ES2220736T3 - Uso de inhibidores de caspasa-3 o desoxirribonucleasa activada por caspasa (cad) para tratar enfermedades cardiacas. - Google Patents
Uso de inhibidores de caspasa-3 o desoxirribonucleasa activada por caspasa (cad) para tratar enfermedades cardiacas.Info
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Abstract
Un procedimiento de rastreo para identificar un compuesto que sea eficaz como inhibidor de la caspasa-3 o la desoxirribonucleasa activada por caspasa (CAD) para incrementar la contractilidad de un corazón en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca, comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas: (a) poner en contacto un compuesto de ensayo que es posiblemente adecuado como inhibidor con caspasa-3 o CAD o con el gen que codifica la caspasa-3 o CAD; y (b) determinar la actividad caspasa-3 o CAD residual o la disminución de la expresión génica; (c) identificar un compuesto de ensayo como inhibidor potencial cuando éste disminuye o inhibe la actividad de la caspasa-3 o CAD o la expresión del gen que codifica la caspasa-3 o CAD, y (d) determinar un posible incremento de la contractilidad mediante la administración a un modelo animal o a una célula muscular de corazón, y (e) identificar un inhibidor potencial como compuesto que es eficaz como inhibidor de la caspasa-3 o CAD cuando la contractilidad resulta incrementada por la administración.
Description
Uso de inhibidores de caspasa-3 o
desoxirribonucleasa activada por caspasa (CAD) para tratar
enfermedades cardíacas.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de rastreo para identificar un inhibidor de la
caspasa-3 o de una desoxirribonucleasa activada por
caspasa (CAD) para la prevención o el tratamiento de las
enfermedades cardíacas, siendo las enfermedades cardíacas
especialmente la insuficiencia del ventrículo izquierdo. Un ejemplo
del inhibidor es ICAD. La administración del inhibidor puede ser
efectuada especialmente por medio de un adenovirus vector que
contiene el gen que codifica el inhibidor de una forma expresable.
La presente invención se refiere a los procedimientos para
identificar inhibidores para la aplicación terapéutica anterior, es
decir compuestos que inhiben la caspasa-3 o CAD o la
expresión de los genes que codifican esos compuestos.
La apoptosis es un forma controlada genéticamente
de muerte celular que es esencial para el desarrollo normal y el
equilibrio fisiológico de los organismos. Muchas enfermedades
degenerativas están asociadas con niveles anormalmente elevados de
apoptosis. Ha sido posible identificar la muerte celular programada
de los cardiomiocitos en numerosas enfermedades cardiovasculares,
por ejemplo en el infarto de miocardio y en la insuficiencia
cardíaca congestiva (insuficiencia cardíaca congestiva, CHF en sus
siglas en inglés). La apoptosis podría ser el resultado de una
estimulación del crecimiento de los cardiomiocitos adultos
prolongada que -como tejido diferenciado terminalmente- ya no son
susceptibles de división. Como compensación para los requerimientos
hemodinámicos cambiados crónicamente con respecto a la falta de
músculo cardíaco, se produce una reacción hipertrófica, y esto
último está mediado por la regulación hacia arriba generalizada y
local del sistema adrenérgico y del sistema renina/angiotensina y
por diversas citoquinas. Sin embargo, no se han utilizado hasta
ahora terapias para las enfermedades cardíacas antes mencionadas que
pretendan inhibir la apoptosis. Las intervenciones farmacológicas
llevadas a cabo hasta ahora en los casos de tales enfermedades
cardíacas, cuyas intervenciones se basan predominantemente en el
bloqueo \beta-adrenérgico, no tienen éxito en
todos los casos o manifiestan a menudo una acción inadecuada.
En WO 99 10501 se describe el papel de la
desoxirribonucleasa activada por caspasa (CAD = CPAN = DFF40) en la
apoptosis celular y también su regulación por ICAD (=DFF45) (página
8, párrafos 2. y 3.). Se menciona la inhibición de CAD por la
proteína ICAD (ejemplo 8), mediante transfección con el gen ICAD
mutado cuyo producto no puede ser escindido por la
caspasa-3 (ejemplo 9), por las hebras CAD
antisentido (página 10, párrafo 3., reivindicaciones 36 y 39) y por
los anticuerpos mono- y policlonales dirigidos a CAD (página 13,
párrafo 4., reivindicación 35). En cuanto a los vectores de
expresión para la transfección, no se describe un adenovirus. Se
considera que estos inhibidores de la apoptosis son útiles para el
tratamiento del infarto cardíaco o el infarto cerebral puesto que
esas patologías inducen lesión celular por apoptosis (página 12,
último párrafo). Se describe y se reivindica un análisis para
identificar inhibidores de CAD, donde al menos un compuesto de
ensayo se pone en contacto con CAD y donde al mismo tiempo se mide
la capacidad de CAD para la fragmentación del ADN (página 12,
párrafo 4., reivindicaciones 24-27, 41).
En WO 96 33268 se describe un método para la
identificación de sustancias que modulan la actividad de la
caspasa-3 (=apopaína=CPP32). Este método comprende
mezclar la caspasa-3 con una sustancia que se va a
someter a ensayo y determinar la actividad caspasa-3
(página 4, líneas 17-20, reivindicación 4). Se
mencionan los moduladores de la actividad de
caspasa-3 y las moléculas antisentido de
caspasa-3 para el tratamiento de las lesiones
cardiovasculares (página 4, línea 25 - página 5, línea 3, página 6,
líneas 9-27). Las moléculas antisentido pueden ser
ADN o ARN y pueden ser introducidas en células mediante
microinyección, encapsulación en liposomas o vectores de expresión
(página 14, líneas 1-10). Se describe un adenovirus
como vector para la transferencia de un gen de
caspasa-3 (página 14, líneas 12 a 16).
Por consiguiente, la invención está basada
sustancialmente en el problema técnico de proporcionar medios
alternativos que tengan uso en la terapia farmacológica de las
enfermedades cardíacas.
Ese problema técnico ha sido resuelto por la
provisión de realizaciones caracterizadas por las reivindicaciones
de la patente. La apoptosis del músculo cardíaco es una máquina de
suicidio celular que está regulada de una manera muy compleja y en
la que dos rutas señal principales conducen a la activación de la
familia de la caspasa y a la promoción de la translocación de la
ADNasa activada por caspasa (CAD) en el núcleo: (a) señalización del
"receptor de muerte" (v.g. receptores Fas, TNF y
DR3-DR6) y (b) liberación de citocromo b a partir de
la mitocondria y posterior transactivación de la procaspasa 9 por
Apaf. La familia de la caspasa de las cisteína proteasas regula el
comienzo de la apoptosis en mamíferos. La caspasa-3
es la enzima clave y escinde las dianas localizadas aguas arriba que
están implicadas en la expresión del fenotipo apoptótico, v.g.,
gelsolin, PAK2, láminas nucleares y, especialmente, la subunidad
inhibidora del factor de fragmentación de ADN (ICAD). El rasgo
bioquímico más importante de la apoptosis es la escisión de ADN
cromosómico en unidades nucleosomales, que parecen ser el evento
final de la apoptosis. La nucleasa responsable de la degradación del
ADN en la apoprosis es CAD. CAD es producida en forma de un complejo
con ICAD para la inhibición de su actividad ADNasa. La
caspasa-3 activada aguas arriba por los estímulos
apoptóticos escinde ICAD, que después permite que CAD entre en el
núcleo y degrade el ADN cromosómico. Durante las investigaciones que
condujeron a la presente invención, se encontró que las actividades
de la caspasa-3 y CAD, las dos moléculas clave en el
proceso de la apoptosis miocárdica, aumentaban en un modelo animal
de CHF, en el que los cambios del nivel hemodinámico y bioquímico
son iguales a los de la correspondiente enfermedad del corazón
humano. La estimulación de la caspasa-3 conduce por
último a la activación de CAD, y ambas enzimas son requeridas por lo
tanto para que la insuficiencia cardíaca progrese. Ha sido posible
mostrar en las investigaciones que la actividad de la
caspasa-3 y de CAD podía ser inhibida
significativamente por la expresión mediada por adenovirus de p35 o
ICAD en los cardiomiocitos. La inhibición de esas enzimas clave
también fue reflejada por una fragmentación reducida del ADN por
ICAD y, aunque en un grado menor, por p35. Puesto que la expresión
de ICAD era claramente más eficaz para inhibir la fragmentación de
ADN in vitro, la expresión del transgen que codifica ICAD
también fue estudiada in vivo en conejos con insuficiencia
cardíaca. Si bien la infección de miocardio de conejo con adenovirus
de control recombinantes no tenía efecto sobre la apoptosis de los
cardiomiocitos, la función hemodinámica de los corazones con
insuficiencia que expresaban ICAD era al menos parcialmente
restaurada (Fig. 6). Por tanto fue posible observar una
contractibilidad mejorada y una presión diastólica final reducida
del ventrículo izquierdo con una reducción de la fragmentación del
ADN inducida por la caspasa-3. Se supone que, en los
síndromes anteriores, la mayor parte de los cardiomiocitos están en
estado pre-apoptótico con actividades incrementadas
de las enzimas implicadas en la apoptosis, que expresan una
preparación de esas células a la apoptosis, pero no indica aún que
ese proceso haya tenido lugar realmente. Los presentes resultados
muestran, sin embargo, que la apoptosis miocárdica contribuye al
progreso de la insuficiencia cardíaca y que la prevención de la
apoptosis en los cardiomiocitos tiene una función útil, es decir la
prevención de la apoptosis es claramente un objetivo atractivo para
la intervención terapéutica. Por medio de los resultados con
corazones con insuficiencia infectados con Ad-p35 o
Ad-ICAD, también es posible mostrar que un enfoque
anti-apoptótico en el caso de la insuficiencia
cardíaca no sólo evita la fragmentación del ADN nuclear, sino que
también mantiene la organización en sarcómeros y por tanto mejora la
fuerza contráctil de las células del músculo cardíaco que todavía
están vivas. Por consiguiente, para la intervención terapéutica en
las enfermedades cardíacas comentadas antes, que están asociadas con
la apoptosis de los cardiomiocitos, la administración de un factor
que inhiba la actividad de CAD o de la caspasa-3, o
del gen que las codifica, puede ser beneficiosa. Por otra parte, la
posibilidad de inhibir la expresión del gen que codifica CAD o
caspasa-3 también puede ser terapéuticamente útil.
Semejante inhibición puede, por lo tanto, tener lugar a diversos
niveles, por ejemplo a nivel genético ("knock out", inhibición
de la traducción por ARN antisentido o por ribozimas) o a nivel
proteico (por medio de anticuerpos inhibidores de CAD o de
caspasa-3, ICAD, etc.).
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a un procedimiento de rastreo para identificar un inhibidor
de caspasa-3 o desoxirribonucleasa activada por
caspasa (CAD) para la prevención o el tratamiento de las
enfermedades cardíacas, especialmente de la insuficiencia cardíaca,
especialmente la insuficiencia del ventrículo izquierdo.
El inhibidor es, por ejemplo, un compuesto que
inhibe la expresión del gen que codifica CAD o
caspasa-3, por ejemplo una ribozima o un ARN
antisentido. Puesto que la secuencia de ácido nucleico completa del
gen que codifica CAD o caspasa-3 es conocida, la
persona experta en la técnica es capaz de identificar tales
compuestos mediante procedimientos rutinarios y someter a ensayo su
acción, por ejemplo, por medio de los procedimientos descritos en
los Ejemplos más abajo.
Una realización mucho más preferida de la
presente invención hace referencia por lo tanto a un procedimiento
de rastreo para identificar un ARN antisentido que se caracteriza
porque es complementario al ARNm transcrito por el gen que codifica
CAD o caspasa-3, o a una porción del mismo,
preferiblemente la región codificadora, y es capaz de unirse
especialmente a ese ARNm, como resultado de lo cual la síntesis de
CAD o caspasa-3 es reducida o inhibida. Una
realización mucho más preferida adicional de la presente invención
hace referencia a un procedimiento de rastreo para identificar una
ribozima que se caracteriza porque es complementaria al ARNm
transcrito por el gen que codifica CAD o caspasa-3,
o a una porción del mismo, y es capaz de unirse específicamente a
ese ARNm y escindirlo, como resultado de lo cual la síntesis de CAD
o caspasa-3 es reducida o inhibida. Partiendo de las
secuencias de CAD o caspasa-3 descritas, la persona
experta en la técnica es capaz de preparar y utilizar ARN
antisentido adecuados. Los procedimientos adecuados se describen en
EP-B1 0.223.399 o EP-A1 0.458, por
ejemplo. Las ribozimas son enzimas de ARN y constan de una única
hebra de ARN. Son capaces de escindir otros ARN intermolecularmente,
por ejemplo los ARNm transcritos por las secuencias que codifican
CAD o caspasa-3. Tales ribozimas deben tener en
principio dos dominios, (1) un dominio catalítico y (2) un dominio
que es complementario al ARN diana y es capaz de unirse a este, lo
que es un pre-requisito para la escisión del ARN
diana. Partiendo de los procedimientos descritos en la literatura,
es posible mientras tanto, construir ribozimas específicas que
cortan un ARN deseado por un sitio concreto,
pre-seleccionado (ver, por ejemplo, Tanner y col.,
en: Antisense Rsearch and Applications, CRC Press, Inc. (1.993),
415-426).
En una realización preferida adicional del
procedimiento de rastreo según la invención para identificar los
inhibidores de caspasa-3 o CAD, el inhibidor es el
ICAD o Baculovirus-p35 descritos en los Ejemplos más
abajo.
En una realización preferida adicional del
procedimiento de rastreo según la invención para identificar los
inhibidores de caspasa-3 o CAP, el inhibidor es un
anticuerpo que se une a caspasa-3 o CAP, o un
fragmento del mismo. Tales anticuerpos pueden ser anticuerpos
monoclonales, policlonales o sintéticos o fragmentos de los mismos.
En relación con esto, el término "fragmento" representa todas
las partes del anticuerpo monoclonal (v.g., Fab, Fv o fragmentos Fv
de cadena sencilla) que tienen la misma especificidad epitópica que
el anticuerpo completo. La preparación de tales fragmentos es
conocida por la persona experta en la técnica. Los anticuerpos según
la invención son preferiblemente anticuerpos monoclonales. Los
anticuerpos según la invención pueden ser preparados según
procedimientos normalizados, en los que la proteínas
caspasa-3 o CAP o un fragmento sintético de la misma
sirve preferiblemente como inmunógeno. Los procedimientos para
obtener anticuerpos monoclonales son conocidos por la persona
experta en la técnica. El anticuerpo monoclonal puede ser un
anticuerpo que se origina a partir de un animal (v.g. ratón), un
anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico o un fragmento del
mismo. Los anticuerpos quiméricos que se asemejan a anticuerpos
humanos o anticuerpos humanizados poseen una antigenicidad potencial
reducida, pero su afinidad con respecto a la diana no está reducida.
La preparación de los anticuerpos quiméricos y humanizados, o de
anticuerpos que se asemejan a los anticuerpos humanos, ha sido
descrita exhaustivamente (ver, por ejemplo, Queen y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86 (1.989), 10029, Y Verhoeyan y col.,
Science 239 (1.988), 1534). Las inmunoglobulinas
humanizadas tienen regiones de estructura básica variable, que se
originan sustancialmente a partir de una inmunoglobulina humana
(referida como inmunoglobulina aceptora) y la complementariedad de
las regiones determinantes, que se originan sustancialmente a partir
de una inmunoglobulina no humana (v.g. de ratón) (referida como
inmunoglobulina donadora). La región o las regiones constantes,
cuando están presentes, también se originan sustancialmente a partir
de una inmunoglobulina humana. Cuando se administran a pacientes
humanos, los anticuerpos humanizados (así como los humanos) ofrecen
numerosas ventajas sobre los anticuerpos de ratones u otras
especies: (a) el sistema inmune humano no debe reconocer la
estructura básica o la región constante del anticuerpo humanizado
como foráneo, y la respuesta de los anticuerpos a semejante
anticuerpo inyectado deberá ser por lo tanto menor que la respuesta
a un anticuerpo de ratón completamente foráneo o un anticuerpo
quimérico parcialmente foráneo; (b) puesto que la región efectora
del anticuerpo humanizado es humana, interacciona mejor con otras
partes del sistema inmune, y (c) los anticuerpos humanizados
inyectados tienen una vida media que es sustancialmente equivalente
a la de los anticuerpos humanos de origen natural, que permite
administrar dosis más pequeñas y menos frecuentes en comparación con
los anticuerpos de otras especies.
Preferiblemente los inhibidores mencionados antes
no son administrados como tales si no que son administrados por
medio de la terapia génica, es decir las secuencias de ADN que
codifican esos inhibidores (v.g. ribozimas, ARN antisentido,
anticuerpos, ICAD, Baculovirus-p35), preferiblemente
insertados en un vector de expresión son llevadas al órgano diana.
Por consiguiente, en la presente invención también se incluyen
vectores de expresión que contienen secuencias de ADN que codifican
esos inhibidores. El término "vector" hace referencia a un
plásmido (pUC18, pBR322, pBlueScript, etc.), a un virus o a otro
vehículo adecuado. Las secuencias de ADN están conectadas
funcionalmente en el vector a elementos reguladores que permiten su
expresión en células huésped procarióticas o eucarióticas. Además de
los elementos reguladores, tales vectores contienen, por ejemplo, un
promotor, típicamente un origen de replicación y genes específicos
que permiten la selección fenotípica de una célula huésped
transformada. Los elementos reguladores para la expresión en
procariotas, por ejemplo E. coli, incluyen el promotor lac-,
trp o el promotor de T7, y para la expresión en eucariotas el
promotor AOX1 o GAL1 en levaduras y el promotor de CMV, SV40-,
RVS-40, el intensificador de CMV o SV40 para la
expresión en células animales. Las secuencias reguladoras adecuadas
se describen adicionalmente en Goeddel: Gene Expresion Technology:
Methods in Enzimology 185, Academic Press, San Diego, CA (1.990).
Los ejemplos adicionales de los promotores adecuados son el promotor
de la metalotioneína I y de la polihedrina. Entre los vectores de
expresión adecuados para E. coli se incluyen, por ejemplo, pGEMEX,
derivados de pUC, pGEX-2T, pET3b y
pQE-8. Entre los vectores adecuados para la
expresión en levadura se incluyen pY100 e Ycpad1, para la expresión
en células de mamífero pMSXND, pKCR, pEFBOS, cDM8 y pCEV4 así como
vectores que se originan a partir de pcDNAI/amp, pcDNAI/neo,
pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo,
pMSG, pSVT7, pko-neo y pHyg.
Las secuencias de ADN descritas antes son
insertadas preferiblemente en un vector adecuado para la terapia
génica, por ejemplo, bajo el control de un promotor específico del
tejido, y transferidas a las células. En una realización preferida
el vector que contienen las secuencias de ADN descritas antes es un
virus, por ejemplo, un adenovirus, un virus Vaccinia o un
retrovirus. Los ejemplos de los retrovirus adecuados son MoMuLV,
HaMuSV, MuMTV, RSV o GaLV. Los adenovirus son particularmente
preferidos, especialmente aquellos que tienen las mutaciones E1 y/o
E3 (deleciones), que también pueden tener adicionalmente una
mutación E4 (deleción), o los adenovirus "gutless"
(destripados). Los vectores adecuados para la terapia génica se
describen adicionalmente en WO 93/04701, WO 92/22635, WO 92/20316,
WO 92/19749 y WO 92/06180. Para los fines de la terapia génica, las
secuencias de ADN según la invención también pueden ser
transportadas a las células diana en forma de dispersiones
coloidales. Entre estas se incluyen, por ejemplo, los liposomas o
los lipoplejos (Mannino y col., Biotechniques 6 (1.988), 682).
Se pueden utilizar los procedimientos generales
conocidos en el campo para la construcción de vectores de expresión
que contienen aquellas secuencias de ADN y secuencias de control
adecuadas. Entre tales procedimientos se incluyen, por ejemplo, los
mecanismos de recombinación in vitro, los procedimientos
sintéticos, así como los mecanismos de recombinación in vivo,
como se describe en los libros de texto comunes.
Los compuestos anteriores, o las secuencias de
ADN o los vectores que las codifican, son administrados
opcionalmente junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Los
portadores adecuados y la formulación de tales medicamentos son
conocidos por la persona experta en la técnica. Entre tales
portadores se incluyen, por ejemplo, soluciones de cloruro de sodio
tamponadas con fosfato, agua, emulsiones por ejemplo emulsiones de
aceite/agua, agentes humectantes, soluciones estériles, etc. La
dosificación adecuada es determinada por el doctor que proporciona
el tratamiento y depende de diversos factores, por ejemplo de la
edad, el sexo y el peso del paciente, de la naturaleza y la fase de
la enfermedad cardíaca, de la naturaleza de la administración,
etc.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para identificar un compuesto que es eficaz como
inhibidor en los procedimientos terapéuticos anteriormente
descritos, comprendiendo el procedimiento (a) poner en contacto el
compuesto de ensayo que es adecuado posiblemente como inhibidor con
la caspasa-3 o CAD o con el gen que codifica la
caspasa-3 o CAD, y (b) determinar la actividad
caspasa-3 o CAD residual o la disminución de la
expresión génica, preferiblemente en comparación con un análisis de
control en el que el compuesto de ensayo no está presente. Una
actividad enzimática o una expresión génica disminuida o
completamente inhibida indica que el compuesto de ensayo es eficaz
como inhibidor. Los análisis adecuados son conocidos por las
personas expertas en la técnica y también se describen, por ejemplo,
en los ejemplos de más abajo. El procedimiento también puede ser
llevado a cabo en un análisis celular. Los compuestos de ensayo
pueden ser una amplia variedad de compuestos, tanto compuestos de
origen natural como sintéticos, compuestos orgánicos e inorgánicos,
así como polímeros (v.g. oligopéptidos, polipéptidos,
oligonucleótidos y polinucleótidos) así como moléculas pequeñas,
anticuerpos, azúcares, ácidos grasos, nucleótidos y análogos de
nucleótidos, análogos de estructuras de origen natural (v.g.
"imitadores" peptídicos, análogos de ácidos nucleicos, etc.) y
otros numerosos compuestos. Además, se puede rastrear un gran número
de compuestos posiblemente útiles que inhiben la apoptosis de los
cardiomiocitos en extractos de productos naturales como sustancia de
partida. Tales extractos pueden ser originados a partir de un gran
número de fuentes, por ejemplo de la clase de los hongos,
actinomicetos, algas, insectos, protozoos, plantas y bacterias. Los
extractos que manifiestan actividad pueden ser analizados después
con el fin de aislar la molécula activa. Ver, por ejemplo, Turner,
J. Ethno-Pharmacol. 51 (1-3)
(1.996), 39-43 y Suh, Anticancer Res. 15
(1.995) 233-239. Los formatos de análisis
fundamentalmente adecuados que afectan a la expresión o actividad de
CAD o de la caspasa-3 son bien conocidos en la
industria biotecnológica y farmacéutica, y los análisis y las
variaciones adicionales de tales análisis son obvios para las
personas expertas en la técnica. Los cambios en el nivel de
expresión de la caspasa-3 o CAD pueden ser
investigados utilizando procedimientos bien conocidos para la
persona experta en la técnica. Entre estos se incluyen el control de
la concentración de ARNm (v.g. utilizando sondas o cebadores
adecuados), los inmunoanálisis con respecto a la concentración de
proteína, los análisis de protección de la ARNasa, los análisis
basados en la amplificación o cualquier otro método adecuado para la
detección que sea conocido en el campo.
La búsqueda de compuestos que sean eficaces para
la terapia y la prevención de la apoptosis de los cardiomiocitos
también se puede llevar a cabo a gran escala, por ejemplo rastreando
un número muy grande de posibles compuestos en bancos de sustancias,
siendo posible que los bancos de sustancias contengan moléculas
sintéticas o naturales. En cualquier caso, la preparación y el
rastreo simultáneo de grandes bancos de moléculas sintéticas puede
ser llevado a cabo por medio de procedimientos bien conocidos de la
química combinatoria, ver, por ejemplo, van Breemen, Anal. Chem.
69 (1.997), 2159-2164 y Lam, Anticancer Drug
Des. 12 (1.997), 145-167. El procedimiento
según la invención también puede ser enormemente acelerado en forma
de un rastreo de rendimiento elevado. Los análisis descritos aquí
pueden ser modificados adecuadamente para su uso en tales
procedimientos. Es obvio para la persona experta en la técnica que
se encuentran disponibles numerosos procedimientos para ese fin.
Registros ecocardiográficos transtorácicos en
modo M en animales de control (arriba) y animales CHF (abajo). Los
diámetros del ventrículo izquierdo se indican por medio de una
flecha de doble cabeza; EDD: diámetro diastólico final; ESD:
diámetro sistólico final; Al cabo de dos semanas, los animales con
marcapasos muestran una dilatación del ventrículo con movimientos de
la pared reducidos, lo que indica una función cardíaca reducida y
una tensión de la pared incrementada.
- a:
- Análisis fluorogénico de los niveles de enzima caspasa-3 medidos en fracciones citosólicas de miocitos aislados de miocardio de control y miocardio con marcapasos (CHF); n = 5 por grupo, p < 0,005 ANOVA con análisis post-hoc de Scheffé.
- b:
- Fragmentación de ADN genómico que había sido aislado de núcleos de hígado de conejo aislados y había sido incubado con extractos citosólicos de miocardio de control y cardiomiocitos de insuficiencia (CHF). La fragmentación de ADN refleja la actividad de la desoxirribonucleasa activada por caspasa (CAD).
- c:
- El ADN aislado del corazón de animales con insuficiencia al cabo de 7 días (CHF 7) y 15 días (CHF 15) mostraba una elevación del escalonamiento del ADN en comparación con el tejido de control.
- d:
- El complejo ADN/histona liberado fue cuantificado con un sistema ELISA de los cardiomiocitos de control y de cardiomiocitos con marcapasos.
Los datos se expresan como los valores medios
\pm EMS; n = 5 por grupo; p < 0,005.
- a:
- Se midió la actividad caspasa-2 en cardiomiocitos de control aislados y células estimuladas con TNF\alpha en presencia de un constructo de adenovirus para p35 (Ad-p35), del constructo vacío (Ad-GFP) y del tetrapéptido inhibidor para la caspasa-3 (DEVD).
- b:
- Se determinó la formación de ADN/histona en células de control aisladas y en cardiomiocitos ventriculares estimulados por TNF\alpha tras la infección por adenovirus con Ad-p35, Ad-ICAD y Ad-GFP (como control).
- c:
- Los cardiomiocitos fueron aislados de miocardio de control y miocardio con marcapasos (CHF), y se midió la actividad caspasa-3 en extractos citosólicos. La 3^{a} y 4^{a} columnas representan medidas de la actividad enzimática de cardiomiocitos de miocardio del ventrículo izquierdo tras la transferencia génica por adenovirus de Ad-p35 y Ad-GFP (como control).
- d:
- Se aislaron miocitos ventriculares de corazones de control y corazones con marcapasos (CHF) y se cuantificó la formación de ADN/histona en extractos libres de células. La 3^{a} y 4^{a} columnas representan el análisis de fragmentación de ADN sobre células de animales después de la transferencia génica miocárdica con Ad-ICAD y adenovirus Ad-GFP de control.
- e:
- Análisis por inmunotransferencia de extractos citosólicos de pared anterolateral de miocardio infectado con Ad-p35 0, 4, 7 y 15 días después de la transferencia génica. La inmunotinción se llevó a cabo con los dos anticuerpos monoclonales anti-Flag M2 y anticuerpo anti-actina de los sarcómeros \alpha para p35, con el fin de permitir la documentación de la expresión de p35 y actina en paralelo.
Los datos se expresan como los valores medios
\pm EMS; n = 4 por grupo; p < 0,01, p < 0,001.
- a:
- Secciones macroscópicas de corazones de conejo, en las que un adenovirus que codifica la \beta-galactosidasa ha sido inyectado bajo control por ultrasonidos (grosor de la sección: 7 \mum, distancia entre secciones individuales: 200 \mum). Las secciones fueron teñidas con X-Gal. El miocardio ventricular izquierdo se denomina LV, el miocardio ventricular derecho se denomina RV.
- b:
- Análisis por inmunotransferencia de extractos citosólicos de miocardio infectado con Ad-GFP, Ad-ICAD y Ad-p35.
- c:
- Fragmentación de ADN genómico que había sido aislado de núcleos de hígado de conejo aislados, tras la incubación con extractos citosólicos de los cardiomiocitos de control ventriculares aislados y los miocitos de la insuficiencia (CHF). Además, se analizó in vivo la actividad de fragmentación de ADN de los cardiomiocitos tras la transferencia génica de adenovirus con Ad-ICAD y Ad-GFP.
- a:
- La expresión de GFP en secciones macroscópicas de miocardio infectado fue visualizada mediante microscopia de fluorescencia de contraste de fases utilizando un filtro de 450-490 nm.
- b:
- La expresión transgénica directa tras la infección por Ad-ICAD fue demostrada por inmunotinción con un anticuerpo monoclonal anti-FLAG contra el epítopo sintético introducido en ambos transgenes. La muestra fue visualizada mediante microscopia de fluorescencia utilizando un filtro de 546 nm (fluorescencia por rodamina).
- c,d:
- Se aislaron cardiomiocitos ventriculares a partir de miocardio infectado con Ad-p35, y se documentó la expresión transgénica mediante microscopia de fluorescencia para GFP y el anticuerpo anti-FLAG.
Se llevó a cabo la caracterización cardíaca en el
estado basal y a concentraciones crecientes de adrenalina.
- a:
- registros del acortamiento fraccionario sobre corazones de control y corazones infectados con Ad-GFP o Ad-ICAD después de 15 días de la provisión del marcapasos. El porcentaje de acortamiento fraccionario se calculó como % FS = [(EDD-ESD)/EDD] x 100.
- b:
- Los diámetros diastólicos finales del ventrículoizquierdo se muestran para el control y para el miocardio infectado con Ad-GFP o Ad-ICAD, después de un tiempo de marcapasos de 15 días.
- c:
- Las presiones diastólicas finales del ventrículo izquierdo fueron determinadas para el control y para animales Ad-GFP o Ad-ICAP tras la provisión del marcapasos.
- d:
- El desarrollo de LVEDP durante el período de la provisión del marcapasos se muestra para los animales Ad-GFP, Ad-ICAD y de control al cabo de 7 y 15 días.
- e:
- Registros dp/dtmax de los animales de control y de los animales tratados con Ad-ICAD, tras la administración de concentraciones crecientes de adrenalina. Los datos se muestran como los valores medios \pm EMS.
La infección con constructos de adenovirus se
llevó a cabo antes del inicio del período de marcapasos.
- a:
- Se estimó el acortamiento fraccionario en el control, CHF y a los 15 días de la administración transcoronaria de Ad-GFP o Ad-p35 a corazones provistos de marcapasos.
- b:
- Curso del acortamiento fraccionario con el tiempo a los 7 y 15 días de la provisión de marcapasos.
- c:
- Se estimó la presión intraventricular diastólica final reducida (LVEDP) en el control, CHF y a los 15 días de la administración transcoronaria de Ad-GFP o Ad-p35 a corazones provistos de marcapasos.
- d:
- registros dp/dtmax tras la administración de dosis crecientes de epinefrina. Los datos se muestran como los valores medios \pm EMS (n = 8 por grupo); * p < 0,05; ** p < 0,001) en comparación con el control y corazones CHF y Ad-GFP.
- a,b,c:
- Se aislaron células de músculo cardíaco de conejo ventricular a partir de la pared anterolateral del control (a), CHF (b) y miocardio con insuficiencia infectado con p35 (c) y se visualizaron tras la tinción con faloidina por medio de microscopia de barrido con láser confocal.
- d:
- Amplitud de contracción en células de músculo cardíaco aislado (n = 60 células de cuatro conejos por grupo).
- e:
- La morfología de las fibras musculares teñidas con faloidina se evaluó semi-cuantitativamente basándose en el área ocupada por el sarcómero organizado en la región celular total: débil, menos de 1/3 de la región celular (región negra); moderada, menos de 2/3 de la región celular (región gris); buena, región celular total (región vacía). Se contaron 120 células aisladas de 4 animales para cada grupo. Los datos (en d) fueron expresados como el valor medio \pm EMS (* p < 0,001 en comparación con el miocardio provisto con un marcapasos (CHF+Ad-GFP)).
- a,b:
- Se inyectó dextrano conjugado con FITC solo (a) o dextrano conjugado con FITC + caspasa-3 activa recombinante humana (b) (imagen a mano izquierda: 4 nm/\muM; imagen a mano derecha: 20 ng/\mul) en células del músculo. La morfología de las fibras de actina fue visualizada por medio de microscopia de barrido con láser confocal tras la tinción con faloidina.
- c:
- La amplitud de la contracción en condiciones basales y de estimulación con isoprenalina (10^{-8} moles/litro) fue determinada en las células tras la microinyección de dextrano conjugado con FITC (como control) o de caspasa-3 (CPP32). Asimismo se llevó a cabo la pre-incubación con DEVD-fmk (R and D Systems, Wiesbaden, Alemania) (columna gris). n = 45 células para cada grupo. Los datos de C se muestran como el valor medio \pm EMS (* p < 0,005 en comparación con las células de control inyectadas (basal; 10^{-8} moles/\ell isoprenalina).
Amplitud de la contracción en células de músculo
cardíaco aisladas (n = 60 células de cuatro conejos por grupo). El
ensayo se llevó a cabo como se describe en la Fig. 8d; n.s. = no
significativo, ** p < 0,05.
Los siguientes Ejemplos ilustran la
invención.
Se prepararon adenovirus recombinantes (E1 y E3
deficientes; serotipo 5) que codifican el inhibidor de la ADNasa
activada por caspasa (ICAD) de rata o el supresor de la apoptosis de
Baculovirus p35 como describen He y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 95, (1.988), 2509-2514. En este punto, la
secuencia que codifica ICAD o p35 y provista en el extremo N del
epítopo "Flag" (Stratagene, La Jolla, CA, USA) fue insertado en
la secuencia poliligadora del vector "pAdTrack" que expresa GFP
entre un promotor de citomegalovirus (CMV) no específico de tejidos
y una señal de poliadenilación de SV40 (Enari y col., Nature
391, (1.988), 43-50), (Davidson y Steller, Nature
391, (1.988), (587-591), He y col., supra),
(Inan y col., Onkogene 13, (1.996) 749-755). El
plásmido resultante fue transformado simultáneamente después junto
con el plásmido "pAdEasy-1" en bacterias BJ5138
electrocompetentes (He y col., supra). Para la preparación de
un adenovirus de control que contenía solamente el gen para GFP
intensificado, se llevó a cabo una transformación simultánea con los
plásmidos "pAdTrack" y "pAdEasy". El ADN del adenovirus
vector recombinante fue extraído de los clones positivos y
transfijado en células HEK 293 subconfluentes utilizando un reactivo
de transfección "SuperFectTM" (QIAGEN, Hilden, Germany). Los
virus recombinantes (Ad-ICAD,
Ad-p35 y Ad-GFP) fueron obtenidos
del producto lisado celular y fueron analizados por medio de PCR y
escisiones de restricción.
Tras el aislamiento, se prepararon adenovirus
recombinantes a gran escala por infección de células HEK 293
subconfluentes en placas de 150 mm (moi: 5 pfu/célula). Al cabo de
48 a 72 horas después de la infección tras la aparición de la acción
citopatogénica, se recogieron las células mediante raspado y
centrifugación durante 20 minutos a 1.000 x g. El sedimento celular
fue resuspendido en PBS y Triton-X 100^{r} al
0,25%. El producto homogeneizado fue incubado durante 10 minutos a
la temperatura ambiente y los núcleos de las células HEK abiertos
fueron separados mediante una etapa de centrifugación a 2.500 x g
(20 minutos). El sobrenadante que contenía las partículas de virus
fue introducido en un gradiente por etapas de CsCl (1,3 a 1,4 g de
CsCl/ml, disuelto en tampón TE) y sometido a ultracentrifugación
durante 1,5 horas a 10ºC y a 150.000 x g. La banda de virus que se
formaba en la interfase de 1,3 y 1,4 g/ml fue separada con una
jeringa, sometida a diálisis frente a PBS conteniendo sacarosa al 1%
y glicerol al 10%, y almacenada en alícuotas a -80ºC. Los títulos de
adenovirus fueron determinados por medio de titulación en placa
sobre células HEK 293 (Krown y col., J. Clin. Invest. 98
(1.996), 2854-2865).
Se cultivaron cardiomiocitos H9c2 (ATCC CRL 1446,
cardiomioblastos de rata) en monocapas en DMEM, FBS al 10%, 2
mmoles/litro de glutamina, penicilina (100 IE/ml) y estreptomicina
(100 \mug/ml) en CO_{2} al 10% a 37ºC en una incubadora
humidificada. Una vez que los cardiomioblastos hubieron alcanzado
una confluencia del 70 al 80%, fueron transfectados en PBS con un
título de adenovirus adecuado. Tras la incubación durante una hora a
la temperatura ambiente, el medio de cultivo se hizo volver a las
placas. Al cabo de 36 a 48 horas de la infección del adenovirus, se
utilizaron las células para los experimentos individuales.
Se aislaron miocitos ventriculares tolerantes al
calcio individuales de ratas Wistar de 12 a 16 semanas de edad
(300-450 g) o de conejos New Zealand macho de 3
meses de edad (2,8-3 kg). Los corazones escindidos
fueron perfundidos vía aorta, a una velocidad de flujo directo
constante, con medio "Powell" libre de Ca^{2+} (110
moles/litro de NaCl, 2,5 mmoles/litro de KCl, 1,2 mmoles/litro de
KH_{2}PO_{4}, 1,2 mmoles/litro de MgSO_{4}, 11 mmoles/litro de
glucosa, 25 mmoles/litro de NaHCO_{3}, equilibrado con CO_{2} al
5% y ajustado a un valor de pH de 7,4). Al cabo de 10 minutos, la
digestión enzimática fue reemplazada por la sustitución del tampón
sin Ca^{2+} por 110 a 218 IE/ml (para ratas o conejos
respectivamente) de tipo colagenasa II (Worthington, Freehold, Nueva
Jersey, USA) y medio "Powell" conteniendo 30 o 40
\mumoles/litro de Ca^{2+} (para ratas o conejos,
respectivamente). Tras una digestión completa del tejido, el corazón
fue separado del dispositivo de perfusión, y el músculo ventricular
fue expuesto y disociado mecánicamente en el medio "Powell" con
oxigenación constante. Tras la filtración sobre una membrana de
nailon (tamaño de malla 200 \mum), la suspensión celular fue
centrifugada durante 3 minutos a 20 x g y las células fueron
resuspendidas en medio "Powell" conteniendo 0,2 mmoles/litro de
Ca^{2+}. Se dejó que las células se sedimentaran, y el sedimento
se recogió en medio "Powell" conteniendo 0,4 mmoles/litro de
Ca^{2+} y se introdujo cuidadosamente en gradiente de seralbúmina
bovina al 4% (BSA) en medio "Powell" (1 mmol/litro de
Ca^{2+}). Tras la centrifugación durante 2 minutos a 20 x g, los
cardiomiocitos fueron resuspendidos en medio de cultivo M199
(suplementado con vitaminas MEM, aminoácidos no esenciales MEM, 25
mmoles/litro HEPES, 10 \mug/litro de insulina, 100 IE/ml de
penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina y 100 \mug/ml de
gentamicina), cultivados en placas revestidas previamente con
laminina (5-10 \mug/cm^{2}) a una densidad de
10^{5} células por cm^{2} y cultivadas en una atmósfera
humidificada (CO_{2} al 5%) a 37ºC. La infección de los
cardiomiocitos con los adenovirus tuvo lugar de 6 a 8 horas después
del cultivo en placa en medio de cultivo M199. Tras el aislamiento
de las células de conejo infectadas in vivo de manera normal
o insuficiente y su uso para la determinación de la aparición de
apoptosis, éstas fueron congeladas directamente a -80ºC en forma de
un sedimento inmediatamente después de la centrifugación en un
gradiente de BSA al 4%.
(I) Para la determinación inmunológica de las
proteínas inducidas GFP, ICAD y p35, se cosecharon los
cardiomioblastos H9c2 48 horas después de la infección (moi: 50
pfu/célula) en tampón HEPES 10 mM, valor de pH 7,0 (que contenía
fosfato de \beta-glicerol 40 mM, NaCl 50 mM,
MgCl_{2} 2 mM, EGTA 5 mM, DTT 1 mM, ATP 2 mM, fosfato de creatina
10 mM, 50 \mug/ml de creatina quinasa, PMSF 1 mM, 1 \mug/ml de
leupeptina, 1 \mug/ml de pepstatina, 10 \mug/ml de aprotinina,
16 \mug/ml de benzamidina, 10 \mug/ml de fenantrolina) y se
rompieron por medio de cuatro ciclos de congelación/descongelación.
Los productos lisados resultantes fueron centrifugados durante 30
minutos a 15.000 rpm y se determinaron las concentraciones de
proteína en un análisis "Bradford". Se diluyeron cantidades
iguales de proteína (50-200 \mug) con tampón de
aplicación SDS, se separaron sobre un gel de poliacrilamida al 12%,
y se transfirieron mediante electroforesis a una membrana de
nitrocelulosa (Bio-Rad Laboratories, Munich,
Alemania). Las transferencias fueron teñidas con rojo "Ponceau"
con el fin de verificar la transferencia de proteínas. Tras bloquear
durante la noche con polvo de leche sin grasa al 5% en TBST
(tris-HCl 10 mM, valor de pH 8,0, NaCl 150 mM,
Tween-20® 0,05), las membranas fueron incubadas
durante una hora con anticuerpos anti-FLAG M2
(Stratagene), que se había diluido 1:10.000 (determinación ICAD) o
1:1.000 (determinación p35) en TBST (con BSA al 0,1% y azida de Na
al 0,02%). Los complejos antígeno/anticuerpo fueron visualizados,
por medio de quimioluminiscencia (estuche de detección "ECL",
Amersham Pharmacia Biotech, Viena, Austria), tras la incubación de
las membranas durante una hora con IgG anti-ratón
diluida 1:10.000 y conjugados con peroxidasa de rábano picante
(Sigma-Aldrcih Chemie GmbH, Munich, Alemania).
(II) Los productos de la escisión de ICAD nativo
de los productos lisados de miocardio con simulacro de operación y
malogrado fueron demostrados utilizando anticuerpos policlonales de
cabra frente al extremo N de Icad de ratón (St. Cruz Biotechnology,
Santa Cruz, USA) (dilución: 1:1.000). Algunos extractos de los
corazones de control también fueron incubados durante 30 minutos a
37ºC con 1 ng/\mul de caspasa-3 activa humana
recombinante en presencia o ausencia del inhibidor de
caspasa-3 tetrapeptídico DEVD-fmk (R
and D Systems, Wiesbaden, Alemania) (100 \mumoles/litro). La
demostración inmunológica de p35 y actina de
\alpha-sarcómero en los extractos de miocardio con
simulacro de operación transcoronaria se llevó a cabo por medio del
anticuerpo anti-FLAG M2 de ratón monoclonal
(dilución: 1:1.000) y un anticuerpo anti-actina de
\alpha-sarcómero monoclonal (Sigma, Taufkirchen,
Alemania) (dilución: 1:5.000).
Cardiomiocitos ventriculares adultos aislados,
que habían sido cultivados en placa sobre cubres de microscopio
revestidos con 5 \mug/cm^{2} de laminina, fueron infectados con
adenovirus Ad-GFT de control o con virus
Ad-ICAD o Ad-p35 (moi: 50
pfu/célula) y analizados 48 horas después de la infección. Para la
determinación de la expresión de los transgenes en corazones de
conejo infectados in vivo, el tejido congelado fue cortado
con un microtomo en secciones congeladas en discos que tenían un
grosor de 3 a 4 \mum. Tras lavar tres veces con PBS, las células y
las secciones fueron fijadas durante 15 minutos con paraformaldehído
al 4% en PBS y después permeabilizadas durante 10 o 30 minutos con
saponina en PBS al 0,1%. Con el fin de evitar la unión de
anticuerpos no específica, los cardiomiocitos fueron tratados
durante 30 minutos con FBS en DMEM al 10% antes del marcaje con
anticuerpo anti-FLAG M2 de ratón monoclonal (IgG1)
(Stratagene, 10 \mug/ml). Tras la incubación con IgG
anti-ratón conjugada con rodamina (Santa Cruz
Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA; 4 \mug/ml), las muestras
fueron visualizadas por medio de microscopia de fluorescencia de
contraste de fases utilizando un filtro de 450-490
nm (fluorescencia GFP) y un filtro de 546 nm (fluorescencia
rodamina) (microscopio inverso "Axiovert 25", Zeiss, Jena,
Alemania).
La apoptosis en cardiomiocitos ventriculares
adultos fue determinada por medio de un ELISA de nucleosoma,
cuantitativo, asequible comercialmente dirigido a ADN e histona y
utilizando anticuerpo de ratón monoclonal (Roche Diagnostics,
Manheim, Alemania). La cantidad de nucleosomas en el producto lisado
de 2 x 10^{3} células fue determinada por medio de la peroxidasa
retenida en el complejo inmune y fue evaluada mediante fotometría.
Se evaluaron tres muestras en cada caso, midiéndose la densidad
óptica (DO) a 405 nm. El factor aumentador de la apoptosis fue
calculado para cada grupo experimental como DO (tratamiento)/DO
(control) tras restar la DO_{405} del fondo.
La actividad de la caspasa-3 fue
determinada por medio del estuche de análisis "CPP32"
colorimétrico (Clontech Laboratories GmbH, Heidelberg, Alemania)
mediante la detección de la p-nitroanilida cromófora
tras la escisión del sustrato marcado
Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)-p-nitroanilida.
En este punto, se lisaron 2 x 10^{6} cardiomiocitos adultos, y se
hicieron reaccionar cantidades iguales de proteína con 50
\mumoles/litro de
DEVD-p-nitroanilida durante una hora
a 37ºC. La actividad fue determinada mediante fotometría a 405 nm y
los resultados fueron calibrados con concentraciones conocidas de
p-nitroanilida. Las unidades de actividad proteasa
fueron definidas como la cantidad de caspasa-3 que
se requiere para producir 1 pmol de p-nitroanilida a
25ºC.
La actividad ICAD fue calculada determinando la
inhibición de CAD en la fragmentación de ADN de núcleos de hígado de
conejo. Los núcleos fueron preparados como describen Blobel y Potter
(Science 154 (1.966) y almacenados a -80ºC.
Se infectaron cardiomioblastos H9c2 con
Ad-GFP o Ad-ICAD (moi: 50
pfu/célula), y 48 horas más tarde se estimuló la actividad CAD
mediante tratamiento de las células con
\alpha-TNF de rata (500 E/ml) durante 5 horas. Se
incubaron 100 \mug de proteína de productos lisados celulares
brutos con 2 x 10^{6} núcleos en un tampón de reacción que
constaba de HEPES 10 mM, valor de pH 7,0, fosfato de
\beta-glicerol 40 mM, NaCl 50 mM, MgCl_{2} 2 mM,
EGTA 5 mM, DTT 1 mM, ATP 2 mM, fosfato de creatina 10 mM, 50
\mug/ml de creatina quinasa y una mezcla de inhibidores de
proteasa (fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF), 10 \mug/ml
de leupeptina, 1 \mug/ml de pepstatina, 10 \mug/ml de
aprotinina, 16 \mug/ml de benzamidina, 10 \mug/ml de
fenantrolina). Tras la incubación durante 90 minutos a 37ºC, se
obtuvieron los núcleos por centrifugación a 35.000 x g (5 minutos) y
después se sometieron a lisis durante 30 minutos a 56ºC en
tris-HCl 100 mM, valor de pH 8,5, EDTA 5 mM, NaCl
0,2 M, SDS al 0,2%, 1 mg/ml de proteinasa K. Después el ADN se hizo
precipitar mediante la adición del mismo volumen de isopropanol, se
disolvió en 20 \mul de tris-HCl, valor de pH 8,5
(con EDTA 1 mM y 1 mg/ml de ARNasa A) y se incubó durante 30 minutos
a 37ºC. El ADN se analizó mediante electroforesis en gel (agarosa al
1% en presencia de 0,5 \mug/ml de bromuro de etidio).
Se anestesiaron conejos New Zealand blancos macho
adultos (2-4 kg) con midazolam (2 mg/kg) y
medetomidina (150 \mug/kg), se intubaron y se sometieron a
respiración artificial. Se abrió la pared torácica izquierda y se
anclaron dos cables marcapasos aislados al corazón izquierdo. Tras
este procedimiento, los animales fueron extubados. En los animales
de control, se llevó a cabo una incisión en la pared del tórax con
la implantación de los cables del marcapaso, pero el marcapasos
nunca se puso en marcha. Doce horas después de esta operación, se
inició una velocidad del marcapasos de 360 latidos/minutos. Esto fue
verificado al principio de los ensayos y después semanalmente (en
total a lo largo de un período de 15 días) por medio de un ECG. La
transferencia génica de adenovirus en el músculo cardíaco de conejo
se llevó a cabo según los protocolos conocidos (Weig y col.,
Circulation 101, (2.000), 1578-1585).
La fuerza contráctil del ventrículo izquierdo se
estudió antes y a los 7 y 15 días de la transferencia génica de
adenovirus. Los conejos fueron anestesiados como se ha descrito
antes. Los registros ecocardiográficos (modo M) se llevaron a cabo
como se describe en estudios previos (Gardin y col., Circ. Res.
76 (1.995), 907-914). Además, se controlaron
continuamente el ECG y la presión arterial. Tras la preparación de
la carótida derecha se insertó en el ventrículo izquierdo un catéter
de "punta Millar 2.5 French" (Hugo Sachs, Freiburg, Alemania)
conectado a un dispositivo diferenciador. La posición del catéter
fue verificada tanto mediante fluoroscopia como observando la forma
de la onda de la presión arterial. Tras la determinación de la
fuerza contráctil basal y de la presión del ventrículo izquierdo
(con el marcapasos desconectado), se inyectaron 200 \mul de NaCl
al 0,9% como control negativo. Después de un período de equilibrado
suficiente, se inyectó adrenalina a concentraciones de 0,1 a 0,8 ng.
Las medidas se tomaron antes de las operaciones quirúrgicas y 7 y 15
días después del período de marcapasos.
Los datos son los valores medios \pm EMS de más
de tres experimentos independientes. Los datos fueron verificados en
cuanto a las diferencias estadísticamente relevantes por medio de un
análisis de variancia de "un factor" (ANOVA) y, después de eso,
por medio de un análisis "Scheffé"
post-hoc.
Los experimentos de microinyección se llevaron a
cabo sobre células de músculo cardíaco recién aislado de conejos con
simulacro de operación por medio de un dispositivo de microinyección
"Femto-Jet" (Eppendorf, Hamburg, Alemania). Se
inyectó dextrano conjugado con FITC (6 mg/ml), solo o combinado con
caspasa-3 activa recombinante humana (4 ng/\mul y
20 ng/\mul) en 5 mmoles/litro de tampón fosfato de potasio (valor
de pH 7,4; 100 mmoles/litro de KCl) en el citoplasma de las células
en medio de cultivo (P_{i} = 1.000 hPa, t_{i} = 0,1 seg.,
P_{c} = 30 hPa) que había sido suplementado con 200
\mumoles/litro de BDM (monooxima de butanodiona, Sigma,
Taufkirchen, Alemania), 10 \mumoles/litro de veparamil y,
opcionalmente, 100 \mumoles/litro de DEFD-fmk.
Tras una incubación de 2 horas, se llevaron a cabo las medidas de la
contracción o la tinción con faloidina. Las células inyectadas
fueron seleccionadas por medio de fluorescencia con FITC.
Se utilizó un modelo de insuficiencia cardíaca
congestiva (CHF) con un pequeño volumen minuto, cuyo modelo
corresponde a cambios en humanos a nivel hemodinámico y bioquímico.
En este ensayo, ninguno de los animales moría durante la
implantación del instrumental quirúrgico, aunque había una tasa de
mortalidad del 10 al 20% durante el período de 15 días en el cual se
conectaba el marcapasos. La provisión de un marcapasos crónica en
los 15 días a 360 latidos condujo al descubrimiento clínico general
de insuficiencia cardíaca sistémica incluyendo la dilatación de
ambos ventrículos (Figura 1c), efusiones pleurales y ascitis
abdominal. Los estudios ecocardiográficos mostraron una subida en el
punto de las diástoles finales del ventrículo izquierdo y una
disminución del acortamiento fraccionario en los conejos CHF (Tabla
1(a)). Las medidas hemodinámicas mostraban del mismo modo una
presión diastólica final superior del ventrículo izquierdo y una
fuerza contráctil inferior del ventrículo izquierdo (determinada
mediante LV +dP/dt) y una relajación (determinada mediante
LV-dP/dt) en los conejos provistos de marcapasos
(Tabla 1(b)). Las medidas ecocardiográficas y hemodinámicas
fueron registradas en cada conejo antes de la implantación del
marcapasos y de nuevo al cabo de 7 y 15 días (con el marcapasos
desconectado). Por consiguiente, cada conejo fue utilizado como su
propio control. Los conejos con simulacro de operación no mostraban
diferencia con respecto a los parámetros hemodinámicos. En el
miocardio con insuficiencia, se observaron cambios bioquímicos en la
transducción de la señal \beta-adrenérgica
similares a los del caso de insuficiencia cardíaca en humanos. La
densidad de receptor \beta-adrenérgico se reducía
significativamente en los miocitos de insuficiencia, y la expresión
de \betaARK1 aumentaba.
Con fines de control, se determinaron los valores
antes de la implantación del marcapasos y los valores de CHF tres
semanas después de la implantación del marcapasos. HR, ritmo
cardíaco [latidos/min (bpm en sus siglas en inglés)]; LVEDD,
diámetro diastólico final del LV; LVESD, diámetro sistólico final
del LV; FS, acortamiento fraccionario, determinado como %FS =
[(EDD-ESD/EDD] x 100; LVEDP, presión diastólica
final del LV; LVSP, presión sistólica final del LV; dp/dtmax,
velocidad máxima de incremento de la presión del LV; dp/dtmin,
velocidad máxima de la caída de la presión del LV.
Con el fin de permitir la evaluación de los
rasgos bioquímicos más importantes de la apoptosis en los corazones
de conejos provistos de marcapasos, se aislaron miocitos
ventriculares adultos y se llevaron a cabo numerosos análisis
moleculares. En la fase final de la insuficiencia cardíaca, la
apoptosis en el miocardio intacto está acompañada de degradación del
ADN. Con el fin de estudiar la capacidad de los productos lisados
celulares de los cardiomiocitos de la insuficiencia para efectuar la
degradación del ADN in vitro, se incubaron los núcleos de
hígado con productos lisados celulares de miocitos malogrados, y se
estudió el ADN por medio de electroforesis en gel de agarosa (Fig.
2a). El miocardio con insuficiencia mostraba un incremento de la
actividad para la degradación del ADN en comparación con el tejido
de control. Era posible bloquear esa actividad mediante la
sobre-expresión de ICAD. Además, en los extractos
celulares totales preparados a partir de cardiomiocitos con
insuficiencia y de control, había un incremento significativo
(aproximadamente 3 veces) de la actividad de la
caspasa-3 en las células CHF (Fig. 2b). Los
extractos de citosol del miocardio de los animales provistos de
marcapasos mostraban un incremento de casi 6 veces en fragmentos de
ADN asociados con histona en comparación con los extractos de los
miocitos de control (Fig. 2c).
Para la manipulación de la ruta de la señal de
degradación del ADN activada por caspasa-3 como
última etapa en el procedimiento de la muerte celular miocárdica, se
produjeron constructos de adenovirus para p35 como potente inhibidor
de la caspasa-3 (Ad-p35) e ICAD
(Ad-ICAD) como molécula captadora para CAD activada.
Los constructos de adenovirus fueron construidos de modo que
codificaran el transgen y, con el fin de controlar la expresión
suficientemente, además GFP (Ad-GFP). Además, ambos
transgenes fueron proporcionados con una "etiqueta" epitópica
para la inmunotinción. Antes de la determinación de las
consecuencias funcionales de la infección por adenovirus en el
miocardio con insuficiencia, se estudió la expresión de los
transgenes en miocitos ventriculares apoptóticos estimulados por
TNF\alpha (Fig. 3a,b). Se infectaron cardiomiocitos adultos con
adenovirus que tenían una multiplicidad de infección (moi) de 80
pfu/célula, que ya habían mostrado lograr la expresión óptima del
transgen prácticamente en el 100% de los miocitos ventriculares. A
las 48 horas de la infección con Ad-p35 o
Ad-ICAD, los extractos de miocitos expresaban
niveles de proteína significativos, que fueron determinados mediante
inmunotinción. La actividad caspasa-3 y la
fragmentación de ADN fueron estimuladas in vitro mediante
tratamiento con TNF\alpha (Fig. 3a,b). La expresión adenoviral de
p35 suprimía las actividades caspasa-3 estimuladas
por TNF\alpha al nivel basal in vitro en cardiomiocitos de
conejo ventriculares. Interesantemente, la
sobre-expresión de ICAD daba una formación de
ADN/histona por debajo de los valores del control (Fig. 3a,b). La
infección de cardiomiocitos con adenovirus de control recombinante
(Ad-GFP) no tenía efecto in vitro ni in
vivo sobre los parámetros de la apoptosis en los miocitos (Fig.
3a,b,c,d). Como se muestra en la Fig. 3 y c, los miocitos aislados
de miocardio con insuficiencia mostraban un incremento significativo
en la inducción mediada por caspasa-3 en comparación
con miocitos sanos (38 \pm 6 unidades activas versus 12 \pm 3
unidades activas/incremento de 5,5 veces en la formación de
ADN/histona, n = 5 en cada grupo p < 0,005). Tras la
administración de los dos transgenes de adenovirus in vivo y
el posterior aislamiento de los miocitos ventriculares de la región
diana miocárdica, casi el 50% de las células mostraba
reproduciblemente una tinción GFP positiva. En esas células, ICAD
bloqueaba eficazmente la actividad caspasa-3
inducida por caspasa-3, p35 inhibía parcialmente la
actividad de la enzima. Las infecciones de control no mostraban
efecto (Fig. 3c,d).
En la Fig. 4a se muestran secciones de tejidos de
un corazón de conejo representativo tres días después de la
transferencia génica de Ad-\betaGal
(10^{9}-10^{10} pfu). La transferencia génica
mostraba una expresión génica máxima 6 días después de la infección,
que estaba seguida de una caída gradual en la expresión en las
siguientes semanas. Al cabo de cuatro semanas, menos del 1% del
miocardio estaba infectado. Dos tercios del miocardio del ventrículo
izquierdo manifestaba reproduciblemente la expresión del transgen
(Fig. 4a). Las imágenes fluorescentes de las secciones macroscópicas
de un corazón infectado con Ad-ICAD bicistrónico
mostraban una marcada expresión transgénica sobre el miocardio
manipulado completo y la inmunotinción de la "etiqueta"
epitópica del transgen mostraba señales en la misma región (Fig.
5a,b). Tras la infección con 10^{9}-10^{10} pfu
Ad-ICAD in vivo, casi el 50% de los
cardiomiocitos ventriculares aislados mostraban fluorescencia verde
y una inmunotinción positiva (Fig. 5c,d). p35 (como proteína de
Baculovirus) mostraba niveles de expresión inferiores que ICAD a
títulos virales ajustados exactamente de la misma manera en las
células eucarióticas, que se muestran por la inmunotransferencia de
la Fig. 4b.
Con el fin de evaluar los efectos funcionales de
ICAD con respecto a la prevención del progreso de la insuficiencia
cardíaca como inhibidor de la etapa clave en la muerte de las
células miocárdicas, se midieron los parámetros ecocardiográficos y
hemodinámicos tras la transferencia génica transcoronaria mediada
por adenovirus. Antes de la implantación del marcapasos, los conejos
fueron tratados por medio de la transferencia génica. Los parámetros
ecocardiográficos y hemodinámicos fueron registrados después de un
tiempo con marcapasos de 7 y 15 días (con el marcapasos
desconectado). Los conejos infectados con Ad-GFP
servían como corazones de control. La Fig. 6a muestra los valores
medios del acortamiento fraccionario de la región infectada para
Ad-GFP y Ad-ICAD. Se producía un
claro incremento significativo en animales tratados con
Ad-ICAD, pero no se producía acción en los animales
de control tratados con virus (15 \pm 0,9% vs. 22,3 \pm 1,1%, n
= 6 en cada grupo, p < 0,05). El diámetro diastólico final del
ventrículo izquierdo era de 18 \pm 4 mm en los animales
Ad-GFP, en comparación con 15 \pm 0,5 mm en los
animales infectados con ICAD (Fig. 6b). Con el fin de suplementar la
información ecocardiográfica referente a la fuerza contráctil
miocárdica local, se determinaron la presión diastólica final del
ventrículo izquierdo y +dp/dt como una medida de la fuerza
contráctil ventricular global. La presión diastólica final en el
ventrículo izquierdo de los animales tratados con adenovirus para
ICAD fue restaurada en un grado significativo de nuevo en
comparación con las células infectadas con Ad-GFP
(10,2 \pm 0,8 mm Hg vs. 14 \pm 1,4 mm Hg, n = 6 en cada grupo, p
< 0,05) (Fig. 6c,d). Los valores +dp/dt basales de los animales
infectados con Ad-GFP no diferían de aquellos de los
animales infectados con Ad-ICAD. Tras la inyección
de adrenalina, se observó un incremento superior dependiente de la
dosis con respecto a +dp/dt en los conejos que expresaban ICAD en
comparación con los animales de control.
Con el fin de estudiar el efecto de la expresión
de p35 sobre la función de contracción de las células musculares
cardíacas ventriculares individuales 15 días después de la
administración del gen in vivo, las células fueron aisladas
de la región diana de los animales de control infectados con
Ad-p35 y Ad-GFP y animales CHF y
cultivadas durante 18 horas. Las células que expresan el transgen
fueron seleccionadas por medio de fluorescencia GFP. La Figura 8
(a,b,c) muestra imágenes microscópicas electrónicas por láser tras
la tinción con faloidina para la visualización de la actina
polimérica en células musculares cardíacas de control y células
musculares cardíacas de la insuficiencia, que habían sido aisladas
de corazones manipulados genéticamente. Interesantemente, las
células musculares cardíacas malogradas que expresan p35
manifestaban una estructura en sarcómeros muy organizada en
comparación con las células infectadas de control que tenían las
unidades sarcoméricas destruidas. El grado de organización en
sarcómeros, determinado mediante evaluación
semi-cuantitativa, se muestra en la Figura
8(e). La razón de las células musculares con respecto a los
sarcómeros bien organizados (más de 2/3 de la región celular) era
del 64% \pm 1% en las células musculares cardíacas de control, 13%
\pm 3% en células musculares cardíacas infectadas con
Ad-GFP y 52% \pm 4% en células musculares
cardíacas infectadas con Ad-p35. La amplitud de la
contracción fue medida en células de la insuficiencia y células de
control que habían sido estimuladas eléctricamente a una velocidad
de aproximadamente 70 contracciones por minuto. La infección con
adenovirus no alteraba las características de contracción de las
células musculares cardíacas. Como se muestra en la Figura 8d, las
células musculares malogradas que expresaban p35 mostraban un
acortamiento fraccionario significativamente aumentado en
comparación con los células musculares equivalentes infectadas con
Ad-GFP (4,3 \pm 0,4% vs. 1,8% \pm 0,2%, n = 40
en cada grupo). Esta mejora en la fuerza contráctil también podía
ser observada tras la estimulación con isoprenalina, y la CE_{50}
de la curva dosis-respuesta fue desplazada a valores
superiores, que eran similares a los de las células sanas (Figura
8d). Estos resultados muestran que p35 restaura la organización en
sarcómeros y la contractibilidad de las células musculares cardíacas
con insuficiencia es restaurada de nuevo como resultado.
Además, se midió la amplitud de la contracción en
células de la insuficiencia y en células de control que habían sido
estimuladas eléctricamente a una velocidad de aproximadamente 70
contracciones por minuto. Como se muestra en la Figura 10, las
células musculares cardíacas malogradas que expresaban ICAD
mostraban un acortamiento fraccionario significativamente
incrementado en comparación con células musculares infectadas con
Ad-GFP equivalentes tras la estimulación con
isoprenalina (mejora de 3,8 \pm 0,9% a 9,5 \pm 1,16%), mientras
los valores basales no diferían (1,8 \pm 0,33% vs. 1,75 \pm
0,33%). Estos resultados muestran que ICAD también restaura la
contractibilidad de las células musculares cardíacas malogradas.
Con el fin de poder estudiar si la activación de
caspasa-3 es suficiente para la inducción del
empeoramiento de la organización en sarcómeros, se inyecto la enzima
activada en el citoplasma de células musculares cardíacas
ventriculares adultas sanas. Las células positivas (aproximadamente
10 a 20%) fueron identificadas por medio de fluorescencia con FITC.
Los rasgos morfológicos de las células musculares cardíacas tras la
microinyección de caspasa-3 activada (4 ng/\mul y
20 ng/\mul) en comparación con las células inyectadas con el
control se muestran en la Figura 9(a+b). El tratamiento de
las células musculares con caspasa-3
(CPP-32) efectuaba una rápida destrucción
dependiente de la concentración de los husillos del músculo liso y
estriado (Figura 9b, imagen izquierda y derecha). Los experimentos
de acortamiento con células individuales (células musculares
cardíacas microinyectadas) mostraba una disminución mediada por
caspasa-3 de la contracción basal y estimulada por
isoprenalina (9,8% vs. 4,3% [10^{-8} iso]; n = 30 en cada grupo).
Estos efectos eran bloqueados por la pre-incubación
de las células musculares con DEVD-fmk (Figura
9c).
Claims (4)
1. Un procedimiento de rastreo para identificar
un compuesto que sea eficaz como inhibidor de la
caspasa-3 o la desoxirribonucleasa activada por
caspasa (CAD) para incrementar la contractilidad de un corazón en el
tratamiento de la insuficiencia cardíaca, comprendiendo el
procedimiento las siguientes etapas:
- (a)
- poner en contacto un compuesto de ensayo que es posiblemente adecuado como inhibidor con caspasa-3 o CAD o con el gen que codifica la caspasa-3 o CAD; y
- (b)
- determinar la actividad caspasa-3 o CAD residual o la disminución de la expresión génica;
- (c)
- identificar un compuesto de ensayo como inhibidor potencial cuando éste disminuye o inhibe la actividad de la caspasa-3 o CAD o la expresión del gen que codifica la caspasa-3 o CAD, y
- (d)
- determinar un posible incremento de la contractilidad mediante la administración a un modelo animal o a una célula muscular de corazón, y
- (e)
- identificar un inhibidor potencial como compuesto que es eficaz como inhibidor de la caspasa-3 o CAD cuando la contractilidad resulta incrementada por la administración.
2. El procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque en la etapa (d) el inhibidor potencial
es administrado a un modelo animal para la insuficiencia
cardíaca.
3. El procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque en la etapa (d) el inhibidor potencial
es administrado a células musculares de corazón aisladas.
4. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque las etapas (a) a
(c) se llevan a cabo en un rastreo con elevado rendimiento
total.
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