JP2003502065A - 高められた増殖能を持つ心筋細胞、およびその製造および使用法 - Google Patents

高められた増殖能を持つ心筋細胞、およびその製造および使用法

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Abstract

(57)【要約】 ベースライン測定及び／又は刺激に応答して心筋細胞の細胞周期を活性化するために増大したサイクリンＤ２活性の使用に関するインビトロ及びインビボでの方法を記載する。これらの目的に有用なベクター、及び活性化した細胞周期を提示する心筋細胞もまた記載する。トランスジェニックサイクリンＤ２の動物モデルもまた記載する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 関連出願 本出願は１９９９年６月１８日に出願された米国特許出願第６０／１３９，９
４２号の便益を請求し、それは全体が本明細書において援用される。
【０００２】 背景技術 本発明は一般的には心筋細胞（cardiomyocytes）およびその使用に、特別の側
面において、サイクリンＤ２蛋白質をコード化する導入核酸を含みおよび高めら
れた増殖能を持っている心筋細胞に、およびそのような心筋細胞を作製および使
用する方法に関している。
【０００３】 成体哺乳類心筋細胞は非常に限られた増殖能しか示さないことはよく確立され
ている。例えば、正常成体心臓における心筋細胞の標識指数は、心筋細胞（card
iomyocyte）核に印を付けるために心筋細胞限定β−ガラクトシダーゼレポータ
ーを発現しているトランスジェニックマウスでトリチウム化チミジンアッセイを
使用して測定された場合、０．００６％未満であることが示されている。Ｓｏｏ
ｎｐａａ，Ｍ．Ｈ．，ａｎｄ Ｆｉｅｌｄ，Ｌ．Ｊ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．２６６：Ｈ１４３９−１４４５（１９９７）。その結果として、哺乳類心筋
細胞は再生増殖の重要な能力が欠如している。
【０００４】 再生的心筋増殖は、例えば、心筋（myocardial）機能の損失を確実にしている
心筋細胞死により特徴付けられる心血管疾患の多くの形に取り組むような、ずば
抜けた治療的能力を持っている。従って、心筋細胞増殖を誘導するための方法を
開発する多くの努力がなされてきた。インビトロで心筋細胞ＤＮＡ合成を増加さ
せる多くの因子が示されている（Ｏｂｅｒｐｒｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｏ．，ｅｔ ａ
ｌ．，心筋肉の発育および再生能，Ｈａｒｄｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｒｎｉｃ Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｃｈｕｒ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（
１９９１））。しかしながら現在まで、胎児または成体培養において、分化した
心筋細胞の持続的増殖を誘導する因子は突き止められていない。
【０００５】 遺伝子導入技術の始まりにより、インビトロまたはインビボで心筋増殖を増加
させる特定の遺伝子産物の能力を試験するための種々の研究が刺激された。例え
ば、そのような研究はｖ−ｍｙｃ（Ｓａｕｌｅ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７９８２−７９８６（１９８７）
：Ｅｎｇｅｉｍａｎｎ，Ｇ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒ
ｄｉｏｌ．２５：１９７−２１３（１９９３））、ｃ−ｍｙｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ
，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３７０９−３７１６
（１９９０）；Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．１０４：１５−１９（１９９１））、ＩＧＦ−１Ｂ（Ｒｅｉｓｓ，Ｋ
．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：８６
３０−８６３５（１９９６））、ＥＩＡ（Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，Ｌ．Ａ．，
ａｎｄ Ｍ．Ｄ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：７７
９１−７７９４（１９９５））およびＳＶ４０ Ｔ抗原（Ｆｉｅｌｄ，Ｌ．Ｊ．
，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１０２９−１０３３（１９８８）；Ｋａｔｚ，Ｅ．
，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６２：Ｈ１８６７−Ｈ１８７６
（１９９２））の強制発現を含んで実施されてきた。
【０００６】 これらの研究努力で、ＤＮＡ腫瘍ウイルスからの細胞性癌原遺伝子または形質
転換癌遺伝子の強制された発現は心筋細胞のＤＮＡ合成、いくつかの場合には増
殖を促進できることが示されたが、再生的心筋増殖を誘導するために有用であろ
う遺伝子の同定の進捗は遅く、困難であった。
【０００７】 哺乳類細胞周期は多年にわたり研究の興味を引く重要な領域であった。この周
期はＧ１期として知られている増殖の第一期を含んでおり、次にＳ期へ進行し、
そこではＤＮＡ複製が行われる。Ｓ期にはＧ２期として知られている第二期が続
き、そこでは細胞の質量が増加する。周期は核分裂および細胞質分裂を含むＭ期
で終結する。この細胞周期の進行はいくつかのチェックポイントで制御されてい
る。高度に組織化されたカスケードは、細胞周期の次工程の開始前に、すべての
必要とされる活性（ゲノム重複、ＤＮＡ修復、染色体分離など）が完了している
ことを確実にする。多チェックポイントの存在はまた、異常な増殖または遺伝子
が傷ついた細胞の同定および除去のための機構も提供できる。
【０００８】 細胞周期チェックポイントを通る移行は一部、プロテインキナーゼのファミリ
ーであるサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の活性およびその活性化パートナ
ーであるサイクリンにより制御されている。ほとんどの例において、ＤＮＡ合成
の開始は、細胞周期のＧ１→Ｓ境界に存在する、いわゆる制限ポイントを通過す
る移行を必要としている。この制限ポイントを通過する移行はＣＤＫ４およびＤ
型サイクリンにより大部分は制御されている（Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．ａｎｄ Ｊ．
Ｐｉｎｅｓ，Ｃｅｌｌ ７９：５７３−５８２（１９９４）；Ｇｒａｎａ，Ｘ．
ａｎｄ Ｅ．Ｐ．Ｒｅｄｄｙ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １１：２１１−２１９（１９
９５）を参照されたい）。
【０００９】 特定の細胞型におけるサイクリンＤ１の強制発現を研究するためにトランスジ
ェニック実験が使用された。結果は細胞型に依存して変化した。ＭＭＴＶ−ＬＴ
Ｒ−サイクリンＤ１導入遺伝子の発現は、構成的乳房増殖を導いた（Ｗａｎｇ，
Ｔ．Ｃ．ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ．）３６９：６６９−６７１（１
９９４））。対照的に、Ｅμ−サイクリンを運んでいるマウスではリンパ球増殖
は観察されなかったが、Ｅμ−サイクリンＤ１およびＥμ−ｍｙｃ導入遺伝子の
両方を運んでいるマウスは、Ｅμ−ｍｙｃ導入遺伝子単独のマウスと比較すると
高められたリンパ腫形成を示した（Ｂｏｄｒｕｇ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕ
ｒ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｏｒｇａｎ．Ｊ．１３：２１２ｌ−２１３０（１９９４
）；およびＬｏｖｅｃ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｏｒｇ
ａｎ．Ｊ．１３：３４８７−３４９５（１９９４）を参照されたい）。ＭＨＣ−
サイクリンＤ１導入遺伝子を運んでいるマウスは、トリチウム化チミジン取り込
みアッセイにより測定されるように、成体心筋細胞において多核形成および持続
性ＤＮＡ合成を示す（Ｓｏｏｎｐａａ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ，Ｃｌｉｎ．
Ｉｎｖｅｓｔ．９９：２６４４−２６５４（１９９７））。
【００１０】 この背景技術を考慮すると、心筋細胞のような細胞の増殖能を高めるための、
および増殖促進細胞の使用のためのさらなる方法が未だに必要とされている。本
発明はこれらの要求に取り組んでいる。
【００１１】 発明の概要 本発明の特色は、心筋細胞におけるサイクリンＤ２活性の増加は高められた増
殖能を細胞に提供するという発見を含んでいる。従って、本発明の一つの側面は
心筋細胞においてサイクリンＤ２活性レベルを増加させることを含む、心筋細胞
の増殖能を高めるための方法に関している。一つの形式において、このことは心
筋細胞内へ核酸を導入することを含んでおり、ここで核酸はサイクリンＤ２をコ
ード化しているヌクレオチド配列を持っている。そのような導入はインビトロま
たはインビボで細胞に実施でき、インビトロの場合、修飾された細胞はその後ヒ
トを含む哺乳類内へ移植できて有用である。
【００１２】 本発明の別の側面は、サイクリンＤ２をコード化している導入核酸を持ってい
る心筋細胞、即ち高められた増殖能を示している心筋細胞を提供する。例えば、
配列表の配列ＩＤ番号：１または配列ＩＤ番号：３のヌクレオチド４から８７０
に対応しているコード配列を細胞は持っている、またはサイクリンＤ２活性を持
っている蛋白質をコード化するようにそれらと十分に類似したコード配列を持っ
ている導入核酸を持つであろう。ヌクレオチド配列は、例えば、構成的プロモー
ター、誘導可能プロモーターまたは心筋細胞特異的プロモーターを含むプロモー
ターへ作動可能なように結合されているであろう。
【００１３】 別の側面において、本発明は誘導可能プロモーターまたは心筋細胞特異的プロ
モーターのようなプロモーターに作動可能なように結合されたサイクリンＤ２を
コード化しているヌクレオチド配列を含んでいる核酸構築物を提供する。サイク
リンＤ２コード配列は配列ＩＤ番号：１または配列ＩＤ番号：３のヌクレオチド
４から８７０のヌクレオチドに対応しているか、またはサイクリンＤ２活性を持
っている蛋白質をコード化するようにそれらと十分に類似したヌクレオチドの配
列であろう。
【００１４】 本発明はまた、哺乳類において心筋細胞の増殖能を高めるための方法も提供す
る。この方法は高められた増殖能が生じるように、哺乳類心筋組織（myocardial
tissue）の心筋細胞中のサイクリンＤ２活性レベルを高めることを含んでいる
。例えば、心筋組織内の心筋細胞は構成的、誘導可能または心筋細胞特異的プロ
モーターのようなプロモーターへ作動可能なように結合されているサイクリンＤ
２をコード化している核酸を取り込んでいる発現ベクターを遺伝子導入できる。
【００１５】 本発明はまた哺乳類に心筋細胞を移植する方法にも関している。本方法は心筋
細胞または心筋原細胞を移植することを含んでおり、ここで心筋細胞は高められ
たレベルのサイクリンＤ２活性を示し、高められた増殖能を持っている。移植さ
れた細胞は構成的、誘導可能または心筋細胞特異的プロモーターのようなプロモ
ーターへ作動可能なように結合されているサイクリンＤ２をコード化している導
入核酸を持っているであろう。
【００１６】 哺乳類心筋組織中の心筋細胞の増殖能の増加を誘導するための方法も本発明に
より提供される。該方法は哺乳類心筋組織に心筋細胞を提供することを含んでお
り、ここで心筋細胞は心筋細胞の増殖能を増加させるために薬理学的作用剤に感
受性である。心筋細胞の増殖能が増加するのを達成するように作用剤が投与され
る。誘導可能心筋細胞は、例えば、心筋組織内に移植された誘導可能細胞として
提供されるか、または、心筋組織中に存在する細胞のインビボ遺伝子形質導入で
生じるであろう。
【００１７】 別の態様において、本発明は修飾されたＤ型サイクリンを提供し、ここで該サ
イクリンは、その天然形に存在する一つまたはそれ以上の（可能であれば全部）
リン酸化部位を除去するように修飾されている。
【００１８】 本発明は高められた増殖能を持っている心筋細胞、およびそのような細胞を作
製および使用するための方法を提供する。本発明の追加の態様および特色は本明
細書の記述から明らかになるであろう。
【００１９】 発明の詳細な説明 本発明の原理の理解を進めるため、そのある種の好適な態様がここで参考にさ
れるであろうし、それを説明するために特別な言葉が使用されるであろう。しか
しながら、それにより本発明の範囲の制限が意図されるものではないことを理解
されたく、本発明が関与する分野の当業者には普通に生じるように、本明細書に
記載したような本発明の原理のそのような改変、さらなる修飾および応用が予期
されている。
【００２０】 本明細書に説明されているように、サイクリンＤ２活性レベルを増加させるこ
とが細胞（例えば、一般的には哺乳類心筋細胞のような非増殖性細胞）に高めら
れた増殖能を提供するために使用できることが発見された。本発明は、とりわけ
、高められた増殖能を持つ新規細胞、インビトロまたはインビボでのそのような
細胞の使用を含んでいる新規方法、高められた増殖能を持つ細胞を得るために細
胞を修飾するための新規遺伝子構築物および方法、新規細胞移植法、およびその
ような細胞を持っている動物モデルを利用できるようにしている。
【００２１】 マウスおよびヒト蛋白質を含む、哺乳類起源のサイクリンＤ２蛋白質が既知で
ある。１９９６年２月９日に公開された米国特許第５，８６９，６４０号はサイ
クリンＤ２蛋白質を含むＤ型サイクリンのアミノ酸およびヌクレオチド配列、な
らびに、特徴付けるデータを開示しており、本明細書において全体が援用される
。サイクリンＤ２は他の既知のＤ型サイクリン、サイクリンＤ１およびサイクリ
ンＤ３と構造的には相関しているが異なっている。これらのＤ型サイクリンはＣ
ＤＫ４およびＣＤＫ６を結合しおよび活性化する。この蛋白質複合体は次に網膜
芽細胞腫ファミリーのメンバーをリン酸化し、それによりＥ２Ｆファミリーメン
バーを放出させる（これらは通常は結合されており、そのため低リン酸化ＲＢフ
ァミリーメンバーにより阻害される）。放出されたＥ２ＦはＤＮＡ合成に必要な
種々の遺伝子産物の転写を促進することにより細胞周期進行を開始させる。
【００２２】 既知の天然Ｄ型サイクリンの基本的構造特性が下記の表１に示されている：
【００２３】
【表１】
【００２４】 多くの従来の報告はこれら３つのサイクリンは機能的に重複していると示唆して
いる。しかしながら、ここでの発見はサイクリンＤ２とサイクリンＤ１およびＤ
３間には重大な機能的相違が存在していることを明らかにした。実例として、下
記表２はトランスジェニックサイクリンＤ２マウス心臓で測定された心室および
左心房ＤＮＡ合成と、対応するトランスジェニックサイクリンＤ１およびＤ３マ
ウスのものとの比較が提供されている。各々の場合、試験は下記実施例３で一般
的に説明したように実施された（ＨＷ／ＢＷ＝心臓重量／体重；Ｉｓｏ＝イソプ
ロテレノール処理）。焼灼損傷（Ｃ．Ｉ．）データ（梗塞の模倣）は下記実施例
１０で説明したような一般的な方法を使用して得られた。
【００２５】
【表２】
【００２６】 観察されるように、トランスジェニックサイクリンＤ２マウスではイソプロテ
レノール処理に応答してＤＮＡ合成は止まらなかったが、一方、トランスジェニ
ックサイクリンＤ１およびＤ３マウスでは停止した。加えて、トランスジェニッ
クサイクリンＤ２マウスにおけるＤＮＡ合成は焼灼損傷（上記心室データ参照）
およびイソプロテレノール処理（左心房データ）に応答して増加した。従って、
サイクリンＤ２はサイクリンＤ１およびＤ３とは異なった機能特性を示している
。
【００２７】 サイクリンＤ２のアミノ酸配列とＤ１およびＤ３の配列との比較は、本質的な
相違をいくつかのドメインで明らかにしている。例えば、Ｄ２はおおよそアミノ
酸残基２００−２４０および２６０−２８０に存在するドメインがＤ１とは著し
く異なっている。Ｄ２はおおよそアミノ酸残基２１０−２２５および２５０−２
８０に存在するドメインがＤ３とは著しく異なっている。従って、サイクリンＤ
２はおおよそヌクレオチド２００−２８０に及ぶ領域でサイクリンＤ１およびＤ
３の両方と異なっている。機能的には、表１に例示したように、これらのサイク
リンはリン酸化部位の傾向が異なっている。予想されるように、これらの部位の
多くは上で非相同と同定されたドメイン内に存在している。
【００２８】 配列ＩＤ番号：１は本明細書の実施例で利用されたマウスサイクリンＤ２のヌ
クレオチド配列および演繹されたアミノ酸配列を示している（マウスサイクリン
Ｄ２配列のＧｅｎｂａｎｋ登録番号８３７４９もまた参照されたい）。配列ＩＤ
番号：３はヒトサイクリンＤ２のヌクレオチド配列および演繹されたアミノ酸配
列を示している。これに関し、本明細書で使用される場合、用語”ヌクレオチド
配列”とはヌクレオチドおよび／またはヌクレオシドおよびその誘導体の、天然
のまたは合成による連続的配列を指すことが意図されている。用語”アミノ酸配
列”とはアミノ酸および／またはその誘導体の、天然のまたは合成による連続的
配列を指すことが意図されている。用語”コード化”および”コード”とは、そ
れにより転写および翻訳の機構を通してヌクレオチド配列が細胞へ情報を提供す
る過程を指しており、それから一連のアミノ酸が特定のアミノ酸配列に組み立て
られ、ポリペプチドが生成される。
【００２９】 理解されるように、本発明はまた、本明細書に開示する特定のサイクリンＤ２
配列とは異なるがそれと実質的な同一性を有し、そのために本明細書に示す特徴
的なサイクリンＤ２活性を示すようなヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の使
用も含む。そのような配列は本発明の種々の側面での使用のためのサイクリンＤ
２核酸およびサイクリンＤ２タンパク質を提供すると考えられる。例えば、変異
体アミノ酸配列をコードする核酸配列は本発明の範囲内である。配列における欠
失、挿入、または置換のような配列への修飾で、得られるポリペプチド分子の機
能性に実質的に影響を与えない“サイレントの”変化を生ずるものは明らかに本
発明で意図される。例えば、理解されるように、遺伝コードの縮重に影響する、
または所定の部位に化学的に均等のアミノ酸を生成させるヌクレオチド配列にお
ける変更が考えられる。従って、アミノ酸アラニン、疎水性アミノ酸のコドンを
別の、疎水性のより低い残基（例えばグリシン）または疎水性のより高い残基（
例えばバリン、ロイシン、またはイソロイシン）をコードするコドンで置換され
てもよい。同様に、１つの負に帯電する残基を別の残基の代わりに（例えばグル
タミン酸の代わりにアスパラギン酸）、または１つの正に帯電する残基を別の残
基の代わりに（例えばアルギニンの代わりにリジン）の置換によって生ずる変化
により、生物学的に均等の産物が生成されると予想される。
【００３０】 また、例えばセリン特異的プロテインキナーゼのコンセンサス配列におけるア
スパラギン酸をセリンで置換するようなホスホ擬態（phosphomimetic）変異によ
って、構成的リン酸化サイクリンＤ２産物を擬態する産物が生成されると予想さ
れる。
【００３１】 コードされたポリヌクレオチド分子のN-末端およびC-末端部分の変化を起こす
ヌクレオチド変化は一般に、ポリペプチドの活性を変更しないと予想される。場
合によっては、実際、配列中に変異を起こしてポリペプチドの生物学的活性に対
する変更の影響を研究することが所望されうる。提案する修飾のそれぞれは十分
に当該分野の通常の技術の範囲内である。
【００３２】 本発明の特徴である方法では、配列番号１（ヌクレオチド4-870）で表すもの
、または配列番号３（ヌクレオチド4-870）で表すものと異なるコード配列を有
する核酸（例えばDNA）を使用してもよく、ここで核酸、または少なくともその
コード部分は、ヌクレオチド4-870の配列番号１または配列番号３を有する核酸
にストリンジェントな条件下で結合し、そしてこの核酸はサイクリンＤ２活性を
有するポリペプチドをコードする。“ストリンジェントな条件”は配列に依存し
、異なる状況で変化する。一般に、ストリンジェントな条件は特定の配列の融解
温度（Ｔｍ）より約５℃低い温度で、所定のイオン強度およびｐＨとなるように
選択される。Ｔｍは（所定のイオン強度およびｐＨ下で）５０％の標的配列が完
全に一致するプローブにハイブリダイズする温度である。一般に、ストリンジェ
ントな条件は塩濃度がｐＨ７で少なくとも約０．０２モルであり、温度が少なく
とも約６０℃である条件である。
【００３３】 好ましい側面では、コードされるポリペプチドは天然のサイクリンＤ２のもの
と一致するリン酸化部位の特徴を保持し、天然のサイクリンＤ１（９部位）およ
びＤ３（１０部位）より少ないリン酸化部位を有し、そして／またはｃＡＭＰキ
ナーゼ、Ｃａキナーゼ、および／もしくはＣＫIIキナーゼのリン酸化部位が欠失
され、そして／またはＧＳＫ３キナーゼリン酸化部位のみを含有する。更に、サ
イクリンＤ２を本発明に従って、特定部位の変異誘発を使用してそのリン酸化部
位の数を減少させる、または完全に除去するように修飾してもよい。更に、サイ
クリンＤ１およびＤ３を修飾し、特定部位の変異誘発を使用してリン酸化部位の
数を減少させる、または完全に除去し、リン酸化能力に関してサイクリンＤ２に
より近く匹敵するＤ-型のサイクリンとなる。そのような修飾は、例えば、セリ
ンおよびスレオニンのようなリン酸化可能なアミノ酸を除去し、これをリン酸化
不能なアミノ酸で、好ましくは非帯電性、非極性アミノ酸（例えばアラニン）で
、タンパク質のコンフォメーションに有害な衝撃を与えないもので置換すること
によって行うことができる。サイクリンＤ１およびＤ３を修飾してサイクリンＤ
２と非相同性である１つ以上の他の領域を相当するＤ２領域で置換し、ここにサ
イクリンＤ２によって示すものと同様の機能特性を示すようにしてもよい。これ
らおよび／または他の潜在的な修飾を天然のＤ-型サイクリンに施与して、ここ
にサイクリンＤ２で示すものと一致する特徴となる活性を有するように修飾され
たＤ-型サイクリンを提供することは本発明の一部をなすものと考えられる（e.g
.maintained DNA synthesis in response to insult and/or inducibility）。
【００３４】 本発明の特徴である別の方法では、配列番号２もしくは配列番号４のアミノ酸
配列、または少なくとも１つの有意な長さ（すなわち少なくとも４０アミノ酸残
基）のそのセグメントと少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくと
も約８０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性を有するアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドで、サイクリンＤ２活性を有するものをコードす
る核酸を使用してもよい。ポリペプチドは、例えば配列番号２もしくは配列番号
４のアミノ酸残基200-280と少なくとも約７０％、８０％、または９０％の同一
性を有するアミノ酸配列を有してもよく、これはサイクリンＤ２がサイクリンＤ
１およびＤ３と異なる領域を表す。ここで使用する同一性の百分率は、高度ＢＬ
ＡＳＴコンピュータープログラム、バージョン2.0.8（アメリカ国立衛生研究所
から入手可）を使用して配列情報を比較することによって決定した同一性の百分
率を意味することを意図する。ＢＬＡＳＴプログラムはKarlinおよびAltschul（
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68(1990)）のアラインメント法に基づく
もので、以下にも記載されている：Altschulら, J. Mol. Biol. 215:403-10(199
0)；KarlinおよびAltchul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7(1993)；お
よびAltschulら(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402。手短に言えば、ＢＬ
ＡＳＴプログラムでは、同一性を、同一のアラインした記号（すなわちヌクレオ
チドまたはアミノ酸）の数を２つの配列のうちの短い方の記号の総数で割ったも
のと定義する。プログラムを使用して、比較されるタンパク質の全長にわたる同
一性の百分率を計算してもよい。ＢＬＡＳＴプログラム、ｂｌａｓｔｐの好まし
いdefaultパラメーターには以下がある：（１）５００の種類（description）；
（２）期待値１０；（３）Karlin-Altschulパラメーターλ＝0.270；（４）Karl
in-AltschulパラメーターK=0.0470；（５）ギャップ・ペナルティー：Existence
11, Extension 1；（６）Ｈ値＝4.94e-324；（６）以下に記載されるようなBLO
SUM62マトリックスに見られる一致するアミノ酸および一致しないアミノ酸のス
コア：Henikoff, S.およびHenikoff, J. G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1
0915-10919(1992)；Pearson, W.R. Prot Sci.4:1145-1160(1995)；そしてHeniko
ff S.およびHenikoff, J.G., Proteins 17:49-61(1993)。またプログラムは、Wo
ottonおよびFederhen（Computers and Chemistry 17:149-163(1993)）のSEGプロ
グラムによって測定される問題の配列のマスクオフ（mask-off）セグメントに対
するSEGフィルターを使用する。
【００３５】 別の形態では、配列番号１または配列番号３（ヌクレオチド4から870）のヌク
レオチド配列のコード部分、またはその少なくとも１つの有意な長さ（すなわち
少なくとも100ヌクレオチド）のセグメントと少なくとも約７０％の同一性を有
するコード配列を含有する核酸を使用してもよく、またこの核酸はここに示す特
徴的なサイクリンＤ２活性を有するポリペプチドをコードする。例えば核酸は配
列番号１または配列番号３のヌクレオチド601から843（アミノ酸200-280をコー
ドする）と少なくとも約70％、少なくとも約80％、または少なくとも約90％の同
一性を有するコード配列を有してもよい。
【００３６】 ヌクレオチド配列は当該分野で周知のプロモーター配列に機能的に結合して種
々の適用に有用な組み換え核酸を提供してもよく、それらの適用には例えば、哺
乳動物または他の真核細胞に核酸を機能的に導入するためのベクターのような媒
体の提供がある。ここで定義するように、ヌクレオチド配列は、他のヌクレオチ
ド配列と機能的な関係にある場合、別のヌクレオチド配列（例えばプロモーター
のような調節要素）に“機能的に結合”する。例えば、ヌクレオチド配列がプロ
モーター配列に機能的に結合する場合、これは一般的にヌクレオチド配列がプロ
モーターと隣接し、プロモーターが遺伝子の転写を促進する能力を有することを
意味する。種々のプロモーターが当該分野で知られており、それらには細胞特異
的プロモーター、誘導プロモーター、および構成プロモーターがある。プロモー
ターは、ヌクレオチド配列テンプレートから生成される所望の産物が標的細胞に
おいて構成的に生成されるように選択してもよい。あるいはまた、当該分野で知
られる活性化要素による活性化を必要とする誘導プロモーターのようなプロモー
ターを選択して、所望の産物の生成を必要に応じて調節してもよい。更にまた、
１つ以上の選択した細胞型において遺伝子の転写を促進するプロモーター（例え
ばいわゆる細胞特異的プロモーター）を選択してもよい。
【００３７】 本発明の好ましい側面では、サイクリンＤ２ヌクレオチド配列が心筋細胞特異
的プロモーターに機能的に結合し、例えば心筋細胞におけるヌクレオチド配列を
構成的に発現させる。そのようなプロモーターの候補の例にはα-ミオシンＨ鎖
（α-ＭＨＣ）プロモーター、β-ミオシンＨ鎖（β-ＭＨＣ）プロモーター、ミ
オシンＬ鎖-２Ｖ（ＭＬＣ-２Ｖ）プロモーター、心房性ナトリウム利尿因子（Ａ
ＮＦ）プロモーターなどがある。そのようなコンストラクトによって心筋細胞に
選択的なサイクリンＤ２核酸の発現が可能となる。
【００３８】 本発明の別な側面では、誘導プロモーターに機能的に結合するサイクリンＤ２
ヌクレオチド配列を含有する組み換え核酸を提供するが、これによってサイクリ
ンＤ２発現および核酸を導入する細胞の増殖能力の向上を誘導物質に反応して亢
進的に調節できる。候補となる誘導プロモーター系の例には、例えば以下がある
：メタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター系（ＭＴプロモーターは硫酸銅のよう
な重金属によって誘導される）；テトラサイクリン調節系（これは発現がテトラ
サイクリンの存在または不在に依存する２元の系である）；グルココルチコイド
反応性プロモーター（これはグルココルチコイド反応要素から誘導される合成配
列を使用し、インビボにおいてデキサメタゾン（dexamethasome）の投与によっ
て誘導される（好適なレセプターを有する細胞））；ムリステロン（muristeron
e）反応性プロモーター（これはゴナドトロピン放出ホルモンプロモーターを使
用し、ムリステロンで誘導される（好適なレセプターを有する細胞））；および
ＴＮＦ反応性プロモーター。使用してもよい、より好ましい更なる誘導プロモー
ターには以下がある：エクジソン・プロモーター系（これは昆虫ホルモン（エク
ジソン）を使用して誘導され、哺乳動物において完全なリガンド依存的発現を起
こす）；β-ＧＡＬ系（これはE.coli lacオペロン・オペレーターおよびtransの
Ｉ遺伝子産物を使用する２元の系であり、無償性誘導物質（ＩＰＴＧ）を使用し
て発現を調節する）；およびＲＵ４８６誘導系（これはＣＹＰ３Ａ５プロモータ
ーを使用し、ＲＵ４８６（十分明らかになっている薬剤）によって誘導される）
。これら、および他の同様の誘導プロモーター系が知られており、本発明におけ
るその使用は当業者の技術範囲内である。
【００３９】 本発明はまた、サイクリンＤ２ヌクレオチド配列を取り込み、インビトロまた
はインビボにおける心筋細胞の遺伝子導入に有用なベクターにも関する。種々の
ベクター系がこれらの目的に好適である。これらには、例えば以下に開示される
アデノウィルス・ベクターのようなウィルスベクターがある：Franzら, Cardiov
asc. Res. 35(3):560-566(1997)；Inesiら, Am. J. Physiol. 274(3 Pt. 1):C64
5-653(1998)；Kohoutら, Circ. Res. 78(6):971-977(1996)；Leorら, J. Mol. C
ell Cardiol. 28(10):2057-2067(1996)；Marchら, Clin. Cardiol. 22(1 Suppl.
1):I23-29(1999)；およびRothmanら, Gene Ther. 3(10):919-926(1996)。アデ
ノ関連ウィルス（ＡＡＶ）ベクターも好適であり、例えばKaptlittら, Ann. Tho
ra. Surg. 62(6):1669-1676(1996)；およびSvenssonら, Circulation 99(2):201
-205(1999)に開示されている。使用してもよい更なるウィルスベクターにはレト
ロウィルスベクター（例えばPrenticeら, J. Mol. Cell Cardiol. 28(1):133-14
0(1996)；およびPetropoulosら, J. Virol. 66(6):3391-3397(1992)参照）およ
びＬｅｎｔｉ（ＨＩＶ-１）ウィルスベクター（Rebolledoら, Circ. Res. 83(7)
:738-742(1998)）がある。好ましい種類の発現ベクターは、上記のものの１つの
ような心筋細胞特異的プロモーターに機能的に結合するサイクリンＤ２核酸を導
入する。更に、ＡＡＶベクターは心筋細胞および組織のトランスフェクションで
の使用に高度な適合性を有し、上記のものの中で好ましい。
【００４０】 本発明によれば、リポソームに基づく導入系を使用してインビトロまたはイン
ビボにおいてサイクリンＤ２核酸を心筋細胞に遺伝学的に導入することもできる
。種々のリポソーム導入系が知られており、組み換え発現ベクターをうまく心筋
細胞へ運搬することについて報告されている。その例は、例えば以下に見られる
：R.W.Zajdelら, Developmental Dynamics. 213(4):412-20(1998)；Y.Sawaら, G
ene Therapy. 5(11):1472-80(1998)；Y.Kawahiraら, Circulation 98(19 Suppl)
:II262-7；discussion II267-8(1998)；G.Yamadaら, Cellular & Molecular Bio
logy 43(8):1165-9(1997)；M. Aokiら, Journal of Molecular & Cellular Card
iology 29(3):949-59(1997)；Y.Sawaら, Journal of Thoracic & Cardiovascula
r Surgery 113(3):512-8；discussion 518-9(1997)；およびI. Aleksicら, Thor
acic & Cardiovascular Surgeon 44(2):81-5(1996)。従って、サイクリンＤ２DN
Aを含むリポソーム組み換え発現ベクターを使用してここに記載する目的でイン
ビトロおよびインビボにおいて心筋細胞を形質転換することもできる。
【００４１】 核酸コンストラクトを使用して、例えばインビボまたはインビトロにおいてサ
イクリンＤ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を心筋細胞に導入し、心
筋細胞の本来のレベルに比較して高いレベルの細胞内サイクリンＤ２活性を得る
ことができる。そのような活性の増加により、細胞の増殖能力を向上できる。増
殖能力の向上の証拠となるのは、例えばＤＮＡの合成レベルおよび核の数（核分
裂）の上昇、および／または細胞分裂レベルの上昇とそれによる細胞数の増加で
ある。ＤＮＡ合成は従来の方法で、例えばトリチウム・チミジン導入分析によっ
てモニタリングできる。細胞分裂は、例えばインビトロもしくはインビボにおけ
る標準的な細胞計数法、または一般的に細胞数の増加に関係する細胞の量もしく
は密度の増加の観察によって、慣例的に検出することもできる。あるいは、また
はそれに加えて、精製した（例えば精製した組み換え）サイクリンＤ２タンパク
質を細胞に導入してサイクリンＤ２活性を増加させてもよく（例えばfusogenic
リポソームまたは他の高分子運搬系によって）、あるいはサイクリンＤ２活性を
増加させる薬理物質で細胞を処理して細胞の増殖能力を増加させることができる
。
【００４２】 本発明によれば、方法を研究、治療、スクリーニング、または他の目的のため
にインビトロまたはインビボで適用できるようにする。インビトロにおいて導入
したサイクリンＤ２ ＤＮＡを発現する心筋細胞の培養方法を、例えば細胞周期
の研究および理解、サイクリンＤ２活性もしくは細胞周期の他の側面を調節する
化学的もしくは物理的物質のスクリーニング、またはその後の哺乳動物（ヒトを
含む）への移植のための心筋細胞の培養に使用することができる。
【００４３】 本発明に従って培養される心筋細胞は種々のソースから誘導できる。例えば、
哺乳動物から回収して培養した後、その哺乳動物（自己移植）、または同じ種（
同種移植）もしくは異なる種（異種移植）の別の哺乳動物に移植してもよい。心
筋細胞は、胚幹細胞のような幹細胞の分化、または心筋細胞に分化する体幹細胞
のような他の類似する多能性細胞から誘導してもよい。それらの誘導の一般的な
方法は米国特許第5,602,301号および5,733,727号（Fieldら）に開示されている
。この点については、そのように誘導する場合、サイクリンＤ２核酸を導入する
ための遺伝学的修飾は幹細胞レベルで行い、例えば１つ以上のベクターを使用し
て心筋細胞特異的プロモーターに機能的に結合するサイクリンＤ２核酸、および
心筋細胞を他の細胞から、幹細胞と区別して、そして／または異なるレベルで選
択することを可能とし、例えば心筋細胞-特異的プロモーターに機能的に結合す
る選択可能なマーカー遺伝子を含む核酸を導入する。形質転換していない幹細胞
から形質転換したものを選別することを可能にする核酸をそのような方法に使用
してもよい。幹細胞および／または心筋細胞のそのような選別は、例えば、好適
なプロモーターに機能的に結合する抗生物質（例えばネオマイシンまたはヒグロ
マイシン）に対する耐性を与える遺伝子もしくは他の化学物質を使用して、また
は好適なプロモーターに機能的に結合するレポーターを使用し、蛍光発色細胞ソ
ーティング（ＦＡＣＳ）による細胞の選別を、例えば既知のＧＦＰレポーターで
、行えるようにしてもよい。
【００４４】 幹細胞由来心筋細胞を使うことで、幹細胞分化後にサイクリンＤ２及びその他
潜在的核酸を取り込む様な遺伝的変更も生じるだろう。例えば心筋細胞に富む、
例えば９０％又はそれ以上心筋細胞を含む分化した細胞集団は、上記の如くプロ
モーター（所望により心筋細胞特異的）と動作可能に連結されたサイクリンＤ２
核酸を有するベクターにより形質転換されるだろう。同一又は別のベクターもま
た、細胞にその他機能的核酸を導入すること、例えばレポーター遺伝子及び／又
は選択可能なマーカーを与えること、又は成長因子及び／又はその他の細胞周期
制御タンパク質の発現を与えることに利用できるだろう。
【００４５】 発明を実施する一つの様態では、上記の好適ベクターを使い左心室、右心室、
左心房、又は右心房の心筋細胞、あるいはその幾つか又は全ての混合体が機能的
サイクリンＤ２核酸を取り込む様にインビトロにて遺伝的に変更されるだろう。
この様なプロトコールで遺伝的に導入されるべき細胞は、例えば様々な発生段階
、例えば胎児、新生児、成体段階にある動物より得られるだろう。好適動物供給
源にはウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、及びネズミの様な哺乳動物が含まれる。ヒト
細胞は、ヒトのドナー又は治療されるべき患者から得ることができる。変更され
た心筋細胞はその後哺乳動物、例えば左心房又は右心房、あるいは左心室又は右
心室に埋め込まれ、哺乳動物内にて細胞移植体を確立する。細胞の移植は、例え
ば注入又はカテーテル挿入を含む好適手段により達成できるだろう。サイクリン
Ｄ２核酸に加え、細胞はまた例えば発現して神経増殖因子の様な成長因子、又は
血管内皮成長因子−１（ＶＥＧＦ−１）の様な血管新生因子といったその他タン
パク質、あるいは１又はそれ以上の追加の細胞周期制御タンパク質若しくはサイ
クリンＤ２の補助因子として機能し、細胞増殖能を増加する様なその他タンパク
質を与える、その他機能的核酸配列を含む様に変更することもできるだろう。
【００４６】 培養及び潜在的移植に適した心筋細胞はまた、導入されたサイクリンＤ２核酸
を発現しているトランスジェニック動物（特に哺乳動物）の心臓からも得られる
だろう。既知技術を使用し、導入されたサイクリンＤ２核酸が本質的に全ての細
胞内に存在しているトランスジェニック動物を作ることができ、培養可能な心筋
細胞を集めるための供給源、又は研究あるいはスクリーニングを目的とする動物
モデルとして利用できる。例えば、トランスジェニックウシ、ブタ、ウマ、ヒツ
ジ又はネズミ動物は心筋細胞供給源、又は研究のための動物モデルとして利用で
きる。
【００４７】 本発明はまた機能的サイクリンＤ２核酸を導入するインビボに於ける心筋細胞
の遺伝的変更も提供する。例えば上記の如くのサイクリンＤ２核酸を含む発現ベ
クターはレシピエント哺乳動物の心筋組織に送り出され、組織内にて心筋細胞を
形質導入する。好適様態では、この様なベクター内のサイクリンＤ２核酸は心筋
細胞特異的プロモーターと動作可能に連結されるだろう。ベクターの送り出しは
、例えば注入、カテーテル挿入、又は血流への注入により好ましく達成されるだ
ろう。レシピエント哺乳動物の心筋組織内での心筋細胞の形質導入を達成できる
供給様態は、本発明に包含されると考えられる。レシピエント内に形質導入細胞
の本質的集団を確立するためには、ベクターの単回送り出し、殆ど同時又は時間
をかけ行われる複数回の送り出しが用いられるだろう。その後形質導入細胞は、
例えば構成的で誘導可能な、又は心筋細胞特異的なプロモーター制御下にサイク
リンＤ２タンパク質を発現し、それにより細胞周期を再活性化させ増殖能を増す
。
【００４８】 インビトロで培養された心筋細胞又は心筋幹細胞（例えば本明細書で論ずる様
な遺伝的に形質導入された幹細胞）の移植、又はインビボでの遺伝的形質導入に
適したベクターの送り出しは、レシピエント心臓内にある１又は複数の選択部位
を狙うか、又は戻すものである。この様な部位（単数又は複数）はレシピエント
の左心房又は右心房、あるいは左心室又は右心室、又はそれらの組合せであろう
。一般的には、移植又は送り出し先部位（単数又は複数）はレシピエントの左心
室又は右心室である。例えば部位（単数又は複数）は、追加の生細胞が必要な部
位、例えば心筋梗塞や心筋症例の様な心臓の損傷又は疾患部位である。この部位
（単数又は複数）は、移植体内での発現又はインビボ導入細胞の発現を介して、
例えば上記の様な神経増殖因子又は血管新生因子といった増殖因子の様なその他
タンパク質を送り出す先の標的でもあろう。
【００４９】 本発明の別の側面では、増加したサイクリンＤ２活性を有する心筋細胞では薬
理学的作用物質との接触に反応して増殖能の大きな増加を示すものが提供できる
ことが見いだされている。例えば、この様な増殖能の増加は以下実施例２及び３
に記載の様に、心筋細胞特異的プロモーターに連結されたサイクリンＤ２ＤＮＡ
を有するトランスジェニックマウスの心臓にて観察されている。この具体例では
、イソプロテレノール処理に反応した増殖能の上昇がトランスジェニックマウス
の左右心房に観察されている。インビボでのイソプロテレノール処理を加えない
トランスジェニックマウスの右心房では、標識指数（チミジン取り込み解析）は
０．０９％であった。イソプロテレノール処理を加えた対応するマウスでは、右
心房の標識指数は０．２９％であった。驚くべきことにインビボでのイソプロテ
レノール処理を加えない左心房標識指数が０．３１％であったのに対し、イソプ
ロテレノール処理した場合のそれは７．２８％であった。更に、以下実施例８に
論じ図５に例示する様に、イソプロテレノール存在下にトランスジェニックサイ
クリンＤ２マウスより採取された左心房心筋細胞の培養体は、培養体中に観察し
た核内に高い増加を示した。これら驚くべき発見は、好適な作用物質の投与又は
処置と組み合わせて増強されたサイクリンＤ２活性を利用することで心筋細胞の
増殖能をインビトロ又はインビボで増加することができる方法の手がかりをもた
らす。この点に関し、これら目的に適した例示の候補作用物質にはイソプロテレ
ノール、エピネフィリン、ノルエピネフィリン、フェニルエフィリンの様な、そ
の幾つかが高血圧治療薬として知られているα−アドレナリン作動性及び／又は
β−アドレナリン作動性受容体アゴニスト、及びフォスフォコリンの様な環状Ａ
ＭＰ誘導剤といった薬理作用物質、及び内因性タンパク質又は同様の機能の有す
る他因子のレベルを増加するその他の薬理学的作用物質が含まれる。本明細書に
おける教示によって、これら及びその他薬理学的作用物質は、増強されたサイク
リンＤ２活性を有する心筋細胞の増殖能を高める能力について容易にスクリーニ
ングされ、そして同定されるだろう。
【００５０】 この発見の利用の一つでは、作用物質に対する反応に於ける心筋細胞増殖能の
増加に細胞移植技術を利用することができる。例えば後に心臓内に移植される細
胞を培養する間に作用物質はその培地中に加え、そして／又は移植後に連続的又
は周期的に細胞を作用物質処理することで、高い増殖能を維持することができる
。別の利用では、哺乳動物の心臓の心筋細胞をインビボにて処理しそのサイクリ
ンＤ２活性を高め、次に作用物質をこの哺乳動物に投与することで増殖能を高め
ることができる。
【００５１】 発明による細胞移植、及び／又はインビボでの遺伝的変更は、例えばヒトを含
む哺乳動物への治療に利用できる。従って、各種エクスビボの細胞移植及び埋め
込み技術、並びに遺伝子治療技術は発明の一部を形成するものとして想定される
。これらは患者の心臓の収縮機能の改善を狙うこと、例えば梗塞又は心筋症によ
る収縮性の喪失の治療に使用できるだろう。
【００５２】 本発見はまた発明の細胞を使用した、心筋細胞に対する生物学的、薬理学的又
はその他作用物質の活性をスクリーニングする方法の手がかりも提供する。例え
ば増強されたサイクリンＤ２活性と組み合わせた場合に、ベースライン又は作用
物質による処理に反応し増大した心筋細胞増殖能に導く補助因子、又はその他条
件に関するスクリーニングの手がかりを提供する。例えば、本明細書に記載のト
ランスジェニックサイクリンＤ２マウスの心内腔の反応の違いは、右心房又は心
室内には存在しないか、減少している補助因子が左心房内に存在すること、及び
／又は左心房には存在しないか、又は減少している阻害タンパク質が右心房又は
心室に存在することに拠るだろう。本明細書に記載のトランスジェニックサイク
リンＤ２マウスは心臓の各種腔内にあるこれら補助因子又は阻害タンパク質の有
無又は相対レベルを発見する自動化技術の利用を可能にする。補助因子（単数又
は複数）の特定は、例えば確立された技術を用いて反応する心臓サンプルと反応
しない心臓サンプルに於ける発現パターンの違いに基づき確立することができる
。例えば遺伝子チップ技術、ディファレンシャルディスプレー及びサブトラクテ
ィブハイブリダイゼーション法は特に、反応性心臓組織（responsive cardiac t
issue）と非反応性心臓組織にて示差的に発現される遺伝子産物を特定するのに
利用できる。心筋細胞濃縮サンプル及び非トランスジェニック組織由来の同類サ
ンプルを利用することで同様に示差的に発現される非特異的因子についてもスク
リーニングすることが可能になる（即ちそれぞれ非心筋細胞にて発現されるもの
、及び増殖細胞に遺伝的に誘導されるもの）。その後、心室、及び／又は右心房
心筋細胞は、左心房心筋細胞同様に作用物質に対するそれらの反応能力を高める
様に変更することができる。例えば、右心房又は右心室あるいは左心室の心筋細
胞はインビトロ、又はインビボにて変更し、作用物質に反応してサイクリンＤ２
に関する補助因子である１又はそれ以上のタンパク質の発現を増加すること、又
は阻害因子の発現を減少させることができる。この様にして追加の作用物質反応
的な、増殖性が高められた心筋細胞が与えられる。
【００５３】 実施例 本発明の原理及び特徴をより良く理解することを促すこをと目的として、以下
の具体的実施例を提供する。これら実施例は例示を目的としており、発明を制限
するものではないことが理解されるだろう。
【００５４】 実施例１ ＭＨＣ−ＣＹＣＤ２融合遺伝子の調製 ＭＨＣ−ＣＹＤ２導入遺伝子を、マウスα−心筋ミオシン重鎖（ＭＨＣ）遺伝
子とマウスサイクリンＤ２（ＣＹＣＤ２）タンパク質をコードするｃＤＮＡを使
って構築した。ＭＨＣプロモーター（配列番号５）は４．５ｋｂの５’フランキ
ング配列とエクソン１−３を含むが開始コドンを含まない１ｋｂの遺伝子から成
る（Ｇｕｌｉｃｋ、Ｊら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６；９１８０−９１８
５（１９９１））。ＣＹＣＤ２ｃＤＮＡはヌクレオチド残基＃２６８−１１４３
（遺伝子バンク登録番号Ｍ８３７４９）（配列番号１）を含み、気泡の如くマウ
ス心臓ＲＮＡの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅により作製さ
れた（Ｋｉｍ、Ｋ．Ｋ，ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ。２６９：２２６０７−２
２６１３（１９９４））。ＣＹＣＤ２ｃＤＮＡの健全性は配列分析により確認さ
れた。センスプライマーの配列は５’ＧＣＴ ＡＴＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ＣＴＧ
ＴＧＣ ＴＧＣ ＧＡＧ ＧＴＧ ＧＡＣ３’（配列番号７）であった。アン
チセンスプライマーの配列は５’ＴＣＣ ＴＣＡ ＣＡＧ ＧＴＣ ＡＡＣ Ａ
ＴＣ ＣＣＧ ＣＡＣ ＧＴＣ ＴＧＴ３’であった（配列番号８）。ＳＶ４０
初期領域転写終止体／ポリアデニレーション部位（ヌクレオチド残基２５８６−
２４５２）がＣＹＣＤ２ｃＤＮＡインサートから下流に挿入された。得られた導
入遺伝子はＭＨＣ−ＣＹＣＤ２と命名され、ＮｒｕＩにて消化され、アガロース
ゲル電気泳動及びＧｅｎｅｃｌｅａｎガラスビーズで溶出され導入遺伝子インサ
ートは精製された。図１に導入遺伝子の地図が示されている。
【００５５】 実施例２ ＭＨＣ−ＣＹＣＤ２トランスジェニックマウスの作製 実施例１で調製したＭＨＣ−ＣＹＣＤ２挿入体を精製し、標準的方法に従い１
細胞胚に注入した（Ｈｏｇａｎ、Ｂ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍ
ｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ、 Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ｐ。４９７（１９９
４））。得られた３４匹のマウスを導入遺伝子の存在についてスクリーニングし
、１１匹がトランスジェニックであると同定された。元マウスに明らかな病的状
態は観察されなかった。８匹のマウスを無作為に選び出し、飼育ケージに入れ最
終的に４トランスジェニック系列を作った。導入遺伝子の発現はまずウエスタン
ブロット分析により確立された（図２）。非トランスジェニック成体心臓（−）
及び１０、９、５及び３と命名されたＭＨＣ−ＣＹＣＤ２系列の成体マウスよ心
臓ホモジェネートを調製した。各系列について２匹のマウスから得たサンプルを
分析した。心臓はＮＰ４０バッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１μｇ／ｍｌ アプロチニン、
１μｇ／ｍｌ ペプスタチン、１μｇ／ｍｌ ロイペプチン、５０μｇ／ｍｌ
ＴＬＣＫ、５０μｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ、１００μｇ／ｍｌ ＴＰＣＫ，１％容積
／容積ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０）。ホモジェネートを４０，０００×ｇで１０分
間遠心分離し清浄にし、上清のタンパク質含有量を市販アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａ
ｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ ＣＡ）を用い定量した。サンプル（６０μｇ／レーン）
を変性条件下、１０％ポリアクリルアミドゲル上にてそのサイズにより分離し、
ニトロセルロース（Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、 Ｓａｎ Ｆｒａｎ
ｃｉｓｃｏ ＣＡ）メンブレン上にエレクトロブロッティングした。フィルター
を０．１％ナフトールブルー−ブラックの４５％エタノール、１０％酢酸液で染
色して転移効率を調べた。ウエスタンブロット分析では、ブロックバッファー（
５％脱脂乾燥乳、３％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ、１×ＰＢＳ）中にて２時間
、室温でインキュベーションし、非特異的結合を遮断した。本試験に用いた抗体
はサイクリンＤ２に対するラットモノクローナル抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ）作業濃度２．５μｇ／ｍｌ）であった。ウエスタンブロット分析は
、高レベルのサイクリンＤ２タンパク質が成体トランスジェニックマウスの心臓
中に存在していることを示した。その他ウエスタンブロット分析は、検証した全
ての組織についてサイクリンＤ２レベルの増加を検出できず、知られているＭＨ
Ｃプロモーターの心筋特異性と矛盾しなかった。
【００５６】 実施例３ 心筋細胞ＤＮＡ合成増加の立証 チミジン取り込みアッセイを用いて、心筋細胞のＤＮＡ合成が成体トランスジ
ェニックＭＣＨ−ＣＹＣＤ２動物中で持続するか調べた。この試験でもＭＨＣ−
ｎＬＡＣと命名された第２のトランスジェニックマウス系列が使用された。ＭＣ
Ｎ−ｎＬＡＣマウスは核に局在するβ−ガラクトシダーゼ（βＧＡＬ）レポータ
ー遺伝子を心筋細胞にのみ発現する（Ｓｏｏｎｐａａ，Ｍ．Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２６４：９８−１０１（１９９４）；Ｓｏｏｎｐａａ，Ｍ．Ｈ．とＬ．Ｊ
．Ｆｉｅｌｄ、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７２：Ｈ２２０−２２６（１９９
７））。正確な心筋細胞トリチウム化チミジン標識指数は、５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドリル−Ｂ−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ＧＡＬ）染色された心臓切
片のオートラジオグラフに於けるβＧＡＬ活性と銀顆粒との共局在をスクリーニ
ングするだけで、ＭＨＣ−ｎＬＡＣ動物について容易に得ることができる。心筋
細胞のＤＮＡ合成に及ぼすサイクリンＤ２の過剰発現の効果をモニターするため
に、ＭＨＣ−ＣＹＣＤ２マウスをＭＨＣ−ｎＬＣマウスと交配させ、ＭＨＣ−ｎ
ＬＡＣ導入遺伝子のみを持つ動物又は両方の導入遺伝子を持つ動物を特定し、隔
離した。マウスが１１週齢に達した時、動物にトリチウム化チミジンを１回注射
し、４時間後に屠殺した。心臓を取り出し、切片化し、Ｘ−ＧＡＬで染色してオ
ートラジオグラフィーにかけた。心室心筋細胞の標識指数は二重トランスジェニ
ックマウスでは０．２４％であったのに対し、ＭＨＣ−ｎＬＡＣコントロール群
ではＤＮＡ合成は観察されなかった（各群について約３０，０００個の核につい
てスコア化した；ｎ＝マウス５匹）。二重トランスジェニックマウスの心房でも
ＤＮＡ合成は観察され、その結果を以下の表３に示す。成体のＭＨＣ−ＣＹＣＤ
２マウスの心臓に観察された持続性の心筋細胞ＤＮＡ合成に注目し、トランスジ
ェニック心筋が心臓肥大にどの程度反応するか確かめるために一連の実験を開始
した。浸透ミニポンプ（モデル２０１、Ａｌｚｅｔ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａ
ｌｉｆｏｒｎｉａ、流速１μｌ／時）に生理食塩水、又は０．０２８ｇ／ｍｌの
イソプロテレノールの生理食塩水液を満たし、肋骨間に小さく開けた縦切開部に
埋め込んだ。８匹のコントロールマウス（ＭＨＣ−ｎＬＡＣ）及び８匹のサイク
リンＤ２マウス（ＭＨＣ−ｎＬＡＣ／ＭＨＣ−ＣＹＣＤ２二重トランスジェニッ
クマウス）を用いた。サイクリン発現マウスでは、イソプロテレノールを７日間
連続投与した結果心臓重量／体重は４７．６％増加した。対照マウスでは、イソ
プロテレノール処理は生理食塩水処理動物に比べ、心臓重量／体重を２８％増加
した。
【００５７】 屠殺前に実験群マウス及び対照マウスにトリチウム化チミジンを単回注射し、
心筋細胞のＤＮＡ合成を調べた。４時間追跡した後動物を屠殺、心臓を取り出し
、凍結保護し、切片を作製、Ｘ−ＧＡＬにて染色してオートラジオグラフィーに
かけた。ここでも心筋細胞のＤＮＡ合成はβＧＡＬ陽性の核に見られる銀粒子の
存在をスコア化することで測定された。イソプロテレノール処理後のＭＨＣ−Ｃ
ＹＣＤ２マウスでは左心房心筋細胞の標識指数に極めて大きな増加が観察された
（イソプロテレノール未処理群０．３１％対イソプロテレノール処理群７．２８
％）。ＭＨＣ−ＣＹＣＤ２マウス右心房のＤＮＡ合成は中程度に増加し、これら
マウスの心室では中程度に減少した。イソプロテレノール処理は、非サイクリン
発現コントロール群の心筋細胞ＤＮＡ合成には影響しなかった。
【００５８】
【表３】
【００５９】 上記データは、サイクリンＤ２を発現しているトランスジェニック動物が心房
及び心室のＤＮＡ合成を持続すること、及び心房心筋細胞のＤＮＡ合成速度がイ
ソプロテレノール処理に反応して劇的に増加することを示している。パルスチェ
ース実験を行い、ＤＮＡ合成を行っている心筋細胞の運命を決定した。ここでも
ＭＨＣ−ＣＹＣＤ２マウスをＭＨＣ−ｎＬＡＣマウスと交配させた。ＭＨＣ−ｎ
ＬＡＣマウスは核局在性にβ−ＧＡＬレポーターを心筋細胞のみに発現した。こ
の交配よりＭＨＣ−ｎＬＡＣ導入遺伝子のみを持つ、又はＭＨＣ−ｎＬＣＡ及び
ＭＨＣ−ＣＹＣＤ２の両方を持つマウスを特定し、隔離した。１１週齢時にＡｌ
ｚｅｔミニポンプ（ミニポンプモデル２００１、Ａｌｚｅｔ、Ｐａｌｏ Ａｌｔ
ｏ ＣＡ；流速１μｌ／時、０．０２８ｇ／ｍｌイソプロテレノール）を使った
イソプロテレノール注入により心筋肥大を誘導した。イソプロテレノール注入７
日後、コントロール（ＭＨＣ−ｎＬＡＣ）及び実験（ＭＨＣ−ｎＬＡＣ／ＭＨＣ
−ＣＹＣＤ２二重トランスジェニック）マウスに３Ｈ−チミジンを単回注射し（
２００ｕＣｉ Ｉ．Ｐ．２８Ｃｉ／ｍＭ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏ
ｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）、４時間（パルス、図３Ａ）又は７２時間（チェー
ス、図３Ｂ）後に屠殺した。心臓を取り出し、３０％ショ糖中に凍結保護し、包
埋、通常の組織学技術を使い１０μｍで切片にした。切片をフォルムアルデヒド
：グルタールアルデヒド（１：１）で後固定し、１ｍｇ／ｍｌのＸ−ＧＡＬ、５
ｍＭフェリシアニドカリウム、５ｍＭフェロシアニドカリウム及び２ｍＭ塩化マ
グネシウムのＰＢＳ液を重層した。切片をＤＡＰ１で二重染色し、３回ＰＢＳに
て洗浄した。乾燥後、染色したスライドを水で１：１に希釈した写真乳剤（Ｉｌ
ｆｏｒｄ Ｌ．４、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ ＰＡ）
にてコーティングし、排液し、遮光ボックス内に４日間、４℃に置いた。次にス
ライドをＫｏｄａｋＤ−１９（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ ＮＹ）で４分間現像し、水
で洗浄、最低４分間３０％チオ硫酸ナトリウムで固定した。スライドは更にＨ2
Ｏにて処理され、濃度勾配を付けたエタノール及びキシレンにより脱水された後
カバースライドを取りつけた。心筋細胞のＤＮＡ合成はＢＧＡＬ活性（青く染色
）と銀顆粒の共局在によりスコア化された。３日間のチェース後に高いＤＮＡ合
成標識指数が観察されたことは、ＤＮＡ合成を行っている心筋細胞が生きている
（Ｅ１Ａ及びＥ２Ｆ遺伝子を移入された心筋細胞では高いアポトーシスが観察さ
れたことと対照的；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
０：７７９１−７７９４（１９９５）；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍら、Ｄｅｖ．Ｂ
ｉｏｌ．１７９：４０２−４１１（１９９６）参照）。青色の核内に銀顆粒が存
在することから、ＭＨＣ−ＣＹＣＤ２／ＭＨＣ−ｎＬＡＣトランスジェニックマ
ウスに於いてイソプロテレノール誘導肥大後の筋細胞のＤＮＡ合成は明らかであ
る（矢印、図３Ａ）。図３Ｂでは、対になった青色の核に重なり銀顆粒が見える
ことから、ＤＮＡ合成後に核分裂が生じたことが示される（又は有糸分裂、対に
なった矢印参照）。
【００６０】 実施例４ ＭＨＣ−ＣＹＣＤ２トランスジェニックマウスにおける種々のタン パク質のレベル解析 ウェスタンブロットを用いて成体ＭＨＣ−ＣＴＣＤ２マウス及びそれらの非ト
ランスジェニック同腹子におけるタンパク質発現レベルを解析した。心臓をＮＰ
４０緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ ｐＨ８．０、１μｇ／ｍｌ アプロチニン、１μｇ／ｍｌ ロイペプチ
ン、５０μｇ／ｍｌ ＴＬＣＫ、５０μｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ、１００μｇ／ｍｌ
ＴＰＣＫ、１％容積／容積 Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）中でホモジナイズし
た。ホモジネートを４０，０００×ｇ、１０分間遠心分離することによって澄ま
せ、上澄みのタンパク質成分を商業的なアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｒｉｃｈｍ
ｏｎｄ、ＣＡ）を用いて定量した。記載したように試料を変性条件下で１０％
ポリアクリルアミドゲル上で分子によって分離し、そしてニトロセルロース（Ｈ
ｏｅｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）膜に
電気ブロットした。転写効率を評価するために、フィルターを０．１％ ナフト
ールブルー−ブラックの４５％ メタノール、１０％ 酢酸で染色した。ウェス
タン解析については、非特異的な結合をブロックするために、ブロック緩衝液（
５％ 脱脂乾燥乳、３％ ＢＳＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ、１×ＰＢＳ）中で２
時間室温でインキュベートした。商業的な抗体を用いて各タンパク質を解析した
。条件（即ち、希釈、反応の長さ、二次抗体など）は取り扱い説明書の推薦され
る方法に従った。結果を以下の表４に示したが、より多数の記号“＋”はより高
レベルのタンパク質を示し、“−”の記号は検出されなかったことを示す。
【００６１】
【表４】
【００６２】 これらの結果は、トランスジェニックマウスにおけるサイクリンＤ２の上方制
御が、細胞周期の進行にとって必要とされる多くの遺伝子産物において発現増加
を増強するのに十分であることを示す。
【００６３】 実施例５ イソプロテレノールにおける細胞周期タンパク質のレベル変化の解 析 成体ＭＨＣ−ＣＹＣＤ２マウス及びそれらの非トランスジェニック同胞種にお
ける心筋肥大をＡｌｚｅｔミニポンプを用いたイソプロテノール注入によって誘
導した（ミニポンプモデル２００１、Ａｌｚｅｔ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ；
流速１μｌ／時、０．０２８ｇ／ｍｌ イソプロテレノール）。イソプロテレノ
ール注入７日後、心臓を採取し、実施例４に記載したような方法を用いてウェス
タンブロット解析を行った。結果を以下の表５に示す。再び、より多数の記号“
＋”はより高レベルのタンパク質を示し、記号“−”は検出されなかったことを
示す。
【００６４】
【表５】
【００６５】 実施例６ ＣＹＣＤ２対対照の心筋細胞の培養 ＭＨＣ−ＣＹＣＤ２トランスジェニックマウス又はそれらの非トランスジェニッ
ク同胞種の新ぞうを所定の年齢で採取し、左心房を切開し、０．１７％ コラゲ
ナーゼ（Ｉ型、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｆｒｅｅｈ
ｏｌｄ、ＮＪ）を含むＰＢＳ中で消化した（３７℃、６０分）。次いで、細胞を
パスツールピペットで粉砕し、１μＭ イソプロテレノールを添加した１０％
ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中でチャンバースライド当たり１×１０5細胞の密度で
播種した。７２時間後に収縮した細胞の存在又は非存在によってプレーティング
を得点化した。結果を以下の表６に示し、“＋”は好結果の培養を示し、“−”
は不成功に終わった培養を示す。
【００６６】
【表６】
【００６７】 これらの結果は、増大したサイクリンＤ２活性が培養心筋細胞に対する許容量
において劇的な改善に到達するために使用され得ることを示す。 実施例７ 左及び右心房における増大した細胞数の立証 新生１４日目のＭＨＣ−ＣＹＣＤ２トランスジェニックマウス及びそれらの非
トランスジェニック同胞種の左及び右心房を採取し、０．１７％ コラゲナーゼ
（Ｉ型、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｆｒｅｅｈｏｌｄ
、ＮＪ）を含むＰＢＳ中で消化した（３７℃、６０分）。次いで、細胞をパスツ
ールピペットで粉砕し、血球計算器で直接カウントした。結果を図４にグラフと
して示し、ＭＨＣ−ＣＹＣＤ２マウスの左及び右心房において増大した細胞数を
非トランスジェニックに対して示す。
【００６８】 実施例８ イソプロテレノールを用いた培養中に増大した細胞核（カリオキネ シス）の立証 新生１４日目のＭＨＣ−ＣＴＣＤ２トランスジェニックマウスの左心房を採取
し、０．１７％ コラゲナーゼ（Ｉ型、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌ、Ｆｒｅｅｈｏｌｄ、ＮＪ）を含むＰＢＳ中で消化した（３７℃、６
０分）。次いで、細胞をパスツールピペットで粉砕し、チャンバースライド当た
り１×１０5細胞の密度で播種した。細胞を１０％ ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ
中で培養した。いつくかのケースでは、培養液にまたイソプロテレノール（１μ
Ｍ）を含んでいた。７２時間後、スライドをグルタールアルデヒド−ホルムアル
デヒド（１：１）で固定し、ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌ Ｘ−ＧＡＬ、５ｍＭ フ
ェリシアン化カリウム、５ｍＭ フェロシアン化カリウム、及び２ｍＭ塩化マグ
ネシウムでのせた。ブルーの核の数を顕微鏡で直接カウントした。図５は結果の
棒グラフを与え、イソプロテレノールの存在下におけるＭＨＣ−ＣＹＣＤ２トラ
ンスジェニックマウスの左心房の心筋細胞の培養は、培養における心筋細胞の核
の数において実質的な増加に導くことを示している。
【００６９】 実施例９ ＣＹＣＤ２心筋細胞における細胞増殖（サイトキネシス）の立証 実施例８に記載したように、新生１４日目のＭＨＣ−ＣＹＣＤ２トランスジェ
ニックマウスの左心房を採取し、消化し、粉砕し、播種し、そして１０％ ＦＢ
Ｓ及びイソプロテレノール（１μＭ）を添加したＤＭＥＭ中で培養した。７２時
間後、スライドをアセトン中で固定し、モノクローナル抗体ＭＦ−２０を用いて
ミオシン重鎖免疫反応について行った。ＦＩＴＣを結合した抗マウスＩｇＧ二次
抗体を用いてシグナルを発生させた。ヘキスト３３３４で染色した核をカウント
した。図６Ａは、サイトキネシスを受けている心筋細胞（ＦＩＴＣシグナル、緑
の立方体）を示す；図６Ｂは、ヘキスト染色（青い立方体）についての同じ領域
を示す。
【００７０】 実施例１０ 焼灼創傷モデルのおける細胞周期活性の立証 本実施例において、増大したサイクリンＤ２レベルを有する心筋細胞の細胞周
期は心筋梗塞をまねる焼灼創傷モデルにおいて活性化されることが示された。１
１周齢のＭＨＣ−ｎＬＡＣ対照又はＭＨＣ−ｎＬＡＣ／ＭＨＣ−ＣＴＣＤ２二重
トランスジェニックマウスを麻酔し（２．５％ アベルチン、０．０１５ｍｌ／
ｇ体重、Ｉ．Ｐ．、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｎｋｏｍｋｏｍａ、
ＮＹ）、及び挿管した（小動物レスピレータ、７０サイクル／秒、一回呼吸圧力
１．２キロパスカル、Ｎａｒｃｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、Ｔ
Ｘ）。第三肋間腔で切開した心臓を露出させ、Ｍｅｄｉ−Ｐａｋ外科用焼灼器（
Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｒｃｈｍｏｎｄ、
ＶＡ）を用いて心臓の頂部と基部の中ほどで心筋を焼灼した。焼灼後、切開を閉
じ、気胸を取り除き、そしてマウスを３７℃で維持したヒーティングパッド上で
麻酔から覚醒させた。本手法に対する致死率は５％未満であった。すべての動物
の操作は、施設ガイドラインに従って行った。創傷７日後、実験マウス及び対照
マウスは３Ｈ−チミジンの１回の注入を受け（２８Ｃｉ／ｍＭでの３００μＣｉ
Ｉ．Ｐ．、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）
、４時間後に屠殺した。心臓を除去し、３０％ショ糖中で凍結防止し、包埋し、
そして標準的な組織学的な手法を用いて１０μｍで切片を作製した。心筋障害の
領域を突き止めるために、切片を製造業者の指示書（Ｓｉｇｍａ）に従ってヘモ
トキシリン及びエオシン（Ｈ ａｎｄ Ｅ）で染色した。心筋細胞の核を突き止
めるために、切片を固定後、ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌ Ｘ−ＧＡＬ、５ｍＭ フ
ェリシアン化カリウム、５ｍＭ フェロシアン化カリウム及び２ｍＭ 塩化マグ
ネシウムを載せた。切片をＤＡＰＩで染色後にカウントし、水で１：１に希釈し
たオートラジオグラフィックのエマルジョン（Ｉｌｆｏｒｄ Ｌ．４、Ｐｏｌｙ
ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）を乾燥した後、水を捨て、４
℃で４日間遮光性の箱中に置いた。次いで、スライドを４分間、Ｋｏｄａｋ Ｄ
−１９（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）で現像し、水洗し、そして少なくとも４分
間、３０％ チオ硫酸ナトリウム中で固定した。さらにスライドを水で洗浄する
ことによって処理し、段階的なエタノール及びキシレンを通して脱水し、続いて
カバースリップを載せた。ＭＨＣ−ＣＹＣＤ２トランスジェニックマウスにおけ
る心筋細胞ＤＮＡ合成はまた焼灼創傷に続いてモニターし、心筋梗塞をまねてい
る。左心室壁（ｆｒｅｅ ｗａｌｌ）を焼灼によって創傷させた。創傷７日後の
心臓の肉眼的検査は、焼灼の部位に壊死領域の存在を提示した。加えて、心筋の
著しいブランチング（ｂｌａｎｃｈｉｎｇ）が焼灼部位に遠位な領域において明
確となり、この部位から先端に局在していた。ブランチングの出現と局在は焼灼
の部位での下にある脈管構造の崩壊に起因する虚血性心筋障害と一致した。心筋
障害の広がりは組織学的な切片において容易に検出され；５０％程度の左心房壁
に影響した。ＤＮＡ合成をモニターするために、創傷されたＭＨＣ−ｎＬＡＣト
ランスジェニック動物（対照）及び創傷されたＭＨＣ−ｎＬＡＣ／ＭＨＣ−ＣＹ
ＣＤ２トランスジェニック動物はトリチウム化チミジンの一回の注入を受けた。
次に、心臓を採取し、切片化し、Ｘ−ＧＡＬで染色し、及びオートラジオグラフ
ィーのための処置を施した。図７Ａは、焼灼部位から上部に局在したＭＨＣ−ｎ
ＬＡＣ／ＭＨＣ−ＣＹＣＤ２トランスジェニックマウスの壊死に近い領域にある
一回合成の心房心筋細胞核（矢印）を示す。図７Ｂは、異なるＭＨＣ−ｎＬＡＣ
／ＭＨＣ−ＣＹＣＤ２トランスジェニック動物の壊死に近い領域を示し；矢印は
ＤＮＡ合成を受けている２つの心筋細胞核に指摘する。壊死に近い領域にある０
．５３％の心筋細胞は、ＭＨＣ−ｎＬＡＣ／ＭＨＣ−ＣＹＣＤ２トランスジェニ
ック動物においてＤＮＡを合成していた（３，２０２個の細胞をスクリーニング
した）。対称的に、壊死に近い領域にある０％の心筋細胞はＭＨＣ−ｎＬＡＣ対
照動物においてＤＮＡを合成していた（３，４００個の細胞をスクリーニングし
た）。即ち、心筋細胞のＤＮＡ合成における増加は、創傷に応答してサイクリン
Ｄ２を発現している心臓において観察される。さらに、ＭＨＣ−ＣＹＣＤ２心臓
における心筋細胞のＤＮＡ合成の総合的な比率は、創傷した対照の心臓（実行し
たアッセイでは検出できない）における比率に対して非常に過剰である。
【００７１】 実施例１１ ＳＴＫ−ｒＭＨＣ−Ｓｗｉｔｃｈ−ＣｙｃＤ２ウイルス 本実施例は、植え付けのために有用な成体心筋組織又は心筋細胞においてサイ
クリンＤ２の誘導可能な発現を提供するために設計されたウイルスを記載する。
既知のＳＴＫウイルスが利用される。ＳＴＫはいかなるアデノウイルスタンパク
質をコードしないように修飾された第三世代のアデノウイルスである。この設計
は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてウイルスで形質移入された細胞に対するいかなる宿
主の免疫応答を制限する。
【００７２】 図８に関して、ウイルスは２つの転写ユニットを含む。第一の転写ユニットは
、ラットのアルファ−心筋ミオシン重鎖（ｒＭＨＣ）プロモータを利用し、既知
の“遺伝子スイッチ”転写因子の心筋特異的発現を標的とする。ウシ成長ホルモ
ン（ｂＧＨ）遺伝子のポリアデニル化及び転写終止配列を遺伝子スイッチ配列の
下流に挿入する。このウイルスでトランスフェクトした心筋細胞は遺伝子スイッ
チタンパク質を発現するであろう。対称的に、このウイルスでトランスフェクト
された非心筋細胞は“遺伝子スイッチ”タンパク質を発現しないであろうし、同
様にｒＭＨＣプロモータは非心筋細胞で活性的でない。遺伝子スイッチの転写因
子は適切なリガンドの存在下でのみ活性的ある（例えば、Ｒｕ４８６）。
【００７３】 ウイルスの第二の転写ユニットは、サイクリンＤ２（ＣｙｃＤ２）の発現を標
的とする４×ＵＡＳ ＴＡＴＡプロモータを利用する。ＳＶ４０の初期領域のポ
リアデニル化及び転写終止配列をＣｙｃＤ２配列の下流に挿入した。４×ＵＡＳ
ＴＡＴＡプロモータの転写は、活性な遺伝子スイッチのタンパク質の存在に依
存する。
【００７４】 このように構築したシステムは、以下のように使用され、機能する。植え付け
のために使用さ得る心臓組織及び／又は心筋細胞は、ウイルス的にＳＴＫ−ｒＭ
ＨＣ−Ｓｗｉｔｃｈ−ＣｙｓＤ２ウイルスで形質移入した。トランスフェクトさ
れた心筋細胞は遺伝子スイッチタンパク質を発現し、リガンドの不存在で不活性
である。非心筋細胞は遺伝子スイッチタンパク質を発現しない。このシステムを
活性化するためには、リガンドが投与される。これは、心筋細胞における遺伝子
スイッチ転写因子の活性化に帰着する。活性化した遺伝子スイッチ転写因子は４
×ＵＡＳ ＴＡＴＡプロモータでの転写を開始する。これは順にＣｙｃＤ２ ｍ
ＲＮＡの合成、最終的にはＣｙｃＤ２タンパク質の合成に帰着する。即ち、この
システムは、サイクリンＤ２の制御された合成に対して供給される。成体の心筋
細胞における遺伝子発現（及びその結果としての細胞周期の活性化）を指向する
ために使用されるであろう。
【００７５】 実施例１２ ＳＴＫ−ｒＭＨＣ−ＣｙｓＤ２−ｎＬＡＣウイルスのテキスト： 本実施例は、成体心筋組織又は他の心筋細胞においてサイクリンＤ２の構造的
な発現を提供するために有用なウイルスの設計を記載する。上記実施例１１に記
載したようにＳＴＫウイルスを利用する。次に図９に関して、１個のビストロン
（ｂｉ−ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）転写ユニットを利用する。ラットアルファ−心筋
ミオシン重鎖（ｒＭＨＣ）プロモータ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ；２６２：Ｈ１８６７−Ｈ１８７６（１９９
２）参照）をサイクリンＤ２の心筋特異的発現を標的にするために使用する（Ｃ
ｙｃＤ２Ａｎ内部リボゾームエントリー部位はＣｙｃＤ２配列の下流に局在する
）。これはマーカー遺伝子をコードする配列に続く（ｎＬＡＣ、核局在ベータ−
ガラクトシダーゼ）。即ち、このウイルスでトランスフェクトした心筋細胞は、
ＣｙｃＤ２及びマーカー遺伝子配列の両方をコードするビシストロン転写物を発
現するであろう。対称的に、このウイルスでトランスフェクトされた非心筋細胞
は、ビシストロン転写物を発現しないであろうし、同様にｒＭＨＣプロモータは
非心筋細胞において活性的でない。即ち、このシステムは、成体心筋細胞におい
てＣｙｃＤ２の構造的な合成のために提供する。マーカー遺伝子の存在は、注入
された心筋細胞と注入されない心筋細胞との間の区別を可能にするであろう。本
発明は図面及び前述の記載において詳細に例証され、及び記載されているが、同
様のことが性格において例証されるように考察されるべきであり、限定されるべ
きものではなく、好ましい態様だけが示され記載されていること、及び本発明の
精神に到達する全ての変化及び修飾は保護されるように期待されていることを理
解すべきである。
【００７６】 本明細書において引用された全ての刊行物は、当該技術分野の技術レベルを表
示し、及び各々が参照によって個別的に援用され、十分に記載されているかのよ
うに本明細書中に参照によって援用される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は実施例１に記載されたように製造されたＭＨＣ−ＣＹＣＤ
２導入遺伝子の地図を示している概略図である。
【図２】 図２は対照マウス（−）および実施例２に記載されたように製造
され、図１に示した導入遺伝子を運んでいるトランスジェニックマウス（１０、
９、５および３で示された線）の心臓におけるサイクリンＤ２発現のウェスタン
ブロット分析の結果を示している。
【図３】 図３Ａおよび３Ｂは、実施例３でさらに示されたように、薬理学
的刺激に応答したＭＨＣ−ＣＹＣＤ２マウスにおける、インビボでの心筋細胞Ｄ
ＮＡ合成および核分裂を示しているパルス標識実験の結果を各々示している顕微
鏡写真である。
【図４】 図４は、実施例７に記載しているように、トランスジェニックＭ
ＨＣ−ＣＹＣＤ２マウスの左および右心房における細胞数が非トランスジェニッ
クマウスと比較すると増加していることを示している棒グラフである。
【図５】 図５は、実施例８に記載しているように、ＭＨＣ−ＣＹＣＤ２ト
ランスジェニックマウスの左心房からの心筋細胞培養物はイソプロテレノール存
在下で培養物中の心筋細胞核数の増加を導いていることを例示している棒グラフ
である。
【図６】 図６Ａおよび６Ｂは、実施例９に記載しているようにして得られ
た、細胞分裂を行っているトランスジェニックＭＨＣ−ＣＹＣＤ２心筋細胞のデ
ィジタル画像である。
【図７】 図７Ａおよび７Ｂは、実施例１０に記載しているようにして得ら
れた、梗塞模倣焼灼損傷モデルにおけるトランスジェニックＭＨＣ−ＣＹＣＤ２
マウス心筋細胞のＤＮＡ合成を示している顕微鏡写真である。
【図８】 図８は実施例１１に記載したような、ＳＴＫ−ｒＭＨＣ−スイッ
チ−ＣｙｃＤ２ウイルスの概略図である。
【図９】 図９は実施例１２に記載したような、ＳＴＫ−ｒＭＨＣ−Ｃｙｃ
Ｄ２−ｎＬＡＣウイルスの概略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 パシュマーシ，キショア・バブ・エス アメリカ合衆国インディアナ州46222，イ ンディアナポリス，ノース・ホワイト・リ バー・パークウェイ・ウェスト・ドライブ 1152，アパートメント 208 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 HA17 4B065 AA91X AA91Y AB01 AC14 CA24 CA44 4C084 AA13 NA14 ZA362 4C087 BB47 BB63 NA14 ZA36 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40 EA23 FA74

Claims (48)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 心筋細胞（cardiomyocyte cell)の増殖能を増加させるための方法であって、
    心筋細胞の増殖能を増加させるために、心筋細胞におけるサイクリンＤ２活性の
    レベルを増加させることを含む、前記方法。
  2. 【請求項２】 心筋細胞を培養培地中に提供し； 核酸を心筋細胞に導入し、ここにおいて、前記核酸はサイクリンＤ２タンパク
    質をコードするヌクレオチドの配列を有する；そして 前記サイクリンＤ２タンパク質の発現に適当な条件下で、心筋細胞を培養する
    ことを含む、請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 前記導入された核酸が、配列番号１若しくは配列番号３のヌクレオチド４ない
    し８７０に対応するヌクレオチド配列、又は当該ヌクレオチド配列に実質的同一
    性を有するヌクレオチド配列を有する、請求項１の方法。
  4. 【請求項４】 前記導入された核酸が、配列番号１若しくは配列番号３のヌクレオチド４ない
    し８７０に対応するヌクレオチド配列を有するか、又は、前記導入された核酸が
    、ストリンジェントな条件下で配列番号１若しくは配列番号３のヌクレオチド４
    ないし８７０を有する核酸にハイブリダイズし、かつ、サイクリンＤ２活性を有
    するタンパク質をコードする、請求項３の方法。
  5. 【請求項５】 前記ヌクレオチド配列が、機能可能なようにプロモーターに結合している、請
    求項４の方法。
  6. 【請求項６】 前記プロモーターが構成性プロモーターである、請求項４の方法。
  7. 【請求項７】 前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項４の方法。
  8. 【請求項８】 前記プロモーターが心筋細胞特異的なプロモーターである、請求項４の方法。
  9. 【請求項９】 前記心筋細胞が哺乳動物の心筋細胞である、請求項１の方法。
  10. 【請求項１０】 心筋細胞を培養するための方法であって、 サイクリンＤ２の増加した細胞内レベルを有する心筋細胞を培養培地中に提
    供し；そして 前記培養培地中で心筋細胞を培養する ことを含む、前記方法。
  11. 【請求項１１】 前記心筋細胞が、構成性プロモーターに機能可能なように連結したサイクリン
    Ｄ２タンパク質をコードする、導入された核酸を有する、請求項１０の方法。
  12. 【請求項１２】 前記心筋細胞が、誘導性プロモーターに機能可能なように連結したサイクリン
    Ｄ２タンパク質をコードする、導入された核酸を有する、請求項１０の方法。
  13. 【請求項１３】 前記心筋細胞が、心筋細胞特異的プロモーターに機能可能なように連結したサ
    イクリンＤ２タンパク質をコードする、導入された核酸を有する、請求項１０の
    方法。
  14. 【請求項１４】 前記導入された核酸が、配列番号１若しくは配列番号３のヌクレオチド４ない
    し８７０に対応するヌクレオチド配列、又は当該ヌクレオチド配列に実質的同一
    性を有するヌクレオチド配列を有するＤＮＡである、請求項１０−１３のいずれ
    か１項の方法。
  15. 【請求項１５】 前記導入された核酸が、配列番号２若しくは配列番号４のアミノ酸配列を有す
    るタンパク質、または、配列番号２若しくは配列番号４のアミノ酸配列に少なく
    とも７０％同一のアミノ酸配列を有し、そして、サイクリンＤ２活性を示すポリ
    ペプチドをコードする、請求項１０−１３のいずれか１項の方法。
  16. 【請求項１６】 前記培養が、細胞の増殖能における増加を誘導する薬剤の存在下で培養するこ
    とを含む、請求項１０−１５のいずれか１項の方法。
  17. 【請求項１７】 前記心筋細胞が哺乳動物の心筋細胞である、請求項１０−１６のいずれか１項
    の方法。
  18. 【請求項１８】 前記心筋細胞がヒトの心筋細胞である、請求項１０−１７いずれか１項の方法
    。
  19. 【請求項１９】 前記心筋細胞がマウスの心筋細胞である、請求項１０−１７いずれか１項の方
    法。
  20. 【請求項２０】 サイクリンＤ２タンパク質をコードする導入された核酸を有する、心筋細胞。
  21. 【請求項２１】 前記導入された核酸が、配列番号１若しくは配列番号３のヌクレオチド４ない
    し８７０に対応するヌクレオチド配列、又は当該ヌクレオチド配列に実質的同一
    性を有するヌクレオチド配列を有する、請求項２０の細胞。
  22. 【請求項２２】 前記導入された核酸が、配列番号２若しくは配列番号４のアミノ酸配列を有す
    るタンパク質、または、配列番号２若しくは配列番号４のアミノ酸配列に少なく
    とも７０％同一のアミノ酸配列を有し、そして、サイクリンＤ２活性を示すポリ
    ペプチドをコードする、請求項２１の方法。
  23. 【請求項２３】 前記ヌクレオチド配列が、機能可能なようにプロモーターに連結した、請求項
    ２０−２２のいずれか１項の細胞。
  24. 【請求項２４】 前記プロモーターが、構成性プロモーターである、請求項２３の細胞。
  25. 【請求項２５】 前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項２３の方法。
  26. 【請求項２６】 前記プロモーターが心筋細胞特異的プロモーターである、請求項２３の方法。
  27. 【請求項２７】 前記心筋細胞が哺乳動物の心筋細胞である、請求項２０−２６のいずれか１項
    の方法。
  28. 【請求項２８】 前記心筋細胞がヒトの心筋細胞である、請求項２０−２６のいずれか１項の方
    法。
  29. 【請求項２９】 サイクリンＤ２タンパク質をコードするヌクレオチドの配列を有する核酸構築
    物であって、当該配列が機能可能なように誘導性プロモーターに連結している、
    前記構築物。
  30. 【請求項３０】 前記ヌクレオチドの配列が、配列番号１若しくは配列番号３のヌクレオチド４
    ないし８７０に対応するか、又は当該ヌクレオチドに実質的同一性を有するヌク
    レオチドの配列である、請求項２９の構築物。
  31. 【請求項３１】 前記ヌクレオチドの配列が、配列番号１若しくは配列番号３のヌクレオチド４
    ないし８７０に対応するか、又は、ストリンジェントな条件下で配列番号１若し
    くは配列番号３のヌクレオチド４ないし８７０にハイブリダイズし、かつ、サイ
    クリンＤ２活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチドの配列である、請
    求項２９の構築物。
  32. 【請求項３２】 心筋細胞特異的プロモーターに機能可能なように連結したサイクリンＤ２タン
    パク質をコードする、ヌクレオチドの配列を有する、核酸構築物。
  33. 【請求項３３】 前記ヌクレオチドの配列が、配列番号１若しくは配列番号３のヌクレオチド４
    ないし８７０に対応するか、又は当該ヌクレオチドに実質的同一性を有するヌク
    レオチドの配列である、請求項３２の構築物。
  34. 【請求項３４】 前記ヌクレオチドの配列が、配列番号１若しくは配列番号３のヌクレオチド４
    ないし８７０に対応するか、又は、ストリンジェントな条件下で配列番号１若し
    くは配列番号３のヌクレオチド４ないし８７０にハイブリダイズし、かつ、サイ
    クリンＤ２活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチドの配列である、請
    求項３２の構築物
  35. 【請求項３５】 哺乳動物中の心筋細胞（myocardial cells）の増殖能を増加するための方法で
    あって、心筋細胞（cardiomyocytes）の増加可能性を増加するために、哺乳動物
    の心筋組織（myocardial tissue）中の心筋細胞(cardiomyocytes)中のサイクリ
    ンＤ２のレベルを増加させることを含む、前記方法。
  36. 【請求項３６】 前記心筋細胞を、プロモーターに機能可能なように連結したサイクリンＤ２タ
    ンパク質をコードする核酸を有する発現ベクターでトランスフェクトすることを
    含む、請求項３５の方法。
  37. 【請求項３７】 前記プロモーターが、構成性プロモーターである、請求項３６の細胞。
  38. 【請求項３８】 前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項３６の方法。
  39. 【請求項３９】 前記プロモーターが心筋細胞特異的プロモーターである、請求項３６の方法。
  40. 【請求項４０】 トランスフェクトされた心筋細胞中の細胞周期の活性を増加させる剤を哺乳動
    物に投与することを、さらに含む、請求項３５−３９のいずれか１項の方法。
  41. 【請求項４１】 前記薬剤がアドレナリン受容体アゴニストである、請求項４０の方法。
  42. 【請求項４２】 受容体アゴニストがβ−アドレナリン受容体アゴニストである、請求項４１の
    方法。
  43. 【請求項４３】 哺乳動物において増殖性心筋細胞を提供するための方法であって、 哺乳動物において心筋細胞を提供し、ここにおいて当該心筋細胞は、当該心
    筋細胞の増殖能力を増加させる剤へ反応性であり；そして 心筋細胞の増殖能力を増加させるために哺乳動物に前記剤を投与する ことを含む、前記方法。
  44. 【請求項４４】 前記心筋細胞が、サイクリンＤ２タンパク質をコードする導入されたＤＮＡを
    含む、請求項４３の方法。
  45. 【請求項４５】 前記導入されたＤＮＡが機能可能なように誘導性プロモーターに連結しており
    、そして、前記剤が前記誘導性プロモーターの誘導を引き起こす、請求項４４の
    方法。
  46. 【請求項４６】 サイクリンＤ２タンパク質をコードする導入されたＤＮＡを発現する心筋細胞
    を有する、トランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、心筋細胞はよって活性
    化された細胞周期を示す、前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
  47. 【請求項４７】 天然型において存在する１又はそれより多くのリン酸化部位を取り除いてある
    、修飾Ｄ型サイクリンタンパク質であって、哺乳動物の心筋細胞が有害な刺激に
    暴露された場合に、増加された増殖能および持続的なＤＮＡ合成を提供する能力
    を示す、前記修飾Ｄ型サイクリン。
  48. 【請求項４８】 請求項４７の修飾Ｄ型サイクリンをコードする核酸分子。
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