JPH11239494A - カスパ―ゼ活性化ｄｎア―ゼ - Google Patents
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 種々のアポトーシスに関与するカスパーゼで
活性化されるＤＮアーゼ(ＣＡＤ)とそれをコードする遺
伝子を提供する。 【解決手段】 マウスのリンパ腫細胞の細胞質画分にカ
スパーゼで活性化されるＤＮアーゼ（ＣＡＤ）を確認
し、ＣＡＤを精製してＣＡＤをコードするｃＤＮＡを分
離する。
活性化されるＤＮアーゼ(ＣＡＤ)とそれをコードする遺
伝子を提供する。 【解決手段】 マウスのリンパ腫細胞の細胞質画分にカ
スパーゼで活性化されるＤＮアーゼ（ＣＡＤ）を確認
し、ＣＡＤを精製してＣＡＤをコードするｃＤＮＡを分
離する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】動物の恒常性は細胞の増殖お
よび分化による他に、アポトーシスとして知られている
過程を経る細胞死によっても調節されている［１］（本
明細書の一部を構成する引用文献を末尾に列挙し、明細
書中の引用箇所にその文献番号を付した）。余剰な細胞
多数が哺乳類の発育の間にアポトーシスによって除去さ
れる。細胞傷害性Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞が
ウイルス感染細胞または腫瘍細胞を殺す時、これらのエ
フェクター細胞は標的細胞内にアポトーシスを誘導する
［２］。アポトーシスによる細胞死は、細胞縮小、核の
凝縮、および微絨毛の消失［３］のような形態的変化を
伴うのが特徴である。アポトーシスの生化学的特徴は染
色体ＤＮＡのヌクレオソーム単位への切断であり、これ
が細胞死過程における最終的な打撃であると思われる
［４−６］。これまで、アポトーシスＤＮＡ分解の原因
であるヌクレアーゼとしてＤＮアーゼＩ、ＤＮアーゼＩ
Ｉ、およびシクロフィリンのような様々なタンパク質が
候補として示唆されてきたが［７−９］、確認はされて
いなかった。
よび分化による他に、アポトーシスとして知られている
過程を経る細胞死によっても調節されている［１］（本
明細書の一部を構成する引用文献を末尾に列挙し、明細
書中の引用箇所にその文献番号を付した）。余剰な細胞
多数が哺乳類の発育の間にアポトーシスによって除去さ
れる。細胞傷害性Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞が
ウイルス感染細胞または腫瘍細胞を殺す時、これらのエ
フェクター細胞は標的細胞内にアポトーシスを誘導する
［２］。アポトーシスによる細胞死は、細胞縮小、核の
凝縮、および微絨毛の消失［３］のような形態的変化を
伴うのが特徴である。アポトーシスの生化学的特徴は染
色体ＤＮＡのヌクレオソーム単位への切断であり、これ
が細胞死過程における最終的な打撃であると思われる
［４−６］。これまで、アポトーシスＤＮＡ分解の原因
であるヌクレアーゼとしてＤＮアーゼＩ、ＤＮアーゼＩ
Ｉ、およびシクロフィリンのような様々なタンパク質が
候補として示唆されてきたが［７−９］、確認はされて
いなかった。
【０００２】
【従来の技術】Ｆａｓリガンドは腫瘍壊死因子ファミリ
ーの一員であるが、活性化されたＴ細胞およびナチュラ
ルキラー細胞に発現され、その受容体であるＦａｓに結
合することによって標的細胞にアポトーシスを誘導する
［２，１０］。本発明者らおよび他の研究陣はＦａｓの
活性化は、カスパーゼカスケードの活性化を誘導するこ
とを示した［１１−１４］。カスパーゼ（アポトーシス
プロテアーゼ）は前駆体型として合成され、アポトーシ
スシグナルがこの前駆体を変換して成熟酵素とし、この
酵素がカスケードの下流にある複数のカスパーゼを切
断、活性化する。今までにカスパーゼファミリーとして
少なくとも１０個が確認されており［１６］、それらは
基質特異性に基づいて３群のサブグループに分類されて
いる［１７，１８］。こうしてアポトーシスシグナルに
よって活性化されたカスパーゼはアクチン、ポリ（ＡＤ
Ｐ−リボース）ポリメラーゼ、フォドリン、およびラミ
ンのような種々の細胞内基質を切断する。これが細胞の
形態学的変化を起こすのかもしれない［１９］。
ーの一員であるが、活性化されたＴ細胞およびナチュラ
ルキラー細胞に発現され、その受容体であるＦａｓに結
合することによって標的細胞にアポトーシスを誘導する
［２，１０］。本発明者らおよび他の研究陣はＦａｓの
活性化は、カスパーゼカスケードの活性化を誘導するこ
とを示した［１１−１４］。カスパーゼ（アポトーシス
プロテアーゼ）は前駆体型として合成され、アポトーシ
スシグナルがこの前駆体を変換して成熟酵素とし、この
酵素がカスケードの下流にある複数のカスパーゼを切
断、活性化する。今までにカスパーゼファミリーとして
少なくとも１０個が確認されており［１６］、それらは
基質特異性に基づいて３群のサブグループに分類されて
いる［１７，１８］。こうしてアポトーシスシグナルに
よって活性化されたカスパーゼはアクチン、ポリ（ＡＤ
Ｐ−リボース）ポリメラーゼ、フォドリン、およびラミ
ンのような種々の細胞内基質を切断する。これが細胞の
形態学的変化を起こすのかもしれない［１９］。
【０００３】Ｆａｓにより誘導されるアポトーシスはＤ
ＮＡの分解も起こす［２０］。Ｆａｓによってアポトー
シスを起こしている細胞から得られた細胞質画分は、分
離した核にＤＮＡ分解を誘導する因子を含むことが見出
されており、このことはヌクレアーゼまたはその活性化
分子がＦａｓ誘発アポトーシスの間に細胞内で作製され
ることを示唆している［２１］。生細胞から得た細胞質
分画は核内でＤＮＡ分解を起こさないが、その抽出物は
カスパーゼ３処理でアポトーシス誘導性抽出物に変換さ
れる。これは、生細胞がＤＮＡ分解を誘導する分子の前
駆体を持っていることを示唆している［１２］。
ＮＡの分解も起こす［２０］。Ｆａｓによってアポトー
シスを起こしている細胞から得られた細胞質画分は、分
離した核にＤＮＡ分解を誘導する因子を含むことが見出
されており、このことはヌクレアーゼまたはその活性化
分子がＦａｓ誘発アポトーシスの間に細胞内で作製され
ることを示唆している［２１］。生細胞から得た細胞質
分画は核内でＤＮＡ分解を起こさないが、その抽出物は
カスパーゼ３処理でアポトーシス誘導性抽出物に変換さ
れる。これは、生細胞がＤＮＡ分解を誘導する分子の前
駆体を持っていることを示唆している［１２］。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】アポトーシスの間にＤ
ＮＡ断片化が起きるとの観察以来［６］、数多くの研究
グループがアポトーシス性ＤＮＡ分解の原因となるＤＮ
アーゼの確認を試みた。しかし、アポトーシスの間に活
性化されるＤＮアーゼは非常に不安定かつ微量であり、
この酵素の精製は極めて困難であった［２６］。ＤＮア
ーゼＩ、ＤＮアーゼＩＩ、シクロフィリン、およびＤＮ
アーゼγを含めて数種の酵素およびタンパク質が候補と
して提案されたが［７−９，２７］、これらの候補はど
れもアポトーシスＤＮアーゼとしての要件全てを満たす
ものではなく、その同定は未解決であった。
ＮＡ断片化が起きるとの観察以来［６］、数多くの研究
グループがアポトーシス性ＤＮＡ分解の原因となるＤＮ
アーゼの確認を試みた。しかし、アポトーシスの間に活
性化されるＤＮアーゼは非常に不安定かつ微量であり、
この酵素の精製は極めて困難であった［２６］。ＤＮア
ーゼＩ、ＤＮアーゼＩＩ、シクロフィリン、およびＤＮ
アーゼγを含めて数種の酵素およびタンパク質が候補と
して提案されたが［７−９，２７］、これらの候補はど
れもアポトーシスＤＮアーゼとしての要件全てを満たす
ものではなく、その同定は未解決であった。
【０００５】
【発明の概要】そこで、本発明者らはアポトーシス性Ｄ
ＮＡ分解の原因となるＤＮアーゼの検索を行い、細胞抽
出物からカスパーゼ３［１２，１５］処理で活性化され
る、比較的安定な前駆体としての新たなＤＮアーゼを確
認した。このＤＮアーゼの精製とそのｃＤＮＡの発現か
ら、これがＤＮアーゼＩまたはＤＮアーゼＩＩと同等
か、さらに高い特異性のある活性を持つＤＮアーゼタン
パク質であることが判明した。このように、本発明者ら
は、カスパーゼ３処理後に核内でＤＮＡ分解を起こすこ
とのできるタンパク質を精製することに成功した。この
タンパク質はＤＮアーゼ活性を持つので、カスパーゼ活
性化ＤＮアーゼ（ＣＡＤ）と命名した。さらに、マウス
ＣＡＤｃＤＮＡの分子クローニングにより、ＣＡＤが３
４２アミノ酸からなり、Ｃ末端に核局在化シグナルを持
つタンパク質であることがわかった。
ＮＡ分解の原因となるＤＮアーゼの検索を行い、細胞抽
出物からカスパーゼ３［１２，１５］処理で活性化され
る、比較的安定な前駆体としての新たなＤＮアーゼを確
認した。このＤＮアーゼの精製とそのｃＤＮＡの発現か
ら、これがＤＮアーゼＩまたはＤＮアーゼＩＩと同等
か、さらに高い特異性のある活性を持つＤＮアーゼタン
パク質であることが判明した。このように、本発明者ら
は、カスパーゼ３処理後に核内でＤＮＡ分解を起こすこ
とのできるタンパク質を精製することに成功した。この
タンパク質はＤＮアーゼ活性を持つので、カスパーゼ活
性化ＤＮアーゼ（ＣＡＤ）と命名した。さらに、マウス
ＣＡＤｃＤＮＡの分子クローニングにより、ＣＡＤが３
４２アミノ酸からなり、Ｃ末端に核局在化シグナルを持
つタンパク質であることがわかった。
【０００６】本発明は、アポトーシスにおけるＤＮＡ分
解に関与するこのカスパーゼ活性化ＤＮアーゼ（ＣＡ
Ｄ）を基礎とする。詳細には、本発明は、（ａ）配列番
号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質および
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１も
しくは複数のアミノ酸が欠失、置換および／または付加
されたアミノ酸配列からなりかつ該タンパク質と同等の
ＤＮアーゼ活性を有するタンパク質の中から選択される
ＤＮアーゼ、好ましくはそのＤＮアーゼ活性がカスパー
ゼを介して活性化されるＤＮアーゼタンパク質； （２）本発明タンパク質をコードしている遺伝子、好ま
しくはＤＮＡ分子、より好ましくは配列番号１に示され
るＤＮＡ配列を有する遺伝子； （３）本発明遺伝子を含有するベクター、好ましくは発
現ベクター； （４）本発明発現ベクターにより形質転換された宿主細
胞； （５）本発明遺伝子と相補的な配列を有する、８塩基以
上からなるＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらの化学的
修飾体； （６）この本発明ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらの
化学的修飾体を含有するベクター；および （７）本発明タンパク質に対する抗体；に関する。
解に関与するこのカスパーゼ活性化ＤＮアーゼ（ＣＡ
Ｄ）を基礎とする。詳細には、本発明は、（ａ）配列番
号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質および
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１も
しくは複数のアミノ酸が欠失、置換および／または付加
されたアミノ酸配列からなりかつ該タンパク質と同等の
ＤＮアーゼ活性を有するタンパク質の中から選択される
ＤＮアーゼ、好ましくはそのＤＮアーゼ活性がカスパー
ゼを介して活性化されるＤＮアーゼタンパク質； （２）本発明タンパク質をコードしている遺伝子、好ま
しくはＤＮＡ分子、より好ましくは配列番号１に示され
るＤＮＡ配列を有する遺伝子； （３）本発明遺伝子を含有するベクター、好ましくは発
現ベクター； （４）本発明発現ベクターにより形質転換された宿主細
胞； （５）本発明遺伝子と相補的な配列を有する、８塩基以
上からなるＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらの化学的
修飾体； （６）この本発明ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらの
化学的修飾体を含有するベクター；および （７）本発明タンパク質に対する抗体；に関する。
【０００７】
【発明の詳しい説明】(１） 配列番号２に示されるア
ミノ酸配列を有するタンパク質ＣＡＤはＤＮアーゼ活性
を有している。ＣＯＳ細胞中に産生させた組換えＣＡＤ
の生化学的分析は、殆どのアポトーシス細胞でＤＮＡ分
解を阻害するオーリントリカルボン酸［２８，２９］３
０μＭ濃度によってＣＡＤのＤＮアーゼ活性が阻害され
ることを示した。また、以下に示すようにＣＡＤは種々
の組織にかなり遍在的に発現され、そのアミノ酸配列に
は核局在化シグナルが含まれている。これらのことか
ら、他のＤＮアーゼがある状況下に一定の役割を演じる
可能性を完全に排除できるものでないが、ＣＡＤはアポ
トーシスの間にＤＮＡ分解を起こすＤＮアーゼであると
考えられた。
ミノ酸配列を有するタンパク質ＣＡＤはＤＮアーゼ活性
を有している。ＣＯＳ細胞中に産生させた組換えＣＡＤ
の生化学的分析は、殆どのアポトーシス細胞でＤＮＡ分
解を阻害するオーリントリカルボン酸［２８，２９］３
０μＭ濃度によってＣＡＤのＤＮアーゼ活性が阻害され
ることを示した。また、以下に示すようにＣＡＤは種々
の組織にかなり遍在的に発現され、そのアミノ酸配列に
は核局在化シグナルが含まれている。これらのことか
ら、他のＤＮアーゼがある状況下に一定の役割を演じる
可能性を完全に排除できるものでないが、ＣＡＤはアポ
トーシスの間にＤＮＡ分解を起こすＤＮアーゼであると
考えられた。
【０００８】ＣＡＤとしての機能を発揮しうるタンパク
質、すなわち機能性ＣＡＤタンパク質は、ＣＯＳ細胞お
よび無細胞系中でＣＡＤの特異的阻害剤（ＩＣＡＤ）の
存在下にのみ産生され、ＣＡＤはＩＣＡＤと複合体を形
成していることが見出された。これらの結果はＣＡＤが
生細胞内ではＩＣＡＤとの不活性な複合体として存在す
ることを示唆する。アポトーシスシグナルによって活性
化されたカスパーゼはＩＣＡＤを切断してＣＡＤを放出
させ、次にこれが核内に入って染色体ＤＮＡを分解す
る。ＣＡＤのこの活性化機序は転写因子ＮＦ−κＢの活
性化機序と著しく類似している。なお、ＩＣＡＤの過剰
発現はＦａｓの活性化またはスタウロスポリン処理によ
り誘導されるＤＮＡ分解を遮断した。
質、すなわち機能性ＣＡＤタンパク質は、ＣＯＳ細胞お
よび無細胞系中でＣＡＤの特異的阻害剤（ＩＣＡＤ）の
存在下にのみ産生され、ＣＡＤはＩＣＡＤと複合体を形
成していることが見出された。これらの結果はＣＡＤが
生細胞内ではＩＣＡＤとの不活性な複合体として存在す
ることを示唆する。アポトーシスシグナルによって活性
化されたカスパーゼはＩＣＡＤを切断してＣＡＤを放出
させ、次にこれが核内に入って染色体ＤＮＡを分解す
る。ＣＡＤのこの活性化機序は転写因子ＮＦ−κＢの活
性化機序と著しく類似している。なお、ＩＣＡＤの過剰
発現はＦａｓの活性化またはスタウロスポリン処理によ
り誘導されるＤＮＡ分解を遮断した。
【０００９】カスパーゼで活性化されたＣＡＤがＩＣＡ
Ｄと結合し、また無細胞での転写、翻訳システム中で新
たに合成されたＣＡＤはＩＣＡＤとの複合体として回収
されたことから、非アポトーシス細胞における前駆体Ｃ
ＡＤは、ＣＡＤとＩＣＡＤの複合体として存在すると思
われる。部分精製ＣＡＤを加熱してＣＡＤを不活化する
と、ＩＣＡＤ活性はＣＡＤを含んでいた画分に見出され
る。ＣＡＤは等電点８．７を示す塩基性タンパク質であ
り、一方ＩＣＡＤは等電点４．５を示す酸性タンパク質
である。そこで、これらタンパク質２種の相互作用は静
電的相互作用によるものと考えられる。アポトーシス過
程の間に活性化されるプロテアーゼであるカスパーゼ３
［１２，１５］はＩＣＡＤを切断でき、多分これがＩＣ
ＡＤからのＣＡＤ放出を起こす。事実、潜在型およびカ
スパーゼ３活性化型のＣＡＤをゲル濾過法で分析する
と、見掛けの分子量は各々８０ｋＤａおよび４０ｋＤａ
であった。アポトーシスの間のこのＣＡＤ活性化機序
（図７）は核転写因子ＮＦ−κＢ［３０，３１］の活性
化について結論された機序に非常に類似している。ＮＦ
−κＢは細胞質中でＩ−κＢとともに複合体として保持
されている。種々の刺激がキナーゼカスケードを活性化
し、これがＩ−κＢのユビキチン依存性分解へと導び
く。分解したＩ−κＢはＮＦ−κＢから解離し、それが
次に核に入って様々な遺伝子の発現を活性化または抑制
する。アポトーシスの経路では、サイトカインを含む種
々の刺激がカスパーゼのプロテアーゼカスケードを活性
化し、それがＩＣＡＤの分解を起こし、ＣＡＤからの解
離を起こすのであろう。放出されたＣＡＤは核内に入る
ことができ、染色体ＤＮＡを分解するのであろう。ＮＦ
−κＢは核局在化シグナルを持ち、Ｉ−κＢの役割の一
つはこのシグナルを遮蔽してＮＦ−κＢの核への移動を
防ぐことにある［３２］。ＣＡＤも核局在化シグナルを
持つ。ＩＣＡＤにはＣＡＤのＤＮアーゼ作用を阻止する
性能があるが、潜在型ＣＡＤはほとんどが細胞質内に見
出されるので、ＩＣＡＤはＣＡＤの核内への移動を阻止
しているのであろう。これらの点を解明するためには、
アポトーシスを引き起こしている細胞内でのＣＡＤの分
子的性質および局在を検討する必要があろう。
Ｄと結合し、また無細胞での転写、翻訳システム中で新
たに合成されたＣＡＤはＩＣＡＤとの複合体として回収
されたことから、非アポトーシス細胞における前駆体Ｃ
ＡＤは、ＣＡＤとＩＣＡＤの複合体として存在すると思
われる。部分精製ＣＡＤを加熱してＣＡＤを不活化する
と、ＩＣＡＤ活性はＣＡＤを含んでいた画分に見出され
る。ＣＡＤは等電点８．７を示す塩基性タンパク質であ
り、一方ＩＣＡＤは等電点４．５を示す酸性タンパク質
である。そこで、これらタンパク質２種の相互作用は静
電的相互作用によるものと考えられる。アポトーシス過
程の間に活性化されるプロテアーゼであるカスパーゼ３
［１２，１５］はＩＣＡＤを切断でき、多分これがＩＣ
ＡＤからのＣＡＤ放出を起こす。事実、潜在型およびカ
スパーゼ３活性化型のＣＡＤをゲル濾過法で分析する
と、見掛けの分子量は各々８０ｋＤａおよび４０ｋＤａ
であった。アポトーシスの間のこのＣＡＤ活性化機序
（図７）は核転写因子ＮＦ−κＢ［３０，３１］の活性
化について結論された機序に非常に類似している。ＮＦ
−κＢは細胞質中でＩ−κＢとともに複合体として保持
されている。種々の刺激がキナーゼカスケードを活性化
し、これがＩ−κＢのユビキチン依存性分解へと導び
く。分解したＩ−κＢはＮＦ−κＢから解離し、それが
次に核に入って様々な遺伝子の発現を活性化または抑制
する。アポトーシスの経路では、サイトカインを含む種
々の刺激がカスパーゼのプロテアーゼカスケードを活性
化し、それがＩＣＡＤの分解を起こし、ＣＡＤからの解
離を起こすのであろう。放出されたＣＡＤは核内に入る
ことができ、染色体ＤＮＡを分解するのであろう。ＮＦ
−κＢは核局在化シグナルを持ち、Ｉ−κＢの役割の一
つはこのシグナルを遮蔽してＮＦ−κＢの核への移動を
防ぐことにある［３２］。ＣＡＤも核局在化シグナルを
持つ。ＩＣＡＤにはＣＡＤのＤＮアーゼ作用を阻止する
性能があるが、潜在型ＣＡＤはほとんどが細胞質内に見
出されるので、ＩＣＡＤはＣＡＤの核内への移動を阻止
しているのであろう。これらの点を解明するためには、
アポトーシスを引き起こしている細胞内でのＣＡＤの分
子的性質および局在を検討する必要があろう。
【００１０】ほとんどのＤＮアーゼおよびプロテアーゼ
は合成されるとすぐにリソソームに隔離される。細胞質
にあるカスパーゼのようなある種のプロテアーゼは不活
性な前駆体型として存在し、種々の刺激がそれらを活性
な酵素に変換する［１５］。ＤＮアーゼであるＣＡＤが
ＣＯＳ細胞内または無細胞系で合成されても、ＣＡＤ活
性は起動されず、ＣＡＤ阻害剤であるＩＣＡＤの存在が
ＣＡＤの機能的酵素を産生するために必要であった。こ
の機序は、「免疫性タンパク質」と呼ばれる阻害剤とと
もに調和して発現され直ちにそれと複合体を形成するコ
リシン遺伝子がコードする細菌ＤＮアーゼの状況［３
３］と類似している。ＩＣＡＤには、事前に形成された
ＣＡＤタンパク質からＣＡＤ活性を起動する性能がない
ことは、ＩＣＡＤが新生されつつあるＣＡＤポリペプチ
ドに正しい折り畳みを可能にする特異的シャペロンとし
て作用することを示唆している。シャペロンは新たなタ
ンパク質折り畳みの間にポリペプチド内またはポリペプ
チド間の正しくない会合を防止し、また非折畳み構造を
保持したまま細胞内オルガネラにタンパク質を誘導する
機能を発揮できるタンパク質である［３４］。ほとんど
のシャペロンは多機能性で遍在的であるが、特異的なシ
ャペロン様機能は最近になってカリウムチャネルのβ−
サブユニット［３５］および２０Ｓプロテオソームのサ
ブユニットの一つ［３６］で確認された。２０Ｓプロテ
オソームのこのサブユニットは前駆体として合成され、
そのサブユニットは会合してプロテオソームになる間に
プロセシングされる。ＣＡＤもＮ−末端に余分な２個の
アミノ酸（ＭｅｔおよびＣｙｓ）を持つプロテインとし
て合成される。この余分なアミノ酸がＩＣＡＤと会合す
ることによって除去される可能性もある。
は合成されるとすぐにリソソームに隔離される。細胞質
にあるカスパーゼのようなある種のプロテアーゼは不活
性な前駆体型として存在し、種々の刺激がそれらを活性
な酵素に変換する［１５］。ＤＮアーゼであるＣＡＤが
ＣＯＳ細胞内または無細胞系で合成されても、ＣＡＤ活
性は起動されず、ＣＡＤ阻害剤であるＩＣＡＤの存在が
ＣＡＤの機能的酵素を産生するために必要であった。こ
の機序は、「免疫性タンパク質」と呼ばれる阻害剤とと
もに調和して発現され直ちにそれと複合体を形成するコ
リシン遺伝子がコードする細菌ＤＮアーゼの状況［３
３］と類似している。ＩＣＡＤには、事前に形成された
ＣＡＤタンパク質からＣＡＤ活性を起動する性能がない
ことは、ＩＣＡＤが新生されつつあるＣＡＤポリペプチ
ドに正しい折り畳みを可能にする特異的シャペロンとし
て作用することを示唆している。シャペロンは新たなタ
ンパク質折り畳みの間にポリペプチド内またはポリペプ
チド間の正しくない会合を防止し、また非折畳み構造を
保持したまま細胞内オルガネラにタンパク質を誘導する
機能を発揮できるタンパク質である［３４］。ほとんど
のシャペロンは多機能性で遍在的であるが、特異的なシ
ャペロン様機能は最近になってカリウムチャネルのβ−
サブユニット［３５］および２０Ｓプロテオソームのサ
ブユニットの一つ［３６］で確認された。２０Ｓプロテ
オソームのこのサブユニットは前駆体として合成され、
そのサブユニットは会合してプロテオソームになる間に
プロセシングされる。ＣＡＤもＮ−末端に余分な２個の
アミノ酸（ＭｅｔおよびＣｙｓ）を持つプロテインとし
て合成される。この余分なアミノ酸がＩＣＡＤと会合す
ることによって除去される可能性もある。
【００１１】本発明は別の態様として、ＣＡＤのほか、
配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは
複数のアミノ酸が欠失、置換および／または付加された
アミノ酸からなり、かつ上記ＣＡＤと同等のＤＮアーゼ
活性を有するタンパク質を包含する。これは、配列番号
１で示されるＤＮＡ配列を有する遺伝子を当業者に周知
の方法、例えば部位特異的突然変異誘発（Methods in E
nzymology, 100:448-(1983))やＰＣＲ法（Molecular Cl
oning 2nd Edt.15章,Cold Harbor LaboratoryPress (19
89),「PCR A Practical Approach」,IRL Press 200-210
(1991))により変異させ、これを配列番号１に記載の遺
伝子と同様にして発現させることにより、得ることがで
きる。なおここで、欠失、置換および／または付加され
るアミノ酸残基の数は、上記部位特異的突然変異誘発の
周知の方法により欠失、置換および／または付加できる
程度の数を指す。得られた変異タンパク質がカスパーゼ
活性化ＤＮアーゼ活性を有するか否かは、後述する実施
例に記載の、ＣＡＤの活性検出法と同様にして確認する
ことができる。
配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは
複数のアミノ酸が欠失、置換および／または付加された
アミノ酸からなり、かつ上記ＣＡＤと同等のＤＮアーゼ
活性を有するタンパク質を包含する。これは、配列番号
１で示されるＤＮＡ配列を有する遺伝子を当業者に周知
の方法、例えば部位特異的突然変異誘発（Methods in E
nzymology, 100:448-(1983))やＰＣＲ法（Molecular Cl
oning 2nd Edt.15章,Cold Harbor LaboratoryPress (19
89),「PCR A Practical Approach」,IRL Press 200-210
(1991))により変異させ、これを配列番号１に記載の遺
伝子と同様にして発現させることにより、得ることがで
きる。なおここで、欠失、置換および／または付加され
るアミノ酸残基の数は、上記部位特異的突然変異誘発の
周知の方法により欠失、置換および／または付加できる
程度の数を指す。得られた変異タンパク質がカスパーゼ
活性化ＤＮアーゼ活性を有するか否かは、後述する実施
例に記載の、ＣＡＤの活性検出法と同様にして確認する
ことができる。
【００１２】（２）別の態様として、本発明は本発明Ｄ
Ｎアーゼタンパク質をコードしている遺伝子を包含す
る。本発明遺伝子にはＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、好
ましくはＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ｃＤＮＡ、ゲノ
ミックＤＮＡあるいは合成ＤＮＡであり得る。またＤＮ
ＡおよびＲＮＡいずれも２本鎖でも１本鎖でもあり得
る。１本鎖の場合、コード鎖あるいは非コード鎖であり
得る。より好ましくは配列番号１で示されるＤＮＡ配列
を有する遺伝子である。
Ｎアーゼタンパク質をコードしている遺伝子を包含す
る。本発明遺伝子にはＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、好
ましくはＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ｃＤＮＡ、ゲノ
ミックＤＮＡあるいは合成ＤＮＡであり得る。またＤＮ
ＡおよびＲＮＡいずれも２本鎖でも１本鎖でもあり得
る。１本鎖の場合、コード鎖あるいは非コード鎖であり
得る。より好ましくは配列番号１で示されるＤＮＡ配列
を有する遺伝子である。
【００１３】（３）別の態様として、本発明は本発明遺
伝子を含有するベクターを包含する。該ベクターには発
現ベクター、クローニングベクター、治療用ベクターな
どの種々の用途を持つベクターが包含される。好ましく
は発現ベクターである。発現ベクターは本発明タンパク
質の大量生産に利用できる。発現ベクターについての詳
細は以下の項に示す。治療用ベクターは本発明遺伝子を
投与し細胞内に導入する手法に用いられ、ウイルスベク
ター等がある。その他、プラスミドを直接筋肉内に投与
する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法等があ
り、これらにもベクターが用いられる。ＣＡＤは核内に
移行してＤＮＡの分解をもたらすので、癌細胞などを死
滅させる等において、本発明治療用ベクターは遺伝子治
療に有用であろう。
伝子を含有するベクターを包含する。該ベクターには発
現ベクター、クローニングベクター、治療用ベクターな
どの種々の用途を持つベクターが包含される。好ましく
は発現ベクターである。発現ベクターは本発明タンパク
質の大量生産に利用できる。発現ベクターについての詳
細は以下の項に示す。治療用ベクターは本発明遺伝子を
投与し細胞内に導入する手法に用いられ、ウイルスベク
ター等がある。その他、プラスミドを直接筋肉内に投与
する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法等があ
り、これらにもベクターが用いられる。ＣＡＤは核内に
移行してＤＮＡの分解をもたらすので、癌細胞などを死
滅させる等において、本発明治療用ベクターは遺伝子治
療に有用であろう。
【００１４】（４）別の態様として、本発明は本発明発
現ベクターにより形質転換された宿主細胞が包含され
る。宿主細胞には原核細胞、真核細胞が含まれ、細菌、
真菌、哺乳動物細胞等が例示される。
現ベクターにより形質転換された宿主細胞が包含され
る。宿主細胞には原核細胞、真核細胞が含まれ、細菌、
真菌、哺乳動物細胞等が例示される。
【００１５】（５）別の態様として、本発明は、本発明
遺伝子と相補的な配列を有する、８塩基以上からなるＤ
ＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらの化学的修飾体が包含
される。「相補的な配列を有する」とはいわゆるアンチ
センスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡあるい
はアンチセンスＤＮＡと呼ばれるものを網羅する意味を
有する。これらは合成装置を用いて人工的に合成した
り、あるいは通常と逆向き（即ちアンチセンス向き）に
遺伝子を発現させることなどによって得ることができ
る。このアンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは８−
１００塩基、好ましくは８−５０塩基である。「化学的
修飾体」とは、本発明アンチセンスオリゴヌクレオチド
の細胞内への移行性または細胞内での安定性が高められ
た修飾体を意味し、例えばホスホロチオエート、アルキ
ルホスホトリエステル、アルキルホスホアミデート等の
誘導体が挙げられる［４１］。これらアンチセンスヌク
レオチドはＣＡＤの発現を抑制する目的で利用される
他、in situハイブリダイゼーション等の研究用試薬と
しても有用である。投与方法は直接生体内の細胞に導入
するin vivo法等がある。
遺伝子と相補的な配列を有する、８塩基以上からなるＤ
ＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらの化学的修飾体が包含
される。「相補的な配列を有する」とはいわゆるアンチ
センスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡあるい
はアンチセンスＤＮＡと呼ばれるものを網羅する意味を
有する。これらは合成装置を用いて人工的に合成した
り、あるいは通常と逆向き（即ちアンチセンス向き）に
遺伝子を発現させることなどによって得ることができ
る。このアンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは８−
１００塩基、好ましくは８−５０塩基である。「化学的
修飾体」とは、本発明アンチセンスオリゴヌクレオチド
の細胞内への移行性または細胞内での安定性が高められ
た修飾体を意味し、例えばホスホロチオエート、アルキ
ルホスホトリエステル、アルキルホスホアミデート等の
誘導体が挙げられる［４１］。これらアンチセンスヌク
レオチドはＣＡＤの発現を抑制する目的で利用される
他、in situハイブリダイゼーション等の研究用試薬と
しても有用である。投与方法は直接生体内の細胞に導入
するin vivo法等がある。
【００１６】（６）あるいは、このアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドを含有するベクターによって投与すること
もできる。本発明はこのようなベクターも包含する。ベ
クターとしてはウイルスベクター等が挙げられる。
ヌクレオチドを含有するベクターによって投与すること
もできる。本発明はこのようなベクターも包含する。ベ
クターとしてはウイルスベクター等が挙げられる。
【００１７】（７）本発明は別の態様として、本発明タ
ンパク質に対する抗体を包含する。該抗体は本発明タン
パク質またはその断片を、例えば文献［４２］に記載さ
れている手法を用いてマウスやウサギを免疫することに
より、容易に調製できる。好ましい本発明抗体はモノク
ローナル抗体である。モノクローナル抗体は文献［４
３，４４］記載の手法により、免疫したマウスやラット
の脾臓またはリンパ節からリンパ球を取りだし、ミエロ
ーマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイ
ブリドーマから入手できる。抗体の用途は、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、ｃＤＮＡライブラリーのスク
リーニング、医薬・診断薬等が挙げられる。ＣＡＤの機
能を阻害する中和抗体が好ましい。
ンパク質に対する抗体を包含する。該抗体は本発明タン
パク質またはその断片を、例えば文献［４２］に記載さ
れている手法を用いてマウスやウサギを免疫することに
より、容易に調製できる。好ましい本発明抗体はモノク
ローナル抗体である。モノクローナル抗体は文献［４
３，４４］記載の手法により、免疫したマウスやラット
の脾臓またはリンパ節からリンパ球を取りだし、ミエロ
ーマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイ
ブリドーマから入手できる。抗体の用途は、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、ｃＤＮＡライブラリーのスク
リーニング、医薬・診断薬等が挙げられる。ＣＡＤの機
能を阻害する中和抗体が好ましい。
【００１８】
【発明の実施の形態】以下に本発明の実施の態様を説明
する。ＣＡＤの精製 Ｆａｓ遺伝子の機能不全突然変異はリンパ節症および巨
脾症を起こす［２］。この突然変異マウスの１種ＭＲＬ
−ｌｐｒのリンパ節から得た細胞質抽出物は高レベルの
ＣＡＤ活性を示し入手し易いので、これをＣＡＤ精製の
出発材料として用いるのが好ましい。しかし、ＣＡＤは
生体内において広汎に発現されているので、他の組織を
用いることもできる。ＣＡＤは精製の間に自己活性化を
起こし、さらにこの活性化型は不安定で容易に失活す
る。そこで粗製抽出物画分をまずカスパーゼ３の阻害
剤、例えばビオチン化−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓ
ｐ−クロロメチルケトン（ｂｉｏ−ＤＥＶＤ−ｃｍｋ）
で処理し、抽出物内のカスパーゼ３を不活化する［１
２］。次にＣＡＤを硫酸アンモニウム分画、ヘパリンー
アガロース−、リソースＱ−、およびリソースＳ−カラ
ムクロマトグラフィーを含む通常の精製操作によって精
製する。ＣＡＤ活性は、核内でＤＮＡ分解を誘導する性
能またはプラスミドＤＮＡを基質に用いるＤＮアーゼ活
性を検定して追跡される。粗製抽出物（Ｓ−１００）は
構成的なＤＮアーゼ活性を含むであろうが、この活性の
大部分はリソースＱカラムクロマトグラフィー等の精製
で除去される。この段階以後、ＣＡＤのＤＮアーゼ活性
が核内でのＤＮＡ断片化活性とともに共精製される。
する。ＣＡＤの精製 Ｆａｓ遺伝子の機能不全突然変異はリンパ節症および巨
脾症を起こす［２］。この突然変異マウスの１種ＭＲＬ
−ｌｐｒのリンパ節から得た細胞質抽出物は高レベルの
ＣＡＤ活性を示し入手し易いので、これをＣＡＤ精製の
出発材料として用いるのが好ましい。しかし、ＣＡＤは
生体内において広汎に発現されているので、他の組織を
用いることもできる。ＣＡＤは精製の間に自己活性化を
起こし、さらにこの活性化型は不安定で容易に失活す
る。そこで粗製抽出物画分をまずカスパーゼ３の阻害
剤、例えばビオチン化−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓ
ｐ−クロロメチルケトン（ｂｉｏ−ＤＥＶＤ−ｃｍｋ）
で処理し、抽出物内のカスパーゼ３を不活化する［１
２］。次にＣＡＤを硫酸アンモニウム分画、ヘパリンー
アガロース−、リソースＱ−、およびリソースＳ−カラ
ムクロマトグラフィーを含む通常の精製操作によって精
製する。ＣＡＤ活性は、核内でＤＮＡ分解を誘導する性
能またはプラスミドＤＮＡを基質に用いるＤＮアーゼ活
性を検定して追跡される。粗製抽出物（Ｓ−１００）は
構成的なＤＮアーゼ活性を含むであろうが、この活性の
大部分はリソースＱカラムクロマトグラフィー等の精製
で除去される。この段階以後、ＣＡＤのＤＮアーゼ活性
が核内でのＤＮＡ断片化活性とともに共精製される。
【００１９】本願と同時係属出願（発明の名称：カスパ
ーゼ活性化ＤＮアーゼの阻害剤：出願日；平成１０年１
２月２５日）において、本発明者らはヒトＤＦＦ４５の
マウス類似体であるＣＡＤ阻害剤、ＩＣＡＤについて記
載している［２２］。ＩＣＡＤは長鎖と短鎖の２種類が
あり、それぞれＩＣＡＤ−ＬおよびＩＣＡＤ−Ｓと表
す。前者のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ
配列は配列番号４および３に示した。後者のそれらは配
列番号６および５に示した。本発明者らはカスパーゼ３
がＩＣＡＤを切断してその阻害作用を不活化することを
見出したことから（実施例、材料の項参照）、ＣＡＤが
ＩＣＡＤと複合体を形成しているか、少なくともＩＣＡ
Ｄに結合できると考えた。この可能性を検討するため
に、部分的に精製したＣＡＤ（リソースＳ画分）をビオ
チン化した。カスパーゼ３処理後に、サンプルを親和性
カラムＧＳＴ−ＤＦＦ４５またはその対照カラム（ＧＳ
Ｔ−ｒｅｖＤＦＦ）に負荷した。この対照カラムはＤＦ
Ｆ４５を逆向きにしてＧＳＴに融合させたものである。
結合したタンパク質をカラムからグルタチオンで溶出
し、溶出液をセイヨウワサビペルオキシダーゼ−複合ス
トレプトアビジンを用いるウェスタンブロッティングで
分析するとＧＳＴ−ＤＦＦ４５親和性カラムから得た溶
出液に分子量４０ｋＤａの特異的バンドが観察された
が、このバンドは対照カラムから得た溶出液にはなかっ
た（図１ａ）。他方、部分精製ＣＡＤをカスパーゼ３で
処理せずにＤＦＦ４５親和性カラムに負荷すると、４０
ｋＤａタンパク質はカラムに保持されなかった。さら
に、カスパーゼ３処理サンプルをＧＳＴ−ＤＦＦ４５親
和性カラムに負荷するとＣＡＤ活性は溶出液にのみ見出
された。これらの結果は４０ｋＤａタンパク質はＣＡＤ
であると思われること、およびそれがヒトのＤＦＦ４５
またはＩＣＡＤに結合できることを示唆する。潜在型Ｃ
ＡＤが上記親和性カラムに結合できないことは、この潜
在型がＣＡＤとＩＣＡＤの複合体であり、またカスパー
ゼ３処理がＩＣＡＤからＣＡＤを解放することを示唆す
る。このＧＳＴ−ＤＦＦ４５はトロンビン切断部位を持
ち［２３］、ＤＦＦ４５はカスパーゼ３によって切断で
きる［２２］。従って、カラムをトロンビンとカスパー
ゼ３の組合せで処理すると４０ｋＤａのタンパク質がカ
ラムから溶出した（図１ｂ参照）。トロンビンとカスパ
ーゼ３によって溶出した４０ｋＤａのサイズはグルタチ
オンによって溶出したものと同一で、分子量４０ｋＤａ
のタンパク質（推測上のＣＡＤ）はカスパーゼ３によっ
ては切断されないことを示唆する。事実、ＣＡＤの一次
配列には推測上のカスパーゼ３切断部位は見出されなか
った（下記および図２参照）。
ーゼ活性化ＤＮアーゼの阻害剤：出願日；平成１０年１
２月２５日）において、本発明者らはヒトＤＦＦ４５の
マウス類似体であるＣＡＤ阻害剤、ＩＣＡＤについて記
載している［２２］。ＩＣＡＤは長鎖と短鎖の２種類が
あり、それぞれＩＣＡＤ−ＬおよびＩＣＡＤ−Ｓと表
す。前者のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ
配列は配列番号４および３に示した。後者のそれらは配
列番号６および５に示した。本発明者らはカスパーゼ３
がＩＣＡＤを切断してその阻害作用を不活化することを
見出したことから（実施例、材料の項参照）、ＣＡＤが
ＩＣＡＤと複合体を形成しているか、少なくともＩＣＡ
Ｄに結合できると考えた。この可能性を検討するため
に、部分的に精製したＣＡＤ（リソースＳ画分）をビオ
チン化した。カスパーゼ３処理後に、サンプルを親和性
カラムＧＳＴ−ＤＦＦ４５またはその対照カラム（ＧＳ
Ｔ−ｒｅｖＤＦＦ）に負荷した。この対照カラムはＤＦ
Ｆ４５を逆向きにしてＧＳＴに融合させたものである。
結合したタンパク質をカラムからグルタチオンで溶出
し、溶出液をセイヨウワサビペルオキシダーゼ−複合ス
トレプトアビジンを用いるウェスタンブロッティングで
分析するとＧＳＴ−ＤＦＦ４５親和性カラムから得た溶
出液に分子量４０ｋＤａの特異的バンドが観察された
が、このバンドは対照カラムから得た溶出液にはなかっ
た（図１ａ）。他方、部分精製ＣＡＤをカスパーゼ３で
処理せずにＤＦＦ４５親和性カラムに負荷すると、４０
ｋＤａタンパク質はカラムに保持されなかった。さら
に、カスパーゼ３処理サンプルをＧＳＴ−ＤＦＦ４５親
和性カラムに負荷するとＣＡＤ活性は溶出液にのみ見出
された。これらの結果は４０ｋＤａタンパク質はＣＡＤ
であると思われること、およびそれがヒトのＤＦＦ４５
またはＩＣＡＤに結合できることを示唆する。潜在型Ｃ
ＡＤが上記親和性カラムに結合できないことは、この潜
在型がＣＡＤとＩＣＡＤの複合体であり、またカスパー
ゼ３処理がＩＣＡＤからＣＡＤを解放することを示唆す
る。このＧＳＴ−ＤＦＦ４５はトロンビン切断部位を持
ち［２３］、ＤＦＦ４５はカスパーゼ３によって切断で
きる［２２］。従って、カラムをトロンビンとカスパー
ゼ３の組合せで処理すると４０ｋＤａのタンパク質がカ
ラムから溶出した（図１ｂ参照）。トロンビンとカスパ
ーゼ３によって溶出した４０ｋＤａのサイズはグルタチ
オンによって溶出したものと同一で、分子量４０ｋＤａ
のタンパク質（推測上のＣＡＤ）はカスパーゼ３によっ
ては切断されないことを示唆する。事実、ＣＡＤの一次
配列には推測上のカスパーゼ３切断部位は見出されなか
った（下記および図２参照）。
【００２０】タンパク質配列分析に十分な量の精製ＣＡ
Ｄを調製するには、リソースＳ画分をカスパーゼ３で活
性化してＧＳＴ−ＤＦＦ４５親和性カラムに負荷する。
カスパーゼ３とトロンビンの組合せによる溶出はグルタ
チオンによる溶出よりも効率的なので、このカラムをト
ロンビンとカスパーゼ３で処理する。溶出液は銀染色で
分析すると（図１ｂ）、４０ｋＤａにバンドを含んでい
る。この親和性カラムから得られる溶出液は強いＣＡＤ
活性を示すはずである。ＣＡＤ標本をカスパーゼ３で処
理せずに親和性カラムに負荷すると、溶出液中には４０
ｋＤａタンパク質もＣＡＤ活性も検出されい。よって、
この４０ｋＤａタンパク質がＣＡＤであると結論され
る。
Ｄを調製するには、リソースＳ画分をカスパーゼ３で活
性化してＧＳＴ−ＤＦＦ４５親和性カラムに負荷する。
カスパーゼ３とトロンビンの組合せによる溶出はグルタ
チオンによる溶出よりも効率的なので、このカラムをト
ロンビンとカスパーゼ３で処理する。溶出液は銀染色で
分析すると（図１ｂ）、４０ｋＤａにバンドを含んでい
る。この親和性カラムから得られる溶出液は強いＣＡＤ
活性を示すはずである。ＣＡＤ標本をカスパーゼ３で処
理せずに親和性カラムに負荷すると、溶出液中には４０
ｋＤａタンパク質もＣＡＤ活性も検出されい。よって、
この４０ｋＤａタンパク質がＣＡＤであると結論され
る。
【００２１】ＣＡＤｃＤＮＡの分子クローニング 分子量４０ｋＤａの推測上のＣＡＤタンパク質をアミノ
酸配列分析して幾つかのペプチド断片を得る。それに基
づき縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計し、マウ
スＴ細胞リンパ腫ｃＤＮＡライブラリーからのＰＣＲ増
幅を行う。次いで、得られたＰＣＲ産物をコロニーハイ
ブリダイゼーションによるｃＤＮＡライブラリーを検索
するためのプローブに用いる。このプローブとハイブリ
ッドを形成するクローンを入手し、その中で完全長コー
ド配列（長さ１.６ｋｂ）を有する１個をヌクレオチド
配列分析によって特性解析する。
酸配列分析して幾つかのペプチド断片を得る。それに基
づき縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計し、マウ
スＴ細胞リンパ腫ｃＤＮＡライブラリーからのＰＣＲ増
幅を行う。次いで、得られたＰＣＲ産物をコロニーハイ
ブリダイゼーションによるｃＤＮＡライブラリーを検索
するためのプローブに用いる。このプローブとハイブリ
ッドを形成するクローンを入手し、その中で完全長コー
ド配列（長さ１.６ｋｂ）を有する１個をヌクレオチド
配列分析によって特性解析する。
【００２２】ＣＯＳ細胞および無細胞系でのＣＡＤ発現 クローニングしたＣＡＤｃＤＮＡがＣＡＤ活性を持つタ
ンパク質をコードすることを確認するため、ＣＡＤ発現
プラスミド（ｐＥＦ−ＣＡＤ）をＣＯＳ細胞に導入し、
細胞抽出物を調製した。図４ａに示す通り、未処理抽出
物はＤＮＡ分解を誘導しなかったが、抽出物をカスパー
ゼ３処理するとＣＡＤ活性を示した。しかしその活性は
空のベクターを遺伝子移入した細胞よりも僅かに（４
倍）高い程度であった。ＣＡＤ発現レベルが低かったこ
とから、ＩＣＡＤの役割に注目し、ＣＡＤをＩＣＡＤと
ともに共発現させた。すると、抽出物は非常に強いＣＡ
Ｄ活性を示した。図４ｂに示す通り、共発現させた細胞
内のＣＡＤ活性は対照細胞よりも約１０００倍強力であ
った。これらの結果はクローニングされたｃＤＮＡは本
質的にＤＮアーゼ活性を持つＣＡＤをコードすることを
示す。
ンパク質をコードすることを確認するため、ＣＡＤ発現
プラスミド（ｐＥＦ−ＣＡＤ）をＣＯＳ細胞に導入し、
細胞抽出物を調製した。図４ａに示す通り、未処理抽出
物はＤＮＡ分解を誘導しなかったが、抽出物をカスパー
ゼ３処理するとＣＡＤ活性を示した。しかしその活性は
空のベクターを遺伝子移入した細胞よりも僅かに（４
倍）高い程度であった。ＣＡＤ発現レベルが低かったこ
とから、ＩＣＡＤの役割に注目し、ＣＡＤをＩＣＡＤと
ともに共発現させた。すると、抽出物は非常に強いＣＡ
Ｄ活性を示した。図４ｂに示す通り、共発現させた細胞
内のＣＡＤ活性は対照細胞よりも約１０００倍強力であ
った。これらの結果はクローニングされたｃＤＮＡは本
質的にＤＮアーゼ活性を持つＣＡＤをコードすることを
示す。
【００２３】ＣＡＤの発現におけるＩＣＡＤの役割を検
討する。転写翻訳共役系を用いる無細胞系において組換
えＧＳＴ−ＩＣＡＤタンパク質の存在または非存在下に
ＣＡＤタンパク質を合成させる（図５）。結果、どちら
の場合もＣＡＤは分子量４０ｋＤａのタンパク質として
合成されるが（図５ａ）、ＩＣＡＤ非存在下に合成され
たＣＡＤはＣＡＤ活性を全く示さず、ＩＣＡＤ存在下に
合成されたＣＡＤはプラスミドＤＮＡを消化した（図５
ｂ）。また、ＣＡＤ合成後の反応混合物にＩＣＡＤを加
えても、混合物にはＣＡＤ活性は見出せない。これらの
結果は機能性ＣＡＤはＩＣＡＤの存在下でのみ合成され
ることを示し、新たに合成されたＣＡＤはＩＣＡＤと複
合体を形成していることを示唆する。
討する。転写翻訳共役系を用いる無細胞系において組換
えＧＳＴ−ＩＣＡＤタンパク質の存在または非存在下に
ＣＡＤタンパク質を合成させる（図５）。結果、どちら
の場合もＣＡＤは分子量４０ｋＤａのタンパク質として
合成されるが（図５ａ）、ＩＣＡＤ非存在下に合成され
たＣＡＤはＣＡＤ活性を全く示さず、ＩＣＡＤ存在下に
合成されたＣＡＤはプラスミドＤＮＡを消化した（図５
ｂ）。また、ＣＡＤ合成後の反応混合物にＩＣＡＤを加
えても、混合物にはＣＡＤ活性は見出せない。これらの
結果は機能性ＣＡＤはＩＣＡＤの存在下でのみ合成され
ることを示し、新たに合成されたＣＡＤはＩＣＡＤと複
合体を形成していることを示唆する。
【００２４】以下に、図面について詳細に説明する。図
１は、４０ｋＤａタンパク質としてＣＡＤを確認した電
気泳動写真の模写図である。ａ ．部分精製ＣＡＤ（リソースＳ画分、０．１ｍｇ）を
ビオチン−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（ピ
アース社）でビオチン化し、６μｇ／ｍＬのカスパーゼ
３の存在下（レーン２および４）または非存在下（レー
ン１および３）に４℃で一夜処理し、次に５μＭ−ｂｉ
ｏ−ＤＥＶＤ−ｃｍｋとともに４℃で３０分間インキュ
ベーションしてカスパーゼ３を不活化した。サンプル
（タンパク質１６μｇ）をＧＳＴ−ＤＦＦ４５親和性ビ
ーズ（容積１０μＬ）（レーン１および２）または対照
ＧＳＴ−ｒｅｖＤＦＦ親和性ビーズ（レーン３および
４）に負荷した。ビーズを５ｍＭ−グルタチオンを含む
緩衝液Ｄ２０μＬとともに４℃で２時間インキュベーシ
ョンした。ビーズから放出されたタンパク質を４〜２０
％勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析
し、ＰＶＤＦ膜に写した。膜をセイヨウワサビ過酸化酵
素複合ストレプトアビジンでプローブし、ビオチンスト
レプトアビジン複合体を化学発光システム（デュポンＮ
ＥＮ社、ルネッサンス）によって可視化した。分子量マ
ーカー（レインボウマーカー、アマーシャム社）はｋＤ
単位で左側に示した。
１は、４０ｋＤａタンパク質としてＣＡＤを確認した電
気泳動写真の模写図である。ａ ．部分精製ＣＡＤ（リソースＳ画分、０．１ｍｇ）を
ビオチン−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（ピ
アース社）でビオチン化し、６μｇ／ｍＬのカスパーゼ
３の存在下（レーン２および４）または非存在下（レー
ン１および３）に４℃で一夜処理し、次に５μＭ−ｂｉ
ｏ−ＤＥＶＤ−ｃｍｋとともに４℃で３０分間インキュ
ベーションしてカスパーゼ３を不活化した。サンプル
（タンパク質１６μｇ）をＧＳＴ−ＤＦＦ４５親和性ビ
ーズ（容積１０μＬ）（レーン１および２）または対照
ＧＳＴ−ｒｅｖＤＦＦ親和性ビーズ（レーン３および
４）に負荷した。ビーズを５ｍＭ−グルタチオンを含む
緩衝液Ｄ２０μＬとともに４℃で２時間インキュベーシ
ョンした。ビーズから放出されたタンパク質を４〜２０
％勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析
し、ＰＶＤＦ膜に写した。膜をセイヨウワサビ過酸化酵
素複合ストレプトアビジンでプローブし、ビオチンスト
レプトアビジン複合体を化学発光システム（デュポンＮ
ＥＮ社、ルネッサンス）によって可視化した。分子量マ
ーカー（レインボウマーカー、アマーシャム社）はｋＤ
単位で左側に示した。
【００２５】ｂ．リソースＳ画分（タンパク質各２ｍ
ｇ）を２．６μｇのカスパーゼ３の存在下（レーン２）
または非存在下（レーン１）に４℃で一夜インキュベー
ションした。カスパーゼ３をｂｉｏ−ＤＥＶＤ−ｃｍｋ
で不活化後、サンプルをＧＳＴ−ＤＦＦ４５親和性カラ
ムに負荷した。親和性カラムから得た溶出液（１００μ
Ｌ）の所定量（５μＬ）を１０〜２０％勾配ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によって分析し、タンパク質を銀
染色によって可視化した。緩衝液Ｄを同じ操作：すなわ
ち、ＧＳＴ−ＤＦＦ４５親和性カラムへの結合およびカ
スパーゼ３およびトロンビンによる溶出、に付した。こ
の操作によって得られた溶出液の銀染色をレーン３に示
す。このレーンに見られるタンパク質は大部分がカスパ
ーゼ３、トロンビンおよびＧＳＴ−ＤＦＦ４５カラムか
ら放出されたタンパク質である。マーカータンパク質の
分子量はｋＤ単位で左側に示した。推測上のＣＡＤ、約
４０ｋＤａのタンパク質を矢印で示す。ｃ ．マウス肝臓核（レーン１および２）またはプラスミ
ドＤＮＡ（レーン３および４）を使用して、ｂで得られ
た親和性カラムから得た溶出液（１００μＬ）中の１μ
Ｌ量のＣＡＤ活性を測定した。カスパーゼ３処理サンプ
ル、レーン１および３、をＧＳＴ−ＤＦＦ４５親和性カ
ラムに負荷した。レーン２および４ではサンプルをカス
パーゼ３処理せずに親和性カラムに負荷した。
ｇ）を２．６μｇのカスパーゼ３の存在下（レーン２）
または非存在下（レーン１）に４℃で一夜インキュベー
ションした。カスパーゼ３をｂｉｏ−ＤＥＶＤ−ｃｍｋ
で不活化後、サンプルをＧＳＴ−ＤＦＦ４５親和性カラ
ムに負荷した。親和性カラムから得た溶出液（１００μ
Ｌ）の所定量（５μＬ）を１０〜２０％勾配ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によって分析し、タンパク質を銀
染色によって可視化した。緩衝液Ｄを同じ操作：すなわ
ち、ＧＳＴ−ＤＦＦ４５親和性カラムへの結合およびカ
スパーゼ３およびトロンビンによる溶出、に付した。こ
の操作によって得られた溶出液の銀染色をレーン３に示
す。このレーンに見られるタンパク質は大部分がカスパ
ーゼ３、トロンビンおよびＧＳＴ−ＤＦＦ４５カラムか
ら放出されたタンパク質である。マーカータンパク質の
分子量はｋＤ単位で左側に示した。推測上のＣＡＤ、約
４０ｋＤａのタンパク質を矢印で示す。ｃ ．マウス肝臓核（レーン１および２）またはプラスミ
ドＤＮＡ（レーン３および４）を使用して、ｂで得られ
た親和性カラムから得た溶出液（１００μＬ）中の１μ
Ｌ量のＣＡＤ活性を測定した。カスパーゼ３処理サンプ
ル、レーン１および３、をＧＳＴ−ＤＦＦ４５親和性カ
ラムに負荷した。レーン２および４ではサンプルをカス
パーゼ３処理せずに親和性カラムに負荷した。
【００２６】図２は、ｃＤＮＡ配列から予測したマウス
ＣＡＤの１文字表示によるアミノ酸配列である。各行の
上側の数字はアミノ酸の位置を示す。アミノ酸はＭｅｔ
−１から始めて番号付けしてある。精製ＣＡＤのＮ−末
端はＡｌａ−３に始まる。精製ＣＡＤから得られたペプ
チド５種に下線を付した。Ｃ末端にある推測上の核局在
化シグナルを二重下線で示した。
ＣＡＤの１文字表示によるアミノ酸配列である。各行の
上側の数字はアミノ酸の位置を示す。アミノ酸はＭｅｔ
−１から始めて番号付けしてある。精製ＣＡＤのＮ−末
端はＡｌａ−３に始まる。精製ＣＡＤから得られたペプ
チド５種に下線を付した。Ｃ末端にある推測上の核局在
化シグナルを二重下線で示した。
【００２７】図３は、ＣＡＤｍＲＮＡの組織分布を示
す。ポリ（Ａ）ＲＮＡは記載した組織からＱｕｉｃｋ・
Ｐｒｅｐ（商標）ｍｉｃｒｏ・ｍＲＮＡ調製キット（フ
ァルマシア社）を用いて調製した。ＲＮＡサンプル（各
２μｇ）を電気泳動に付し、報告［４０］通りにノーザ
ンハイブリダイゼーションによって分析した。32Ｐ標識
したマウスＣＡＤｃＤＮＡ（上図）またはヒトＥＦ−１
αｃＤＮＡ（下図）をプローブに用いた。
す。ポリ（Ａ）ＲＮＡは記載した組織からＱｕｉｃｋ・
Ｐｒｅｐ（商標）ｍｉｃｒｏ・ｍＲＮＡ調製キット（フ
ァルマシア社）を用いて調製した。ＲＮＡサンプル（各
２μｇ）を電気泳動に付し、報告［４０］通りにノーザ
ンハイブリダイゼーションによって分析した。32Ｐ標識
したマウスＣＡＤｃＤＮＡ（上図）またはヒトＥＦ−１
αｃＤＮＡ（下図）をプローブに用いた。
【００２８】図４は、ＣＯＳ細胞中でのマウスＣＡＤの
発現を示す電気泳動写真の模写図である。ａ ．ＣＯＳ細胞にｐＥＦ−ＢＯＳ（レーン１および２）
(MizushimaおよびNagata、Nucleic Acids Res.18,5322
(1990))、ｐＥＦ−ＣＡＤ（レーン３および４）、また
はｐＥＦ−ＩＣＡＤ−Ｌ（レーン５および６）(参考例
１参照）を遺伝子移入するか、またはｐＥＦ−ＣＡＤと
ｐＥＦ−ＩＣＡＤ−Ｌを共遺伝子移入（レーン７および
８）して、実施例に記載した通りに細胞抽出物を調製し
た。７．５μｇ／ｍＬのカスパーゼ３の非存在下（レー
ン１、３、５および７）または存在下（レーン２、４、
６および８）に核（上図）またはプラスミドＤＮＡ（下
図）を用いて抽出物の所定量（タンパク質８μｇ）をＣ
ＡＤ作用について検定した。ｂ ．ｐＥＦ−ＢＯＳ（レーン１〜４）、ｐＥＦ−ＣＡＤ
（レーン５〜８）またはｐＥＦ−ＩＣＡＤ−Ｌ（レーン
９〜１２）を遺伝子移入したか、またはｐＥＦ−ＣＡＤ
とｐＥＦ−ＩＣＡＤ−Ｌを共遺伝子移入（レーン１３〜
２２）したＣＯＳ細胞から細胞抽出物を調製した。各抽
出物からの所定量を７．５μｇ／ｍＬのカスパーゼ３の
存在下にマウス肝臓核（上図）またはプラスミドＤＮＡ
（下図）を用いてＣＡＤ活性について検定した。使用し
たタンパク質の量は各レーンの上側に記載した。
発現を示す電気泳動写真の模写図である。ａ ．ＣＯＳ細胞にｐＥＦ−ＢＯＳ（レーン１および２）
(MizushimaおよびNagata、Nucleic Acids Res.18,5322
(1990))、ｐＥＦ−ＣＡＤ（レーン３および４）、また
はｐＥＦ−ＩＣＡＤ−Ｌ（レーン５および６）(参考例
１参照）を遺伝子移入するか、またはｐＥＦ−ＣＡＤと
ｐＥＦ−ＩＣＡＤ−Ｌを共遺伝子移入（レーン７および
８）して、実施例に記載した通りに細胞抽出物を調製し
た。７．５μｇ／ｍＬのカスパーゼ３の非存在下（レー
ン１、３、５および７）または存在下（レーン２、４、
６および８）に核（上図）またはプラスミドＤＮＡ（下
図）を用いて抽出物の所定量（タンパク質８μｇ）をＣ
ＡＤ作用について検定した。ｂ ．ｐＥＦ−ＢＯＳ（レーン１〜４）、ｐＥＦ−ＣＡＤ
（レーン５〜８）またはｐＥＦ−ＩＣＡＤ−Ｌ（レーン
９〜１２）を遺伝子移入したか、またはｐＥＦ−ＣＡＤ
とｐＥＦ−ＩＣＡＤ−Ｌを共遺伝子移入（レーン１３〜
２２）したＣＯＳ細胞から細胞抽出物を調製した。各抽
出物からの所定量を７．５μｇ／ｍＬのカスパーゼ３の
存在下にマウス肝臓核（上図）またはプラスミドＤＮＡ
（下図）を用いてＣＡＤ活性について検定した。使用し
たタンパク質の量は各レーンの上側に記載した。
【００２９】図５は、無細胞系でのマウスＣＡＤの発現
を示す電気泳動写真の模写図である。ａ ．ｐｃＤＮＡ−ＣＡＤ（レーン３および４）または空
ベクター（レーン１および２）を最終容積５０μＬ中で
35Ｓ−Ｍｅｔの存在下に試験管内転写翻訳に付した。レ
ーン２および４の反応混合物は１６０ｎｇのＧＳＴ−Ｉ
ＣＡＤ−Ｌを含む。反応後、５μＬ量を１０〜２０％勾
配ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析し、続
いてオートラジオグラフィーに付した。標準タンパク質
の分子量はｋＤ単位で左側に示した。ｂ ．マウスＣＡＤを最終容積５０μＬ中、１６０ｎｇの
ＧＳＴ−ＩＣＡＤ−Ｌ非存在下（レーン１、２、５、お
よび６）または存在下（レーン３、４、７、および８）
に試験管内転写翻訳系で合成した。３μＬ量を用い、１
５０ｎｇのカスパーゼ３非存在下（レーン１、３、５、
および７）または存在下（レーン２、４、６および８）
に、核（レーン１〜４）またはプラスミドＤＮＡ（レー
ン５〜８）でＣＡＤ活性を測定した。
を示す電気泳動写真の模写図である。ａ ．ｐｃＤＮＡ−ＣＡＤ（レーン３および４）または空
ベクター（レーン１および２）を最終容積５０μＬ中で
35Ｓ−Ｍｅｔの存在下に試験管内転写翻訳に付した。レ
ーン２および４の反応混合物は１６０ｎｇのＧＳＴ−Ｉ
ＣＡＤ−Ｌを含む。反応後、５μＬ量を１０〜２０％勾
配ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析し、続
いてオートラジオグラフィーに付した。標準タンパク質
の分子量はｋＤ単位で左側に示した。ｂ ．マウスＣＡＤを最終容積５０μＬ中、１６０ｎｇの
ＧＳＴ−ＩＣＡＤ−Ｌ非存在下（レーン１、２、５、お
よび６）または存在下（レーン３、４、７、および８）
に試験管内転写翻訳系で合成した。３μＬ量を用い、１
５０ｎｇのカスパーゼ３非存在下（レーン１、３、５、
および７）または存在下（レーン２、４、６および８）
に、核（レーン１〜４）またはプラスミドＤＮＡ（レー
ン５〜８）でＣＡＤ活性を測定した。
【００３０】図６は、ＣＡＤのＩＣＡＤ−Ｌへの結合を
示す電気泳動写真の模写図である。ａ ．マウスＣＡＤｃＤＮＡ（レーン３および４）または
空ベクター（レーン１および２）を最終容積５０μＬ
中、35Ｓ−Ｍｅｔの存在下に試験管内転写翻訳に付し
た。レーン２および４の反応混合物には１６０ｎｇのＧ
ＳＴ−ＩＣＡＤ−Ｌを含めた。ＩＣＡＤ−Ｌを抗ＦＬＡ
Ｇ抗体（コダック社、Ｍ２抗体）により、免疫沈降し、
沈降物を１５μＬのサンプル緩衝液中で９０℃に５分間
加熱した。溶出したタンパク質を１０〜２０％勾配ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動し、標識されたタンパク質
をオートラジオグラフィーで可視化した。標準タンパク
質の分子量はｋＤ単位で左側に示した。ｂ ．マウスＣＡＤを１６０ｎｇのＧＳＴ−ＩＣＡＤ−Ｌ
非存在下（レーン１および２）または存在下（レーン３
および４）に試験管内転写翻訳系で合成した。ＩＣＡＤ
−Ｌを上記抗ＦＬＡＧ抗体（レーン２、４、６および
８）または対照抗体（レーン１、３、５および７）とと
もに免疫沈降させ、沈降物を１０μＬの緩衝液Ｄに懸濁
した。３μＬ量を用いて１５０ｎｇのカスパーゼ３存在
下に核（レーン１〜４）またはプラスミドＤＮＡ（レー
ン５〜８）でＣＡＤ活性を測定した。
示す電気泳動写真の模写図である。ａ ．マウスＣＡＤｃＤＮＡ（レーン３および４）または
空ベクター（レーン１および２）を最終容積５０μＬ
中、35Ｓ−Ｍｅｔの存在下に試験管内転写翻訳に付し
た。レーン２および４の反応混合物には１６０ｎｇのＧ
ＳＴ−ＩＣＡＤ−Ｌを含めた。ＩＣＡＤ−Ｌを抗ＦＬＡ
Ｇ抗体（コダック社、Ｍ２抗体）により、免疫沈降し、
沈降物を１５μＬのサンプル緩衝液中で９０℃に５分間
加熱した。溶出したタンパク質を１０〜２０％勾配ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動し、標識されたタンパク質
をオートラジオグラフィーで可視化した。標準タンパク
質の分子量はｋＤ単位で左側に示した。ｂ ．マウスＣＡＤを１６０ｎｇのＧＳＴ−ＩＣＡＤ−Ｌ
非存在下（レーン１および２）または存在下（レーン３
および４）に試験管内転写翻訳系で合成した。ＩＣＡＤ
−Ｌを上記抗ＦＬＡＧ抗体（レーン２、４、６および
８）または対照抗体（レーン１、３、５および７）とと
もに免疫沈降させ、沈降物を１０μＬの緩衝液Ｄに懸濁
した。３μＬ量を用いて１５０ｎｇのカスパーゼ３存在
下に核（レーン１〜４）またはプラスミドＤＮＡ（レー
ン５〜８）でＣＡＤ活性を測定した。
【００３１】図７は、アポトーシスにおけるＣＡＤおよ
びＩＣＡＤの機能を示す模式図である。ＣＡＤタンパク
質が合成される時、ＩＣＡＤはＣＡＤの新生鎖に結合し
てその正しい折り畳みを可能にするのであろう。ＩＣＡ
ＤはＣＡＤと複合体を形成したまま存続してＣＡＤのＤ
Ｎアーゼ活性を阻害し、また核局在化シグナルを遮蔽し
てＣＡＤを細胞質内に留めるのであろう。アポトーシス
刺激がカスパーゼを活性化するとＩＣＡＤが切断され、
放出されたＣＡＤは核に入ることができ、そこで染色体
ＤＮＡを分解する。
びＩＣＡＤの機能を示す模式図である。ＣＡＤタンパク
質が合成される時、ＩＣＡＤはＣＡＤの新生鎖に結合し
てその正しい折り畳みを可能にするのであろう。ＩＣＡ
ＤはＣＡＤと複合体を形成したまま存続してＣＡＤのＤ
Ｎアーゼ活性を阻害し、また核局在化シグナルを遮蔽し
てＣＡＤを細胞質内に留めるのであろう。アポトーシス
刺激がカスパーゼを活性化するとＩＣＡＤが切断され、
放出されたＣＡＤは核に入ることができ、そこで染色体
ＤＮＡを分解する。
【００３２】
【実施例】以下の実施例において、本発明をさらに詳細
に説明するが、本発明の範囲はこれらによって何ら限定
されるものではない。材料 組換えカスパーゼ３は文献記載の通りにＥ．ｃｏｌｉで
生産して精製した［３７］。ビオチン化−Ａｓｐ−Ｇｌ
ｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−クロロメチルケトン（以下、ｂｉ
ｏ−ＤＥＶＤ−ｃｍｋという）はペプチド研究所に注文
して合成した。タンパク質精製に使用した充填カラムは
全てファルマシア社から入手した。
に説明するが、本発明の範囲はこれらによって何ら限定
されるものではない。材料 組換えカスパーゼ３は文献記載の通りにＥ．ｃｏｌｉで
生産して精製した［３７］。ビオチン化−Ａｓｐ−Ｇｌ
ｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−クロロメチルケトン（以下、ｂｉ
ｏ−ＤＥＶＤ−ｃｍｋという）はペプチド研究所に注文
して合成した。タンパク質精製に使用した充填カラムは
全てファルマシア社から入手した。
【００３３】ＣＡＤ検定法 ＣＡＤ活性はマウス肝臓核を用いるＤＮＡ断片化検定
［２１］により、またはＤＮアーゼ活性検定により測定
した。略述すれば、アポトーシス検定のためには核（２
×１０5個）をサンプルとともに１５０ｎｇのカスパー
ゼ３を含む２０μＬの緩衝液Ａ（１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ
−ＫＯＨ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ−ＮａＣｌ、２０％
（ｖ／ｖ）グリセリン、４０ｍＭ−β−グリセロ燐酸、
２ｍＭ−ＭｇＣｌ２、５ｍＭ−ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ−
（ｐ−アミノフェニル）メタンスルホニルフルオリド
（ＡＰＭＳＦ）、５ｍＭ−ＤＴＴ、および１ｍｇ／ｍＬ
ウシ血清アルブミン）中で３０℃で２時間インキュベー
ションした。反応後、ＤＮＡを核から抽出し、１．５％
アガロースゲル電気泳動によって分析した。場合によっ
ては、放出されたＤＮＡ／ヒストン複合体をベーリンガ
ーマンハイム社から入手したキットを用いるＥＬＩＳＡ
システムで定量した。ＤＮアーゼの検定には、前記反応
混合物の核をプラスミドＤＮＡ１μｇと置き換えた。
［２１］により、またはＤＮアーゼ活性検定により測定
した。略述すれば、アポトーシス検定のためには核（２
×１０5個）をサンプルとともに１５０ｎｇのカスパー
ゼ３を含む２０μＬの緩衝液Ａ（１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ
−ＫＯＨ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ−ＮａＣｌ、２０％
（ｖ／ｖ）グリセリン、４０ｍＭ−β−グリセロ燐酸、
２ｍＭ−ＭｇＣｌ２、５ｍＭ−ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ−
（ｐ−アミノフェニル）メタンスルホニルフルオリド
（ＡＰＭＳＦ）、５ｍＭ−ＤＴＴ、および１ｍｇ／ｍＬ
ウシ血清アルブミン）中で３０℃で２時間インキュベー
ションした。反応後、ＤＮＡを核から抽出し、１．５％
アガロースゲル電気泳動によって分析した。場合によっ
ては、放出されたＤＮＡ／ヒストン複合体をベーリンガ
ーマンハイム社から入手したキットを用いるＥＬＩＳＡ
システムで定量した。ＤＮアーゼの検定には、前記反応
混合物の核をプラスミドＤＮＡ１μｇと置き換えた。
【００３４】実施例１：ＣＡＤの精製および配列分析 ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウス（４〜６月齢）をＳＬＣ
から購入した。リンパ節（約７０．４ｇ）をマウス１４
匹から調製し、抽出緩衝液（１２．５ｍＭ−ＰＩＰＥＳ
−ＮａＯＨ、ｐＨ７．０、７５ｍＭ−ＨＥＰＥＳ−ＫＯ
Ｈ、ｐＨ７．０、１２．５ｍＭ−ＫＣｌ、３７．５ｍＭ
−ＮａＣｌ、２ｍＭ−ＭｇＣｌ２、５ｍＭ−ＥＧＴＡ、
１ｍＭ−ＤＴＴ、５ｍＭ−サイトカラシンＢ、１ｍＭ−
フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、リ
ューペプチン１μｇ／ｍＬ、ペプスタチンＡ１μｇ／ｍ
Ｌおよび３０ｍＭ−β−グリセロ燐酸）２４４ｍＬに懸
濁した。細胞を凍結および解凍の３周期で崩壊し、１０
０，０００×ｇで２時間遠心分離した。Ｓ−１００画分
（タンパク質３１５０ｍｇ）を０．１ｍＭのｂｉｏ−Ｄ
ＥＶＤ−ｃｍｋとともに４℃で３０分間インキュベーシ
ョンして、カスパーゼ３を不活化した。次にこのサンプ
ルを２５％から５０％飽和硫酸アンモニウムで分画し、
緩衝液Ｂ（１０ｍＭ−トリスＨＣｌ、ｐＨ８．９、５０
ｍＭ−ＮａＣｌ、２０％（ｖ／ｖ）グリセリン、１ｍＭ
−ＤＴＴ、０．１ｍＭ−ＡＰＭＳＦ、および０．１５％
ＣＨＡＰＳ）に対して透析し、緩衝液Ｂと平衡させたＨ
ｉＴｒａｐ−Ｈｅｐａｒｉｎ２０ｍＬのカラムに負荷し
た。１５０ｍＭ−ＮａＣｌを含む緩衝液Ｂで洗った後、
タンパク質（タンパク質８９．６ｍｇ）を５００ｍＭ−
ＮａＣｌを含む緩衝液Ｂで溶出し、緩衝液Ｂと平衡させ
たＰＤ−１０カラムを通した。このサンプルを緩衝液Ｂ
と平衡させた６ｍＬのリソースＱカラムに負荷し、保持
されたタンパク質を１５０ｍＭから４００ｍＭまでの直
線ＮａＣｌ勾配で溶出した。活性画分（タンパク質１
６．４ｍｇ）を集め、緩衝液Ｃ（２０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ
−ＫＯＨ、ｐＨ７．０、２０％（ｖ／ｖ）グリセリン、
０．１ｍＭ−ＡＰＭＳＦ、１ｍＭ−ＤＴＴおよび０．１
５％ＣＨＡＰＳ）と平衡させたＰＤ−１０カラムを通し
た。このサンプルを緩衝液Ｃと平衡させたリソースＳカ
ラム（容積１ｍＬ）に負荷し、保持されたタンパク質を
０ｍＭから５００ｍＭまでの直線ＮａＣｌ勾配１５ｍＬ
で溶出した。活性画分（タンパク質２ｍｇ）を集め、緩
衝液Ｄ（１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．０、
５０ｍＭ−ＮａＣｌ、２０％（ｖ／ｖ）グリセリン、４
０ｍＭ−β−グリセロ燐酸、２ｍＭ−ＥＧＴＡ、０．１
ｍＭ−ＡＰＭＳＦ、１ｍＭ−ＤＴＴ、および０．０２％
トゥイーン２０）と平衡させたＰＤ−１０カラムを通し
た。このサンプルを２．６μｇのカスパーゼ３とともに
４℃で一夜インキュベーションし、次に５μＭ−ｂｉｏ
−ＤＥＶＤ−ｃｍｋとともに４℃で３０分間インキュベ
ーションしてカスパーゼ３を不活化した。混合物にＧＳ
Ｔ−ＤＦＦ４５親和性ビーズ（容積２５μＬ）を加え、
これを次に４℃に２時間放置した。緩衝液Ｄで洗った
後、ビーズを５０μＬの緩衝液Ｄに懸濁した。この懸濁
液に２μｇのカスパーゼ３および６μｇのトロンビンを
加え、室温で一夜および３７℃で１時間で順次インキュ
ベーションした。このビーズを遠心分離して除き、ビー
ズから放出されたタンパク質を集めた。
から購入した。リンパ節（約７０．４ｇ）をマウス１４
匹から調製し、抽出緩衝液（１２．５ｍＭ−ＰＩＰＥＳ
−ＮａＯＨ、ｐＨ７．０、７５ｍＭ−ＨＥＰＥＳ−ＫＯ
Ｈ、ｐＨ７．０、１２．５ｍＭ−ＫＣｌ、３７．５ｍＭ
−ＮａＣｌ、２ｍＭ−ＭｇＣｌ２、５ｍＭ−ＥＧＴＡ、
１ｍＭ−ＤＴＴ、５ｍＭ−サイトカラシンＢ、１ｍＭ−
フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、リ
ューペプチン１μｇ／ｍＬ、ペプスタチンＡ１μｇ／ｍ
Ｌおよび３０ｍＭ−β−グリセロ燐酸）２４４ｍＬに懸
濁した。細胞を凍結および解凍の３周期で崩壊し、１０
０，０００×ｇで２時間遠心分離した。Ｓ−１００画分
（タンパク質３１５０ｍｇ）を０．１ｍＭのｂｉｏ−Ｄ
ＥＶＤ−ｃｍｋとともに４℃で３０分間インキュベーシ
ョンして、カスパーゼ３を不活化した。次にこのサンプ
ルを２５％から５０％飽和硫酸アンモニウムで分画し、
緩衝液Ｂ（１０ｍＭ−トリスＨＣｌ、ｐＨ８．９、５０
ｍＭ−ＮａＣｌ、２０％（ｖ／ｖ）グリセリン、１ｍＭ
−ＤＴＴ、０．１ｍＭ−ＡＰＭＳＦ、および０．１５％
ＣＨＡＰＳ）に対して透析し、緩衝液Ｂと平衡させたＨ
ｉＴｒａｐ−Ｈｅｐａｒｉｎ２０ｍＬのカラムに負荷し
た。１５０ｍＭ−ＮａＣｌを含む緩衝液Ｂで洗った後、
タンパク質（タンパク質８９．６ｍｇ）を５００ｍＭ−
ＮａＣｌを含む緩衝液Ｂで溶出し、緩衝液Ｂと平衡させ
たＰＤ−１０カラムを通した。このサンプルを緩衝液Ｂ
と平衡させた６ｍＬのリソースＱカラムに負荷し、保持
されたタンパク質を１５０ｍＭから４００ｍＭまでの直
線ＮａＣｌ勾配で溶出した。活性画分（タンパク質１
６．４ｍｇ）を集め、緩衝液Ｃ（２０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ
−ＫＯＨ、ｐＨ７．０、２０％（ｖ／ｖ）グリセリン、
０．１ｍＭ−ＡＰＭＳＦ、１ｍＭ−ＤＴＴおよび０．１
５％ＣＨＡＰＳ）と平衡させたＰＤ−１０カラムを通し
た。このサンプルを緩衝液Ｃと平衡させたリソースＳカ
ラム（容積１ｍＬ）に負荷し、保持されたタンパク質を
０ｍＭから５００ｍＭまでの直線ＮａＣｌ勾配１５ｍＬ
で溶出した。活性画分（タンパク質２ｍｇ）を集め、緩
衝液Ｄ（１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．０、
５０ｍＭ−ＮａＣｌ、２０％（ｖ／ｖ）グリセリン、４
０ｍＭ−β−グリセロ燐酸、２ｍＭ−ＥＧＴＡ、０．１
ｍＭ−ＡＰＭＳＦ、１ｍＭ−ＤＴＴ、および０．０２％
トゥイーン２０）と平衡させたＰＤ−１０カラムを通し
た。このサンプルを２．６μｇのカスパーゼ３とともに
４℃で一夜インキュベーションし、次に５μＭ−ｂｉｏ
−ＤＥＶＤ−ｃｍｋとともに４℃で３０分間インキュベ
ーションしてカスパーゼ３を不活化した。混合物にＧＳ
Ｔ−ＤＦＦ４５親和性ビーズ（容積２５μＬ）を加え、
これを次に４℃に２時間放置した。緩衝液Ｄで洗った
後、ビーズを５０μＬの緩衝液Ｄに懸濁した。この懸濁
液に２μｇのカスパーゼ３および６μｇのトロンビンを
加え、室温で一夜および３７℃で１時間で順次インキュ
ベーションした。このビーズを遠心分離して除き、ビー
ズから放出されたタンパク質を集めた。
【００３５】このように、タンパク質配列分析に十分な
量の精製ＣＡＤを調製するため、リソースＳ画分をカス
パーゼ３で活性化してＧＳＴ−ＤＦＦ４５親和性カラム
に負荷した。カスパーゼ３とトロンビンの組合せによる
溶出はグルタチオンによる溶出よりも効率的なので、こ
のカラムをトロンビンとカスパーゼ３で処理した。溶出
液は銀染色で分析すると（図１ｂ）、４０ｋＤａにバン
ドを含んでいた。３５ｋＤａ以下にある数個の強いバン
ドはカラムからタンパク質を溶出するために用いたトロ
ンビンとカスパーゼ３に由来するものであった。親和性
カラムから得た溶出液は強いＣＡＤ活性を示した。図１
ｃに示す通り、４０ｋＤａタンパク質を１ナノグラム以
下含む溶出液１マイクロリットルは核内染色体ＤＮＡを
２時間以内に完全に断片化でき、またプラスミドＤＮＡ
を効率的に消化した。ＣＡＤ標本をカスパーゼ３で処理
せずに親和性カラムに負荷すると、溶出液中には４０ｋ
Ｄａタンパク質もＣＡＤ活性も検出されなかった（図１
ｂおよびｃ）。これらの結果から、本発明者らは４０ｋ
Ｄａタンパク質がＣＡＤであると結論した。精製の概要
を表１に示す。ここでは核のＣＡＤ誘導ＤＮＡ分解は核
から放出されたヒストン／ＤＮＡコンプレックスの量を
測定することによって定量的に検定した。マウスリンパ
節の細胞質画分から出発したＣＡＤの全精製率は約１８
００００倍で、収率は２．３％であった。
量の精製ＣＡＤを調製するため、リソースＳ画分をカス
パーゼ３で活性化してＧＳＴ−ＤＦＦ４５親和性カラム
に負荷した。カスパーゼ３とトロンビンの組合せによる
溶出はグルタチオンによる溶出よりも効率的なので、こ
のカラムをトロンビンとカスパーゼ３で処理した。溶出
液は銀染色で分析すると（図１ｂ）、４０ｋＤａにバン
ドを含んでいた。３５ｋＤａ以下にある数個の強いバン
ドはカラムからタンパク質を溶出するために用いたトロ
ンビンとカスパーゼ３に由来するものであった。親和性
カラムから得た溶出液は強いＣＡＤ活性を示した。図１
ｃに示す通り、４０ｋＤａタンパク質を１ナノグラム以
下含む溶出液１マイクロリットルは核内染色体ＤＮＡを
２時間以内に完全に断片化でき、またプラスミドＤＮＡ
を効率的に消化した。ＣＡＤ標本をカスパーゼ３で処理
せずに親和性カラムに負荷すると、溶出液中には４０ｋ
Ｄａタンパク質もＣＡＤ活性も検出されなかった（図１
ｂおよびｃ）。これらの結果から、本発明者らは４０ｋ
Ｄａタンパク質がＣＡＤであると結論した。精製の概要
を表１に示す。ここでは核のＣＡＤ誘導ＤＮＡ分解は核
から放出されたヒストン／ＤＮＡコンプレックスの量を
測定することによって定量的に検定した。マウスリンパ
節の細胞質画分から出発したＣＡＤの全精製率は約１８
００００倍で、収率は２．３％であった。
【００３６】
【表１】マウスＣＡＤの精製 段階 タンパク質 全活性 比活性 精製率 収率 （ｍｇ）（×1000単位）（単位/μg） （倍） （％） Ｓ−１００ 3150 1493 0.47 100 硫酸アンモニウム 850 960.5 1.13 2 65 ヘパリン 89.6 1333.2 14.9 32 90.2 リソースＱ 16.4 944.6 57.6 123 63.9 リソースＳ 2.0 560.2 280.0 596 37.9GST-DFF45セファロース 0.0004 34.3 85800.0 182553 2.3 Ｓ−１００画分は１４匹のＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウ
スのリンパ節から調製した。ＣＡＤ活性を測定するには
２×１０5個の核をサンプルとともに１５０ｎｇのカス
パーゼ３を含む緩衝液Ａ中で３０℃で２時間インキュベ
ーションした。核から放出されたヒストン／ＤＮＡ複合
体を次にＣｅｌｌ・Ｄｅａｔｈ・ＥＬＩＳＡキットで検
定した。ＣＡＤ活性１単位はＥＬＩＳＡ系で４０５ｎｍ
の吸光度１を与える活性として便宜的に定義した。この
検定での１０単位はおよそ１μｇのプラスミドＤＮＡを
３０℃で２時間に分解する活性に対応する。ＧＳＴ−Ｄ
ＦＦ４５セファロースから得た溶出液のＣＡＤタンパク
質濃度はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の銀染
色から推測した。
スのリンパ節から調製した。ＣＡＤ活性を測定するには
２×１０5個の核をサンプルとともに１５０ｎｇのカス
パーゼ３を含む緩衝液Ａ中で３０℃で２時間インキュベ
ーションした。核から放出されたヒストン／ＤＮＡ複合
体を次にＣｅｌｌ・Ｄｅａｔｈ・ＥＬＩＳＡキットで検
定した。ＣＡＤ活性１単位はＥＬＩＳＡ系で４０５ｎｍ
の吸光度１を与える活性として便宜的に定義した。この
検定での１０単位はおよそ１μｇのプラスミドＤＮＡを
３０℃で２時間に分解する活性に対応する。ＧＳＴ−Ｄ
ＦＦ４５セファロースから得た溶出液のＣＡＤタンパク
質濃度はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の銀染
色から推測した。
【００３７】ペプチド配列分析には、ＧＳＴ−ＤＦＦ４
５親和性カラムから溶出したサンプルをマイクロコン−
１０装置（アミコン社）を用いて濃縮し、１０〜２０％
勾配ポリアクリルアミドゲル（第一化学社）電気泳動に
よって分画し、ポリビニリジンジフルオリド膜（アプラ
イドバイオシステムズ社、プロブロット）にブロットし
た。ポンソウＳで染色後、固定化したＣＡＤ（２〜４ｐ
モル）を還元し、Ｓ−カルボキシメチル化し、報告［３
８］通りにアクロモバクタープロテアーゼＩおよびＡｓ
ｐ−Ｎを用いて消化した。膜から放出されたペプチドを
Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ・ＡＲ・Ｃ１８・３００Ａカラム
（和光純薬）を用いる逆相高速液体クロマトグラフィー
によって分画し、タンパク質配列決定装置（島津、ＰＰ
ＳＱ−２３）を用いて配列決定した。得られた配列は配
列番号２に記載の配列と一致した。
５親和性カラムから溶出したサンプルをマイクロコン−
１０装置（アミコン社）を用いて濃縮し、１０〜２０％
勾配ポリアクリルアミドゲル（第一化学社）電気泳動に
よって分画し、ポリビニリジンジフルオリド膜（アプラ
イドバイオシステムズ社、プロブロット）にブロットし
た。ポンソウＳで染色後、固定化したＣＡＤ（２〜４ｐ
モル）を還元し、Ｓ−カルボキシメチル化し、報告［３
８］通りにアクロモバクタープロテアーゼＩおよびＡｓ
ｐ−Ｎを用いて消化した。膜から放出されたペプチドを
Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ・ＡＲ・Ｃ１８・３００Ａカラム
（和光純薬）を用いる逆相高速液体クロマトグラフィー
によって分画し、タンパク質配列決定装置（島津、ＰＰ
ＳＱ−２３）を用いて配列決定した。得られた配列は配
列番号２に記載の配列と一致した。
【００３８】実施例２：マウスＣＡＤｃＤＮＡのクロー
ニング 実施例１により得られた分子量４０ｋＤａの推測上のＣ
ＡＤタンパク質をアミノ酸配列分析して５種のペプチド
断片を得た。これらの２種を用いて縮重オリゴヌクレオ
チドプライマーを設計し、マウスＴ細胞リンパ腫ｃＤＮ
ＡライブラリーからのＰＣＲ増幅を行った。マウスＷＲ
１９Ｌ細胞のｃＤＮＡライブラリーをｐＥＦ−ＢＯＳベ
クター（ＦＥＲＭ ＢＰ−３５４９；受託日１９９１年
９月６日）(MizushimaおよびNagata,Nucleic Acids Re
s.18,522(1990))を用いて構築した。このｃＤＮＡライ
ブラリーから精製マウスＣＡＤのアミノ酸配列に基づい
て設計した次の縮重プライマーを用いるＰＣＲによって
マウスＣＡＤｃＤＮＡをクローニングした。センスプラ
イマーは５’−ＡＡ（Ａ／Ｇ）ＴＴ（Ｃ／Ｔ）ＧＧＩＧ
ＴＩＧＣＩＧＣ−３’であり、アンチセンスプライマー
は５’−ＴＧＩ（Ｃ／Ｇ）（Ａ／Ｔ）ＩＡＣ（Ａ／Ｇ）
ＴＧ（Ａ／Ｇ）ＴＧＩＡ（Ａ／Ｇ）ＩＡ（Ａ／Ｇ）（Ａ
／Ｇ）ＴＣ−３’であった。式中、Ｉはイノシンを示
す。反応混合物はライブラリーから得たプラスミドＤＮ
Ａ１μｇと各プライマー１００ｐモルをＰＣＲ緩衝液５
０μＬに含んでいた。
ニング 実施例１により得られた分子量４０ｋＤａの推測上のＣ
ＡＤタンパク質をアミノ酸配列分析して５種のペプチド
断片を得た。これらの２種を用いて縮重オリゴヌクレオ
チドプライマーを設計し、マウスＴ細胞リンパ腫ｃＤＮ
ＡライブラリーからのＰＣＲ増幅を行った。マウスＷＲ
１９Ｌ細胞のｃＤＮＡライブラリーをｐＥＦ−ＢＯＳベ
クター（ＦＥＲＭ ＢＰ−３５４９；受託日１９９１年
９月６日）(MizushimaおよびNagata,Nucleic Acids Re
s.18,522(1990))を用いて構築した。このｃＤＮＡライ
ブラリーから精製マウスＣＡＤのアミノ酸配列に基づい
て設計した次の縮重プライマーを用いるＰＣＲによって
マウスＣＡＤｃＤＮＡをクローニングした。センスプラ
イマーは５’−ＡＡ（Ａ／Ｇ）ＴＴ（Ｃ／Ｔ）ＧＧＩＧ
ＴＩＧＣＩＧＣ−３’であり、アンチセンスプライマー
は５’−ＴＧＩ（Ｃ／Ｇ）（Ａ／Ｔ）ＩＡＣ（Ａ／Ｇ）
ＴＧ（Ａ／Ｇ）ＴＧＩＡ（Ａ／Ｇ）ＩＡ（Ａ／Ｇ）（Ａ
／Ｇ）ＴＣ−３’であった。式中、Ｉはイノシンを示
す。反応混合物はライブラリーから得たプラスミドＤＮ
Ａ１μｇと各プライマー１００ｐモルをＰＣＲ緩衝液５
０μＬに含んでいた。
【００３９】これにより、３２２ｂｐの断片が得られ、
これをコロニーハイブリダイゼーションによるｃＤＮＡ
ライブラリーを検索するためのプローブに用いた。即ち
ＰＣＲ産物（３３２ｂｐ）をプローブに用い、ＷＲ１９
ＬｃＤＮＡをコロニーハイブリダイゼーションによって
検索した。このプローブＤＮＡはランダムプライマー標
識キット（ベーリンガーマンハイム社）を用いて32Ｐで
標識し、実質的に報告［３９］通り、コロニーハイブリ
ダイゼーションを行った。１×１０6個のクローンから
陽性クローン８個を得た。その中で、４個のクローンは
マウスＣＡＤの完全長コード配列（長さ１.６ｋｂ）を
持っていた。ＤＮＡ配列決定装置（アプライドバイオシ
ステムズ社、ＰＲＩＺＭ３１０）を用いて、そのうちの
１個のｃＤＮＡの両鎖を配列決定した（配列番号１）。
このｃＤＮＡ（ｐＥＦ−ＣＡＤ）は３４４アミノ酸の読
取り枠を含んでいた（図２）。精製タンパク質から得た
ペプチド配列５種はこのコード配列の中に見出すことが
できた。精製ＣＡＤのＮ−末端はコード配列の３番目に
現れるアラニンであることが確認されて、マウスＣＡＤ
はＮ−末端で翻訳後プロセシングを受けるらしいことが
示唆された。成熟タンパク質のＮ−末端に先行する余分
なメチオニン残基とシステイン残基は様々な種のアクチ
ン遺伝子に見出されている［２４］。成熟ＣＡＤは３４
２アミノ酸から構成され、分子量計算値３９３３３Ｄａ
はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動からの推測
とよく一致する。上記ＤＮＡ、ｐＥＦ−ＣＡＤを大腸菌
に導入したEscherichia coli／ｐＥＦ−ＣＡＤは茨城県
つくば市東１丁目１番３号、工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託されている（受託日：平成９年１２月１
６日；受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１６５５８）。
これをコロニーハイブリダイゼーションによるｃＤＮＡ
ライブラリーを検索するためのプローブに用いた。即ち
ＰＣＲ産物（３３２ｂｐ）をプローブに用い、ＷＲ１９
ＬｃＤＮＡをコロニーハイブリダイゼーションによって
検索した。このプローブＤＮＡはランダムプライマー標
識キット（ベーリンガーマンハイム社）を用いて32Ｐで
標識し、実質的に報告［３９］通り、コロニーハイブリ
ダイゼーションを行った。１×１０6個のクローンから
陽性クローン８個を得た。その中で、４個のクローンは
マウスＣＡＤの完全長コード配列（長さ１.６ｋｂ）を
持っていた。ＤＮＡ配列決定装置（アプライドバイオシ
ステムズ社、ＰＲＩＺＭ３１０）を用いて、そのうちの
１個のｃＤＮＡの両鎖を配列決定した（配列番号１）。
このｃＤＮＡ（ｐＥＦ−ＣＡＤ）は３４４アミノ酸の読
取り枠を含んでいた（図２）。精製タンパク質から得た
ペプチド配列５種はこのコード配列の中に見出すことが
できた。精製ＣＡＤのＮ−末端はコード配列の３番目に
現れるアラニンであることが確認されて、マウスＣＡＤ
はＮ−末端で翻訳後プロセシングを受けるらしいことが
示唆された。成熟タンパク質のＮ−末端に先行する余分
なメチオニン残基とシステイン残基は様々な種のアクチ
ン遺伝子に見出されている［２４］。成熟ＣＡＤは３４
２アミノ酸から構成され、分子量計算値３９３３３Ｄａ
はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動からの推測
とよく一致する。上記ＤＮＡ、ｐＥＦ−ＣＡＤを大腸菌
に導入したEscherichia coli／ｐＥＦ−ＣＡＤは茨城県
つくば市東１丁目１番３号、工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託されている（受託日：平成９年１２月１
６日；受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１６５５８）。
【００４０】マウスＣＡＤはＣｙｓ残基に富み（成熟タ
ンパク質中、１２残基）、等電点８．７の塩基性タンパ
ク質である。ＧｅｎＢａｎｋデータベースのＢＬＡＳＴ
検索ではＣＡＤ遺伝子と相同的な遺伝子が見当たらず、
ＣＡＤは新規遺伝子産物であることが判明した。しか
し、Ｃ−末端にある１５アミノ酸残基からなる配列は核
局在化シグナルの特徴を有し［２５］、これはＣＡＤが
核内に入って染色体ＤＮＡを分解できる事実と符合す
る。ＣＡＤｍＲＮＡの組織分布をノーザンハイブリダイ
ゼーションによって検討したところ、心臓を除く全組織
が約２．５ｋＢのＣＡＤｍＲＮＡを発現する（図３）こ
とが見出された。肺、小腸、卵巣、子宮および脾のよう
ないくつかの組織はＣＡＤｍＲＮＡを豊富に発現した。
ンパク質中、１２残基）、等電点８．７の塩基性タンパ
ク質である。ＧｅｎＢａｎｋデータベースのＢＬＡＳＴ
検索ではＣＡＤ遺伝子と相同的な遺伝子が見当たらず、
ＣＡＤは新規遺伝子産物であることが判明した。しか
し、Ｃ−末端にある１５アミノ酸残基からなる配列は核
局在化シグナルの特徴を有し［２５］、これはＣＡＤが
核内に入って染色体ＤＮＡを分解できる事実と符合す
る。ＣＡＤｍＲＮＡの組織分布をノーザンハイブリダイ
ゼーションによって検討したところ、心臓を除く全組織
が約２．５ｋＢのＣＡＤｍＲＮＡを発現する（図３）こ
とが見出された。肺、小腸、卵巣、子宮および脾のよう
ないくつかの組織はＣＡＤｍＲＮＡを豊富に発現した。
【００４１】実施例３：ＣＯＳ細胞および無細胞系での
ＣＡＤ発現 クローニングしたＣＡＤｃＤＮＡがＣＡＤ活性を持つタ
ンパク質をコードすることを確認するため、ＣＡＤ発現
プラスミド（ｐＥＦ−ＣＡＤ）をＣＯＳ細胞に導入し、
細胞抽出物を調製した。図４ａに示す通り、未処理抽出
物はＤＮＡ分解を誘導しなかったが、抽出物をカスパー
ゼ３処理すると空のベクターを遺伝子移入した細胞より
も僅かに（４倍）高いＣＡＤ活性を示した。このＣＡＤ
発現レベルが低かったのことについて本発明者らは二つ
の可能性を考えた。すなわち、機能性あるＣＡＤはＩＣ
ＡＤの非存在下では合成できないのか、または遺伝子移
入した細胞がＣＡＤによって直ちに殺されたかのいずれ
かである。これらの可能性を検討するために、ＣＯＳ細
胞にＣＡＤ発現プラスミドをＣＡＤ活性を阻害すること
になるＩＣＡＤ発現プラスミドとともに導入した。ＣＯ
Ｓ細胞内のＩＣＡＤ単独の発現は内在性ＣＡＤ活性を阻
害し、抽出物はカスパーゼ３処理後にさえ全くＣＡＤ活
性を示さなかった。他方、ＣＡＤをＩＣＡＤとともに共
発現すると、抽出物は非常に強いＣＡＤ活性を示した。
図４ｂに示す通り、ＣＡＤとＩＣＡＤを共遺伝子移入し
た細胞から得た全抽出物の１０から２０ナノグラムはカ
スパーゼ３で処理すれば、核内染色体ＤＮＡを効率的に
切断し、またプラスミドＤＮＡを消化できた。この遺伝
子移入細胞内のＣＡＤ活性は空ベクターを遺伝子移入し
た対照細胞よりも約１０００倍強力であった。これらの
結果はクローニングしたｃＤＮＡは本質的にＤＮアーゼ
活性を持つＣＡＤをコードすることを示す。しかし、こ
の活性はＣＡＤがＩＣＡＤと共発現された時のみ、ＣＯ
Ｓ細胞中に証明できる。
ＣＡＤ発現 クローニングしたＣＡＤｃＤＮＡがＣＡＤ活性を持つタ
ンパク質をコードすることを確認するため、ＣＡＤ発現
プラスミド（ｐＥＦ−ＣＡＤ）をＣＯＳ細胞に導入し、
細胞抽出物を調製した。図４ａに示す通り、未処理抽出
物はＤＮＡ分解を誘導しなかったが、抽出物をカスパー
ゼ３処理すると空のベクターを遺伝子移入した細胞より
も僅かに（４倍）高いＣＡＤ活性を示した。このＣＡＤ
発現レベルが低かったのことについて本発明者らは二つ
の可能性を考えた。すなわち、機能性あるＣＡＤはＩＣ
ＡＤの非存在下では合成できないのか、または遺伝子移
入した細胞がＣＡＤによって直ちに殺されたかのいずれ
かである。これらの可能性を検討するために、ＣＯＳ細
胞にＣＡＤ発現プラスミドをＣＡＤ活性を阻害すること
になるＩＣＡＤ発現プラスミドとともに導入した。ＣＯ
Ｓ細胞内のＩＣＡＤ単独の発現は内在性ＣＡＤ活性を阻
害し、抽出物はカスパーゼ３処理後にさえ全くＣＡＤ活
性を示さなかった。他方、ＣＡＤをＩＣＡＤとともに共
発現すると、抽出物は非常に強いＣＡＤ活性を示した。
図４ｂに示す通り、ＣＡＤとＩＣＡＤを共遺伝子移入し
た細胞から得た全抽出物の１０から２０ナノグラムはカ
スパーゼ３で処理すれば、核内染色体ＤＮＡを効率的に
切断し、またプラスミドＤＮＡを消化できた。この遺伝
子移入細胞内のＣＡＤ活性は空ベクターを遺伝子移入し
た対照細胞よりも約１０００倍強力であった。これらの
結果はクローニングしたｃＤＮＡは本質的にＤＮアーゼ
活性を持つＣＡＤをコードすることを示す。しかし、こ
の活性はＣＡＤがＩＣＡＤと共発現された時のみ、ＣＯ
Ｓ細胞中に証明できる。
【００４２】ＣＡＤの発現におけるＩＣＡＤの役割を検
討するため、転写翻訳共役系を用いる無細胞系でＣＡＤ
タンパク質を合成した。すなわち、ＣＡＤｍＲＮＡをＴ
７ポリメラーゼで合成し、網状赤血球抽出物中で組換え
ＧＳＴ−ＩＣＡＤタンパク質の存在または非存在下に翻
訳した（図５）。どちらの場合も、ＣＡＤは分子量４０
ｋＤａのタンパク質として合成された（図５ａ）。ＩＣ
ＡＤ非存在下に合成されたＣＡＤはＣＡＤ活性を全く示
さなかったが、ＩＣＡＤ存在下に合成されたＣＡＤは、
生成物をカスパーゼ３で活性化した後には効率的に核内
染色体ＤＮＡを切断し、プラスミドＤＮＡを消化した
（図５ｂ）。しかし、ＣＡＤ合成後の反応混合物にＩＣ
ＡＤを加えても、混合物にはＣＡＤ活性は見出せなかっ
た。これらの結果は機能性ＣＡＤはＩＣＡＤの存在下で
のみ合成されることを示し、新たに合成されたＣＡＤは
ＩＣＡＤと複合体を形成されていることを示唆する。事
実、ＦＬＡＧエピトープで標識したＩＣＡＤを抗ＦＬＡ
Ｇ抗体で免疫沈降させると４０ｋＤａＣＡＤタンパク質
がＩＣＡＤと共沈降し（図６ａ）、沈降物のカスパーゼ
３処理は核内ＤＮＡ断片化活性およびＤＮアーゼ活性を
起動した（図６ｂ）。ＩＣＡＤが抽出物に入っていない
と４０ｋＤａタンパク質もＣＡＤ活性も観察されず、ま
た対照抗体はＣＡＤ活性を沈降させないので、この共免
疫沈降は特異的である。これらの結果から、ＣＡＤがＤ
Ｎアーゼであること、ＣＡＤがＩＣＡＤと複合体を形成
すること、および活性ＣＡＤがカスパーゼ３の作用によ
って複合体から放出されることを確認した。
討するため、転写翻訳共役系を用いる無細胞系でＣＡＤ
タンパク質を合成した。すなわち、ＣＡＤｍＲＮＡをＴ
７ポリメラーゼで合成し、網状赤血球抽出物中で組換え
ＧＳＴ−ＩＣＡＤタンパク質の存在または非存在下に翻
訳した（図５）。どちらの場合も、ＣＡＤは分子量４０
ｋＤａのタンパク質として合成された（図５ａ）。ＩＣ
ＡＤ非存在下に合成されたＣＡＤはＣＡＤ活性を全く示
さなかったが、ＩＣＡＤ存在下に合成されたＣＡＤは、
生成物をカスパーゼ３で活性化した後には効率的に核内
染色体ＤＮＡを切断し、プラスミドＤＮＡを消化した
（図５ｂ）。しかし、ＣＡＤ合成後の反応混合物にＩＣ
ＡＤを加えても、混合物にはＣＡＤ活性は見出せなかっ
た。これらの結果は機能性ＣＡＤはＩＣＡＤの存在下で
のみ合成されることを示し、新たに合成されたＣＡＤは
ＩＣＡＤと複合体を形成されていることを示唆する。事
実、ＦＬＡＧエピトープで標識したＩＣＡＤを抗ＦＬＡ
Ｇ抗体で免疫沈降させると４０ｋＤａＣＡＤタンパク質
がＩＣＡＤと共沈降し（図６ａ）、沈降物のカスパーゼ
３処理は核内ＤＮＡ断片化活性およびＤＮアーゼ活性を
起動した（図６ｂ）。ＩＣＡＤが抽出物に入っていない
と４０ｋＤａタンパク質もＣＡＤ活性も観察されず、ま
た対照抗体はＣＡＤ活性を沈降させないので、この共免
疫沈降は特異的である。これらの結果から、ＣＡＤがＤ
Ｎアーゼであること、ＣＡＤがＩＣＡＤと複合体を形成
すること、および活性ＣＡＤがカスパーゼ３の作用によ
って複合体から放出されることを確認した。
【００４３】実施例４：組換えヒトＤＦＦ４５と組換え
マウスＩＣＡＤ ヒトＤＦＦ４５をコードするｃＤＮＡ［２２］はヒトＫ
Ｔ３ｃＤＮＡライブラリー［２０］からＰＣＲによって
分離した。このＰＣＲ産物（１ｋｂ）をｐＧＥＸ−２Ｔ
［１２８／１２９］のグルタチオンＳ−トランスフェラ
ーゼ（ＧＳＴ）遺伝子と正方向および逆方向に融合した
（各々ｐＧＥＸ−ＤＦＦおよびｐＧＥＸ−ｒｅｖＤＦ
Ｆ）。ｐＧＥＸ−２Ｔ［１２８／１２９］はｐＧＥＸ−
２Ｔ（ファルマシア社）の誘導体であって、これにはＦ
ＬＡＧ−エピトープ標識（ＤＹＫＤＤＤＤＫＡ）および
心筋キナーゼ認識配列（ＲＲＡＳＶ）［２３］がＧＳＴ
遺伝子の後に挿入されている。このＧＳＴ−ＤＦＦ４５
融合タンパク質をＥ．ｃｏｌｉのＡＤ２０２株(Nakano,
H., Yamazaki,T., Ikeda,M., Masai,H., Miyatake,S.お
よびSaito,T.(1994) Nucleic Acid Res.22:543-4)で発
現し、製造社の指示に従ってグルタチオン−セファロー
ス４Ｂに吸着させた。ビーズは湿ったビーズ１ｍＬ当り
約１ｍｇのＧＳＴ融合タンパク質を保持していた。
マウスＩＣＡＤ ヒトＤＦＦ４５をコードするｃＤＮＡ［２２］はヒトＫ
Ｔ３ｃＤＮＡライブラリー［２０］からＰＣＲによって
分離した。このＰＣＲ産物（１ｋｂ）をｐＧＥＸ−２Ｔ
［１２８／１２９］のグルタチオンＳ−トランスフェラ
ーゼ（ＧＳＴ）遺伝子と正方向および逆方向に融合した
（各々ｐＧＥＸ−ＤＦＦおよびｐＧＥＸ−ｒｅｖＤＦ
Ｆ）。ｐＧＥＸ−２Ｔ［１２８／１２９］はｐＧＥＸ−
２Ｔ（ファルマシア社）の誘導体であって、これにはＦ
ＬＡＧ−エピトープ標識（ＤＹＫＤＤＤＤＫＡ）および
心筋キナーゼ認識配列（ＲＲＡＳＶ）［２３］がＧＳＴ
遺伝子の後に挿入されている。このＧＳＴ−ＤＦＦ４５
融合タンパク質をＥ．ｃｏｌｉのＡＤ２０２株(Nakano,
H., Yamazaki,T., Ikeda,M., Masai,H., Miyatake,S.お
よびSaito,T.(1994) Nucleic Acid Res.22:543-4)で発
現し、製造社の指示に従ってグルタチオン−セファロー
ス４Ｂに吸着させた。ビーズは湿ったビーズ１ｍＬ当り
約１ｍｇのＧＳＴ融合タンパク質を保持していた。
【００４４】実施例５：ＣＯＳ細胞への遺伝子移入、試
験管内転写翻訳、および免疫沈降 プラスミドｐＥＦ−ＩＣＡＤ−ＬはマウスＩＣＡＤ−Ｌ
の哺乳類発現ベクターである。サルＣＯＳ７細胞に報告
［４０］通り、電気穿孔によってプラスミドＤＮＡを遺
伝子移入した。３７℃で４８時間の培養後、細胞を緩衝
液Ｄ０．１ｍＬに懸濁し、凍結および解凍の反復によっ
て崩壊させ、細胞の破砕片および核を除去するため１５
０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。無細胞系でＣＡ
Ｄを発現するには、マウスＣＡＤ完全長コード配列をｐ
ｃＤＮＡＩ／Ａｍｐベクター（インビトローゲン社）の
Ｔ７プロモーターの下に置いて、ｐｃＤＮＡ−ＣＡＤと
命名した。製造社の指示に従って、ＴＮＴインビトロ転
写／翻訳キット（プロメガ社）を用いる転写翻訳共役系
をＣＡＤに適用した。すなわち、ｐｃＤＮＡ−ＣＡＤの
ＤＮＡ（１μｇ）をＴＮＴ試薬４０μＬおよび４０μＣ
ｉの35Ｓ−メチオニン（アマーシャム社）とともにＧＳ
Ｔ−ＩＣＡＤ−Ｌ融合タンパク質１６０ｎｇの存在下に
３０℃で２時間インキュベーションした。ＩＣＡＤ−Ｌ
／ＣＡＤ複合体を免疫沈降させるため、反応混合物を
０．５ｍＬまで緩衝液Ｄで希釈し、抗ＦＬＡＧ・Ｍ２親
和性ビーズ（コダック社、３ｍｇＩｇＧ／ｍＬビーズ）
１０μＬを加えた。４℃で２時間インキュベーションし
た後、ランメリのサンプル緩衝液中、９０℃に５分間加
熱して結合したタンパク質を溶出させ、１０〜２０％勾
配ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、増感板を用
いてＸ−ＯＭＡＴ・Ｘ線フィルム（コダック社）に感光
させた。
験管内転写翻訳、および免疫沈降 プラスミドｐＥＦ−ＩＣＡＤ−ＬはマウスＩＣＡＤ−Ｌ
の哺乳類発現ベクターである。サルＣＯＳ７細胞に報告
［４０］通り、電気穿孔によってプラスミドＤＮＡを遺
伝子移入した。３７℃で４８時間の培養後、細胞を緩衝
液Ｄ０．１ｍＬに懸濁し、凍結および解凍の反復によっ
て崩壊させ、細胞の破砕片および核を除去するため１５
０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。無細胞系でＣＡ
Ｄを発現するには、マウスＣＡＤ完全長コード配列をｐ
ｃＤＮＡＩ／Ａｍｐベクター（インビトローゲン社）の
Ｔ７プロモーターの下に置いて、ｐｃＤＮＡ−ＣＡＤと
命名した。製造社の指示に従って、ＴＮＴインビトロ転
写／翻訳キット（プロメガ社）を用いる転写翻訳共役系
をＣＡＤに適用した。すなわち、ｐｃＤＮＡ−ＣＡＤの
ＤＮＡ（１μｇ）をＴＮＴ試薬４０μＬおよび４０μＣ
ｉの35Ｓ−メチオニン（アマーシャム社）とともにＧＳ
Ｔ−ＩＣＡＤ−Ｌ融合タンパク質１６０ｎｇの存在下に
３０℃で２時間インキュベーションした。ＩＣＡＤ−Ｌ
／ＣＡＤ複合体を免疫沈降させるため、反応混合物を
０．５ｍＬまで緩衝液Ｄで希釈し、抗ＦＬＡＧ・Ｍ２親
和性ビーズ（コダック社、３ｍｇＩｇＧ／ｍＬビーズ）
１０μＬを加えた。４℃で２時間インキュベーションし
た後、ランメリのサンプル緩衝液中、９０℃に５分間加
熱して結合したタンパク質を溶出させ、１０〜２０％勾
配ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、増感板を用
いてＸ−ＯＭＡＴ・Ｘ線フィルム（コダック社）に感光
させた。
【００４５】以下に参考例を示す。尚、参考例において
使用したＣＡＤおよびＩＣＡＤの検定法は以下の通りで
ある。ＣＡＤおよびＩＣＡＤの検定法 ＣＡＤ活性はマウス肝臓核を使用するアポトーシスにつ
いての試験管内検定法によって、または基質としてプラ
スミドＤＮＡを使用するＤＮアーゼ活性測定法によって
測定した。すなわち、１００μｇ／ｍＬのウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）およびＡＴＰ再生系（２ｍＭ−ＡＴ
Ｐ、１０ｍＭ−ホスホクレアチン、および５０μｇ／ｍ
Ｌクレアチンキナーゼ）を含む２０μＬの緩衝液Ａ（１
０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ−
ＮａＣｌ、５ｍＭ−ＭｇＣｌ２、５ｍＭ−ＥＧＴＡ、１
０％グリセリン、および１ｍＭ−ＤＴＴ）中で７５ｎｇ
の組換えカスパーゼ３［２２］とともにサンプルを４℃
で１２時間および３０℃で１時間インキュベーションし
た。１０μＭ−Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｃｈｏ（ペプチド研究
所）とともに４℃で３０分間インキュベーションしてカ
スパーゼ３を不活化後、核（１×１０6個）を混合物に
加え、４℃で１２時間および３０℃で１時間インキュベ
ーションした。ＤＮＡを核から回収し、１％アガロース
ゲル電気泳動によって分析した。ＤＮアーゼ活性を測定
するには核の代わりに１μｇのプラスミドＤＮＡを用い
て３０℃で２時間インキュベーションした。
使用したＣＡＤおよびＩＣＡＤの検定法は以下の通りで
ある。ＣＡＤおよびＩＣＡＤの検定法 ＣＡＤ活性はマウス肝臓核を使用するアポトーシスにつ
いての試験管内検定法によって、または基質としてプラ
スミドＤＮＡを使用するＤＮアーゼ活性測定法によって
測定した。すなわち、１００μｇ／ｍＬのウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）およびＡＴＰ再生系（２ｍＭ−ＡＴ
Ｐ、１０ｍＭ−ホスホクレアチン、および５０μｇ／ｍ
Ｌクレアチンキナーゼ）を含む２０μＬの緩衝液Ａ（１
０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ−
ＮａＣｌ、５ｍＭ−ＭｇＣｌ２、５ｍＭ−ＥＧＴＡ、１
０％グリセリン、および１ｍＭ−ＤＴＴ）中で７５ｎｇ
の組換えカスパーゼ３［２２］とともにサンプルを４℃
で１２時間および３０℃で１時間インキュベーションし
た。１０μＭ−Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｃｈｏ（ペプチド研究
所）とともに４℃で３０分間インキュベーションしてカ
スパーゼ３を不活化後、核（１×１０6個）を混合物に
加え、４℃で１２時間および３０℃で１時間インキュベ
ーションした。ＤＮＡを核から回収し、１％アガロース
ゲル電気泳動によって分析した。ＤＮアーゼ活性を測定
するには核の代わりに１μｇのプラスミドＤＮＡを用い
て３０℃で２時間インキュベーションした。
【００４６】ＩＣＡＤ活性はＣＡＤ活性の阻害を観察す
ることによって測定した。活性化ＣＡＤの原料として
は、Ｆａｓ活性化細胞から得た細胞質画分またはカスパ
ーゼ３活性化部分精製マウスＣＡＤ（リソースＳ画分、
前記同時係属出願参照）を使用した（参考例１参照）。
すなわち、マウスＷ４細胞を０．５μｇ／ｍＬの抗Ｆａ
ｓＪｏ２抗体［３７］で３７℃で２０分間処理し、報告
［２５］の通りＳ−１００画分を調製した。この画分中
のカスパーゼ３は１０μＭ−Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｃｈｏと
ともに４℃で３０分間インキュベーションして不活化し
た。部分的に精製したＣＡＤについては、ＣＡＤ（１０
０ｎｇ）を１５０ｎｇのカスパーゼ３とともに１００μ
ｇ／ｍＬのＢＳＡを含む緩衝液Ａ１００μＬ中で４℃で
１２時間および３０℃で１時間インキュベーションし、
このカスパーゼ３はＡｃ−ＤＥＶＤ−ｃｈｏで不活化し
た。被験サンプルは最終容積２０μＬ中の活性ＣＡＤ
（Ｆａｓ活性化Ｗ４細胞から得た細胞抽出物の２０μｇ
または活性化部分精製マウスＣＡＤの５ｎｇ）に加え
た。４℃で３０分間インキュベーションした後、標的と
して核またはプラスミドＤＮＡを使用して残留ＣＡＤ活
性を前記の通りに測定した。
ることによって測定した。活性化ＣＡＤの原料として
は、Ｆａｓ活性化細胞から得た細胞質画分またはカスパ
ーゼ３活性化部分精製マウスＣＡＤ（リソースＳ画分、
前記同時係属出願参照）を使用した（参考例１参照）。
すなわち、マウスＷ４細胞を０．５μｇ／ｍＬの抗Ｆａ
ｓＪｏ２抗体［３７］で３７℃で２０分間処理し、報告
［２５］の通りＳ−１００画分を調製した。この画分中
のカスパーゼ３は１０μＭ−Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｃｈｏと
ともに４℃で３０分間インキュベーションして不活化し
た。部分的に精製したＣＡＤについては、ＣＡＤ（１０
０ｎｇ）を１５０ｎｇのカスパーゼ３とともに１００μ
ｇ／ｍＬのＢＳＡを含む緩衝液Ａ１００μＬ中で４℃で
１２時間および３０℃で１時間インキュベーションし、
このカスパーゼ３はＡｃ−ＤＥＶＤ−ｃｈｏで不活化し
た。被験サンプルは最終容積２０μＬ中の活性ＣＡＤ
（Ｆａｓ活性化Ｗ４細胞から得た細胞抽出物の２０μｇ
または活性化部分精製マウスＣＡＤの５ｎｇ）に加え
た。４℃で３０分間インキュベーションした後、標的と
して核またはプラスミドＤＮＡを使用して残留ＣＡＤ活
性を前記の通りに測定した。
【００４７】参考例１：ＩＣＡＤの精製およびペプチド
の配列決定 プロテアーゼ阻害剤の混合物［１ｍＭ−（ｐ−アミノフ
ェニル）メタンスルホニルフルオリド塩酸塩（ｐ−ＡＰ
ＭＳＦ）、１μｇ／ｍＬアプロチニン、１μｇ／ｍＬロ
イペプチン、および１μｇ／ｍＬペプスタチンＡ］を添
加した緩衝液ＡにマウスＷＲ１９Ｌ細胞を懸濁した（２
×１０9細胞／ｍＬ）。細胞をガラス製のダウンスホモ
ジナイザーに移し、凍結および解凍を３周行って崩壊さ
せたが、各解凍サイクルの間にペッスルで摩りつぶし
た。ホモジネートを３００００×ｇで３０分間および１
０００００×ｇで１２時間遠心分離してＳ−１００画分
を得た。このＳ−１００画分（１７１０ｍｇ）を緩衝液
Ａと平衡させたＤＥＡＥセファロースＦＦカラム（容積
１７０ｍＬ、ファルマシア社）に負荷した。カラムを緩
衝液Ａで洗い、１７００ｍＬ中の５０〜３５０ｍＭ−直
線状ＮａＣｌ勾配で溶出した。活性画分（タンパク質１
２５ｍｇ）を集めて、２５％飽和から５０％飽和までの
硫酸アンモニウムで分画し、１Ｍ−硫酸アンモニウムを
添加した緩衝液Ｂ（５０ｍＭ−ＮａＣｌ不含緩衝液Ａ）
に溶解した。このサンプルをブチル−セファロース４Ｆ
Ｆカラム（容積１８ｍＬ、ファルマシア社）に負荷し、
１Ｍ−硫酸アンモニウムを添加した緩衝液Ｂと平衡させ
た。このカラムを１．０から０Ｍまでの硫酸アンモニウ
ムを直線状濃度減少勾配で含む緩衝液Ｂ１８０ｍＬで溶
出し、続いて緩衝液Ｂによって溶出した。活性画分を集
めて最終濃度０．８Ｍになるまで硫酸アンモニウムを加
えた。不溶性物質を除去後、サンプル（タンパク質４．
２ｍｇ）をフェニル−スーパロースＨＲ５／５カラム
（ファルマシア社）に負荷し、１０ｍＬの緩衝液Ｂで溶
出した。活性画分（１．３ｍｇ）を集め、最終濃度０．
０２％になるまでトゥイーン２０を加えた。サンプルを
緩衝液Ｃ（０．０２％トゥイーン２０含有緩衝液Ａ）と
平衡させたスーパデックス−２００ＨＲ１０／３０ゲル
濾過カラムに負荷した。各活性画分を９０℃で１５分間
加熱し、１０００００×ｇで３０分間遠心分離して沈降
物を除いた。ペプチド配列分析のためにはサンプルを１
０〜２０％勾配ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、
ポリビニリジンジフルオリド膜（プロブロット、アプラ
イドバイオシステムズ社）にブロットした。ポンソーＳ
で染色後、固定化したＩＣＡＤ（約１０ｐモル）を還元
し、Ｓ−カルボキシメチル化し、報告［３８］通りに原
位置でアクロモバクタープロテアーゼＩによって消化し
た。膜から溶出したペプチドをワコーシル（Ｗａｋｏｓ
ｉｌ）−ＩＩ、ＡＲ・Ｃ１８・３００Ａカラム（和光純
薬）を用いる逆相高速液体クロマトグラフィーによって
分画し、タンパク質配列決定装置（島津、ＰＰＳＱ−２
３型）を使用して配列決定した。
の配列決定 プロテアーゼ阻害剤の混合物［１ｍＭ−（ｐ−アミノフ
ェニル）メタンスルホニルフルオリド塩酸塩（ｐ−ＡＰ
ＭＳＦ）、１μｇ／ｍＬアプロチニン、１μｇ／ｍＬロ
イペプチン、および１μｇ／ｍＬペプスタチンＡ］を添
加した緩衝液ＡにマウスＷＲ１９Ｌ細胞を懸濁した（２
×１０9細胞／ｍＬ）。細胞をガラス製のダウンスホモ
ジナイザーに移し、凍結および解凍を３周行って崩壊さ
せたが、各解凍サイクルの間にペッスルで摩りつぶし
た。ホモジネートを３００００×ｇで３０分間および１
０００００×ｇで１２時間遠心分離してＳ−１００画分
を得た。このＳ−１００画分（１７１０ｍｇ）を緩衝液
Ａと平衡させたＤＥＡＥセファロースＦＦカラム（容積
１７０ｍＬ、ファルマシア社）に負荷した。カラムを緩
衝液Ａで洗い、１７００ｍＬ中の５０〜３５０ｍＭ−直
線状ＮａＣｌ勾配で溶出した。活性画分（タンパク質１
２５ｍｇ）を集めて、２５％飽和から５０％飽和までの
硫酸アンモニウムで分画し、１Ｍ−硫酸アンモニウムを
添加した緩衝液Ｂ（５０ｍＭ−ＮａＣｌ不含緩衝液Ａ）
に溶解した。このサンプルをブチル−セファロース４Ｆ
Ｆカラム（容積１８ｍＬ、ファルマシア社）に負荷し、
１Ｍ−硫酸アンモニウムを添加した緩衝液Ｂと平衡させ
た。このカラムを１．０から０Ｍまでの硫酸アンモニウ
ムを直線状濃度減少勾配で含む緩衝液Ｂ１８０ｍＬで溶
出し、続いて緩衝液Ｂによって溶出した。活性画分を集
めて最終濃度０．８Ｍになるまで硫酸アンモニウムを加
えた。不溶性物質を除去後、サンプル（タンパク質４．
２ｍｇ）をフェニル−スーパロースＨＲ５／５カラム
（ファルマシア社）に負荷し、１０ｍＬの緩衝液Ｂで溶
出した。活性画分（１．３ｍｇ）を集め、最終濃度０．
０２％になるまでトゥイーン２０を加えた。サンプルを
緩衝液Ｃ（０．０２％トゥイーン２０含有緩衝液Ａ）と
平衡させたスーパデックス−２００ＨＲ１０／３０ゲル
濾過カラムに負荷した。各活性画分を９０℃で１５分間
加熱し、１０００００×ｇで３０分間遠心分離して沈降
物を除いた。ペプチド配列分析のためにはサンプルを１
０〜２０％勾配ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、
ポリビニリジンジフルオリド膜（プロブロット、アプラ
イドバイオシステムズ社）にブロットした。ポンソーＳ
で染色後、固定化したＩＣＡＤ（約１０ｐモル）を還元
し、Ｓ−カルボキシメチル化し、報告［３８］通りに原
位置でアクロモバクタープロテアーゼＩによって消化し
た。膜から溶出したペプチドをワコーシル（Ｗａｋｏｓ
ｉｌ）−ＩＩ、ＡＲ・Ｃ１８・３００Ａカラム（和光純
薬）を用いる逆相高速液体クロマトグラフィーによって
分画し、タンパク質配列決定装置（島津、ＰＰＳＱ−２
３型）を使用して配列決定した。
【００４８】ゲルからのＩＣＡＤの回収 ＩＣＡＤは実質的にＨａｇｅｒら［３６］に従ってポリ
アクリルアミドゲルから回収した。すなわち、ＩＣＡＤ
１００ｎｇをランメリ（Ｌａｍｍｅｌｌｉ）のサンプル
緩衝液中で９５℃に５分間加熱し、ポリアクリルアミド
ゲル（第一化学）で電気泳動した。ゲルを３〜５ｍｍ厚
の細片に切断し、Ｈ２Ｏで洗い、１ｍＬの緩衝液（５０
ｍＭ−トリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭ−ＤＴＴ、
０．１ｍＭ−ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、０．１
％ＳＤＳおよびＢＳＡ０．１ｍｇ／ｍＬ）中で砕き、室
温で一夜撹拌した。ゲルから溶出したタンパク質を冷ア
セトンで沈降させ、６Ｍ−グアニジンＨＣｌを含む緩衝
液Ｃに溶解した。この溶液を室温で２０分間インキュベ
ーションし、緩衝液Ｃに対して室温で透析した。
アクリルアミドゲルから回収した。すなわち、ＩＣＡＤ
１００ｎｇをランメリ（Ｌａｍｍｅｌｌｉ）のサンプル
緩衝液中で９５℃に５分間加熱し、ポリアクリルアミド
ゲル（第一化学）で電気泳動した。ゲルを３〜５ｍｍ厚
の細片に切断し、Ｈ２Ｏで洗い、１ｍＬの緩衝液（５０
ｍＭ−トリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭ−ＤＴＴ、
０．１ｍＭ−ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、０．１
％ＳＤＳおよびＢＳＡ０．１ｍｇ／ｍＬ）中で砕き、室
温で一夜撹拌した。ゲルから溶出したタンパク質を冷ア
セトンで沈降させ、６Ｍ−グアニジンＨＣｌを含む緩衝
液Ｃに溶解した。この溶液を室温で２０分間インキュベ
ーションし、緩衝液Ｃに対して室温で透析した。
【００４９】参考例２：ＩＣＡＤｃＤＮＡの分子クロー
ニング オリゴヌクレオチド２種（５’−ＧＡＴＴＣＣＧＡＴＧ
ＧＡＧＧＧＡＣ−３’および５’−ＧＡＴＡＡＡＣＴＣ
ＡＧＣＴＣＴＧＧ−３’）をＥＳＴクローン＃６１５７
１２から設計した。これは精製ＩＣＡＤ（図３）のペプ
チド配列の一つをコードしている。ＷＲ１９ＬのｃＤＮ
ＡライブラリーからｃＤＮＡ（４７６ｂｐ）をＰＣＲに
よって増幅し、ランダムプライマー標識キット（ベーリ
ンガーマンハイム社）を用いて32Ｐで標識し、これをプ
ローブに用いてＷＲ１９ＬのｃＤＮＡライブラリーを検
索した。コロニーハイブリダイゼーションを報告［３
９］の通りに行って、２×１０5クローンの中から８個
の陽性クローンを得た。その中で２個のクローンがＩＣ
ＡＤ−ＬのｃＤＮＡを、他の２個のクローンがＩＣＡＤ
−ＳのｃＤＮＡを有していた。各型のｃＤＮＡから１個
を取り、ＤＮＡ配列決定装置（ファルマシアアルフレッ
ド社）を用いて両鎖について配列決定した（配列番号３
および５）。
ニング オリゴヌクレオチド２種（５’−ＧＡＴＴＣＣＧＡＴＧ
ＧＡＧＧＧＡＣ−３’および５’−ＧＡＴＡＡＡＣＴＣ
ＡＧＣＴＣＴＧＧ−３’）をＥＳＴクローン＃６１５７
１２から設計した。これは精製ＩＣＡＤ（図３）のペプ
チド配列の一つをコードしている。ＷＲ１９ＬのｃＤＮ
ＡライブラリーからｃＤＮＡ（４７６ｂｐ）をＰＣＲに
よって増幅し、ランダムプライマー標識キット（ベーリ
ンガーマンハイム社）を用いて32Ｐで標識し、これをプ
ローブに用いてＷＲ１９ＬのｃＤＮＡライブラリーを検
索した。コロニーハイブリダイゼーションを報告［３
９］の通りに行って、２×１０5クローンの中から８個
の陽性クローンを得た。その中で２個のクローンがＩＣ
ＡＤ−ＬのｃＤＮＡを、他の２個のクローンがＩＣＡＤ
−ＳのｃＤＮＡを有していた。各型のｃＤＮＡから１個
を取り、ＤＮＡ配列決定装置（ファルマシアアルフレッ
ド社）を用いて両鎖について配列決定した（配列番号３
および５）。
【００５０】参考例３： Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＩＣＡ
Ｄの発現 Ｄ１１７ＥおよびＤ２２４Ｅの突然変異体を作製するた
め、ＩＣＡＤ−ＳおよびＩＣＡＤ−ＬのｃＤＮＡを突然
変異ヌクレオチドを有する２０ヌクレオチドのプライマ
ーを用いて組換えＰＣＲ法［４０］により突然変異させ
た。Ｄ１１７Ｅ／Ｄ２２４Ｅ二重突然変異体はＤ１１７
とＤ２２４の間にあるＢｇｌＩＩ部位を用いてＤ２２４
Ｅ突然変異体のＮ−末端側の半分をＤ１１７Ｅ突然変異
体のものに置換して作製した。野生型および突然変異型
のｃＤＮＡをｐＧＥＸ−２Ｔ［１２８／１２９］のグル
タチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子に
融合させた。ｐＧＥＸ−２Ｔ［１２８／１２９］はｐＧ
ＥＸ−２Ｔ（ファルマシア社）から読取り枠内にＧＳＴ
遺伝子に続けてＦＬＡＧエピトープ標識（ＤＹＫＤＤＤ
ＤＫＡ）および心筋キナーゼ認識部位（ＲＲＡＳＶ）を
挿入する［４１］ことによって誘導した。この融合タン
パク質をＥ．ｃｏｌｉＡＤ２０２株で発現させ、本質的
に製造社の指示に従ってグルタチオン−セファロース４
Ｂ（ファルマシア社）によって精製した。グルタチオン
カラムから溶出した組換えＩＣＡＤを緩衝液Ｃ中のＮａ
Ｃｌ勾配によってモノＱ・ＨＲ５／５カラムで精製し
た。
Ｄの発現 Ｄ１１７ＥおよびＤ２２４Ｅの突然変異体を作製するた
め、ＩＣＡＤ−ＳおよびＩＣＡＤ−ＬのｃＤＮＡを突然
変異ヌクレオチドを有する２０ヌクレオチドのプライマ
ーを用いて組換えＰＣＲ法［４０］により突然変異させ
た。Ｄ１１７Ｅ／Ｄ２２４Ｅ二重突然変異体はＤ１１７
とＤ２２４の間にあるＢｇｌＩＩ部位を用いてＤ２２４
Ｅ突然変異体のＮ−末端側の半分をＤ１１７Ｅ突然変異
体のものに置換して作製した。野生型および突然変異型
のｃＤＮＡをｐＧＥＸ−２Ｔ［１２８／１２９］のグル
タチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子に
融合させた。ｐＧＥＸ−２Ｔ［１２８／１２９］はｐＧ
ＥＸ−２Ｔ（ファルマシア社）から読取り枠内にＧＳＴ
遺伝子に続けてＦＬＡＧエピトープ標識（ＤＹＫＤＤＤ
ＤＫＡ）および心筋キナーゼ認識部位（ＲＲＡＳＶ）を
挿入する［４１］ことによって誘導した。この融合タン
パク質をＥ．ｃｏｌｉＡＤ２０２株で発現させ、本質的
に製造社の指示に従ってグルタチオン−セファロース４
Ｂ（ファルマシア社）によって精製した。グルタチオン
カラムから溶出した組換えＩＣＡＤを緩衝液Ｃ中のＮａ
Ｃｌ勾配によってモノＱ・ＨＲ５／５カラムで精製し
た。
【００５１】参考例４： ジャーカット細胞の形質転
換、細胞死検定およびウェスタンブロッティング 野生型のＩＣＡＤ−ＳおよびＩＣＡＤ−Ｌ、およびそれ
らの二重突然変異体のＮ−末端をＦＬＡＧエピトープで
標識し、ｐＥＦ−ＢＯＳベクターに連結した［４２］。
ヒトジャーカット細胞にＩＣＡＤ発現プラスミドおよび
ｐＢＬＩＩｈｙｇを電気穿孔法により報告［１０］通り
に共遺伝子移入した。ハイグロマイシンＢ（８００μｇ
／ｍＬ）耐性の形質転換体を釣り上げて増殖させた。個
々のクローン中のＩＣＡＤ発現を抗−ＦＬＡＧモノクロ
ーナル抗体（クローンＭ２、コダック社）を用いるウェ
スタンブロッティングによって分析した。アポトーシス
を起こさせるため、ジャーカット細胞（２．５×１０5
細胞／ｍＬ）を０．５μｇ／ｍＬのマウス抗ヒトＦａｓ
モノクローナル抗体（クローンＣＨ１１、ＭＢＬ社）ま
たは１０μＭ−スタウロスポリンとともに３７℃でイン
キュベーションした。細胞死はＲ＆Ｄシステムズ社から
のキットを用いるアネキシンＶ法［３１］によって検定
した。ＤＮＡ断片化は報告の通りに検定した［１０］。
ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの蛋白分解はヒ
トポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼに対するマウ
スモノクローナル抗体（Ｇ．Ｇ．Ｐｏｉｒｉｅｒ博士提
供）を用いるウェスタンブロッティングによって測定し
た。細胞質中のカスパーゼ３活性を測定するにはカスパ
ーゼ３認識部位を有するペプチド（ＤＥＶＤＡＰＫ）を
強螢光性の（７−メトキシクマリン−４−イル）アセチ
ル基（ＭＣＡ）およびそれを消光するペプチド研究所の
２，４−ジニトロフェニル（Ｄｎｐ）基と結合して得ら
れた生成物ＭＣＡ−ＤＥＶＤＡＰＫ（ｄｎｐ）を基質と
して使用した。
換、細胞死検定およびウェスタンブロッティング 野生型のＩＣＡＤ−ＳおよびＩＣＡＤ−Ｌ、およびそれ
らの二重突然変異体のＮ−末端をＦＬＡＧエピトープで
標識し、ｐＥＦ−ＢＯＳベクターに連結した［４２］。
ヒトジャーカット細胞にＩＣＡＤ発現プラスミドおよび
ｐＢＬＩＩｈｙｇを電気穿孔法により報告［１０］通り
に共遺伝子移入した。ハイグロマイシンＢ（８００μｇ
／ｍＬ）耐性の形質転換体を釣り上げて増殖させた。個
々のクローン中のＩＣＡＤ発現を抗−ＦＬＡＧモノクロ
ーナル抗体（クローンＭ２、コダック社）を用いるウェ
スタンブロッティングによって分析した。アポトーシス
を起こさせるため、ジャーカット細胞（２．５×１０5
細胞／ｍＬ）を０．５μｇ／ｍＬのマウス抗ヒトＦａｓ
モノクローナル抗体（クローンＣＨ１１、ＭＢＬ社）ま
たは１０μＭ−スタウロスポリンとともに３７℃でイン
キュベーションした。細胞死はＲ＆Ｄシステムズ社から
のキットを用いるアネキシンＶ法［３１］によって検定
した。ＤＮＡ断片化は報告の通りに検定した［１０］。
ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの蛋白分解はヒ
トポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼに対するマウ
スモノクローナル抗体（Ｇ．Ｇ．Ｐｏｉｒｉｅｒ博士提
供）を用いるウェスタンブロッティングによって測定し
た。細胞質中のカスパーゼ３活性を測定するにはカスパ
ーゼ３認識部位を有するペプチド（ＤＥＶＤＡＰＫ）を
強螢光性の（７−メトキシクマリン−４−イル）アセチ
ル基（ＭＣＡ）およびそれを消光するペプチド研究所の
２，４−ジニトロフェニル（Ｄｎｐ）基と結合して得ら
れた生成物ＭＣＡ−ＤＥＶＤＡＰＫ（ｄｎｐ）を基質と
して使用した。
【００５２】
【発明の効果】本明細書に記載した発明の成果は、ＣＡ
Ｄが、長い間求められてきたアポトーシスの間に染色体
ＤＮＡを切断するＤＮアーゼであること、を確証したこ
とにある。ＣＡＤはアポトーシスプロテアーゼ（カスパ
ーゼ）を染色体ＤＮＡの分解と結びつけるものであり、
そのＣＡＤの確認および分子クローニングは細胞死因子
受容体または抗癌剤の作用に端を発するアポトーシス過
程全体の理解に寄与するものである。また、ＣＡＤまた
はそれをコードする遺伝子、ＣＡＤｃＤＮＡは、望まし
くない細胞、例えば癌細胞の除去、消滅の促進に、直接
あるいは間接的に利用することができる。さらに、ＣＡ
Ｄはアポトーシスが関与する細胞死に関する研究用試薬
として用いることができる。
Ｄが、長い間求められてきたアポトーシスの間に染色体
ＤＮＡを切断するＤＮアーゼであること、を確証したこ
とにある。ＣＡＤはアポトーシスプロテアーゼ（カスパ
ーゼ）を染色体ＤＮＡの分解と結びつけるものであり、
そのＣＡＤの確認および分子クローニングは細胞死因子
受容体または抗癌剤の作用に端を発するアポトーシス過
程全体の理解に寄与するものである。また、ＣＡＤまた
はそれをコードする遺伝子、ＣＡＤｃＤＮＡは、望まし
くない細胞、例えば癌細胞の除去、消滅の促進に、直接
あるいは間接的に利用することができる。さらに、ＣＡ
Ｄはアポトーシスが関与する細胞死に関する研究用試薬
として用いることができる。
【００５３】 参考文献 1. Jacobson, M.D., Weil, M. & Raff, M.C., Cell, 88, 347-354 (1997). 2. Nagata, S., Cell, 88, 355-365 (1997). 3. Wyllie, A.H., Kerr, J.F.R. & Currie, A.R., Int. Rev. Cytol., 68, 251-306 (1980). 4. Compton, M.M., Cancer Metastasis Rev., 11, 105-119 (1992). 5. Wyllie, A.H., Morris, R.G., Smith, A.L. & Dunlop, D., J. Pathol., 142, 66-77 (1984). 6. Wyllie, A.H., Nature, 284, 555-556 (1980). 7. Peitsch, M.C. et al., EMBO J., 12, 371-377 (1993). 8. Montague, J.W., Huges, F.J. & Cidlowski, J.A., J. Biol. Chem., 272, 6677-6684 (1997). 9. Barry, M. & Eastman, A., Arch. Biochem. Biophys., 300, 440-450 (1993). 10. Nagata, S. & Goldstein, P., Science, 267, 1449-1456 (1995). 11. Enari, M., Hug, H. & Nagata, S., Nature, 375, 78-81 (1995). 12. Enari, M., Talanian, R.V., Wong, W.W. & Nagata, S., Nature, 380, 723-726 (1996). 13. Longthorne, V.& Williams, G., EMBO J., 16, 3805-3812 (1997). 14. Armstrong, R.C., et al., J. Biol. Chem., 271, 16850-16855 (1996). 15. Henkart, P.A., Immunity, 4, 195-201 (1996). 16. Alnemri, E.S. et al., Cell, 87, 171 (1996). 17. Talanian, R.V. et al., J. Biol. Chem., 272, 9677-9682 (1997). 18. Thornberry, N.A. et al., J. Biol. Chem., 272, 17907-17911 (1997). 19. Martin, S. & Green, D., Cell, 82, 349-352 (1995).
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【００５５】 30. Verma, I., Stevenson, J., Schwarz, E., Van Antwerp, D., & Miyamoto, S., Genes & Develop., 9, 2723-2735 (1995). 31. Baldwin, A., Annu. Rev. Immunol., 14, 649-681 (1996). 32. Beg, A. et al., Genes & Develop., 6, 1899-1913 (1992). 33. Wallis, R. et al., Eur. J. Biochem., 207, 687-695 (1992). 34. Hartl, F.-U., Hlodan, R. & Langer, T., Trends in Biol. Sci., 19, 20-25 (1994). 35. Shi, G. et al., Neuron, 16, 843-852 (1996). 36. Chen, P. & Hochstrasser, M., Cell, 86, 961-972 (1996). 37. Kamens, J. et al., J. Biol. Chem., 270, 15250-15256 (1995). 38. Iwamatsu, A. & Yoshida-Kubomura, N., J. Biochem. (Tokyo), 120, 29-34 (1996). 39. Sambrook, J., Fretsch, E.F. & Maniatis, T., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", in 2nd Eddition, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY, 1989. 40. Suda, T., Takahasi, T., Goldstein, P. & Nagata, S., Cell, 75, 1169-1178 (1993). 41. "Antisense RNA and DNA" WILET-LISS刊 1992 P.1-50, J.Med.Chem. 36, 1923-1937(1993). 42. Current Protcols In Immunology 2.4.1-2.6.6. 43. Kohler and Milstein, Nature,256,495-497, 1975. 44. Ueda, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79:4386-4390, 1982.
【００５６】
【配列表】配列表 ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ <110> Osaka Bioscience Institute <120> Caspase-activated DNases <130> 163868 <140> <141> <150> JP 369443/1997 <151> 1997-12-25 <160> 6 <117> Word (MS-DOS text) <210> 1 <211> 1038 <212> DNA <213> human <400> 1 atgtgcgcgg tgctccgcca acccaaatgc gtcaagttgc gagccctaca tagcgcctgc 60 aagttcggcg tggcggcccg gagctgccag gagctgctgc gtaagggctg cgtccgcttc 120 cagctcccga tgcccggttc ccggctgtgc ctgtacgaag atggcacgga ggtgacggac 180 gactgcttcc cgggccttcc caacgacgct gagctcctat tgctcaccgc tggcgagacc 240 tggcatggct atgtgagtga catcacacgt ttcctcagtg tgtttaatga gccacatgcc 300 ggcgtcatcc aggctgcacg gcaactgctg tcagatgagc aggccccact gaggcaaaag 360 ctgctggccg atcttctgca tcacgtgagc cagaatatta ctgcagagac ccgggagcag 420 gacccatcct ggtttgaagg tttggagtcg agattcagga ataagtcggg ctatctgaga 480 tacagctgtg agagtcggat ccggggttac ctaagagagg tgagcgctta cacctctatg 540 gtggatgaag cagctcaaga agagtacctg cgagtccttg gctccatgtg ccagaagctc 600 aaatcggtgc agtacaatgg cagctatttc gacagaggtg cagaggccag cagccgcctc 660 tgtactccag aaggatggtt ctcctgccag ggcccctttg acctggagag ctgtctttcc 720 aagcactcca tcaaccccta tggcaacaga gagagccgga tcctcttcag tacctggaac 780 ctggatcata taatagagaa gaagcgcacc gtggtaccca cgctggctga agccatccag 840 gatgggaggg aggtgaactg ggagtacttc tacagcctgc tcttcactgc cgagaacctg 900 aagctggtgc acatcgcctg ccacaagaag accacacaca agctggagtg cgaccgcagt 960 aggatctatc ggcctcagac aggatccagg aggaagcagc ctgctcggaa gaagcgccct 1020 gctcggaagc gctagtga 1038
【００５７】 <210> 2 <211> 344 <212> PRT <213> human <400> 2 Met Cys Ala Val Leu Arg Gln Pro Lys Cys Val Lys Leu Arg Ala 1 5 10 15 Leu His Ser Ala Cys Lys Phe Gly Val Ala Ala Arg Ser Cys Gln 20 25 30 Glu Leu Leu Arg Lys Gly Cys Val Arg Phe Gln Leu Pro Met Pro 35 40 45 Gly Ser Arg Leu Cys Leu Tyr Glu Asp Gly Thr Glu Val Thr Asp 50 55 60 Asp Cys Phe Pro Gly Leu Pro Asn Asp Ala Glu Leu Leu Leu Leu 65 70 75 Thr Ala Gly Glu Thr Trp His Gly Tyr Val Ser Asp Ile Thr Arg 80 85 90 Phe Leu Ser Val Phe Asn Glu Pro His Ala Gly Val Ile Gln Ala 95 100 105 Ala Arg Gln Leu Leu Ser Asp Glu Gln Ala Pro Leu Arg Gln Lys 110 115 120 Leu Leu Ala Asp Leu Leu His His Val Ser Gln Asn Ile Thr Ala 125 130 135 Glu Thr Arg Glu Gln Asp Pro Ser Trp Phe Glu Gly Leu Glu Ser 140 145 150 Arg Phe Arg Asn Lys Ser Gly Tyr Leu Arg Tyr Ser Cys Glu Ser 155 160 165 Arg Ile Arg Gly Tyr Leu Arg Glu Val Ser Ala Tyr Thr Ser Met 170 175 180 Val Asp Glu Ala Ala Gln Glu Glu Tyr Leu Arg Val Leu Gly Ser 185 190 195 Met Cys Gln Lys Leu Lys Ser Val Gln Tyr Asn Gly Ser Tyr Phe 200 205 210 Asp Arg Gly Ala Glu Ala Ser Ser Arg Leu Cys Thr Pro Glu Gly 215 220 225 Trp Phe Ser Cys Gln Gly Pro Phe Asp Leu Glu Ser Cys Leu Ser 230 235 240 Lys His Ser Ile Asn Pro Tyr Gly Asn Arg Glu Ser Arg Ile Leu 245 250 255 Phe Ser Thr Trp Asn Leu Asp His Ile Ile Glu Lys Lys Arg Thr 260 265 270 Val Val Pro Thr Leu Ala Glu Ala Ile Gln Asp Gly Arg Glu Val 275 280 285 Asn Trp Glu Tyr Phe Tyr Ser Leu Leu Phe Thr Ala Glu Asn Leu 290 295 300 Lys Leu Val His Ile Ala Cys His Lys Lys Thr Thr His Lys Leu 305 310 315 Glu Cys Asp Arg Ser Arg Ile Tyr Arg Pro Gln Thr Gly Ser Arg 320 325 330 Arg Lys Gln Pro Ala Arg Lys Lys Arg Pro Ala Arg Lys Arg 335 340 344
【００５８】 <210> 3 <211> 996 <212> DNA <213> human <400> 3 atggagctgt cgcggggagc cagcgcccca gacccggacg atgtccggcc tctcaaaccg 60 tgtctgctac gccgcaacca cagccgcgat cagcacggcg tggcagcctc cagtctcgag 120 gagctgagga gcaaagcctg tgaactcctg gccattgata agtccctgac gccgatcacc 180 ctggtcctgg ctgaggacgg gaccatagtg gatgacgatg actacttcct ctgccttcct 240 tccaatacga agtttgtggc gttggcctgc aatgagaagt ggacttataa tgattccgat 300 ggagggacgg cttgggtttc ccaagagtcc tttgaggcag atgagccgga cagcagggca 360 ggggtgaagt ggaagaatgt ggccaggcag ctgaaagaag atctgtccag catcatcctg 420 ctgtcagaag aggacctcca agcgctcatc gacatcccat gtgcagagct ggctcaggaa 480 ctctgccaaa gctgtgccac tgtccagggg ctgcagagca cactccagca ggtgcttgac 540 cagagagagg aagcccgcca gtccaagcag ctcctggaac tttacctcca ggccttggag 600 aaagagggca acatcttgtc caaccagaaa gagtccaaag ctgccctcag tgaagagctg 660 gatgcagttg acacaggcgt cggcagagag atggcttcgg aagtgctgct cagaagccag 720 atccttacca cactgaagga gaagcctgcc ccagagctga gtttatctag tcaggatttg 780 gagtctgtct ccaaggagga tcccaaagcc ctggctgtcg ctctgagctg ggacataagg 840 aaggcagaga cagtccagca ggcctgcacc acggagctcg ccctgcggct gcagcaagtg 900 cagagcttgc attcactcag gaatctatca gcaaggagga gcccactgcc tggggaacca 960 cagcgaccca aacgagccaa acgagactcc tcgtag 996
【００５９】 <210> 4 <211> 331 <212> PRT <213> human <400> 4 Met Glu Leu Ser Arg Gly Ala Ser Ala Pro Asp Pro Asp Asp Val 1 5 10 15 Arg Pro Leu Lys Pro Cys Leu Leu Arg Arg Asn His Ser Arg Asp 20 25 30 Gln His Gly Val Ala Ala Ser Ser Leu Glu Glu Leu Arg Ser Lys 35 40 45 Ala Cys Glu Leu Leu Ala Ile Asp Lys Ser Leu Thr Pro Ile Thr 50 55 60 Leu Val Leu Ala Glu Asp Gly Thr Ile Val Asp Asp Asp Asp Tyr 65 70 75 Phe Leu Cys Leu Pro Ser Asn Thr Lys Phe Val Ala Leu Ala Cys 80 85 90 Asn Glu Lys Trp Thr Tyr Asn Asp Ser Asp Gly Gly Thr Ala Trp 95 100 105 Val Ser Gln Glu Ser Phe Glu Ala Asp Glu Pro Asp Ser Arg Ala 110 115 120 Gly Val Lys Trp Lys Asn Val Ala Arg Gln Leu Lys Glu Asp Leu 125 130 135 Ser Ser Ile Ile Leu Leu Ser Glu Glu Asp Leu Gln Ala Leu Ile 140 145 150 Asp Ile Pro Cys Ala Glu Leu Ala Gln Glu Leu Cys Gln Ser Cys 155 160 165 Ala Thr Val Gln Gly Leu Gln Ser Thr Leu Gln Gln Val Leu Asp 170 175 180 Gln Arg Glu Glu Ala Arg Gln Ser Lys Gln Leu Leu Glu Leu Tyr 185 190 195 Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu Gly Asn Ile Leu Ser Asn Gln Lys 200 205 210 Glu Ser Lys Ala Ala Leu Ser Glu Glu Leu Asp Ala Val Asp Thr 215 220 225 Gly Val Gly Arg Glu Met Ala Ser Glu Val Leu Leu Arg Ser Gln 230 235 240 Ile Leu Thr Thr Leu Lys Glu Lys Pro Ala Pro Glu Leu Ser Leu 245 250 255 Ser Ser Gln Asp Leu Glu Ser Val Ser Lys Glu Asp Pro Lys Ala 260 265 270 Leu Ala Val Ala Leu Ser Trp Asp Ile Arg Lys Ala Glu Thr Val 275 280 285 Gln Gln Ala Cys Thr Thr Glu Leu Ala Leu Arg Leu Gln Gln Val 290 295 300 Gln Ser Leu His Ser Leu Arg Asn Leu Ser Ala Arg Arg Ser Pro 305 310 315 Leu Pro Gly Glu Pro Gln Arg Pro Lys Arg Ala Lys Arg Asp Ser 320 325 330 Ser
【００６０】 <210> 5 <211> 798 <212> DNA <213> human <400> 5 atggagctgt cgcggggagc cagcgcccca gacccggacg atgtccggcc tctcaaaccg 60 tgtctgctac gccgcaacca cagccgcgat cagcacggcg tggcagcctc cagtctcgag 120 gagctgagga gcaaagcctg tgaactcctg gccattgata agtccctgac gccgatcacc 180 ctggtcctgg ctgaggacgg gaccatagtg gatgacgatg actacttcct ctgccttcct 240 tccaatacga agtttgtggc gttggcctgc aatgagaagt ggacttataa tgattccgat 300 ggagggacgg cttgggtttc ccaagagtcc tttgaggcag atgagccgga cagcagggca 360 ggggtgaagt ggaagaatgt ggccaggcag ctgaaagaag atctgtccag catcatcctg 420 ctgtcagaag aggacctcca agcgctcatc gacatcccat gtgcagagct ggctcaggaa 480 ctctgccaaa gctgtgccac tgtccagggg ctgcagagca cactccagca ggtgcttgac 540 cagagagagg aagcccgcca gtccaagcag ctcctggaac tttacctcca ggccttggag 600 aaagagggca acatcttgtc caaccagaaa gagtccaaag ctgccctcag tgaagagctg 660 gatgcagttg acacaggcgt cggcagagag atggcttcgg aagtgctgct cagaagccag 720 atccttacca cactgaagga gaagcctgcc ccagagctga gtttatctag tcaggatttg 780 gaggtgggca agaactag 798
【００６１】 <210> 6 <211> 265 <212> PRT <213> human <400> 6 Met Glu Leu Ser Arg Gly Ala Ser Ala Pro Asp Pro Asp Asp Val 1 5 10 15 Arg Pro Leu Lys Pro Cys Leu Leu Arg Arg Asn His Ser Arg Asp 20 25 30 Gln His Gly Val Ala Ala Ser Ser Leu Glu Glu Leu Arg Ser Lys 35 40 45 Ala Cys Glu Leu Leu Ala Ile Asp Lys Ser Leu Thr Pro Ile Thr 50 55 60 Leu Val Leu Ala Glu Asp Gly Thr Ile Val Asp Asp Asp Asp Tyr 65 70 75 Phe Leu Cys Leu Pro Ser Asn Thr Lys Phe Val Ala Leu Ala Cys 80 85 90 Asn Glu Lys Trp Thr Tyr Asn Asp Ser Asp Gly Gly Thr Ala Trp 95 100 105 Val Ser Gln Glu Ser Phe Glu Ala Asp Glu Pro Asp Ser Arg Ala 110 115 120 Gly Val Lys Trp Lys Asn Val Ala Arg Gln Leu Lys Glu Asp Leu 125 130 135 Ser Ser Ile Ile Leu Leu Ser Glu Glu Asp Leu Gln Ala Leu Ile 140 145 150 Asp Ile Pro Cys Ala Glu Leu Ala Gln Glu Leu Cys Gln Ser Cys 155 160 165 Ala Thr Val Gln Gly Leu Gln Ser Thr Leu Gln Gln Val Leu Asp 170 175 180 Gln Arg Glu Glu Ala Arg Gln Ser Lys Gln Leu Leu Glu Leu Tyr 185 190 195 Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu Gly Asn Ile Leu Ser Asn Gln Lys 200 205 210 Glu Ser Lys Ala Ala Leu Ser Glu Glu Leu Asp Ala Val Asp Thr 215 220 225 Gly Val Gly Arg Glu Met Ala Ser Glu Val Leu Leu Arg Ser Gln 230 235 240 Ile Leu Thr Thr Leu Lys Glu Lys Pro Ala Pro Glu Leu Ser Leu 245 250 255 Ser Ser Gln Asp Leu Glu Val Gly Lys Asn 260 265
【図１】 ４０ｋＤａタンパク質としてＣＡＤを確認し
た電気泳動写真の模写図である。
た電気泳動写真の模写図である。
【図２】 ｃＤＮＡ配列から予測したマウスＣＡＤの１
文字表示によるアミノ酸配列である。
文字表示によるアミノ酸配列である。
【図３】 ＣＡＤｍＲＮＡの組織分布を示す。
【図４】 ＣＯＳ細胞中でのマウスＣＡＤの発現を示す
電気泳動写真の模写図である。
電気泳動写真の模写図である。
【図５】 無細胞系でのマウスＣＡＤの発現を示す電気
泳動写真の模写図である。
泳動写真の模写図である。
【図６】 ＣＡＤのＩＣＡＤ−Ｌへの結合を示す電気泳
動写真の模写図である。
動写真の模写図である。
【図７】 アポトーシスにおけるＣＡＤおよびＩＣＡＤ
の機能を示す模式図である。
の機能を示す模式図である。
Claims (10)
- 【請求項１】 以下の（ａ）または（ｂ）から選択され
るＤＮアーゼ： （ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタン
パク質、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列にお
いて１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換および／ま
たは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ該タンパク
質と同等のＤＮアーゼ活性を有するタンパク質。 - 【請求項２】 そのＤＮアーゼ活性がカスパーゼを介し
て活性化される請求項１記載のＤＮアーゼ。 - 【請求項３】 請求項１または２記載のＤＮアーゼをコ
ードしている遺伝子。 - 【請求項４】 配列番号１に示されるＤＮＡ配列を有す
る請求項３記載の遺伝子。 - 【請求項５】 請求項３記載の遺伝子を含有するベクタ
ー。 - 【請求項６】 発現ベクターである請求項５記載のベク
ター。 - 【請求項７】 請求項６記載の発現ベクターにより形質
転換された宿主細胞。 - 【請求項８】 請求項３記載の遺伝子と相補的な配列を
有する、８塩基以上からなるＤＮＡもしくはＲＮＡまた
はそれらの化学的修飾体。 - 【請求項９】 請求項８記載のＤＮＡもしくはＲＮＡま
たはそれらの化学的修飾体を含有するベクター。 - 【請求項１０】 請求項１または２記載のＤＮアーゼに
対する抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10369093A JPH11239494A (ja) | 1997-12-25 | 1998-12-25 | カスパ―ゼ活性化ｄｎア―ゼ |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP36944397 | 1997-12-25 | ||
| JP9-369443 | 1997-12-25 | ||
| JP10369093A JPH11239494A (ja) | 1997-12-25 | 1998-12-25 | カスパ―ゼ活性化ｄｎア―ゼ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11239494A true JPH11239494A (ja) | 1999-09-07 |
Family
ID=26582067
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10369093A Withdrawn JPH11239494A (ja) | 1997-12-25 | 1998-12-25 | カスパ―ゼ活性化ｄｎア―ゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11239494A (ja) |
-
1998
- 1998-12-25 JP JP10369093A patent/JPH11239494A/ja not_active Withdrawn
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050616 |
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| A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20070709 |