CN111569089A - D5r-聚氨基糖苷类基因载体的复合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物领域，特别涉及D5R‑聚氨基糖苷类基因载体的复合物。本发明提供的D5R‑聚氨基糖苷类基因载体的复合物(SS‑HPT/Drd5质粒)在体内具有强大的心脏富集和基因传递能力，而托普霉素的添加增强了其生物相容性和安全性。D5R‑聚氨基糖苷类基因载体的复合物(SS‑HPT/Drd5质粒)消除了ROS的产生，改善了自噬，保护线粒体，改善了心脏功能，减轻了压力负荷诱发的心肌肥厚导致的炎症和纤维化。

Description

D5R-聚氨基糖苷类基因载体的复合物及其应用
技术领域
本发明涉及药物领域，特别涉及D5R-聚氨基糖苷类基因载体的复合物。
背景技术
慢性心力衰竭(Chronic Heart Failure,CHF)是由于心脏结构或功能异常导致心室充盈或射血能力受损的复杂临床综合征，是多种心脏病终末阶段的临床表现。我国心衰患病率已达1％，至少有1000万心力衰竭患者,且发病率持续增长,已成为世界上拥有最大心衰患者群的国家之一。近年来循证治疗的发展有效地改善了心衰患者的生活质量，但5年死亡率与恶性肿瘤相仿。
左心室肥厚是前临床心衰阶段的重要表征，随时间推移发生失代偿导致心衰。β肾上腺素能受体阻滞剂(β-adrenergic receptors blockers)是治疗左心室肥厚的一线用药。患者标准化手术治疗后室间隔厚度减小，给予β肾上腺素能受体阻滞剂能够有效缓解病程、改善预后，但仍有约10％的用药患者会发生心衰，最终面临心脏移植或者死亡。因此，探索心肌肥厚术后导致心衰的生物标志物及可能靶点，为心衰防治提供更全面的理论依据，对于人类心衰的预防和治疗、保障人类健康具有重大意义。
现有的基因治疗靶点药物研发，通过病毒和非病毒载体递呈心肌钙(Ca2+)离子传导的靶蛋白(Ca2+-ATPase，S100A1和AC6)和β-肾上腺素系统靶蛋白能够有效改善心肌收缩力和左室功能，但并没能从根本上解决心肌损伤的问题。
现有的基因治疗药物中非病毒基因递呈载体多聚-1-赖氨酸(PLL)的DNA复合物和聚乙烯亚胺(PEI)递呈基因质粒靶向性差，复合物往往会聚集并积聚在不同的组织中，因此通常不能通过基因疗法有效治疗心脏疾病。而超声靶向微泡(UTM)给药转化的效率比较低。病毒AAV载体递呈基因药物靶向性则有待提高，它不仅可以递呈到心肌，还能够递呈到其他组织，另外病毒载体的包装能力和免疫原性存在治疗风险。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了D5R-聚氨基糖苷类基因载体的复合物。D5R-聚氨基糖苷类基因载体的复合物(SS-HPT/Drd5质粒)在体内具有强大的心脏富集和基因传递能力，而托普霉素的添加增强了其生物相容性和安全性。D5R-聚氨基糖苷类基因载体的复合物(SS-HPT/Drd5质粒)消除了ROS的产生，改善了自噬，保护线粒体，改善了心脏功能，减轻了压力负荷诱发的心肌肥厚导致的炎症和纤维化。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了心脏多巴胺D5受体在制备保护心肌和/或治疗心肌肥厚的制剂和/或药物中的应用。
多巴胺D5受体(D5R)是多巴胺受体的五种亚型之一，小鼠D5R基因敲除会导致高血压和代偿性心肌肥大。心脏特异性降低D5R表达引起小鼠心肌功能障碍和心衰。同时我们发现D5R在正常心肌组织中高表达，而在肥厚性心肌病病人心肌组织中持续降低，在心衰病人的心肌组织中显著降低。这些发现表明，D5R对于维持人心脏功能至关重要。通过氨基糖苷类基因载体纳米复合物(SS-HPT/DRD5质粒)进行心脏特异性D5R递呈，通过降低了氧化应激和线粒体依赖的ROS产生以及改变心肌自噬，而不仅仅是通过调控心肌钙(Ca2+)离子传导的靶蛋白(Ca2+-ATPase，S100A1和AC6)来改善心肌收缩，从而从根本上改善心肌功能，另外D5R还能够与β-肾上腺素能受体相互作用，补充异丙肾上腺素对心肌收缩力的调节，因此心肌D5R是有效的治疗靶点。
在本发明的一些具体实施方案中，所述心脏多巴胺D5受体过表达。
在本发明的一些具体实施方案中，心脏多巴胺D5受体通过下调心脏中NADPH氧化酶的表达，抑制线粒体生成的ROS，改善线粒体功能和/或增加自噬起到保护心肌的作用。
在上述研究的基础上，本发明还提供了D5R-聚氨基糖苷类基因载体的复合物，包括D5R和聚氨基糖苷类基因载体；
所述聚氨基糖苷类基因载体的制备方法为：
步骤1：取2-羟乙基二硫化物，氢氧化钠，四丁基溴化铵混合后与环氧氯丙烷制得羟乙基二硫二缩水甘油醚；
步骤2：取所述羟乙基二硫二缩水甘油醚与DMSO，妥布霉素，三乙胺混合发生超支化反应，再计入过量的乙二胺终止反应。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中2-羟乙基二硫化物，氢氧化钠，四丁基溴化铵与环氧氯丙烷的摩尔比为1:3:0.01:3，所述混合为40℃搅拌至溶解。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤2中，以mL/mg/mg/μL/mL计，DMSO、妥布霉素、所述羟乙基二硫二缩水甘油醚、三乙胺、乙二胺的比例为5:467:665:300:1；所述超支化反应为在氮气保护下，于40℃反应24h；所述终止反应的条件为60℃反应1h。
在本发明的一些具体实施方案中，所述D5R-聚氨基糖苷类基因载体的复合物的制备方法为：取所述D5R与无RNA酶水混合后，与所述聚氨基糖苷类基因载体络合。
本发明还提供了所述的复合物在制备保护心肌和/或治疗心肌肥厚的制剂和/或药物中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，所述心脏多巴胺D5受体过表达；所述心脏多巴胺D5受体通过下调心脏中NADPH氧化酶的表达，抑制线粒体生成的ROS，改善线粒体功能和/或增加自噬起到保护心肌的作用。
在上述研究的基础上，本发明还提供了保护心肌和/或治疗心肌肥厚的制剂和/或药物，包括所述的复合物以及药学上可接受的辅料。
本发明是建立在以下两个技术背景基础上，即基因递呈载体实现心脏靶向的技术、基因治疗靶点对于心脏功能的有效保护作用。
多巴胺D5受体(Dopamine D5 receptor,D5R)是多巴胺受体5个亚型中最特殊的受体，即持续性自激活受体。动物实验发现，小鼠在心肌肥厚致心衰发病过程中心脏D5R的表达逐渐降低；在心衰代偿性肥厚的早期给予多巴胺D5R-聚氨基糖苷类基因载体的复合物靶向治疗，能够显著抑制氧化应激并且改善线粒体自噬，以及抑制心肌凋亡的发生。因此，D5R既可能作为心肌肥厚发生心衰的生物标志物，又可能作为治疗心肌肥厚致心衰的新的作用靶点。
基于聚阳离子的非病毒载体具有低免疫原性的特点，本发明构建的聚氨基糖苷类基因复合物具有超支化结构，含有托普霉素单体，能够有效抗菌抗感染，并且还含有二硫键能够与大分子形成稳定的化合物，且易于制备。氨基糖苷类基因载体纳米复合物静脉注射到循环系统中能够保持高浓度并且血管通透性好，基于电荷吸引作用靶向富集到损伤的心肌，在肾脏中无富集，因此具有优于病毒载体及其他非病毒载体的优势。
因此，本发明解决了两个问题：1)发现了D5R作为心肌肥厚发生心衰的新的治疗靶点，有效控制了心衰的发生发展；2)通过聚氨基糖苷类基因载体包裹DRD5质粒能够安全有效的靶向心肌组织，从源头机制上改善心肌损伤，并且对其他的器官没有副作用。另外聚氨基糖苷类基因载体还连接了托普霉素，能够有效抗炎，进一步提升了该发明的安全性，用于心肌肥厚的防治。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示成像仪拍摄结果；
图2示SS-HPT/Drd5质粒复合物能够在心脏中稳定的表达；其中，图2(a)示WesternBlot实验结果；图2(b)示Western Blot实验结果；图2(c)示免疫组化实验结果；
图3示SS-HPT/Drd5质粒复合物能够有效改善TAC以及SS-HPT/Drd5 siRNA引起的心脏肥大；其中，图3(a)示数码相机拍摄心脏组织结果；图3(b)示心脏横截面HE染色以及WGA心肌细胞膜染色结果；图3(c)示心脏横截面定量分析结果；图3(d)示心脏超声结果；图3(e)示左心室内径统计结果；图3(f)示左心室体积统计结果；图3(g)示心脏射血分数统计结果；图3(h)示心脏短轴缩短率统计结果；
图4示SS-HPT/Drd5质粒复合物能够通过抑制氧化应激从而达到治疗效果；其中，图4(a)示ROS测定结果；图4(b)示NADPH氧化酶活性的测定结果；图4(c)示心脏线粒体中产生的H2O2的测定结果；图4(d)示p40及p47蛋白Western Blot结果；图4(e)示p40及p47蛋白Western Blot的定量分析结果；图4(f)示透射电镜拍摄的小鼠心肌线粒体形态结果；
图5示SS-HPT/Drd5质粒防止心肌内质网应激和凋亡；其中，图5(a)示小鼠心脏组织中自噬标记物P62和AGT5 Western Blot结果；图5(b)示P62 Western Blot定量分析结果；图5(c)示AGT5 WesternBlot定量分析结果；图5(d)示人心脏组织自噬标记物P62和ATG5Western Blot结果；图5(e)示P62Western Blot定量分析结果；图5(f)示ATG5 WesternBlot定量分析结果；
图6示SS-HPT/Drd5质粒抑制细胞凋亡；其中，图6(a)示心脏纤维化标记物MMP2、MMP9以及COL1aWestern Blot结果；图6(b)示MMP2、MMP9以及COL1a Western Blot定量分析结果；图6(c)示心肌细胞TUNEL阳性的定量分析结果；图6(d)示RT-PCR对心脏中心肌标志物mRNA表达的定量分析结果；图6(e)示免疫荧光分析心肌细胞凋亡结果。
具体实施方式
本发明公开了D5R-聚氨基糖苷类基因载体的复合物，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语：
多巴胺D5受体：多巴胺受体是通过其相应的膜受体与多巴胺结合并发挥作用的一种位于生物体内的受体，多巴胺受体为七个跨膜区域组成的G蛋白偶联受体家族，目前已分离出五种多巴胺受体(DA2R)。根据它们的生物化学和药理学性质，可分为D1类和D2类受体，D1类受体包括D1和D5受体(在大鼠也称D1A和D1B受体)，D2类受体包括D2，D3和D4受体。D5受体是多巴胺受体的五种亚型之一，属于组成型受体，和其他多巴胺受体均属于视紫红质家族，为细胞表面七跨膜G蛋白偶联受体。D5受体在肾脏中表达丰富，尤其在肾近曲小管，肾皮质和髓质部的集合管、髓质Henle环升支和肾动脉中膜等部位表达明显。同时，D5受体在心脏、冠状动脉、肠系膜动脉等心血管组织中也有较多的表达。研究表明，D5受体的表达与高血压心脏病关系密切。
氨基糖苷类超支化聚合物：英文简称SS-HPT，H是hyperbranch的缩写，表示材料结构是超支化形状；P是polyaminoglyciside的缩写，是聚氨基糖苷的意思，表明材料的类型；T是表示其中一个单体是托普霉素，一种抗生素；SS是说明组成这个聚合物的另一个单体含双硫键，即这个聚合物可以降解(双硫键可以被谷胱甘肽打断)是α-氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，也是蛋白水解的中间产物。根据上述特性，SS-HPT可用于络合核酸(如siRNA,质粒)等大分子物质，形成聚氨基糖苷类复合物，可作为有效的基因载体。
纳米复合物(基因递呈复合物)：是指直径在纳米级至微米级，形状为球形或其他几何体的材料。该几何体粒径范围一般为1-500um，小的可以为几纳米，大的可达800um。标准的复合物包括非官能化的产品，或者带有羧基、胺或者链霉素亲和素官能团的产品。聚氨基糖苷类基因复合物具有超支化结构，含有托普霉素单体，能够有效抗菌抗感染，并且还含有二硫键能够与大分子形成稳定的化合物。
心肌肥厚：这是一种产生较缓慢但较有效的代偿功能，主要发生在长期压力负荷过重的情况下，心肌总量增加，收缩力加强，使心脏得以维持正常的血循环，同时有相当的储备力。但这种代偿功能也有其不利之处，主要因为肥大的心肌需氧增加，而冠状动脉的供血量往往不能予以满足，造成心肌缺血，这将最后导致心肌收缩力的减退。
肥厚性心肌病(hypertrophic cardiomyopathy，HCM)：是常见的遗传性心脏病之一，特征为心室壁呈不对称性肥厚，常侵及室间隔，心室内腔变小，左心室血液充盈受阻，左心室舒张期顺应性下降。根据左心室流出道有无梗阻分为梗阻性及非梗阻性肥厚型心肌病，可能与遗传等有关。肥厚型心肌病有猝死风险，是运动性猝死的原因之一。有研究表明，HCM是常染色显性遗传病，60％～70％为家族性，30％～40％为散发性，目前已证实至少14个基因突变与肥厚型心肌病的发病有关，其中有10种是编码肌小节结构蛋白的基因，绝大部分突变位于这些基因。这些基因编码肌节或相邻z盘之间区域粗、细肌丝收缩蛋白，以β肌球蛋白重链(编码基因为MYH7)及肌球蛋白结合蛋白C(编码基因为MYBPC3)最为常见。基因突变导致心肌收缩装置钙离子敏感性增高或心肌细胞压力增加，从而诱发代偿性心肌肥厚。大量基因检测发现HCM患者基因存在很大的变异性及不同的分子通道，识别了超过2000种肌节突变。约1/3的HCM患者存在致病突变并可用于家族成员筛查，但散发的HCM患者更为常见。肌小节基因突变并不能充分解释所有HCM患者的临床及病理生理学特征，从整体上阐明疾病异质性还需更全面的模型。
基因治疗(gene therapy):是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。基因治疗的靶细胞主要分为两大类：体细胞和生殖细胞，如今开展的基因治疗只限于体细胞。生殖细胞的基因治疗是将正常基因直接引入生殖细胞，以纠正缺陷基因。这样，不仅可使遗传疾病在当代得到治疗，而且还能将新基因传给患者后代，使遗传病得到根治。但生殖细胞的基因治疗涉及问题较多，技术也较复杂，因此，如今更多地是采用体细胞基因治疗。体细胞应该是在体内能保持相当长的寿命或者具有分裂能力的细胞，这样才能使被转入的基因能有效地、长期地发挥“治疗”作用。
1.心脏多巴胺D5受体(D5R)对心肌功能的保护作用
(1)首先我们利用动物实验说明了SS-HPT/Drd5质粒能够下调心脏中NADPH氧化酶的表达，抑制线粒体生成的ROS同时改善线粒体功能和增加自噬。
(2)给药方法：
TAC组：按照体重，通过尾静脉注射给与不同体积的水。
TAC+SS-HPT/Drd5 siRNA组：按照体重，通过尾静脉注射给与不同体积的SS-HPT/Drd5 siRNA复合物。
TAC+SS-HPT/Drd5质粒组：按照体重，通过尾静脉注射给给与相应剂量的SS-HPT/Drd5质粒复合物
结果：TAC+SS-HPT/Drd5质粒组小鼠心脏D5R的表达显著升高，NADPH氧化酶活性降低，ROS的产生减少，改善线粒体功能和增加自噬。研究说明心脏D5R的过表达能够通过抑制NADPH氧化酶的活性减少ROS的产生，并且改善自噬从而对心肌功能产生一定的保护作用。
2、D5R-聚氨基糖苷类基因载体的复合物能够治疗心肌肥厚
在体内形成了稳定的D5R基因过表达系统
此发明中，我们首次将D5R基因与聚氨基糖苷类基因载体与连接，形成稳定的纳米复合物，通过TAC造心肌损伤模型，尾静脉注射后纳米复合物随着血流靶向心肌损伤部位，形成稳定的D5R基因过表达系统。我们通过使用荧光染料将该纳米复合物进行标记，可视化的观测到了D5R-聚氨基糖苷类基因载体的复合物在心脏中的大量聚集，同时也检测到了D5R在心脏中的稳定过表达。
3、D5R-聚氨基糖苷类基因载体的复合物能够逆转肥厚性型心肌病的发生发展。
本发明使用小鼠TAC模型和临床样本检查了心脏D5R的状态及其在肥厚性心肌病和心衰发生发展中的作用，证实了D5R对于心脏的保护作用在临床治疗中的重要意义。D5R-聚氨基糖苷类基因载体的复合物(SS-HPT/Drd5质粒)在体内具有强大的心脏富集和基因传递能力，而托普霉素的添加增强了其生物相容性和安全性。D5R-聚氨基糖苷类基因载体的复合物(SS-HPT/Drd5质粒)消除了ROS的产生，改善了自噬，保护线粒体，改善了心脏功能，减轻了压力负荷诱发的心肌肥厚导致的炎症和纤维化。
本发明的有益效果包括但不下限于：
从根本上改善心脏功能，逆转心肌重构。压力负荷致心肌肥厚的过程中，氧化应激水平逐渐升高，线粒体自噬改变，线粒体能量调节发生变化。D5R能够通过抑制氧化应激、调节线粒体自噬等机制，从而改善心肌凋亡，改善能量代谢和心肌收缩力，延缓病程，从源头上改善了能量代谢和心肌收缩。
D5R-聚氨基糖苷类基因载体的复合物无毒副作用。本发明使用的聚氨基糖苷类基因载体具有超支化结构，含有托普霉素单体，能够有效抗菌抗感染，并且还含有二硫键能够与大分子形成稳定的化合物。在体内能够稳定递呈DrD5基因到达心脏组织，而不对其他器官产生影响。
本发明提供的D5R-聚氨基糖苷类基因载体的复合物中所用原料、试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 D5R-聚氨基糖苷类基因载体的纳米复合物的制备
1.多巴胺D5R质粒合成
Drd5的序列(如SEQ ID No.1所示)：
aacctgtgtc tttgtacagt caaagggtct gagttgggag aaggcaccta gatatgctccaccatagcgt tctggtgttt cctgtcatcc ctgaagcctc cgagttctta taacaggggc ttaaagactgtagcattgag atatgaaggc tcgtagttattgtccagttc agaggacatt aattccaggtatctggaacttagaacaaat cctcatgccc tcaccatggc aacagggctc acctcctctgtctcatacctctccctcccgtggccactat tgctacagat atcctgaccc ttttacctctttatcaaata agctcactctgccccagggc ctttacatgg gcttactttc ctccaagatg acaactcatc ctgaagcagc ttttcccttcaatccagcta ctccctcttttgttattctg tttgatttta tttatagcatttagcactgtatgacattgtttattttgaa attgtttatttctctctcct caataatata agcccaagaa agataaggaatatgttttta attctgtttc tgtccccggg ccctagaata gggtctggga gatggttgca gcagaatccctagctgaaat ggcaatcttg tgctaattag aaaaaaagag ctcccttgcc cccgtctctgtttctttttttttttttttt agatggaatc tccctctgtt accgaggctg gagtgcagtg gtgtgatcttgaagagagcc ctttcttgat atactttatc atcttctgct agaagttttt ctatactcattataaaaacccaccctatct gtcacttaca caccatgtattgtcttgctt ccaccccatc aaaaatgctt gtggaatgaatggattggtg aaagtcaggg ggactggaac atctgaaaac aaatgtcagt gtgtggccag cgtctgtgcacctttcttgg ttgattgaaa(由公司合成)。
2.D5R-聚氨基糖苷类基因载体的复合物的制备：
2.1羟乙基二硫二缩水甘油醚(HDDE)的合成
实验器材：圆底烧瓶，搅拌仪，离心管
实验试剂：去离子水，2-羟乙基二硫化物,氢氧化钠,四丁基溴化铵，环氧氯丙烷
实验步骤：
a.在烧瓶中加入0.59mL2-羟乙基二硫化物(5mmol,0.59mL)，600mg氢氧化钠(15mmol，600mg)和16mg四丁基溴化铵(0.05mmol，16mg)缓慢加入圆底烧瓶中。
b.将反应混合物在40℃搅拌充分至溶解。
c.将1.18mL环氧氯丙烷(15mmol，1.18mL)缓慢滴加到上述混合物中，继续搅拌3小时。
d.静置一段时间后，使用柱色谱法纯化HDDE的产物(乙酸乙酯/正己烷＝4/1)
2.2氨基糖苷类超支化聚合物的制备
实验器材：圆底烧瓶，搅拌仪，离心管
实验试剂：去离子水，妥布霉素，三乙胺，乙二胺
实验步骤:
a.取5mL DMSO,加入1mmol，467mg妥布霉素，搅拌混匀后，加入2.5mmol，665mgHDDE，搅拌均匀。
b.通过鼓入氮气流将反应混合物脱气10分钟，然后添加300μL TEA.
c.随后在氮气保护下不断搅拌，40℃进行反应。
d.24小时后，将过量的ED(1mL)加入到混合物中，在60℃下反应1小时来终止超支化反应。
e.用去离子水将粗产物透析(MWCO 1000)以除去未反应的小分子，并将超支化产物(SS-HPT)冻干。
2.3聚氨基糖苷类超支化聚合物连接D5R
实验器材：涡旋仪，离心管
实验试剂：去离子水，SS-HPT,D5质粒、siRNA
实验步骤:
a.将2.5nmol的D5质粒或者siRNA溶于100ul无RNA酶水中。
b.将100ul上述水溶液缓慢加入1.33mgsSS-HPT材料中.
c.每隔5min涡旋一次，共30min，使其充分络合,制得D5R-聚氨基糖苷类基因载体的复合物
实施例2 肥厚性心肌病模型小鼠实验
动物：6-8周龄的雄性C57小鼠30只。
实验动物饲料：正常饲料
药物：D5R-聚氨基糖苷类基因载体的复合物
仪器和试剂：Trifoil
Figure BDA0002457535300000062
成像仪，透射电子显微镜，
实验方法：
(1)TAC的鼠模型的制备：
将C57BL/6J小鼠麻醉后，去除颈部和胸部毛发，再用优碘和酒精清洗，仰卧位置于实验台上，用加热垫使温度保持在37℃。水平切开胸骨上切迹皮肤0.5～1.0cm。拨开胸腺，在胸骨近端部分，进行2～3mm的纵向切割。这为低放大倍率观察主动脉弓提供了视野。一端带有圈套的线从右无名小管的根部和左颈总动脉之间的主动脉下穿过。6/0号缝合线绑在圈套上将线从主动脉拉出。弯曲的27G平头针头放置到主动脉弓旁，然后紧贴针和主动脉周围缝合。结扎后，迅速取出针。闭合皮肤，敷上医用敷料，小鼠放在暖垫上恢复，直到完全清醒。假手术组，除不结扎，其他相同。完成手术6周后，称体重，对假手术组及TAC手术组进行小鼠心脏和左右侧颈总动脉超声检查。获得M型超声心动图像，对于舒张期室间隔、舒张期左室后壁、射血分数、缩短分数等心脏功能指标进行测定。
(2)给药方法：
TAC组：按照体重，通过尾静脉注射给与不同体积的水。
TAC+SS-HPT/Drd5 siRNA组：按照体重，通过尾静脉注射给与不同体积的SS-HPT/Drd5 siRNA复合物。
TAC+SS-HPT/Drd5质粒(D5R-聚氨基糖苷类基因载体的复合物)组：按照体重，通过尾静脉注射给与相应剂量的SS-HPT/Drd5质粒复合物
效果例1 SS-HPT/Drd5复合物是有效的的基因递送系统
首先，SS-HPT能够有效地将Drd5质粒靶向运输至TAC小鼠的心脏损伤部位。将Cy7荧光与SS-HPT/Drd5质粒耦连后，通过尾静脉注射至正常C57小鼠以及TAC小鼠体内，Trifoil
Figure BDA0002457535300000063
成像仪拍摄结果显示，TAC小鼠中心脏的荧光比对照小鼠高大约两倍，但两组的肝脏中的荧光相似，肾脏和其他器官的信号非常微弱，这证实了SS-HPT/Drd5复合物在受损心脏中的富集程度高于其他器官，并且在TAC小鼠中的募集度也远远高于正常鼠。这说明SS-HPT/Drd5质粒复合物确实能够有效的靶向到达TAC小鼠的心脏损伤部位。如图1所示。
其次，SS-HPT/Drd5质粒复合物能够在心脏中稳定的表达。Western Blot实验以及免疫组化实验证实(图2、表1～表2)，C57小鼠进行TAC手术之后，心脏D5R的表达减少，尾静脉注射心脏靶向药物SS-HPT/Drd5 siRNA后，会进一步下调D5R的表达，然而尾静脉注射心脏靶向复合物SS-HPT/Drd5质粒后会上调D5R的表达(肾脏中未观察到这种作用)。上述结果不仅说明D5R-聚氨基糖苷类基因载体的复合物能够将外源D5R基因高效的靶向运输至心脏，而且能够使其在心脏中稳定的表达。
表1图2(a)数据
Figure BDA0002457535300000061
Figure BDA0002457535300000071
表2图2(a)数据
Figure BDA0002457535300000072
效果例2 SS-HPT/Drd5质粒能够有效逆转肥厚型心肌病(HCM)
心脏外观结构特征以及HE染色结果均证实(图3、表3～表7)，TAC手术引起的心脏肥大能够被SS-HPT/Drd5 siRNA进一步加剧，SS-HPT/Drd5质粒复合物能够有效改善TAC以及SS-HPT/Drd5 siRNA引起的心脏肥大，同时WGA染色也表明了，SS-HPT/Drd5质粒对心肌细胞肥大的改善作用。心脏超声结果也显示，SS-HPT/Drd5质粒复合物也能够改善SS-HPT/Drd5 siRNA小鼠的收缩期和舒张期左心室内径增大、收缩期和舒张期左心室内体积增加以及左心室射血分数的降低。以上结果均说明，SS-HPT/Drd5质粒复合物能够有效逆转TAC小鼠的肥厚性心肌的发生发展。
表3图3(c)数据
Figure BDA0002457535300000073
Figure BDA0002457535300000081
表4图3(e)数据
Figure BDA0002457535300000082
表5图3(f)数据
Figure BDA0002457535300000083
Figure BDA0002457535300000091
表6图3(g)数据
Figure BDA0002457535300000092
表7图3(h)数据
Figure BDA0002457535300000093
效果例3 SS-HPT/Drd5质粒能够抑制心肌NADPH氧化酶活性
图4表明，TAC手术会增加心脏中的ROS的产生、NADPH氧化酶活性以及H2O2产生，SS-HPT/Drd5 siRNA使得上述情况进一步恶化，而SS-HPT/Drd5质粒复合物的则能够降低上述产物的表达，由此可见SS-HPT/Drd5质粒复合物能够通过抑制氧化应激从而达到治疗效果。
表8图4(a)数据
Figure BDA0002457535300000101
表9图4(b)数据
Figure BDA0002457535300000102
表10图4(c)数据
Figure BDA0002457535300000111
表11图4(e)数据
Figure BDA0002457535300000112
表12图4(e)数据
Figure BDA0002457535300000113
Figure BDA0002457535300000121
表13图5(b)数据
Figure BDA0002457535300000122
表14图5(c)数据
Figure BDA0002457535300000123
Figure BDA0002457535300000131
表15图5(e)数据
Figure BDA0002457535300000132
表16图5(f)数据
Figure BDA0002457535300000133
Figure BDA0002457535300000141
表17图6(b)数据
Figure BDA0002457535300000142
表18图6(b)数据
Figure BDA0002457535300000143
表19图6(b)数据
Figure BDA0002457535300000151
表20图6(c)数据
Figure BDA0002457535300000152
表21图6(d)数据
Figure BDA0002457535300000153
Figure BDA0002457535300000161
Figure BDA0002457535300000171
Figure BDA0002457535300000181
Figure BDA0002457535300000191
Figure BDA0002457535300000201
Figure BDA0002457535300000211
Figure BDA0002457535300000221
Figure BDA0002457535300000231
效果例4 SS-HPT/Drd5质粒防止心肌内质网应激和凋亡
内质网应激(ER)是与多种疾病(包括心脏肥大和心力衰竭)相关的进化保守的细胞反应。TAC手术诱导小鼠心脏ER的标志物高表达，SS-HPT/Drd5 siRNA进一步上调了TAC小鼠中这些与ER相关的蛋白的表达，但SS-HPT/Drd5质粒使这些ER相关蛋白的表达显著降低(值接近对照值)，上述结果证实，D5R可以通过减少由NADPH氧化酶和线粒体以及内质网应激引起的心脏ROS产生来改善心肌功能。
效果例5 SS-HPT/Drd5质粒改善心肌细胞自噬
自噬是一种保守的过程，可降解功能障碍的蛋白质和细胞成分，在心脏肥大和心力衰竭中起着复杂而重要的作用。SS-HPT/Drd5质粒中自噬markerP62和ATG5水平升高，证实D5R依赖性自噬的增加是心脏保护性应答。但也有研究显示过度自噬能够加剧心衰的发生，我们的研究也发现，SS-HPT/Drd5siRNA使得心肌组织自噬加剧，而在人心衰病人的心肌组织中同样发现了过度自噬的现象，因此也提示我们，需要在心肌肥厚的早期给予小鼠SS-HPT/Drd5质粒有助于改善自噬。
氧化应激会加速炎症和细胞凋亡，进而导致心肌细胞肥大和成纤维细胞增殖，从而导致心脏重塑。我们发现，TAC小鼠的心肌纤维化标志物(COL1a，MMP2和MMP9)以及促凋亡蛋白(BAX)表达显著升高，SS-HPT/Drd5 siRNA进一步诱导上述标志物的高表达。SS-HPT/Drd5质粒能够有效抑制心肌纤维化以及凋亡蛋白的表达。上诉结果提供了SS-HPT/Drd5质粒能修复心脏损伤并改善心脏功能的有力证据。或将在HCM或心力衰竭患者的临床管理中提供早期D5R补充治疗的理由。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国医学科学院医学实验动物研究所
<120> D5R-聚氨基糖苷类基因载体的复合物及其应用
<130> MP1934059
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 960
<212> DNA
<213> Drd5
<400> 1
aacctgtgtc tttgtacagt caaagggtct gagttgggag aaggcaccta gatatgctcc 60
accatagcgt tctggtgttt cctgtcatcc ctgaagcctc cgagttctta taacaggggc 120
ttaaagactg tagcattgag atatgaaggc tcgtagttat tgtccagttc agaggacatt 180
aattccaggt atctggaact tagaacaaat cctcatgccc tcaccatggc aacagggctc 240
acctcctctg tctcatacct ctccctcccg tggccactat tgctacagat atcctgaccc 300
ttttacctct ttatcaaata agctcactct gccccagggc ctttacatgg gcttactttc 360
ctccaagatg acaactcatc ctgaagcagc ttttcccttc aatccagcta ctccctcttt 420
tgttattctg tttgatttta tttatagcat ttagcactgt atgacattgt ttattttgaa 480
attgtttatt tctctctcct caataatata agcccaagaa agataaggaa tatgttttta 540
attctgtttc tgtccccggg ccctagaata gggtctggga gatggttgca gcagaatccc 600
tagctgaaat ggcaatcttg tgctaattag aaaaaaagag ctcccttgcc cccgtctctg 660
tttctttttt tttttttttt agatggaatc tccctctgtt accgaggctg gagtgcagtg 720
gtgtgatctt gaagagagcc ctttcttgat atactttatc atcttctgct agaagttttt 780
ctatactcat tataaaaacc caccctatct gtcacttaca caccatgtat tgtcttgctt 840
ccaccccatc aaaaatgctt gtggaatgaa tggattggtg aaagtcaggg ggactggaac 900
atctgaaaac aaatgtcagt gtgtggccag cgtctgtgca cctttcttgg ttgattgaaa 960

Claims (10)

1.心脏多巴胺D5受体在制备保护心肌和/或治疗心肌肥厚的制剂和/或药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述心脏多巴胺D5受体过表达。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，心脏多巴胺D5受体通过下调心脏中NADPH氧化酶的表达，抑制线粒体生成的ROS，改善线粒体功能和/或增加自噬起到保护心肌的作用。
4.D5R-聚氨基糖苷类基因载体的复合物，其特征在于，包括D5R和聚氨基糖苷类基因载体；
所述聚氨基糖苷类基因载体的制备方法为：
步骤1：取2-羟乙基二硫化物，氢氧化钠，四丁基溴化铵混合后与环氧氯丙烷制得羟乙基二硫二缩水甘油醚；
步骤2：取所述羟乙基二硫二缩水甘油醚与DMSO，妥布霉素，三乙胺混合发生超支化反应，再计入过量的乙二胺终止反应。
5.如权利要求4所述的复合物，其特征在于，步骤1中2-羟乙基二硫化物，氢氧化钠，四丁基溴化铵与环氧氯丙烷的摩尔比为1:3:0.01:3，所述混合为40℃搅拌至溶解。
6.如权利要求4所述的复合物，其特征在于，步骤2中，以mL/mg/mg/μL/mL计，DMSO、妥布霉素、所述羟乙基二硫二缩水甘油醚、三乙胺、乙二胺的比例为5:467:665:300:1；所述超支化反应为在氮气保护下，于40℃反应24h；所述终止反应的条件为60℃反应1h。
7.如权利要求4至6任一项所述的复合物，其特征在于，其制备方法为：取所述D5R与无RNA酶水混合后，与所述聚氨基糖苷类基因载体络合。
8.如权利要求4至7任一项所述的复合物在制备保护心肌和/或治疗心肌肥厚的制剂和/或药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述心脏多巴胺D5受体过表达；所述心脏多巴胺D5受体通过下调心脏中NADPH氧化酶的表达，抑制线粒体生成的ROS，改善线粒体功能和/或增加自噬起到保护心肌的作用。
10.保护心肌和/或治疗心肌肥厚的制剂和/或药物，其特征在于，包括如权利要求4至7任一项所述的复合物以及药学上可接受的辅料。
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