射野生型Elabela，注射量为0.2μg/kg/天小鼠；E组尾静脉注射生理盐水，注射量为0.2μg/kg/天小鼠。
图3：小鼠血肌酐含量。A组尾静脉注射Elabela突变体，注射量为0.1μg/kg/天小鼠；B组尾静脉注射Elabela突变体，注射量为0.2μg/kg/天小鼠；C组尾静脉注射Elabela突变体，注射量为0.3μg/kg/天小鼠；D组尾静脉注射野生型Elabela，注射量为0.2μg/kg/天小鼠；E组尾静脉注射生理盐水，注射量为0.2μg/kg/天小鼠。
图4：小鼠尿氮素含量。小鼠血肌酐含量。A组尾静脉注射Elabela突变体，注射量为0.1μg/kg/天小鼠；B组尾静脉注射Elabela突变体，注射量为0.2μg/kg/天小鼠；C组尾静脉注射Elabela突变体，注射量为0.3μg/kg/天小鼠；D组尾静脉注射野生型Elabela，注射量为0.2μg/kg/天小鼠；E组尾静脉注射生理盐水，注射量为0.2μg/kg/天小鼠。
图5：小鼠24h尿蛋白含量。小鼠血肌酐含量。A组尾静脉注射Elabela突变体，注射量为0.1μg/kg/天小鼠；B组尾静脉注射Elabela突变体，注射量为0.2μg/kg/天小鼠；C组尾静脉注射Elabela突变体，注射量为0.3μg/kg/天小鼠；D组尾静脉注射野生型Elabela，注射量为0.2μg/kg/天小鼠；E组尾静脉注射生理盐水，注射量为0.2μg/kg/天小鼠。
图6：小鼠血钠尿肽含量。小鼠血肌酐含量。A组尾静脉注射Elabela突变体，注射量为0.1μg/kg/天小鼠；B组尾静脉注射Elabela突变体，注射量为0.2μg/kg/天小鼠；C组尾静脉注射Elabela突变体，注射量为0.3μg/kg/天小鼠；D组尾静脉注射野生型Elabela，注射量为0.2μg/kg/天小鼠；E组尾静脉注射生理盐水，注射量为0.2μg/kg/天小鼠。
图7：小鼠心功能EF值。小鼠血肌酐含量。A组尾静脉注射Elabela突变体，注射量为0.1μg/kg/天小鼠；B组尾静脉注射Elabela突变体，注射量为0.2μg/kg/天小鼠；C组尾静脉注射Elabela突变体，注射量为0.3μg/kg/天小鼠；D组尾静脉注射野生型Elabela，注射量为0.2μg/kg/天小鼠；E组尾静脉注射生理盐水，注射量为0.2μg/kg/天小鼠。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1
1、Elabela 在心肾综合征患者中表达水平差异
临床研究中发现，对比心肾综合征患者与正常患者血清Elabela水平，如图1所示，心肾综合征患者的Elabela表达水平普遍高于对照组，这提示Elabela很有可能与心肾综合征治疗相关。
2、为了验证Elabela对心肾综合征的治疗效果，构建了心肾综合征小鼠模型，构建方法如下：
SD雄鼠(体重200±20g)购自吉林大学实验动物中心，所有实验动物的护理和使用制度与实验动物指导方针一致。在饲养中，大鼠经过12:12小时明暗交替饲养，饲养温度26±1℃。大鼠予以永久性结扎冠状动脉左前降支血管致心肌梗死，1周后行3/4肾脏切除，建立心肾综合征模型小鼠，对照组小鼠进行假手术。建立成功后立即检测血肌酐、尿素氮、24小时尿蛋白、尿肌酐、血钠尿肽等生化指标，并测量大鼠心功能指数。结果如表1所示。
由此可见，心肾综合症模型小鼠和对照组小鼠的血肌酐、尿素氮、24小时尿蛋白、尿肌酐、血钠尿肽和血清Elabela水平均存在明显差异，这提示了Elabela有望作为心肾综合症的生物标记物。
表1：心肾综合征模型小鼠与对照小鼠的心肾功能指标平均值
3、Elabela突变体在治疗心肾综合征的效果
在研究中，我们意外获得了一种肽类激素Elabela突变体，将其氨基酸序列与野生型Elabela相比，发现该突变体是将野生型Elabela的第5位和第16位的天冬酰胺突变为天冬氨酸得到的。为了研究Elabela突变体和野生型Elabela对心肾综合征治疗的效果，分别人工合成氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示的野生型Elabela和SEQ ID NO .2所示的Elabela突变体。
具体而言，SEQ ID NO .1如下：
QRPVN LTMRR KLRKH NCLQR RCMPL HSRVP FP
SEQ ID NO .2如下：
QRPVD LTMRR KLRKH DCLQR RCMPL HSRVP FP
将心肾综合征模型小鼠分为5组，每组10只，分别进行以下操作：
A组：尾静脉注射Elabela突变体，注射量为0.1μg/kg/天小鼠；
B组：尾静脉注射Elabela突变体，注射量为0.2μg/kg/天小鼠；
C组：尾静脉注射Elabela突变体，注射量为0.3μg/kg/天小鼠；
D组：尾静脉注射野生型Elabela，注射量为0.2μg/kg/天小鼠；
E组：尾静脉注射生理盐水，注射量为0.2μg/kg/天小鼠。
每组均连续注射3天，第3次注射后立即测定血肌酐、尿素氮、24小时尿蛋白、尿肌酐、血钠尿肽以及大鼠心功能值。
1）血肌酐和尿肌酐
血肌酐代表的是肾功能的水平，而尿肌酐是代表尿液中肌酐排泄的程度。肌酐一般来源分内源性和外源性，内源性肌酐主要是来源于肌肉的代谢，而外源性肌酐跟动物蛋白摄入的多少有关系。肾功能受损时，肌酐排泄受损，尿肌酐的水平会下降，而血肌酐的水平增高。
如图2和图3可知，A、B、C、D组小鼠的血肌酐含量明显低于E组，相反，其尿肌酐含量明显高于E组，这说明Elabela能够缓解心肾综合征导致的血尿肌酐失衡，进而治疗心肾综合征，且Elabela突变体的治疗效果比野生型Elabela更好，并随着Elabela突变体施用量的增加，治疗效果也随之增强。
2）尿氮素
尿素氮是人体蛋白质代谢的主要终末产物，通常肾脏为排泄尿素的主要器官，尿素从肾小球滤过后在各段小管均可重吸收，但肾小管内尿流速越快重吸收越少，也即达到了最大清除率。各种肾实质性病变，如肾小球肾炎、间质性肾炎、急慢性肾功能衰竭、肾内占位性和破坏性病变均可使血尿素氮增高。
如图4所示，A、B、C、D组小鼠的尿氮素含量明显低于E组，在这四组中，D组的尿氮素含量为21.32mmol/L，略高于其余这三组，A、B、C三组的尿氮素含量依次降低，C组尿氮素含量最低，为16.48mmol/L。这说明Elabela能够缓解心肾综合征导致的尿氮素升高，且Elabela突变体相较于野生型Elabela具有更好的尿氮素降低效果，并随着Elabela突变体施用量的增加，降低效果也随之增强。
3）24h尿蛋白
24小时尿蛋白定量亦称为24小时尿蛋白排泄率，是通过收集24小时的全部尿液，来测定其中的蛋白质的含量，进而计算出24小时内的蛋白总量，正常尿液中的蛋白质含量极微，肾脏疾病和某些生理情况如剧烈运动等，尿蛋白含量可显著增加，24小时尿蛋白定量是肾病患者不可缺少的检查之一。
如图5所示，A、B、C、D组小鼠的24小时尿蛋白含量明显低于E组，在这四组中，D组的尿氮素含量为19.77mg，略高于其余这三组，A、B、C三组的24小时尿蛋白含量依次降低，C组24小时尿蛋白含量最低，为13.05mg。这说明Elabela能够缓解心肾综合征导致的24小时尿蛋白升高，也即Elabela能够治疗心肾综合征，且Elabela突变体相较于野生型Elabela具有更好的尿胆素降低效果，并随着Elabela突变体施用量的增加，降低效果也随之增强。
4）血钠尿肽
血钠尿肽（BNP）是由心房和心室肌细胞分泌的一种多肽类激素，它是反映心脏功能的一个重要标志物。心力衰竭时血浆中BNP水平升高，且其升高程度与心力衰竭严重程度为正相关，其次还可见于肺栓塞、慢性阻塞性肺疾病、肾衰竭，且血浆BNP升高几乎见于所有的终末期肾病。
如图6所示，A、B、C、D组小鼠的血钠尿肽含量分别为92.76pg/ml、87.28pg/ml、67.42pg/ml和121.11pg/ml，均明显低于E组的187.66pg/ml。这说明Elabela能够缓解心肾综合征导致的血钠尿肽升高，也即Elabela能够治疗心肾综合征，且Elabela突变体相较于野生型Elabela具有更好的心肾综合征治疗效果，并随着Elabela突变体施用量的增加，治疗效果也随之增强。
5）心功能EF值
心功能EF值是指心脏的射血分数，即心脏每搏输出量与舒张末期容积的比值，主要可以反映患者的心肌收缩能力和心室收缩泵血功能。EF值是判断心脏功能的重要指标，心功能不全的患者可分为射血分数降低的心力衰竭和射血分数保持的心力衰竭，如果EF值小于50%，则属于射血分数保存的心力衰竭。
如图7所示，A、B、C、D组小鼠的EF值分别为57.4%、63.5%、67.3%、55.8%，均明显低于E组的40.6%。这说明Elabela能够缓解心肾综合征导致的心功能衰竭，也即Elabela能够治疗心肾综合征，且Elabela突变体相较于野生型Elabela具有更好的心肾综合征治疗效果，并随着Elabela突变体施用量的增加，治疗效果也随之增强。
综上所述，Elabela突变体能够有效缓解了心肾综合征模型小鼠的血尿肌酐失衡、尿蛋白、尿氮素、血钠尿肽升高以及心功能EF值降低的症状，说明Elabela突变体能够有效治疗心肾综合征，且治疗效果明显优于野生型Elabela，有希望将Elabela突变体应用至心肾综合征及其预后治疗中去。
以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1. 一种肽类激素Elabela突变体，所述Elabela突变体是对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型Elabela多肽进行了突变，将第5位和第16位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，所述Elabela突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种药物组合物，其包含权利要求1所述肽类激素Elabela突变体和药学上可接受的载体。
3.权利要求1所述肽类激素Elabela突变体在制备用于治疗心肾综合征的药物中的应用。
4.权利要求1所述肽类激素Elabela突变体在制备缓解由心肾综合征导致的血肌酐升高的药物中的应用。
5.权利要求1所述肽类激素Elabela突变体在制备缓解由心肾综合征导致的尿肌酐降低的药物中的应用。
6.权利要求1所述肽类激素Elabela突变体在制备缓解由心肾综合征导致的尿蛋白升高的药物中的应用。
7.权利要求1所述肽类激素Elabela突变体在制备缓解由心肾综合征导致的尿氮素升高的药物中的应用。
8.权利要求1所述肽类激素Elabela突变体在制备缓解由心肾综合征导致的血钠尿肽升高的药物中的应用。
9.权利要求1所述肽类激素Elabela突变体在制备用于治疗心力衰竭的药物中的应用。
10.权利要求1所述肽类激素Elabela突变体在制备用于治疗肾功能衰竭的药物中的应用。
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