ES2220736T3

ES2220736T3 - Uso de inhibidores de caspasa-3 o desoxirribonucleasa activada por caspasa (cad) para tratar enfermedades cardiacas.

Info

Publication number: ES2220736T3
Application number: ES01913667T
Authority: ES
Inventors: Karl-Ludwig Laugwitz; Alessandra Moretti; Martin Ungerer
Original assignee: Procorde GmbH
Current assignee: Procorde GmbH
Priority date: 2000-02-16
Filing date: 2001-02-16
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2021-02-16
Also published as: JP2003522801A; US20030130216A1; AU2001239183A1; WO2001060400B1; EP1255559A2; WO2001060400A2; ATE265227T1; DE50102129D1; DK1255559T3; WO2001060400A3; EP1255559B1; DE10006889A1

Abstract

Un procedimiento de rastreo para identificar un compuesto que sea eficaz como inhibidor de la caspasa-3 o la desoxirribonucleasa activada por caspasa (CAD) para incrementar la contractilidad de un corazón en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca, comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas: (a) poner en contacto un compuesto de ensayo que es posiblemente adecuado como inhibidor con caspasa-3 o CAD o con el gen que codifica la caspasa-3 o CAD; y (b) determinar la actividad caspasa-3 o CAD residual o la disminución de la expresión génica; (c) identificar un compuesto de ensayo como inhibidor potencial cuando éste disminuye o inhibe la actividad de la caspasa-3 o CAD o la expresión del gen que codifica la caspasa-3 o CAD, y (d) determinar un posible incremento de la contractilidad mediante la administración a un modelo animal o a una célula muscular de corazón, y (e) identificar un inhibidor potencial como compuesto que es eficaz como inhibidor de la caspasa-3 o CAD cuando la contractilidad resulta incrementada por la administración.

Description

Uso de inhibidores de caspasa-3 o desoxirribonucleasa activada por caspasa (CAD) para tratar enfermedades cardíacas.

La presente invención se refiere a un procedimiento de rastreo para identificar un inhibidor de la caspasa-3 o de una desoxirribonucleasa activada por caspasa (CAD) para la prevención o el tratamiento de las enfermedades cardíacas, siendo las enfermedades cardíacas especialmente la insuficiencia del ventrículo izquierdo. Un ejemplo del inhibidor es ICAD. La administración del inhibidor puede ser efectuada especialmente por medio de un adenovirus vector que contiene el gen que codifica el inhibidor de una forma expresable. La presente invención se refiere a los procedimientos para identificar inhibidores para la aplicación terapéutica anterior, es decir compuestos que inhiben la caspasa-3 o CAD o la expresión de los genes que codifican esos compuestos.

La apoptosis es un forma controlada genéticamente de muerte celular que es esencial para el desarrollo normal y el equilibrio fisiológico de los organismos. Muchas enfermedades degenerativas están asociadas con niveles anormalmente elevados de apoptosis. Ha sido posible identificar la muerte celular programada de los cardiomiocitos en numerosas enfermedades cardiovasculares, por ejemplo en el infarto de miocardio y en la insuficiencia cardíaca congestiva (insuficiencia cardíaca congestiva, CHF en sus siglas en inglés). La apoptosis podría ser el resultado de una estimulación del crecimiento de los cardiomiocitos adultos prolongada que -como tejido diferenciado terminalmente- ya no son susceptibles de división. Como compensación para los requerimientos hemodinámicos cambiados crónicamente con respecto a la falta de músculo cardíaco, se produce una reacción hipertrófica, y esto último está mediado por la regulación hacia arriba generalizada y local del sistema adrenérgico y del sistema renina/angiotensina y por diversas citoquinas. Sin embargo, no se han utilizado hasta ahora terapias para las enfermedades cardíacas antes mencionadas que pretendan inhibir la apoptosis. Las intervenciones farmacológicas llevadas a cabo hasta ahora en los casos de tales enfermedades cardíacas, cuyas intervenciones se basan predominantemente en el bloqueo \beta-adrenérgico, no tienen éxito en todos los casos o manifiestan a menudo una acción inadecuada.

En WO 99 10501 se describe el papel de la desoxirribonucleasa activada por caspasa (CAD = CPAN = DFF40) en la apoptosis celular y también su regulación por ICAD (=DFF45) (página 8, párrafos 2. y 3.). Se menciona la inhibición de CAD por la proteína ICAD (ejemplo 8), mediante transfección con el gen ICAD mutado cuyo producto no puede ser escindido por la caspasa-3 (ejemplo 9), por las hebras CAD antisentido (página 10, párrafo 3., reivindicaciones 36 y 39) y por los anticuerpos mono- y policlonales dirigidos a CAD (página 13, párrafo 4., reivindicación 35). En cuanto a los vectores de expresión para la transfección, no se describe un adenovirus. Se considera que estos inhibidores de la apoptosis son útiles para el tratamiento del infarto cardíaco o el infarto cerebral puesto que esas patologías inducen lesión celular por apoptosis (página 12, último párrafo). Se describe y se reivindica un análisis para identificar inhibidores de CAD, donde al menos un compuesto de ensayo se pone en contacto con CAD y donde al mismo tiempo se mide la capacidad de CAD para la fragmentación del ADN (página 12, párrafo 4., reivindicaciones 24-27, 41).

En WO 96 33268 se describe un método para la identificación de sustancias que modulan la actividad de la caspasa-3 (=apopaína=CPP32). Este método comprende mezclar la caspasa-3 con una sustancia que se va a someter a ensayo y determinar la actividad caspasa-3 (página 4, líneas 17-20, reivindicación 4). Se mencionan los moduladores de la actividad de caspasa-3 y las moléculas antisentido de caspasa-3 para el tratamiento de las lesiones cardiovasculares (página 4, línea 25 - página 5, línea 3, página 6, líneas 9-27). Las moléculas antisentido pueden ser ADN o ARN y pueden ser introducidas en células mediante microinyección, encapsulación en liposomas o vectores de expresión (página 14, líneas 1-10). Se describe un adenovirus como vector para la transferencia de un gen de caspasa-3 (página 14, líneas 12 a 16).

Por consiguiente, la invención está basada sustancialmente en el problema técnico de proporcionar medios alternativos que tengan uso en la terapia farmacológica de las enfermedades cardíacas.

Ese problema técnico ha sido resuelto por la provisión de realizaciones caracterizadas por las reivindicaciones de la patente. La apoptosis del músculo cardíaco es una máquina de suicidio celular que está regulada de una manera muy compleja y en la que dos rutas señal principales conducen a la activación de la familia de la caspasa y a la promoción de la translocación de la ADNasa activada por caspasa (CAD) en el núcleo: (a) señalización del "receptor de muerte" (v.g. receptores Fas, TNF y DR3-DR6) y (b) liberación de citocromo b a partir de la mitocondria y posterior transactivación de la procaspasa 9 por Apaf. La familia de la caspasa de las cisteína proteasas regula el comienzo de la apoptosis en mamíferos. La caspasa-3 es la enzima clave y escinde las dianas localizadas aguas arriba que están implicadas en la expresión del fenotipo apoptótico, v.g., gelsolin, PAK2, láminas nucleares y, especialmente, la subunidad inhibidora del factor de fragmentación de ADN (ICAD). El rasgo bioquímico más importante de la apoptosis es la escisión de ADN cromosómico en unidades nucleosomales, que parecen ser el evento final de la apoptosis. La nucleasa responsable de la degradación del ADN en la apoprosis es CAD. CAD es producida en forma de un complejo con ICAD para la inhibición de su actividad ADNasa. La caspasa-3 activada aguas arriba por los estímulos apoptóticos escinde ICAD, que después permite que CAD entre en el núcleo y degrade el ADN cromosómico. Durante las investigaciones que condujeron a la presente invención, se encontró que las actividades de la caspasa-3 y CAD, las dos moléculas clave en el proceso de la apoptosis miocárdica, aumentaban en un modelo animal de CHF, en el que los cambios del nivel hemodinámico y bioquímico son iguales a los de la correspondiente enfermedad del corazón humano. La estimulación de la caspasa-3 conduce por último a la activación de CAD, y ambas enzimas son requeridas por lo tanto para que la insuficiencia cardíaca progrese. Ha sido posible mostrar en las investigaciones que la actividad de la caspasa-3 y de CAD podía ser inhibida significativamente por la expresión mediada por adenovirus de p35 o ICAD en los cardiomiocitos. La inhibición de esas enzimas clave también fue reflejada por una fragmentación reducida del ADN por ICAD y, aunque en un grado menor, por p35. Puesto que la expresión de ICAD era claramente más eficaz para inhibir la fragmentación de ADN in vitro, la expresión del transgen que codifica ICAD también fue estudiada in vivo en conejos con insuficiencia cardíaca. Si bien la infección de miocardio de conejo con adenovirus de control recombinantes no tenía efecto sobre la apoptosis de los cardiomiocitos, la función hemodinámica de los corazones con insuficiencia que expresaban ICAD era al menos parcialmente restaurada (Fig. 6). Por tanto fue posible observar una contractibilidad mejorada y una presión diastólica final reducida del ventrículo izquierdo con una reducción de la fragmentación del ADN inducida por la caspasa-3. Se supone que, en los síndromes anteriores, la mayor parte de los cardiomiocitos están en estado pre-apoptótico con actividades incrementadas de las enzimas implicadas en la apoptosis, que expresan una preparación de esas células a la apoptosis, pero no indica aún que ese proceso haya tenido lugar realmente. Los presentes resultados muestran, sin embargo, que la apoptosis miocárdica contribuye al progreso de la insuficiencia cardíaca y que la prevención de la apoptosis en los cardiomiocitos tiene una función útil, es decir la prevención de la apoptosis es claramente un objetivo atractivo para la intervención terapéutica. Por medio de los resultados con corazones con insuficiencia infectados con Ad-p35 o Ad-ICAD, también es posible mostrar que un enfoque anti-apoptótico en el caso de la insuficiencia cardíaca no sólo evita la fragmentación del ADN nuclear, sino que también mantiene la organización en sarcómeros y por tanto mejora la fuerza contráctil de las células del músculo cardíaco que todavía están vivas. Por consiguiente, para la intervención terapéutica en las enfermedades cardíacas comentadas antes, que están asociadas con la apoptosis de los cardiomiocitos, la administración de un factor que inhiba la actividad de CAD o de la caspasa-3, o del gen que las codifica, puede ser beneficiosa. Por otra parte, la posibilidad de inhibir la expresión del gen que codifica CAD o caspasa-3 también puede ser terapéuticamente útil. Semejante inhibición puede, por lo tanto, tener lugar a diversos niveles, por ejemplo a nivel genético ("knock out", inhibición de la traducción por ARN antisentido o por ribozimas) o a nivel proteico (por medio de anticuerpos inhibidores de CAD o de caspasa-3, ICAD, etc.).

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un procedimiento de rastreo para identificar un inhibidor de caspasa-3 o desoxirribonucleasa activada por caspasa (CAD) para la prevención o el tratamiento de las enfermedades cardíacas, especialmente de la insuficiencia cardíaca, especialmente la insuficiencia del ventrículo izquierdo.

El inhibidor es, por ejemplo, un compuesto que inhibe la expresión del gen que codifica CAD o caspasa-3, por ejemplo una ribozima o un ARN antisentido. Puesto que la secuencia de ácido nucleico completa del gen que codifica CAD o caspasa-3 es conocida, la persona experta en la técnica es capaz de identificar tales compuestos mediante procedimientos rutinarios y someter a ensayo su acción, por ejemplo, por medio de los procedimientos descritos en los Ejemplos más abajo.

Una realización mucho más preferida de la presente invención hace referencia por lo tanto a un procedimiento de rastreo para identificar un ARN antisentido que se caracteriza porque es complementario al ARNm transcrito por el gen que codifica CAD o caspasa-3, o a una porción del mismo, preferiblemente la región codificadora, y es capaz de unirse especialmente a ese ARNm, como resultado de lo cual la síntesis de CAD o caspasa-3 es reducida o inhibida. Una realización mucho más preferida adicional de la presente invención hace referencia a un procedimiento de rastreo para identificar una ribozima que se caracteriza porque es complementaria al ARNm transcrito por el gen que codifica CAD o caspasa-3, o a una porción del mismo, y es capaz de unirse específicamente a ese ARNm y escindirlo, como resultado de lo cual la síntesis de CAD o caspasa-3 es reducida o inhibida. Partiendo de las secuencias de CAD o caspasa-3 descritas, la persona experta en la técnica es capaz de preparar y utilizar ARN antisentido adecuados. Los procedimientos adecuados se describen en EP-B1 0.223.399 o EP-A1 0.458, por ejemplo. Las ribozimas son enzimas de ARN y constan de una única hebra de ARN. Son capaces de escindir otros ARN intermolecularmente, por ejemplo los ARNm transcritos por las secuencias que codifican CAD o caspasa-3. Tales ribozimas deben tener en principio dos dominios, (1) un dominio catalítico y (2) un dominio que es complementario al ARN diana y es capaz de unirse a este, lo que es un pre-requisito para la escisión del ARN diana. Partiendo de los procedimientos descritos en la literatura, es posible mientras tanto, construir ribozimas específicas que cortan un ARN deseado por un sitio concreto, pre-seleccionado (ver, por ejemplo, Tanner y col., en: Antisense Rsearch and Applications, CRC Press, Inc. (1.993), 415-426).

En una realización preferida adicional del procedimiento de rastreo según la invención para identificar los inhibidores de caspasa-3 o CAD, el inhibidor es el ICAD o Baculovirus-p35 descritos en los Ejemplos más abajo.

En una realización preferida adicional del procedimiento de rastreo según la invención para identificar los inhibidores de caspasa-3 o CAP, el inhibidor es un anticuerpo que se une a caspasa-3 o CAP, o un fragmento del mismo. Tales anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales, policlonales o sintéticos o fragmentos de los mismos. En relación con esto, el término "fragmento" representa todas las partes del anticuerpo monoclonal (v.g., Fab, Fv o fragmentos Fv de cadena sencilla) que tienen la misma especificidad epitópica que el anticuerpo completo. La preparación de tales fragmentos es conocida por la persona experta en la técnica. Los anticuerpos según la invención son preferiblemente anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos según la invención pueden ser preparados según procedimientos normalizados, en los que la proteínas caspasa-3 o CAP o un fragmento sintético de la misma sirve preferiblemente como inmunógeno. Los procedimientos para obtener anticuerpos monoclonales son conocidos por la persona experta en la técnica. El anticuerpo monoclonal puede ser un anticuerpo que se origina a partir de un animal (v.g. ratón), un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico o un fragmento del mismo. Los anticuerpos quiméricos que se asemejan a anticuerpos humanos o anticuerpos humanizados poseen una antigenicidad potencial reducida, pero su afinidad con respecto a la diana no está reducida. La preparación de los anticuerpos quiméricos y humanizados, o de anticuerpos que se asemejan a los anticuerpos humanos, ha sido descrita exhaustivamente (ver, por ejemplo, Queen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1.989), 10029, Y Verhoeyan y col., Science 239 (1.988), 1534). Las inmunoglobulinas humanizadas tienen regiones de estructura básica variable, que se originan sustancialmente a partir de una inmunoglobulina humana (referida como inmunoglobulina aceptora) y la complementariedad de las regiones determinantes, que se originan sustancialmente a partir de una inmunoglobulina no humana (v.g. de ratón) (referida como inmunoglobulina donadora). La región o las regiones constantes, cuando están presentes, también se originan sustancialmente a partir de una inmunoglobulina humana. Cuando se administran a pacientes humanos, los anticuerpos humanizados (así como los humanos) ofrecen numerosas ventajas sobre los anticuerpos de ratones u otras especies: (a) el sistema inmune humano no debe reconocer la estructura básica o la región constante del anticuerpo humanizado como foráneo, y la respuesta de los anticuerpos a semejante anticuerpo inyectado deberá ser por lo tanto menor que la respuesta a un anticuerpo de ratón completamente foráneo o un anticuerpo quimérico parcialmente foráneo; (b) puesto que la región efectora del anticuerpo humanizado es humana, interacciona mejor con otras partes del sistema inmune, y (c) los anticuerpos humanizados inyectados tienen una vida media que es sustancialmente equivalente a la de los anticuerpos humanos de origen natural, que permite administrar dosis más pequeñas y menos frecuentes en comparación con los anticuerpos de otras especies.

Preferiblemente los inhibidores mencionados antes no son administrados como tales si no que son administrados por medio de la terapia génica, es decir las secuencias de ADN que codifican esos inhibidores (v.g. ribozimas, ARN antisentido, anticuerpos, ICAD, Baculovirus-p35), preferiblemente insertados en un vector de expresión son llevadas al órgano diana. Por consiguiente, en la presente invención también se incluyen vectores de expresión que contienen secuencias de ADN que codifican esos inhibidores. El término "vector" hace referencia a un plásmido (pUC18, pBR322, pBlueScript, etc.), a un virus o a otro vehículo adecuado. Las secuencias de ADN están conectadas funcionalmente en el vector a elementos reguladores que permiten su expresión en células huésped procarióticas o eucarióticas. Además de los elementos reguladores, tales vectores contienen, por ejemplo, un promotor, típicamente un origen de replicación y genes específicos que permiten la selección fenotípica de una célula huésped transformada. Los elementos reguladores para la expresión en procariotas, por ejemplo E. coli, incluyen el promotor lac-, trp o el promotor de T7, y para la expresión en eucariotas el promotor AOX1 o GAL1 en levaduras y el promotor de CMV, SV40-, RVS-40, el intensificador de CMV o SV40 para la expresión en células animales. Las secuencias reguladoras adecuadas se describen adicionalmente en Goeddel: Gene Expresion Technology: Methods in Enzimology 185, Academic Press, San Diego, CA (1.990). Los ejemplos adicionales de los promotores adecuados son el promotor de la metalotioneína I y de la polihedrina. Entre los vectores de expresión adecuados para E. coli se incluyen, por ejemplo, pGEMEX, derivados de pUC, pGEX-2T, pET3b y pQE-8. Entre los vectores adecuados para la expresión en levadura se incluyen pY100 e Ycpad1, para la expresión en células de mamífero pMSXND, pKCR, pEFBOS, cDM8 y pCEV4 así como vectores que se originan a partir de pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo y pHyg.

Las secuencias de ADN descritas antes son insertadas preferiblemente en un vector adecuado para la terapia génica, por ejemplo, bajo el control de un promotor específico del tejido, y transferidas a las células. En una realización preferida el vector que contienen las secuencias de ADN descritas antes es un virus, por ejemplo, un adenovirus, un virus Vaccinia o un retrovirus. Los ejemplos de los retrovirus adecuados son MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV o GaLV. Los adenovirus son particularmente preferidos, especialmente aquellos que tienen las mutaciones E1 y/o E3 (deleciones), que también pueden tener adicionalmente una mutación E4 (deleción), o los adenovirus "gutless" (destripados). Los vectores adecuados para la terapia génica se describen adicionalmente en WO 93/04701, WO 92/22635, WO 92/20316, WO 92/19749 y WO 92/06180. Para los fines de la terapia génica, las secuencias de ADN según la invención también pueden ser transportadas a las células diana en forma de dispersiones coloidales. Entre estas se incluyen, por ejemplo, los liposomas o los lipoplejos (Mannino y col., Biotechniques 6 (1.988), 682).

Se pueden utilizar los procedimientos generales conocidos en el campo para la construcción de vectores de expresión que contienen aquellas secuencias de ADN y secuencias de control adecuadas. Entre tales procedimientos se incluyen, por ejemplo, los mecanismos de recombinación in vitro, los procedimientos sintéticos, así como los mecanismos de recombinación in vivo, como se describe en los libros de texto comunes.

Los compuestos anteriores, o las secuencias de ADN o los vectores que las codifican, son administrados opcionalmente junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores adecuados y la formulación de tales medicamentos son conocidos por la persona experta en la técnica. Entre tales portadores se incluyen, por ejemplo, soluciones de cloruro de sodio tamponadas con fosfato, agua, emulsiones por ejemplo emulsiones de aceite/agua, agentes humectantes, soluciones estériles, etc. La dosificación adecuada es determinada por el doctor que proporciona el tratamiento y depende de diversos factores, por ejemplo de la edad, el sexo y el peso del paciente, de la naturaleza y la fase de la enfermedad cardíaca, de la naturaleza de la administración, etc.

La presente invención se refiere a un procedimiento para identificar un compuesto que es eficaz como inhibidor en los procedimientos terapéuticos anteriormente descritos, comprendiendo el procedimiento (a) poner en contacto el compuesto de ensayo que es adecuado posiblemente como inhibidor con la caspasa-3 o CAD o con el gen que codifica la caspasa-3 o CAD, y (b) determinar la actividad caspasa-3 o CAD residual o la disminución de la expresión génica, preferiblemente en comparación con un análisis de control en el que el compuesto de ensayo no está presente. Una actividad enzimática o una expresión génica disminuida o completamente inhibida indica que el compuesto de ensayo es eficaz como inhibidor. Los análisis adecuados son conocidos por las personas expertas en la técnica y también se describen, por ejemplo, en los ejemplos de más abajo. El procedimiento también puede ser llevado a cabo en un análisis celular. Los compuestos de ensayo pueden ser una amplia variedad de compuestos, tanto compuestos de origen natural como sintéticos, compuestos orgánicos e inorgánicos, así como polímeros (v.g. oligopéptidos, polipéptidos, oligonucleótidos y polinucleótidos) así como moléculas pequeñas, anticuerpos, azúcares, ácidos grasos, nucleótidos y análogos de nucleótidos, análogos de estructuras de origen natural (v.g. "imitadores" peptídicos, análogos de ácidos nucleicos, etc.) y otros numerosos compuestos. Además, se puede rastrear un gran número de compuestos posiblemente útiles que inhiben la apoptosis de los cardiomiocitos en extractos de productos naturales como sustancia de partida. Tales extractos pueden ser originados a partir de un gran número de fuentes, por ejemplo de la clase de los hongos, actinomicetos, algas, insectos, protozoos, plantas y bacterias. Los extractos que manifiestan actividad pueden ser analizados después con el fin de aislar la molécula activa. Ver, por ejemplo, Turner, J. Ethno-Pharmacol. 51 (1-3) (1.996), 39-43 y Suh, Anticancer Res. 15 (1.995) 233-239. Los formatos de análisis fundamentalmente adecuados que afectan a la expresión o actividad de CAD o de la caspasa-3 son bien conocidos en la industria biotecnológica y farmacéutica, y los análisis y las variaciones adicionales de tales análisis son obvios para las personas expertas en la técnica. Los cambios en el nivel de expresión de la caspasa-3 o CAD pueden ser investigados utilizando procedimientos bien conocidos para la persona experta en la técnica. Entre estos se incluyen el control de la concentración de ARNm (v.g. utilizando sondas o cebadores adecuados), los inmunoanálisis con respecto a la concentración de proteína, los análisis de protección de la ARNasa, los análisis basados en la amplificación o cualquier otro método adecuado para la detección que sea conocido en el campo.

La búsqueda de compuestos que sean eficaces para la terapia y la prevención de la apoptosis de los cardiomiocitos también se puede llevar a cabo a gran escala, por ejemplo rastreando un número muy grande de posibles compuestos en bancos de sustancias, siendo posible que los bancos de sustancias contengan moléculas sintéticas o naturales. En cualquier caso, la preparación y el rastreo simultáneo de grandes bancos de moléculas sintéticas puede ser llevado a cabo por medio de procedimientos bien conocidos de la química combinatoria, ver, por ejemplo, van Breemen, Anal. Chem. 69 (1.997), 2159-2164 y Lam, Anticancer Drug Des. 12 (1.997), 145-167. El procedimiento según la invención también puede ser enormemente acelerado en forma de un rastreo de rendimiento elevado. Los análisis descritos aquí pueden ser modificados adecuadamente para su uso en tales procedimientos. Es obvio para la persona experta en la técnica que se encuentran disponibles numerosos procedimientos para ese fin.

Breve descripción de las figuras Figura 1 Caracterización hemodinámica y ecocardiográfica del modelo de insuficiencia cardíaca

Registros ecocardiográficos transtorácicos en modo M en animales de control (arriba) y animales CHF (abajo). Los diámetros del ventrículo izquierdo se indican por medio de una flecha de doble cabeza; EDD: diámetro diastólico final; ESD: diámetro sistólico final; Al cabo de dos semanas, los animales con marcapasos muestran una dilatación del ventrículo con movimientos de la pared reducidos, lo que indica una función cardíaca reducida y una tensión de la pared incrementada.

Figura 2 Inducción de la activación de CAD mediada por caspasa-3 y posterior fragmentación de ADN en cardiomiocitos ventriculares aislados de miocardio de control y miocardio con insuficiencia (CHF)

a:: Análisis fluorogénico de los niveles de enzima caspasa-3 medidos en fracciones citosólicas de miocitos aislados de miocardio de control y miocardio con marcapasos (CHF); n = 5 por grupo, p < 0,005 ANOVA con análisis post-hoc de Scheffé.

b:: Fragmentación de ADN genómico que había sido aislado de núcleos de hígado de conejo aislados y había sido incubado con extractos citosólicos de miocardio de control y cardiomiocitos de insuficiencia (CHF). La fragmentación de ADN refleja la actividad de la desoxirribonucleasa activada por caspasa (CAD).

c:: El ADN aislado del corazón de animales con insuficiencia al cabo de 7 días (CHF 7) y 15 días (CHF 15) mostraba una elevación del escalonamiento del ADN en comparación con el tejido de control.

d:: El complejo ADN/histona liberado fue cuantificado con un sistema ELISA de los cardiomiocitos de control y de cardiomiocitos con marcapasos.

Los datos se expresan como los valores medios \pm EMS; n = 5 por grupo; p < 0,005.

Figura 3 Bloqueo de la actividad de la caspasa-3 y de la fragmentación del ADN por sobreexpresión adenoviral de p35 e ICAD in vitro (a,b) e in vivo (c,d)

a:: Se midió la actividad caspasa-2 en cardiomiocitos de control aislados y células estimuladas con TNF\alpha en presencia de un constructo de adenovirus para p35 (Ad-p35), del constructo vacío (Ad-GFP) y del tetrapéptido inhibidor para la caspasa-3 (DEVD).

b:: Se determinó la formación de ADN/histona en células de control aisladas y en cardiomiocitos ventriculares estimulados por TNF\alpha tras la infección por adenovirus con Ad-p35, Ad-ICAD y Ad-GFP (como control).

c:: Los cardiomiocitos fueron aislados de miocardio de control y miocardio con marcapasos (CHF), y se midió la actividad caspasa-3 en extractos citosólicos. La 3^{a} y 4^{a} columnas representan medidas de la actividad enzimática de cardiomiocitos de miocardio del ventrículo izquierdo tras la transferencia génica por adenovirus de Ad-p35 y Ad-GFP (como control).

d:: Se aislaron miocitos ventriculares de corazones de control y corazones con marcapasos (CHF) y se cuantificó la formación de ADN/histona en extractos libres de células. La 3^{a} y 4^{a} columnas representan el análisis de fragmentación de ADN sobre células de animales después de la transferencia génica miocárdica con Ad-ICAD y adenovirus Ad-GFP de control.

e:: Análisis por inmunotransferencia de extractos citosólicos de pared anterolateral de miocardio infectado con Ad-p35 0, 4, 7 y 15 días después de la transferencia génica. La inmunotinción se llevó a cabo con los dos anticuerpos monoclonales anti-Flag M2 y anticuerpo anti-actina de los sarcómeros \alpha para p35, con el fin de permitir la documentación de la expresión de p35 y actina en paralelo.

Los datos se expresan como los valores medios \pm EMS; n = 4 por grupo; p < 0,01, p < 0,001.

Figura 4 Transferencia génica de adenovirus al miocardio con insuficiencia

a:: Secciones macroscópicas de corazones de conejo, en las que un adenovirus que codifica la \beta-galactosidasa ha sido inyectado bajo control por ultrasonidos (grosor de la sección: 7 \mum, distancia entre secciones individuales: 200 \mum). Las secciones fueron teñidas con X-Gal. El miocardio ventricular izquierdo se denomina LV, el miocardio ventricular derecho se denomina RV.

b:: Análisis por inmunotransferencia de extractos citosólicos de miocardio infectado con Ad-GFP, Ad-ICAD y Ad-p35.

c:: Fragmentación de ADN genómico que había sido aislado de núcleos de hígado de conejo aislados, tras la incubación con extractos citosólicos de los cardiomiocitos de control ventriculares aislados y los miocitos de la insuficiencia (CHF). Además, se analizó in vivo la actividad de fragmentación de ADN de los cardiomiocitos tras la transferencia génica de adenovirus con Ad-ICAD y Ad-GFP.

Figura 5 Secciones de tejido bajo luz tras la transferencia génica in vivo con los constructos de adenovirus para p35 e ICAD

a:: La expresión de GFP en secciones macroscópicas de miocardio infectado fue visualizada mediante microscopia de fluorescencia de contraste de fases utilizando un filtro de 450-490 nm.

b:: La expresión transgénica directa tras la infección por Ad-ICAD fue demostrada por inmunotinción con un anticuerpo monoclonal anti-FLAG contra el epítopo sintético introducido en ambos transgenes. La muestra fue visualizada mediante microscopia de fluorescencia utilizando un filtro de 546 nm (fluorescencia por rodamina).

c,d:: Se aislaron cardiomiocitos ventriculares a partir de miocardio infectado con Ad-p35, y se documentó la expresión transgénica mediante microscopia de fluorescencia para GFP y el anticuerpo anti-FLAG.

Figura 6 Medidas ecocardiográficas y hemodinámicas sobre corazones tratados con Ad-ICAD

Se llevó a cabo la caracterización cardíaca en el estado basal y a concentraciones crecientes de adrenalina.

a:: registros del acortamiento fraccionario sobre corazones de control y corazones infectados con Ad-GFP o Ad-ICAD después de 15 días de la provisión del marcapasos. El porcentaje de acortamiento fraccionario se calculó como % FS = [(EDD-ESD)/EDD] x 100.

b:: Los diámetros diastólicos finales del ventrículoizquierdo se muestran para el control y para el miocardio infectado con Ad-GFP o Ad-ICAD, después de un tiempo de marcapasos de 15 días.

c:: Las presiones diastólicas finales del ventrículo izquierdo fueron determinadas para el control y para animales Ad-GFP o Ad-ICAP tras la provisión del marcapasos.

d:: El desarrollo de LVEDP durante el período de la provisión del marcapasos se muestra para los animales Ad-GFP, Ad-ICAD y de control al cabo de 7 y 15 días.

e:: Registros dp/dtmax de los animales de control y de los animales tratados con Ad-ICAD, tras la administración de concentraciones crecientes de adrenalina. Los datos se muestran como los valores medios \pm EMS.

Figura 7 Medidas ecocardiográficas y hemodinámicas sobre corazones tratados con Ad-p35

La infección con constructos de adenovirus se llevó a cabo antes del inicio del período de marcapasos.

a:: Se estimó el acortamiento fraccionario en el control, CHF y a los 15 días de la administración transcoronaria de Ad-GFP o Ad-p35 a corazones provistos de marcapasos.

b:: Curso del acortamiento fraccionario con el tiempo a los 7 y 15 días de la provisión de marcapasos.

c:: Se estimó la presión intraventricular diastólica final reducida (LVEDP) en el control, CHF y a los 15 días de la administración transcoronaria de Ad-GFP o Ad-p35 a corazones provistos de marcapasos.

d:: registros dp/dtmax tras la administración de dosis crecientes de epinefrina. Los datos se muestran como los valores medios \pm EMS (n = 8 por grupo); * p < 0,05; ** p < 0,001) en comparación con el control y corazones CHF y Ad-GFP.

Figura 8 Efecto de la expresión de p35 sobre la organización en sarcómeros y la fuerza contráctil de las células musculares de corazones provistos de marcapasos

a,b,c:: Se aislaron células de músculo cardíaco de conejo ventricular a partir de la pared anterolateral del control (a), CHF (b) y miocardio con insuficiencia infectado con p35 (c) y se visualizaron tras la tinción con faloidina por medio de microscopia de barrido con láser confocal.

d:: Amplitud de contracción en células de músculo cardíaco aislado (n = 60 células de cuatro conejos por grupo).

e:: La morfología de las fibras musculares teñidas con faloidina se evaluó semi-cuantitativamente basándose en el área ocupada por el sarcómero organizado en la región celular total: débil, menos de 1/3 de la región celular (región negra); moderada, menos de 2/3 de la región celular (región gris); buena, región celular total (región vacía). Se contaron 120 células aisladas de 4 animales para cada grupo. Los datos (en d) fueron expresados como el valor medio \pm EMS (* p < 0,001 en comparación con el miocardio provisto con un marcapasos (CHF+Ad-GFP)).

Figura 9 Microinyección de caspasa-3 activada en el citoplasma de células de músculo cardíaco ventricular sano

a,b:: Se inyectó dextrano conjugado con FITC solo (a) o dextrano conjugado con FITC + caspasa-3 activa recombinante humana (b) (imagen a mano izquierda: 4 nm/\muM; imagen a mano derecha: 20 ng/\mul) en células del músculo. La morfología de las fibras de actina fue visualizada por medio de microscopia de barrido con láser confocal tras la tinción con faloidina.

c:: La amplitud de la contracción en condiciones basales y de estimulación con isoprenalina (10^{-8} moles/litro) fue determinada en las células tras la microinyección de dextrano conjugado con FITC (como control) o de caspasa-3 (CPP32). Asimismo se llevó a cabo la pre-incubación con DEVD-fmk (R and D Systems, Wiesbaden, Alemania) (columna gris). n = 45 células para cada grupo. Los datos de C se muestran como el valor medio \pm EMS (* p < 0,005 en comparación con las células de control inyectadas (basal; 10^{-8} moles/\ell isoprenalina).

Figura 10 Efecto de ICAD sobre la contractilidad de células de músculo cardíaco individuales

Amplitud de la contracción en células de músculo cardíaco aisladas (n = 60 células de cuatro conejos por grupo). El ensayo se llevó a cabo como se describe en la Fig. 8d; n.s. = no significativo, ** p < 0,05.

Los siguientes Ejemplos ilustran la invención.

Ejemplo 1 Procedimiento General (A) Construcción y purificación de adenovirus recombinante

Se prepararon adenovirus recombinantes (E1 y E3 deficientes; serotipo 5) que codifican el inhibidor de la ADNasa activada por caspasa (ICAD) de rata o el supresor de la apoptosis de Baculovirus p35 como describen He y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, (1.988), 2509-2514. En este punto, la secuencia que codifica ICAD o p35 y provista en el extremo N del epítopo "Flag" (Stratagene, La Jolla, CA, USA) fue insertado en la secuencia poliligadora del vector "pAdTrack" que expresa GFP entre un promotor de citomegalovirus (CMV) no específico de tejidos y una señal de poliadenilación de SV40 (Enari y col., Nature 391, (1.988), 43-50), (Davidson y Steller, Nature 391, (1.988), (587-591), He y col., supra), (Inan y col., Onkogene 13, (1.996) 749-755). El plásmido resultante fue transformado simultáneamente después junto con el plásmido "pAdEasy-1" en bacterias BJ5138 electrocompetentes (He y col., supra). Para la preparación de un adenovirus de control que contenía solamente el gen para GFP intensificado, se llevó a cabo una transformación simultánea con los plásmidos "pAdTrack" y "pAdEasy". El ADN del adenovirus vector recombinante fue extraído de los clones positivos y transfijado en células HEK 293 subconfluentes utilizando un reactivo de transfección "SuperFectTM" (QIAGEN, Hilden, Germany). Los virus recombinantes (Ad-ICAD, Ad-p35 y Ad-GFP) fueron obtenidos del producto lisado celular y fueron analizados por medio de PCR y escisiones de restricción.

Tras el aislamiento, se prepararon adenovirus recombinantes a gran escala por infección de células HEK 293 subconfluentes en placas de 150 mm (moi: 5 pfu/célula). Al cabo de 48 a 72 horas después de la infección tras la aparición de la acción citopatogénica, se recogieron las células mediante raspado y centrifugación durante 20 minutos a 1.000 x g. El sedimento celular fue resuspendido en PBS y Triton-X 100^{r} al 0,25%. El producto homogeneizado fue incubado durante 10 minutos a la temperatura ambiente y los núcleos de las células HEK abiertos fueron separados mediante una etapa de centrifugación a 2.500 x g (20 minutos). El sobrenadante que contenía las partículas de virus fue introducido en un gradiente por etapas de CsCl (1,3 a 1,4 g de CsCl/ml, disuelto en tampón TE) y sometido a ultracentrifugación durante 1,5 horas a 10ºC y a 150.000 x g. La banda de virus que se formaba en la interfase de 1,3 y 1,4 g/ml fue separada con una jeringa, sometida a diálisis frente a PBS conteniendo sacarosa al 1% y glicerol al 10%, y almacenada en alícuotas a -80ºC. Los títulos de adenovirus fueron determinados por medio de titulación en placa sobre células HEK 293 (Krown y col., J. Clin. Invest. 98 (1.996), 2854-2865).

(B) Cultivo celular e infección con adenovirus de cardiomioblastos H9c2

Se cultivaron cardiomiocitos H9c2 (ATCC CRL 1446, cardiomioblastos de rata) en monocapas en DMEM, FBS al 10%, 2 mmoles/litro de glutamina, penicilina (100 IE/ml) y estreptomicina (100 \mug/ml) en CO_{2} al 10% a 37ºC en una incubadora humidificada. Una vez que los cardiomioblastos hubieron alcanzado una confluencia del 70 al 80%, fueron transfectados en PBS con un título de adenovirus adecuado. Tras la incubación durante una hora a la temperatura ambiente, el medio de cultivo se hizo volver a las placas. Al cabo de 36 a 48 horas de la infección del adenovirus, se utilizaron las células para los experimentos individuales.

(C) Preparación y cultivo de cardiomiocitos ventriculares adultos de ratas y conejos

Se aislaron miocitos ventriculares tolerantes al calcio individuales de ratas Wistar de 12 a 16 semanas de edad (300-450 g) o de conejos New Zealand macho de 3 meses de edad (2,8-3 kg). Los corazones escindidos fueron perfundidos vía aorta, a una velocidad de flujo directo constante, con medio "Powell" libre de Ca^{2+} (110 moles/litro de NaCl, 2,5 mmoles/litro de KCl, 1,2 mmoles/litro de KH_{2}PO_{4}, 1,2 mmoles/litro de MgSO_{4}, 11 mmoles/litro de glucosa, 25 mmoles/litro de NaHCO_{3}, equilibrado con CO_{2} al 5% y ajustado a un valor de pH de 7,4). Al cabo de 10 minutos, la digestión enzimática fue reemplazada por la sustitución del tampón sin Ca^{2+} por 110 a 218 IE/ml (para ratas o conejos respectivamente) de tipo colagenasa II (Worthington, Freehold, Nueva Jersey, USA) y medio "Powell" conteniendo 30 o 40 \mumoles/litro de Ca^{2+} (para ratas o conejos, respectivamente). Tras una digestión completa del tejido, el corazón fue separado del dispositivo de perfusión, y el músculo ventricular fue expuesto y disociado mecánicamente en el medio "Powell" con oxigenación constante. Tras la filtración sobre una membrana de nailon (tamaño de malla 200 \mum), la suspensión celular fue centrifugada durante 3 minutos a 20 x g y las células fueron resuspendidas en medio "Powell" conteniendo 0,2 mmoles/litro de Ca^{2+}. Se dejó que las células se sedimentaran, y el sedimento se recogió en medio "Powell" conteniendo 0,4 mmoles/litro de Ca^{2+} y se introdujo cuidadosamente en gradiente de seralbúmina bovina al 4% (BSA) en medio "Powell" (1 mmol/litro de Ca^{2+}). Tras la centrifugación durante 2 minutos a 20 x g, los cardiomiocitos fueron resuspendidos en medio de cultivo M199 (suplementado con vitaminas MEM, aminoácidos no esenciales MEM, 25 mmoles/litro HEPES, 10 \mug/litro de insulina, 100 IE/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina y 100 \mug/ml de gentamicina), cultivados en placas revestidas previamente con laminina (5-10 \mug/cm^{2}) a una densidad de 10^{5} células por cm^{2} y cultivadas en una atmósfera humidificada (CO_{2} al 5%) a 37ºC. La infección de los cardiomiocitos con los adenovirus tuvo lugar de 6 a 8 horas después del cultivo en placa en medio de cultivo M199. Tras el aislamiento de las células de conejo infectadas in vivo de manera normal o insuficiente y su uso para la determinación de la aparición de apoptosis, éstas fueron congeladas directamente a -80ºC en forma de un sedimento inmediatamente después de la centrifugación en un gradiente de BSA al 4%.

Análisis de transferencia Western

(I) Para la determinación inmunológica de las proteínas inducidas GFP, ICAD y p35, se cosecharon los cardiomioblastos H9c2 48 horas después de la infección (moi: 50 pfu/célula) en tampón HEPES 10 mM, valor de pH 7,0 (que contenía fosfato de \beta-glicerol 40 mM, NaCl 50 mM, MgCl_{2} 2 mM, EGTA 5 mM, DTT 1 mM, ATP 2 mM, fosfato de creatina 10 mM, 50 \mug/ml de creatina quinasa, PMSF 1 mM, 1 \mug/ml de leupeptina, 1 \mug/ml de pepstatina, 10 \mug/ml de aprotinina, 16 \mug/ml de benzamidina, 10 \mug/ml de fenantrolina) y se rompieron por medio de cuatro ciclos de congelación/descongelación. Los productos lisados resultantes fueron centrifugados durante 30 minutos a 15.000 rpm y se determinaron las concentraciones de proteína en un análisis "Bradford". Se diluyeron cantidades iguales de proteína (50-200 \mug) con tampón de aplicación SDS, se separaron sobre un gel de poliacrilamida al 12%, y se transfirieron mediante electroforesis a una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad Laboratories, Munich, Alemania). Las transferencias fueron teñidas con rojo "Ponceau" con el fin de verificar la transferencia de proteínas. Tras bloquear durante la noche con polvo de leche sin grasa al 5% en TBST (tris-HCl 10 mM, valor de pH 8,0, NaCl 150 mM, Tween-20® 0,05), las membranas fueron incubadas durante una hora con anticuerpos anti-FLAG M2 (Stratagene), que se había diluido 1:10.000 (determinación ICAD) o 1:1.000 (determinación p35) en TBST (con BSA al 0,1% y azida de Na al 0,02%). Los complejos antígeno/anticuerpo fueron visualizados, por medio de quimioluminiscencia (estuche de detección "ECL", Amersham Pharmacia Biotech, Viena, Austria), tras la incubación de las membranas durante una hora con IgG anti-ratón diluida 1:10.000 y conjugados con peroxidasa de rábano picante (Sigma-Aldrcih Chemie GmbH, Munich, Alemania).

(II) Los productos de la escisión de ICAD nativo de los productos lisados de miocardio con simulacro de operación y malogrado fueron demostrados utilizando anticuerpos policlonales de cabra frente al extremo N de Icad de ratón (St. Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) (dilución: 1:1.000). Algunos extractos de los corazones de control también fueron incubados durante 30 minutos a 37ºC con 1 ng/\mul de caspasa-3 activa humana recombinante en presencia o ausencia del inhibidor de caspasa-3 tetrapeptídico DEVD-fmk (R and D Systems, Wiesbaden, Alemania) (100 \mumoles/litro). La demostración inmunológica de p35 y actina de \alpha-sarcómero en los extractos de miocardio con simulacro de operación transcoronaria se llevó a cabo por medio del anticuerpo anti-FLAG M2 de ratón monoclonal (dilución: 1:1.000) y un anticuerpo anti-actina de \alpha-sarcómero monoclonal (Sigma, Taufkirchen, Alemania) (dilución: 1:5.000).

(E) Estudios inmunocitoquímicos y microscópicos

Cardiomiocitos ventriculares adultos aislados, que habían sido cultivados en placa sobre cubres de microscopio revestidos con 5 \mug/cm^{2} de laminina, fueron infectados con adenovirus Ad-GFT de control o con virus Ad-ICAD o Ad-p35 (moi: 50 pfu/célula) y analizados 48 horas después de la infección. Para la determinación de la expresión de los transgenes en corazones de conejo infectados in vivo, el tejido congelado fue cortado con un microtomo en secciones congeladas en discos que tenían un grosor de 3 a 4 \mum. Tras lavar tres veces con PBS, las células y las secciones fueron fijadas durante 15 minutos con paraformaldehído al 4% en PBS y después permeabilizadas durante 10 o 30 minutos con saponina en PBS al 0,1%. Con el fin de evitar la unión de anticuerpos no específica, los cardiomiocitos fueron tratados durante 30 minutos con FBS en DMEM al 10% antes del marcaje con anticuerpo anti-FLAG M2 de ratón monoclonal (IgG1) (Stratagene, 10 \mug/ml). Tras la incubación con IgG anti-ratón conjugada con rodamina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA; 4 \mug/ml), las muestras fueron visualizadas por medio de microscopia de fluorescencia de contraste de fases utilizando un filtro de 450-490 nm (fluorescencia GFP) y un filtro de 546 nm (fluorescencia rodamina) (microscopio inverso "Axiovert 25", Zeiss, Jena, Alemania).

(F) ELISA para fragmentos de ADN unidos a histona

La apoptosis en cardiomiocitos ventriculares adultos fue determinada por medio de un ELISA de nucleosoma, cuantitativo, asequible comercialmente dirigido a ADN e histona y utilizando anticuerpo de ratón monoclonal (Roche Diagnostics, Manheim, Alemania). La cantidad de nucleosomas en el producto lisado de 2 x 10^{3} células fue determinada por medio de la peroxidasa retenida en el complejo inmune y fue evaluada mediante fotometría. Se evaluaron tres muestras en cada caso, midiéndose la densidad óptica (DO) a 405 nm. El factor aumentador de la apoptosis fue calculado para cada grupo experimental como DO (tratamiento)/DO (control) tras restar la DO_{405} del fondo.

(G) Actividad caspasa-3

La actividad de la caspasa-3 fue determinada por medio del estuche de análisis "CPP32" colorimétrico (Clontech Laboratories GmbH, Heidelberg, Alemania) mediante la detección de la p-nitroanilida cromófora tras la escisión del sustrato marcado Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)-p-nitroanilida. En este punto, se lisaron 2 x 10^{6} cardiomiocitos adultos, y se hicieron reaccionar cantidades iguales de proteína con 50 \mumoles/litro de DEVD-p-nitroanilida durante una hora a 37ºC. La actividad fue determinada mediante fotometría a 405 nm y los resultados fueron calibrados con concentraciones conocidas de p-nitroanilida. Las unidades de actividad proteasa fueron definidas como la cantidad de caspasa-3 que se requiere para producir 1 pmol de p-nitroanilida a 25ºC.

(H) Análisis de la actividad ICAD

La actividad ICAD fue calculada determinando la inhibición de CAD en la fragmentación de ADN de núcleos de hígado de conejo. Los núcleos fueron preparados como describen Blobel y Potter (Science 154 (1.966) y almacenados a -80ºC.

Se infectaron cardiomioblastos H9c2 con Ad-GFP o Ad-ICAD (moi: 50 pfu/célula), y 48 horas más tarde se estimuló la actividad CAD mediante tratamiento de las células con \alpha-TNF de rata (500 E/ml) durante 5 horas. Se incubaron 100 \mug de proteína de productos lisados celulares brutos con 2 x 10^{6} núcleos en un tampón de reacción que constaba de HEPES 10 mM, valor de pH 7,0, fosfato de \beta-glicerol 40 mM, NaCl 50 mM, MgCl_{2} 2 mM, EGTA 5 mM, DTT 1 mM, ATP 2 mM, fosfato de creatina 10 mM, 50 \mug/ml de creatina quinasa y una mezcla de inhibidores de proteasa (fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF), 10 \mug/ml de leupeptina, 1 \mug/ml de pepstatina, 10 \mug/ml de aprotinina, 16 \mug/ml de benzamidina, 10 \mug/ml de fenantrolina). Tras la incubación durante 90 minutos a 37ºC, se obtuvieron los núcleos por centrifugación a 35.000 x g (5 minutos) y después se sometieron a lisis durante 30 minutos a 56ºC en tris-HCl 100 mM, valor de pH 8,5, EDTA 5 mM, NaCl 0,2 M, SDS al 0,2%, 1 mg/ml de proteinasa K. Después el ADN se hizo precipitar mediante la adición del mismo volumen de isopropanol, se disolvió en 20 \mul de tris-HCl, valor de pH 8,5 (con EDTA 1 mM y 1 mg/ml de ARNasa A) y se incubó durante 30 minutos a 37ºC. El ADN se analizó mediante electroforesis en gel (agarosa al 1% en presencia de 0,5 \mug/ml de bromuro de etidio).

(I) Transferencia génica y operaciones con el animal

Se anestesiaron conejos New Zealand blancos macho adultos (2-4 kg) con midazolam (2 mg/kg) y medetomidina (150 \mug/kg), se intubaron y se sometieron a respiración artificial. Se abrió la pared torácica izquierda y se anclaron dos cables marcapasos aislados al corazón izquierdo. Tras este procedimiento, los animales fueron extubados. En los animales de control, se llevó a cabo una incisión en la pared del tórax con la implantación de los cables del marcapaso, pero el marcapasos nunca se puso en marcha. Doce horas después de esta operación, se inició una velocidad del marcapasos de 360 latidos/minutos. Esto fue verificado al principio de los ensayos y después semanalmente (en total a lo largo de un período de 15 días) por medio de un ECG. La transferencia génica de adenovirus en el músculo cardíaco de conejo se llevó a cabo según los protocolos conocidos (Weig y col., Circulation 101, (2.000), 1578-1585).

(J) Datos hemodinámicos y ecocardiográficos in vivo

La fuerza contráctil del ventrículo izquierdo se estudió antes y a los 7 y 15 días de la transferencia génica de adenovirus. Los conejos fueron anestesiados como se ha descrito antes. Los registros ecocardiográficos (modo M) se llevaron a cabo como se describe en estudios previos (Gardin y col., Circ. Res. 76 (1.995), 907-914). Además, se controlaron continuamente el ECG y la presión arterial. Tras la preparación de la carótida derecha se insertó en el ventrículo izquierdo un catéter de "punta Millar 2.5 French" (Hugo Sachs, Freiburg, Alemania) conectado a un dispositivo diferenciador. La posición del catéter fue verificada tanto mediante fluoroscopia como observando la forma de la onda de la presión arterial. Tras la determinación de la fuerza contráctil basal y de la presión del ventrículo izquierdo (con el marcapasos desconectado), se inyectaron 200 \mul de NaCl al 0,9% como control negativo. Después de un período de equilibrado suficiente, se inyectó adrenalina a concentraciones de 0,1 a 0,8 ng. Las medidas se tomaron antes de las operaciones quirúrgicas y 7 y 15 días después del período de marcapasos.

(K) Análisis estadísticos

Los datos son los valores medios \pm EMS de más de tres experimentos independientes. Los datos fueron verificados en cuanto a las diferencias estadísticamente relevantes por medio de un análisis de variancia de "un factor" (ANOVA) y, después de eso, por medio de un análisis "Scheffé" post-hoc.

(L) Microinyección

Los experimentos de microinyección se llevaron a cabo sobre células de músculo cardíaco recién aislado de conejos con simulacro de operación por medio de un dispositivo de microinyección "Femto-Jet" (Eppendorf, Hamburg, Alemania). Se inyectó dextrano conjugado con FITC (6 mg/ml), solo o combinado con caspasa-3 activa recombinante humana (4 ng/\mul y 20 ng/\mul) en 5 mmoles/litro de tampón fosfato de potasio (valor de pH 7,4; 100 mmoles/litro de KCl) en el citoplasma de las células en medio de cultivo (P_{i} = 1.000 hPa, t_{i} = 0,1 seg., P_{c} = 30 hPa) que había sido suplementado con 200 \mumoles/litro de BDM (monooxima de butanodiona, Sigma, Taufkirchen, Alemania), 10 \mumoles/litro de veparamil y, opcionalmente, 100 \mumoles/litro de DEFD-fmk. Tras una incubación de 2 horas, se llevaron a cabo las medidas de la contracción o la tinción con faloidina. Las células inyectadas fueron seleccionadas por medio de fluorescencia con FITC.

Ejemplo 2 Efectos fisiológicos de la taquicardia crónica en conejos

Se utilizó un modelo de insuficiencia cardíaca congestiva (CHF) con un pequeño volumen minuto, cuyo modelo corresponde a cambios en humanos a nivel hemodinámico y bioquímico. En este ensayo, ninguno de los animales moría durante la implantación del instrumental quirúrgico, aunque había una tasa de mortalidad del 10 al 20% durante el período de 15 días en el cual se conectaba el marcapasos. La provisión de un marcapasos crónica en los 15 días a 360 latidos condujo al descubrimiento clínico general de insuficiencia cardíaca sistémica incluyendo la dilatación de ambos ventrículos (Figura 1c), efusiones pleurales y ascitis abdominal. Los estudios ecocardiográficos mostraron una subida en el punto de las diástoles finales del ventrículo izquierdo y una disminución del acortamiento fraccionario en los conejos CHF (Tabla 1(a)). Las medidas hemodinámicas mostraban del mismo modo una presión diastólica final superior del ventrículo izquierdo y una fuerza contráctil inferior del ventrículo izquierdo (determinada mediante LV +dP/dt) y una relajación (determinada mediante LV-dP/dt) en los conejos provistos de marcapasos (Tabla 1(b)). Las medidas ecocardiográficas y hemodinámicas fueron registradas en cada conejo antes de la implantación del marcapasos y de nuevo al cabo de 7 y 15 días (con el marcapasos desconectado). Por consiguiente, cada conejo fue utilizado como su propio control. Los conejos con simulacro de operación no mostraban diferencia con respecto a los parámetros hemodinámicos. En el miocardio con insuficiencia, se observaron cambios bioquímicos en la transducción de la señal \beta-adrenérgica similares a los del caso de insuficiencia cardíaca en humanos. La densidad de receptor \beta-adrenérgico se reducía significativamente en los miocitos de insuficiencia, y la expresión de \betaARK1 aumentaba.

Con fines de control, se determinaron los valores antes de la implantación del marcapasos y los valores de CHF tres semanas después de la implantación del marcapasos. HR, ritmo cardíaco [latidos/min (bpm en sus siglas en inglés)]; LVEDD, diámetro diastólico final del LV; LVESD, diámetro sistólico final del LV; FS, acortamiento fraccionario, determinado como %FS = [(EDD-ESD/EDD] x 100; LVEDP, presión diastólica final del LV; LVSP, presión sistólica final del LV; dp/dtmax, velocidad máxima de incremento de la presión del LV; dp/dtmin, velocidad máxima de la caída de la presión del LV.

Ejemplo 3 Parámetros de la apoptosis en la insuficiencia cardíaca

Con el fin de permitir la evaluación de los rasgos bioquímicos más importantes de la apoptosis en los corazones de conejos provistos de marcapasos, se aislaron miocitos ventriculares adultos y se llevaron a cabo numerosos análisis moleculares. En la fase final de la insuficiencia cardíaca, la apoptosis en el miocardio intacto está acompañada de degradación del ADN. Con el fin de estudiar la capacidad de los productos lisados celulares de los cardiomiocitos de la insuficiencia para efectuar la degradación del ADN in vitro, se incubaron los núcleos de hígado con productos lisados celulares de miocitos malogrados, y se estudió el ADN por medio de electroforesis en gel de agarosa (Fig. 2a). El miocardio con insuficiencia mostraba un incremento de la actividad para la degradación del ADN en comparación con el tejido de control. Era posible bloquear esa actividad mediante la sobre-expresión de ICAD. Además, en los extractos celulares totales preparados a partir de cardiomiocitos con insuficiencia y de control, había un incremento significativo (aproximadamente 3 veces) de la actividad de la caspasa-3 en las células CHF (Fig. 2b). Los extractos de citosol del miocardio de los animales provistos de marcapasos mostraban un incremento de casi 6 veces en fragmentos de ADN asociados con histona en comparación con los extractos de los miocitos de control (Fig. 2c).

Ejemplo 4 La transferencia génica de p35 e ICAD inhibe suficientemente el incremento de la actividad caspasa-3 y la fragmentación de ADN in vitro e in vivo

Para la manipulación de la ruta de la señal de degradación del ADN activada por caspasa-3 como última etapa en el procedimiento de la muerte celular miocárdica, se produjeron constructos de adenovirus para p35 como potente inhibidor de la caspasa-3 (Ad-p35) e ICAD (Ad-ICAD) como molécula captadora para CAD activada. Los constructos de adenovirus fueron construidos de modo que codificaran el transgen y, con el fin de controlar la expresión suficientemente, además GFP (Ad-GFP). Además, ambos transgenes fueron proporcionados con una "etiqueta" epitópica para la inmunotinción. Antes de la determinación de las consecuencias funcionales de la infección por adenovirus en el miocardio con insuficiencia, se estudió la expresión de los transgenes en miocitos ventriculares apoptóticos estimulados por TNF\alpha (Fig. 3a,b). Se infectaron cardiomiocitos adultos con adenovirus que tenían una multiplicidad de infección (moi) de 80 pfu/célula, que ya habían mostrado lograr la expresión óptima del transgen prácticamente en el 100% de los miocitos ventriculares. A las 48 horas de la infección con Ad-p35 o Ad-ICAD, los extractos de miocitos expresaban niveles de proteína significativos, que fueron determinados mediante inmunotinción. La actividad caspasa-3 y la fragmentación de ADN fueron estimuladas in vitro mediante tratamiento con TNF\alpha (Fig. 3a,b). La expresión adenoviral de p35 suprimía las actividades caspasa-3 estimuladas por TNF\alpha al nivel basal in vitro en cardiomiocitos de conejo ventriculares. Interesantemente, la sobre-expresión de ICAD daba una formación de ADN/histona por debajo de los valores del control (Fig. 3a,b). La infección de cardiomiocitos con adenovirus de control recombinante (Ad-GFP) no tenía efecto in vitro ni in vivo sobre los parámetros de la apoptosis en los miocitos (Fig. 3a,b,c,d). Como se muestra en la Fig. 3 y c, los miocitos aislados de miocardio con insuficiencia mostraban un incremento significativo en la inducción mediada por caspasa-3 en comparación con miocitos sanos (38 \pm 6 unidades activas versus 12 \pm 3 unidades activas/incremento de 5,5 veces en la formación de ADN/histona, n = 5 en cada grupo p < 0,005). Tras la administración de los dos transgenes de adenovirus in vivo y el posterior aislamiento de los miocitos ventriculares de la región diana miocárdica, casi el 50% de las células mostraba reproduciblemente una tinción GFP positiva. En esas células, ICAD bloqueaba eficazmente la actividad caspasa-3 inducida por caspasa-3, p35 inhibía parcialmente la actividad de la enzima. Las infecciones de control no mostraban efecto (Fig. 3c,d).

Ejemplo 5 La transferencia génica de adenovirus en músculo cardíaco con insuficiencia es eficaz

En la Fig. 4a se muestran secciones de tejidos de un corazón de conejo representativo tres días después de la transferencia génica de Ad-\betaGal (10^{9}-10^{10} pfu). La transferencia génica mostraba una expresión génica máxima 6 días después de la infección, que estaba seguida de una caída gradual en la expresión en las siguientes semanas. Al cabo de cuatro semanas, menos del 1% del miocardio estaba infectado. Dos tercios del miocardio del ventrículo izquierdo manifestaba reproduciblemente la expresión del transgen (Fig. 4a). Las imágenes fluorescentes de las secciones macroscópicas de un corazón infectado con Ad-ICAD bicistrónico mostraban una marcada expresión transgénica sobre el miocardio manipulado completo y la inmunotinción de la "etiqueta" epitópica del transgen mostraba señales en la misma región (Fig. 5a,b). Tras la infección con 10^{9}-10^{10} pfu Ad-ICAD in vivo, casi el 50% de los cardiomiocitos ventriculares aislados mostraban fluorescencia verde y una inmunotinción positiva (Fig. 5c,d). p35 (como proteína de Baculovirus) mostraba niveles de expresión inferiores que ICAD a títulos virales ajustados exactamente de la misma manera en las células eucarióticas, que se muestran por la inmunotransferencia de la Fig. 4b.

Ejemplo 6 El bloqueo del mecanismo de la apoptosis activada por caspasa-3 mejora la fuerza contráctil

Con el fin de evaluar los efectos funcionales de ICAD con respecto a la prevención del progreso de la insuficiencia cardíaca como inhibidor de la etapa clave en la muerte de las células miocárdicas, se midieron los parámetros ecocardiográficos y hemodinámicos tras la transferencia génica transcoronaria mediada por adenovirus. Antes de la implantación del marcapasos, los conejos fueron tratados por medio de la transferencia génica. Los parámetros ecocardiográficos y hemodinámicos fueron registrados después de un tiempo con marcapasos de 7 y 15 días (con el marcapasos desconectado). Los conejos infectados con Ad-GFP servían como corazones de control. La Fig. 6a muestra los valores medios del acortamiento fraccionario de la región infectada para Ad-GFP y Ad-ICAD. Se producía un claro incremento significativo en animales tratados con Ad-ICAD, pero no se producía acción en los animales de control tratados con virus (15 \pm 0,9% vs. 22,3 \pm 1,1%, n = 6 en cada grupo, p < 0,05). El diámetro diastólico final del ventrículo izquierdo era de 18 \pm 4 mm en los animales Ad-GFP, en comparación con 15 \pm 0,5 mm en los animales infectados con ICAD (Fig. 6b). Con el fin de suplementar la información ecocardiográfica referente a la fuerza contráctil miocárdica local, se determinaron la presión diastólica final del ventrículo izquierdo y +dp/dt como una medida de la fuerza contráctil ventricular global. La presión diastólica final en el ventrículo izquierdo de los animales tratados con adenovirus para ICAD fue restaurada en un grado significativo de nuevo en comparación con las células infectadas con Ad-GFP (10,2 \pm 0,8 mm Hg vs. 14 \pm 1,4 mm Hg, n = 6 en cada grupo, p < 0,05) (Fig. 6c,d). Los valores +dp/dt basales de los animales infectados con Ad-GFP no diferían de aquellos de los animales infectados con Ad-ICAD. Tras la inyección de adrenalina, se observó un incremento superior dependiente de la dosis con respecto a +dp/dt en los conejos que expresaban ICAD en comparación con los animales de control.

Ejemplo 7 La reconstitución funcional de la fuerza contráctil se logra mediante un empeoramiento reducido de la organización en sarcómeros mediante la sobre-expresión de p35 o ICAD

Con el fin de estudiar el efecto de la expresión de p35 sobre la función de contracción de las células musculares cardíacas ventriculares individuales 15 días después de la administración del gen in vivo, las células fueron aisladas de la región diana de los animales de control infectados con Ad-p35 y Ad-GFP y animales CHF y cultivadas durante 18 horas. Las células que expresan el transgen fueron seleccionadas por medio de fluorescencia GFP. La Figura 8 (a,b,c) muestra imágenes microscópicas electrónicas por láser tras la tinción con faloidina para la visualización de la actina polimérica en células musculares cardíacas de control y células musculares cardíacas de la insuficiencia, que habían sido aisladas de corazones manipulados genéticamente. Interesantemente, las células musculares cardíacas malogradas que expresan p35 manifestaban una estructura en sarcómeros muy organizada en comparación con las células infectadas de control que tenían las unidades sarcoméricas destruidas. El grado de organización en sarcómeros, determinado mediante evaluación semi-cuantitativa, se muestra en la Figura 8(e). La razón de las células musculares con respecto a los sarcómeros bien organizados (más de 2/3 de la región celular) era del 64% \pm 1% en las células musculares cardíacas de control, 13% \pm 3% en células musculares cardíacas infectadas con Ad-GFP y 52% \pm 4% en células musculares cardíacas infectadas con Ad-p35. La amplitud de la contracción fue medida en células de la insuficiencia y células de control que habían sido estimuladas eléctricamente a una velocidad de aproximadamente 70 contracciones por minuto. La infección con adenovirus no alteraba las características de contracción de las células musculares cardíacas. Como se muestra en la Figura 8d, las células musculares malogradas que expresaban p35 mostraban un acortamiento fraccionario significativamente aumentado en comparación con los células musculares equivalentes infectadas con Ad-GFP (4,3 \pm 0,4% vs. 1,8% \pm 0,2%, n = 40 en cada grupo). Esta mejora en la fuerza contráctil también podía ser observada tras la estimulación con isoprenalina, y la CE_{50} de la curva dosis-respuesta fue desplazada a valores superiores, que eran similares a los de las células sanas (Figura 8d). Estos resultados muestran que p35 restaura la organización en sarcómeros y la contractibilidad de las células musculares cardíacas con insuficiencia es restaurada de nuevo como resultado.

Además, se midió la amplitud de la contracción en células de la insuficiencia y en células de control que habían sido estimuladas eléctricamente a una velocidad de aproximadamente 70 contracciones por minuto. Como se muestra en la Figura 10, las células musculares cardíacas malogradas que expresaban ICAD mostraban un acortamiento fraccionario significativamente incrementado en comparación con células musculares infectadas con Ad-GFP equivalentes tras la estimulación con isoprenalina (mejora de 3,8 \pm 0,9% a 9,5 \pm 1,16%), mientras los valores basales no diferían (1,8 \pm 0,33% vs. 1,75 \pm 0,33%). Estos resultados muestran que ICAD también restaura la contractibilidad de las células musculares cardíacas malogradas.

Ejemplo 8 Microinyección de caspasa-3 activada en células musculares cardíacas ventriculares aisladas

Con el fin de poder estudiar si la activación de caspasa-3 es suficiente para la inducción del empeoramiento de la organización en sarcómeros, se inyecto la enzima activada en el citoplasma de células musculares cardíacas ventriculares adultas sanas. Las células positivas (aproximadamente 10 a 20%) fueron identificadas por medio de fluorescencia con FITC. Los rasgos morfológicos de las células musculares cardíacas tras la microinyección de caspasa-3 activada (4 ng/\mul y 20 ng/\mul) en comparación con las células inyectadas con el control se muestran en la Figura 9(a+b). El tratamiento de las células musculares con caspasa-3 (CPP-32) efectuaba una rápida destrucción dependiente de la concentración de los husillos del músculo liso y estriado (Figura 9b, imagen izquierda y derecha). Los experimentos de acortamiento con células individuales (células musculares cardíacas microinyectadas) mostraba una disminución mediada por caspasa-3 de la contracción basal y estimulada por isoprenalina (9,8% vs. 4,3% [10^{-8} iso]; n = 30 en cada grupo). Estos efectos eran bloqueados por la pre-incubación de las células musculares con DEVD-fmk (Figura 9c).

Claims

1. Un procedimiento de rastreo para identificar un compuesto que sea eficaz como inhibidor de la caspasa-3 o la desoxirribonucleasa activada por caspasa (CAD) para incrementar la contractilidad de un corazón en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca, comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas:

(a): poner en contacto un compuesto de ensayo que es posiblemente adecuado como inhibidor con caspasa-3 o CAD o con el gen que codifica la caspasa-3 o CAD; y

(b): determinar la actividad caspasa-3 o CAD residual o la disminución de la expresión génica;

(c): identificar un compuesto de ensayo como inhibidor potencial cuando éste disminuye o inhibe la actividad de la caspasa-3 o CAD o la expresión del gen que codifica la caspasa-3 o CAD, y

(d): determinar un posible incremento de la contractilidad mediante la administración a un modelo animal o a una célula muscular de corazón, y

(e): identificar un inhibidor potencial como compuesto que es eficaz como inhibidor de la caspasa-3 o CAD cuando la contractilidad resulta incrementada por la administración.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa (d) el inhibidor potencial es administrado a un modelo animal para la insuficiencia cardíaca.

3. El procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa (d) el inhibidor potencial es administrado a células musculares de corazón aisladas.

4. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque las etapas (a) a (c) se llevan a cabo en un rastreo con elevado rendimiento total.