CN114288387A - Humanin衍生物HNG在制备治疗心衰药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Humanin衍生物HNG在制备治疗心力衰竭药物中的应用。本发明通过ISO诱导建立心脏衰竭小鼠模型，同时对实验小鼠注射HNG，经实验证实HNG能够预防和改善病理性条件下的心功能恶化，能够改善病理性条件下的心脏的增厚和扩大，能够减缓TGF‑β的上调，从而缓解心肌纤维化和心室重塑。HNG在心力衰竭早期应用可以预防或延缓心力衰竭的发生发展，当心力衰竭晚期时应用可以逆转心衰表现，HNG有望应用于新的治疗心衰的药物。

Description

Humanin衍生物HNG在制备治疗心衰药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及Humanin衍生物HNG在制备治疗心衰药物中的应用。

背景技术

心力衰竭(heartfailure)简称心衰，是指由于心脏的收缩功能和(或)舒张功能发生障碍，不能将静脉回心血量充分排出心脏，导致静脉系统血液淤积，动脉系统血液灌注不足，从而引起心脏循环障碍症候群，此种障碍症候群集中表现为肺淤血、腔静脉淤血。心力衰竭并不是一个独立的疾病，而是心脏疾病发展的终末阶段。根据心力衰竭发生的缓急，临床可分为急性心力衰竭和慢性心力衰竭。根据心力衰竭发生的部位可分为左心、右心和全心衰竭。还有收缩性或舒张性心力衰竭之分。

Humanin(HN)是线粒体基因当中编码16SrRNA基因中的一段产生的衍生肽，由24个氨基酸组成，是近年来在人体内发现的内源性多肽，能够保护神经细胞免于各种阿尔茨海默氏病相关因素诱导的凋亡。HN肽链的第14位氨基酸丝氨酸Ser被谷氨酸Gly取代的突变体[Glyl4]-Humanin(HNG)被发现具有很高的神经保护活性。

已有研究表明，HNG激活抗氧化防御机制，维持线粒体内膜电位，保护线粒体功能，维持线粒体结构；还有研究报道在大鼠心肌缺血再灌注之前给与HNG治疗，可以减轻脑组织线粒体功能障碍，但不能减轻脑屏障损伤和脑氧化应激反应；还有学者报道在心脏缺血再灌注过程中高剂量使用HNG可以缓解线粒体功能失调，从而发挥心脏保护作用；HNG可以提高右雷佐生在阿霉素导致的的心肌毒性中的保护作用；慢性HNG治疗可以防止小鼠年龄相关的心肌纤维化发展。

目前关于HNG在心脏相关方面研究主要集中在HNG在心脏缺血再灌注中的保护作用，可以和抗癌辅助药物右雷佐生协同抵抗化疗药物阿霉素产生的心脏毒性，长期使用可以缓解年龄相关的心脏纤维化。

然而并没有一个研究关注过HNG对于心力衰竭过程的影响，在早期应用是否可以预防或延缓心力衰竭的发生发展，当心力衰竭晚期时应用是否可以逆转心衰表现。

发明内容

本发明在研究过程中发现，在心力衰竭早期应用HNG可以预防或延缓心力衰竭的发生发展，当心力衰竭晚期时应用HNG可以逆转心衰表现。基于此，本发明要求保护如下技术方案：

Humanin衍生物HNG在制备治疗心力衰竭药物中的应用。

所述HNG的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述HNG预防和改善病理性条件下的心功能恶化。

所述HNG改善病理性条件下的心脏的增厚和扩大。

所述HNG减轻病理性条件下的心脏重塑。

所述HNG减缓TGF-β的上调，从而缓解心肌纤维化和心室重塑。

本发明的有益效果是：本发明通过ISO诱导建立心脏衰竭小鼠模型，同时对实验小鼠注射HNG，经实验证实HNG能够预防和改善病理性条件下的心功能恶化，能够改善病理性条件下的心脏的增厚和扩大，能够减缓TGF-β的上调，从而缓解心肌纤维化和心室重塑。HNG在心力衰竭早期应用可以预防或延缓心力衰竭的发生发展，当心力衰竭晚期时应用可以逆转心衰表现，HNG有望应用于新的治疗心衰的药物。

附图说明

图1是小鼠血清NT-proBNP水平检测结果。

图2是实验结束后小鼠心脏大体观察。

图3是小鼠心脏组织病理学分析图，其中，图a、b、c分别是对照组、模型组、治疗组的HE染色检测结果，图d、e、f分别是对照组、模型组、治疗组的天狼星红染色检测结果，图g、h、i分别是对照组、模型组、治疗组的WGA免疫荧光染色检测结果。

图4是实验小鼠的TGF-β的表达Western blot检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；所用生物、化学试剂，如无特殊说明，均为本领域常规试剂，均可通过商购获得。

实施例1

1实验材料和试剂

1.1实验动物

C57BL/6小鼠由华西医院病理研究室提供，选取8～10周龄C57BL/6雄性小鼠，体质量22～26g。

1.2主要实验试剂

异丙肾上腺素购自美国Sigma公司，根据HNG序列，共24个氨基酸，合成肽段，命名为HNG(SEQ ID NO.1：Met-Ala-Pro-Arg-Gly-Phe-Ser-Cys-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Ala)纯度≥95％。TGF-β、GAPDH抗体及Anti-rabbitIgG,HRP-linked抗体购自CST(Cell Signaling Technology,Inc)，WGA荧光抗体购自美国LifeTechnology公司，HE染色试剂盒、天狼星红染色试剂盒均购自中国珠海贝索生物技术有限公司，DAPI及荧光二抗购自美国Invitrogen公司，DAB显色剂购自丹麦Dako公司。

2实验方法

2.1实验组处理

将15只成年C57BL/6雄性小鼠按照随机数字表法分为对照组、模型组(ISO组)及HNG治疗组，分别是3只，6只，6只。模型组及HNG治疗组均腹腔注射异丙肾上腺素(ISO)60mg/kg，治疗组额外注射HNG 4mg/kg，每天1次，持续注射28d。对照组腹腔注射等体积的生理盐水，每天1次，持续注射28d。第29天每组小鼠进行超声心动图检测，评估模型建立情况。

2.2超声心动图检测

各组小鼠连续28d腹腔注射异丙肾上腺素、ISO+HNG或生理盐水后进行超声心动图检测。小鼠鼻腔吸入2％异氟烷进行全身麻醉，将麻醉后的小鼠左侧卧位固定于操作台上，然后将高频探头置于胸骨旁乳突肌水平心室短轴切面采集图像。测量反应舒张功能的相关指标:舒张末期左心室内径(LVEDd)、舒张末期左心室容积(EDV)及舒张末期左室后壁厚度(LVPWd)等，测量反应收缩功能的相关指标:收缩末期左心室内径(LVESd)、收缩末期左心室容积(ESV)、射血分数(EF)及左心室短轴缩短率(FS)等。超声检测后，在小鼠麻醉状态下断颈处死小鼠，立即打开胸腔游离心脏，并称取全心质量。取心脏中段组织浸泡于10％中性福尔马林固定液48h，用于观察病理组织改变；剩余心脏组织在－80℃条件下保存，用于后续相关检测。

2.3心脏大体观及心脏质量与体质量比

称量小鼠，处死后游离完整心脏组织观察心脏外观，称量全心质量，计算全心质量(mg)/体质量(g)。

2.4心脏组织病理分析

将已固定的心脏组织进行包埋，然后做4μm连续切片，进行脱蜡处理后进行HE染色观察心肌细胞形态及其排列等情况，进行天狼星红染色，镜下观察心肌纤维化，进行WGA免疫荧光染色显示心肌细胞膜，抗体浓度为1∶300。

2.5 Western blot检测

电子天平称取15～20mg小鼠心脏组织置于已加入组织强裂解混合液的匀浆管中进行匀浆，4℃冰箱内静置1h后，放入4℃离心机以12000r/min进行离心10min，提取上清液，用BCA检测试剂盒检测总蛋白浓度后加入缓冲液，混匀后，于沸水浴5～10min。采用SDS-PAGE配置凝胶，蛋白上样后，经过电泳、转膜、封闭后，添加一抗GAPDH(1∶4000)、TGF-β(1∶1000)4℃过夜孵育，将一抗取出置于室温下复温30min后，二抗(1∶5000)孵育1h，ECL显影，凝胶成像仪器曝光。采用Image Lab软件分析条带灰度值，用目的蛋白与内参蛋白的比值来衡量蛋白的相对表达量。

2.6统计学分析

采用GraphPad Prism 7.0统计软件进行分析，两组间数据比较采用t检验，多组间数据比较采用单因素方差分析。检验水准:α＝0.05。

3实验结果

3.1超声心动图

所有小鼠在诱导开始算起的第14天和第28天行超声心动图检测。如表1所示，结果显示，在第14天，与对照组比较，模型组小鼠出现明显的心功能恶化，体现在心腔扩大，心脏射血功能明显下降，LVESd及ESV明显增加，EF及FS明显降低，提示异丙肾上腺素诱导了小鼠的心功能恶化，然而HNG治疗组的心功能还维持在一个稳定的状态；在第28天，模型组小鼠的心功能继续恶化，而与模型组比较，HNG治疗组LVESd及ESV明显更低，EF及FS明显更高，结果显示HNG的治疗可以预防和改善异丙肾上腺素诱导的小鼠心功能恶化。

表1不同时间点异丙肾上腺素对各组小鼠心功能的影响

3.2小鼠血清NT-proBNP水平

如图1所示，与对照组比较，模型组及HNG治疗组的血清NT-proBNP水平都有升高，而模型组显然更明显；与模型组相比，HNG治疗组血清NT-proBNP水平明显下降。结果显示：HNG可以维持异丙肾上腺素诱导所致的的小鼠心功能恶化，但不能完全维持。

3.3小鼠心脏大体观察

如图2所示，与对照组比较，模型组小鼠心脏大体外观明显增大，并且小鼠的心脏质量与身体质量的比值明显增加；与模型组比较，HNG治疗组小鼠的以上指标明显有所缓解。结果显示：维持HNG治疗可以改善心脏的增厚和扩大。

3.4小鼠心脏组织病理学分析

HE染色、天狼星红染色及WGA免疫荧光染色检测结果显示(图3)：与对照组比较，模型组出现了明显的心肌细胞排列紊乱、心肌纤维化以及心肌细胞的肥大；与模型组比较，HNG治疗组心肌细胞排列紊乱、心肌纤维化及心肌细胞肥大等情况有明显改善。结果显示：HNG的维持治疗可以明显减轻异丙肾上腺素诱导的小鼠心脏重塑。

3.5心肌纤维化关键基因的表达

为了更进一步确定HNG是如何改善心肌纤维化的发展，我们检测了纤维化关键基因TGF-β的表达(以GAPDH为参照)。Western blot检测结果(图4)显示：与对照组相比，模型组的TGF-β表达水平显著提高，而HNG治疗组的TGF-β水平虽然有所上升，但相较于模型组，表达量还是低于模型组的。这个结果表明HNG的治疗可以减缓TGF-β的上调，从而缓解心肌纤维化和心室重塑。

序列表

<110> 重庆医科大学

<120> Humanin衍生物HNG在制备治疗心衰药物中的应用

<160> 1

<210> 1

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> HNG氨基酸序列

<400> 1

Met Ala Pro Arg Gly Phe Ser Cys Leu Leu Leu Leu Thr Gly Glu Ile

1 5 10 15

Asp Leu Pro Val Lys Arg Arg Ala

20

Claims (6)

1.Humanin衍生物HNG在制备治疗心力衰竭药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述HNG的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述HNG预防和改善病理性条件下的心功能恶化。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述HNG改善病理性条件下的心脏的增厚和扩大。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述HNG减轻病理性条件下的心脏重塑。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述HNG减缓TGF-β的上调，从而缓解心肌纤维化和心室重塑。

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