JP2001510028A - ｐ２７およびその融合物で血管増殖性疾患を処置する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ｐ２７をコードする遺伝子をインビボで投与することによる血管増殖性疾患の処置方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） （発明の分野） 本発明は、ｐ２７をコードする遺伝子の投与によってインビボで血管増殖性疾
患を処置または予防するための方法を提供する。

【０００２】 （背景の議論） 血管疾患は、平滑筋細胞増殖および遊走からなる損傷に対する線維増殖性応答
ならびに結合組織形成によって特徴づけられる。血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）が
マイトジェンシグナルに応じて増殖するメカニズムは、十分に記載される；しか
し、ＶＳＭＣを細胞周期のＧ１期中に増殖状態から非増殖状態へ移動させる細胞
性遺伝子産物の役割は、十分に理解されていない。

【０００３】 細胞周期の期の間の遷移が、サイクリン依存性キナーゼのファミリーによって
触媒されることは公知である（Ｐ．Ｎｕｒｓ，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４
４，５０３−５０８；Ｌ．Ｈａｒｔｗｅｌｌら，（１９７４）Ｓｃｉｅｎｃｅ
１８３，４６−５１）。多くの細胞では、細胞周期のＧ１を通過して、そしてＳ
期へ入ることは、サイクリン／サイクリン依存性キナーゼ複合体（ＣＤＫ）、主
としてサイクリンＤ−ｃｄｋ４，６およびサイクリンＥ−ｃｄｋ２の結合および
活性化を必要とする（Ｃ．Ｊ．Ｓｈｅｒｒ，（１９９４）Ｃｅｌｌ ７９，５５
１；Ｃ．Ｊ．Ｓｈｅｒｒ（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４，１６７２）。

【０００４】 サイクリン依存性キナーゼインヒビター（ＣＫＩ）は、サイクリン−ＣＤＫ活
性および網膜芽細胞腫（Ｒｂ）のリン酸化を阻害し、Ｇ１／Ｓ増殖停止を生じる
天然に存在する遺伝子産物である（Ｄ．Ｏ．Ｍｏｒｇａｎ，Ｎａｔｕｒｅ １９
９５，３７４：１７１；Ｃ．Ｊ．ＳｈｅｒｒおよびＪ．Ｍ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｇ
ｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．１９９５，９：１１４９）。ＣＤＫ調節に直接関与するＣＫ
Ｉは、ｐ２１^cip1/Waf1（Ｙ．Ｘｉｏｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ １９９３，３６６ ：７０１；Ｊ．Ｗ．Ｈａｒｐｅｒら，Ｃｅｌｌ １９９３，７５：８０５）、ｐ
２７^Kip1（Ｈ．Ｐｙｏｓｈｉｍａ，Ｔ．Ｈｕｎｔｅｒ，Ｃｅｌｌ １９９４，７
８：６７；Ｋ．Ｐｏｌｙａｋら，Ｃｅｌｌ １９９４，７８：５９；Ｓ．Ｃｏａ
ｔｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９６，２７２：８７７）、およびｐ１６／ｐ１５ ^INKN （Ｍ．Ｓｅｒｒａｎｏら，Ｎａｔｕｒｅ １９９３，３６６：７０４）であ
る。

【０００５】 これらのＣＫＩのこれまでの研究は、悪性形質転換における可能性のある役割
に焦点を絞った。例えば、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ９５／１８８２４号（出願人Ｓ
ｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ）は、ｐ２７がサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体の活性化を阻害
する能力を調節し得る薬剤を同定する方法を記載する。このＰＣＴ公開公報は、
さらに、これらの薬剤を使用する、ガンおよび過形成のような、過増殖性障害と
診断された被験体を処置する方法を提供する。このような薬剤は、タンパク質と
非タンパク質部分の両方であり得る。不運にも、アテローム性硬化症、血管形成
、および再狭窄を含む、心臓血管疾患におけるＣＫＩの関与は、十分に研究され
ていない。

【０００６】 現在、細胞増殖を阻害することに焦点を絞る心臓血管疾患を処置するために使
用される多くの方法がある。利用可能な治療に関連する主な問題が、殺傷される
必要がある増殖する細胞へ阻害剤を標的することについて生じる。標的すること
は、伝統的に、抗体とカップリングした化学または放射線治療剤を使用して試み
られている。より最近には、特定の細胞タイプに有害な遺伝子産物を提供するこ
とによって増殖する細胞を標的する、遺伝子治療アプローチが、使用されている
。これらの遺伝子産物をコードする遺伝子は、自殺遺伝子として公知である。こ
の遺伝子産物は、部位特異的に点滴注入されるか、特異的細胞を標的するベクタ
ーを使用して特異的細胞で発現されるか、または細胞タイプ特異的プロモーター
の制御下で発現されるかのいずれかである。

【０００７】 ＨＳＶ−１チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）は、哺乳動物系において最も広く
使用される自殺遺伝子である。ＴＫは、細胞酵素によって後に三リン酸形態にリ
ン酸化されるグアノシンアナログのガンシクロビル（ＧＣＶ）およびアシクロビ
ル（ＡＣＶ）を、効率的にリン酸化する。これらの最終産物は、増殖するＤＮＡ
鎖に組み込まれ、伸長停止（ＡＣＶ）またはＤＮＡ合成における激しい減速（Ｇ
ＣＶ）を生じる。死は、通常、アポトーシスのような、いくつかの細胞株におい
て同定されたメカニズムを介して生じる。細胞死を引き起こすメカニズムは知ら
れていない。ＧＣＶの場合には、ＤＮＡポリメラーゼ阻害のレベル以外での他の
作用が存在し得る。なぜなら、ＧＣＶによる変異体ウイルスＤＮＡポリメラーゼ
の阻害とＧＣＶの存在下でのこれらの変異体の増殖との間で相互関係が観察され
ないからである。

【０００８】 ＴＫ−ＧＣＶ系の独特の特徴の１つは、形質導入されていない細胞の死を特徴
づけたバイスタンダー効果である。２つのメカニズムが、この現象を説明するた
めに提案されている。１９９３年に、Ｆｒｅｅｍａｎおよび共同研究者らは、バ
イスタンダー細胞によるリン酸化されたＧＣＶの取り込みが、ＴＫ形質導入され
た細胞から生じ、そして毒性薬物を含む、アポトーシス小胞のエンドサイトーシ
スによって生じると仮定した。しかし、増加している証拠は、バイスタンダー効
果が、ギャップ接合部細胞間連絡によって媒介され、そしてリン酸化されたガン
シクロビルをＴＫ⁺からＴＫ^-細胞へ移動させることを示唆する。１９９５年に、
細胞カップリングを定量するためにフローサイトメトリーアッセイを使用して、
Ｆｉｃｋおよび共同研究者らは、ＧＣＶ処置中のバイスタンダー腫瘍細胞傷害性
が、ギャップ接合部媒介性のカップリングの程度と非常に相互関係することを見
いだした。バイスタンダー効果を通常は全く示さない、ＴＫを発現するｎｅｕｒ
ｏ−２ａマウス神経芽腫細胞株では、コネキシン−４３のアデノウイルス媒介性
の過剰発現は、バイスタンダー効果媒介性の細胞殺傷を与えることを示した。

【０００９】 ＴＫ−ＧＣＶ系は、ガンのモデルならびにインビボでの再狭窄に、既にうまく
適用されている（Ｐｌａｕｔｚら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９９１，８３：
５７８；Ｏｈｎｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９４，２６５：７８１）。しかし、
インビボでの遺伝子送達の効率は、非常に低いままであり、そして他のレベルで
のＴＫ媒介性の殺傷の増強が考慮されなければならない。ＴＫ媒介性の腫瘍抑制
および免疫系を連結するための試みにおいて、ＨＳＶ−ＴＫおよびインターロイ
キン−２遺伝子の両方を有するレトロウイルスベクターを構築した。しかし、ラ
ット９Ｌ神経膠肉腫モデルを使用して、このベクターでの腫瘍撲滅の増強は全く
観察されなかった。

【００１０】 （発明の要旨） したがって、本発明の１つの目的は、インビボで血管増殖性疾患を処置および
予防する方法を提供することである。

【００１１】 １つの適用では、本発明は、インビボで再狭窄を処置および予防する方法を提
供する。

【００１２】 第２の適用では、本発明は、インビボでアテローム性硬化症を処置および予防
する方法を提供する。

【００１３】 第３の適用では、本発明は、インビボで血管形成を処置および予防する方法を
提供する。

【００１４】 発明者らは、ｐ２７が、急性損傷および細胞増殖への応答を制御するために動
脈で機能することを、現在見いだしている。発明者らは、ｐ２７発現および過剰
発現が、インビボでの血管平滑筋細胞増殖の阻害を生じるために十分であるとい
う最初の直接的証拠を提供する。したがって、本発明は、冠状動脈および末梢の
再狭窄を含む血管増殖性疾患を処置するために、抗増殖性遺伝子としてのｐ２７
遺伝子の使用に関する。

【００１５】 本明細書に記載の方法は、バイスタンダー効果を増加させることを目標とする
。ＴＫの作用のメカニズムは、ＤＮＡ複製のレベルであるようなので、細胞の増
殖を停止することは、ＴＫ−ＧＣＶ媒介性の殺傷に対して、細胞を一時的に不感
受性にし、細胞の寿命およびＴＫ発現の期間を延長し、それによってリン酸化さ
れたＧＣＶのバイスタンダー細胞への移動を増加させる。

【００１６】 （発明の詳細な説明） 本発明は、ｐ２７またはその融合タンパク質をコードする遺伝子の腫瘍阻害量
をその必要のある患者に投与する工程を包含する、血管増殖性疾患を処置する方
法を提供する。

【００１７】 （Ｉ．ｐ２７およびその融合タンパク質） ｐ２７（第１のポリペプチド）のアミノ酸配列を、図５（配列番号２）に示す
。このタンパク質をコードするどのＤＮＡも、本発明に従って使用され得る。ｐ
２７をコードするｃＤＮＡは、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ９５／１８８２４号、ＰＣ
Ｔ公開公報ＷＯ９６／０２１４０（出願人：Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、Ｔｏｙｏｓ
ｈｉｍａら（Ｃｅｌｌ １９９４，７８：６７−７４）、およびＰｏｌｙａｋら
（Ｃｅｌｌ １９９４，７８：５９−６６）に記載される。本明細書で使用され
る場合、「ｐ２７」とは、天然のままのｐ２７ならびにその変異したｐ２７およ
び融合タンパク質の両方をいう。

【００１８】 用語「変異したｐ２７」は、野生型ｐ２７に類似のアミノ酸配列を有するが野
生型ｐ２７とは異なる少なくとも１つのアミノ酸を有するポリペプチドを含む。
変異したｐ２７と野生型ｐ２７との間のアミノ酸の差は、１つ以上のアミノ酸の
置換、１つ以上のアミノ酸の欠失、または１つ以上のアミノ酸の付加であり得る
。変異に好ましい部位は、最後の４つのカルボキシ末端アミノ酸残基またはタン
パク質をコードするＤＮＡの３’末端の最後の１２塩基対を含む。好ましくは、
塩基対は、ＤＮＡのその末端の制限エンドヌクレアーゼ部位を導入するように操
作される。

【００１９】 代わりの実施態様では、ｐ２７は、真核生物細胞における転写を直接的または
間接的に活性化する第２のポリペプチドに作動可能に連結される。第１および第
２のポリペプチドを作動可能に連結するために、代表的には、第１および第２の
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、融合タンパク質をコードするキ
メラ遺伝子を生成するために互いにインフレームに連結されるが、第１および第
２のポリペプチドは、各ポリペプチドの機能を維持する他の手段によって作動可
能に連結され得る（例えば、化学的に架橋される）。

【００２０】 第２のポリペプチドは、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８０，８：５９４９；Ｍａｎｓｏｕｒら，
Ｎａｔｕｒｅ １９８８，３３６：３４８−３５２）、β−ガラクトシダーゼ、
ｐ１６（Ｃｈａｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９５，１５：２６８２
−２６８８；Ｇｕａｎら，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．１９９４，８：２９３９−
２９５２）、ｐ２１（Ｈａｒｐｅｒら，Ｃｅｌｌ １９９３，７５：８０５；Ｘ
ｉｏｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ １９９３，３６６：７０１）、ｐ５７（Ｌｅｅら，
Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．１９９５，９：６３９−６４９；Ｍａｔｓｕｏｋａら
，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．１９９５，９：６５０−６６２）、網膜芽細胞腫（
Ｒｂ）（Ｃｈａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５，２６７：５１８を参照のこ
と）またはその変異体（例えば、Ｈａｍｅｌら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
１９９２，１２：３４３１を参照のこと）、シトシンデアミナーゼ（ＷＯ９４２
８１４３；Ｗａｎｇら，Ｃａｎ．Ｓｏｃ．Ｐｅｔｒｏｌ．Ｇｅｏｌ．Ｍｅｍ．１
９８８，１４：７１）、一酸化窒素、および一酸化窒素シンターゼからなる群よ
り選択され得る。

【００２１】 （ＩＩ．発現系） 本発明によって有用な適切な発現ベクターには、真核生物およびウイルスベク
ターが挙げられる。有用な真核生物ベクターには、ｐＲｃＲＳＶおよびｐＲｃＣ
ＭＶが挙げられる。好ましくは、ウイルスベクターが使用される。

【００２２】 ウイルスベクター系は、欠損遺伝子を含有する哺乳動物に遺伝子を移入するこ
とに非常に効率的であるとして示されている。例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ａｍ．
Ｊ．Ｍｅｄ．１９９２，９２（６Ａ）：４４Ｓ−５２Ｓ；Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄ
ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９２，８９（１４
）：６４８２−６４８６を参照のこと。好ましくは、複製および形質転換の損な
われた能力を有するレトロウイルスベクターが使用される。本発明による有用な
ｐ２１を発現する適切なウイルスベクターには、Ｄａｖｉｄｓｏｎら，Ｎａｔｕ
ｒｅ Ｇｅｎ．１９９３，３：２１９に記載されるようなアデノウイルスベクタ
ーｐＡｄ−ＢｇｈＶＩと組み合わせたＡｄ５−３６０が挙げられる。好ましくは
、アデノウイルスベクターが使用される。

【００２３】 好ましくは、アデノウイルスベクターには、Ｄａｖｉｄｏｓｏｎら，Ｎａｔｕ
ｒｅ Ｇｅｎ．１９９３，３：２１９に記載されるＡＤＶ；あるいは、タイプ７
００１、またはタイプ１もしくは１２を含む、他のアデノウイルスタイプ（Ｙａ
ｎｇら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９５，１：１０５２およびＯｈｎｏら，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ １９９４，２６５：７８１に記載されるような）が挙げられる。

【００２４】 ｐ２７は、これらの発現ベクターに挿入され、そしてＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒ
ｉｔｓｃｈ，およびＭａｎｉａｔｉｓ「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（第２版）：ｐｐ．Ｅ５（Ｃｏｌｄ Ｓａｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）（その開示は、参考として本明細書に援用され
る）に記載のような従来の組換え技法を使用して細胞トランスフェクションのた
めに使用され得る。あるいは、発現ベクターは、Ｄａｖｉｄｏｓｏｎら，Ｎａｔ
ｕｒｅ Ｇｅｎ．１９９３，３：２１９−２２３またはＬｅｍａｒｃｈａｎｄら
，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９２，８９（１４）
：６４８２−６４８６に記載のような相同組換え技法を使用して調製され得る。

【００２５】 本発明の発現ベクターは、プロモーターおよびエンハンサーのような調節エレ
メント、ならびに抗生物質耐性遺伝子のような選択マーカーをさらに含み得る。

【００２６】 さらに、本発明の発現ベクターは、ｐ２７と同じ調節エレメントの制御下か、
または独立の調節下に、他の治療的に有用な遺伝子を含み得る。

【００２７】 ウイルスベクターが、インビボで細胞に取り込まれそして組み込まれ、そして
任意の挿入された構築物を含むそのＤＮＡを発現することが、十分に確立される
。例えば、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３，２６８
（４）：２３００−２３０３；Ｃｒｙｓｔａｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９２，
９２（６Ａ）：４４５−５２５；Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’
ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９２，８９（１４）；６４８４−６４８６
を参照のこと（これらの開示は参考として本明細書に援用される）。

【００２８】 代わりの実施態様では、発現ベクターの他にも他の送達系が、ｐ２７タンパク
質を送達するために使用され得ることもまた理解される。主として、リポソーム
およびＤＮＡ結合体の使用を含むこれらの技法は、上記の発現ベクターによって
提供されるものと同様の送達収量を提供すると予測される。すなわち、発現ベク
ターを介してｐ２７遺伝子を発現することよりもむしろ、リポソームにおいてｐ
２７をコードする遺伝子の治療量を組み込むこともまた可能である。

【００２９】 さらに、ウイルスベクターおよびリポソームの組み合わせ治療はまた、とても
大きな見込みを示しており、そしてまた本発明における使用について考慮される
。Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３，２６８（４）：
２３００−２３０３。

【００３０】 リポソームは、疾患組織への活性薬剤の非常に効果的な送達を提供することが
公知である。例えば、薬学的または他の生物学的に活性な薬剤は、効果的にリポ
ソームに組み込まれそして細胞へ送達されている。したがって、本発明による構
築物はまた、リポソーム中に適切に形成されそして選択された組織に送達され得
る。ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，
Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）の商標のもとに利用可能なような、カチオン性脂質
から調製されたリポソームが好ましい。リポソームに基づく処置が特に興味を引
くのは、リポソームが、比較的安定でありそして系からの移動またはその代謝の
前に比較的長い寿命を有するという事実である。さらに、リポソームは、大きな
免疫応答を生じない。

【００３１】 したがって、本発明の１つの局面では、ｐ２７をコードする遺伝子を含むベク
ターは、リポソームに組み込まれ、そして特定の組織への構築物の送達に使用さ
れる。リポソームは、細胞をトランスフェクトしそして細胞が発現をするように
なり、最終的にはｐ２７タンパク質を生成することにおいて、構築物を補助する
。

【００３２】 （ＩＩＩ．治療組成物） 本発明の組成物は、ｐ２７を発現する遺伝子の治療的有効量および薬学的に受
容可能なキャリアである。遺伝子を投与するために、適切なベクターおよびキャ
リアは、ｐ２７の改良された発現を提供するために処方物中に組み込まれ得る。

【００３３】 ウイルス粒子が処方物中で不活性化されそして処方物が生理学的に適合可能で
あるならば、上記の処方物のいずれかは、ウイルスベクターでの処置に適切であ
り得る。

【００３４】 投与されるべきｐ２７の量は、患者のサイズおよび疾患が進行した状態に依存
する。従来の組換えＤＮＡ技法を使用して遺伝子の調節エレメントを改変するこ
とによってか、または投与された遺伝子力価の量を変更することによって、ｐ２
７発現の量は、患者の必要に対して調節され得る。代表的には、処置されるべき
細胞当たり約５０ウイルスベクターを送達することが所望される。アデノウイル
スでは、処方物は、一般に、１ｍｌ当たりおよそ１０¹⁰ウイルス感染単位を含む
べきである。レトロウイルスでは、わずかに異なる力価が適用可能であり得る。
Ｗｏｏら，Ｅｎｚｙｍｅ １９８７，３８：２０７−２１３を参照のこと。適切
な投与量レベルを決定することにおけるさらなる援助は、Ｋａｙら，Ｈｕｍ．Ｇ
ｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９２，３：６４１−６４７；Ｌｉｕら，Ｓｏｍａｔ．Ｃ
ｅｌｌ Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１９９２，１８：８９−９６；およびＬｅｄ
ｌｅｙら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９１，２：３３１−３５８に見い
だされ得る。

【００３５】 発現ベクターの投与のために調製される特定の処方物に依存して、本発明の組
成物の投与は、種々の方法によって行われ得る。本発明の組成物は、好ましくは
、組織への発現ベクター（またはこれを含むリポソーム）の直接注入によってか
、またはＵ．Ｓ．５，３２８，４７０に記載のような血管壁へのバルーンカテー
テル移植によって投与される。より少ない好ましい実施態様では、患者からの細
胞が収集され、インビトロでｐ２７で形質転換され、そしてその患者に戻され得
る。

【００３６】 （ＩＶ．本発明の適用） 本発明は、血管増殖性疾患の処置において、遺伝子治療目的に特に有用であり
得る。遺伝子治療の一般的アプローチは、導入された遺伝物質によってコードさ
れる１つ以上の遺伝子産物が、細胞で産生されて機能的活性を回復または増強す
るような、細胞への核酸の導入を包含する。遺伝子治療アプローチについての総
説については、Ｗ．Ｆ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９２，２５６
：８０８−８１３；Ａ．Ｄ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ １９９２，３５７：
４５５−４６０；Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，Ｔ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８９，２４
４：１２７５−１２８１；およびＤ．Ｃｏｕｒｎｏｙｅｒら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉ
ｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９０，１：１９６−２０８を参照のこと。

【００３７】 本発明の方法によって処置され得る血管増殖性疾患は、血管損傷に応答する内
膜平滑筋細胞増殖によって特徴づけられる。血管増殖性疾患の例には、アテロー
ム性硬化症、血管形成、および再狭窄が挙げられる。

【００３８】 アテローム性硬化症は、大および中サイズの動脈の内膜における不規則に分布
した脂質沈着物によって特徴づけられるアテローム性硬化症である。アテローム
性硬化症は、動脈を裏打ちする細胞が、高血圧、喫煙、環境中の毒性物質、およ
び他の薬剤の結果として傷害を受ける場合に発動する多段階プロセスである。こ
の疾患は、高密度リポタンパク質が動脈傷害部位に蓄積しそして血小板がこの脂
肪コアを覆う線維性キャップを形成するように作用する場合に、プラーク構築に
よって特徴づけられる。

【００３９】 血管形成は、新しい血管の発生である。

【００４０】 血管形成術からの動脈損傷は、一連の増殖性、血管作用性、および再狭窄を導
き得る炎症応答を誘導する。インビボでこのプロセスを刺激するいくつかの因子
が定義されているが、応答を限定することにおける特定の細胞性遺伝子産物の役
割は、十分に理解されていない。発明者らは、現在、ｐ２７が、増殖性応答をバ
ルーンカテーテル損傷に限定するように作用することを見いだしている。血管内
皮および平滑筋細胞増殖を、ｐ２７ ＣＫＩがサイクリン依存性キナーゼおよび
細胞周期のＧ₁期を通過する進行を阻害する能力によって停止した。再狭窄は、 Ｅｐｓｔｅｉｎら，ＪＡＣＣ １９９４，２３（６）：１２７８およびＬａｎｄ
ａｕら，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ １９９４，３３０（１４）：９８
１に記載のように診断およびモニターされ得る臨床的症状である。

【００４１】 本発明の組成物は、すべての哺乳動物、特にヒトを処置するために使用され得
る。

【００４２】 本発明の組成物は、免疫治療剤、遺伝子治療剤（例えば、ＨＬＡ−Ｂ７）、タ
ンパク質（例えば、サイトカイン、好ましくは、Ｇｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、およ
び／またはＩＬ−１２）、ならびにシスプラチンのような抗ガン薬と組み合わせ
て投与され得る。あるいは、組成物は、養子細胞移入治療中に投与され得る。

【００４３】 本発明を一般的に記載してきたが、さらなる理解は、例示のみの目的で本明細
書で提供されるある特定の実施例を参照して得られ得、そして限定することは意
図されない。

【００４４】 （実施例） （実施例１） 細胞周期におけるｐ２７過剰発現の効果を研究した。

【００４５】 （細胞培養およびトランスフェクション） （１．プラスミド） ヒトｐ２１、ｐ１６、ｐ２７、ＨＳＶ−１チミジンキナーゼ（ｔｋ）、ヒトア
ルカリホスファターゼ（ｈＡＰ）、およびヒトＣＤ２を発現するｃＤＮＡを、サ
イトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター、エンハンサーおよびイントロン
、ならびにウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む真核生物発現ベクタ
ーのＶＲ１０１２に導入した。ＣＭＶ前初期遺伝子プロモーターおよびＳＶ４０
ポリアデニル化シグナルの制御下でＨＩＶ−１ Ｖｐｒを発現するプラスミドは
、Ｄｒ．Ｅ．Ｃｏｈｅｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃ
ａｎａｄａ）によって提供された。（Ｙａｎｇら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９５，
１：１０５２およびＯｈｎｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９４，２６５：７８１を
参照のこと）。

【００４６】 ｐ２７およびｔｋを発現するジシストロンの構築物（ｐＣＭＶｐ２７ＣＩＴＥ
ｔｋ）を、ｐ２７コード配列のすぐ下流に位置するＸｂａＩ部位とｔｋ遺伝子の
開始コドンを囲むＮｃｏＩ部位との間に、ｐＣＩＴＥ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｗ
Ｉ）からのＥｃｏＲＩ−ＮｃｏＩフラグメントを挿入することによって作製した
。このＥｃｏＲＩ−ＮｃｏＩフラグメント（「ＣＩＴＥ」）は、脳心筋炎ウイル
ス（ＥＭＣ）ＲＮＡ５’非コード領域のコピーを含み、これは真核生物リボソー
ムによる翻訳の開始のための内部侵入点として機能する。ｐ２７活性についての
コントロールとして、ｐ２７コード領域を含むがＣＭＶプロモーターに対して逆
方向であるベクターを、同様に構築した。発現カセットのサイズを減少させるた
めに、ＣＭＶイントロンを含むＳａｃＩＩ−ＥｃｏｒＶフラグメントを、両方の
ベクターにおいて欠失した。

【００４７】 ｐ２７とｔｋとの間の融合タンパク質を、ｐＣＭＶｐ２７ＣＩＴＥｔｋからＡ
ａｔＩＩ−ＮｃｏＩフラグメントを欠失させることによって作製し、プラスミド
ｐＣＭＶｐ２７ｔｋを生じた。得られるタンパク質を、ｐ２７の最後の４アミノ
酸（ＲＲＱＴ；配列番号８）について欠失し、そして追加のセリン残基を、チミ
ジンキナーゼの最初のメチオニンの前に挿入した。

【００４８】 ｐ２７ ｃｄｃ２キナーゼコンセンサス部位「ＴＰＫＫ」（配列番号６）の「
ＧＧＡＡ」（配列番号７）への変異を、テンプレートとしてプラスミドｐＣＭＶ
ｐ２７ｃｉｔｅｔｋを使用する重複ＰＣＲベースの方法を使用して行った。一方
の側において、ｐ２７コード領域の開始から、１８６ヌクレオチドから５７６ヌ
クレオチドまでに対応する配列を、プライマーとしてオリゴヌクレオチド＃２６
（５’−ＣＧＡＴＴＴＴＣＡＧＡＡＴＣＡＣＡＡＡＣＣＣＣ−３’）（配列番号
２）および＃２４（５’−ＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＣＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＴＣ
ＣＡＣＡＧＡＡＣＣ−３’）（配列番号３）を使用して増幅した。他方、ｐ２７
コード領域の開始から下流のＣＩＴＥ配列に位置するＢｇＩＩ部位までのヌクレ
オチド５５４に対応する配列を、オリゴヌクレオチド＃２３（５’−ＧＡＧＣＡ
ＧＧＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＡＧＡＡＧ−３’）（配列番号
４）および＃２７（５’−ＴＴＴＧＧＣＣＧＣＡＧＡＧＧＣＡＣＣＴＧＴ−３’
）（配列番号５）を使用して増幅した。オリゴヌクレオチド＃２３および＃２４
における変異は、関連の位置において野生型とは異なる。両方のＰＣＲ産物を、
プライマーとしてオリゴ＃２６および＃２７を使用して、６サイクル（９４℃、
１５秒／４５℃、３０秒／７２℃、４５秒）次いで３０サイクル（９４℃、１５
秒／６５℃、３０秒／７２℃、４５秒）で、１回の反応で増幅した。得られるＤ
ＮＡフラグメントを、ＳａｃＩＩおよびＸｂａＩで切断し、そしてｐＣＭＶｐ２
７ＣＩＴＥｔｋに挿入して対応するフラグメントを置換した。配列の完全性を、
配列決定によって確認した。

【００４９】 ｐ２７コード領域のＮ−末端部分とチミジンキナーゼをコードする配列との間
の融合物を、ｐＣＭＶｐ２７ｃｉｔｅｔｋからＳａｃＩＩ−ＮｃｏＩフラグメン
トを欠失させることによって生成し、プラスミドｐＣＭＶｐ２７ＳＮｔｋを生じ
た。同様に、ｐＣＭＶｐ２７ＳＦｔｋおよびｐＣＭＶｐ２７ＮＦｔｋを、ｐＣＭ
Ｖｐ２７ｔｋから、それぞれＳａｃＩＩ−ＦｓｐＩおよびＮａｒＩ−ＦｓｐＩフ
ラグメントを欠失させることによって構築した。

【００５０】 ｐ２７のサイクリン−ｃｄｋ２結合ドメインの下流へのｐ２１のＮ−末端部分
の導入を、プラスミドＶＲ１０１２−ｐ２１ＮからのＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
フラグメントを、ｐＣＭＶｐ２７ｔｋのＳａｃＩＩとＦｓｐＩ部位との間にライ
ゲートすることによって行って、プラスミドｐＣＭＶｐ２７Ｓｐ２１Ｆｔｋを生
じた。ＶＲ１０１２−ｐ２１Ｎは、ｐ２１の最初の７５アミノ酸をコードする配
列のコピーを含む。同様に、ｐＣＭＶｐ２７Ｎｐ２１Ｆｔｋを、同じＮｃｏＩ−
ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをｐＣＭＶｐ２７ｔｋのＮａｒＩとＦｓｐＩ部位間
に挿入することによって構築した。

【００５１】 （２．２９３細胞トランスフェクションおよびＦＡＣＳ分析） ２９３細胞を、１０％ウシ胎児血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地中
で３７℃および５％ＣＯ₂で培養した。１０−ｃｍ直径の培養ディッシュ中で前 日に播種した細胞（２×１０⁶）を、既述のＣａＰＯ₄方法を使用して１５ｍｇの
プラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。細胞周期分析について、２９３細胞
を、代表的には、１２ｍｇの細胞周期インヒビター発現プラスミドの３μｇのＣ
Ｄ２発現プラスミドでトランスフェクトした。

【００５２】 トランスフェクションの１日後、細胞を、２ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＰＢＳを含む
組織培養ディッシュから剥離した。細胞クラスターを、細胞懸濁液を２、３回ピ
ペットで出し入れすることによって破砕し、そして１０⁶細胞を１５−ｃｍ直径 ディッシュ上に再播種した。翌日、細胞を採取し、そして既述（Ｓｈｍｉｄら，
１９９１）のように、フローサイトメトリーによって細胞表面ＣＤ２およびＤＮ
Ａ含量について同時にテストした。簡単にいえば、１０⁶細胞を、５０ｍｌの抗 ＣＤ２マウスハイブリドーマ上清（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＨＢ２２２）と氷上で２０
分間インキュベートした。次いで、細胞を、１ｍｌのＰＢＳ−２％ウシ胎児血清
で２回洗浄し、そして５０ｍｌのＰＢＳ−２％ウシ胎児血清中０．２ｍｇのフル
オレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ヒツジ抗マウス免疫グロブリン
と氷上で２０分間インキュベートした。細胞を、１ｍｌのＰＢＳ−２％ウシ胎児
血清で洗浄し、そして０．２５％パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ中で氷上で１時
間固定した。固定した細胞を、０．２％ｔｗｅｅｎ ２０−ＰＢＳで３７℃にて
１５分間透過化処理した。細胞を１ｍｌのＰＢＳ−２％ウシ胎児血清で再度洗浄
し、そして１ｍｌ当たり３０ｍｇのヨウ化プロピジウムおよび２ユニットのＤＮ
Ａｓｅを含まないＲＮＡｓｅ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含
む１ｍｌのＰＢＳ中で３７℃にて１時間インキュベートした。蛍光を、ＦＡＣＳ
ＣＡＮ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）フローサイトメトリーで分析した
。データは、最高のＣＤ２レベルを発現する細胞に対応する、少なくとも１００
００事象を表す。ＤＮＡプロファイルを、ＭｏｄＦｉｔ ＬＴソフトウエア（Ｖ
ｅｒｉｔｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｈｏｕｓｅ，Ｉｎｃ．）を使用して分析した。

【００５３】 （３．バイスタンダーアッセイ） Ｒｅｎｃａ細胞を、１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ培地中で３７℃お
よび５％ＣＯ₂にて培養した。細胞を、９０％コンフルエンシーに達するまで１ ０−ｃｍ直径ディッシュ中で培養し、次いで１００ｍｇのＬｉｐｆｅｃｔａｍｉ
ｎｅ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）と複合体化した２５ｍｇのＤＮＡでトランスフェク
トした。バイスタンダー実験について、Ｒｅｎｃａ細胞を、代表的には、５ｍｇ
のＣＤ２発現プラスミドおよび２０ｍｇのｔｋ発現プラスミドでトランスフェク
トした。

【００５４】 トランスフェクションの１日後、細胞を採取し、そしてトランスフェクトして
いない細胞の漸増量で希釈した。９６ウェルプレート中ウェル当たり１０⁴細胞 を播種し、そして３７℃にて６時間インキュベートして細胞をプレートに細胞接
着させた。次いで、培地を５ｍＭ ＧＣＶを含む新鮮な培地に交換した。培養を
５日目に終了し、そして細胞増殖を比色アッセイを使用して測定した。トランス
フェクション効率を決定するために、０．５×１０⁶細胞を１０ｃｍ−直径培養 ディッシュに播種し、そして３７℃にてもう１日インキュベートした。次いで、
細胞を採取し、そして上記のようにＣＤ２発現についてＦＡＣＳによって分析し
た。

【００５５】 （結果） （１．ｐ２７の過剰発現は、ｐ２１、ｐ１６、またはＶｐｒよりも強力に種
々の細胞株を停止する。） ４つのサイクリン依存性キナーゼインヒビター（ｐ２１、ｐ２７、ｐ１６、お
よびＶｐｒ）を、アデノウイルス形質転換した胚腎臓細胞株である２９３細胞で
テストした。ＣＭＶエンハンサー／プロモーターの制御下でｐ２１、ｐ２７、ｐ
１６、Ｖｐｒ、またはｈＡＰを発現するベクターを、ＣＤ２発現プラスミドとと
もに２９３細胞にトランスフェクトした。すべての構築物から類似のｍＲＮＡレ
ベルを得るために、すべてのインヒビターを、ＣＭＶプロモーターの制御下で発
現させた。発現の２日後、細胞を採取し、そして抗ＣＤ２抗体およびヨウ化プロ
ピジウムで同時に染色した。細胞方面マーカーＣＤ２（ＣＭＶ−ＣＤ２）を発現
するもう１つのベクターと、これらのプラスミドの同時トランスフェクションの
際に、細胞をフローサイトメトリーによってソーティングし、そしてＤＮＡ含量
について分析した。

【００５６】 ｐ２１およびｐ２７トランスフェクトした２９３細胞において、Ｇ１期にある
細胞の割合は、コントロールについての２７％と比較して、それぞれ５８％およ
び７６％であった。

【００５７】 （２．ｐ２７媒介性のＧ１停止の最適化） ｐ２７およびＴＫを同時発現するベクターを構築した。両方のコード配列を、
ベクターのサイズを減少させそして２つの隣接するプロモーター間の競合を避け
るために、単一転写ユニットに挿入した。特に、Ｅ１領域のみが欠失される場合
に４．５ｋｂｐのキャパシティーを有する現在の世代のアデノウイルスベクター
に遺伝子を移入しなければならない場合、小さいサイズのベクターは、実際には
、最適な遺伝子移入のための重要な特徴である。ｐ２７を、ＣＭＶプロモーター
の下流に挿入して、これに脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）内部リボソーム侵入部
位（ＣＩＴＥ）、ＴＫコード配列、およびウシ成長ホルモン遺伝子からのポリア
デニル化シグナルが続く、ＣＭＶｐ２７ＣＩＴＥＴＫを生じた。

【００５８】 このベクターがＧ１における細胞周期を停止する能力をテストするために、２
９３細胞を、ＣＭＶｐ２７ＣＩＴＥＴＫおよび内部コントロールとしてのＣＭＶ
ＣＤ２の混合物でトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞
を、ＤＮＡ含量およびＣＤ２発現について同時に分析した。ＣＤ２発現細胞のパ
ーセントはすべての試料に匹敵するので、すべてのプラスミドは、類似の効率で
トランスフェクトされている。

【００５９】 ｃｄｃ２キナーゼコンセンサス部位ＴＰＫＫ（配列番号６）のＧＧＡＡ（配列
番号７）への変異は、ｐ２７活性を中程度に増加させる。ｐ２７コード領域内の
内部欠失もまた、ｐ２７活性を増加させる。ｐ２１およびｐ２７のＮ末端ドメイ
ンの融合は、Ｇ１における細胞周期停止を増加させない。

【００６０】 （実施例２） ＣＫＩ発現が動脈修復と関連するかどうかを決定するために、ウエスタンブロ
ット分析を、正常および損傷ブタ動脈について行った。ブタ動脈損傷は、ヒト血
管疾患の十分に研究された動物モデルであり、血管損傷に続く血管疾患において
、内膜平滑筋細胞増殖は、１〜２日目に始まり、迅速に増加し、そして７日目に
内膜細胞の１５〜１８％でピークになり、そして１４日目に１〜２％まで減少す
る。

【００６１】 ブタ大腿動脈を、バルーンカテーテル（Ｃ．Ｒ．Ｂａｒｄ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃ
ａ，ＭＡ）で５００ｍｍＨｇの圧力で５分間損傷し、そして損傷後１、４、７、
１４、２１、６０日目に単離した。損傷していないブタ大腿動脈およびブタ冠状
動脈を同様に単離した。標本の数は、異なる時点について２〜４の範囲であった
。損傷していないヒト冠状動脈を、心臓移植を受ける患者から得た。びまん性内
膜肥厚で８標本、初期アテローム性硬化症で７標本、および進行したアテローム
性硬化症で２０標本を得た。すべての標本をホルマリン中で固定し、パラフィン
に包埋し、ポリリジンコーティングしたスライド上に置き、キシレンの３回の交
換で脱パラフィン化し、そして１００％、９５％、７５％エチルアルコール中で
再水和した。

【００６２】 免疫組織化学研究を、ｐ２７（１：１００希釈、マウスモノクローナル抗体、
Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ｐ２１（１：５００希釈、ウサギポリクローナル抗体
、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ｐ１６（１：５０００希釈、ウサギポリクローナル
抗体、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、平滑筋α−アクチン（１：５００希釈、マウス
モノクローナル抗体、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、ＣＤ６８（１：１００、希釈マ
ウスモノクローナル抗体、ＤＡＫＯ）に対する抗体で行った。スライドを、０．
３％過酸化水素中で３０分間インキュベートして、内因性ペルオキシダーゼ活性
を使い尽くした。一次抗体を１％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈し、そして４℃にて
１２時間スライドにアプライした。数回の洗浄後、ビオチン化した二次ウマ抗マ
ウスＩｇＧまたはウマ抗ウサギＩｇＧ（１：４００希釈、ＺＹＭＥＤ）を、室温
にて３０分間スライドにアプライした。標本を、アルカリホスファターゼ試薬（
Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で室温にて３０分間発色させ、赤い
反応産物を得、次いでメチルグリーンで対比染色した。

【００６３】 Ｌ２９３細胞を、リン酸カルシウム方法によって、ＲｃＣＭＶｐ１６、ＲｃＣ
ＭＶｐ２１、ＲｃＣＭＶｐ２７、ＲｃＣＭＶβ−ガラクトシダーゼ、またはＲｃ
ＣＭＶコントロールプラスミドでトランスフェクトした。細胞を、トランスフェ
クションの４８時間後にＰＢＳで洗浄し、そしてペレットを免疫組織化学のため
に調製した。ｐ２７、ｐ２１、およびｐ１６に対する抗体を、それぞれのｃＤＮ
Ａでトランスフェクトした細胞について、ならびにコントロールプラスミドでト
ランスフェクトした細胞についてテストした。それぞれのｃＤＮＡでトランスフ
ェクトした細胞の染色は、β−ガラクトシダーゼ発現によって決定されるような
トランスフェクション効率に匹敵したが、コントロールプラスミドでトランスフ
ェクトした細胞は染色されなかった。マウスＩｇＧをモノクローナル抗体につい
てのネガティブコントロールとして、そしてウサギ血清をポリクローナル抗体に
ついてのネガティブコントロールとして使用した。これらのコントロール一次抗
体は、トランスフェクトされた細胞も動脈標本も染色しなかった。抗体を、サイ
クリン依存性キナーゼインヒビターｃＤＮＡの１つで、またはコントロールプラ
スミドでトランスフェクトしたＬ２９３細胞からのライセートで、予め吸着した
。ポジティブライセートは、トランスフェクトした細胞および動脈標本のそれぞ
れの抗体による染色を消滅させたが、コントロールライセートでは消滅しなかっ
た。

【００６４】 これまでの研究から十分に特徴づけられた動脈標本を、平滑筋α−アクチン抗
体についてのポジティブコントロールとして、そしてヒト扁桃をＣＤ６８抗体に
ついてのポジティブコントロールとして用いた。サイクリン依存性キナーゼイン
ヒビターと平滑筋α−アクチン、またはサイクリン依存性キナーゼインヒビター
とＣＤ６８についての二重標識免疫組織化学を、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓプロトコルに従って行った。赤い反応産物をｐ２１およびｐ２７につ
いて選択し、青い反応産物を平滑筋α−アクチンおよびＣＤ６８について選択し
、そしてメチルグリーン対比染色を単一の標識研究について行った。

【００６５】 ｐ１６、ｐ２１、およびｐ２７の発現を、内膜、中膜、および外膜について別
々に定量した。平均値を、個々の標本から得たスコアを加算し、そして合計を標
本の数で割ることによって、各時点について決定した。内膜および中膜面積をデ
ジタル面積測定（Ｉｍａｇｅ Ｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉ
ｍａｇｉｎｇ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）によって測定し、そして内膜
対中膜比を算出した。

【００６６】 正常および損傷した動脈からのブタ細胞株のウエスタンブロットを行った。新
内膜を、２１日目に完全に形成した。構成性ｐ２７発現を、静止状態の動脈で検
出し、発現は１日目に減少したが、ｐ２７発現を７日後に観察し、２１日目に増
加した。時間経過およびｐ２７を発現する細胞タイプを、免疫組織化学によって
研究した。ｐ２１発現と比較して、ｐ２７を正常動脈内膜および中膜の平滑筋細
胞で、および外膜で発現した。損傷後、ｐ２７タンパク質を、これらの細胞の＜
１％で検出し、そして発現を発生中の新内膜で検出した７日目まで、低いままで
あった。新内膜が完全に形成された場合（２１日目）、ｐ２７発現は、内弾性板
に隣接する内膜のより低い領域ではっきりした。

【００６７】 動脈損傷後のサイクリン依存性キナーゼインヒビターの発現も測定した。ｐ２
７を、損傷していない動脈では高レベルで、損傷後７日目では低レベルで、およ
び損傷後２１日目では再度高レベルで発現した。ｐ２１の発現は、この時間中に
大きく変化しなかった。ｐ１６の発現は、損傷していない動脈では検出され得ず
、損傷後４日目に存在し、その後の時点ではもはや存在しなかった。

【００６８】 ｐ２７を、静止状態の動脈でおよび損傷後２１日目以後に高レベルで発現した
が、発現は、損傷後最初の１４日間に顕著に減少した。ｐ２１を、静止状態の動
脈で発現し、そして発現は、損傷後にあまり変化しなかった。ｐ１６は、損傷後
１および４日目以外は検出され得なかった。発現の同様の変化を、内膜および中
膜について観察した。

【００６９】 ｐ２１とは違って、ｐ２７タンパク質は、６０日後に修復過程が完了したとき
に動脈のすべての層で顕著であった。ｐ２７の発現は、ＢｒｄＣ組込みによって
これまでに決定された細胞増殖と逆に相関した。反対に、ｐ１６発現は、ウエス
タン分析または免疫組織化学によって静止状態のまたは損傷した動脈で検出され
なかった。

【００７０】 （実施例３） 組換えアデノウイルスによるＶＳＭＣの感染を研究した。

【００７１】 ブタおよびヒトＶＳＭＣおよびＨｅＬａ細胞を、ｍｏｉ ３００ｐｆｕ／細胞
でβ−ガラクトシダーゼアデノウイルスで感染させた。ブタＶＳＣＭの１２±３
％およびヒトＶＳＭＣの１０±２％のみが、β−ガラクトシダーゼについて染色
陽性であった。このパーセントは、ｍｏｉ １５００ｐｆｕ／細胞でブタＶＳＭ
Ｃについては４０±４％およびヒトＶＳＭＣについては３５±４％まで増加した
。

【００７２】 反対に、ＨｅＬａ細胞の９２±１％は、ｍｏｉ ３００ｐｆｕ／細胞でβ−ガ
ラクトシダーゼについて陽性であり、そしてｍｏｉ １５００ｐｆｕ／細胞では
すべての細胞が陽性であった。同様に、Ａ５４９細胞の７６±３％は、ｍｏｉ
３００ｐｆｕ／細胞で陽性であり、そしてｍｏｉ １５００ｐｆｕ／細胞ではす
べての細胞が陽性であった。感染の非常に高い多重度は、ＶＳＭＣの効果的な感
染に必要であった（ｍｏｉ １５０００ｐｆｕ／細胞でβ−ガラクトシダーゼに
ついてブタ細胞の９５±２％およびヒト細胞の９５±１％が陽性）。

【００７３】 （実施例４） インビトロでＶＳＭＣ増殖におけるｐ２７、ｐ２１、およびｐ１６の効果を研
究した。ｐ２７、ｐ２１、およびｐ１６をコードするアデノウイルスベクターを
構築し、そしてＶＳＭＣ増殖におけるＣＫＩ発現の効果を検査した。コントロー
ル実験を、Ｅ１領域におけるインサートを欠くアデノウイルスベクターで（ＡＤ
ＶΔＥ１）、およびウイルスなしで行った。

【００７４】 ブタ大動脈血管平滑筋細胞の増殖におけるサイクリン依存性キナーゼインヒビ
ターの効果。１群当たり１００００細胞を、５０００ｐｆｕ／細胞（右パネル）
または１００００ｐｆｕ／細胞（左パネル）のｍｏｉで、ｐ１６またはｐ２１ま
たはｐ２７アデノウイルスで感染させた。コントロールウイルス（ΔＥ１）で感
染した細胞ならびに感染していない細胞を、ネガティブコントロールとして用い
た。細胞数を、血球計を使用して８日目まで隔日に決定した。

【００７５】 ヒトｐ２７、ｐ２１、およびｐ１６についてのｃＤＮＡを、ＲｃＣＭＶ（Ｉｎ
ｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）プラスミドにライゲートし、そしてジデオキシチェーンタ
ーミネーション方法によって配列決定した。組換えアデノウイルスを、短縮型ウ
イルスＤＮＡ（Ａｄ５ ｓｕｂ３６０)、ならびに、ウイルス増殖についてアデ ノウイルスマップユニット０〜１および相同組換えについてマップユニット９〜
１６に隣接したｃＤＮＡの１つを有するプラスミドとの同時トランスフェクショ
ンによって構築した。得られるアデノウイルスは、Ｅ１およびＥ３領域に欠失を
有し、そしてサイトメガロウイルスプロモーターの制御下のｃＤＮＡの１つ、お
よびウシ成長ホルモンポリアデニル化部位を含んだ。個々のプラークを単離し、
そして組換えウイルスを、少なくとも２回、プラーク精製をした。ウイルスを、
二重バンド塩化セシウム勾配で精製し、そしてサザンブロット分析、ウエスタン
ブロット分析、およびいくつかの細胞株の増殖の阻害によって導入遺伝子の存在
について分析した。β−ガラクトシダーゼ発現ウイルスおよびＥ１で欠失したが
導入遺伝子を欠くウイルス（ΔＥ１）を、同一の方法で精製した。精製したウイ
ルスの力価を、２４時間の吸着時間を使用し、そして感染後１２日目にプラーク
の数を計数して、２９３細胞上でのプラークアッセイによって決定した。力価は
、すべての調製物について５×１０¹⁰〜２×１０¹¹ｐｆｕ／ｍｌの範囲であった
。精製された調製物中の野生型ウイルスの力価を、２９３細胞と同じ条件を使用
してＡ５４９細胞におけるプラークアッセイによって決定した。すべての調製物
について１／１０⁹ｐｆｕ未満であった。

【００７６】 ブタ大動脈血管平滑筋細胞を、外移植方法によって単離し、２０％ＦＣＳを補
充したＤＭＥＭ中で維持した。ヒト大動脈血管平滑筋細胞をＣｌｏｎｅｔｉｃｓ
から得、そして２０％ＦＣＳを補充したＭ１９９中で培養した。血管平滑筋細胞
（ＶＳＭＣ）を、継代数２および１０の間、実験について使用した。２９３細胞
、Ａ５４９細胞、およびＨｅＬａ細胞をＡＴＣＣから得、そして推奨されるよう
に培養した。Ａ５４９細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＶＳＭＣの感染度を、３００
〜１５０００ｐｆｕ／細胞の範囲の漸増する感染多重度（ｍｏｉ）で、β−ガラ
クトシダーゼアデノウイルスを使用して分析した。β−ガラクトシダーゼ発現を
、１．２５％グルタルアルデヒド中で細胞を固定し、そしてＸ−ｇａｌで３７℃
にて１時間染色することによって、感染後２４時間で分析した。感染した細胞の
パーセントを、２００×倍率で５ランダム顕微鏡視野において染色した細胞なら
びに細胞の総数を計数することによって決定した。ΔＥ１ウイルスで感染した細
胞ならびに感染していない細胞を、すべてのこれらの実験についてのネガティブ
コントロールとして使用した。

【００７７】 細胞周期のどの期に増殖停止が存在するかを決定するために、ｐ２７、ｐ２１
、またはｐ１６を過剰発現する平滑筋細胞を、ヨウ化プロピジウムで染色し、そ
してフローサイトメトリーによって分析した。ｐ２７およびｐ２１の過剰発現は
、形質導入および２０％ＦＣＳ中での維持の後に、細胞増殖の阻害を生じた。逆
に、ｐ１６の過剰発現は、平滑筋増殖の部分的阻害を生じた。ＣＫＩの等価量の
発現が存在し、そのため増殖阻害の差は、定性的であるが定量的ではなかった。

【００７８】 （実施例５） ブタ大動脈血管平滑筋細胞の細胞周期分布におけるサイクリン依存性キナーゼ
インヒビターの効果を研究した。細胞を、５０００ｐｆｕ／細胞または１０００
０ｐｆｕ／細胞のｍｏｉでｐ１６またはｐ２１またはｐ２７アデノウイルスで感
染させた。コントロールウイルスで感染した細胞（ΔＥ１）ならびに感染してい
ない細胞を、ネガティブコントロールとして用いた。細胞周期分布を、ヨウ化プ
ロピジウムでの染色によって感染後４８時間で決定した。

【００７９】 増殖の分析については、ＶＳＭＣを３５−ｍｍ−ディッシュ当たり１００００
細胞の密度で播種し、２４時間培養し、その後５０００または１００００ｐｆｕ
／細胞のｍｏｉでのアデノウイルス感染させた。感染の際に、細胞を通常の培地
中に維持し、そして細胞数を、血球計を使用して８日目までに隔日に決定した。
細胞周期分布および細胞サイズを検査するために、ＶＳＭＣを、１５−ｃｍ−デ
ィッシュ当たり２５００００細胞の密度で播種し、２４時間培養し、その後５０
００または１００００ｐｆｕ／細胞のｍｏｉでアデノウイルス感染させた。感染
の２４時間後、細胞を１：２の比で分割し、そしてさらに２４時間培養し、分析
の時に４０〜６０％コンフルエンシーを生じた。細胞周期分布を、２％パラホル
ムアルデヒド中での固定、０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０での透過化処理、３０μｇ
／ｍｌの最終濃度でのヨウ化プロピジウムでの染色、およびフローサイトメータ
ー（ＦＡＣｓｃａｎ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して励起４９
３ｎｍでのＤＮＡ含量の分析後に検査した。細胞サイズを、前方角散乱を使用す
るフローサイトメーターによって決定し、そして算数および幾何学的手段をサイ
トメーターソフトウエア（ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓ
ｏｎ）で算出した。ΔＥ１ウイルスで感染した細胞ならびに感染していない細胞
を、本実施例のすべてのこれらの実験についてのネガティブコントロールとして
使用した。

【００８０】 ｐ２７、ｐ２１、およびｐ１６の過剰発現は、形質導入されていない細胞また
はＡＤＶ−ΔＥ１ベクターで形質導入された細胞と比較してＧ１停止を促進した
。ｐ２７、ｐ２１、およびｐ１６形質導入した細胞における細胞サイズは、細胞
サイズのフローサイトメトリー分析によって決定した場合、コントロール細胞と
比較してより大きかった。

【００８１】 （実施例６） ブタＶＳＭＣの細胞周期分布における増殖因子の効果を研究した。実施例５に
記載の細胞を、ウシ血清アルブミンまたはウシ胎児血清の存在下で培養した。細
胞を０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下で培養した場合、集団はＧ
１で停止した。２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）の存在下では、細胞は、Ｓおよび
Ｇ２／Ｍ期における細胞のより多数によって示されるように増殖していた。

【００８２】 （実施例７） ｐ２７タンパク質レベルおよび機能的結果における増殖因子の効果を研究した
。０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下で培養した初代ＶＳＭＣ（左
パネル）を、Ｇ１ Ｓ期で停止した。２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）の存在下で
は、ＶＳＭＣを増殖させるために刺激し、そしてＧ１／Ｓ期停止した細胞の数は
実質的に減少した。初代ブタ大動脈ＶＳＭＣを、説明した方法（Ｏｈｎｏら，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ １９９４，２６５：７８１）によって単離し、そして２０％ＦＣ
Ｓを含むＭ１９９中に維持した。細胞周期分析の２４時間前に、ＶＳＭＣを、０
．２％ＢＳＡを含むＭ１９９または２０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中に移した。細
胞周期の分析について、細胞を２４時間後に採取し、リン酸緩衝化生理食塩水（
ＰＢＳ）で２回洗浄し、そして２％パラホルムアルデヒドで６０分間固定し、そ
して０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０中で透過化処理した。細胞を、１ｍｌのＰＢＳ中
１ユニットのＤＮａｓｅを含まないＲＮａｓｅで３７℃にて３０分間処理し、０
．０３ｍｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムに再懸濁し、そしてＦＡＣＳｃａｎモデル
（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用するフローサイトメトリーによっ
て分析した。

【００８３】 ｐ２７タンパク質レベルは、ウエスタンブロット分析によって決定されるよう
に、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）よりも０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存
在下でより高く、このことは、ｐ２７タンパク質レベルと増殖因子濃度との逆関
連を示した。逆に、ｃｄｋ２タンパク質レベルは、ウエスタンブロット分析によ
って決定されるように、ＦＣＳの存在下で大きくは変化しなかった。ｃｄｋ２キ
ナーゼと複合体化したｐ２７は、ＢＳＡ対ＦＣＳの存在下で、総ｐ２７レベルと
同様に変化した。この観察と一致して、ｃｄｋ２キナーゼ活性は、ＦＣＳに比較
した場合、ＢＳＡにおいてより低かった。

【００８４】 （実施例８） 血管平滑筋細胞増殖停止のこのＣＫＩモデルが、ヒト血管疾患に適用可能であ
るかどうかを決定するために、ヒト血管におけるｐ２７、ｐ２１、およびｐ１６
の発現パターンを検査した。

【００８５】 大動脈および冠状動脈の４０標本を、心臓移植を受けている２５名の患者（１
８名の男性および７名の女性、２１〜６７歳）から取り出した心臓から得た。こ
れらの部分を、古典的組織学的基準によって３つの群に分類した：アテローム性
硬化症の臨床的または形態学的証拠のない加齢ヒト動脈に特徴的な、びまん性内
膜過形成；いくつかの脂質沈着物および巣状壊死によって特徴づけられる、初期
アテローム性硬化症；ならびに、線維性キャップ、壊死性コア、脂質沈着物、巣
状壊死、および石灰化をともなう、進行したアテローム性硬化症。組織を、ウエ
スタンブロット分析のために液体窒素中で急速凍結しそして−７０℃で貯蔵し、
または１０％緩衝化ホルマリン中で４時間固定し、次いで７０％エタノール中で
１８時間、そしてパラフィン包埋した。切片（６μｍ厚）を、ポリ−Ｌ−リジン
コーティングしたスライド上に置き、そして免疫染色を行った。ｐ２７およびｐ
２１の両方とも、アテローム発生のすべての段階で発現したが、ｐ１６は、標本
のいずれにおいても検出され得なかった。

【００８６】 アテローム性硬化症ヒト冠状動脈を、抗ｐ２７または抗ｐ２１抗体、ならびに
平滑筋細胞マーカーα−アクチンで二重標識した。内膜におけるｐ２７およびｐ
２１の発現は、平滑筋細胞と同時局在化した。二重標識免疫染色を、標準的技法
を使用して、ｐ２７およびｐ２１抗体、ならびに平滑筋細胞マーカーのα−アク
チンで行った。赤い反応産物をｐ２１およびｐ２７について選択し、青い反応産
物を平滑筋α−アクチンについて選択し、そしてメチルグリーン対比染色を行っ
た。平滑筋α−アクチン陽性細胞（青）は、ｐ２１（赤）およびｐ２７（赤）を
発現する。

【００８７】 ｐ２７およびｐ２１は、内膜、中膜、および外膜に存在したが、ｐ１６は、こ
れらの動脈で検出され得なかった。ｐ２７およびｐ２１の発現は、びまん性内膜
過形成のある動脈ならびにアテローム性硬化症標本に存在した。ｐ２７およびｐ
２１の発現は、α−アクチン陽性細胞およびＣＤ６８陽性細胞と関連し、平滑筋
細胞およびマクロファージとの同一性を確認した。これらのＣＫＩは、細胞増殖
マーカーＫｉ６７を発現する細胞と関連しなかった。これらの所見は、ｐ２７お
よびｐ２１が、びまん性内膜過形成のあるヒト動脈でならびにアテローム発生中
に発現されることを示す。逆に、ｐ１６は、非常に低いレベルで発現されるよう
である（表１を参照のこと）。 表１−ヒト冠状動脈におけるｐ２７の発現

【００８８】

【表１】

【００８９】 （実施例９） ｐ２７、ｐ２１、およびｐ１６の発現パターンを、びまん性内膜肥厚、初期ア
テローム発生、および進行したアテローム発生のあるヒト冠状動脈において検査
した。

【００９０】 細胞周期のＧ１の通過、およびＳ期への進入は、サイクリン／サイクリン依存
性キナーゼ（ＣＤＫ）複合体、主としてサイクリンＤ−ｃｄｋ４およびサイクリ
ンＥ−ｃｄｋ２の結合および活性化を必要とする。サイクリン依存性キナーゼイ
ンヒビター（ＣＫＩ）ｐ２７およびｐ２１は、サイクリン−ｃｄｋ活性を阻害し
、Ｇ１／Ｓ増殖停止を生じる。これらのＣＫＩの発現がｖｓｍｃ増殖を阻害する
かどうかを決定するために、ブタｖｓｍｃを、ｐ２７、ｐ２１、またはｐ１６を
発現するアデノウイルスベクターあるいはコントロールウイルスＡｄΔＥ１でト
ランスフェクトした。ｐ２７およびｐ２１の発現は、ＡｄΔＥ１トランスフェク
トした細胞と比較してｖｓｍｃ増殖の完全阻害を生じたが（ｐ＜０．０１）、ｐ
１６発現は、コントロールと比較してｖｓｍｃ増殖の部分阻害（６３％）を誘導
した。ＦＡＣＳ分析物のヨウ化プロピジウム染色は、Ｇ１停止を証明した。キナ
ーゼアッセイおよび免疫沈降研究は、ｐ２７およびｐ２１によるｃｄｋ２活性の
阻害を証明したが、ｐ１６では阻害を示さなかった。インビボでのＣＫＩ発現の
効果を研究するために、ｐ２７およびｐ１６のアデノウイルス遺伝子移入を、バ
ルーン損傷したブタ動脈で行った。遺伝子移入の７日後、内膜ｖｓｍｃ増殖は、
ｐ１６およびＡｄΔＥ１コントロール動脈と比較してｐ２７動脈で減少した（ｐ
＜０．０５）。増殖のこの減少は、ｐ１６（１．１３±０．０９ｍ２）およびＡ
ｄΔＥ１コントロール動脈（０．９８±０．８ｍｍ２）と比較してｐ２７動脈（
０．５±０．０６ｍｍ２）で内膜区域の阻害に関連した（ｐ＜０．５）。したが
って、ＫＩＰ／ＣＩＰ ＣＫＩのｐ２７およびｐ２１は、ＩＮＫ ＣＫＩのｐ１
６と比較してｖｓｍｃ増殖をネガティブに調節する。これらの研究は、ｖｓｍｃ
において細胞周期のＧ１停止を調節することにおけるＫＩＰ／ＣＩＰおよびＩＮ
Ｋ ＣＫＩの異なる役割を示唆する。

【００９１】 詳細な説明全体を通して引用された参考文献は、参考として本明細書に援用さ
れる。本発明をここで十分に説明してきたが、本発明に対する多くの変更および
改変が、本明細書に記載の本発明の意図または範囲から逸脱せずに行われ得るこ
とは、当業者に明らかである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、（ｉ）ＣＭＶエンハンサー／プロモーターの制御下でｐ２１、ｐ２７
、ｐ１６、Ｖｐｒ、またはｈＡＰを発現するベクターで、および（ｉｉ）ＣＤ−
２発現プラスミドで、形質転換された２９３細胞のＤＮＡプロファイルを表すヒ
ストグラムである。細胞周期の各期における細胞の画分を、対応するピークの上
に示す。ＤＮＡポジティブ細胞の割合を、トランスフェクション効率における変
動性を示すために各グラフの上右角に示す。

【図２】 図２Ａは、ｐ２７およびＴＫを発現する構築物の概略図である。図２Ｂは、上
記のプラスミドおよびＣＤ２発現プラスミドでトランスフェクトした２９３細胞
のＤＮＡプロファイルを示すヒストグラムである。ＣＤ−２発現細胞はすべて、
分析に含まれる。細胞周期の各期における細胞の画分を、対応するピークの上に
示す。ＣＤ−２ポジティブ細胞の割合を、トランスフェクション効率における変
動性を示すために各グラフの上右角に示した。図２Ｃは、５μＭ ＧＣＶの存在
または不在において上記のプラスミドでトランスフェクトした２９３細胞の増殖
を示すヒストグラムである。増殖を、比色アッセイを使用して測定した。データ
は、３測定の平均である。

【図３】 図３Ａは、ｐ２７およびＴＫを発現する構築物の概略図である。図３Ｂは、上
記のプラスミドおよびＣＤ２発現プラスミドでトランスフェクトした２９３細胞
のＤＮＡプロファイルを示すヒストグラムである。細胞周期のＧ１期における細
胞の画分を、対応するピークの上に示す。ＣＤ−２ポジティブ細胞の割合を、ト
ランスフェクション効率における変動性を示すために各グラフの上右角に示した
。すべての値は、２実験の平均である。図２Ｃは、バイスタンダーアッセイを示
す。Ｒｅｎｃａ細胞を、種々のプラスミドでトランスフェクトし、そしてトラン
スフェクトされていない細胞で希釈した。５μＭ ＧＣＶの培養培地への添加お
よび細胞増殖アッセイを、それぞれトランスフェクション後１および５日に行っ
た。

【図４Ａ】 図４Ａは、ｃｄｃ２キナーゼコンセンサス部位ＴＰＫＫのＧＧＡＡへの変異が
、ｐ２７活性を中程度に増加させることを示すヒストグラムである。すべての実
験を、図２Ｂおよび３Ｂにおけるように２９３細胞を使用して行った。

【図４Ｂ】 図４Ｂは、ｐ２７コード領域内の内部欠失が、ｐ２７活性を増加させることを
示すヒストグラムである。すべての実験を、図２Ｂおよび３Ｂにおけるように２
９３細胞を使用して行った。

【図４Ｃ】 図４Ｃは、ｐ２１およびｐ２７のＮ末端ドメインの融合物が、Ｇ１における細
胞周期停止を増加させないことを示す。すべての実験を、図２Ｂおよび３Ｂにお
けるように２９３細胞を使用して行った。

【図５】 図５は、ｐ２７のＤＮＡおよびタンパク質配列（配列番号１〜２）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/10 １０１ Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 Ｗｏｌｖｅｒｉｎｅ Ｔｏｗｅｒ， Ｒｏ ｏｍ 2071， 3003 Ｓ． Ｓｔａｔｅ Ｓｔｒｅｅｔ， Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ， ＭＩ 48109−1280， Ｕ．Ｓ．Ａ. (72)発明者 ナベル， エリザベス ジー. アメリカ合衆国 ミシガン 48105， ア ン アーバー， アンドーバー 3390

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 血管増殖性疾患を、処置の必要のある患者において処置する
   方法であって、ｐ２７をコードする遺伝子の治療的有効量をインビボで投与する
   工程を包含する、方法。
2. 【請求項２】 前記ｐ２７が、変異を含むかまたは第２のポリペプチドに融
   合される、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記第２のポリペプチドが、チミジンキナーゼである、請求
   項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記遺伝子が、発現ベクターに含まれる、請求項１に記載の
   方法。
5. 【請求項５】 前記発現ベクターが、真核生物またはウイルスベクターであ
   る、請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、
   請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記アデノウイルスベクターが、複製欠損である、請求項６
   に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記血管増殖性疾患が、再狭窄である、請求項１に記載の方
   法。
9. 【請求項９】 前記血管増殖性疾患が、アテローム性硬化症である、請求項
   １に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記血管増殖性疾患が、血管形成である、請求項１に記載
    の方法。
11. 【請求項１１】 前記発現ベクターが、リポソーム中にカプセル化される、
    請求項２に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記患者がヒトである、請求項１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 非ウイルス性およびウイルス性発現ベクターの１ｍｌあた
    り約１０⁶〜１０¹¹ｐｆｕが投与される、請求項４に記載の方法。
14. 【請求項１４】 患者において内膜平滑筋細胞増殖を阻害する方法であって
    、ｐ２７をコードする遺伝子の治療的有効量をインビボで投与する工程を包含す
    る、方法。
15. 【請求項１５】 第２のポリペプチドに作動可能に連結される、ｐ２７の融
    合タンパク質。
16. 【請求項１６】 前記第２のポリペプチドが、チミジンキナーゼである、請
    求項１４に記載の融合タンパク質。