JP2003522801A - 心疾患治療用カスパーゼ−３またはカスパーゼ活性化デオキシリボヌクレアーゼ（ｃａｄ）阻害剤の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、心疾患、特に左心室の不全の予防または治療に使用する、カスパーゼ-3またはカスパーゼ活性化デオキシリボヌクレアーゼ（CAD）の阻害剤に関するものである。本発明の特別な態様によると阻害剤はICADである。この阻害剤は望ましくはこの阻害剤をコードする遺伝子を発現し得る形で含むアデノウイルスベクターを介して投与する。本発明はまた創造的治療適用のための阻害剤、すなわちカスパーゼ-3またはCADあるいはこれらの化合物をコードする遺伝子の発現を阻害する化合物の同定方法に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明はカスパーゼ−3またはカスパーゼ活性化デオキシリボヌクレアーゼ（C
AD）阻害剤を心臓疾患、特に左心室不全の治療に使用することに関係する。本発
明の特有の態様においてその阻害剤はICADである。阻害剤の投与は、特に発現し
うる形で阻害剤をコードした遺伝子を含むアデノウイルスによって行われる。最
終的に、本発明は上記治療適用のための阻害剤、言い換えるとカスパーゼ−3ま
たはCADまたはそれらの化合物をコードする遺伝子の発現を阻害する化合物、を
同定する方法に関係する。

【０００２】 アポトーシスは生物の正常な発育及び生理的平衡にとって必須な遺伝的に調節
された形の細胞死である。多くの退行性疾患は異常に高いレベルのアポトーシス
に関連している。多くの心血管疾患、例えば心筋梗塞及び鬱血性心不全（鬱血性
心不全、CHF）において心筋細胞のプログラムされた細胞死を認めることは可能
であった。アポトーシスは−分化し終わった組織として−最早分裂できなくなっ
た成熟心筋細胞に対する持続的成長刺激の結果ともいえる。心筋が衰えたにもか
かわらず慢性的に変化する血液循環の要求に対する代償として、全身および局所
のアドレナリン作動系およびレニン/アンジオテンシン系の上方調節及び種々の
サイトカインにより仲介される肥大反応を生じる。しかし、これまでこのような
心臓疾患に対してアポトーシスの阻止を目的とした治療は行われていなかった。
このような心臓疾患に薬理学的介入がこれまでに行われたが、主としてβ‐アド
レナリン阻害に基づくものであり、全ての症例で成功するものでもないし、また
しばしば不適当な反応を示す。

【０００３】 したがって、本発明は本質的に心臓疾患の薬理学的治療に使用する代替手段を
提供する技術的問題に基づいている。

【０００４】 その技術的問題は特許請求の範囲に示す態様を提供することにより解決された
。心筋のアポトーシスは、高度に複雑な方法で調節されそして二つの主なシグナ
ル伝達経路がカスパーゼファミリーの活性化及びカスパーゼ活性化DNA分解酵素
（CAD）の核内への移動促進を生じる細胞自殺の仕組みである：（a）「死受容体
」信号伝達（例えば、Fas, TNF及びDR3-DR6受容体）及び（b）ミトコンドリア
からチトクロームbの放出及び続くApafによるプロカスパーゼ9のトランス活性化
。システインプロテアーゼであるカスパーゼファミリーは哺乳動物ではアポトー
シスの開始を調節している。カスパーゼ−3はキー酵素であり、アポトシス表現
型の発現に含まれる上流に位置する標的、例えばゲルソリン、PAK2、核ラミン及
び特に、DNAフラグメンテーション因子の阻害サブニット（ICAD）を切断する。
アポトーシスの最も重要な生化学的特徴は染色体DNAがヌクレオソーム単位に切
断することであり、これはアポトーシスの最後の事象のように見える。アポトー
シスにおけるDNA分解に必要なヌクレアーゼはCADである。CADはそのDNA分解酵素
活性を抑制するためにICADとの複合体として生産される。アポトーシス刺激によ
り上流で活性化されたカスパーゼ−3はICADを切断し、次いでCADを核に入り込ま
せそして染色体DNAを分解する。本発明を生み出すための研究中に、心筋アポト
ーシスの過程における二つのキー分子、カスパーゼ−3及びCADの活性は、循環動
態及び生化学的濃度の変化が対応するヒト心臓疾患と同じである動物モデルCHF
において増加することが判明した。カスパーゼ−3の活性化は最終的にCADの活性
化を生ずるので、両酵素は心不全の進展に必要である。本研究により、心筋細胞
においてアデノウイルス仲介p35またはICADの発現によってカスパーゼ−3及びCA
D活性を著明に阻害しうることを示すことができた。これらのキー酵素の阻害はI
CADによるDNAフラグメンテーションの減少に反映されるが、p35による程度は少
なかった。ICAD発現によりインビトロにおいてDNA分解の阻害効果がより明らか
であったので、ICADをコードする導入遺伝子の発現について心不全ウサギにおい
てインビボでも検討した。対照の組換えアデノウイルスで感染したウサギ心筋で
は心筋細胞アポトーシスに対して無効であったが、ICADを発現した不全心の循環
機能は少なくとも部分的に回復した（図6）。このように、カスパーゼ−3誘発DN
A分解の減少を伴う左心室の収縮機能の改善及び拡張期末圧の低下を観察するこ
とができた。上記の現象において、大部分の心筋細胞においてアポトーシスに関
する酵素活性が増加し、アポトーシスの準備ができているが実際にその過程が生
じていない、前アポトーシス状態にあると推測される。しかし、この結果は、心
筋のアポトーシスが心不全の進展に関与しておりまた心筋細胞のアポトーシスの
阻止は有用な機能であること、すなわちアポトーシスの阻止は明らかに治療介入
の魅力的な目標であることを示している。不全心にAd-p35またはAd-ICADを感染
させた結果によると、心不全例における抗アポトーシス療法は核のDNA分解を防
ぐだけでなく、ザルコメア構造を維持し、したがってまだ生存している心筋細胞
の収縮力を改善することを示すことができた。したがって、心筋細胞のアポトー
シスが関係する上述の心臓疾患における治療介入には、CADまたはカスパーゼ−3
の活性を阻害する因子、またはそれをコードする遺伝子の投与が有益であろう。
他方、CADまたはカスパーゼ−3をコードする遺伝子の発現を阻害できることも治
療的に有用である。したがって、そのような阻害は種々のレベル、例えば遺伝子
レベル（「ノックアウト」、アンチセンスRNAによる翻訳の阻害、またはリボザ
イム）またはタンパクレベル（CADまたはカスパーゼ−3阻害抗体、ICADなどによ
る）で生じる。

【０００５】 したがって、本発明は、心臓疾患、特に心不全、特に左心室不全の予防または
治療にカスパーゼ−3またはカスパーゼ活性化デオキシリボヌクレアーゼ（CAD）
の阻害剤を使用することに関係している。

【０００６】 本発明の望ましい態様において、阻害剤はCADまたはカスパーゼ−3をコードす
る遺伝子の発現を阻害する化合物、例えばリボザイムまたはアンチセンスRNAで
ある。CADまたはカスパーゼ−3をコードする遺伝子の全核酸配列は解っているの
で、当業者は通常の方法、例えば下記例に記述したような方法により、そのよう
な化合物を同定しその作用を調べることができる。

【０００７】 本発明の非常に望ましい態様は、CADまたはカスパーゼ−3、またはその部分、
望ましくはコード領域、をコードする遺伝子により転写されたmRNAに相補的であ
りまたそのmRNAに特異的に結合することができそしてその結果としてCADまたは
カスパーゼ−3の合成が減少または阻害されることが特徴であるアンチセンスRNA
に関係している。本発明のさらに非常に望ましい態様は、CADまたはカスパーゼ
−3、またはその部分、望ましくはコード領域、をコードする遺伝子により転写
されたmRNAに相補的でありまたそのmRNAに特異的に結合しそしてそれを切断する
ことができ、その結果としてCADまたはカスパーゼ−3の合成が減少または阻害さ
れることが特徴であるリボザイムに関係する。公開されているCADまたはカスパ
ーゼ−3配列から出発して、当業者は適当なアンチセンスRNAを調製及び使用する
ことができる。適する方法は例えばEP-B1 0 223 399またはEP-A1 0 458、に記述
されている。リボザイムはRNA酵素であり、一本鎖RNAからなる。それはほかのRN
A、例えばCADまたはカスパーゼ−3をコードする配列により転写されたRNAを分子
間的に切断することができる。そのリボザイムは原則として二つのドメインを持
たなければならない、（1）触媒ドメイン及び（2）標的RNAの切断の前提条件で
ある、標的RNAに相補的でありそれに結合することができるドメイン。文献に記
述されている方法から出発して、目的とするRNAを特異的な、予め選択した部位
で切断する特異的なリボザイムを構築することがいずれ可能になる（例えば、Ta
nner et al., in: Antisense Research and Applications, CRC Press, Inc. (1
993), 415-426を参照）。

【０００８】 本発明にしたがってカスパーゼ−3またはCAD阻害剤を使用するさらに望ましい
態様において、阻害剤は下記例に記述するICADまたはバクロウイルス‐p35であ
る。

【０００９】 本発明にしたがってカスパーゼ−3またはCAD阻害剤を使用するさらに望ましい
態様において、阻害剤はカスパーゼ−3またはCADまたはそのフラグメントに結合
する抗体である。その抗体はモノクロナール、ポリクロナールまたは合成抗体ま
たはそのフラグメントであってもよい。これに関連して、用語「フラグメント」
は完全抗体として同一の抗原決定基特異性を有するモノクロナール抗体（例えば
Fab、FvまたはFvフラグメント）の一本鎖の部分全てを意味する。そのようなフ
ラグメントの調製は当業者には既知である。本発明の抗体はモノクロナール抗体
であることが望ましい。本発明の抗体は、カスパーゼ−3またはCADタンパクまた
はその合成フラグメントが免疫原として役立つことが望ましい標準的方法で調製
することができる。モノクロナール抗体を得る方法は当業者には既知である。モ
ノクロナール抗体は動物（例えば、マウス）から由来する抗体、ヒト化抗体ある
いはキメラ抗体またはそのフラグメントでありうる。ヒト抗体に似たキメラ抗体
あるいはヒト化抗体では潜在的抗原性は減少しているが、標的に関する親和性は
減少していない。キメラ及びヒト化抗体またはヒト抗体に似た抗体の調製は詳細
に記述されている（例えば、Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1
989), 10029, and Verhoeyan et al., Science 239 (1988), 1534を参照）。ヒ
ト化免疫グロブリンは本質的にヒト免疫グロブリン（アクセプター免疫グロブリ
ンという）から由来する可変性基本的構造領域及び非ヒト免疫グロブリン（例え
ば、マウスの）（ドナー免疫グロブリンという）から本質的に由来する決定領域
の相補性を有している。不変部領域は存在するとすればやはり本質的にヒト免疫
グロブリンから由来する。ヒトに投与する場合、（ヒト抗体と同様）ヒト化抗体
はマウスやほかの動物種の抗体に比して多くの利点を有する：（a）ヒト免疫系
はヒト化抗体の基本構造あるいは不変部領域を異物と認識できないので、注射さ
れたその抗体に反応する抗体は完全に異物であるマウス抗体または部分的に異物
であるキメラ抗体に反応する抗体より少ない；(b)ヒト化抗体のエフェクター領
域はヒト由来であるから、ヒト免疫系のほかの部分とよく反応する、そして(c)
注射された抗体は天然に存在するヒト抗体と本質的に同等の半減期を有している
ので、ほかの動物種の抗体に比較して投与する量を少なくまた回数を減らすこと
ができる。

【００１０】 上述の阻害剤は望ましくはそれ自体が投与されるのではなく、遺伝子治療の方
法により投与されるものである、つまり、これらの阻害剤（例えば、リボザイム
、アンチセンスRNA、抗体、ICAD、バキュロウイルス‐p35）をコードするDNA配
列は望ましくは発現ベクターに挿入されて、標的器官に導入される。したがって
、本発明はこれらの阻害剤をコードするDNA配列を含む発現ベクターも包含して
いる。用語「ベクター」は、プラスミド（pUC18, pBR322, pBlueScriptなど）、
ウイルスまたはそのほかの適当な担体のことをいう。DNA配列はベクター中で、
原核または真核宿主細胞におけるその発現をさせる調節配列に機能的に連結して
いる。そのベクターは、調節配列に加えて、例えばプロモーター、典型的には複
製の起源及び形質転換宿主細胞の表現形による選択をするための特殊な遺伝子を
含んでいる。原核生物、例えばE.coli、における発現の調節配列はlac-, trpプ
ロモーターまたはT7プロモーターを含んでおり、真核生物における発現にはイー
ストのAOX1またはGAL1プロモーター及び動物細胞における発現にはCMV, SV40-,
RVS-40プロモーター、CMVまたはSV40エンハンサーを含んでいる。適切な調節配
列についてはさらにGoeddelに記述されている：Gene Expression Technology: M
ethods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)。その他の
適当なプロモーターの例はメタロチオナインI 及びポリヘドリンプロモーターで
ある。E. coliに適した発現ベクターには、例えば、pGEMEX, pUC誘導体、pGEX-2
T, pET3b及び pQE-8が含まれる。イーストにおける発現に適したベクターとして
はpY100及びYcpadlが、哺乳動物細胞における発現にはpMSXND, pKCR, pEFBOS, c
DM8及びpCEV4並びにpcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV
2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo及び pHygから由来するベクター
、が含まれる。

【００１１】 上記のDNA配列は望ましくは遺伝子治療に適したベクターに挿入され、例えば
組織特異的プロモーターの調節の下に、細胞に導入される。望ましい態様におい
て、上記DNA配列を含むベクターはウイルス、例えばアデノウイルス、ワクシニ
アウイルスまたはレトロウイルスである。適したレトロウイルスの例はMoMuLV,
HaMuSV, MuMTV, RSVまたは GaLVである。アデノウイルスは特に望ましく、特にE
1及び/またはE3変異（欠失）を持つもの、さらに加えてE4変異（欠失）を持つも
のまたは「ガットレス」アデノウイルスである。遺伝子治療に適したベクターは
さらにWO 93/04701, WO 92/22635, WO 92/20316, WO 92/19749及びWO 92/06180
に開示されている。遺伝子治療の目的には、本発明のDNA配列をコロイド状分散
体の形で標的細胞に移行することもできる。これには、例えばリポソームまたは
リポプレックスが含まれる（Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682）
。

【００１２】 この分野で既知の一般的な方法をそのDNA配列及び適当な調節配列を含む発現
ベクターの構築に使用することができる。そのような方法には、一般的な教科書
に記載されているように、例えばインビトロリコンビナントテクニック、合成操
作、並びにインビボリコンビナントテクニックが含まれる。

【００１３】 上記化合物、またはそれをコードするDNA配列またはベクターは任意に医薬品
として許容しうる担体とともに投与する。そのような医薬品の担体及び製剤は当
業者には既知である。適する担体には、例えば、リン酸バッファー食塩液、水、
乳剤、例えば油/水乳剤、湿潤剤、無菌溶液などが含まれる。適切な投与量は治
療する医師により決定され、そして種々の要因に依存する、例えば、患者の年齢
、性及び体重、心臓疾患の性質と状態、投与方法、など。

【００１４】 最終的に、本発明は上記治療方法における阻害剤として有効な化合物を同定す
る方法に関係し、その方法は(a)阻害剤として適すると思われる試験化合物をカ
スパーゼ−3またはCADまたはカスパーゼ−3またはCAD をコードする遺伝子と接
触させ、そして(b) カスパーゼ−3またはCAD活性あるいは遺伝子発現の低下を、
望ましくは試験化合物が存在しない対照試験と比較して測定する。酵素活性ある
いは遺伝子発現が低下したり完全に阻害されれば、試験化合物が阻害剤として有
効であることを示す。適当な試験法は当業者には既知であり、例として下記例に
記述する。この操作は細胞を用いたアッセイでも行うことができる。試験化合物
は、幅広い種類の化合物、天然物及び合成化合物、有機及び無機化合物、並びに
ポリマー（例えば、オリゴペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド及びポ
リヌクレオチド）並びに小型分子、抗体、糖類、脂肪酸、ヌクレオチド及びヌク
レオチド同族体、天然に存在する構造の同族体（例えば、ペプチド「類似体」、
核酸同族体など）及び多数の他の化合物であり得る。さらに、心筋細胞のアポト
ーシスを阻害する非常に多くの有用と思われる化合物を出発物質として天然物抽
出物の中からスクリーニングすることができる。そのような抽出物は多種の原料
、例えば、キノコ、放線菌、藻類、昆虫、原生動物、植物及び細菌から由来する
。活性を示す抽出物は次いで活性分子を単離するために分析する。例えば、Turn
er, J. Ethnopharmacol. 51(1-3) (1996), 39-43及びSuh, Anticancer Res. 15
(1995) 233-239を参照。CADまたはカスパーゼ−3の発現または活性に影響する試
験化合物を同定するための基本的に適切なアッセイ方式はバイオテクノロジー産
業及び医薬品産業では良く知られており、また追加的なアッセイ及びそのような
アッセイの変法は当業者には明らかである。カスパーゼ−3またはCADの発現レベ
ルの変化は当業者には良く知られた方法で調べることができる。これには、mRNA
濃度の測定（例えば、適当なプローブまたはプライマーを使用して）、タンパク
濃度に関するイムノアッセイ、RNA分解酵素保護アッセイ、増幅に基づくアッセ
イあるいはこの分野で知られている検出に適したその他の方法が含まれる。

【００１５】 心筋細胞のアポトーシスを防止することによる治療に有効な化合物の探索は大
規模に行うことができる、例えば物質ライブラリー中の多数の可能性のある化合
物をスクリーニングすることにより合成または天然分子を含む物質ライブラリー
に適用することができる。いずれの場合にも、合成分子の大きなバンクの調製及
び同時スクリーニングを良く知られているコンビナトリーケミストリーの方法に
よって行うことができる、例えば、van Breemen, Anal. Chem. 69 (1997), 2159
-2164及びLam, Anticancer Drug Des. 12 (1997), 145-167を参照。本発明の方
法はハイスループットスクリーニングとして著しく加速することもできる。ここ
に記述したアッセイはそのような方法に使用するために適当に修正することがで
きる。多くの操作法がその目的に使用できることは当業者には明白である。

【００１６】 以下の例により本発明を説明する。

【００１７】 例１： 一般的方法 （A）リコンビナントアデノウイルスの構築と精製 ラットのカスパーゼ活性化DNA分解酵素阻害剤（ICAD）またはバキュロウイル
スアポトーシス抑制p35をコードするリコンビナントアデノウイルス（E1及びD3
欠失；血清型5）をHe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, (1988), 2509
-2514による記述にしたがって調製した。次いで、ICADまたはp35をコードする配
列及びN末に”Flag”抗原決定基（Stratagene, La Jolla, CA, USA）を加えた配
列を、組織非特異的サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター及びSV40ポリア
デニル化シグナルの間にあるGFP発現”ｐAdTrack”ベクターのポリリンカー配列
に挿入した(Enari et al., Nature 391, (1988), 43-50), (Davidson and Stell
er, Nature 391, (1998), 587-591), (He et al., 上記), (Inan et al., Onkog
ene 13, (1996), 749-755)。この様にして得られたプラスミドを”pAdEasy-1”
プラスミドと共に電気耐性を有するBJ5138細菌に導入した(He et al., 上記)。
増強されたGFPの遺伝子のみを含有する対照アデノウイルスを調製するために、
プラスミド”pAdTrack”及び”pADeasy”の同時形質導入を行なった。リコンビ
ナントアデノウイルスベクターDNAは陽性クローンから抽出し、”SuperFectTM”
”遺伝子導入試薬（QIAGEN，Hilden,ドイツ）を使用してコンフルエントになっ
ていないHEK 293細胞に導入した。リコンビナントウイルス（Ad-ICAD, Ad-p35
及びAd-GFP）は細胞分解物から得られ、PCR及び制限解裂により分析した。

【００１８】 単離の後、リコンビナントアデノウイルスは150mmプレート中でコンフルエン
トになっていないHEK 293を感染させる（moi: 5 pfu/cell）ことにより大量に
調製した。細胞病原作用が発現した後48から72時間に細胞をかきとって集め、10
00×gで20分間遠心分離した。細胞ペレットをPBS及び0.25％トリトン‐X100^TMに
再懸濁した。懸濁液は室温で10分間インキュベートし、解裂したHEK細胞の核を2
500×g（20分）の遠心分離により除去した。ウイルス粒子を含む上清をCsCl段階
グラジエント（1.3及び1.4gのCsCl/ml、TEバッファーに溶解）に導入し、そして
150,000×gでの遠心分離を10℃で1.5時間行なった。1.3及び1.4 g/mlの境界に
形成されたウイルス帯をシリンジで取出し、１％サッカロース及び10％グリセロ
ールを含むPBSに対して透析を行ない、分割して‐80℃で保存した。アデノウイ
ルス力価はHEK 293細胞におけるプラークタイトレーションにより測定した（Kr
own et al., J. Clin. Invest. 98 (1996), 2854-2865）。

【００１９】 (B)H9c2心筋芽細胞の細胞培養及びアデノウイルス感染 H9c2心筋芽細胞（ATCC CRL 1446、ラット心筋芽細胞）を10％CO₂、37℃の加
湿培養器の中でDMEM, 10％FBS, 2 mmol/lグルタミン、ペニシリン（100 IE/
ml）及びストレプトマイシン（100 μg/ml）中モノレイヤーに培養した。心筋
芽細胞が70から80％のコンフルエンスに達した後、適当なアデノウイルス力価で
PBS中で遺伝子導入した。室温にて1時間インキュベートした後、培養をプレート
に戻した。アデノウイルス感染後36から48時間で細胞をそれぞれの試験に使用し
た。

【００２０】 （C）ラット及びウサギの心室心筋細胞の調製及び培養 個別のカルシウム耐性心室筋細胞を12から16週齢ウイスターラット（300‐450
g）または3ヶ月齢雄ニュージーランドウサギ（2.8‐3 kg）から単離した。取
出した心臓を大動脈を介して一定の流量でCa²⁺除去”Powell”培地（110 mmol/l
NaCl, 2.5 mmol/l KCl, 1.2 mmol/l KH₂PO₄, 1.2 mmol/l MgSO₄, 11 mmol /lグ
ルコース , 25 mmol/l NaHCO₃, 5%CO₂で平衡させpH値を7.4に調節）で潅流した
。10分後、Ca²⁺除去バッファーをII型コラゲナーゼ（Worthington, Freehold, N
ew Jersey, USA）110または218 IE/ml（それぞれラットとウサギに対して）及
び30または40μmol/l Ca²⁺（それぞれラットとウサギに対して）含有”Powell”
培地に置換し、酵素消化に切り替えた。組織の完全な消化の後、心臓を潅流装置
からはずし、心室筋を取出し持続的に酸素を供給した”Powell”培地中で機械的
に分離した。ナイロン膜（200μmメッシュ）で濾過した後、細胞懸濁を20×gで3
分間遠心分離し、そして細胞を再度0.2 mmol/l Ca²⁺含有”Powell”培地に懸濁
した。細胞を沈殿させ、ペレットを0.4 mmol/l Ca²⁺含有”Powell”培地に集め
、注意深くPowell”培地（1 mmol/l Ca²⁺）中の4％ウシ血清アルブミン（BSA）
グラジエントに導入した。20×gで2分間遠心分離した後、心筋細胞はM199培地（
MEMビタミン類、MEM非必須アミノ酸、25 mmol/l HEPES, 10 μg/lインスリン、1
00IE/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン及び100μg/mlゲンタマイシ
ンを添加）に再懸濁し、ラミニンプレコート皿（5‐10μg/cm²）上に10⁵細胞/cm ² の密度に接種し、加湿雰囲気（5％CO₂）37℃で培養した。アデノウイルスによ
る心筋細胞の感染はM199培地中へ接種後6から8時間で行なった。インビボで感染
したウサギの正常あるいは不全細胞の単離後及びアポトーシスの存在の測定に使
用した後には、4％BSAグラジエントで遠心分離して得られたペレットの形で‐80
℃で直ちに凍結した。

【００２１】 （D）ウエスタンブロット分析 （I）誘導タンパクGFP, ICAD及びp35を免疫学的に測定するために、H9c2心筋
芽細胞を10 mM HEPESバッファー、pH値7.0（40 mM β‐グリセロールリン酸、50
mM NaCl，2 mM MgCl₂, 5 mM EGTA, 1 mM DTT, 2 mM ATP, 10 mMクレアチンリン
酸、50 μg/mlクレアチンキナーゼ、1 mM PMSF, 1μg/mlロイペプチン、1μg/ml
ペプスタチン、10μg/mlアプロチニン、16μg/mlベンズアミジン、10μg/mlフェ
ナンスロリンを含有）中で感染（moi：50 pfu/cell）した後48時間で採取し、4
回凍結/溶解を繰り返すことにより破壊した。得られた分解物を15,000rpmで30分
間遠心分離し、タンパク濃度は”Bradford”アッセイで測定した。等しいタンパ
ク量（50‐200 μg）をSDS適用バッファーで希釈し、12％ポリアクリルアミド
ゲル上で分離し、電気泳動によりニトロセルロース膜（Bio-Rad Laboratories,
Munich, ドイツ）に転移した。ブロットはタンパク転移をチェックするために”
Ponceau”レッドで染色した。TBST（10 mM tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.
05 Tween-20^TM）中5％脱脂乳粉で終夜ブロッキングした後、膜を1時間、1:10,00
0（ICAD測定用）または1:1000（p35測定用）にTBST（0.1％BSA及び0.02％Naアチ
ドを添加）で希釈した抗FLAG M2抗体（Stratagene）とインキュベートした。1:
10,000希釈し、西洋ワサビパーオキシダーゼ（Sigma-Aldrich Chemie GmbH,ミュ
ンヘン、ドイツ）を結合した抗マウスIgGと膜を1時間インキュベートした後、ケ
ミルミネッセンス（”ECL”検出キット、Amersham Pharmacia Biotech,ウイーン
、オーストリア）により抗原/抗体複合体を可視化した。

【００２２】 （II）偽処置及び不全心筋の分解物中の天然ICAD切断生成物は、マウスICAD（
St. Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA）(1:1000希釈）のN-末に対するポリ
クロナールヤギ抗体を使用して測定した。対照心臓の抽出物を1 ng/μlのリコン
ビナントヒト活性カスパーゼ−3と、テトラペプチドカスパーゼ−3阻害剤DEVD-f
mk（R and D Systems, Wiesbaden,ドイツ）（100μmol/l）の存在下または非存
在下に、37℃ 30分間インキュベートした。経冠動脈偽処置心筋の抽出物中のp3
5及びα‐ザルコメアアクチンの免疫学的検出はモノクロナールマウス抗FLAG M
2抗体（1:1000希釈）及びモノクロナール抗α‐ザルコメアアクチン抗体（Sigma
, Taufkirchen,ドイツ）（1:5000希釈）を使用しておこなった。

【００２３】 （E）免疫細胞化学及び顕微鏡試験 ラミニン5μg/cm²でコートした顕微鏡スライドグラスに接種した単離成熟心室
心筋細胞に対照アデノウイルスAd-GFPまたはAd-ICADまたはAd-p35ウイルスを感
染させ（moi: 50 pfu/cell）、感染後48時間に分析した。インビボ感染したウサ
ギ心臓における導入遺伝子の発現の測定には、凍結組織を3から4μmの厚さの円
盤に凍結切片用ミクロトームで薄切した。PBSを3回注いだ後、細胞及び切片をPB
S中4％パラフォルムアルデヒドで15分間固定し、10あるいは30分間PBS中0.1％サ
ポニンで処理して透過性とした。非特異的抗体結合を避けるために、モノクロナ
ールマウス抗FLAG M2（IgG1）抗体（Stratagene, 10μg/ml）で標識する前に
心筋細胞を30分間DMEM中10％FBSで処理した。ローダミン抱合抗マウスIgG（Sant
a Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA,USA; 4 μg/ml）とインキュベーション
後、450-490 nmフィルター（GFP蛍光）及び 546 nmフィルター（ローダミン蛍光
）を使用して位相差蛍光顕微鏡（倒立顕微鏡”Axiovert 25”, Zeiss, Jena,ド
イツ）により可視化した。

【００２４】 （F）ヒストン結合DNAフラグメントのELISA 成熟心室心筋細胞におけるアポトーシスは、市販DNA及びヒストン定量用ヌク
レオソームELISA及びモノクロナールマウス抗体（Roche Diagnostics, Mannheim
,ドイツ）を使用することにより測定した。2×10³細胞の分解物中のヌクレオソ
ーム量は免疫複合体に残存するパーオキシダーゼを利用して光学的に測定した。
各例につき3検体を測定し、405 nmにおける光学密度（OD）を測定した。アポト
ーシスの増加係数は各実験群に対して、背景OD₄₀₅を差し引いた後、OD（処置）/
OD（対照）として計算した。

【００２５】 （G）カスパーゼ−3活性 カスパーゼ−3活性は、標識基質Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)-p-nitroanilideの切
断後発色団p-nitroanilideを検出する比色分析 ”CPP32”アッセイキット（Clon
tech Laboratories GmbH, Heidelberg,ドイツ）により測定した。次いで、2×10 ⁶ 成熟心筋細胞を分解し、当量のタンパクを50μmol/lのDEVD-p-nitroanilideと3
7℃ 1時間反応させた。活性は405 nmにおいて光学的測定を行ない、結果を既知
濃度のp-nitroanilideで補正した。タンパク分解活性の単位は、1 pmolのp-nitr
oanilideを25℃において生産するのに必要なカスパーゼ−3の量とした。

【００２６】 （H）ICAD活性の測定 ICAD活性は、ウサギ肝細胞核から得たDNAの分解におけるCADの阻害を測定して
計算した。核はBlobel and Potter (Science 154 (1966), 1662)の記述にしたが
って調製し、-80℃で保存した。

【００２７】 H9c2心筋芽細胞をAd-GFPまたはAd-ICAD（moi:50 pfu/cell）に感染させ、48時
間後細胞をラットα-TNF（500 E/ml）で5時間処理してCAD活性を刺激した。粗
細胞分解物の100μgタンパクを2×10⁶核と反応バッファー中インキュベートした
。反応バッファーの組成、10 mM HEPES, pH 7.0, 40 mM β‐グリセロールリン
酸、50 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5 mM EGTA, 1 mM DTT， 2 mM ATP, 10 mMクレア
チンリン酸、 50 μg/mlクレアチンキナーゼ及びタンパク分解酵素阻害剤の混合
物（1 mMフェニルメチルスルフォニルフルオリド（PMSF）、10μg/mlロイペプチ
ン、1μg/mlペプスタチン、10μg/mlアプロチニン、16μg/mlベンズアミジン、1
0μg/mlフェナンスロリン）。37℃ 90分インキュベーション後、35,000×g（5
分）遠心分離により核を回収し、100 mM tris-HCl, pH 8.5, 5 mM EDTA, 0.2 M
NaCl, 0.2% SDS, 1 mg/mlタンパク分解酵素K中で56℃ 30分分解した。次いでDN
Aを同量のイソプロパノールを加えて沈殿させ、20μlのtris-HCl, pH 8.5(1 mM
EDTA及び1 mg/ml RNA分解酵素Aを含む)に溶解し、37℃で30分間インキュベート
した。DNAはゲル電気泳動で分析した（0.5μg/ml ethidium bromideを含む1％ア
ガロース）。

【００２８】 （I）遺伝子導入及び動物の手術 成熟雄白色ニュージーランドウサギ（2-4 kg）をミダゾラム（2 mg/kg）及び
メデトミジン（150μｇ/kg）で麻酔し、挿管し人工呼吸した。左胸壁を切開し、
2個のペースメーカーを左心に装着した。この操作の後動物から挿管を除去した
。対照動物では、胸壁を切開してペースメーカーケーブルの埋め込みを行なった
がペースメーカーは作動させなかった。この手術の12時間後360ビート/分の速度
でペースメーカーを開始した。これを試験開始時及び毎週（全期間15日間）ECG
によりチェックした。ウサギ心筋へアデノウイルス遺伝子の導入は既知プロトコ
ールにしたがって行なった（Weig et al., Circulation 101, (2000), 1578-158
5）。

【００２９】 （J）インビボ循環動態及びエコーカルジオグラフのデータ 左心室の収縮力はアデノウイルス遺伝子導入の前及び7及び15日後に試験した
。ウサギは上記と同様に麻酔した。エコーカルジオグラフ記録（Mモード）は過
去の試験の記述（Gardin et al., Circ. Res. 76 (1995), 907-914）と同様に行
なった。さらに、ECG及び血圧は継続的に監視した。右頚動脈処置後、微分デバ
イスに連結した”Millar 2.5 French tip”カテーテル（Hugo Sachs, Freiburg,
ドイツ）を左心室に挿入した。カテーテルの位置は蛍光透視装置及び血圧波形
の観察によってチェックした。基礎収縮力及び左心室の圧（ペースメーカーのス
イッチを切る）を測定した後、200μlの0.9％NaClを陰性対照として注入した。
充分な平衡時間を置いた後、アドレナリンを0.1から0.8 ngの濃度で注射した。
測定は外科手術の前及びペースメーカー装着期間の7及び15日後に行なった。

【００３０】 （K）統計解析 データは独立した3実験の 平均値 ± 標準誤差 である。データを1元配置分
散分析（ANOVA）及びそれに続く”Scheffe” ポストホック分析により統計的有
意差を検定した。

【００３１】 （L）マイクロインジェクション マイクロインジェクション実験は新規に単離した偽手術ウサギ心筋細胞に”Fe
mto-Jet”マイクロインジェクション装置（Eppendorf, Hamburg,ドイツ）を使用
して行なった。5 mmol/lリン酸カリウムバッファー（pH 7.4； 100 mmol/l KCl
） 中のFITC抱合デキストラン（6 mg/ml）単独またはヒトリコンビナント活性カス
パーゼ−3（4 ng/μl及び20 ng/μl）を併用して、培地中の細胞の細胞質中に注
入した（Pi=1000 hPa, ti=0.1 sec., Pc=30 hPa）。培地には、200μmol/l BDM
(ブタンジオンモノオキシム、Sigma, Taufkirchen,ドイツ)、 10μmol/lベラパ
ミル及び任意に100μmol/l DEFD-fmkを添加した。2時間インキュベーション後、
収縮力測定及びファロイジン染色を行なった。注入された細胞はFITC蛍光により
選別した。

【００３２】 例２： ウサギにおける慢性頻脈の生理的効果 循環動態及び生化学的レベルのヒトにおける変化に相当する低拍出量慢性心不
全（CHF）モデルを使用した。その試験において、外科的な装置埋め込み中に動
物の死亡はなかったが、ペースメーカーを装着した15日間に10から20％の死亡率
が認められた。1分間360ビートのペースメーカーを15日間装着したことにより両
心室の拡張（図1c）、胸膜腔浸出液及び腹水を含む全身心不全の一般的臨床所見
を認めた。エコーカルジオグラフ検査によりCHFウサギにおいて左心室拡張期末
容積の増加及び分画径短縮の減少を認めた。循環動態測定では同様にペースメー
カーを装着したウサギにおいて高い左心室拡張期末圧及び左心室の低い収縮力（
LV+dP/dtで測定）及び弛緩（LV-dP/dtで測定）を認めた（表1（b））。エコーカ
ルジオグラフ及び循環動態測定は各ウサギについてペースメーカー埋め込み前及
びその後7及び15日（ペースメーカーのスイッチを切って）に行なった。したが
って、各ウサギを自身の対照として使用した。偽手術ウサギは循環動態パラメー
タに関して変動を示さなかった。不全心筋において、ヒトの心不全例におけると
同様のβ‐アドレナリン信号伝達の生化学的変化を観察した。不全心筋細胞にお
いてβ‐アドレナリン受容体の密度は著しく減少し、βARK1の発現は増加してい
た。

【００３３】 対照の目的で、ペースメーカー埋め込み前の値及びペースメーカー埋め込み3
週間後のCHF値を測定した。HR,心拍［回/分（bpm）］；LVEDD、左心室拡張期末
径；LVESP、左心室収縮期末径；FS、分画径短縮、％FS＝［（EDD-ESD）/EDD］×
100；LVEDP、左心室拡張期末圧；LVSP、左心室収縮期圧；dp/dtmax、左心室圧上
昇最大速度；dp/dtmin、左心室圧低下最大速度。

【００３４】 例３： 心不全におけるアポトーシスパラメータ ペースメーカーを装着したウサギの心臓におけるアポトーシスの最も重要な生
化学的な特徴を評価するために、成熟心室心筋細胞を単離し、多くの分子分析を
行なった。心不全の最終段階において正常心筋のアポトーシスはDNA分解を伴っ
ている。不全心筋細胞の細胞分解物のインビトロにおけるDNA分解能を調べる目
的で、肝臓の核を不全心筋細胞分解物とインキュベートし、そしてアガロースゲ
ル電気泳動によりDNAを調べた（図2a）。不全心筋は対照組織と比較してDNA分解
活性の増加を示した。その活性はICADの過剰発現により抑制することができた。
さらに、不全及び対照心筋細胞から調製した全細胞抽出物中では、CHF細胞のカ
スパーゼ−3活性は（約3倍）増加していた（図2b）。ペースメーカーを装着した
動物の心筋サイトゾル抽出物は、対照心筋細胞抽出物に比較してヒストン会合DN
Aフラグメントが約6倍増加することを示した（図2c）。

【００３５】 例４： p35及びICAD遺伝子導入は、インビトロ及びインビボにおいてカスパーゼ−3活性
の増加及びDNAフラグメンテーションを充分阻害する 心筋細胞死の過程の最終段階としてのカスパーゼ−3活性化DNA分解信号伝達経
路を操作するために、強力なカスパーゼ−3阻害剤としてp35（Ad-p35）及び活性
化CADの消去分子としてICAD（Ad-ICAD）に対するアデノウイルス構築を調製した
。アデノウイルス構築は、導入遺伝子をコードし、GFP（Ad-GFP）を含めて充分
な発現をするように、構築した。さらに、両導入遺伝子には免疫染色用の抗原決
定基「タグ」を付けた。不全心筋におけるアデノウイルスの感染結果を測定する
前に、TNFα刺激アポトーシスを生じている心室心筋細胞における導入遺伝子の
発現を調べた（図3a,b）。成熟心筋細胞を、実際上100％の心室心筋細胞に導入
遺伝子を最高に発現することが既に判明している感染多重度（moi）80 pfu/cell
のアデノウイルスで感染させた。Ad-p35またはAd-ICADで感染後48時間で心筋細
胞抽出物は、免疫染色による測定により有意なタンパク濃度を示した。カスパー
ゼ−3活性及びDNAフラグメンテーションはTNFα処理によりインビトロで増強さ
れた（図3a,b）。ウサギ心室心筋細胞においてインビトロでのアデノウイルスp3
5の発現はTNFα刺激カスパーゼ−3活性化を基礎レベルまで抑制した。興味有る
ことは、ICADの過剰発現によりDNA/ヒストン形成は対照値以下となった（図3a,b
）。心筋細胞のリコンビナント対照アデノウイルス（Ad-GFP）による感染は、心
筋細胞のアポトーシスパラメータに対してインビトロ及びインビボにおいて影響
しなかった（図3a,b,c,d）。図3及びcに示したように、不全心筋から単離した心
筋細胞ではカスパーゼ−3仲介DNAフラグメンテーションが健康心筋細胞に比して
有意に増加していた（38±6活性単位対12±3活性単位 / DNA/ヒストン形成は5
.5倍増加。n=各群5、p<0.005）。インビボにおける2種のアデノウイルス導入遺
伝子の投与及び続く心筋標的領域から心室心筋細胞の単離の後、ほとんど50％の
細胞が再現性よくGFP染色陽性を示した。これらの細胞では、ICADがカスパーゼ
−3誘導CAD活性を有効に抑制しており、p35は部分的に酵素活性を阻害した。対
照感染は作用を示さなかった（図3c,d）。

【００３６】 例５： 不全心筋へのアデノウイルス遺伝子導入は有効である Ad-βGal（10⁹‐10¹⁰ pfu）の遺伝子導入後3日の代表的なウサギ心臓の組織切
片を図4aに示した。感染後6日で導入遺伝子は最大の発現を示し、その後次週に
は発現は徐々に低下した。4週間後、感染した心筋は1％以下であった。左心室心
筋の3分の2は再現性よく導入遺伝子の発現を示した（図4a）。2シストロン性Ad-
ICADを感染させた心臓の肉眼切片の蛍光像には処置心筋全体に明らかな導入遺伝
子の発現が認められ、また導入遺伝子の抗原決定基「タグ」の免疫染色では同じ
領域に存在を認めた（図5a,b）。インビボでAd-ICAD 10⁹‐10¹⁰ pfuを感染させ
た後、単離心室心筋細胞のほとんど50％は緑色蛍光及び陽性免疫染色を示した（
図5c,d）。p35（バキュロウイルスタンパクとして）は、真核細胞におけると正
確に同じ方法で補正して、ICADよりも低い発現レベルであり、図4bのイムノブロ
ットに示されている。

【００３７】 例６： カスパーゼ−3活性化アポトーシス機構の阻害は収縮力を改善する 心筋細胞死の重要な段階の阻害剤として心不全の進展の防止に関するICADの機
能的効果を評価するために、アデノウイルス仲介経冠動脈遺伝子導入の後エコー
カルジオグラフ及び循環動態パラメータを測定した。ペースメーカーの埋め込み
前に、ウサギに遺伝子導入の処置をした。エコーカルジオグラフ及び循環動態パ
ラメータの測定はペースメーカー期間の7及び15日に行なった（ペースメーカー
のスイッチを切って）。Ad-GFPで感染したウサギを対照心として使用した。図6a
はAd-GFP及びAd-ICADに感染した領域の分画径短縮の平均値を示している。Ad-IC
ADで処置した動物では明らかな有意な増加が生じているが、ウイルスで処置した
対照動物では作用が生じていない（15 ± 0.9％対22.3 ± 1.1％、n=各群6、p <
0.05）。左心室の拡張期末径は、Ad-GFP動物では18 ± 4mmであり、これに対し
てICAD導入動物では15 ± 0.5mmであった（図6b）。局所心筋収縮力に関してエ
コーカルジオグラフ情報を補足するために、左心室拡張期末圧及び＋dp/dtを心
室全体の収縮力の指標として測定した。ICADのアデノウイルスで処置した動物の
左心室の拡張期末圧は、Ad-GFP感染細胞に比して有意に回復した（10.2 ± 0.8m
mHg対14 ± 1.4mmHg、n=各群6、p < 0.05）（図6c,d）。Ad-GFP感染動物の基礎
＋dp/dt値はAd-ICAD感染動物の値と差が無かった。アドレナリンの注射の後、IC
AD発現ウサギにおける＋dp/dt値の用量依存的増加は対照動物に比較してより高
いことが観察された。

【００３８】 例７： 収縮力の機能的復元はp35またはICADの過剰発現によるザルコメア構造の悪化減
少により達成される インビボにおける遺伝子の注射後15日の個別の心室心筋細胞収縮機能に対する
p35発現の効果を検討するために、Ad-p35及びAd-GFPに感染した対照動物及びCHF
動物の標的領域から細胞を単離し、18時間培養した。導入遺伝子を発現した細胞
をGFP蛍光により選別した。図8（a,b,c）は対照心筋細胞及び不全心筋細胞並び
に遺伝子操作心から単離した細胞の中の重合アクチンを可視化するためにファロ
イジン染色した後のレーザー電子顕微鏡像を示す。興味が有るのは、p35を発現
した不全心筋細胞は、分解ザルコメア単位を有する対照感染細胞に比較してより
高度にザルコメア構造形成を示した。半定量的測定によるザルコメア形成の程度
は図8(e)に示した。よく構成されたザルコメア（細胞領域の2/3以上）の筋細胞
の比は、対照心筋細胞において64％ ±１％、Ad-GFP感染不全心筋細胞で13％ ±
3％及びAd-p35感染心筋細胞において52％ ± 4％であった。収縮振幅を毎分約7
0収縮の速さで電気刺激をした不全細胞及び対照細胞において測定した。アデノ
ウイルス感染は心筋細胞の収縮性を変化させなかった。図8dに示すように、p35
を発現した不全心筋細胞はAd-GFPを感染させた同等の心筋細胞と比較して分画径
短縮の有意な増加を示した（4.3 ± 0.4％対1.8 ± 0.2％、n=各群40）。この収
縮力の改善はイソプレナリン刺激後においても認められ、また用量反応曲線のEC ₅₀ は健康細胞の値と同じ高値へ移動した（図8d）。これらの結果は、p35がザル
コメア構造を復元し、そして不全心筋細胞の収縮性も結果として回復することを
示している。

【００３９】 さらに、収縮振幅を、毎分約70収縮の速さで電気的に刺激して、不全細胞及び
対照細胞について測定した。図10に示すように、イソプレナリン刺激後ICADを発
現した不全心筋細胞はAd-GFP感染心筋に比較して分画径短縮の有意な増加を示し
た（3.8 ± 0.9% から9.5 ± 1.16 %へ改善したが、基礎値には差が無かった（1
.8 ± 0.33%対 1.75 ± 0.33%））。この結果は、ICADも不全心筋細胞の収縮性
を回復することを示している。

【００４０】 例８： 単離左心室心筋細胞へ活性化カスパーゼ−3のマイクロインジェクション カスパーゼ−3の活性化がザルコメア構造の悪化を誘導するのに充分なもので
あるか否かを検討するために、活性化した酵素を正常成熟左心室心筋細胞に注入
した。陽性細胞（約10から20％）はFITC蛍光により同定した。活性化したカスパ
ーゼ−3（4 ng/μl及び20 ng/μl）のマイクロインジェクション後の心筋細胞の
形態学的外観を対照注射細胞と比較して図9（a+b）に示した。筋細胞をカスパー
ゼ−3（CPP-32）で処理すると急速な、濃度に依存した平滑及び横紋の筋束の破
壊を生じた（図9b、左側と右側の写真）。個別細胞（マイクロインジェクション
した心筋細胞）による短縮実験は基礎及びイソプレナリン刺激収縮のカスパーゼ
−3による低下を示した（9.8％対4.3％［10^-8 iso］; n=各群30）。これらの
効果は、筋細胞をDEVD-fmkと予めインキュベートすることにより阻害された（図
9c）。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１：心不全モデルの循環動態及びエコーカルジオグラフの特徴 対照動物（上）及び心不全動物（下）における経胸壁 M-modeエコーカルジオ
グラフ。左心室の径は両頭矢印で示す；EDD：拡張期末径；ESD：収縮期末径。2
週間後、ペースメーカーを着けた動物は、心機能の低下及び壁ストレスの増加を
示す壁運動の低下を伴う心室拡張を示した。

【図２】 図２：対照心筋及び不全心筋（CHF）から単離した心室心筋細胞におけるカス
パーゼ−3仲介CAD活性化の誘導及び続くDNAフラグメンテーション a：対照心筋及びペースメーカーを着けた心筋(CHF)の単離心筋細胞のサイトゾ
ール分画中で測定したカスパーゼ−3酵素濃度の蛍光アッセイ; n=各群5、p<0.00
5 ANOVA, Scheffeポストホック分析。 b：単離ウサギ肝細胞核から単離され、対照心筋及び不全心筋（CHF）のサイト
ゾル抽出物とインキュベートしたゲノムDNAのフラグメンテーション。DNAフラグ
メンテーションはカスパーゼ活性化デオキシリボヌクレアーゼ（CAD）の活性を
反映している。 c：心不全動物の心臓から7日後（CHF 7）及び15日後（CHF 15）に単離したDNA
のほつれは対照組織に比較して上昇したことを示した。 d：遊離DNA/ヒストン複合体を、対照心筋細胞およびペースメーカーを付けた
心筋細胞についてELISA系で定量した。 データは平均値±標準誤差で示した；n=各群5；p<0.005。

【図３】 インビトロ（a,b）及びインビボ（c,d）におけるアデノウイルスによるp35及
びICADの過剰発現によるカスパーゼ−3活性及びDNAフラグメンテーションの阻害 a：p35のアデノウイルス構築（Ad-p35）、空構築（Ad-GEP）及びカスパーゼ−
3のテトラペプチド阻害剤（DEVD）の存在下に単離対照心筋細胞及びTNFα刺激細
胞においてカスパーゼ−3活性を測定した。 ｂ：Ad-p35、Ad-ICAD及びAd-GFP（対照として）をアデノウイルス感染させた
後単離対照細胞及びTNFα刺激心室心筋細胞においてDNA/ヒストン生成を測定し
た。 ｃ：心筋細胞を対照心筋及びペースメーカーを着けた心筋（CHF）から単離し
、サイトゾル中のカスパーゼ−3活性を測定した。3番目及び4番目のカラムはAd-
p35及びAd-GFP（対照）のアデノウイルス遺伝子導入後に心筋細胞の酵素活性を
測定した結果を示している。 ｄ：心室心筋細胞を対照心臓及びペースメーカーを付けた心臓から単離し、無
細胞抽出物中でのDNA/ヒストン生成を定量した。3番目及び4番目のカラムはAd-I
CAD及び対照アデノウイルスAd-GFPを心筋に遺伝子導入した動物の細胞におけるD
NAフラグメンテーションを示す。 e：Ad-p35で感染して遺伝子導入後0，4，7、及び15日の心筋前外壁サイトゾル
抽出物のイムノブロットアッセイ。免疫染色は、p35及びアクチンの発現を平行
して記録するために二つのモノクロナール抗体、抗Flag M2及びp35に対する抗α
ザルコメアアクチン抗体で行った。 データは平均値±標準誤差で示した；n=各群4；p<0.01、p<0.001。

【図４】 図４：不全心筋へのアデノウイルス遺伝子導入 a：β‐ガラクトシダーゼをコードするアデノウイルスを超音波コントロール
の下に注射したウサギ心臓の肉眼的薄切（厚さ7μm、各切片の間隔：200μm）。
切片はX-Galで染色。左心室心筋をLVと呼び、右心室心筋をRVと呼ぶ。 ｂ：Ad-GFP、Ad-ICAD及びAd-p35で感染させた心筋のサイトゾル抽出物のイム
ノブロット分析。 ｃ：単離した対照心室心筋細胞および不全心室心筋細胞（CHF）のサイトゾル
抽出物とインキュベートした際の単離ウサギ肝細胞核から単離したゲノムDNAの
フラグメンテーション。さらに、Ad-ICAD及びAd-GFPでアデノウイルス遺伝子導
入した後の心筋細胞のDNAフラグメンテーション活性をインビボで分析した。

【図５】 インビボにおいてp35及びICADのアデノウイルス構築を遺伝子導入した光線下
の組織切片 a：感染心筋の肉眼的切片におけるGFP発現を450‐490 nmフィルターを使用し
た位相差蛍光顕微鏡により可視化した。 b：AD-ICAD感染後の直接導入遺伝子発現を、両導入遺伝子に挿入した合成抗原
決定基に対するモノクロナール抗FLAG抗体を用いた免疫染色により示した。検体
は546 nmフィルター（ローダミン蛍光）を使用した蛍光顕微鏡により可視化した
。 c,d：心室心筋細胞をAd-p35に感染した心筋から単離し、導入遺伝子発現をGFP
及び抗FLAG抗体に対する蛍光顕微鏡で記録した。

【図６】 図６：Ad-ICADで治療した心臓のエコーカルジオグラフィー及び循環動態の測
定 心臓カテーテルは基礎状態及びアドレナリン濃度を増加させて行なった。 a：ペースメーカー装着後15日の対照心臓及びAD-GFPまたはAd-ICADに感染させ
た心臓の分画径短縮の記録。分画径短縮パーセントは次のように計算した； ％FS＝［（EDD − ESD）/ EDD］ × 100． b：左心室の拡張期末径をペースメーカー装着15日後に対照心筋及びAD-GFPま
たはAd-ICADに感染させた心筋について示した。 c：左心室の拡張期末圧をペースメーカー装着後の対照及びAD-GFPまたはAd-IC
AD動物について測定した。 d：ペースメーカー装着期間中のLVEDPの変化を7日及び15日後のAD-GFPまたはA
d-ICAD及び対照動物について示した。 e：アドレナリンの注射濃度を増加させて測定した対照動物及びAd-ICAD処置動
物のdp/dtmax。データは平均値 ± 標準誤差で示した。

【図７】 図７：Ad-p35で処置した心臓のエコーカルジオグラフ及び循環動態測定 アデノウイルス感染はペースメーカー装着前に行なった。 a：分画径短縮を対照、CHF及びペースメーカー装着した心臓にAd-GFPまたはAd
-p35を経冠動脈投与した15日後に測定した。 b：ペースメーカー装着後7及び15日後の分画径短縮経時変化。 c：減少した拡張期末心室圧（LVEDP）を対照、心不全及びペースメーカー装着
した心臓にAd-GFPまたはAd-p35を径冠動脈投与した15日後に測定した。 d：エピネフリンの投与量を増加させて測定したdp/dtmax。データは平均値
± 標準誤差（n = 各群8；^* p < 0.05;^** p <0.001）、対照、心不全及びAD-G
FPの心臓で比較して示した。

【図８】 図８：p35発現のペースメーカーを装着した心筋細胞のザルコメア構造及び収
縮力に及ぼす影響 a,b,c：対照（a）、CHF（b）及びAd-p35感染不全心筋（c）の前外壁からウサ
ギ心室心筋細胞を単離し、ファロイジン染色後共焦点レーザー顕微鏡により可視
化した。 d：単離心筋細胞の収縮振幅（n = 60細胞、各群ウサギ4匹）。 e：ファロイジン染色心筋細胞の形態は全細胞領域中に形成されたザルコメア
が占める領域に基づいて半定量的に判定した：弱い、細胞領域の1/3以下（黒い
領域）；中等度、細胞領域の2/3以下（グレー領域）；良好、全細胞領域（空領
域）。各群毎に4動物の120細胞が計測された。（dの）データは平均値 ± 標
準誤差（^* p <0.001、ペースメーカーを装着した心筋（CHF＋Ad-GFP）と比較）
で示した。

【図９】 図９：健康な心室心筋細胞へ活性化カスパーゼ−3のマイクロインジェクショ
ン a,b：FITC抱合デキストランのみ（a）またはFITC抱合デキストラン＋ヒトリコ
ンビナント活性化カスパーゼ−3（b）（左側写真：4 nm/μM;右側写真：20 ng/
μl）を心筋細胞に注入した。アクチン繊維の形態はファロイジン染色後共焦点
レーザー顕微鏡で可視化した。 c：基礎的状態及びイソプレナリン刺激（10^‐8mol/l）の収縮振幅をFITC抱合
デキストラン（対照として）またはカスパーゼ−3（CPP32）をマイクロインジェ
クションした細胞について測定した。DEVD-fmk（R及びD系、Wiesbaden，ドイツ
）との予備インキュベーションも行なった（グレーカラム）。各群n=45細胞。c
のデータは平均値 ± 標準誤差（^* p <0.005、注入対照細胞と比較（基準；10 ^‐8 mol/l イソプレナリン）で示した。

【図１０】 図１０：個別心筋細胞の収縮性に対するICADの影響 単離心筋細胞の収縮振幅（各群4匹のウサギから得たn=60細胞）。試験は図8d
に記述したのと同様に行なった；n.s. = 有意性なし、^** p <0.05。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１４年３月２５日（２００２．３．２５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 48/00 ４Ｃ０８７ 48/00 Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 9/00 9/04 9/04 9/10 9/10 43/00 １０５ 43/00 １０５ １１１ １１１ Ｃ１２Ｑ 1/34 Ｃ１２Ｑ 1/34 1/68 Ａ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/64 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA29 AA40 BA13 BB20 CB01 CB17 DA12 DA13 DA14 DA20 FA16 FB01 FB03 JA01 4B063 QA19 QA20 QQ08 QQ30 QQ34 QQ43 QR08 QR42 QR56 QS25 QS34 QX02 4C084 AA02 AA13 AA17 BA44 CA01 CA53 DA01 DA58 NA14 ZA36 ZB21 ZC20 4C085 AA13 AA14 BB11 BB17 CC21 CC31 DD62 EE01 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA36 ZB21 ZC20 4C087 AA01 AA02 BB65 BC83 CA12 NA14 ZA36 ZB21 ZC20

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 心疾患の予防または治療へのカスパーゼ−3またはカスパー
   ゼ活性化デオキシリボヌクレアーゼ（CAD）阻害剤の使用。
2. 【請求項２】 心疾患が心不全である請求項1に記載の使用。
3. 【請求項３】 心不全が左心室の不全である請求項2に記載の使用。
4. 【請求項４】 阻害剤がカスパーゼ−3またはCADをコードする遺伝子の発現
   を阻害する請求項1から3のいずれか一つに記載の使用。
5. 【請求項５】 カスパーゼ−3またはCADをコードする遺伝子から転写された
   mRNAまたはその部分に相補的であり、そのmRNAに特異的に結合してそれを分解す
   ることができ、その結果としてカスパーゼ−3またはCADの合成が減少または阻害
   されることが特徴であるリボザイムが阻害剤である請求項4に記載の使用。
6. 【請求項６】 カスパーゼ−3またはCADをコードする遺伝子から転写された
   mRNAまたはその部分に相補的であり、そのmRNAに特異的に結合することができ、
   その結果としてカスパーゼ−3またはCADの合成が減少または阻害されることが特
   性であるアンチセンスRNAが阻害剤である請求項4に記載の使用。
7. 【請求項７】 阻害剤がICADまたはバキュロウイスル‐p35である請求項1か
   ら3のいずれか一つに記載の使用。
8. 【請求項８】 阻害剤がカスパーゼ−3またはCADに結合する抗体またはその
   フラグメントである請求項1から3のいずれか一つに記載の使用。
9. 【請求項９】 心臓疾患の予防または治療を阻害剤をコードするDNA配列を
   挿入した発現ベクターを投与することにより行なう請求項1から8のいずれか一つ
   に記載の使用。
10. 【請求項１０】 ベクターがアデノウイルスである請求項9に記載の使用。
11. 【請求項１１】 下記段階： （a)阻害剤として適する可能性が有る化合物をカスパーゼ−3またはCADあるいは
    カスパーゼ−3またはCADをコードする遺伝子と接触させ；そして （b）残存するカスパーゼ−3またはCAD活性あるいは遺伝子発現の低下を測定す
    る；そして カスパーゼ−3またはCAD活性あるいはカスパーゼ−3またはCADの遺伝子発現の
    低下または完全な阻害はテスト化合物が阻害剤として有効であることを示すこと
    からなる、カスパーゼ−3またはカスパーゼ活性化デオキシリボヌクレアーゼ（C
    AD）の阻害剤として有効である化合物を同定する方法。