JPH11239495A - カスパ―ゼ活性化ｄｎア―ゼの阻害物質 - Google Patents
カスパ―ゼ活性化ｄｎア―ゼの阻害物質Info
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Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 種々のアポトーシスに関与するカスパーゼで
活性化されるＤＮアーゼＣＡＤに対する阻害物質ＩＣＡ
ＤおよびそれをコードするｃＤＮＡを提供する。 【解決手段】 マウスのリンパ腫細胞の細胞質画分にカ
スパーゼで活性化されるＤＮアーゼおよびその阻害物質
ＩＣＡＤを確認し、ＩＣＡＤを精製し、長鎖型および短
鎖型をコードするＩＣＡＤｃＤＮＡを２種分離すること
により、組換えＩＣＡＤを得る。
活性化されるＤＮアーゼＣＡＤに対する阻害物質ＩＣＡ
ＤおよびそれをコードするｃＤＮＡを提供する。 【解決手段】 マウスのリンパ腫細胞の細胞質画分にカ
スパーゼで活性化されるＤＮアーゼおよびその阻害物質
ＩＣＡＤを確認し、ＩＣＡＤを精製し、長鎖型および短
鎖型をコードするＩＣＡＤｃＤＮＡを２種分離すること
により、組換えＩＣＡＤを得る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は主としてアポトーシ
スによる細胞死を阻害するタンパク質、詳細には細胞死
の起因となるＤＮＡ分解に関与するカスパーゼ活性化Ｄ
Ｎアーゼの活性を阻害するタンパク質およびそれをコー
ドする遺伝子に関する。
スによる細胞死を阻害するタンパク質、詳細には細胞死
の起因となるＤＮＡ分解に関与するカスパーゼ活性化Ｄ
Ｎアーゼの活性を阻害するタンパク質およびそれをコー
ドする遺伝子に関する。
【０００２】
【発明の背景】アポトーシスは広範な生理的および病理
的刺激に応答して細胞が除かれる過程である［１（本明
細書の一部を構成する引用文献を末尾に列挙し、明細書
中の引用箇所にその文献番号を付した）］。これは胚の
形成、リンパ球の発達、ホルモンが誘導する組織萎縮お
よび老化細胞の交代の間に起きる。アポトーシスは形態
的には原形質膜のブレッビングを伴う細胞の縮小および
核膜に沿った三日月形デポジットの形成を伴う核の凝縮
によって特徴付けられる［２，３］。アポトーシスの最
終段階には細胞自体が断片化し、アポトーシス小体と呼
ばれる小胞構造が現れる。アポトーシスはまた生化学的
にも特徴付けられ、著しい特徴の一つが１８０ｂｐマル
チマーのＤＮＡラダーを生じる染色体ＤＮＡのヌクレオ
ソーム間分解である［４〜６］。このＤＮＡ分解は細胞
死の過程の中で最後の打撃であると思われる。
的刺激に応答して細胞が除かれる過程である［１（本明
細書の一部を構成する引用文献を末尾に列挙し、明細書
中の引用箇所にその文献番号を付した）］。これは胚の
形成、リンパ球の発達、ホルモンが誘導する組織萎縮お
よび老化細胞の交代の間に起きる。アポトーシスは形態
的には原形質膜のブレッビングを伴う細胞の縮小および
核膜に沿った三日月形デポジットの形成を伴う核の凝縮
によって特徴付けられる［２，３］。アポトーシスの最
終段階には細胞自体が断片化し、アポトーシス小体と呼
ばれる小胞構造が現れる。アポトーシスはまた生化学的
にも特徴付けられ、著しい特徴の一つが１８０ｂｐマル
チマーのＤＮＡラダーを生じる染色体ＤＮＡのヌクレオ
ソーム間分解である［４〜６］。このＤＮＡ分解は細胞
死の過程の中で最後の打撃であると思われる。
【０００３】
【従来の技術】サイトカインおよび抗癌薬のような種々
の分子ならびに細胞増殖に必要な因子の欠乏は速やかに
アポトーシスを誘導する［７，８］。例えば、Ｆａｓリ
ガンドの細胞表面受容体であるＦａｓがアゴニスト抗体
またはＦａｓリガンドによって活性化されると、ある種
のリンパ腫細胞は数時間以内に細胞死する［９］。この
過程はタンパク質合成阻害物質またはＲＮＡ合成阻害物
質を存在させても進行する［１０］ので、アポトーシス
に必要な情報伝達成分は全てが増殖細胞の中にすでに存
在しており、アポトーシスのシグナルはそれらを始動さ
せるに過ぎないことが推測されていた。最近、アポトー
シスの過程に関与する数種の情報伝達分子が確認された
［１１〜１５］。これらの成分のあるものはプロアポト
ーシス性であるが、その他はアンチアポトーシス性であ
るか、またはプロアポトーシス性分子の阻害物質であ
る。カスパーゼはＣ．ｅｌｅｇａｎｓの細胞死エフェク
ター（Ｃｅｄ−３）として初めて確認された。これはシ
ステインプロテアーゼファミリーに属し、哺乳類ではこ
のファミリーに属するものが少なくとも１０種類［１
６，１７］存在する。カスパーゼ３のようなある種のカ
スパーゼはアポトーシスの過程で活性化され、ポリ（Ａ
ＤＰ−リボース）ポリメラーゼ、アクチン、フォドリン
およびラミンのような種々の基質を切断する［１１，１
５］。ＣｒｍＡまたはｐ３５のようなウイルス遺伝子産
物はカスパーゼに結合してそれを阻害している。最近、
これと類似のカスパーゼ阻害物質の一つがＩＡＰ（アポ
トーシス阻害物質）ファミリーに属することが確認され
た［１８］。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおける細胞死阻害物
質（Ｃｅｄ−９）として初めて確認されたＢｃｌ−２の
ファミリーは２種のサブファミリーに分類される［１２
〜１４，１９，２０］。アンチアポトーシスサブファミ
リーはＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗおよびＡ
１を含み、一方、プロアポトーシスサブファミリーはＢ
ａｘ、Ｂｃｌ−ｘＳ、ＢａｋおよびＢａｄを含む。Ｂｃ
ｌ−２ファミリーに属するものはヘテロ二量体を形成す
ることができ［１３］、ミトコンドリアのインテグリテ
ィーを維持することおよび／またはＣｅｄ−４を経てミ
トコンドリアにカスパーゼをリクルートすることに関与
していると思われる［２０，２１］。
の分子ならびに細胞増殖に必要な因子の欠乏は速やかに
アポトーシスを誘導する［７，８］。例えば、Ｆａｓリ
ガンドの細胞表面受容体であるＦａｓがアゴニスト抗体
またはＦａｓリガンドによって活性化されると、ある種
のリンパ腫細胞は数時間以内に細胞死する［９］。この
過程はタンパク質合成阻害物質またはＲＮＡ合成阻害物
質を存在させても進行する［１０］ので、アポトーシス
に必要な情報伝達成分は全てが増殖細胞の中にすでに存
在しており、アポトーシスのシグナルはそれらを始動さ
せるに過ぎないことが推測されていた。最近、アポトー
シスの過程に関与する数種の情報伝達分子が確認された
［１１〜１５］。これらの成分のあるものはプロアポト
ーシス性であるが、その他はアンチアポトーシス性であ
るか、またはプロアポトーシス性分子の阻害物質であ
る。カスパーゼはＣ．ｅｌｅｇａｎｓの細胞死エフェク
ター（Ｃｅｄ−３）として初めて確認された。これはシ
ステインプロテアーゼファミリーに属し、哺乳類ではこ
のファミリーに属するものが少なくとも１０種類［１
６，１７］存在する。カスパーゼ３のようなある種のカ
スパーゼはアポトーシスの過程で活性化され、ポリ（Ａ
ＤＰ−リボース）ポリメラーゼ、アクチン、フォドリン
およびラミンのような種々の基質を切断する［１１，１
５］。ＣｒｍＡまたはｐ３５のようなウイルス遺伝子産
物はカスパーゼに結合してそれを阻害している。最近、
これと類似のカスパーゼ阻害物質の一つがＩＡＰ（アポ
トーシス阻害物質）ファミリーに属することが確認され
た［１８］。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおける細胞死阻害物
質（Ｃｅｄ−９）として初めて確認されたＢｃｌ−２の
ファミリーは２種のサブファミリーに分類される［１２
〜１４，１９，２０］。アンチアポトーシスサブファミ
リーはＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗおよびＡ
１を含み、一方、プロアポトーシスサブファミリーはＢ
ａｘ、Ｂｃｌ−ｘＳ、ＢａｋおよびＢａｄを含む。Ｂｃ
ｌ−２ファミリーに属するものはヘテロ二量体を形成す
ることができ［１３］、ミトコンドリアのインテグリテ
ィーを維持することおよび／またはＣｅｄ−４を経てミ
トコンドリアにカスパーゼをリクルートすることに関与
していると思われる［２０，２１］。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】以前に、本発明者らは
増殖細胞がカスパーゼ３によって核内ＤＮＡ分解を起こ
す形態に変換される因子を含有することを証明した［２
２］。さらに、本発明者らによる、本願と同時係属出願
（発明の名称：カスパーゼ活性化ＤＮアーゼ、ＣＡＤ：
出願日：平成１０年１２月２５日）において、本発明者
らは、この因子を精製し、これがＤＮアーゼ活性を持つ
ことを証明し、この因子をカスパーゼ活性化ＤＮアーゼ
（ＣＡＤ）と命名した。ＣＡＤのアミノ酸配列およびそ
れをコードするＤＮＡ配列はそれぞれ、配列表の配列番
号２および１に記載している。本発明においては、無細
胞系を用いてＣＡＤの阻害物質を検索し、アポトーシス
細胞からではなく増殖細胞から得た細胞質画分がそのよ
うな阻害物質を含むことを見出し、この阻害物質をＩＣ
ＡＤと命名した。ＩＣＡＤをマウスＴ細胞リンパ腫から
精製し、それが３２ｋＤａのタンパク質であることを確
認すると共に、それをコードするｃＤＮＡ複数を分離し
た。さらに、ＩＣＡＤには、長鎖（ＩＣＡＤ−Ｌ）およ
び短鎖（ＩＣＡＤ−Ｓ）の２種類があることも確認し
た。
増殖細胞がカスパーゼ３によって核内ＤＮＡ分解を起こ
す形態に変換される因子を含有することを証明した［２
２］。さらに、本発明者らによる、本願と同時係属出願
（発明の名称：カスパーゼ活性化ＤＮアーゼ、ＣＡＤ：
出願日：平成１０年１２月２５日）において、本発明者
らは、この因子を精製し、これがＤＮアーゼ活性を持つ
ことを証明し、この因子をカスパーゼ活性化ＤＮアーゼ
（ＣＡＤ）と命名した。ＣＡＤのアミノ酸配列およびそ
れをコードするＤＮＡ配列はそれぞれ、配列表の配列番
号２および１に記載している。本発明においては、無細
胞系を用いてＣＡＤの阻害物質を検索し、アポトーシス
細胞からではなく増殖細胞から得た細胞質画分がそのよ
うな阻害物質を含むことを見出し、この阻害物質をＩＣ
ＡＤと命名した。ＩＣＡＤをマウスＴ細胞リンパ腫から
精製し、それが３２ｋＤａのタンパク質であることを確
認すると共に、それをコードするｃＤＮＡ複数を分離し
た。さらに、ＩＣＡＤには、長鎖（ＩＣＡＤ−Ｌ）およ
び短鎖（ＩＣＡＤ−Ｓ）の２種類があることも確認し
た。
【０００５】したがって、本発明は、ＣＡＤの阻害物質
である長鎖または短鎖のＩＣＡＤおよびそれらをコード
する遺伝子を基礎とする。詳細には、本発明は、 （１）（ａ）それぞれ配列番号４または６に示されるア
ミノ酸配列を有する長鎖または短鎖からなるカスパーゼ
活性化ＤＮアーゼ阻害能を有するタンパク質、および
（ｂ）配列番号４または６に記載のアミノ酸配列におい
て１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換および／また
は付加されたアミノ酸配列からなり、カスパーゼ活性化
ＤＮアーゼ阻害能を有するタンパク質の中から選択され
るカスパーゼ活性化ＤＮアーゼ阻害物質ＩＣＡＤ、具体
的には配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する、長
鎖カスパーゼ活性化ＤＮアーゼ阻害物質ＩＣＡＤ−Ｌま
たは配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する、短鎖
カスパーゼ活性化ＤＮアーゼ阻害物質ＩＣＡＤ−Ｓ；
である長鎖または短鎖のＩＣＡＤおよびそれらをコード
する遺伝子を基礎とする。詳細には、本発明は、 （１）（ａ）それぞれ配列番号４または６に示されるア
ミノ酸配列を有する長鎖または短鎖からなるカスパーゼ
活性化ＤＮアーゼ阻害能を有するタンパク質、および
（ｂ）配列番号４または６に記載のアミノ酸配列におい
て１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換および／また
は付加されたアミノ酸配列からなり、カスパーゼ活性化
ＤＮアーゼ阻害能を有するタンパク質の中から選択され
るカスパーゼ活性化ＤＮアーゼ阻害物質ＩＣＡＤ、具体
的には配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する、長
鎖カスパーゼ活性化ＤＮアーゼ阻害物質ＩＣＡＤ−Ｌま
たは配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する、短鎖
カスパーゼ活性化ＤＮアーゼ阻害物質ＩＣＡＤ−Ｓ；
【０００６】（２）（ａ）それぞれ配列番号４または６
に示されるアミノ酸配列を有する長鎖または短鎖からな
るカスパーゼ活性化ＤＮアーゼ阻害能を有するタンパク
質、または（ｂ）配列番号４または６に記載のアミノ酸
配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換お
よび／または付加されたアミノ酸配列からなり、カスパ
ーゼ活性化ＤＮアーゼ阻害能を有するタンパク質をコー
ドする遺伝子、具体的には配列番号４に示されるアミノ
酸配列を有する長鎖カスパーゼ活性化ＤＮアーゼ阻害物
質ＩＣＡＤ−Ｌをコードする遺伝子、好ましくは配列番
号３に示されるＤＮＡ配列を有する請求項５に記載の遺
伝子、または配列番号６示されるアミノ酸配列を有する
短鎖カスパーゼ活性化ＤＮアーゼ阻害物質ＩＣＡＤ−Ｓ
をコードする遺伝子、好ましくは配列番号５に示される
ＤＮＡ配列を有する請求項７に記載の遺伝子； （３）上記本発明遺伝子を含有するベクター、好ましく
は発現ベクター； （４）該発現ベクターにより形質転換された宿主細胞； （５）上記本発明遺伝子と相補的な配列を有する、８塩
基以上からなるＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらの化
学的修飾体； （６）該ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらの化学的修
飾体を含有するベクター；および （７）上記本発明ＤＮアーゼ阻害物質に対する抗体；に
関する。
に示されるアミノ酸配列を有する長鎖または短鎖からな
るカスパーゼ活性化ＤＮアーゼ阻害能を有するタンパク
質、または（ｂ）配列番号４または６に記載のアミノ酸
配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換お
よび／または付加されたアミノ酸配列からなり、カスパ
ーゼ活性化ＤＮアーゼ阻害能を有するタンパク質をコー
ドする遺伝子、具体的には配列番号４に示されるアミノ
酸配列を有する長鎖カスパーゼ活性化ＤＮアーゼ阻害物
質ＩＣＡＤ−Ｌをコードする遺伝子、好ましくは配列番
号３に示されるＤＮＡ配列を有する請求項５に記載の遺
伝子、または配列番号６示されるアミノ酸配列を有する
短鎖カスパーゼ活性化ＤＮアーゼ阻害物質ＩＣＡＤ−Ｓ
をコードする遺伝子、好ましくは配列番号５に示される
ＤＮＡ配列を有する請求項７に記載の遺伝子； （３）上記本発明遺伝子を含有するベクター、好ましく
は発現ベクター； （４）該発現ベクターにより形質転換された宿主細胞； （５）上記本発明遺伝子と相補的な配列を有する、８塩
基以上からなるＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらの化
学的修飾体； （６）該ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらの化学的修
飾体を含有するベクター；および （７）上記本発明ＤＮアーゼ阻害物質に対する抗体；に
関する。
【０００７】
【発明の詳しい説明】第１の態様として、本発明はカス
パーゼ活性化ＤＮアーゼ阻害能を有するタンパク質ＩＣ
ＡＤ、具体的には配列番号４に示されるアミノ酸配列を
有する、長鎖カスパーゼ活性化ＤＮアーゼ阻害物質ＩＣ
ＡＤ−Ｌまたは配列番号６に示されるアミノ酸配列を有
する、短鎖カスパーゼ活性化ＤＮアーゼ阻害物質ＩＣＡ
Ｄ−Ｓに関する。後述するように、大腸菌で産生した組
換えＩＣＡＤはＣＡＤのＤＮアーゼ活性を特異的に阻害
したが、アポトーシスＤＮＡ分解を起こすＤＮアーゼで
はないかと提唱されていたＤＮアーゼＩまたはＤＮアー
ゼＩＩ［２３，２４］は阻害しなかった。ＩＣＡＤはカ
スパーゼ３認識部位を２ケ所含み、そのＣＡＤ阻害作用
はカスパーゼ３処理によって破壊された。ヒトジャーカ
ット細胞をＩＣＡＤで形質転換すると、Ｆａｓを作用さ
せてもＤＮＡ分解は起きなかった。そして、このＩＣＡ
Ｄ形質転換体はスタウロスポリンが誘導するＤＮＡ分解
に耐性であるにも拘らず、スタウロスポリンはこの細胞
をカスパーゼを活性化することによって細胞死させた。
上記の結果はカスパーゼカスケードの下流にあるＣＡＤ
の活性化がアポトーシスの間に起きるヌクレオソーム間
ＤＮＡ分解の原因であること、およびＩＣＡＤがこの過
程の阻害物質として作用することを示している。
パーゼ活性化ＤＮアーゼ阻害能を有するタンパク質ＩＣ
ＡＤ、具体的には配列番号４に示されるアミノ酸配列を
有する、長鎖カスパーゼ活性化ＤＮアーゼ阻害物質ＩＣ
ＡＤ−Ｌまたは配列番号６に示されるアミノ酸配列を有
する、短鎖カスパーゼ活性化ＤＮアーゼ阻害物質ＩＣＡ
Ｄ−Ｓに関する。後述するように、大腸菌で産生した組
換えＩＣＡＤはＣＡＤのＤＮアーゼ活性を特異的に阻害
したが、アポトーシスＤＮＡ分解を起こすＤＮアーゼで
はないかと提唱されていたＤＮアーゼＩまたはＤＮアー
ゼＩＩ［２３，２４］は阻害しなかった。ＩＣＡＤはカ
スパーゼ３認識部位を２ケ所含み、そのＣＡＤ阻害作用
はカスパーゼ３処理によって破壊された。ヒトジャーカ
ット細胞をＩＣＡＤで形質転換すると、Ｆａｓを作用さ
せてもＤＮＡ分解は起きなかった。そして、このＩＣＡ
Ｄ形質転換体はスタウロスポリンが誘導するＤＮＡ分解
に耐性であるにも拘らず、スタウロスポリンはこの細胞
をカスパーゼを活性化することによって細胞死させた。
上記の結果はカスパーゼカスケードの下流にあるＣＡＤ
の活性化がアポトーシスの間に起きるヌクレオソーム間
ＤＮＡ分解の原因であること、およびＩＣＡＤがこの過
程の阻害物質として作用することを示している。
【０００８】アポトーシスはプロアポトーシスおよびア
ンチアポトーシス分子によって調節されることが多い
［１１，１３，１４］。本発明者らは、カスパーゼ３が
活性化できるＤＮアーゼ（ＣＡＤ）およびその阻害物質
（ＩＣＡＤ）を確認した。精製したＩＣＡＤはＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動による３２ｋＤａのタ
ンパク質であった。天然のＩＣＡＤはゲル濾過で測定す
ると見掛けの分子量７５ｋＤａを有し、ホモダイマーと
して存在することを示す。非アポトーシス性増殖細胞で
はＣＡＤはＩＣＡＤとの複合体として存在しており、こ
のことは細胞中のＩＣＡＤ濃度（遊離型およびＣＡＤ複
合型の双方）はＣＡＤ濃度を超えることを示唆してい
る。ＩＣＡＤが存在しないと、機能を有するＣＡＤは合
成されないので、本発明者らはＣＡＤ生合成の間はＩＣ
ＡＤがシャペロン様の機能を持っている［３２］のであ
ろうと推測している。過剰にあるＩＣＡＤが新生期のＣ
ＡＤポリペプチド鎖に生合成中に結合し、さらに複合し
たまま残留してその核内への輸送およびＤＮアーゼ活性
を阻害していると思われる。精製したＩＣＡＤは主とし
てＩＣＡＤの短鎖型（ＩＣＡＤ−Ｓ）であったが、分子
クローニングの結果、ＩＣＡＤは一つは長鎖型および一
つは短鎖型（ＩＣＡＤ−ＬおよびＩＣＡＤ−Ｓ）の２種
の型を持つことがわかった。マウスＩＣＡＤ染色体遺伝
子の最近の分析により、これら２種の型は様式の異なる
スプライシングを受けたｍＲＮＡからの翻訳によるもの
であることがわかった。ＩＣＡＤ−ＬはＩＣＡＤ−Ｓよ
りも強いＣＡＤ阻害作用を有すると思われる。種々の組
織内におけるこれらＩＣＡＤｍＲＮＡ２型の発現を研究
して、両者の間に機能の相違があればそれを解明するこ
とは興味深いことである。
ンチアポトーシス分子によって調節されることが多い
［１１，１３，１４］。本発明者らは、カスパーゼ３が
活性化できるＤＮアーゼ（ＣＡＤ）およびその阻害物質
（ＩＣＡＤ）を確認した。精製したＩＣＡＤはＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動による３２ｋＤａのタ
ンパク質であった。天然のＩＣＡＤはゲル濾過で測定す
ると見掛けの分子量７５ｋＤａを有し、ホモダイマーと
して存在することを示す。非アポトーシス性増殖細胞で
はＣＡＤはＩＣＡＤとの複合体として存在しており、こ
のことは細胞中のＩＣＡＤ濃度（遊離型およびＣＡＤ複
合型の双方）はＣＡＤ濃度を超えることを示唆してい
る。ＩＣＡＤが存在しないと、機能を有するＣＡＤは合
成されないので、本発明者らはＣＡＤ生合成の間はＩＣ
ＡＤがシャペロン様の機能を持っている［３２］のであ
ろうと推測している。過剰にあるＩＣＡＤが新生期のＣ
ＡＤポリペプチド鎖に生合成中に結合し、さらに複合し
たまま残留してその核内への輸送およびＤＮアーゼ活性
を阻害していると思われる。精製したＩＣＡＤは主とし
てＩＣＡＤの短鎖型（ＩＣＡＤ−Ｓ）であったが、分子
クローニングの結果、ＩＣＡＤは一つは長鎖型および一
つは短鎖型（ＩＣＡＤ−ＬおよびＩＣＡＤ−Ｓ）の２種
の型を持つことがわかった。マウスＩＣＡＤ染色体遺伝
子の最近の分析により、これら２種の型は様式の異なる
スプライシングを受けたｍＲＮＡからの翻訳によるもの
であることがわかった。ＩＣＡＤ−ＬはＩＣＡＤ−Ｓよ
りも強いＣＡＤ阻害作用を有すると思われる。種々の組
織内におけるこれらＩＣＡＤｍＲＮＡ２型の発現を研究
して、両者の間に機能の相違があればそれを解明するこ
とは興味深いことである。
【０００９】カスパーゼ３はＩＣＡＤを切断して不活性
化する。最初に本発明者らは、細胞内ＣＡＤの効率的阻
害はカスパーゼ３耐性ＩＣＡＤによってのみ得られるで
あろうと考えた。しかし、ジャーカット細胞内での野生
型ＩＣＡＤの過剰発現はＦａｓの関与により、ならびに
スタウロスポリン処理により、誘導されるＤＮＡ分解を
完全に遮断した。これらの結果はＩＣＡＤが阻害できる
ＤＮアーゼはアポトーシスの間に活性化され、また、こ
の活性化は様々な型の刺激によって触発できることを示
唆する。ＩＣＡＤはＣＡＤを阻害するが、ＤＮアーゼＩ
またはＤＮアーゼＩＩを阻害しないことから、本発明者
らは少なくともＦａｓまたはスタウロスポリンがアポト
ーシスを誘導するヒトジャーカット細胞においては、Ｃ
ＡＤまたはＣＡＤ様ＤＮアーゼがアポトーシスにおける
ＤＮＡ分解の原因であると結論した。細胞内に導入され
たＩＣＡＤの殆どがこれらのアポトーシス刺激によって
速やかに分解されたことから、ＣＡＤの活性を阻害する
には少量のＩＣＡＤで十分であること、またはＣＡＤの
濃度が極めて僅かであること、が判明した。胸腺ではグ
ルココルチコイドによって［６］、また種々の細胞では
増殖因子または血清の不足によって［３３］、アポトー
シスを誘導できる。アポトーシスにおけるＣＡＤ関与の
普遍性をさらに評価するには、他のアポトーシス系にお
けるＩＣＡＤの効果を研究する必要があると思われる。
化する。最初に本発明者らは、細胞内ＣＡＤの効率的阻
害はカスパーゼ３耐性ＩＣＡＤによってのみ得られるで
あろうと考えた。しかし、ジャーカット細胞内での野生
型ＩＣＡＤの過剰発現はＦａｓの関与により、ならびに
スタウロスポリン処理により、誘導されるＤＮＡ分解を
完全に遮断した。これらの結果はＩＣＡＤが阻害できる
ＤＮアーゼはアポトーシスの間に活性化され、また、こ
の活性化は様々な型の刺激によって触発できることを示
唆する。ＩＣＡＤはＣＡＤを阻害するが、ＤＮアーゼＩ
またはＤＮアーゼＩＩを阻害しないことから、本発明者
らは少なくともＦａｓまたはスタウロスポリンがアポト
ーシスを誘導するヒトジャーカット細胞においては、Ｃ
ＡＤまたはＣＡＤ様ＤＮアーゼがアポトーシスにおける
ＤＮＡ分解の原因であると結論した。細胞内に導入され
たＩＣＡＤの殆どがこれらのアポトーシス刺激によって
速やかに分解されたことから、ＣＡＤの活性を阻害する
には少量のＩＣＡＤで十分であること、またはＣＡＤの
濃度が極めて僅かであること、が判明した。胸腺ではグ
ルココルチコイドによって［６］、また種々の細胞では
増殖因子または血清の不足によって［３３］、アポトー
シスを誘導できる。アポトーシスにおけるＣＡＤ関与の
普遍性をさらに評価するには、他のアポトーシス系にお
けるＩＣＡＤの効果を研究する必要があると思われる。
【００１０】別の態様として、本発明は配列番号４また
は６に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のア
ミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸
配列からなり、カスパーゼ活性化ＤＮアーゼ阻害能を有
するタンパク質に関する。本タンパク質は、それぞれ配
列番号３または５に示されるＤＮＡ配列を有する遺伝子
を当業者に周知の方法、例えば部位特異的突然変異誘発
（Methods in Enzymology, 100:448-(1983))やＰＣＲ法
（Molecular Cloning 2nd Edt. 15章, Cold Harbor Lab
oratory Press (1989), 「PCR A Practical Approach」
IRL Press 200-210 (1991))により変異させ、これを配
列番号３または５に記載の遺伝子と同様にして発現させ
ることにより得ることができる。なおここで、欠失、置
換および／または付加されるアミノ酸残基の数は、上記
部位特異的突然変異誘発などの周知の方法により欠失、
置換および／または付加できる程度の数を指す。得られ
た変異タンパク質がＣＡＤ阻害能を有するか否かは、後
述する実施例に記載しているＣＡＤの活性検出法と同様
にして確認することができる。その他の、上記本発明の
実施の態様はすべて、上述する本発明の具体的な説明、
特に実施例を参照すれば実施することができる。
は６に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のア
ミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸
配列からなり、カスパーゼ活性化ＤＮアーゼ阻害能を有
するタンパク質に関する。本タンパク質は、それぞれ配
列番号３または５に示されるＤＮＡ配列を有する遺伝子
を当業者に周知の方法、例えば部位特異的突然変異誘発
（Methods in Enzymology, 100:448-(1983))やＰＣＲ法
（Molecular Cloning 2nd Edt. 15章, Cold Harbor Lab
oratory Press (1989), 「PCR A Practical Approach」
IRL Press 200-210 (1991))により変異させ、これを配
列番号３または５に記載の遺伝子と同様にして発現させ
ることにより得ることができる。なおここで、欠失、置
換および／または付加されるアミノ酸残基の数は、上記
部位特異的突然変異誘発などの周知の方法により欠失、
置換および／または付加できる程度の数を指す。得られ
た変異タンパク質がＣＡＤ阻害能を有するか否かは、後
述する実施例に記載しているＣＡＤの活性検出法と同様
にして確認することができる。その他の、上記本発明の
実施の態様はすべて、上述する本発明の具体的な説明、
特に実施例を参照すれば実施することができる。
【００１１】本発明は別の態様として、本発明カスパー
ゼ活性化ＤＮアーゼ阻害物質をコードする遺伝子に関す
る。本発明遺伝子にはＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、好
ましくはＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ｃＤＮＡ、ゲノ
ミックＤＮＡあるいは合成ＤＮＡであり得る。またＤＮ
ＡおよびＲＮＡいずれも２本鎖でも１本鎖でもあり得
る。１本鎖の場合、コード鎖あるいは非コード鎖であり
得る。より好ましくは配列番号１に示されるＤＮＡ配列
を有する遺伝子である。
ゼ活性化ＤＮアーゼ阻害物質をコードする遺伝子に関す
る。本発明遺伝子にはＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、好
ましくはＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ｃＤＮＡ、ゲノ
ミックＤＮＡあるいは合成ＤＮＡであり得る。またＤＮ
ＡおよびＲＮＡいずれも２本鎖でも１本鎖でもあり得
る。１本鎖の場合、コード鎖あるいは非コード鎖であり
得る。より好ましくは配列番号１に示されるＤＮＡ配列
を有する遺伝子である。
【００１２】別の態様として、本発明は本発明遺伝子を
含有するベクターを包含する。該ベクターには発現ベク
ター、クローニングベクター、治療用ベクターなどの種
々の用途を持つベクターが包含される。好ましくは発現
ベクターである。発現ベクターは本発明タンパク質の大
量生産に利用できる。発現ベクターについての詳細は以
下の項に示す。治療用ベクターは本発明遺伝子を投与し
細胞内に導入する手法に用いられるベクターであり、そ
のような手法にはウイルスベクター等による方法があ
る。その他、プラスミドを直接筋肉内に投与する方法
（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法等があり、これら
にもベクターが用いられる。ＩＣＡＤはＣＡＤによるＤ
ＮＡ分解を阻害するので、本発明治療用ベクターは細胞
死阻止を目的とする遺伝子治療に有用であろう。
含有するベクターを包含する。該ベクターには発現ベク
ター、クローニングベクター、治療用ベクターなどの種
々の用途を持つベクターが包含される。好ましくは発現
ベクターである。発現ベクターは本発明タンパク質の大
量生産に利用できる。発現ベクターについての詳細は以
下の項に示す。治療用ベクターは本発明遺伝子を投与し
細胞内に導入する手法に用いられるベクターであり、そ
のような手法にはウイルスベクター等による方法があ
る。その他、プラスミドを直接筋肉内に投与する方法
（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法等があり、これら
にもベクターが用いられる。ＩＣＡＤはＣＡＤによるＤ
ＮＡ分解を阻害するので、本発明治療用ベクターは細胞
死阻止を目的とする遺伝子治療に有用であろう。
【００１３】別の態様として、本発明は本発明発現ベク
ターにより形質転換された宿主細胞が包含される。宿主
細胞には原核細胞、真核細胞が含まれ、細菌、真菌、哺
乳動物細胞等が例示される。
ターにより形質転換された宿主細胞が包含される。宿主
細胞には原核細胞、真核細胞が含まれ、細菌、真菌、哺
乳動物細胞等が例示される。
【００１４】別の態様として、本発明は、本発明遺伝子
と相補的な配列を有する、８塩基以上からなるＤＮＡも
しくはＲＮＡまたはそれらの化学的修飾体が包含され
る。「相補的な配列を有する」とはいわゆるアンチセン
スオリゴヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡあるいはア
ンチセンスＤＮＡと呼ばれるものを網羅する意味を有す
る。これらは合成装置を用いて人工的に合成したり、あ
るいは通常と逆向き（即ちアンチセンス向き）に遺伝子
を発現させることなどによって得ることができる。この
アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは８−１００塩
基、好ましくは８−５０塩基である。「化学的修飾体」
とは、本発明アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞内
への移行性または細胞内での安定性が高められた修飾体
を意味し、例えばホスホロチオエート、アルキルホスホ
トリエステル、アルキルホスホアミデート等の誘導体が
挙げられる［４４］。これらアンチセンスヌクレオチド
はＩＣＡＤの発現を抑制する目的で利用される他、in s
ituハイブリダイゼーション等の研究用試薬としても有
用である。ＩＣＡＤの発現を抑制することにより、細胞
死誘導なる効果が得られ、癌細胞の死滅などを引き起こ
すことができる。投与方法は直接生体内の細胞に導入す
るin vivo法等がある。本発明は別の態様として、この
アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有するベクターに
関するる。本発明はこのようなベクターも包含する。ベ
クターとしてはウイルスベクター等が挙げられる。
と相補的な配列を有する、８塩基以上からなるＤＮＡも
しくはＲＮＡまたはそれらの化学的修飾体が包含され
る。「相補的な配列を有する」とはいわゆるアンチセン
スオリゴヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡあるいはア
ンチセンスＤＮＡと呼ばれるものを網羅する意味を有す
る。これらは合成装置を用いて人工的に合成したり、あ
るいは通常と逆向き（即ちアンチセンス向き）に遺伝子
を発現させることなどによって得ることができる。この
アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは８−１００塩
基、好ましくは８−５０塩基である。「化学的修飾体」
とは、本発明アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞内
への移行性または細胞内での安定性が高められた修飾体
を意味し、例えばホスホロチオエート、アルキルホスホ
トリエステル、アルキルホスホアミデート等の誘導体が
挙げられる［４４］。これらアンチセンスヌクレオチド
はＩＣＡＤの発現を抑制する目的で利用される他、in s
ituハイブリダイゼーション等の研究用試薬としても有
用である。ＩＣＡＤの発現を抑制することにより、細胞
死誘導なる効果が得られ、癌細胞の死滅などを引き起こ
すことができる。投与方法は直接生体内の細胞に導入す
るin vivo法等がある。本発明は別の態様として、この
アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有するベクターに
関するる。本発明はこのようなベクターも包含する。ベ
クターとしてはウイルスベクター等が挙げられる。
【００１５】本発明は別の態様として、本発明タンパク
質に対する抗体を包含する。該抗体は本発明タンパク質
またはその断片を、例えば文献［４５］に記載されてい
る手法を用いてマウスやウサギを免疫することにより、
容易に調製できる。好ましい本発明抗体はモノクローナ
ル抗体である。モノクローナル抗体は文献［４６，４
７］記載の手法により、免疫したマウスやラットの脾臓
またはリンパ節からリンパ球を取りだし、ミエローマ細
胞と融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリド
ーマから入手できる。抗体の用途は、アフィニティーク
ロマトグラフィー、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニ
ング、医薬・診断薬等が挙げられる。ＣＡＤの機能を阻
害する中和抗体が好ましい。
質に対する抗体を包含する。該抗体は本発明タンパク質
またはその断片を、例えば文献［４５］に記載されてい
る手法を用いてマウスやウサギを免疫することにより、
容易に調製できる。好ましい本発明抗体はモノクローナ
ル抗体である。モノクローナル抗体は文献［４６，４
７］記載の手法により、免疫したマウスやラットの脾臓
またはリンパ節からリンパ球を取りだし、ミエローマ細
胞と融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリド
ーマから入手できる。抗体の用途は、アフィニティーク
ロマトグラフィー、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニ
ング、医薬・診断薬等が挙げられる。ＣＡＤの機能を阻
害する中和抗体が好ましい。
【００１６】
【発明の実施の形態】以下に本発明の実施の態様をより
具体的に説明する。ＩＣＡＤの精製 本発明者らは以前に、Ｆａｓ活性化細胞から得た細胞質
画分が核内ＤＮＡ分解を起こす因子を含んでいることを
証明した［２５］。さらに、増殖細胞はカスパーゼによ
ってＤＮＡ分解を起こす形に変換できる因子を含むこと
も証明した［２２］。この因子の特性を解析するため、
マウスＴ細胞リンパ腫から得られるＳ−１００画分をＤ
ＡＥＡ−セファロースカラムクロマトグラフィーなどで
分画する。各画分をカスパーゼ３処理し、核内でＤＮＡ
分解を起こす性能を検定することで、ＤＮＡ分解活性が
認められる。この活性はカスパーゼ３で処理をしないと
検出できないはずである。数種のＤＮアーゼが核内でヌ
クレオソーム間ＤＮＡ分解を起こすことが知られている
［５，２６］。核内ＤＮＡ分解を起こすこの活性が裸の
ＤＮＡを切断できるかどうかを検討するため、プラスミ
ドＤＮＡを基質に用いてＤＮアーゼ活性について各画分
を検定する。ここでは、図１ａの中段の図に示す通り、
核内ＤＮＡ分解を起こす画分はプラスミドＤＮＡも消化
し、またこのＤＮアーゼ活性はカスパーゼ３依存性であ
ることが見出された（下段の図）。このようにして得ら
れたこのタンパク質をカスパーゼ活性化ＤＮアーゼ（Ｃ
ＡＤ）と命名した。ＣＡＤの精製およびそのｃＤＮＡの
クローニングの詳細は、以下の参考例を参照のこと。
具体的に説明する。ＩＣＡＤの精製 本発明者らは以前に、Ｆａｓ活性化細胞から得た細胞質
画分が核内ＤＮＡ分解を起こす因子を含んでいることを
証明した［２５］。さらに、増殖細胞はカスパーゼによ
ってＤＮＡ分解を起こす形に変換できる因子を含むこと
も証明した［２２］。この因子の特性を解析するため、
マウスＴ細胞リンパ腫から得られるＳ−１００画分をＤ
ＡＥＡ−セファロースカラムクロマトグラフィーなどで
分画する。各画分をカスパーゼ３処理し、核内でＤＮＡ
分解を起こす性能を検定することで、ＤＮＡ分解活性が
認められる。この活性はカスパーゼ３で処理をしないと
検出できないはずである。数種のＤＮアーゼが核内でヌ
クレオソーム間ＤＮＡ分解を起こすことが知られている
［５，２６］。核内ＤＮＡ分解を起こすこの活性が裸の
ＤＮＡを切断できるかどうかを検討するため、プラスミ
ドＤＮＡを基質に用いてＤＮアーゼ活性について各画分
を検定する。ここでは、図１ａの中段の図に示す通り、
核内ＤＮＡ分解を起こす画分はプラスミドＤＮＡも消化
し、またこのＤＮアーゼ活性はカスパーゼ３依存性であ
ることが見出された（下段の図）。このようにして得ら
れたこのタンパク質をカスパーゼ活性化ＤＮアーゼ（Ｃ
ＡＤ）と命名した。ＣＡＤの精製およびそのｃＤＮＡの
クローニングの詳細は、以下の参考例を参照のこと。
【００１７】ＣＡＤの研究中に、本発明者らは増殖細胞
から得たＳ−１００画分がＦａｓ活性化細胞から得た抽
出物内に存在するＣＡＤ活性の阻害活性に着目した。こ
のＣＡＤ阻害活性の特性を解析するため、Ｆａｓ活性化
細胞内のＣＡＤ活性をＤＥＡＥ−セファロースカラムか
ら得た各画分の存在下に検定する。それにより、核内に
おいてＣＡＤが誘導するＤＮＡ断片化を阻害するタンパ
ク質含有画分が得られる。このタンパク質がＩＣＡＤで
ある。これをさらに硫酸アンモニウム分画、およびブチ
ル−セファロースおよびフェニル−スーパロースカラム
クロマトグラフィーなどによって精製する。このサンプ
ルをゲル濾過カラムに負荷すると、ＩＣＡＤは見かけの
分子量７５ｋＤａを示す単一ピークとして溶出される。
ＩＣＡＤの物理化学的分析により、還元剤の存在下に加
熱および変性剤に耐性であることが示される。それ故、
ゲル濾過カラムから得た各画分にあるタンパク質を加熱
し、変性した凝集塊を遠心分離によって除く。上清液は
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動像に数個のバン
ド（図２ａ）を示し、ＩＣＡＤ活性を示す（図２ｂ）。
ＩＣＡＤを特定のバンドに割当てるため、加熱したサン
プルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ
て分画し、ゲルを細断する。ゲル片から溶出される３２
ｋＤａのタンパク質を含む画分は核内のＣＡＤ誘導ＤＮ
Ａ分解ならびにそのＤＮアーゼ活性を阻害し（図２ｃ、
２ｄ）、この３２ｋＤａタンパク質がＩＣＡＤであるこ
とが示される。
から得たＳ−１００画分がＦａｓ活性化細胞から得た抽
出物内に存在するＣＡＤ活性の阻害活性に着目した。こ
のＣＡＤ阻害活性の特性を解析するため、Ｆａｓ活性化
細胞内のＣＡＤ活性をＤＥＡＥ−セファロースカラムか
ら得た各画分の存在下に検定する。それにより、核内に
おいてＣＡＤが誘導するＤＮＡ断片化を阻害するタンパ
ク質含有画分が得られる。このタンパク質がＩＣＡＤで
ある。これをさらに硫酸アンモニウム分画、およびブチ
ル−セファロースおよびフェニル−スーパロースカラム
クロマトグラフィーなどによって精製する。このサンプ
ルをゲル濾過カラムに負荷すると、ＩＣＡＤは見かけの
分子量７５ｋＤａを示す単一ピークとして溶出される。
ＩＣＡＤの物理化学的分析により、還元剤の存在下に加
熱および変性剤に耐性であることが示される。それ故、
ゲル濾過カラムから得た各画分にあるタンパク質を加熱
し、変性した凝集塊を遠心分離によって除く。上清液は
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動像に数個のバン
ド（図２ａ）を示し、ＩＣＡＤ活性を示す（図２ｂ）。
ＩＣＡＤを特定のバンドに割当てるため、加熱したサン
プルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ
て分画し、ゲルを細断する。ゲル片から溶出される３２
ｋＤａのタンパク質を含む画分は核内のＣＡＤ誘導ＤＮ
Ａ分解ならびにそのＤＮアーゼ活性を阻害し（図２ｃ、
２ｄ）、この３２ｋＤａタンパク質がＩＣＡＤであるこ
とが示される。
【００１８】ＩＣＡＤ ｃＤＮＡの分子クローニング 精製ＩＣＡＤをアミノ酸配列分析に付してペプチド配列
を得、これに基づき、マウスＥＳＴデータベースを活用
してプライマーを作製する。この配列を用いて、マウス
Ｔ細胞リンパ腫ｃＤＮＡライブラリーからＩＣＡＤ ｃ
ＤＮＡを分離する。これにより、長さ２．０および１．
０ｋｂのｃＤＮＡが得られる。それぞれは長さ３３１お
よび２６５アミノ酸の読取り枠を含む（図３ａ）。長い
方のＩＣＡＤおよび短い方のＩＣＡＤをそれぞれＩＣＡ
Ｄ−ＬおよびＩＣＡＤ−Ｓと命名した。
を得、これに基づき、マウスＥＳＴデータベースを活用
してプライマーを作製する。この配列を用いて、マウス
Ｔ細胞リンパ腫ｃＤＮＡライブラリーからＩＣＡＤ ｃ
ＤＮＡを分離する。これにより、長さ２．０および１．
０ｋｂのｃＤＮＡが得られる。それぞれは長さ３３１お
よび２６５アミノ酸の読取り枠を含む（図３ａ）。長い
方のＩＣＡＤおよび短い方のＩＣＡＤをそれぞれＩＣＡ
Ｄ−ＬおよびＩＣＡＤ−Ｓと命名した。
【００１９】ＩＣＡＤの発現および特性検定 ＩＣＡＤ−ＬおよびＩＣＡＤ−ＳをコードしているｃＤ
ＮＡを含有するプラスミドにより形質転換された大腸菌
はそれぞれ、Escherichia coli／ｐＥＦＬ−ＩＣＡＤＬ
およびEscherichia coli／ｐＥＦＬ−ＩＣＡＤＳとし
て、茨城県つくば市東１丁目１番３号、工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託されている（受託日：いずれ
も平成９年１２月１６日；受託番号：それぞれＦＥＲＭ
Ｐ−１６５６０、ＦＥＲＭ Ｐ−１６５５９）。得られ
たＩＣＡＤ−ＳおよびＩＣＡＤ−Ｌタンパク質は双方と
も、酸性アミノ酸が豊富であり等電点約４．５を示す。
ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおけるＢＬＡＳＴ相同性
検索の結果、マウスＩＣＡＤ−ＬはヒトＤＦＦ４５（Ｄ
ＮＡ断片化因子４５）［２７］に対して高度に相同的で
あることが示される。種々のマウス組織のＩＣＡＤｃＤ
ＮＡによるノーザンハイブリッダイゼーション分析の結
果から、ほとんどの組織がＩＣＡＤｍＲＮＡの広いバン
ドを発現することを示し、小腸、卵巣、子宮および脾臓
ではかなり豊富に発現することが見出された（図４）。
ＮＡを含有するプラスミドにより形質転換された大腸菌
はそれぞれ、Escherichia coli／ｐＥＦＬ−ＩＣＡＤＬ
およびEscherichia coli／ｐＥＦＬ−ＩＣＡＤＳとし
て、茨城県つくば市東１丁目１番３号、工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託されている（受託日：いずれ
も平成９年１２月１６日；受託番号：それぞれＦＥＲＭ
Ｐ−１６５６０、ＦＥＲＭ Ｐ−１６５５９）。得られ
たＩＣＡＤ−ＳおよびＩＣＡＤ−Ｌタンパク質は双方と
も、酸性アミノ酸が豊富であり等電点約４．５を示す。
ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおけるＢＬＡＳＴ相同性
検索の結果、マウスＩＣＡＤ−ＬはヒトＤＦＦ４５（Ｄ
ＮＡ断片化因子４５）［２７］に対して高度に相同的で
あることが示される。種々のマウス組織のＩＣＡＤｃＤ
ＮＡによるノーザンハイブリッダイゼーション分析の結
果から、ほとんどの組織がＩＣＡＤｍＲＮＡの広いバン
ドを発現することを示し、小腸、卵巣、子宮および脾臓
ではかなり豊富に発現することが見出された（図４）。
【００２０】ＤＮアーゼ活性に対するＩＣＡＤによる阻
害 ＣＡＤのＤＮアーゼ活性に対するＩＣＡＤによる特異的
阻害はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳ
Ｔ）−融合タンパク質としてＩＣＡＤを調製し、この組
換えＩＣＡＤがＦａｓ活性化細胞から得られる抽出物が
誘導する核のＤＮＡ分解を阻害するか否かを調べること
で確認される。同時にＤＮアーゼＩおよびＤＮアーゼＩ
ＩのＤＮアーゼ作用に対するＩＣＡＤの阻害作用を調べ
ることで、その特異性が決定できる。
害 ＣＡＤのＤＮアーゼ活性に対するＩＣＡＤによる特異的
阻害はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳ
Ｔ）−融合タンパク質としてＩＣＡＤを調製し、この組
換えＩＣＡＤがＦａｓ活性化細胞から得られる抽出物が
誘導する核のＤＮＡ分解を阻害するか否かを調べること
で確認される。同時にＤＮアーゼＩおよびＤＮアーゼＩ
ＩのＤＮアーゼ作用に対するＩＣＡＤの阻害作用を調べ
ることで、その特異性が決定できる。
【００２１】カスパーゼ３によるＩＣＡＤの不活化 増殖細胞から得られる細胞抽出物とは対照的に、Ｆａｓ
活性化アポトーシス細胞から得られる細胞抽出物はＩＣ
ＡＤ活性を示さず、ＩＣＡＤがアポトーシスのシグナル
によって不活化されることが示唆された。この不活化を
起こす候補の一つがカスパーゼである。カスパーゼ３に
よる推測上の切断部位がＩＣＡＤには２個所ある：すな
わちアミノ酸１１７位およびアミノ酸２２４位にあるＤ
ＥＰＤおよびＤＡＶＤはカスパーゼ３の共通切断部位に
よく適合している（図３ａ）［２８，２９］。カスパー
ゼは切断部位のＰ１位にアスパラギン酸を要求する［２
８，２９］。カスパーゼ３が１１７位のアミノ酸と２２
４位のアミノ酸でＩＣＡＤを切断することを確認するた
め、切断部位のアスパラギン酸を一重または二重にグル
タミン酸に変異させたＩＣＡＤ変異体を調製し、カスパ
ーゼ３処理を行う。次に、ＣＡＤ誘導ＤＮＡ分解に対す
る変異体ＩＣＡＤの阻害作用を測定することで、カスパ
ーゼ３耐性ＩＣＡＤの可能性を探ることができる。
活性化アポトーシス細胞から得られる細胞抽出物はＩＣ
ＡＤ活性を示さず、ＩＣＡＤがアポトーシスのシグナル
によって不活化されることが示唆された。この不活化を
起こす候補の一つがカスパーゼである。カスパーゼ３に
よる推測上の切断部位がＩＣＡＤには２個所ある：すな
わちアミノ酸１１７位およびアミノ酸２２４位にあるＤ
ＥＰＤおよびＤＡＶＤはカスパーゼ３の共通切断部位に
よく適合している（図３ａ）［２８，２９］。カスパー
ゼは切断部位のＰ１位にアスパラギン酸を要求する［２
８，２９］。カスパーゼ３が１１７位のアミノ酸と２２
４位のアミノ酸でＩＣＡＤを切断することを確認するた
め、切断部位のアスパラギン酸を一重または二重にグル
タミン酸に変異させたＩＣＡＤ変異体を調製し、カスパ
ーゼ３処理を行う。次に、ＣＡＤ誘導ＤＮＡ分解に対す
る変異体ＩＣＡＤの阻害作用を測定することで、カスパ
ーゼ３耐性ＩＣＡＤの可能性を探ることができる。
【００２２】アポトーシスにおける活性化ＤＮアーゼに
対するＩＣＡＤの特異的遮断 ＩＣＡＤ過剰発現細胞にアポトーシス性ＤＮＡ分解が存
在しないことを調べる。ヒトジャーカット細胞はアゴニ
スト性抗Ｆａｓ抗体によって、または高濃度のスタウロ
スポリンによって殺すことができ、どちらの場合も細胞
死には染色体ＤＮＡのヌクレオソーム間切断を伴う［３
０］。野生型ＩＣＡＤ−ＬおよびＩＣＡＤ−Ｓならびに
それらのカスパーゼ３耐性二重変異体をジャーカット細
胞に導入し、ＩＣＡＤを発現する安定な形質転換体クロ
ーンを選択する。そこで、抗Ｆａｓ抗体と反応させ、Ｄ
ＮＡ断片化が起こらないことを示す。同様に、スタウロ
スポリンと反応させ、ＤＮＡ分解が阻止されることを示
す。
対するＩＣＡＤの特異的遮断 ＩＣＡＤ過剰発現細胞にアポトーシス性ＤＮＡ分解が存
在しないことを調べる。ヒトジャーカット細胞はアゴニ
スト性抗Ｆａｓ抗体によって、または高濃度のスタウロ
スポリンによって殺すことができ、どちらの場合も細胞
死には染色体ＤＮＡのヌクレオソーム間切断を伴う［３
０］。野生型ＩＣＡＤ−ＬおよびＩＣＡＤ−Ｓならびに
それらのカスパーゼ３耐性二重変異体をジャーカット細
胞に導入し、ＩＣＡＤを発現する安定な形質転換体クロ
ーンを選択する。そこで、抗Ｆａｓ抗体と反応させ、Ｄ
ＮＡ断片化が起こらないことを示す。同様に、スタウロ
スポリンと反応させ、ＤＮＡ分解が阻止されることを示
す。
【００２３】以下に図面について詳細に説明する。図１
は、マウスＷＲ１９Ｌ細胞から得た抽出物中のＣＡＤお
よびＩＣＡＤ活性を示す電気泳動写真の模写図である。
ＷＲ１９Ｌ細胞から得たＳ−１００画分（タンパク質５
００ｍｇ）をＤＥＡＥ−セファロースカラム（２．６×
１１ｃｍ）に負荷し、タンパク質を５０〜３５０ｍＭ−
ＮａＣｌ直線勾配で溶出した。ａ ．記載した画分の所定量（１０μＬ）をカスパーゼ３
で処理し、核（上図）またはプラスミドＤＮＡ（中図）
でＣＡＤ活性を測定した。カスパーゼ３処理しない場合
のＤＮアーゼ活性も測定した。ｂ ．記載した画分のＩＣＡＤ活性を１０μＬ量を使用し
て測定した。
は、マウスＷＲ１９Ｌ細胞から得た抽出物中のＣＡＤお
よびＩＣＡＤ活性を示す電気泳動写真の模写図である。
ＷＲ１９Ｌ細胞から得たＳ−１００画分（タンパク質５
００ｍｇ）をＤＥＡＥ−セファロースカラム（２．６×
１１ｃｍ）に負荷し、タンパク質を５０〜３５０ｍＭ−
ＮａＣｌ直線勾配で溶出した。ａ ．記載した画分の所定量（１０μＬ）をカスパーゼ３
で処理し、核（上図）またはプラスミドＤＮＡ（中図）
でＣＡＤ活性を測定した。カスパーゼ３処理しない場合
のＤＮアーゼ活性も測定した。ｂ ．記載した画分のＩＣＡＤ活性を１０μＬ量を使用し
て測定した。
【００２４】図２は、３２ｋＤａタンパク質としてのＩ
ＣＡＤの確認を示す電気泳動写真の模写図である。フェ
ニル−スーパロースカラムから得た画分（タンパク質
１．３ｍｇ）をスーパデックス２００カラムに負荷し
た。ＩＣＡＤ活性を含む画分を９０℃に１５分間加熱
し、不溶性タンパク質を１０００００×ｇで３０分間遠
心分離して除いた。ａ ．記載した画分の所定量（５μＬ）を１０〜２０％勾
配ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、銀染色でタン
パク質を可視化した。マーカータンパク質（レインボウ
マーカー、アマーシャム社）の分子量をｋＤａで左側に
示した。スーパデックス２００カラムは標準タンパク質
で補正した。使用した標準タンパク質はトランスフェリ
ン（ＴＦ、８１ｋＤａ）およびオボアルブミン（４６ｋ
Ｄａ）であって、その溶出位置を図の下側に矢印で示し
た。ＩＣＡＤは右側の矢印で示した。ｂ ．記載した画分の５μＬ量を用い、Ｆａｓ−活性化Ｗ
４細胞から得た抽出物（２０μｇ）および肝臓核でＩＣ
ＡＤ活性を測定した。ＩＣＡＤ非存在下のＣＡＤ活性を
第１レーン（−）に示す。ｃ ．スーパデックス２００のカラムから得た画分１４〜
１７を集め、濃縮し、９０℃に１５分間加熱した。遠心
分離後、上清液中のタンパク質約１００ｎｇを１０〜２
０％勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離
した。ゲルを細断した後、タンパク質をゲルから溶出し
て４０μＬの緩衝液Ｃに溶解した。５μＬ量を用いて、
Ｆａｓ−活性化Ｗ４細胞から得た抽出物（２０μｇ）お
よび肝臓核でＩＣＡＤ活性を測定した。第１レーン
（−）はＩＣＡＤ非存在下のＣＡＤ活性を示す。分子量
標準タンパク質の位置は下側に矢印で示す。ｄ ．図２ｃのゲル片７から回収したタンパク質の所定量
（５μＬ）をＦａｓ−活性化Ｗ４細胞から得た抽出物
（２０μｇ）とともに４℃で、３０分間インキュベーシ
ョンし、残留するＣＡＤ活性をプラスミドＤＮＡで測定
した。レーン１＝プラスミドＤＮＡ；レーン２＝ＣＡＤ
とともにインキュベーションしたＤＮＡ；レーン３＝Ｃ
ＡＤおよびＩＣＡＤとともにインキュベーションしたＤ
ＮＡ；レーン４＝ＩＣＡＤとともにインキュベーション
したＤＮＡ。
ＣＡＤの確認を示す電気泳動写真の模写図である。フェ
ニル−スーパロースカラムから得た画分（タンパク質
１．３ｍｇ）をスーパデックス２００カラムに負荷し
た。ＩＣＡＤ活性を含む画分を９０℃に１５分間加熱
し、不溶性タンパク質を１０００００×ｇで３０分間遠
心分離して除いた。ａ ．記載した画分の所定量（５μＬ）を１０〜２０％勾
配ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、銀染色でタン
パク質を可視化した。マーカータンパク質（レインボウ
マーカー、アマーシャム社）の分子量をｋＤａで左側に
示した。スーパデックス２００カラムは標準タンパク質
で補正した。使用した標準タンパク質はトランスフェリ
ン（ＴＦ、８１ｋＤａ）およびオボアルブミン（４６ｋ
Ｄａ）であって、その溶出位置を図の下側に矢印で示し
た。ＩＣＡＤは右側の矢印で示した。ｂ ．記載した画分の５μＬ量を用い、Ｆａｓ−活性化Ｗ
４細胞から得た抽出物（２０μｇ）および肝臓核でＩＣ
ＡＤ活性を測定した。ＩＣＡＤ非存在下のＣＡＤ活性を
第１レーン（−）に示す。ｃ ．スーパデックス２００のカラムから得た画分１４〜
１７を集め、濃縮し、９０℃に１５分間加熱した。遠心
分離後、上清液中のタンパク質約１００ｎｇを１０〜２
０％勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離
した。ゲルを細断した後、タンパク質をゲルから溶出し
て４０μＬの緩衝液Ｃに溶解した。５μＬ量を用いて、
Ｆａｓ−活性化Ｗ４細胞から得た抽出物（２０μｇ）お
よび肝臓核でＩＣＡＤ活性を測定した。第１レーン
（−）はＩＣＡＤ非存在下のＣＡＤ活性を示す。分子量
標準タンパク質の位置は下側に矢印で示す。ｄ ．図２ｃのゲル片７から回収したタンパク質の所定量
（５μＬ）をＦａｓ−活性化Ｗ４細胞から得た抽出物
（２０μｇ）とともに４℃で、３０分間インキュベーシ
ョンし、残留するＣＡＤ活性をプラスミドＤＮＡで測定
した。レーン１＝プラスミドＤＮＡ；レーン２＝ＣＡＤ
とともにインキュベーションしたＤＮＡ；レーン３＝Ｃ
ＡＤおよびＩＣＡＤとともにインキュベーションしたＤ
ＮＡ；レーン４＝ＩＣＡＤとともにインキュベーション
したＤＮＡ。
【００２５】図３は、マウスのＩＣＡＤ−ＳおよびＩＣ
ＡＤ−Ｌのアミノ酸配列を示す。ａ ．ＩＣＡＤ−ＳおよびＩＣＡＤ−Ｌのアミノ酸配列。
ＩＣＡＤ−Ｌのアミノ酸残基の中でＩＣＡＤ−Ｓのもの
と一致するものは「−」で示した。精製ＩＣＡＤから得
たペプチド配列５個には下線を付けた。カスパーゼ３に
よる推測上の切断部位２ケ所を二重下線で示した。アミ
ノ酸番号は配列の上側に記載した。ｂ ．マウスＩＣＡＤ−ＬとヒトＤＦＦ４５のアミノ酸配
列の並列比較。ヒトＤＦＦ４５のアミノ酸配列［２７］
をマウスＩＣＡＤ−Ｌのアミノ酸配列と並列した。両者
の間で一致するアミノ酸を太字で示した。アミノ酸番号
は配列の上側に記載した。
ＡＤ−Ｌのアミノ酸配列を示す。ａ ．ＩＣＡＤ−ＳおよびＩＣＡＤ−Ｌのアミノ酸配列。
ＩＣＡＤ−Ｌのアミノ酸残基の中でＩＣＡＤ−Ｓのもの
と一致するものは「−」で示した。精製ＩＣＡＤから得
たペプチド配列５個には下線を付けた。カスパーゼ３に
よる推測上の切断部位２ケ所を二重下線で示した。アミ
ノ酸番号は配列の上側に記載した。ｂ ．マウスＩＣＡＤ−ＬとヒトＤＦＦ４５のアミノ酸配
列の並列比較。ヒトＤＦＦ４５のアミノ酸配列［２７］
をマウスＩＣＡＤ−Ｌのアミノ酸配列と並列した。両者
の間で一致するアミノ酸を太字で示した。アミノ酸番号
は配列の上側に記載した。
【００２６】図４は、ＩＣＡＤｍＲＮＡの組織分布を示
す電気泳動写真の模写図である。ポリ（Ａ）ＲＮＡを記
載の組織からＱｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ（商品名）マイクロ
ｍＲＮＡ調製キット（ファルマシア社）を用いて調製し
た。各原料から得たＲＮＡ２μｇを電気泳動に付し、報
告［９］通りノーザンハイブリッダイゼーションによっ
て分析した。32Ｐ−標識したマウスＩＣＡＤ−ＬｃＤＮ
Ａ（上図）またはヒトＥＦ−１αｃＤＮＡ（下図）をプ
ローブとして使用した。
す電気泳動写真の模写図である。ポリ（Ａ）ＲＮＡを記
載の組織からＱｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ（商品名）マイクロ
ｍＲＮＡ調製キット（ファルマシア社）を用いて調製し
た。各原料から得たＲＮＡ２μｇを電気泳動に付し、報
告［９］通りノーザンハイブリッダイゼーションによっ
て分析した。32Ｐ−標識したマウスＩＣＡＤ−ＬｃＤＮ
Ａ（上図）またはヒトＥＦ−１αｃＤＮＡ（下図）をプ
ローブとして使用した。
【００２７】図５は、組換えＩＣＡＤによるＣＡＤの特
異的阻害を示す電気泳動写真の模写図である。ａおよびｂ ．Ｆａｓ−活性化Ｗ４細胞から得た細胞抽出
物（２０μｇ）を記載量のＧＳＴ−ＩＣＡＤ−Ｌととも
にプレインキュベーションし、ＣＡＤ活性を肝臓核
（ａ）またはプラスミドＤＮＡ（ｂ）で測定した。ＧＳ
Ｔ−ＩＣＡＤ−Ｌとプレインキュベーションしなかった
もののＣＡＤ活性をレーン１およびレーン９に示す。Ｃ
ＡＤ活性に及ぼす対照ＧＳＴタンパク質の効果をレーン
８およびレーン１４に示す。ｃおよびｄ ．添加量を数段階に設定したＤＮアーゼＩ
（ベーリンガーマンハイム社）（ｃ）またはＤＮアーゼ
ＩＩ（シグマ社）（ｄ）を１０ｎｇ（ｃ）または１０μ
ｇ（ｄ）のＧＳＴ−ＩＣＡＤ−Ｌとともに４℃で３０分
間プレインキュベーションした。プラスミドＤＮＡ
（１．０μｇ）を反応混合物に加え、さらに３０℃で２
時間インキュベーションし、次にアガロースゲル電気泳
動で分析した。レーン１〜４＝ＤＮアーゼ単独；レーン
５〜８＝ＤＮアーゼとＩＣＡＤ−Ｌ。
異的阻害を示す電気泳動写真の模写図である。ａおよびｂ ．Ｆａｓ−活性化Ｗ４細胞から得た細胞抽出
物（２０μｇ）を記載量のＧＳＴ−ＩＣＡＤ−Ｌととも
にプレインキュベーションし、ＣＡＤ活性を肝臓核
（ａ）またはプラスミドＤＮＡ（ｂ）で測定した。ＧＳ
Ｔ−ＩＣＡＤ−Ｌとプレインキュベーションしなかった
もののＣＡＤ活性をレーン１およびレーン９に示す。Ｃ
ＡＤ活性に及ぼす対照ＧＳＴタンパク質の効果をレーン
８およびレーン１４に示す。ｃおよびｄ ．添加量を数段階に設定したＤＮアーゼＩ
（ベーリンガーマンハイム社）（ｃ）またはＤＮアーゼ
ＩＩ（シグマ社）（ｄ）を１０ｎｇ（ｃ）または１０μ
ｇ（ｄ）のＧＳＴ−ＩＣＡＤ−Ｌとともに４℃で３０分
間プレインキュベーションした。プラスミドＤＮＡ
（１．０μｇ）を反応混合物に加え、さらに３０℃で２
時間インキュベーションし、次にアガロースゲル電気泳
動で分析した。レーン１〜４＝ＤＮアーゼ単独；レーン
５〜８＝ＤＮアーゼとＩＣＡＤ−Ｌ。
【００２８】図６は、カスパーゼ３切断によるＩＣＡＤ
の不活化を示す電気泳動写真の模写図である。ａ ．ゲル濾過および加熱処理で精製した天然ＩＣＡＤ
（１００ｎｇ）を１５ｎｇのカスパーゼ３とともに緩衝
液Ａ中で４℃で一夜および３０℃で２時間インキュベー
ションした。Ｆａｓ−活性化Ｗ４細胞から得た抽出物
（２０μｇ）（レーン１〜５）またはカスパーゼ３活性
化部分精製ＣＡＤ（５ｎｇ）（レーン６〜１０）を各２
５ｎｇのカスパーゼ３処理ＩＣＡＤまたは無処理ＩＣＡ
Ｄと混合した。４℃で３０分間インキュベーションした
後、ＣＡＤ活性をマウス核（レーン１〜５）またはプラ
スミドＤＮＡ（レーン６〜１０）で検定した。このＣＡ
Ｄ検定はＣＡＤ（レーン２および７）、ＣＡＤおよびＩ
ＣＡＤ（レーン３および８）、ＣＡＤおよびカスパーゼ
３処理ＩＣＡＤ（レーン４および９）、およびカスパー
ゼ３処理ＩＣＡＤ単独（レーン５および１０）で行っ
た。ｂ ．精製ＩＣＡＤ（１００ｎｇ）を１５ｎｇのカスパー
ゼ３で前記の通り処理し、１０〜２０％勾配ポリアクリ
ルアミドゲルで電気泳動に付し、銀染色で可視化した。
レーン１＝カスパーゼ３処理前のＩＣＡＤ；レーン２＝
カスパーゼ３処理後のＩＣＡＤ；レーン３＝１５ｎｇの
カスパーゼ３。ＩＣＡＤは右側に矢印で示した。
の不活化を示す電気泳動写真の模写図である。ａ ．ゲル濾過および加熱処理で精製した天然ＩＣＡＤ
（１００ｎｇ）を１５ｎｇのカスパーゼ３とともに緩衝
液Ａ中で４℃で一夜および３０℃で２時間インキュベー
ションした。Ｆａｓ−活性化Ｗ４細胞から得た抽出物
（２０μｇ）（レーン１〜５）またはカスパーゼ３活性
化部分精製ＣＡＤ（５ｎｇ）（レーン６〜１０）を各２
５ｎｇのカスパーゼ３処理ＩＣＡＤまたは無処理ＩＣＡ
Ｄと混合した。４℃で３０分間インキュベーションした
後、ＣＡＤ活性をマウス核（レーン１〜５）またはプラ
スミドＤＮＡ（レーン６〜１０）で検定した。このＣＡ
Ｄ検定はＣＡＤ（レーン２および７）、ＣＡＤおよびＩ
ＣＡＤ（レーン３および８）、ＣＡＤおよびカスパーゼ
３処理ＩＣＡＤ（レーン４および９）、およびカスパー
ゼ３処理ＩＣＡＤ単独（レーン５および１０）で行っ
た。ｂ ．精製ＩＣＡＤ（１００ｎｇ）を１５ｎｇのカスパー
ゼ３で前記の通り処理し、１０〜２０％勾配ポリアクリ
ルアミドゲルで電気泳動に付し、銀染色で可視化した。
レーン１＝カスパーゼ３処理前のＩＣＡＤ；レーン２＝
カスパーゼ３処理後のＩＣＡＤ；レーン３＝１５ｎｇの
カスパーゼ３。ＩＣＡＤは右側に矢印で示した。
【００２９】図７は、ＩＣＡＤ−ＬおよびＩＣＡＤ−Ｓ
の模式図、およびカスパーゼ３耐性変異体の検出結果を
示す電気泳動写真の模写図である。ＩＣＡＤ−Ｌおよび
ＩＣＡＤ−Ｓおよびそれらの突然変異体の組換えＧＳＴ
融合タンパク質を大腸菌に産生させ、実施例に記載した
通りに精製した。ａ ．ＩＣＡＤ−ＬおよびＩＣＡＤ−Ｓの図式的表示。推
測上のカスパーゼ３切断部位を示す。 ｂ．ＩＣＡＤ−
Ｌ（レーン１〜８）またはＩＣＡＤ−Ｓ（レーン９〜１
６）の組換えＧＳＴ融合タンパク質（２μｇ）を７５ｎ
ｇのカスパーゼ３とともに緩衝液Ａ中で３７℃で１５分
間インキュベーションした。カスパーゼ３処理前（レー
ン１、３、５、７、９、１１、１３および１５）および
カスパーゼ３処理後（レーン２、４、６、８、１０、１
２、１４、および１６）のサンプルを１０〜２０％勾配
ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、クーマジーブリ
リアントブルーで染色した。分析したＧＳＴ−ＩＣＡＤ
タンパク質は次の通り：野生型（Ｌ／ＷＴおよびＳ／Ｗ
Ｔ）；Ｄ１１７一重変異体（Ｌ／Ｄ１１７ＥおよびＳ／
Ｄ１１７Ｅ）；Ｄ２２４一重変異体（Ｌ／Ｄ２２４Ｅお
よびＳ／Ｄ２２４Ｅ）；またはＤ１１７およびＤ２２４
二重変異体（Ｌ／ｄｍおよびＳ／ｄｍ）。ｃ ．１０ｎｇのＧＳＴ−ＩＣＡＤ−Ｌ（レーン３〜１
０）またはＧＳＴ−ＩＣＡＤ−Ｓ（レーン１１〜１８）
を１５ｎｇのカスパーゼ３の存在下（レーン２、４、
６、８、１０、１２、１４および１６）または非存在下
（レーン１、３、５、７、９、１１、１３および１５）
に０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含む緩衝液Ａ中で４℃で
一夜および３０℃で２時間インキュベーションした。Ｆ
ａｓ−活性化Ｗ４細胞から得た細胞抽出物（２０μｇ）
を混合物に加え、４℃で３０分間インキュベーションし
た。次にＣＡＤ活性を肝臓核で測定した。使用したＧＳ
Ｔ−ＩＣＡＤタンパク質は次の通り：野生型（Ｌ／ＷＴ
およびＳ／ＷＴ）；Ｄ１１７一重変異体（Ｌ／Ｄ１１７
ＥおよびＳ／Ｄ１１７Ｅ）；Ｄ２２４一重変異体（Ｌ／
Ｄ２２４ＥおよびＳ／Ｄ２２４Ｅ）；またはＤ１１７お
よびＤ２２４二重変異体（Ｌ／ｄｍおよびＳ／ｄｍ）。
の模式図、およびカスパーゼ３耐性変異体の検出結果を
示す電気泳動写真の模写図である。ＩＣＡＤ−Ｌおよび
ＩＣＡＤ−Ｓおよびそれらの突然変異体の組換えＧＳＴ
融合タンパク質を大腸菌に産生させ、実施例に記載した
通りに精製した。ａ ．ＩＣＡＤ−ＬおよびＩＣＡＤ−Ｓの図式的表示。推
測上のカスパーゼ３切断部位を示す。 ｂ．ＩＣＡＤ−
Ｌ（レーン１〜８）またはＩＣＡＤ−Ｓ（レーン９〜１
６）の組換えＧＳＴ融合タンパク質（２μｇ）を７５ｎ
ｇのカスパーゼ３とともに緩衝液Ａ中で３７℃で１５分
間インキュベーションした。カスパーゼ３処理前（レー
ン１、３、５、７、９、１１、１３および１５）および
カスパーゼ３処理後（レーン２、４、６、８、１０、１
２、１４、および１６）のサンプルを１０〜２０％勾配
ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、クーマジーブリ
リアントブルーで染色した。分析したＧＳＴ−ＩＣＡＤ
タンパク質は次の通り：野生型（Ｌ／ＷＴおよびＳ／Ｗ
Ｔ）；Ｄ１１７一重変異体（Ｌ／Ｄ１１７ＥおよびＳ／
Ｄ１１７Ｅ）；Ｄ２２４一重変異体（Ｌ／Ｄ２２４Ｅお
よびＳ／Ｄ２２４Ｅ）；またはＤ１１７およびＤ２２４
二重変異体（Ｌ／ｄｍおよびＳ／ｄｍ）。ｃ ．１０ｎｇのＧＳＴ−ＩＣＡＤ−Ｌ（レーン３〜１
０）またはＧＳＴ−ＩＣＡＤ−Ｓ（レーン１１〜１８）
を１５ｎｇのカスパーゼ３の存在下（レーン２、４、
６、８、１０、１２、１４および１６）または非存在下
（レーン１、３、５、７、９、１１、１３および１５）
に０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含む緩衝液Ａ中で４℃で
一夜および３０℃で２時間インキュベーションした。Ｆ
ａｓ−活性化Ｗ４細胞から得た細胞抽出物（２０μｇ）
を混合物に加え、４℃で３０分間インキュベーションし
た。次にＣＡＤ活性を肝臓核で測定した。使用したＧＳ
Ｔ−ＩＣＡＤタンパク質は次の通り：野生型（Ｌ／ＷＴ
およびＳ／ＷＴ）；Ｄ１１７一重変異体（Ｌ／Ｄ１１７
ＥおよびＳ／Ｄ１１７Ｅ）；Ｄ２２４一重変異体（Ｌ／
Ｄ２２４ＥおよびＳ／Ｄ２２４Ｅ）；またはＤ１１７お
よびＤ２２４二重変異体（Ｌ／ｄｍおよびＳ／ｄｍ）。
【００３０】図８は、ＤＮＡ断片化を伴わないジャーカ
ット細胞の細胞死を示すグラフおよび電気泳動写真の模
写図である。ＩＣＡＤ−ＬまたはＩＣＡＤ−Ｓまたはそ
のカスパーゼ３切断部位における二重変異体をＦＬＡＧ
エピトープで標識して、ヒトのジャーカット細胞に導入
した。ａ ．ジャーカット母細胞および、ＩＣＡＤ−Ｌを発現す
る安定形質転換体クローン（ＪＩＬ−３および−７）お
よびその二重変異体を発現する安定形質転換体クローン
（ＪＩＬｄｍ−４および−２０）、ならびにＩＣＡＤ−
Ｓを発現する安定形質転換体クローン（ＪＩＳ−１４お
よび−１５）およびその二重変異体を発現する安定形質
転換体クローン（ＪＩＳｄｍ−１４および−１８）から
得た細胞（各１×１０4個細胞）をレムリのサンプル緩
衝液中で溶解し、抗ＦＬＡＧ抗体でのウェスタンブロッ
ティングによって分析した。標準タンパク質の分子量は
右側の矢印でＫによって示した。ｂ ．ジャーカット母細胞およびＩＣＡＤを発現する記載
の形質転換体クローン（１．２×１０5細胞）を３７℃
で０．５μｇ／ｍＬの抗Ｆａｓ抗体（レーン１〜２０）
または１０μＭ−スタウロスポリン（レーン２１〜３
２）とともに記載の時間インキュベーションした。染色
体ＤＮＡを調製してアガロースゲルで分析した。ｃ、ｄおよびｅ ．ジャーカット細胞とそのＩＣＡＤ−Ｌ
を発現する形質転換体クローン（ＪＩＬ−３）またはＩ
ＣＡＤ−Ｓを発現する形質転換体クローン（ＪＩＳ−１
５）を１０μＭ−スタウロスポリンとともに３７℃で２
時間インキュベーションした。ｃ ．スタウロスポリンとともにインキュベーションする
前（細線）の細胞およびインキュベーションした後（太
線）の細胞をＦＩＴＣ標識アネクシンＶで染色し、ＦＡ
ＣＳｃａｎ（ベクトンディッキンソン社）を用いてフロ
ーサイトメトリーによって分析した。ＩＣＡＤを発現す
るその他の形質転換体クローンも同様な結果を示した。ｄ ．スタウロスポリンとともにインキュベーションする
前（レーン１、３および５）の細胞およびインキュベー
ションした後（レーン２、４および６）の細胞５×１０
4個をレムリのサンプル緩衝液中で溶解し、抗ポリ（Ａ
ＤＰ−リボース）ポリメラーゼモノクローナル抗体（ク
ローンＣ−２〜１０）［４３］を用いるウェスタンブロ
ッティングによって分析した。無処置および切断ポリ
（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の位置
を右側に矢印で示した。ｅ ．スタウロスポリンとともにインキュベーションする
前（白柱）およびインキュベーションした後（黒柱）に
細胞抽出物を調製し、タンパク質２０μｇ中のカスパー
ゼ３活性を螢光性基質、ＭＣＡ−ＤＥＶＤＡＰＫ（ｄｎ
ｐ）で報告［２２］の通りに測定した。この活性は便宜
的単位で表現した。組換えカスパーゼ３の１ｎｇは同一
の検定条件ではこの単位で２２０を示した。
ット細胞の細胞死を示すグラフおよび電気泳動写真の模
写図である。ＩＣＡＤ−ＬまたはＩＣＡＤ−Ｓまたはそ
のカスパーゼ３切断部位における二重変異体をＦＬＡＧ
エピトープで標識して、ヒトのジャーカット細胞に導入
した。ａ ．ジャーカット母細胞および、ＩＣＡＤ−Ｌを発現す
る安定形質転換体クローン（ＪＩＬ−３および−７）お
よびその二重変異体を発現する安定形質転換体クローン
（ＪＩＬｄｍ−４および−２０）、ならびにＩＣＡＤ−
Ｓを発現する安定形質転換体クローン（ＪＩＳ−１４お
よび−１５）およびその二重変異体を発現する安定形質
転換体クローン（ＪＩＳｄｍ−１４および−１８）から
得た細胞（各１×１０4個細胞）をレムリのサンプル緩
衝液中で溶解し、抗ＦＬＡＧ抗体でのウェスタンブロッ
ティングによって分析した。標準タンパク質の分子量は
右側の矢印でＫによって示した。ｂ ．ジャーカット母細胞およびＩＣＡＤを発現する記載
の形質転換体クローン（１．２×１０5細胞）を３７℃
で０．５μｇ／ｍＬの抗Ｆａｓ抗体（レーン１〜２０）
または１０μＭ−スタウロスポリン（レーン２１〜３
２）とともに記載の時間インキュベーションした。染色
体ＤＮＡを調製してアガロースゲルで分析した。ｃ、ｄおよびｅ ．ジャーカット細胞とそのＩＣＡＤ−Ｌ
を発現する形質転換体クローン（ＪＩＬ−３）またはＩ
ＣＡＤ−Ｓを発現する形質転換体クローン（ＪＩＳ−１
５）を１０μＭ−スタウロスポリンとともに３７℃で２
時間インキュベーションした。ｃ ．スタウロスポリンとともにインキュベーションする
前（細線）の細胞およびインキュベーションした後（太
線）の細胞をＦＩＴＣ標識アネクシンＶで染色し、ＦＡ
ＣＳｃａｎ（ベクトンディッキンソン社）を用いてフロ
ーサイトメトリーによって分析した。ＩＣＡＤを発現す
るその他の形質転換体クローンも同様な結果を示した。ｄ ．スタウロスポリンとともにインキュベーションする
前（レーン１、３および５）の細胞およびインキュベー
ションした後（レーン２、４および６）の細胞５×１０
4個をレムリのサンプル緩衝液中で溶解し、抗ポリ（Ａ
ＤＰ−リボース）ポリメラーゼモノクローナル抗体（ク
ローンＣ−２〜１０）［４３］を用いるウェスタンブロ
ッティングによって分析した。無処置および切断ポリ
（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の位置
を右側に矢印で示した。ｅ ．スタウロスポリンとともにインキュベーションする
前（白柱）およびインキュベーションした後（黒柱）に
細胞抽出物を調製し、タンパク質２０μｇ中のカスパー
ゼ３活性を螢光性基質、ＭＣＡ−ＤＥＶＤＡＰＫ（ｄｎ
ｐ）で報告［２２］の通りに測定した。この活性は便宜
的単位で表現した。組換えカスパーゼ３の１ｎｇは同一
の検定条件ではこの単位で２２０を示した。
【００３１】
【実施例】以下の実施例において、本発明をさらに詳細
に説明するが、本発明の範囲はこれらによって何ら限定
されるものではない。ＣＡＤおよびＩＣＡＤの検定法 ＣＡＤ活性は、マウス肝臓核を使用するアポトーシスに
ついての試験管内検定法によって、または基質としてプ
ラスミドＤＮＡを使用するＤＮアーゼ活性測定法によっ
て測定した。すなわち、１００μｇ／ｍＬのウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）およびＡＴＰ再生系（２ｍＭ−ＡＴ
Ｐ、１０ｍＭ−ホスホクレアチン、および５０μｇ／ｍ
Ｌクレアチンキナーゼ）を含む２０μＬの緩衝液Ａ（１
０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ−
ＮａＣｌ、５ｍＭ−ＭｇＣｌ２、５ｍＭ−ＥＧＴＡ、１
０％グリセリン、および１ｍＭ−ＤＴＴ）中で７５ｎｇ
の組換えカスパーゼ３［２２］とともにサンプルを４℃
で１２時間および３０℃で１時間インキュベーションし
た。１０μＭ−Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｃｈｏ（ペプチド研究
所）とともに４℃で３０分間インキュベーションしてカ
スパーゼ３を不活化後、核（１×１０6個）を混合物に
加え、４℃で１２時間および３０℃で１時間インキュベ
ーションした。ＤＮＡを核から回収し、１％アガロース
ゲル電気泳動によって分析した。ＤＮアーゼ活性を測定
するには核の代わりに１μｇのプラスミドＤＮＡを用い
て３０℃で２時間インキュベーションした。
に説明するが、本発明の範囲はこれらによって何ら限定
されるものではない。ＣＡＤおよびＩＣＡＤの検定法 ＣＡＤ活性は、マウス肝臓核を使用するアポトーシスに
ついての試験管内検定法によって、または基質としてプ
ラスミドＤＮＡを使用するＤＮアーゼ活性測定法によっ
て測定した。すなわち、１００μｇ／ｍＬのウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）およびＡＴＰ再生系（２ｍＭ−ＡＴ
Ｐ、１０ｍＭ−ホスホクレアチン、および５０μｇ／ｍ
Ｌクレアチンキナーゼ）を含む２０μＬの緩衝液Ａ（１
０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ−
ＮａＣｌ、５ｍＭ−ＭｇＣｌ２、５ｍＭ−ＥＧＴＡ、１
０％グリセリン、および１ｍＭ−ＤＴＴ）中で７５ｎｇ
の組換えカスパーゼ３［２２］とともにサンプルを４℃
で１２時間および３０℃で１時間インキュベーションし
た。１０μＭ−Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｃｈｏ（ペプチド研究
所）とともに４℃で３０分間インキュベーションしてカ
スパーゼ３を不活化後、核（１×１０6個）を混合物に
加え、４℃で１２時間および３０℃で１時間インキュベ
ーションした。ＤＮＡを核から回収し、１％アガロース
ゲル電気泳動によって分析した。ＤＮアーゼ活性を測定
するには核の代わりに１μｇのプラスミドＤＮＡを用い
て３０℃で２時間インキュベーションした。
【００３２】ＩＣＡＤ活性はＣＡＤ活性の阻害を観察す
ることによって測定した。活性化ＣＡＤの原料として
は、Ｆａｓ活性化細胞から得た細胞質画分またはカスパ
ーゼ３活性化部分精製マウスＣＡＤを使用した（参考例
１参照）。すなわち、マウスＷ４細胞を０．５μｇ／ｍ
Ｌの抗ＦａｓＪｏ２抗体［３７］で３７℃で２０分間処
理し、報告［２５］の通りＳ−１００画分を調製した。
この画分中のカスパーゼ３は１０μＭ−Ａｃ−ＤＥＶＤ
−ｃｈｏとともに４℃で３０分間インキュベーションし
て不活化した。部分的に精製したＣＡＤについては、Ｃ
ＡＤ（１００ｎｇ）を１５０ｎｇのカスパーゼ３ととも
に１００μｇ／ｍＬのＢＳＡを含む緩衝液Ａ１００μＬ
中で４℃で１２時間および３０℃で１時間インキュベー
ションし、このカスパーゼ３はＡｃ−ＤＥＶＤ−ｃｈｏ
で不活化した。被験サンプルは最終容積２０μＬ中の活
性ＣＡＤ（Ｆａｓ活性化Ｗ４細胞から得た細胞抽出物の
２０μｇまたは活性化部分精製マウスＣＡＤの５ｎｇ）
に加えた。４℃で３０分間インキュベーションした後、
標的として核またはプラスミドＤＮＡを使用して残留Ｃ
ＡＤ活性を前記の通りに測定した。
ることによって測定した。活性化ＣＡＤの原料として
は、Ｆａｓ活性化細胞から得た細胞質画分またはカスパ
ーゼ３活性化部分精製マウスＣＡＤを使用した（参考例
１参照）。すなわち、マウスＷ４細胞を０．５μｇ／ｍ
Ｌの抗ＦａｓＪｏ２抗体［３７］で３７℃で２０分間処
理し、報告［２５］の通りＳ−１００画分を調製した。
この画分中のカスパーゼ３は１０μＭ−Ａｃ−ＤＥＶＤ
−ｃｈｏとともに４℃で３０分間インキュベーションし
て不活化した。部分的に精製したＣＡＤについては、Ｃ
ＡＤ（１００ｎｇ）を１５０ｎｇのカスパーゼ３ととも
に１００μｇ／ｍＬのＢＳＡを含む緩衝液Ａ１００μＬ
中で４℃で１２時間および３０℃で１時間インキュベー
ションし、このカスパーゼ３はＡｃ−ＤＥＶＤ−ｃｈｏ
で不活化した。被験サンプルは最終容積２０μＬ中の活
性ＣＡＤ（Ｆａｓ活性化Ｗ４細胞から得た細胞抽出物の
２０μｇまたは活性化部分精製マウスＣＡＤの５ｎｇ）
に加えた。４℃で３０分間インキュベーションした後、
標的として核またはプラスミドＤＮＡを使用して残留Ｃ
ＡＤ活性を前記の通りに測定した。
【００３３】実施例１： ＩＣＡＤの精製およびペプチドの配列決定 プロテアーゼ阻害物質の混合物［１ｍＭ−（ｐ−アミノ
フェニル）メタンスルホニルフルオリド塩酸塩（ｐ−Ａ
ＰＭＳＦ）、１μｇ／ｍＬアプロチニン、１μｇ／ｍＬ
ロイペプチン、および１μｇ／ｍＬペプスタチンＡ］を
添加した緩衝液ＡにマウスＴ細胞リンパ腫のマウスＷＲ
１９Ｌ細胞を懸濁した（２×１０9細胞／ｍＬ）。細胞
をガラス製のダウンスホモジナイザーに移し、凍結およ
び解凍を３周行って崩壊させたが、各解凍サイクルの間
にペッスルで摩りつぶした。ホモジネートを３００００
×ｇで３０分間および１０００００×ｇで１２時間遠心
分離してＳ−１００画分を得た。このＳ−１００画分
（１７１０ｍｇ）を緩衝液Ａと平衡させたＤＥＡＥセフ
ァロースＦＦカラム（容積１７０ｍＬ、ファルマシア
社）に負荷した。カラムを緩衝液Ａで洗い、１７００ｍ
Ｌ中の５０〜３５０ｍＭ−直線状ＮａＣｌ勾配で溶出し
た。得られた各画分をカスパーゼ３処理し、次に核内で
ＤＮＡ分解を起こす性能を検定した。図１ａに示す通
り、ＤＮＡ分解活性は約１４５ｍＭ−ＮａＣｌに単一ピ
ークとして溶出された。この活性はカスパーゼ３で処理
をしないと検出できなかった。
フェニル）メタンスルホニルフルオリド塩酸塩（ｐ−Ａ
ＰＭＳＦ）、１μｇ／ｍＬアプロチニン、１μｇ／ｍＬ
ロイペプチン、および１μｇ／ｍＬペプスタチンＡ］を
添加した緩衝液ＡにマウスＴ細胞リンパ腫のマウスＷＲ
１９Ｌ細胞を懸濁した（２×１０9細胞／ｍＬ）。細胞
をガラス製のダウンスホモジナイザーに移し、凍結およ
び解凍を３周行って崩壊させたが、各解凍サイクルの間
にペッスルで摩りつぶした。ホモジネートを３００００
×ｇで３０分間および１０００００×ｇで１２時間遠心
分離してＳ−１００画分を得た。このＳ−１００画分
（１７１０ｍｇ）を緩衝液Ａと平衡させたＤＥＡＥセフ
ァロースＦＦカラム（容積１７０ｍＬ、ファルマシア
社）に負荷した。カラムを緩衝液Ａで洗い、１７００ｍ
Ｌ中の５０〜３５０ｍＭ−直線状ＮａＣｌ勾配で溶出し
た。得られた各画分をカスパーゼ３処理し、次に核内で
ＤＮＡ分解を起こす性能を検定した。図１ａに示す通
り、ＤＮＡ分解活性は約１４５ｍＭ−ＮａＣｌに単一ピ
ークとして溶出された。この活性はカスパーゼ３で処理
をしないと検出できなかった。
【００３４】次いで、活性画分（タンパク質１２５ｍ
ｇ）を集めて、２５％飽和から５０％飽和までの硫酸ア
ンモニウムで分画し、１Ｍ−硫酸アンモニウムを添加し
た緩衝液Ｂ（５０ｍＭ−ＮａＣｌ不含緩衝液Ａ）に溶解
した。このサンプルをブチル−セファロース４ＦＦカラ
ム（容積１８ｍＬ、ファルマシア社）に負荷し、１Ｍ−
硫酸アンモニウムを添加した緩衝液Ｂと平衡させた。こ
のカラムを１．０から０Ｍまでの硫酸アンモニウムを直
線状濃度減少勾配で含む緩衝液Ｂ１８０ｍＬで溶出し、
続いて緩衝液Ｂによって溶出した。活性画分を集めて最
終濃度０．８Ｍになるまで硫酸アンモニウムを加えた。
不溶性物質を除去後、サンプル（タンパク質４．２ｍ
ｇ）をフェニル−スーパロースＨＲ５／５カラム（ファ
ルマシア社）に負荷し、１０ｍＬの緩衝液Ｂで溶出し
た。活性画分（１．３ｍｇ）を集め、最終濃度０．０２
％になるまでトゥイーン２０を加えた。サンプルを緩衝
液Ｃ（０．０２％トゥイーン２０含有緩衝液Ａ）と平衡
させたスーパデックス−２００ＨＲ１０／３０ゲル濾過
カラムに負荷した。部分的に精製したＩＣＡＤの物理化
学的特性は還元剤（５ｍＭ β−メルカプトエタノー
ル）の存在下に加熱（９０℃）および変性剤（０．１％
ＳＤＳ）に耐性であることを示した。よって、各活性画
分を９０℃で１５分間加熱し、１０００００×ｇで３０
分間遠心分離して沈降物を除いた。
ｇ）を集めて、２５％飽和から５０％飽和までの硫酸ア
ンモニウムで分画し、１Ｍ−硫酸アンモニウムを添加し
た緩衝液Ｂ（５０ｍＭ−ＮａＣｌ不含緩衝液Ａ）に溶解
した。このサンプルをブチル−セファロース４ＦＦカラ
ム（容積１８ｍＬ、ファルマシア社）に負荷し、１Ｍ−
硫酸アンモニウムを添加した緩衝液Ｂと平衡させた。こ
のカラムを１．０から０Ｍまでの硫酸アンモニウムを直
線状濃度減少勾配で含む緩衝液Ｂ１８０ｍＬで溶出し、
続いて緩衝液Ｂによって溶出した。活性画分を集めて最
終濃度０．８Ｍになるまで硫酸アンモニウムを加えた。
不溶性物質を除去後、サンプル（タンパク質４．２ｍ
ｇ）をフェニル−スーパロースＨＲ５／５カラム（ファ
ルマシア社）に負荷し、１０ｍＬの緩衝液Ｂで溶出し
た。活性画分（１．３ｍｇ）を集め、最終濃度０．０２
％になるまでトゥイーン２０を加えた。サンプルを緩衝
液Ｃ（０．０２％トゥイーン２０含有緩衝液Ａ）と平衡
させたスーパデックス−２００ＨＲ１０／３０ゲル濾過
カラムに負荷した。部分的に精製したＩＣＡＤの物理化
学的特性は還元剤（５ｍＭ β−メルカプトエタノー
ル）の存在下に加熱（９０℃）および変性剤（０．１％
ＳＤＳ）に耐性であることを示した。よって、各活性画
分を９０℃で１５分間加熱し、１０００００×ｇで３０
分間遠心分離して沈降物を除いた。
【００３５】得られた上清液はＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動像に数個のバンド（図２ａ）を示し、Ｉ
ＣＡＤ活性を示した（図２ｂ）。ＩＣＡＤを特定のバン
ドに割当てるため、加熱したサンプルをＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動によって分画し、ゲルを細断
した。図２ｃに示す通り、ゲル片から溶出した３２ｋＤ
ａのタンパク質を含むタンパク質は核内のＣＡＤ誘導Ｄ
ＮＡ分解ならびにそのＤＮアーゼ活性を阻害し（図２
ｄ）、この３２ｋＤａタンパク質がＩＣＡＤであること
を示した。表１はマウスＷＲ１９Ｌ細胞から得られたＩ
ＣＡＤの精製をまとめたものである。Ｓ−１００画分か
ら得られたＩＣＡＤの通算精製率は約１７０００倍であ
って、収率は１１．８％であった。タンパク質約１２μ
ｇが４×１０11個の細胞（培養液２００リットル）から
得られた。
ドゲル電気泳動像に数個のバンド（図２ａ）を示し、Ｉ
ＣＡＤ活性を示した（図２ｂ）。ＩＣＡＤを特定のバン
ドに割当てるため、加熱したサンプルをＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動によって分画し、ゲルを細断
した。図２ｃに示す通り、ゲル片から溶出した３２ｋＤ
ａのタンパク質を含むタンパク質は核内のＣＡＤ誘導Ｄ
ＮＡ分解ならびにそのＤＮアーゼ活性を阻害し（図２
ｄ）、この３２ｋＤａタンパク質がＩＣＡＤであること
を示した。表１はマウスＷＲ１９Ｌ細胞から得られたＩ
ＣＡＤの精製をまとめたものである。Ｓ−１００画分か
ら得られたＩＣＡＤの通算精製率は約１７０００倍であ
って、収率は１１．８％であった。タンパク質約１２μ
ｇが４×１０11個の細胞（培養液２００リットル）から
得られた。
【００３６】
【表１】 マウスＩＣＡＤの精製 段階 タンパク質 全活性 比活性 精製率 収率 （ｍｇ） （×1000単位) （単位/μg） （倍） （％） Ｓ−１００ 1710.0 20853.0 12.2 100 DEAE-セファロース 125.0 10975.6 87.8 7 52.6 硫酸アンモニウム 62.0 10812.1 174.3 14 51.8フ゛チル -セファロース 4.2 3995.1 951.6 78 19.2フェニル -スーハ゜ロース 1.3 3408.5 2622.0 215 16.3スーハ゜テ゛ックス 0.12 2726.3 22719.5 1863 13.1 加熱処理 0.012 2453.7 204475.6 16767 11.8 Ｓ−１００画分は４×１０11個のマウスＷＲ１９Ｌ細胞
から調製した。ＩＣＡＤ活性はマウス核で実験操作法に
記載した通りに測定した。阻害作用１単位はＣＡＤ活性
１単位を半分阻害する希釈率と定義した。加熱処理サン
プル中のＩＣＡＤタンパク質濃度はＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動物の銀染色で評価した。
から調製した。ＩＣＡＤ活性はマウス核で実験操作法に
記載した通りに測定した。阻害作用１単位はＣＡＤ活性
１単位を半分阻害する希釈率と定義した。加熱処理サン
プル中のＩＣＡＤタンパク質濃度はＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動物の銀染色で評価した。
【００３７】ペプチド配列決定 ペプチド配列分析のためにはサンプルを１０〜２０％勾
配ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ポリビニリジ
ンジフルオリド膜（プロブロット、アプライドバイオシ
ステムズ社）にブロットした。ポンソーＳで染色後、固
定化したＩＣＡＤ（約１０ｐモル）を還元し、Ｓ−カル
ボキシメチル化し、報告［３８］通りに原位置でアクロ
モバクタープロテアーゼＩによって消化した。膜から溶
出したペプチドをワコーシル（Ｗａｋｏｓｉｌ）−Ｉ
Ｉ、ＡＲ・Ｃ１８・３００Ａカラム（和光純薬）を用い
る逆相高速液体クロマトグラフィーによって分画し、タ
ンパク質配列決定装置（島津、ＰＰＳＱ−２３型）を使
用して配列決定した。
配ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ポリビニリジ
ンジフルオリド膜（プロブロット、アプライドバイオシ
ステムズ社）にブロットした。ポンソーＳで染色後、固
定化したＩＣＡＤ（約１０ｐモル）を還元し、Ｓ−カル
ボキシメチル化し、報告［３８］通りに原位置でアクロ
モバクタープロテアーゼＩによって消化した。膜から溶
出したペプチドをワコーシル（Ｗａｋｏｓｉｌ）−Ｉ
Ｉ、ＡＲ・Ｃ１８・３００Ａカラム（和光純薬）を用い
る逆相高速液体クロマトグラフィーによって分画し、タ
ンパク質配列決定装置（島津、ＰＰＳＱ−２３型）を使
用して配列決定した。
【００３８】ゲルからのＩＣＡＤの回収 ＩＣＡＤは実質的にＨａｇｅｒら［３６］に従ってポリ
アクリルアミドゲルから回収した。すなわち、ＩＣＡＤ
１００ｎｇをレムリ（Ｌａｍｍｅｌｌｉ）のサンプル緩
衝液中で９５℃に５分間加熱し、ポリアクリルアミドゲ
ル（第一化学）で電気泳動した。ゲルを３〜５ｍｍ厚の
細片に切断し、Ｈ2Ｏで洗い、１ｍＬの緩衝液（５０ｍ
Ｍ−トリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭ−ＤＴＴ、０．
１ｍＭ−ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、０．１％Ｓ
ＤＳおよびＢＳＡ０．１ｍｇ／ｍＬ）中で砕き、室温で
一夜撹拌した。ゲルから溶出したタンパク質を冷アセト
ンで沈降させ、６Ｍ−グアニジンＨＣｌを含む緩衝液Ｃ
に溶解した。この溶液を室温で２０分間インキュベーシ
ョンし、緩衝液Ｃに対して室温で透析した。
アクリルアミドゲルから回収した。すなわち、ＩＣＡＤ
１００ｎｇをレムリ（Ｌａｍｍｅｌｌｉ）のサンプル緩
衝液中で９５℃に５分間加熱し、ポリアクリルアミドゲ
ル（第一化学）で電気泳動した。ゲルを３〜５ｍｍ厚の
細片に切断し、Ｈ2Ｏで洗い、１ｍＬの緩衝液（５０ｍ
Ｍ−トリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭ−ＤＴＴ、０．
１ｍＭ−ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、０．１％Ｓ
ＤＳおよびＢＳＡ０．１ｍｇ／ｍＬ）中で砕き、室温で
一夜撹拌した。ゲルから溶出したタンパク質を冷アセト
ンで沈降させ、６Ｍ−グアニジンＨＣｌを含む緩衝液Ｃ
に溶解した。この溶液を室温で２０分間インキュベーシ
ョンし、緩衝液Ｃに対して室温で透析した。
【００３９】実施例２： ＩＣＡＤ ｃＤＮＡの分子クローニング 実施例１により得られた精製ＩＣＡＤをアミノ酸配列分
析に付して５個のペプチド配列を得た。配列の一つがマ
ウスＥＳＴデータベースに見出され、この配列を用い
て、互いに異なる２種のＩＣＡＤ ｃＤＮＡをマウスＴ
細胞リンパ腫ｃＤＮＡライブラリーから分離した。オリ
ゴヌクレオチド２種（５’−ＧＡＴＴＣＣＧＡＴＧＧＡ
ＧＧＧＡＣ−３’および５’−ＧＡＴＡＡＡＣＴＣＡＧ
ＣＴＣＴＧＧ−３’）をＥＳＴクローン＃６１５７１２
から設計した。これは精製ＩＣＡＤ（図３）のペプチド
配列の一つをコードしている。ＷＲ１９ＬのｃＤＮＡラ
イブラリーからｃＤＮＡ（４７６ｂｐ）をＰＣＲによっ
て増幅し、ランダムプライマー標識キット（ベーリンガ
ーマンハイム社）を用いて32Ｐで標識し、これをプロー
ブに用いてＷＲ１９ＬのｃＤＮＡライブラリーを検索し
た。コロニーハイブリッダイゼーションを報告［３９］
の通りに行って、２×１０5クローンの中から８個の陽
性クローンを得た。その中で２個のクローンがＩＣＡＤ
−ＬのｃＤＮＡを、他の２個のクローンがＩＣＡＤ−Ｓ
のｃＤＮＡを有していた。各型のｃＤＮＡから１個を取
り、ＤＮＡ配列決定装置（ファルマシアアルフレッド
社）を用いて両鎖について配列決定した（配列番号３お
よび５）。これらｃＤＮＡは長さ２．０および１．０ｋ
ｂであり、各々長さ３３１および２６５アミノ酸の読取
り枠を含んでいた（図３ａ）。このｃＤＮＡ２種は２６
１位のアミノ酸までは同一であり、そこから後の配列は
異なり、これらのｍＲＮＡ２種が異なるスプライシング
によって作製されることを示唆している。長い方のＩＣ
ＡＤおよび短い方のＩＣＡＤをそれぞれＩＣＡＤ−Ｌお
よびＩＣＡＤ−Ｓと命名した。
析に付して５個のペプチド配列を得た。配列の一つがマ
ウスＥＳＴデータベースに見出され、この配列を用い
て、互いに異なる２種のＩＣＡＤ ｃＤＮＡをマウスＴ
細胞リンパ腫ｃＤＮＡライブラリーから分離した。オリ
ゴヌクレオチド２種（５’−ＧＡＴＴＣＣＧＡＴＧＧＡ
ＧＧＧＡＣ−３’および５’−ＧＡＴＡＡＡＣＴＣＡＧ
ＣＴＣＴＧＧ−３’）をＥＳＴクローン＃６１５７１２
から設計した。これは精製ＩＣＡＤ（図３）のペプチド
配列の一つをコードしている。ＷＲ１９ＬのｃＤＮＡラ
イブラリーからｃＤＮＡ（４７６ｂｐ）をＰＣＲによっ
て増幅し、ランダムプライマー標識キット（ベーリンガ
ーマンハイム社）を用いて32Ｐで標識し、これをプロー
ブに用いてＷＲ１９ＬのｃＤＮＡライブラリーを検索し
た。コロニーハイブリッダイゼーションを報告［３９］
の通りに行って、２×１０5クローンの中から８個の陽
性クローンを得た。その中で２個のクローンがＩＣＡＤ
−ＬのｃＤＮＡを、他の２個のクローンがＩＣＡＤ−Ｓ
のｃＤＮＡを有していた。各型のｃＤＮＡから１個を取
り、ＤＮＡ配列決定装置（ファルマシアアルフレッド
社）を用いて両鎖について配列決定した（配列番号３お
よび５）。これらｃＤＮＡは長さ２．０および１．０ｋ
ｂであり、各々長さ３３１および２６５アミノ酸の読取
り枠を含んでいた（図３ａ）。このｃＤＮＡ２種は２６
１位のアミノ酸までは同一であり、そこから後の配列は
異なり、これらのｍＲＮＡ２種が異なるスプライシング
によって作製されることを示唆している。長い方のＩＣ
ＡＤおよび短い方のＩＣＡＤをそれぞれＩＣＡＤ−Ｌお
よびＩＣＡＤ−Ｓと命名した。
【００４０】実施例３： 大腸菌におけるＩＣＡＤの発現 常法により、実施例２記載のＩＣＡＤ−ＬおよびＩＣＡ
Ｄ−ＳをコードしているｃＤＮＡをプラスミドにクロー
ニングし、得られたプラスミドを大腸菌に導入した。調
製した形質転換体はそれぞれEscherichia coli／ｐＥＦ
Ｌ−ＩＣＡＤＬおよびEscherichia coli／ｐＥＦＬ−Ｉ
ＣＡＤＳとして、茨城県つくば市東１丁目１番３号、工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている（受
託日：いずれも平成９年１２月１６日；受託番号：それ
ぞれＦＥＲＭ Ｐ−１６５６０、ＦＥＲＭ Ｐ−１６５５
９）。実施例２にて精製ＩＣＡＤと共に得られたペプチ
ド配列５種は全てがＩＣＡＤ−Ｓ配列の中に見出され、
その分子量計算値（２９１６９Ｄａ）はＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動から推測した値と良く一致し
た。ＩＣＡＤ−ＳおよびＩＣＡＤ−Ｌは双方とも酸性ア
ミノ酸が豊富で等電点約４．５を示す。ＧｅｎＢａｎｋ
データベースにおけるＢＬＡＳＴ相同性検索の結果、マ
ウスＩＣＡＤ−ＬがヒトＤＦＦ４５（ＤＮＡ断片化因子
４５）［２７］に対して高度に相同的であることを示し
た。図３ｂに示す通り、この２種の配列はギャップなし
に並列でき、また、アミノ酸配列のレベルで７６．１％
同一であり、マウスＩＣＡＤ−ＬはヒトＤＦＦ４５の対
応物であることを示唆する。
Ｄ−ＳをコードしているｃＤＮＡをプラスミドにクロー
ニングし、得られたプラスミドを大腸菌に導入した。調
製した形質転換体はそれぞれEscherichia coli／ｐＥＦ
Ｌ−ＩＣＡＤＬおよびEscherichia coli／ｐＥＦＬ−Ｉ
ＣＡＤＳとして、茨城県つくば市東１丁目１番３号、工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている（受
託日：いずれも平成９年１２月１６日；受託番号：それ
ぞれＦＥＲＭ Ｐ−１６５６０、ＦＥＲＭ Ｐ−１６５５
９）。実施例２にて精製ＩＣＡＤと共に得られたペプチ
ド配列５種は全てがＩＣＡＤ−Ｓ配列の中に見出され、
その分子量計算値（２９１６９Ｄａ）はＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動から推測した値と良く一致し
た。ＩＣＡＤ−ＳおよびＩＣＡＤ−Ｌは双方とも酸性ア
ミノ酸が豊富で等電点約４．５を示す。ＧｅｎＢａｎｋ
データベースにおけるＢＬＡＳＴ相同性検索の結果、マ
ウスＩＣＡＤ−ＬがヒトＤＦＦ４５（ＤＮＡ断片化因子
４５）［２７］に対して高度に相同的であることを示し
た。図３ｂに示す通り、この２種の配列はギャップなし
に並列でき、また、アミノ酸配列のレベルで７６．１％
同一であり、マウスＩＣＡＤ−ＬはヒトＤＦＦ４５の対
応物であることを示唆する。
【００４１】種々のマウス組織のＩＣＡＤｃＤＮＡによ
るノーザンハイブリッダイゼーション分析の結果から、
ほとんどの組織はＩＣＡＤ−ＬおよびＩＣＡＤ−Ｓのｍ
ＲＮＡが共存することに起因すると思われる約３ｋｂの
ＩＣＡＤｍＲＮＡ（図４）の広いバンドを発現すること
を示した。小腸、卵巣、子宮、および脾臓のような組織
はこのｍＲＮＡをかなり豊富に発現することが見出され
た。
るノーザンハイブリッダイゼーション分析の結果から、
ほとんどの組織はＩＣＡＤ−ＬおよびＩＣＡＤ−Ｓのｍ
ＲＮＡが共存することに起因すると思われる約３ｋｂの
ＩＣＡＤｍＲＮＡ（図４）の広いバンドを発現すること
を示した。小腸、卵巣、子宮、および脾臓のような組織
はこのｍＲＮＡをかなり豊富に発現することが見出され
た。
【００４２】試験例１：ＣＡＤのＤＮアーゼ活性に対す
るＩＣＡＤによる特異的阻害 ＩＣＡＤの酵素的特性を検討するため、大腸菌内でＩＣ
ＡＤ−ＬおよびＩＣＡＤ−Ｓをグルタチオン−Ｓ−トラ
ンスフェラーゼ（ＧＳＴ）−融合タンパク質として調製
し、均一になるまで精製した。図５ａに示す通り、組換
えＩＣＡＤはＦａｓ活性化細胞から得られた抽出物が誘
導する核のＤＮＡ分解を阻害した。ＩＣＡＤによるこの
阻害は用量依存的であり、数ｎｇのＩＣＡＤ−ＬはＦａ
ｓ活性化細胞から得られた２０μｇの抽出物のＣＡＤ活
性を十分に阻害した（図５ａ）。ＩＣＡＤ−ＬはＣＡＤ
のＤＮアーゼ活性も効率的に阻害した（図５ｂ）。一
方、ＩＣＡＤ−ＬはＤＮアーゼＩおよびＤＮアーゼＩＩ
のＤＮアーゼ作用はどちらも阻害しなかった（図５ｃお
よびｄ）。ＣＡＤに対する同様な特異的阻害効果がＩＣ
ＡＤ−Ｓでも観察された。
るＩＣＡＤによる特異的阻害 ＩＣＡＤの酵素的特性を検討するため、大腸菌内でＩＣ
ＡＤ−ＬおよびＩＣＡＤ−Ｓをグルタチオン−Ｓ−トラ
ンスフェラーゼ（ＧＳＴ）−融合タンパク質として調製
し、均一になるまで精製した。図５ａに示す通り、組換
えＩＣＡＤはＦａｓ活性化細胞から得られた抽出物が誘
導する核のＤＮＡ分解を阻害した。ＩＣＡＤによるこの
阻害は用量依存的であり、数ｎｇのＩＣＡＤ−ＬはＦａ
ｓ活性化細胞から得られた２０μｇの抽出物のＣＡＤ活
性を十分に阻害した（図５ａ）。ＩＣＡＤ−ＬはＣＡＤ
のＤＮアーゼ活性も効率的に阻害した（図５ｂ）。一
方、ＩＣＡＤ−ＬはＤＮアーゼＩおよびＤＮアーゼＩＩ
のＤＮアーゼ作用はどちらも阻害しなかった（図５ｃお
よびｄ）。ＣＡＤに対する同様な特異的阻害効果がＩＣ
ＡＤ−Ｓでも観察された。
【００４３】試験例２：カスパーゼ３によるＩＣＡＤの
不活化 精製ＩＣＡＤをカスパーゼ３とインキュベーションする
と、３２ｋＤａのＩＣＡＤタンパク質は特異的に切断さ
れ（図６ｂ）、もはや核内のＣＡＤ誘導ＤＮＡ分解もＤ
Ｎアーゼ活性も阻害できなかった（図６ａ）。カスパー
ゼは切断部位のＰ１位にアスパラギン酸を要求する［２
８，２９］。カスパーゼ３が１１７位のアミノ酸と２２
４位のアミノ酸でＩＣＡＤを切断すること（図７ａ）を
確認するため、切断部位のアスパラギン酸を一重または
二重にグルタミン酸に変異させ、各ＩＣＡＤ変異体につ
いて組換えＧＳＴ融合タンパク質を大腸菌中で産生させ
た。
不活化 精製ＩＣＡＤをカスパーゼ３とインキュベーションする
と、３２ｋＤａのＩＣＡＤタンパク質は特異的に切断さ
れ（図６ｂ）、もはや核内のＣＡＤ誘導ＤＮＡ分解もＤ
Ｎアーゼ活性も阻害できなかった（図６ａ）。カスパー
ゼは切断部位のＰ１位にアスパラギン酸を要求する［２
８，２９］。カスパーゼ３が１１７位のアミノ酸と２２
４位のアミノ酸でＩＣＡＤを切断すること（図７ａ）を
確認するため、切断部位のアスパラギン酸を一重または
二重にグルタミン酸に変異させ、各ＩＣＡＤ変異体につ
いて組換えＧＳＴ融合タンパク質を大腸菌中で産生させ
た。
【００４４】変異体の調製 Ｄ１１７ＥおよびＤ２２４Ｅの変異体を作製するため、
ＩＣＡＤ−ＳおよびＩＣＡＤ−ＬのｃＤＮＡを変異ヌク
レオチドを有する２０ヌクレオチドのプライマーを用い
て組換えＰＣＲ法［４０］により変異させた。Ｄ１１７
Ｅ／Ｄ２２４Ｅ二重変異体はＤ１１７とＤ２２４の間に
あるＢｇｌＩＩ部位を用いてＤ２２４Ｅ変異体のＮ−末
端側の半分をＤ１１７Ｅ変異体のものに置換して作製し
た。野生型および変異型のｃＤＮＡをｐＧＥＸ−２Ｔ
［１２８／１２９］のグルタチオン−Ｓ−トランスフェ
ラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子に融合させた。ｐＧＥＸ−２Ｔ
［１２８／１２９］はｐＧＥＸ−２Ｔ（ファルマシア
社）から読取り枠内にＧＳＴ遺伝子に続けてＦＬＡＧエ
ピトープ標識（ＤＹＫＤＤＤＤＫＡ）および心筋キナー
ゼ認識部位（ＲＲＡＳＶ）が挿入されている［４１］。
この融合タンパク質を大腸菌ＡＤ２０２株で発現させ、
本質的に製造社の指示に従ってグルタチオン−セファロ
ース４Ｂ（ファルマシア社）によって精製した。グルタ
チオンカラムから溶出した組換えＩＣＡＤを緩衝液Ｃ中
のＮａＣｌ勾配によってモノＱ・ＨＲ５／５カラムで精
製した。
ＩＣＡＤ−ＳおよびＩＣＡＤ−ＬのｃＤＮＡを変異ヌク
レオチドを有する２０ヌクレオチドのプライマーを用い
て組換えＰＣＲ法［４０］により変異させた。Ｄ１１７
Ｅ／Ｄ２２４Ｅ二重変異体はＤ１１７とＤ２２４の間に
あるＢｇｌＩＩ部位を用いてＤ２２４Ｅ変異体のＮ−末
端側の半分をＤ１１７Ｅ変異体のものに置換して作製し
た。野生型および変異型のｃＤＮＡをｐＧＥＸ−２Ｔ
［１２８／１２９］のグルタチオン−Ｓ−トランスフェ
ラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子に融合させた。ｐＧＥＸ−２Ｔ
［１２８／１２９］はｐＧＥＸ−２Ｔ（ファルマシア
社）から読取り枠内にＧＳＴ遺伝子に続けてＦＬＡＧエ
ピトープ標識（ＤＹＫＤＤＤＤＫＡ）および心筋キナー
ゼ認識部位（ＲＲＡＳＶ）が挿入されている［４１］。
この融合タンパク質を大腸菌ＡＤ２０２株で発現させ、
本質的に製造社の指示に従ってグルタチオン−セファロ
ース４Ｂ（ファルマシア社）によって精製した。グルタ
チオンカラムから溶出した組換えＩＣＡＤを緩衝液Ｃ中
のＮａＣｌ勾配によってモノＱ・ＨＲ５／５カラムで精
製した。
【００４５】図７ｂに示す通り、野生型ＩＣＡＤ−Ｌ
（Ｌ／ＷＴ）のカスパーゼ３による処理では分子量４０
ｋＤａおよび１２ｋＤａのバンド２個が得られた。上側
のバンドはＧＳＴおよびＩＣＡＤのＮ−末端部分からな
る融合タンパク質であるが、下側のバンドは実際にはＩ
ＣＡＤの中央とＣ末端部分に由来するバンド２個であ
る。Ａｓｐ−１１７を変異（Ｌ／Ｄ１１７Ｅ）させる
と、カスパーゼ３が作製した上側のバンドは分子量５２
ｋＤａのバンドに移動したが、一方Ａｓｐ−２２４を変
異（Ｌ／Ｄ２２４Ｅ）させると、下側のバンドは分子量
２６ｋＤａのバンドに移動した。さらに両部位で二重に
変異させると（Ｌ／ｄｍ）、カスパーゼ３に耐性のＩＣ
ＡＤが作製された。ＩＣＡＤ−Ｓの変異体でも同様な結
果が得られた。次にＣＡＤ誘導ＤＮＡ分解に対する変異
体ＩＣＡＤの阻害作用を測定した。在来型ＩＣＡＤで見
出された通り、組換えＩＣＡＤのカスパーゼ３処理は活
性を破壊した（図７ｃ）。Ａｓｐ−１１７での一重変異
またはＡｓｐ−１１７とＡｓｐ−２２４での二重変異を
有する各ＩＣＡＤはカスパーゼ３処理後はまだ活性を示
した。他方、Ａｓｐ−１１７位に無傷の切断部位を有す
るＩＣＡＤ、殊にＩＣＡＤ−Ｓはカスパーゼ３に感受性
であった。これらの結果は、Ａｓｐ−１１７位における
ＩＣＡＤのカスパーゼ３による切断はＩＣＡＤを不活化
すること、およびＡｓｐ−１１７位における変異でカス
パーゼ３耐性ＩＣＡＤを作製できることを示している。
（Ｌ／ＷＴ）のカスパーゼ３による処理では分子量４０
ｋＤａおよび１２ｋＤａのバンド２個が得られた。上側
のバンドはＧＳＴおよびＩＣＡＤのＮ−末端部分からな
る融合タンパク質であるが、下側のバンドは実際にはＩ
ＣＡＤの中央とＣ末端部分に由来するバンド２個であ
る。Ａｓｐ−１１７を変異（Ｌ／Ｄ１１７Ｅ）させる
と、カスパーゼ３が作製した上側のバンドは分子量５２
ｋＤａのバンドに移動したが、一方Ａｓｐ−２２４を変
異（Ｌ／Ｄ２２４Ｅ）させると、下側のバンドは分子量
２６ｋＤａのバンドに移動した。さらに両部位で二重に
変異させると（Ｌ／ｄｍ）、カスパーゼ３に耐性のＩＣ
ＡＤが作製された。ＩＣＡＤ−Ｓの変異体でも同様な結
果が得られた。次にＣＡＤ誘導ＤＮＡ分解に対する変異
体ＩＣＡＤの阻害作用を測定した。在来型ＩＣＡＤで見
出された通り、組換えＩＣＡＤのカスパーゼ３処理は活
性を破壊した（図７ｃ）。Ａｓｐ−１１７での一重変異
またはＡｓｐ−１１７とＡｓｐ−２２４での二重変異を
有する各ＩＣＡＤはカスパーゼ３処理後はまだ活性を示
した。他方、Ａｓｐ−１１７位に無傷の切断部位を有す
るＩＣＡＤ、殊にＩＣＡＤ−Ｓはカスパーゼ３に感受性
であった。これらの結果は、Ａｓｐ−１１７位における
ＩＣＡＤのカスパーゼ３による切断はＩＣＡＤを不活化
すること、およびＡｓｐ−１１７位における変異でカス
パーゼ３耐性ＩＣＡＤを作製できることを示している。
【００４６】試験例３：ＩＣＡＤ過剰発現細胞における
アポトーシス性ＤＮＡ分解不存在の確認 アポトーシスの間に起きるＤＮＡ分解に及ぼすＩＣＡＤ
の効果を検討するため、野生型のＩＣＡＤ−ＬおよびＩ
ＣＡＤ−Ｓならびにそれらのカスパーゼ３耐性二重変異
体をＦＬＡＧエピトープで標識し、その発現プラスミド
をジャーカット細胞に導入した。野生型のＩＣＡＤ−Ｓ
およびＩＣＡＤ−Ｌ、およびそれらの二重変異体のＮ−
末端をＦＬＡＧエピトープで標識し、ｐＥＦ−ＢＯＳベ
クター（ＦＥＲＭ ＢＰ−３５４９；受託日１９９１年
９月６日）に連結した［４２］。ヒトジャーカット細胞
にＩＣＡＤ発現プラスミドおよびｐＢＬＩＩｈｙｇを電
気穿孔法により報告［１０］通りに共遺伝子移入した。
ハイグロマイシンＢ（８００μｇ／ｍＬ）耐性の形質転
換体を釣り上げて増殖させた。個々のクローン中のＩＣ
ＡＤ発現を抗−ＦＬＡＧモノクローナル抗体（クローン
Ｍ２、コダック社）を用いるウェスタンブロッティング
によって分析した（図８ａ）。なお、全形質転換クロー
ンのＦａｓ発現レベルは母細胞のものと類似であった。
アポトーシスを起こさせるため、ジャーカット細胞
（２．５×１０5細胞／ｍＬ）を０．５μｇ／ｍＬのマ
ウス抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体（クローンＣＨ１
１、ＭＢＬ社）とともに３７℃でインキュベーションし
た。ジャーカット母細胞を抗Ｆａｓ抗体で処理すると、
染色体ＤＮＡは４時間以内に１８０ｂｐマルチマーに分
解された（図８ｂ）。他方、野生型のＩＣＡＤ−Ｌまた
はＩＣＡＤ−Ｓを発現する形質転換体またはそれらのカ
スパーゼ３耐性変異体を発現する形質転換体は抗Ｆａｓ
抗体と６時間インキュベーションした後でも、いかなる
ＤＮＡ断片化も示さなかった。同様に、ジャーカット細
胞を１０μＭ−スタウロスポリンとともにインキュベー
ションすると、染色体ＤＮＡは２時間以内に分解された
が、この分解は野生型ＩＣＡＤ−ＬまたはＩＣＡＤ−Ｓ
の過剰発現によって完全に阻止された。ＤＮＡ断片化は
報告の通りに検定した［１０］。これらの結果はアポト
ーシスの間に活性化されたＤＮアーゼをＩＣＡＤが特異
的に遮断することを示している。
アポトーシス性ＤＮＡ分解不存在の確認 アポトーシスの間に起きるＤＮＡ分解に及ぼすＩＣＡＤ
の効果を検討するため、野生型のＩＣＡＤ−ＬおよびＩ
ＣＡＤ−Ｓならびにそれらのカスパーゼ３耐性二重変異
体をＦＬＡＧエピトープで標識し、その発現プラスミド
をジャーカット細胞に導入した。野生型のＩＣＡＤ−Ｓ
およびＩＣＡＤ−Ｌ、およびそれらの二重変異体のＮ−
末端をＦＬＡＧエピトープで標識し、ｐＥＦ−ＢＯＳベ
クター（ＦＥＲＭ ＢＰ−３５４９；受託日１９９１年
９月６日）に連結した［４２］。ヒトジャーカット細胞
にＩＣＡＤ発現プラスミドおよびｐＢＬＩＩｈｙｇを電
気穿孔法により報告［１０］通りに共遺伝子移入した。
ハイグロマイシンＢ（８００μｇ／ｍＬ）耐性の形質転
換体を釣り上げて増殖させた。個々のクローン中のＩＣ
ＡＤ発現を抗−ＦＬＡＧモノクローナル抗体（クローン
Ｍ２、コダック社）を用いるウェスタンブロッティング
によって分析した（図８ａ）。なお、全形質転換クロー
ンのＦａｓ発現レベルは母細胞のものと類似であった。
アポトーシスを起こさせるため、ジャーカット細胞
（２．５×１０5細胞／ｍＬ）を０．５μｇ／ｍＬのマ
ウス抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体（クローンＣＨ１
１、ＭＢＬ社）とともに３７℃でインキュベーションし
た。ジャーカット母細胞を抗Ｆａｓ抗体で処理すると、
染色体ＤＮＡは４時間以内に１８０ｂｐマルチマーに分
解された（図８ｂ）。他方、野生型のＩＣＡＤ−Ｌまた
はＩＣＡＤ−Ｓを発現する形質転換体またはそれらのカ
スパーゼ３耐性変異体を発現する形質転換体は抗Ｆａｓ
抗体と６時間インキュベーションした後でも、いかなる
ＤＮＡ断片化も示さなかった。同様に、ジャーカット細
胞を１０μＭ−スタウロスポリンとともにインキュベー
ションすると、染色体ＤＮＡは２時間以内に分解された
が、この分解は野生型ＩＣＡＤ−ＬまたはＩＣＡＤ−Ｓ
の過剰発現によって完全に阻止された。ＤＮＡ断片化は
報告の通りに検定した［１０］。これらの結果はアポト
ーシスの間に活性化されたＤＮアーゼをＩＣＡＤが特異
的に遮断することを示している。
【００４７】次に、スタウロスポリンによる細胞死をア
ネキシンＶ法を用いるフローサイトメトリー［３１］に
よって追跡した。細胞死はＲ＆Ｄシステムズ社からのキ
ットを用いて検定した。ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリ
メラーゼの蛋白分解はヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポ
リメラーゼに対するマウスモノクローナル抗体（Ｇ．
Ｇ．Ｐｏｉｒｉｅｒ博士より提供）を用いるウェスタン
ブロッティングによって測定した。細胞質中のカスパー
ゼ３活性を測定するにはカスパーゼ３認識部位を有する
ペプチド（ＤＥＶＤＡＰＫ）を強螢光性の（７−メトキ
シクマリン−４−イル）アセチル基（ＭＣＡ）およびそ
れを消光する２，４−ジニトロフェニル（Ｄｎｐ）基と
結合して得られた生成物ＭＣＡ−ＤＥＶＤＡＰＫ（ｄｎ
ｐ）を基質として使用した。
ネキシンＶ法を用いるフローサイトメトリー［３１］に
よって追跡した。細胞死はＲ＆Ｄシステムズ社からのキ
ットを用いて検定した。ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリ
メラーゼの蛋白分解はヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポ
リメラーゼに対するマウスモノクローナル抗体（Ｇ．
Ｇ．Ｐｏｉｒｉｅｒ博士より提供）を用いるウェスタン
ブロッティングによって測定した。細胞質中のカスパー
ゼ３活性を測定するにはカスパーゼ３認識部位を有する
ペプチド（ＤＥＶＤＡＰＫ）を強螢光性の（７−メトキ
シクマリン−４−イル）アセチル基（ＭＣＡ）およびそ
れを消光する２，４−ジニトロフェニル（Ｄｎｐ）基と
結合して得られた生成物ＭＣＡ−ＤＥＶＤＡＰＫ（ｄｎ
ｐ）を基質として使用した。
【００４８】図８ｃに示す通り、ジャーカット母細胞な
らびに野生型ＩＣＡＤ−Ｌまたは野生型ＩＣＡＤ−Ｓを
発現する形質転換体細胞の殆どがスタウロスポリン処理
後２時間以内にアネキシンＶ陽性になった（細胞死を示
す）。この細胞死に伴って、１１６ｋＤａのポリ（ＡＤ
Ｐ−リボース）ポリメラーゼが８５ｋＤａタンパク質に
切断された（図８ｄ）。さらに、細胞質中のカスパーゼ
３活性を螢光性基質を使用して測定すると、スタウロス
ポリン処理後のＩＣＡＤ形質転換体細胞内の活性はジャ
ーカット母細胞で見出されるものと同等であった（図８
ｅ）。抗Ｆａｓ抗体はジャーカット細胞およびＩＣＡＤ
形質転換体をカスパーゼ３の活性化によって殺したが、
この細胞死プロセスの速度はスタウロスポリンによって
誘導されるもとの比べて遅かった。これらの結果は、お
そらく様々なカスパーゼによって種々の細胞内基質が切
断される結果として、細胞はＤＮＡ分解なしに死ぬこと
があることを示している。
らびに野生型ＩＣＡＤ−Ｌまたは野生型ＩＣＡＤ−Ｓを
発現する形質転換体細胞の殆どがスタウロスポリン処理
後２時間以内にアネキシンＶ陽性になった（細胞死を示
す）。この細胞死に伴って、１１６ｋＤａのポリ（ＡＤ
Ｐ−リボース）ポリメラーゼが８５ｋＤａタンパク質に
切断された（図８ｄ）。さらに、細胞質中のカスパーゼ
３活性を螢光性基質を使用して測定すると、スタウロス
ポリン処理後のＩＣＡＤ形質転換体細胞内の活性はジャ
ーカット母細胞で見出されるものと同等であった（図８
ｅ）。抗Ｆａｓ抗体はジャーカット細胞およびＩＣＡＤ
形質転換体をカスパーゼ３の活性化によって殺したが、
この細胞死プロセスの速度はスタウロスポリンによって
誘導されるもとの比べて遅かった。これらの結果は、お
そらく様々なカスパーゼによって種々の細胞内基質が切
断される結果として、細胞はＤＮＡ分解なしに死ぬこと
があることを示している。
【００４９】以下に参考例を示す。尚、参考例において
使用した材料、およびＣＡＤの検定法は以下の通りであ
る。材料 組換えカスパーゼ３は大腸菌で産生して文献記載の通り
に精製した［３７］。ビオチン化−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖ
ａｌ−Ａｓｐ−クロロメチルケトン（以下、ｂｉｏ−Ｄ
ＥＶＤ−ｃｍｋという）はペプチド研究所に注文して合
成した。タンパク質精製に使用した充填カラムは全てフ
ァルマシア社から入手した。
使用した材料、およびＣＡＤの検定法は以下の通りであ
る。材料 組換えカスパーゼ３は大腸菌で産生して文献記載の通り
に精製した［３７］。ビオチン化−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖ
ａｌ−Ａｓｐ−クロロメチルケトン（以下、ｂｉｏ−Ｄ
ＥＶＤ−ｃｍｋという）はペプチド研究所に注文して合
成した。タンパク質精製に使用した充填カラムは全てフ
ァルマシア社から入手した。
【００５０】ＣＡＤ検定法 ＣＡＤ活性はマウス肝臓核を用いるＤＮＡ断片化検定
［２１］により、またはＤＮアーゼ活性検定により測定
した。略述すれば、アポトーシス検定のためには核（２
×１０5個）をサンプルとともに１５０ｎｇのカスパー
ゼ３を含む２０μＬの緩衝液Ａ（１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ
−ＫＯＨ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ−ＮａＣｌ、２０％
（ｖ／ｖ）グリセリン、４０ｍＭ−β−グリセロ燐酸、
２ｍＭ−ＭｇＣｌ２、５ｍＭ−ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ−
（ｐ−アミノフェニル）メタンスルホニルフルオリド
（ＡＰＭＳＦ）、５ｍＭ−ＤＴＴ、および１ｍｇ／ｍＬ
ウシ血清アルブミン）中で３０℃で２時間インキュベー
ションした。反応後、ＤＮＡを核から抽出し、１．５％
アガロースゲル電気泳動によって分析した。場合によっ
ては、放出されたＤＮＡ／ヒストン複合体をベーリンガ
ーマンハイム社から入手したキットを用いるＥＬＩＳＡ
システムで定量した。ＤＮアーゼの検定には、前記反応
混合物の核をプラスミドＤＮＡ１μｇと置き換えた。
［２１］により、またはＤＮアーゼ活性検定により測定
した。略述すれば、アポトーシス検定のためには核（２
×１０5個）をサンプルとともに１５０ｎｇのカスパー
ゼ３を含む２０μＬの緩衝液Ａ（１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ
−ＫＯＨ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ−ＮａＣｌ、２０％
（ｖ／ｖ）グリセリン、４０ｍＭ−β−グリセロ燐酸、
２ｍＭ−ＭｇＣｌ２、５ｍＭ−ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ−
（ｐ−アミノフェニル）メタンスルホニルフルオリド
（ＡＰＭＳＦ）、５ｍＭ−ＤＴＴ、および１ｍｇ／ｍＬ
ウシ血清アルブミン）中で３０℃で２時間インキュベー
ションした。反応後、ＤＮＡを核から抽出し、１．５％
アガロースゲル電気泳動によって分析した。場合によっ
ては、放出されたＤＮＡ／ヒストン複合体をベーリンガ
ーマンハイム社から入手したキットを用いるＥＬＩＳＡ
システムで定量した。ＤＮアーゼの検定には、前記反応
混合物の核をプラスミドＤＮＡ１μｇと置き換えた。
【００５１】参考例１：ＣＡＤの精製および配列分析 ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウス（４〜６月齢）をＳＬＣ
から購入した。リンパ節（約７０．４ｇ）をマウス１４
匹から調製し、抽出緩衝液（１２．５ｍＭ−ＰＩＰＥＳ
−ＮａＯＨ、ｐＨ７．０、７５ｍＭ−ＨＥＰＥＳ−ＫＯ
Ｈ、ｐＨ７．０、１２．５ｍＭ−ＫＣｌ、３７．５ｍＭ
−ＮａＣｌ、２ｍＭ−ＭｇＣｌ２、５ｍＭ−ＥＧＴＡ、
１ｍＭ−ＤＴＴ、５ｍＭ−サイトカラシンＢ、１ｍＭ−
フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、リ
ューペプチン１μｇ／ｍＬ、ペプスタチンＡ１μｇ／ｍ
Ｌおよび３０ｍＭ−β−グリセロ燐酸）２４４ｍＬに懸
濁した。細胞を凍結および解凍の３周期で崩壊し、１０
００００×ｇで２時間遠心分離した。Ｓ−１００画分
（タンパク質３１５０ｍｇ）を０．１ｍＭのｂｉｏ−Ｄ
ＥＶＤ−ｃｍｋとともに４℃で３０分間インキュベーシ
ョンして、カスパーゼ３を不活化した。次にこのサンプ
ルを２５％から５０％飽和硫酸アンモニウムで分画し、
緩衝液Ｂ（１０ｍＭ−トリスＨＣｌ、ｐＨ８．９、５０
ｍＭ−ＮａＣｌ、２０％（ｖ／ｖ）グリセリン、１ｍＭ
−ＤＴＴ、０．１ｍＭ−ＡＰＭＳＦ、および０．１５％
ＣＨＡＰＳ）に対して透析し、緩衝液Ｂと平衡させたＨ
ｉＴｒａｐ−Ｈｅｐａｒｉｎ２０ｍＬのカラムに負荷し
た。１５０ｍＭ−ＮａＣｌを含む緩衝液Ｂで洗った後、
タンパク質（タンパク質８９．６ｍｇ）を５００ｍＭ−
ＮａＣｌを含む緩衝液Ｂで溶出し、緩衝液Ｂと平衡させ
たＰＤ−１０カラムを通した。このサンプルを緩衝液Ｂ
と平衡させた６ｍＬのリソースＱカラムに負荷し、保持
されたタンパク質を１５０ｍＭから４００ｍＭまでの直
線ＮａＣｌ勾配で溶出した。活性画分（タンパク質１
６．４ｍｇ）を集めて、緩衝液Ｃ（２０ｍＭ−ＨＥＰＥ
Ｓ−ＫＯＨ、ｐＨ７．０、２０％（ｖ／ｖ）グリセリ
ン、０．１ｍＭ−ＡＰＭＳＦ、１ｍＭ−ＤＴＴおよび
０．１５％ＣＨＡＰＳ）と平衡させたＰＤ−１０カラム
を通した。このサンプルを緩衝液Ｃと平衡させたリソー
スＳカラム（容積１ｍＬ）に負荷し、保持されたタンパ
ク質を０ｍＭから５００ｍＭまでの直線ＮａＣｌ勾配１
５ｍＬで溶出した。活性画分（タンパク質２ｍｇ）を集
め、緩衝液Ｄ（１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ
７．０、５０ｍＭ−ＮａＣｌ、２０％（ｖ／ｖ）グリセ
リン、４０ｍＭ−β−グリセロ燐酸、２ｍＭ−ＥＧＴ
Ａ、０．１ｍＭ−ＡＰＭＳＦ、１ｍＭ−ＤＴＴ、および
０．０２％トゥイーン２０）と平衡させたＰＤ−１０カ
ラムを通した。このサンプルを２．６μｇのカスパーゼ
３とともに４℃で一夜インキュベーションし、次に５μ
Ｍ−ｂｉｏ−ＤＥＶＤ−ｃｍｋとともに４℃で３０分間
インキュベーションしてカスパーゼ３を不活化した。混
合物にＧＳＴ−ＤＦＦ４５親和性ビーズ（容積２５μ
Ｌ）を加え、これを次に４℃に２時間放置した。緩衝液
Ｄで洗った後、ビーズを５０μＬの緩衝液Ｄに懸濁し
た。この懸濁液に２μｇのカスパーゼ３および６μｇの
トロンビンを加え、室温で一夜および３７℃で１時間で
順次インキュベーションした。このビーズを遠心分離し
て除き、ビーズから放出されたタンパク質を集めた。
から購入した。リンパ節（約７０．４ｇ）をマウス１４
匹から調製し、抽出緩衝液（１２．５ｍＭ−ＰＩＰＥＳ
−ＮａＯＨ、ｐＨ７．０、７５ｍＭ−ＨＥＰＥＳ−ＫＯ
Ｈ、ｐＨ７．０、１２．５ｍＭ−ＫＣｌ、３７．５ｍＭ
−ＮａＣｌ、２ｍＭ−ＭｇＣｌ２、５ｍＭ−ＥＧＴＡ、
１ｍＭ−ＤＴＴ、５ｍＭ−サイトカラシンＢ、１ｍＭ−
フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、リ
ューペプチン１μｇ／ｍＬ、ペプスタチンＡ１μｇ／ｍ
Ｌおよび３０ｍＭ−β−グリセロ燐酸）２４４ｍＬに懸
濁した。細胞を凍結および解凍の３周期で崩壊し、１０
００００×ｇで２時間遠心分離した。Ｓ−１００画分
（タンパク質３１５０ｍｇ）を０．１ｍＭのｂｉｏ−Ｄ
ＥＶＤ−ｃｍｋとともに４℃で３０分間インキュベーシ
ョンして、カスパーゼ３を不活化した。次にこのサンプ
ルを２５％から５０％飽和硫酸アンモニウムで分画し、
緩衝液Ｂ（１０ｍＭ−トリスＨＣｌ、ｐＨ８．９、５０
ｍＭ−ＮａＣｌ、２０％（ｖ／ｖ）グリセリン、１ｍＭ
−ＤＴＴ、０．１ｍＭ−ＡＰＭＳＦ、および０．１５％
ＣＨＡＰＳ）に対して透析し、緩衝液Ｂと平衡させたＨ
ｉＴｒａｐ−Ｈｅｐａｒｉｎ２０ｍＬのカラムに負荷し
た。１５０ｍＭ−ＮａＣｌを含む緩衝液Ｂで洗った後、
タンパク質（タンパク質８９．６ｍｇ）を５００ｍＭ−
ＮａＣｌを含む緩衝液Ｂで溶出し、緩衝液Ｂと平衡させ
たＰＤ−１０カラムを通した。このサンプルを緩衝液Ｂ
と平衡させた６ｍＬのリソースＱカラムに負荷し、保持
されたタンパク質を１５０ｍＭから４００ｍＭまでの直
線ＮａＣｌ勾配で溶出した。活性画分（タンパク質１
６．４ｍｇ）を集めて、緩衝液Ｃ（２０ｍＭ−ＨＥＰＥ
Ｓ−ＫＯＨ、ｐＨ７．０、２０％（ｖ／ｖ）グリセリ
ン、０．１ｍＭ−ＡＰＭＳＦ、１ｍＭ−ＤＴＴおよび
０．１５％ＣＨＡＰＳ）と平衡させたＰＤ−１０カラム
を通した。このサンプルを緩衝液Ｃと平衡させたリソー
スＳカラム（容積１ｍＬ）に負荷し、保持されたタンパ
ク質を０ｍＭから５００ｍＭまでの直線ＮａＣｌ勾配１
５ｍＬで溶出した。活性画分（タンパク質２ｍｇ）を集
め、緩衝液Ｄ（１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ
７．０、５０ｍＭ−ＮａＣｌ、２０％（ｖ／ｖ）グリセ
リン、４０ｍＭ−β−グリセロ燐酸、２ｍＭ−ＥＧＴ
Ａ、０．１ｍＭ−ＡＰＭＳＦ、１ｍＭ−ＤＴＴ、および
０．０２％トゥイーン２０）と平衡させたＰＤ−１０カ
ラムを通した。このサンプルを２．６μｇのカスパーゼ
３とともに４℃で一夜インキュベーションし、次に５μ
Ｍ−ｂｉｏ−ＤＥＶＤ−ｃｍｋとともに４℃で３０分間
インキュベーションしてカスパーゼ３を不活化した。混
合物にＧＳＴ−ＤＦＦ４５親和性ビーズ（容積２５μ
Ｌ）を加え、これを次に４℃に２時間放置した。緩衝液
Ｄで洗った後、ビーズを５０μＬの緩衝液Ｄに懸濁し
た。この懸濁液に２μｇのカスパーゼ３および６μｇの
トロンビンを加え、室温で一夜および３７℃で１時間で
順次インキュベーションした。このビーズを遠心分離し
て除き、ビーズから放出されたタンパク質を集めた。
【００５２】ペプチド配列分析には、ＧＳＴ−ＤＦＦ４
５親和性カラムから溶出したサンプルをマイクロコン−
１０装置（アミコン社）を用いて濃縮し、１０〜２０％
勾配ポリアクリルアミドゲル（第一化学社）電気泳動に
よって分画し、ポリビニリジンジフルオリド膜（アプラ
イドビオシステムズ社、プロブロット）にブロットし
た。ポンカウＳで染色後、固定化したＣＡＤ（２〜４ｐ
モル）を還元し、Ｓ−カルボキシメチル化し、報告［３
８］通りにアクロモバクタープロテアーゼＩおよびＡｓ
ｐ−Ｎを用いて原位置消化した。膜から放出されたペプ
チドをＷａｋｏｓｉｌ−ＩＩ・ＡＲ・Ｃ１８・３００Ａ
カラム（和光純薬）を用いる逆相高速液体クロマトグラ
フィーによって分画し、タンパク質配列決定装置（島
津、ＰＰＳＱ−２３）を用いて配列決定した。得られた
配列は配列番号２に記載の配列と一致した。
５親和性カラムから溶出したサンプルをマイクロコン−
１０装置（アミコン社）を用いて濃縮し、１０〜２０％
勾配ポリアクリルアミドゲル（第一化学社）電気泳動に
よって分画し、ポリビニリジンジフルオリド膜（アプラ
イドビオシステムズ社、プロブロット）にブロットし
た。ポンカウＳで染色後、固定化したＣＡＤ（２〜４ｐ
モル）を還元し、Ｓ−カルボキシメチル化し、報告［３
８］通りにアクロモバクタープロテアーゼＩおよびＡｓ
ｐ−Ｎを用いて原位置消化した。膜から放出されたペプ
チドをＷａｋｏｓｉｌ−ＩＩ・ＡＲ・Ｃ１８・３００Ａ
カラム（和光純薬）を用いる逆相高速液体クロマトグラ
フィーによって分画し、タンパク質配列決定装置（島
津、ＰＰＳＱ−２３）を用いて配列決定した。得られた
配列は配列番号２に記載の配列と一致した。
【００５３】参考例２：マウスＣＡＤｃＤＮＡのクロー
ニング マウスＷＲ１９Ｌ細胞のｃＤＮＡライブラリーをｐＥＦ
−ＢＯＳベクターを用いて構築した。このｃＤＮＡライ
ブラリーから精製マウスＣＡＤのアミノ酸配列に基づい
て設計した次の縮重プライマーを用いるＰＣＲによって
マウスＣＡＤｃＤＮＡをクローニングした。センスプラ
イマーは５’−ＡＡ（Ａ／Ｇ）ＴＴ（Ｃ／Ｔ）ＧＧＩＧ
ＴＩＧＣＩＧＣ−３’であり、アンチセンスプライマー
は５’−ＴＧＩ（Ｃ／Ｇ）（Ａ／Ｔ）ＩＡＣ（Ａ／Ｇ）
ＴＧ（Ａ／Ｇ）ＴＧＩＡ（Ａ／Ｇ）ＩＡ（Ａ／Ｇ）（Ａ
／Ｇ）ＴＣ−３’であった。式中、Ｉはイノシンを示
す。反応混合物はライブラリーから得たプラスミドＤＮ
Ａ１μｇと各プライマー１００ｐモルをＰＣＲ緩衝液５
０μＬに含んでいた。ＰＣＲ産物（３３２ｂｐ）をプロ
ーブに用いて、ＷＲ１９ＬｃＤＮＡをコロニーハイブリ
ッダイゼーションによって検索した。このプローブＤＮ
Ａはランダムプライマー標識キット（ベーリンガーマン
ハイム社）を用いて32Ｐで標識し、実質的に報告［３
９］通り、コロニーハイブリッダイゼーションを行っ
た。１×１０6個のクローンから陽性クローン８個を得
た。その中で、４個のクローンはマウスＣＡＤの完全長
コード配列を持っていた。ＤＮＡ配列決定装置（アプラ
イドバイオシステムズ社、ＰＲＩＺＭ３１０）を用いて
ｃＤＮＡ１個の両鎖を配列決定した（配列番号１）。
ニング マウスＷＲ１９Ｌ細胞のｃＤＮＡライブラリーをｐＥＦ
−ＢＯＳベクターを用いて構築した。このｃＤＮＡライ
ブラリーから精製マウスＣＡＤのアミノ酸配列に基づい
て設計した次の縮重プライマーを用いるＰＣＲによって
マウスＣＡＤｃＤＮＡをクローニングした。センスプラ
イマーは５’−ＡＡ（Ａ／Ｇ）ＴＴ（Ｃ／Ｔ）ＧＧＩＧ
ＴＩＧＣＩＧＣ−３’であり、アンチセンスプライマー
は５’−ＴＧＩ（Ｃ／Ｇ）（Ａ／Ｔ）ＩＡＣ（Ａ／Ｇ）
ＴＧ（Ａ／Ｇ）ＴＧＩＡ（Ａ／Ｇ）ＩＡ（Ａ／Ｇ）（Ａ
／Ｇ）ＴＣ−３’であった。式中、Ｉはイノシンを示
す。反応混合物はライブラリーから得たプラスミドＤＮ
Ａ１μｇと各プライマー１００ｐモルをＰＣＲ緩衝液５
０μＬに含んでいた。ＰＣＲ産物（３３２ｂｐ）をプロ
ーブに用いて、ＷＲ１９ＬｃＤＮＡをコロニーハイブリ
ッダイゼーションによって検索した。このプローブＤＮ
Ａはランダムプライマー標識キット（ベーリンガーマン
ハイム社）を用いて32Ｐで標識し、実質的に報告［３
９］通り、コロニーハイブリッダイゼーションを行っ
た。１×１０6個のクローンから陽性クローン８個を得
た。その中で、４個のクローンはマウスＣＡＤの完全長
コード配列を持っていた。ＤＮＡ配列決定装置（アプラ
イドバイオシステムズ社、ＰＲＩＺＭ３１０）を用いて
ｃＤＮＡ１個の両鎖を配列決定した（配列番号１）。
【００５４】参考例３：組換えヒトＤＦＦ４５と組換え
マウスＩＣＡＤ ヒトＤＦＦ４５をコードするｃＤＮＡ［２２］はヒトＫ
Ｔ３ｃＤＮＡライブラリー［２０］からＰＣＲによって
分離した。このＰＣＲ産物（１ｋｂ）をｐＧＥＸ−２Ｔ
［１２８／１２９］のグルタチオンＳ−トランスフェラ
ーゼ（ＧＳＴ）遺伝子と正方向および逆方向に融合した
（各々ｐＧＥＸ−ＤＦＦおよびｐＧＥＸ−ｒｅｖＤＦ
Ｆ）。ｐＧＥＸ−２Ｔ［１２８／１２９］はｐＧＥＸ−
２Ｔ（ファルマシア社）の誘導体であって、これにはＦ
ＬＡＧ−エピトープ標識（ＤＹＫＤＤＤＤＫＡ）および
心筋キナーゼ認識配列（ＲＲＡＳＶ）［２３］がＧＳＴ
遺伝子の後に挿入されている。このＧＳＴ−ＤＦＦ４５
融合タンパク質を大腸菌のＡＤ２０２株で発現し、製造
社の指示に従ってグルタチオン−セファロース４Ｂに吸
着させた。ビーズは湿ったビーズ１ｍＬ当り約１ｍｇの
ＧＳＴ融合タンパク質を保持していた。
マウスＩＣＡＤ ヒトＤＦＦ４５をコードするｃＤＮＡ［２２］はヒトＫ
Ｔ３ｃＤＮＡライブラリー［２０］からＰＣＲによって
分離した。このＰＣＲ産物（１ｋｂ）をｐＧＥＸ−２Ｔ
［１２８／１２９］のグルタチオンＳ−トランスフェラ
ーゼ（ＧＳＴ）遺伝子と正方向および逆方向に融合した
（各々ｐＧＥＸ−ＤＦＦおよびｐＧＥＸ−ｒｅｖＤＦ
Ｆ）。ｐＧＥＸ−２Ｔ［１２８／１２９］はｐＧＥＸ−
２Ｔ（ファルマシア社）の誘導体であって、これにはＦ
ＬＡＧ−エピトープ標識（ＤＹＫＤＤＤＤＫＡ）および
心筋キナーゼ認識配列（ＲＲＡＳＶ）［２３］がＧＳＴ
遺伝子の後に挿入されている。このＧＳＴ−ＤＦＦ４５
融合タンパク質を大腸菌のＡＤ２０２株で発現し、製造
社の指示に従ってグルタチオン−セファロース４Ｂに吸
着させた。ビーズは湿ったビーズ１ｍＬ当り約１ｍｇの
ＧＳＴ融合タンパク質を保持していた。
【００５５】参考例４：ＣＯＳ細胞への遺伝子移入、試
験管内転写翻訳、および免疫沈降 プラスミドｐＥＦ−ＩＣＡＤ−ＬはマウスＩＣＡＤ−Ｌ
の哺乳類発現ベクターである。サルＣＯＳ７細胞に報告
［４０］通り、電気穿孔によってプラスミドＤＮＡを遺
伝子移入した。３７℃で４８時間の培養後、細胞を緩衝
液Ｄ０．１ｍＬに懸濁し、凍結および解凍の反復によっ
て崩壊させ、細胞の破砕片および核を除去するため１５
０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。無細胞系でＣＡ
Ｄを発現するには、マウスＣＡＤ完全長コード配列をｐ
ｃＤＮＡＩ／Ａｍｐベクター（インビトローゲン社）の
Ｔ７プロモーターの下に置いて、ｐｃＤＮＡ−ＣＡＤと
命名した。製造社の指示に従って、ＴＮＴインビトロ転
写／翻訳キット（プロメガ社）を用いる転写翻訳共役系
をＣＡＤに適用した。略述すれば、ｐｃＤＮＡ−ＣＡＤ
のＤＮＡ（１μｇ）をＴＮＴ試薬４０μＬおよび４０μ
Ｃｉの35Ｓ−メチオニン（アマーシャム社）とともにＧ
ＳＴ−ＩＣＡＤ−Ｌ融合タンパク質１６０ｎｇの存在下
に３０℃で２時間インキュベーションした。ＩＣＡＤ−
Ｌ／ＣＡＤ複合体を免疫沈降させるため、反応混合物を
０．５ｍＬまで緩衝液Ｄで希釈し、抗ＦＬＡＧ・Ｍ２親
和性ビーズ（コダック社、３ｍｇＩｇＧ／ｍＬビーズ）
１０μＬを加えた。４℃で２時間インキュベーションし
た後、ランメリのサンプル緩衝液中、９０℃に５分間加
熱して結合したタンパク質を溶出させ、１０〜２０％勾
配ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、増感板を用
いてＸ−ＯＭＡＴ・Ｘ線フィルム（コダック社）に感光
させた。
験管内転写翻訳、および免疫沈降 プラスミドｐＥＦ−ＩＣＡＤ−ＬはマウスＩＣＡＤ−Ｌ
の哺乳類発現ベクターである。サルＣＯＳ７細胞に報告
［４０］通り、電気穿孔によってプラスミドＤＮＡを遺
伝子移入した。３７℃で４８時間の培養後、細胞を緩衝
液Ｄ０．１ｍＬに懸濁し、凍結および解凍の反復によっ
て崩壊させ、細胞の破砕片および核を除去するため１５
０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。無細胞系でＣＡ
Ｄを発現するには、マウスＣＡＤ完全長コード配列をｐ
ｃＤＮＡＩ／Ａｍｐベクター（インビトローゲン社）の
Ｔ７プロモーターの下に置いて、ｐｃＤＮＡ−ＣＡＤと
命名した。製造社の指示に従って、ＴＮＴインビトロ転
写／翻訳キット（プロメガ社）を用いる転写翻訳共役系
をＣＡＤに適用した。略述すれば、ｐｃＤＮＡ−ＣＡＤ
のＤＮＡ（１μｇ）をＴＮＴ試薬４０μＬおよび４０μ
Ｃｉの35Ｓ−メチオニン（アマーシャム社）とともにＧ
ＳＴ−ＩＣＡＤ−Ｌ融合タンパク質１６０ｎｇの存在下
に３０℃で２時間インキュベーションした。ＩＣＡＤ−
Ｌ／ＣＡＤ複合体を免疫沈降させるため、反応混合物を
０．５ｍＬまで緩衝液Ｄで希釈し、抗ＦＬＡＧ・Ｍ２親
和性ビーズ（コダック社、３ｍｇＩｇＧ／ｍＬビーズ）
１０μＬを加えた。４℃で２時間インキュベーションし
た後、ランメリのサンプル緩衝液中、９０℃に５分間加
熱して結合したタンパク質を溶出させ、１０〜２０％勾
配ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、増感板を用
いてＸ−ＯＭＡＴ・Ｘ線フィルム（コダック社）に感光
させた。
【００５６】
【発明の効果】ＩＣＡＤおよびそれをコードする遺伝
子、ＩＣＡＤ ｃＤＮＡは、遺伝子治療などにより細胞
死の防止に役立つ可能性があり、また、アポトーシスを
含む細胞死に関する研究用試薬として用いることができ
る。
子、ＩＣＡＤ ｃＤＮＡは、遺伝子治療などにより細胞
死の防止に役立つ可能性があり、また、アポトーシスを
含む細胞死に関する研究用試薬として用いることができ
る。
【００５７】
【発明の意義】マウスＩＣＡＤ−ＬはヒトＤＦＦのサブ
ユニットの一つ（ＤＦＦ４５、ＤＮＡ断片化因子４５）
［２７］とかなりの相同性を有し、ＤＦＦ４５のマウス
対応物であると思われる。この考えは組換えヒトＤＦＦ
４５が活性化マウスＣＡＤに結合できるとの観察によっ
て支持される。ヒトＤＦＦは精製されて４５ｋＤａおよ
び４０ｋＤａのサブユニットから構成されること、およ
びカスパーゼ３で処理すると核内ＤＮＡ断片化を起こす
ことが見出されている。この性質は今回本発明者らが確
認した潜在型ＣＡＤの性質に類似している。しかし、Ｄ
ＦＦ４５自体はＤＮアーゼ活性を示さず、ＤＦＦはヒト
のＣＡＤでないことが示唆される。ＬｉｕなどはＤＦＦ
４５がカスパーゼ３で切断されると、ＤＦＦは核に入っ
て核のＤＮアーゼを活性化すると提唱した［２７］。対
照的に、マウスＣＡＤはＤＮアーゼ活性を持っており、
ＩＣＡＤはそれに結合してこの活性を阻害する。これら
の結果はＩＣＡＤがＣＡＤ以外にＤＮアーゼを調節する
その他の分子（ＤＦＦ４０）にも結合できることを示す
のであろう。ＩＣＡＤの過剰発現がヒト細胞中でアポト
ーシス過程におけるＤＮＡ分解を阻害するので、ＤＦＦ
が調節するＤＮアーゼはＣＡＤまたはＣＡＤ様ＤＮアー
ゼであると思われる。ＤＦＦ４０の分子クローニングお
よび試験管内および生体内における機能解析を行えば、
これらの点は解明されるであろう。
ユニットの一つ（ＤＦＦ４５、ＤＮＡ断片化因子４５）
［２７］とかなりの相同性を有し、ＤＦＦ４５のマウス
対応物であると思われる。この考えは組換えヒトＤＦＦ
４５が活性化マウスＣＡＤに結合できるとの観察によっ
て支持される。ヒトＤＦＦは精製されて４５ｋＤａおよ
び４０ｋＤａのサブユニットから構成されること、およ
びカスパーゼ３で処理すると核内ＤＮＡ断片化を起こす
ことが見出されている。この性質は今回本発明者らが確
認した潜在型ＣＡＤの性質に類似している。しかし、Ｄ
ＦＦ４５自体はＤＮアーゼ活性を示さず、ＤＦＦはヒト
のＣＡＤでないことが示唆される。ＬｉｕなどはＤＦＦ
４５がカスパーゼ３で切断されると、ＤＦＦは核に入っ
て核のＤＮアーゼを活性化すると提唱した［２７］。対
照的に、マウスＣＡＤはＤＮアーゼ活性を持っており、
ＩＣＡＤはそれに結合してこの活性を阻害する。これら
の結果はＩＣＡＤがＣＡＤ以外にＤＮアーゼを調節する
その他の分子（ＤＦＦ４０）にも結合できることを示す
のであろう。ＩＣＡＤの過剰発現がヒト細胞中でアポト
ーシス過程におけるＤＮＡ分解を阻害するので、ＤＦＦ
が調節するＤＮアーゼはＣＡＤまたはＣＡＤ様ＤＮアー
ゼであると思われる。ＤＦＦ４０の分子クローニングお
よび試験管内および生体内における機能解析を行えば、
これらの点は解明されるであろう。
【００５８】Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるプログラムさ
れた細胞死の研究は細胞を殺すためにはＤＮアーゼ活性
は必ずしも必要ではないことを示している［３４］。マ
ウス細胞系統の一つでは細胞傷害性リンパ球の作用によ
って見掛けのＤＮＡ断片化なしに細胞死することが報告
されている［３５］。本発明においては、ＩＣＡＤを発
現する形質転換体が染色体ＤＮＡの切断なしにスタウロ
スポリン処理で細胞死することが確認された。これらの
条件下ではカスパーゼ（カスパーゼ３）は完全に活性化
されており、そのことがアポトーシスＤＮアーゼをカス
パーゼの下流に配置し、また、細胞死を起こすにはアク
チン、ｒｈｏ−ＧＤＩ、およびフォドリンのような様々
な細胞基質の切断で十分であることを示している［１
５］。ＤＮＡの切断に加えて、アポトーシス刺激は核の
凝縮および断片化を誘導する［２］。ＤＮＡ分解または
ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼおよびラミンの
ような核タンパク質の切断が細胞の形態的変化の原因で
あるかどうかはまだ確認されていない［３，２６，３
６］。ＤＮＡは分解しないが、完全に活性化されたカス
パーゼを有する細胞が入手できたことから、この点が解
明されるであろう。最後に、染色体ＤＮＡの分解が死ん
だ細胞の清掃に、貪食作用を加速する点で、または貪食
している細胞が死につつある細胞から得た無傷のＤＮＡ
によって形質転換されることを予防する点で、関与して
いると推測されている［２６］。ＩＣＡＤを発現するト
ランスジェニックマウスまたはＣＡＤを欠失するマウス
を使用すれば、これらの疑問に答えることが可能である
と思われる。
れた細胞死の研究は細胞を殺すためにはＤＮアーゼ活性
は必ずしも必要ではないことを示している［３４］。マ
ウス細胞系統の一つでは細胞傷害性リンパ球の作用によ
って見掛けのＤＮＡ断片化なしに細胞死することが報告
されている［３５］。本発明においては、ＩＣＡＤを発
現する形質転換体が染色体ＤＮＡの切断なしにスタウロ
スポリン処理で細胞死することが確認された。これらの
条件下ではカスパーゼ（カスパーゼ３）は完全に活性化
されており、そのことがアポトーシスＤＮアーゼをカス
パーゼの下流に配置し、また、細胞死を起こすにはアク
チン、ｒｈｏ−ＧＤＩ、およびフォドリンのような様々
な細胞基質の切断で十分であることを示している［１
５］。ＤＮＡの切断に加えて、アポトーシス刺激は核の
凝縮および断片化を誘導する［２］。ＤＮＡ分解または
ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼおよびラミンの
ような核タンパク質の切断が細胞の形態的変化の原因で
あるかどうかはまだ確認されていない［３，２６，３
６］。ＤＮＡは分解しないが、完全に活性化されたカス
パーゼを有する細胞が入手できたことから、この点が解
明されるであろう。最後に、染色体ＤＮＡの分解が死ん
だ細胞の清掃に、貪食作用を加速する点で、または貪食
している細胞が死につつある細胞から得た無傷のＤＮＡ
によって形質転換されることを予防する点で、関与して
いると推測されている［２６］。ＩＣＡＤを発現するト
ランスジェニックマウスまたはＣＡＤを欠失するマウス
を使用すれば、これらの疑問に答えることが可能である
と思われる。
【００５９】本明細書に記載した結果は、アポトーシス
プロテアーゼをアポトーシスの最終段階にあるＤＮアー
ゼと結びつけるアポトーシスＤＮアーゼ阻害物質（ＩＣ
ＡＤ）の存在を証明するものである。今後、組換えＩＣ
ＡＤおよびその遺伝子の利用が可能となったことで、ア
ポトーシスの過程についての理解がさらに深まって行く
であろう。
プロテアーゼをアポトーシスの最終段階にあるＤＮアー
ゼと結びつけるアポトーシスＤＮアーゼ阻害物質（ＩＣ
ＡＤ）の存在を証明するものである。今後、組換えＩＣ
ＡＤおよびその遺伝子の利用が可能となったことで、ア
ポトーシスの過程についての理解がさらに深まって行く
であろう。
【００６０】参考文献 1. Jacobson, M.D., Weil, M. & Raff, M.C., Cell, 8
8, 347〜354 (1997). 2. Wyllie, A.H., Kerr, J.F.R., & Currie, A.R., In
t. Rev.Cytol., 68, 251〜306 (1980). 3. Earnshaw, W.C., Curr. Opin. Cell Biol., 7, 337
〜343 (1995). 4. Compton, M.M., Cancer Metastasis Rev., 11, 105
〜119 (1992). 5. Wyllie, A.H., Morris, R.G., Smith, A.L. & Dunl
op, D., J.Pathol., 142, 66〜77 (1984). 6. Wyllie, A.H., Nature, 284, 555〜556 (1980). 7. Nagata, S., Cell, 88, 355〜365 (1997). 8. Hickman, J.A., Cancer Metastasis Rev., 11, 121
〜139 (1992). 9. Suda, T., Takahashi, T., Goldstein, P. & Nagat
a, S., Cell,75, 1169〜1178 (1993). 10. Itoh, N. et al., Cell, 66, 233〜243 (1991).
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〜105 (1995). 14. Reed, J., Nature, 387, 773〜776 (1997). 15. Martin, S. & Green, D., Cell, 82, 349〜352 (1
995). 16. Yuan, J. Shaham, S., Ledoux, S., Ellis, H.M.
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S. & Reed, J.C.,Nature, 388, 300〜304 (1997). 19. Hengartner, M.O., Ellis, R.E. & Horvitz, H.
R., Nature, 356,494〜499 (1992).
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5. 47. Ueda, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79:4386-4390, 19
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82.
【００６５】
【配列表】配列表 ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ <110> Osaka Bioscience Institute <120> Inhibitors for Caspase-activated DNases <130> 163996 <140> <141> <150> JP 369356/1997 <151> 1997-12-25 <160> 6 <117> Word (MS-DOS text) <210> 1 <211> 1038 <212> DNA <213> human <400> 1 atgtgcgcgg tgctccgcca acccaaatgc gtcaagttgc gagccctaca tagcgcctgc 60 aagttcggcg tggcggcccg gagctgccag gagctgctgc gtaagggctg cgtccgcttc 120 cagctcccga tgcccggttc ccggctgtgc ctgtacgaag atggcacgga ggtgacggac 180 gactgcttcc cgggccttcc caacgacgct gagctcctat tgctcaccgc tggcgagacc 240 tggcatggct atgtgagtga catcacacgt ttcctcagtg tgtttaatga gccacatgcc 300 ggcgtcatcc aggctgcacg gcaactgctg tcagatgagc aggccccact gaggcaaaag 360ct
gctggccg atcttctgca tcacgtgagc cagaatatta ctgcagagac ccgggagcag 420 gacccatcct ggtttgaagg tttggagtcg agattcagga ataagtcggg ctatctgaga 480 tacagctgtg agagtcggat ccggggttac ctaagagagg tgagcgctta cacctctatg 540 gtggatgaag cagctcaaga agagtacctg cgagtccttg gctccatgtg ccagaagctc 600 aaatcggtgc agtacaatgg cagctatttc gacagaggtg cagaggccag cagccgcctc 660 tgtactccag aaggatggtt ctcctgccag ggcccctttg acctggagag ctgtctttcc 720 aagcactcca tcaaccccta tggcaacaga gagagccgga tcctcttcag tacctggaac 780 ctggatcata taatagagaa gaagcgcacc gtggtaccca cgctggctga agccatccag 840 gatgggaggg aggtgaactg ggagtacttc tacagcctgc tcttcactgc cgagaacctg 900 aagctggtgc acatcgcctg ccacaagaag accacacaca agctggagtg cgaccgcagt 960 aggatctatc ggcctcagac aggatccagg aggaagcagc ctgctcggaa gaagcgccct 1020 gctcggaagc gctagtga 1038
gctggccg atcttctgca tcacgtgagc cagaatatta ctgcagagac ccgggagcag 420 gacccatcct ggtttgaagg tttggagtcg agattcagga ataagtcggg ctatctgaga 480 tacagctgtg agagtcggat ccggggttac ctaagagagg tgagcgctta cacctctatg 540 gtggatgaag cagctcaaga agagtacctg cgagtccttg gctccatgtg ccagaagctc 600 aaatcggtgc agtacaatgg cagctatttc gacagaggtg cagaggccag cagccgcctc 660 tgtactccag aaggatggtt ctcctgccag ggcccctttg acctggagag ctgtctttcc 720 aagcactcca tcaaccccta tggcaacaga gagagccgga tcctcttcag tacctggaac 780 ctggatcata taatagagaa gaagcgcacc gtggtaccca cgctggctga agccatccag 840 gatgggaggg aggtgaactg ggagtacttc tacagcctgc tcttcactgc cgagaacctg 900 aagctggtgc acatcgcctg ccacaagaag accacacaca agctggagtg cgaccgcagt 960 aggatctatc ggcctcagac aggatccagg aggaagcagc ctgctcggaa gaagcgccct 1020 gctcggaagc gctagtga 1038
【００６６】<210> 2 <211> 344 <212> PRT <213> human <400> 2 Met Cys Ala Val Leu Arg Gln Pro Lys Cys Val Lys Leu Arg Ala 1 5 10 15 Leu His Ser Ala Cys Lys Phe Gly Val Ala Ala Arg Ser Cys Gln 20 25 30 Glu Leu Leu Arg Lys Gly Cys Val Arg Phe Gln Leu Pro Met Pro 35 40 45 Gly Ser Arg Leu Cys Leu Tyr Glu Asp Gly Thr Glu Val Thr Asp 50 55 60 Asp Cys Phe Pro Gly Leu Pro Asn Asp Ala Glu Leu Leu Leu Leu 65 70 75 Thr Ala Gly Glu Thr Trp His Gly Tyr Val Ser Asp Ile Thr Arg 80 85 90 Phe Leu Ser Val Phe Asn Glu Pro His Ala Gly Val Ile Gln Ala 95 100 105 Ala Arg Gln Leu Leu Ser Asp Glu Gln Ala Pro Leu Arg Gln Lys 110 115 120 Leu Leu Ala Asp Leu Leu His His Val Ser Gln Asn Ile Thr Ala 125 130 135 Glu Thr Arg Glu Gln Asp Pro Ser Trp Phe Glu Gly Leu Glu Ser 140 145 150 Arg Phe Arg Asn Lys Ser Gly Tyr Leu Arg Tyr Ser Cys Glu Ser 155 160 165 Arg Ile Arg Gly Tyr Leu Arg Glu Val Ser Ala Tyr Thr Ser Met 170 175 180 Val Asp Glu Ala Ala Gln Glu Glu Tyr Leu Arg Val Leu Gly Ser 185 190 195 Met Cys Gln Lys Leu Lys Ser Val Gln Tyr Asn Gly Ser Tyr Phe 200 205 210 Asp Arg Gly Ala Glu Ala Ser Ser Arg Leu Cys Thr Pro Glu Gly 215 220 225 Trp Phe Ser Cys Gln Gly Pro Phe Asp Leu Glu Ser Cys Leu Ser 230 235 240 Lys His Ser Ile Asn Pro Tyr Gly Asn Arg Glu Ser Arg Ile Leu 245 250 255 Phe Ser Thr Trp Asn Leu Asp His Ile Ile Glu Lys Lys Arg Thr
260 265 270 Val Val Pro Thr Leu Ala Glu Ala Ile Gln Asp Gly Arg Glu Val 275 280 285 Asn Trp Glu Tyr Phe Tyr Ser Leu Leu Phe Thr Ala Glu Asn Leu 290 295 300 Lys Leu Val His Ile Ala Cys His Lys Lys Thr Thr His Lys Leu 305 310 315 Glu Cys Asp Arg Ser Arg Ile Tyr Arg Pro Gln Thr Gly Ser Arg 320 325 330 Arg Lys Gln Pro Ala Arg Lys Lys Arg Pro Ala Arg Lys Arg 335 340 344
260 265 270 Val Val Pro Thr Leu Ala Glu Ala Ile Gln Asp Gly Arg Glu Val 275 280 285 Asn Trp Glu Tyr Phe Tyr Ser Leu Leu Phe Thr Ala Glu Asn Leu 290 295 300 Lys Leu Val His Ile Ala Cys His Lys Lys Thr Thr His Lys Leu 305 310 315 Glu Cys Asp Arg Ser Arg Ile Tyr Arg Pro Gln Thr Gly Ser Arg 320 325 330 Arg Lys Gln Pro Ala Arg Lys Lys Arg Pro Ala Arg Lys Arg 335 340 344
【００６７】<210> 3 <211> 996 <212> DNA <213> human <400> 3 atggagctgt cgcggggagc cagcgcccca gacccggacg atgtccggcc tctcaaaccg 60 tgtctgctac gccgcaacca cagccgcgat cagcacggcg tggcagcctc cagtctcgag 120 gagctgagga gcaaagcctg tgaactcctg gccattgata agtccctgac gccgatcacc 180 ctggtcctgg ctgaggacgg gaccatagtg gatgacgatg actacttcct ctgccttcct 240 tccaatacga agtttgtggc gttggcctgc aatgagaagt ggacttataa tgattccgat 300gg
agggacgg cttgggtttc ccaagagtcc tttgaggcag atgagccgga cagcagggca 360 ggggtgaagt ggaagaatgt ggccaggcag ctgaaagaag atctgtccag catcatcctg 420 ctgtcagaag aggacctcca agcgctcatc gacatcccat gtgcagagct ggctcaggaa 480 ctctgccaaa gctgtgccac tgtccagggg ctgcagagca cactccagca ggtgcttgac 540 cagagagagg aagcccgcca gtccaagcag ctcctggaac tttacctcca ggccttggag 600 aaagagggca acatcttgtc caaccagaaa gagtccaaag ctgccctcag tgaagagctg 660ga
tgcagttg acacaggcgt cggcagagag atggcttcgg aagtgctgct cagaagccag 720 atccttacca cactgaagga gaagcctgcc ccagagctga gtttatctag tcaggatttg 780 gagtctgtct ccaaggagga tcccaaagcc ctggctgtcg ctctgagctg ggacataagg 840 aaggcagaga cagtccagca ggcctgcacc acggagctcg ccctgcggct gcagcaagtg 900 cagagcttgc attcactcag gaatctatca gcaaggagga gcccactgcc tggggaacca 960 cagcgaccca aacgagccaa acgagactcc tcgtag 996
agggacgg cttgggtttc ccaagagtcc tttgaggcag atgagccgga cagcagggca 360 ggggtgaagt ggaagaatgt ggccaggcag ctgaaagaag atctgtccag catcatcctg 420 ctgtcagaag aggacctcca agcgctcatc gacatcccat gtgcagagct ggctcaggaa 480 ctctgccaaa gctgtgccac tgtccagggg ctgcagagca cactccagca ggtgcttgac 540 cagagagagg aagcccgcca gtccaagcag ctcctggaac tttacctcca ggccttggag 600 aaagagggca acatcttgtc caaccagaaa gagtccaaag ctgccctcag tgaagagctg 660ga
tgcagttg acacaggcgt cggcagagag atggcttcgg aagtgctgct cagaagccag 720 atccttacca cactgaagga gaagcctgcc ccagagctga gtttatctag tcaggatttg 780 gagtctgtct ccaaggagga tcccaaagcc ctggctgtcg ctctgagctg ggacataagg 840 aaggcagaga cagtccagca ggcctgcacc acggagctcg ccctgcggct gcagcaagtg 900 cagagcttgc attcactcag gaatctatca gcaaggagga gcccactgcc tggggaacca 960 cagcgaccca aacgagccaa acgagactcc tcgtag 996
【００６８】<210> 4 <211> 331 <212> PRT <213> human <400> 4 Met Glu Leu Ser Arg Gly Ala Ser Ala Pro Asp Pro Asp Asp Val 1 5 10 15 Arg Pro Leu Lys Pro Cys Leu Leu Arg Arg Asn His Ser Arg Asp 20 25 30 Gln His Gly Val Ala Ala Ser Ser Leu Glu Glu Leu Arg Ser Lys 35 40 45 Ala Cys Glu Leu Leu Ala Ile Asp Lys Ser Leu Thr Pro Ile Thr 50 55 60 Leu Val Leu Ala Glu Asp Gly Thr Ile Val Asp Asp Asp Asp Tyr 65 70 75 Phe Leu Cys Leu Pro Ser Asn Thr Lys Phe Val Ala Leu Ala Cys 80 85 90 Asn Glu Lys Trp Thr Tyr Asn Asp Ser Asp Gly Gly Thr Ala Trp 95 100 105 Val Ser Gln Glu Ser Phe Glu Ala Asp Glu Pro Asp Ser Arg Ala 110 115 120 Gly Val Lys Trp Lys Asn Val Ala Arg Gln Leu Lys Glu Asp Leu 125 130 135 Ser Ser Ile Ile Leu Leu Ser Glu Glu Asp Leu Gln Ala Leu Ile 140 145 150 Asp Ile Pro Cys Ala Glu Leu Ala Gln Glu Leu Cys Gln Ser Cys 155 160 165 Ala Thr Val Gln Gly Leu Gln Ser Thr Leu Gln Gln Val Leu Asp 170 175 180 Gln Arg Glu Glu Ala Arg Gln Ser Lys Gln Leu Leu Glu Leu Tyr 185 190 195 Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu Gly Asn Ile Leu Ser Asn Gln Lys 200 205 210 Glu Ser Lys Ala Ala Leu Ser Glu Glu Leu Asp Ala Val Asp Thr
215 220 225 Gly Val Gly Arg Glu Met Ala Ser Glu Val Leu Leu Arg Ser Gln 230 235 240 Ile Leu Thr Thr Leu Lys Glu Lys Pro Ala Pro Glu Leu Ser Leu 245 250 255 Ser Ser Gln Asp Leu Glu Ser Val Ser Lys Glu Asp Pro Lys Ala 260 265 270 Ｌｅｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｉｌｅ
Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ 275 280 285 Gln Gln Ala Cys Thr Thr Glu Leu Ala Leu Arg Leu Gln Gln Val 290 295 300 Gln Ser Leu His Ser Leu Arg Asn Leu Ser Ala Arg Arg Ser Pro 305 310 315 Leu Pro Gly Glu Pro Gln Arg Pro Lys Arg Ala Lys Arg Asp Ser 320 325 330 Ser
215 220 225 Gly Val Gly Arg Glu Met Ala Ser Glu Val Leu Leu Arg Ser Gln 230 235 240 Ile Leu Thr Thr Leu Lys Glu Lys Pro Ala Pro Glu Leu Ser Leu 245 250 255 Ser Ser Gln Asp Leu Glu Ser Val Ser Lys Glu Asp Pro Lys Ala 260 265 270 Ｌｅｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｉｌｅ
Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ 275 280 285 Gln Gln Ala Cys Thr Thr Glu Leu Ala Leu Arg Leu Gln Gln Val 290 295 300 Gln Ser Leu His Ser Leu Arg Asn Leu Ser Ala Arg Arg Ser Pro 305 310 315 Leu Pro Gly Glu Pro Gln Arg Pro Lys Arg Ala Lys Arg Asp Ser 320 325 330 Ser
【００６９】<210> 5 <211> 798 <212> DNA <213> human <400> 5 atggagctgt cgcggggagc cagcgcccca gacccggacg atgtccggcc tctcaaaccg 60 tgtctgctac gccgcaacca cagccgcgat cagcacggcg tggcagcctc cagtctcgag 120 gagctgagga gcaaagcctg tgaactcctg gccattgata agtccctgac gccgatcacc 180 ctggtcctgg ctgaggacgg gaccatagtg gatgacgatg actacttcct ctgccttcct 240 tccaatacga agtttgtggc gttggcctgc aatgagaagt ggacttataa tgattccgat 300 ggagggacgg cttgggtttc ccaagagtcc tttgaggcag atgagccgga cagcagggca 360 ggggtgaagt ggaagaatgt ggccaggcag ctgaaagaag atctgtccag catcatcctg 420 ctgtcagaag aggacctcca agcgctcatc gacatcccat gtgcagagct ggctcaggaa 480 ctctgccaaa gctgtgccac tgtccagggg ctgcagagca cactccagca ggtgcttgac 540 cagagagagg aagcccgcca gtccaagcag ctcctggaac tttacctcca ggccttggag 600 aaagagggca acatcttgtc caaccagaaa gagtccaaag ctgccctcag tgaagagctg 660 gatgcagttg acacaggcgt cggcagagag atggcttcgg aagtgctgct cagaagccag 720 atccttacca cactgaagga gaagcctgcc ccagagctga gtttatctag tcaggatttg 780 gaggtgggca agaactag 798
【００７０】<210> 6 <211> 265 <212> PRT <213> human <400> 6 Met Glu Leu Ser Arg Gly Ala Ser Ala Pro Asp Pro Asp Asp Val 1 5 10 15 Arg Pro Leu Lys Pro Cys Leu Leu Arg Arg Asn His Ser Arg Asp 20 25 30 Gln His Gly Val Ala Ala Ser Ser Leu Glu Glu Leu Arg Ser Lys 35 40 45 Ala Cys Glu Leu Leu Ala Ile Asp Lys Ser Leu Thr Pro Ile Thr 50 55 60 Leu Val Leu Ala Glu Asp Gly Thr Ile Val Asp Asp Asp Asp Tyr 65 70 75 Phe Leu Cys Leu Pro Ser Asn Thr Lys Phe Val Ala Leu Ala Cys 80 85 90 Asn Glu Lys Trp Thr Tyr Asn Asp Ser Asp Gly Gly Thr Ala Trp
95 100 105 Val Ser Gln Glu Ser Phe Glu Ala Asp Glu Pro Asp Ser Arg Ala 110 115 120 Gly Val Lys Trp Lys Asn Val Ala Arg Gln Leu Lys Glu Asp Leu 125 130 135 Ser Ser Ile Ile Leu Leu Ser Glu Glu Asp Leu Gln Ala Leu Ile 140 145 150 Asp Ile Pro Cys Ala Glu Leu Ala Gln Glu Leu Cys Gln Ser Cys 155 160 165 Ala Thr Val Gln Gly Leu Gln Ser Thr Leu Gln Gln Val Leu Asp 170 175 180 Gln Arg Glu Glu Ala Arg Gln Ser Lys Gln Leu Leu Glu Leu Tyr
185 190 195 Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu Gly Asn Ile Leu Ser Asn Gln Lys 200 205 210 Glu Ser Lys Ala Ala Leu Ser Glu Glu Leu Asp Ala Val Asp Thr 215 220 225 Gly Val Gly Arg Glu Met Ala Ser Glu Val Leu Leu Arg Ser Gln 230 235 240 Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ
Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ 245 250 255 Ser Ser Gln Asp Leu Glu Val Gly Lys Asn 260 265
95 100 105 Val Ser Gln Glu Ser Phe Glu Ala Asp Glu Pro Asp Ser Arg Ala 110 115 120 Gly Val Lys Trp Lys Asn Val Ala Arg Gln Leu Lys Glu Asp Leu 125 130 135 Ser Ser Ile Ile Leu Leu Ser Glu Glu Asp Leu Gln Ala Leu Ile 140 145 150 Asp Ile Pro Cys Ala Glu Leu Ala Gln Glu Leu Cys Gln Ser Cys 155 160 165 Ala Thr Val Gln Gly Leu Gln Ser Thr Leu Gln Gln Val Leu Asp 170 175 180 Gln Arg Glu Glu Ala Arg Gln Ser Lys Gln Leu Leu Glu Leu Tyr
185 190 195 Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu Gly Asn Ile Leu Ser Asn Gln Lys 200 205 210 Glu Ser Lys Ala Ala Leu Ser Glu Glu Leu Asp Ala Val Asp Thr 215 220 225 Gly Val Gly Arg Glu Met Ala Ser Glu Val Leu Leu Arg Ser Gln 230 235 240 Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ
Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ 245 250 255 Ser Ser Gln Asp Leu Glu Val Gly Lys Asn 260 265
【図１】 マウスＷＲ１９Ｌ細胞から得た抽出物中のＣ
ＡＤおよびＩＣＡＤ活性を示す電気泳動の図面に代わる
写真である。
ＡＤおよびＩＣＡＤ活性を示す電気泳動の図面に代わる
写真である。
【図２】 ３２ｋＤａタンパク質としてのＩＣＡＤの確
認を示す電気泳動の図面に代わる写真である。
認を示す電気泳動の図面に代わる写真である。
【図３】 マウスのＩＣＡＤ−ＳおよびＩＣＡＤ−Ｌの
アミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列を示す。
【図４】 ＩＣＡＤｍＲＮＡの組織分布を示す電気泳動
の図面に代わる写真である。
の図面に代わる写真である。
【図５】 組換えＩＣＡＤによるＣＡＤの特異的阻害を
示す電気泳動の図面に代わる写真である。
示す電気泳動の図面に代わる写真である。
【図６】 カスパーゼ３切断によるＩＣＡＤの不活化を
示す電気泳動の図面に代わる写真である。
示す電気泳動の図面に代わる写真である。
【図７】 ＩＣＡＤ−ＬおよびＩＣＡＤ−Ｓの模式図、
およびカスパーゼ３耐性変異体の検出結果を示す電気泳
動の図面に代わる写真である。
およびカスパーゼ３耐性変異体の検出結果を示す電気泳
動の図面に代わる写真である。
【図８】 ＤＮＡ断片化を伴わないジャーカット細胞の
細胞死を示すグラフおよび電気泳動の図面に代わる写真
である。
細胞死を示すグラフおよび電気泳動の図面に代わる写真
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 21/08 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (14)
- 【請求項１】 以下の（ａ）または（ｂ）から選択され
るカスパーゼ活性化ＤＮアーゼ阻害物質： （ａ）それぞれ配列番号４または６に示されるアミノ酸
配列を有する長鎖または短鎖からなるカスパーゼ活性化
ＤＮアーゼ阻害能を有するタンパク質、（ｂ）配列番号
４または６に記載のアミノ酸配列において１もしくは複
数のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたア
ミノ酸配列からなり、カスパーゼ活性化ＤＮアーゼ阻害
能を有するタンパク質。 - 【請求項２】 配列番号４に示されるアミノ酸配列を有
する、長鎖カスパーゼ活性化ＤＮアーゼ阻害物質ＩＣＡ
Ｄ−Ｌ。 - 【請求項３】 配列番号６に示されるアミノ酸配列を有
する、短鎖カスパーゼ活性化ＤＮアーゼ阻害物質ＩＣＡ
Ｄ−Ｓ。 - 【請求項４】 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質
をコードする遺伝子： （ａ）それぞれ配列番号４または６に示されるアミノ酸
配列を有する長鎖または短鎖からなるカスパーゼ活性化
ＤＮアーゼ阻害能を有するタンパク質、（ｂ）配列番号
４または６に記載のアミノ酸配列において１もしくは複
数のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたア
ミノ酸配列からなり、カスパーゼ活性化ＤＮアーゼ阻害
能を有するタンパク質。 - 【請求項５】 配列番号４に示されるアミノ酸配列を有
する長鎖カスパーゼ活性化ＤＮアーゼ阻害物質ＩＣＡＤ
−Ｌをコードする遺伝子。 - 【請求項６】 配列番号３に示されるＤＮＡ配列を有す
る請求項５に記載の遺伝子。 - 【請求項７】 配列番号６示されるアミノ酸配列を有す
る短鎖カスパーゼ活性化ＤＮアーゼ阻害物質ＩＣＡＤ−
Ｓをコードする遺伝子。 - 【請求項８】 配列番号５に示されるＤＮＡ配列を有す
る請求項７に記載の遺伝子。 - 【請求項９】 請求項４から８までのいずれかに記載の
遺伝子を含有するベクター。 - 【請求項１０】 発現ベクターである請求項９記載のベ
クター。 - 【請求項１１】 請求項１０記載の発現ベクターにより
形質転換された宿主細胞。 - 【請求項１２】 請求項４から８までのいずれかに記載
の遺伝子と相補的な配列を有する、８塩基以上からなる
ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらの化学的修飾体。 - 【請求項１３】 請求項１２記載のＤＮＡもしくはＲＮ
Ａまたはそれらの化学的修飾体を含有するベクター。 - 【請求項１４】 請求項１から３までのいずれかに記載
のＤＮアーゼ阻害物質に対する抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10369222A JPH11239495A (ja) | 1997-12-25 | 1998-12-25 | カスパ―ゼ活性化ｄｎア―ゼの阻害物質 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9-369356 | 1997-12-25 | ||
| JP36935697 | 1997-12-25 | ||
| JP10369222A JPH11239495A (ja) | 1997-12-25 | 1998-12-25 | カスパ―ゼ活性化ｄｎア―ゼの阻害物質 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11239495A true JPH11239495A (ja) | 1999-09-07 |
Family
ID=26582082
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10369222A Withdrawn JPH11239495A (ja) | 1997-12-25 | 1998-12-25 | カスパ―ゼ活性化ｄｎア―ゼの阻害物質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11239495A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001060400A3 (de) * | 2000-02-16 | 2002-04-18 | Procorde Gmbh | Verwendung von inhibitoren von caspase-3 oder der caspase-aktivierten desoxyribonuclease (cad) zur behandlung von herzerkrankungen |
-
1998
- 1998-12-25 JP JP10369222A patent/JPH11239495A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001060400A3 (de) * | 2000-02-16 | 2002-04-18 | Procorde Gmbh | Verwendung von inhibitoren von caspase-3 oder der caspase-aktivierten desoxyribonuclease (cad) zur behandlung von herzerkrankungen |
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