JP2002541829A

JP2002541829A - 遺伝子治療および治療的スクリーニングに有用なｅＮＯＳ変異体

Info

Publication number: JP2002541829A
Application number: JP2000611751A
Authority: JP
Inventors: セツサ，ウイリアム・シー
Original assignee: イエール・ユニバーシテイ
Priority date: 1999-04-16
Filing date: 2000-04-14
Publication date: 2002-12-10
Also published as: NZ514305A; AU2004210533A1; US7888089B2; MXPA01010459A; HRP20010797A2; CN100357433C; AU4237800A; NO20015008L; EP1178722A1; WO2000062605A1; UA76939C2; AU774010B2; EP1178722A4; US20090246183A1; EE200100538A; KR100737945B1; US20040253685A1; ZA200108463B; US20110173711A1; CZ20013427A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、Ａｋｔ依存性リン酸化の部位における構造改変を含む新規のＮＯＳ変種または変異体に関する。改変されたタンパク質またはペプチド、特にはヒトｅＮＯＳタンパク質またはペプチド、Ａｋｔタンパク質またはポリペプチドおよびこれらをコードする核酸分子は、血管形成術後の再狭窄、高血圧、アテローム性動脈硬化症、心不全および欠失した血管新生を伴う疾患の治療に対する遺伝子治療薬として有用である。ＮＯＳタンパク質及びペプチドは、ＮＯＳ活性を調節する薬剤のためのスクリーニング方法にも有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連特許の説明本出願は、引用することによりその全体が本明細書中に編入される、１９９４
年４月１６日付けの米国仮特許出願第６０／１２９，５５０号の利益を主張する
。連邦政府支援の謝辞本発明は、一部が連邦政府承認資金ＨＬ５７６６５およびＨＬ６１３７１によ
り援助された研究から生まれた。技術分野本発明は、Ａｋｔ依存性リン酸化部位内の構造的改変を含む新規のＮＯＳ変種
または変異体に関する。改変されたＮＯＳタンパク質またはペプチドおよびこれ
らをコードする核酸分子は、血管形成術後の再狭窄、高血圧、アテローム性動脈
硬化症、心不全、糖尿病および血管新生欠陥を伴う疾患を含む疾患の治療のため
の遺伝子治療薬剤として有用である。発明の背景アテローム性動脈硬化症および血管血栓症は、病的状態および死亡の主要な原
因であり、冠動脈疾患、心筋梗塞、および卒中をもたらす。アテローム性動脈硬
化症は、血管を通している内皮内の変化から始まる。内皮変化は、部分的には酸
化された低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールの取り込みにより起き
る内皮損傷の発生を結果的にもたらすであろう。この損傷の破裂は、血管の血栓
および閉塞となることがある。冠動脈の場合、複雑な損傷の破裂は、心筋梗塞に
陥り、一方頸動脈の場合には卒中が起きるであろう。

【０００２】アテローム性冠動脈性心疾患では、内皮機能不全は、血管拡張物質、例えば酸
化窒素の産生を低下させるであろう。心筋虚血は、自律血管拡張が妨げられた場
合に、血流を制限する冠動脈狭窄または内皮機能不全によりもたらされる。両方
の場合に、動脈血流は酸素要求の上昇に比例してもはや増加できなくなる。別の
状況では、心筋虚血は、酸素要求は一定でも、冠動脈痙攣を介する冠血管流の一
次低下、冠動脈管腔径の低下に導く潜在アテローム性プラークの急速な発達およ
び／または血小板凝集による断続的な微細血管閉塞が起きる。

【０００３】バルーン血管形成術は、プラークにより狭窄された血管を再開するために一般
に使用される。バルーン血管形成術は高い割合で血管の再開に成功するけれども
、これはしばしば内皮を露出し操作の間に血管を損傷する。この損傷は、損傷の
領域への血管の血管平滑筋細胞の病変の形への変異および増殖を起こし、これは
血管内膜平滑筋過剰形成または再狭窄として知られている。この新しい病変は、
血管形成術の３〜６カ月以内に患者に高い割合で症候の再発をもたらす。

【０００４】アテローム性動脈硬化症、血栓症および再狭窄において、例えば血管が拡張で
はなく収縮する正常機能の不全も起きる。血管の過剰な血管収縮は、血管腔のさ
らなる狭窄を起こし、血流を制限する。これは、狭心症（心動脈が関係する場合
）、または一過性脳虚血（すなわち、脳血管が関係する場合には「小卒中」）な
どの症候群を起こすことがある。この異常な血管機能（過剰な血管収縮または不
適切な血管拡張）は、他の疾患状態でも同様に起きる。高血圧症（高い血圧）は
、血管壁の過剰な血管収縮でも、また肥厚によっても、特に循環系の小さい血管
内において起きる。この過程は、肺血管にも影響し、肺高血圧症を起こす。過剰
な血管収縮または不適切な血管拡張に関連することが知られている他の疾患は、
移植アテローム性動脈硬化症、鬱血性心不全、妊娠中毒、レイノー現象、プリン
ズメタル型狭心症（冠動脈痙攣）、脳痙攣、溶血性尿毒症およびインポテンスで
ある。

【０００５】内皮により放出される物質、最初は「内皮細胞由来弛緩因子」（ＥＤＲＦ）と
呼ばれた物質は、これらの病原過程を阻害するために重要な役割を果たす。ＥＤ
ＲＦは、酸化窒素（ＮＯ）であることが知られている。ＮＯは、ヒト生理学に多
くの役割を有し、これには血管平滑筋の弛緩、血小板凝集の阻害、有糸分裂誘発
の阻害、血管平滑筋の増殖、および白血球付着が含まれる。ＮＯは最も強力な内
因性血管拡張物質であり、そして導管動脈内の運動誘発性血管拡張に大きい関係
を有するので、ＮＯ合成の増強は、正常な個体内でも血管疾患を有する個体内で
も運動能力も改善することができるであろう。

【０００６】内皮酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）は、全身の血圧の維持、血管再形成および
血管新生に関係する酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）アイソフォームである(Shesely
et al., 1996; Huang et al., 1995; Rudic et al., 1998; Murohata et al.,
1998) 。ＮＯの内皮産生の不全は、アテローム性動脈硬化症および血管障害の初
期で永続する特徴であり、ｅＮＯＳは、血管遺伝子治療の魅力的な目標であるこ
とが分かっている。ｅＮＯＳ活性化の制御はほとんど分かっていないが、ｅＮＯ
Ｓが種々の細胞刺激に応答してリン酸化されることは知られている(Michel et a
l., 1993; Garcia-Cardena et al., 1996; Corson et al., 1996) 、しかし、酸
化窒素（ＮＯ）産生の制御におけるリン酸化および関係するキナーゼの役割は、
これまで解明されていない。発明の要旨本発明は、その一部分はセリン／トレオニンタンパク質キナーゼ、Ａｋｔ（タ
ンパク質キナーゼＢ）が、ウシｅＮＯＳ中の残基１１７９またはヒトｅＮＯＳ中
の残基１１７７に相当するセリン残基上でｅＮＯＳを直接リン酸化でき、そして
酵素を活性化してＮＯ産生に導くという新しい発見からもたらされた。変異ｅＮ
ＯＳ（Ｓ１１７９ＡまたはＳ１１７７Ａ）は、Ａｋｔリン酸化および活性化に抵
抗性であり、一方変異ｅＮＯＳ（Ｓ１１７９ＤおよびＳ１１７７Ｄ）または（Ｓ
１１７９ＥおよびＳ１１７７Ｅ）は、構成性活性である。さらに、アデノウイル
ス媒介遺伝子を用いて導入活性化されたＡｋｔは、内皮細胞からの基礎ＮＯ放出
を増加し、そして活性化欠失ＡｋｔはＶＥＧＦ刺激ＮＯ産生を減衰する。このよ
うに、ｅＮＯＳは、気体状二次メッセンジャーであるＮＯの放出のためにＡｋｔ
を介するシグナル伝達に連結する新規に記載されたＡｋｔ基質である。本発明は
、一部分は、変異ｅＮＯＳ（Ｓ１１７９Ｄ）がＮＯ産生の速度の増加およびレダ
クターゼ活性の上昇を示すという知見にも基づいている。

【０００７】本発明は、ＮＯＳ、ポリペプチドまたはタンパク質およびこれらをコードする
単離された核酸分子を含み、ここで、ＮＯＳポリペプチドまたはタンパク質は、
ウシｅＮＯＳの残基１１７９、ヒトｅＮＯＳの残基１１７７、ラットｎＮＯＳの
残基１４１２、またはヒトｎＮＯＳの残基１４１５に相当する置換されたアミノ
酸残基を含む。好ましい置換基は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む負
に荷電したＲ基を有するアミノ酸を含む。

【０００８】本発明は、またＮＯＳポリペプチドまたはタンパク質およびこれらをコードす
る単離された核酸分子も含み、ここで、ＮＯＳポリペプチドまたはタンパク質は
、ウシｅＮＯＳの残基１１７９、ヒトｅＮＯＳの残基１１７７、ラットｎＮＯＳ
の残基１４１２、またはヒトｎＮＯＳの残基１４１５に相当する置換されたアミ
ノ酸残基を含む。好ましい置換基は、非−負荷電のＲ基を有するアミノ酸、例え
ばアラニンを含む。

【０００９】本発明は、本発明のＮＯＳポリペプチドまたはＡｋｔポリペプチドをコードす
る導入遺伝子を送達することを含んでなる、患者内で欠失した内因性血管新生を
伴う虚血疾患、特には末梢血管疾患および／または心筋虚血における副行血管発
生を刺激する方法を提供する。

【００１０】本発明は、さらに本発明のＮＯＳポリペプチドを発現するヒト以外の形質転換
動物を含む。

【００１１】最後に、本発明は、（ａ）精製されたＮＯＳ、好ましくはｅＮＯＳまたはｎＮ
ＯＳ、またはＮＯＳ、好ましくはｅＮＯＳまたはｎＮＯＳを発現する細胞および
Ａｋｔを薬剤に対して暴露し、そして（ｂ）ＮＯＳ、好ましくはｅＮＯＳまたは
ｎＮＯＳのＡｋｔで制御される活性を測定する一般段階を含んでなる、ＮＯＳの
Ａｋｔ制御される活性を調節する薬剤を同定するための方法を含む。

【００１２】

【発明の詳細な記述】

Ａ．一般説明本発明は、その一部はセリン／トレオニンタンパク質キナーゼ、Ａｋｔ（タン
パク質キナーゼＢ）がセリン１１７９（ヒトｅＮＯＳ中のセリン１１７７）上で
ｅＮＯＳを直接リン酸化でき、そして酵素を活性化してＮＯ産生に導き、一方、
変異ｅＮＯＳ（Ｓ１１７９Ａ）はＡｋｔリン酸化および活性化に抵抗性であると
いう発見に基づく。さらに、アデノウイルス媒介遺伝子導入を用いて活性化され
たＡｋｔは、内皮細胞からの基礎ＮＯ放出を増加しそして活性化欠失ＡｋｔはＶ
ＥＧＦ刺激ＮＯ産生を減衰させる。従って、ｅＮＯＳは、気体状二次メッセンジ
ャーであるＮＯの放出のためにＡｋｔを介するシグナル伝達に連結する新規に記
載されたＡｋｔ基質である。本発明は、その一部は、変異ｅＮＯＳ、例えばＳ１
１７９Ｄが、ＮＯ産生の速度の増加およびレダクターゼ活性の上昇を示すという
発見にも基づく。

【００１３】ＮＯ産生がｅＮＯＳのＡｋｔ依存性リン酸化により制御されるという証明は、
ＮＯの合成または生物的活性の不全を伴う心血管疾患における内皮機能を改善す
る目的の遺伝子治療に使用される新規の構成性活性ｅＮＯＳ変異体を提供する。
このような疾患は、血管形成術後の再狭窄、高血圧、アテローム性動脈硬化症、
心筋梗塞を含む心不全、糖尿病、および阻害された血管新生を伴う疾患を含む。
本発見は、ＮＯの合成または生物学的活性における不全を伴う疾患を治療するた
めに有用な薬剤の設計のためにも有用な新規の治療目標も提供する。

【００１４】本発明は、疾患の治療を目的とする遺伝子治療に使用するためのラットｎＮＯ
Ｓの残基１４１２またはヒトｎＮＯＳの１４１５に相当する置換されたアミノ酸
を有する新規の構成性活性ｎＮＯＳ変異体も提供する。Ｂ．特定の態様ＮＯＳ変異タンパク質またはポリペプチドの生産本発明は、ＮＯＳタンパク質またはポリペプチド、ＮＯＳタンパク質の対立変
種、およびＮＯＳタンパク質の保存性アミノ酸置換を提供し、これらすべては、
Ａｋｔ媒介リン酸化の部位であるセリン残基の突然変異を含む。例えば、本発明
のタンパク質またはポリペプチドは、下記を含むがこれらに限定はされない、（
１）セリンから、他のアミノ酸、例えばアラニンへの残基１１７７の突然変異(J
anssens et al.(1992), J. Biol. Chem, 267:14519-14522、これは引用すること
によりその全体を本明細書中に編入する）を含んでなりそしてＡｋｔ媒介リン酸
化に抵抗性であるヒトｅＮＯＳタンパク質；（２）セリンから、他のアミノ酸、
例えばアラニンへの残基１１７９の突然変異を含んでなりそしてＡｋｔ媒介リン
酸化に抵抗性であるウシｅＮＯＳタンパク質（米国特許（ＵＳ）第５，４９８，
５３９号の配列番号２、これは引用することによりその全体を本明細書中に編入
する）；（３）セリンから、他のアミノ酸、例えばアラニンへの残基１４１５の
突然変異を含んでなりそしてＡｋｔ媒介リン酸化に抵抗性であるヒトｎＮＯＳタ
ンパク質；（４）セリンから、他のアミノ酸、例えばアラニンへの残基１４１２
の突然変異を含んでなりそしてＡｋｔ媒介リン酸化に抵抗性であるラットｎＮＯ
Ｓタンパク質；（５）セリンから、負に荷電したＲ基、例えばアスパラギン酸ま
たはグルタミン酸への残基１１７７の突然変異を含んでなりそして構成性活性で
ありそしてＮＯ産生の増加およびレダクターゼ活性の上昇を示すヒトｅＮＯＳタ
ンパク質；（６）セリンから、負に荷電したＲ基を含むアミノ酸、例えばアスパ
ラギン酸またはグルタミン酸への残基１１７９の突然変異を含んでなりそして構
成性活性でありそしてＮＯ産生の増加およびレダクターゼ活性の上昇を示すウシ
ｅＮＯＳタンパク質；（７）セリンから、負に荷電したＲ基を含むアミノ酸、例
えばアスパラギン酸またはグルタミン酸への残基１４１５の突然変異を含んでな
りそして構成性活性でありそしてＮＯ産生の増加およびレダクターゼ活性の上昇
を示すヒトｎＮＯＳタンパク質；（８）セリンから、負に荷電したＲ基を含むア
ミノ酸、例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸への残基１４１２の突然変異
を含んでなりそして構成性活性でありそしてＮＯ産生の増加およびレダクターゼ
活性の上昇を示すラットｎＮＯＳタンパク質；および（９）ヒトｅＮＯＳの位置
１１７７またはウシｅＮＯＳの位置１１７９、ラットｎＮＯＳ位置１４１２、お
よびヒトｎＮＯＳの位置１４１５におけるセリンに相当する位置においてセリン
以外のアミノ酸を含むように変性され、そしてＡｋｔリン酸化に抵抗性であり、
構成性活性であるか、またはＮＯ産生の増加およびレダクターゼ活性の上昇のい
ずれかを示す、ヒト、ウシ、またはラット以外の種からのＮＯＳタンパク質。Ｎ
ＯＳ変異体は、リン酸化モチーフＲＸＲＸＸＳ／Ｔ内の他のアミノ酸の突然変異
により産生されてもよい。

【００１５】本発明は、ＮＯ産生およびレダクターゼ活性の上昇を示しそしてＡｋｔ媒介リ
ン酸化の部位におけるセリン残基での突然変異を含んでなる構成性活性ＮＯＳポ
リペプチド、好ましくはｅＮＯＳまたはｎＮＯＳを提供する。ＮＯ産生およびレ
ダクターゼ活性の上昇を示すこれらのＮＯＳポリペプチドの保存的変種、例えば
置換、欠失、および挿入変異体を得ることは、熟練者の技術の範囲内でもある。
本明細書中に使用する場合に、保存的変種とは、構成性活性ＮＯＳ、好ましくは
ｅＮＯＳまたはｎＮＯＳのＮＯ産生のための能力または構成的活性ＮＯＳ、好ま
しくはｅＮＯＳまたはｎＮＯＳのレダクターゼ活性に不利には影響しないアミノ
酸配列内の改変を呼ぶ。野生型ＮＯＳと比較してこれがさらに高いレベルでＮＯ
を産生せずそしてさらに高いレダクターゼ活性を有するように改善された配列が
構成性ＮＯＳの能力に影響する場合に、置換、挿入、または欠失は、構成性活性
ＮＯＳポリペプチドに不利に影響するといわれる。例えば、構成性ＮＯＳの全体
的な荷電、構造または疎水性／親水性は、構成性ＮＯＳの活性に不利に影響しな
いで改変できる。従って、ＮＯＳポリペプチドのアミノ酸配列は、例えばＮＯＳ
の活性に不利に影響しないでポリペプチドに一層高い疎水性または親水性を与え
るように改変できる。

【００１６】本明細書中に使用する場合に、「構成性活性」なＮＯＳの変異体または変種は
、天然起源から変性または単離されたどちらでも、ヒトＮＯＳ中の残基１１７７
またはウシＮＯＳ中の残基１１７９に相当するアミノ酸残基における非リン酸化
形内のセリンを含む本来のＮＯＳよりも高い速度でＮＯを産生するＮＯＳタンパ
ク質、好ましくはｅＮＯＳまたはｎＮＯＳを呼ぶ。好ましい構成性活性変種は、
ヒトｅＮＯＳ中の位置１１７７またはウシＮＯＳ中の位置１１７９のセリンに相
当するアミノ酸残基において負に荷電したＲ基を有するアミノ酸、例えばアスパ
ラギン酸またはグルタミン酸を含んでなる。

【００１７】本発明は、ＮＯＳタンパク質またはポリペプチド、ＮＯＳタンパク質の対立変
種、およびウシｅＮＯＳの残基１１７７、ヒトｅＮＯＳの残基１１７９、ラット
ｎＮＯＳの残基１４１２、およびヒトｎＮＯＳの残基１４１５に相当する置換
されたアミノ酸残基を含むＮＯＳタンパク質の保存的アミノ酸置換を提供し、こ
こで置換されたアミノ酸残基は、非−負荷電のＲ基、例えばアラニンを含んでな
る。

【００１８】本発明のＮＯＳタンパク質、好ましくはｅＮＯＳまたはｎＮＯＳタンパク質は
、単離された形であってもよい。本明細書中に使用する場合に、タンパク質は、
通常はタンパク質と結合している細胞成分からタンパク質を除くために、物理的
、機械的または化学的方法を使用して単離されるものを呼ぶ。熟練者は、単離タ
ンパク質を得るために標準的な精製方法を容易に使用できる。

【００１９】ウシｅＮＯＳ中の残基１１７９、ヒトｅＮＯＳ中の残基１１７７、ラットｎＮ
ＯＳ中の残基１４１２、およびヒトｎＮＯＳ中の残基１４１５に相当するＡｋｔ
リン酸化部位に位置(span)するＮＯＳポリペプチドも本発明に含まれる。ペプチ
ドは、リン酸化部位にセリンを含んでもよく、または、好ましくは、ウシｅＮＯ
Ｓ中の残基１１７９、ヒトｅＮＯＳ中の残基１１７７、ラットｎＮＯＳ中の残基
１４１２、およびヒトｎＮＯＳ中の残基１４１５に相当する位置にセリンの置換
を含んでもよい。このような置換は、そのリン酸化部位中のセリンに類似するＲ
基を有するアミノ酸、例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸を含むが、これ
に限定はされない。このような置換は、非−負のＲ基を有するアミノ酸、例えば
アラニンも含む。この部位に位置するペプチドは、約３、５、７、１０、１２、
１５、１７、２０、２５、３０、４０、５０またはそれ以上のアミノ酸の長さで
あってもよい。

【００２０】本発明のＮＯＳタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、ヒトｅＮＯＳ中
の位置１１７７、ウシｅＮＯＳ中の位置１１７９、ラットｎＮＯＳ中の位置１４
１２、およびヒトｎＮＯＳ中の位置１４１５におけるセリンに相当するセリンを
コードするヌクレオチドトリプレットを置換または改変するために変性されたＮ
ＯＳｃＤＮＡからの組換え発現を含む、利用できるいかなる手段により産生され
てもよい。セリン残基をコードするヌクレオチドトリプレットを突然変異させる
ためにあらゆる利用できる技術、例えば相同性組換え、部位特異的突然変異誘発
またはＰＣＲ突然変異誘発(Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1989参照) を使用してもよい。出発ｃＤＮＡは、ヒ
トおよびウシｅＮＯＳｃＤＮＡならびにラビット、ラット、ネズミ、ブタ、ヒツ
ジ、ウマおよびヒト以外の霊長類種を含みこれらの限定はされない他の動物種の
ｅＮＯＳタンパク質をコードするｃＤＮＡを含んでもよい。

【００２１】本明細書中に使用する場合に、本発明のＮＯＳタンパク質またはポリペプチド
、好ましくはｅＮＯＳまたはｎＮＯＳタンパク質またはポリペプチドをコードす
る核酸分子は、核酸分子が、核酸の起源に由来する他のポリペプチドをコードす
る夾雑核酸から本質的に分離されている場合に、「単離された」を呼ばれる。

【００２２】本発明は、さらにコードする核酸分子の断片も提供する。本明細書中に使用す
る場合に、コードする核酸分子の断片は、配列をコードする全タンパク質の小部
分を呼ぶ。断片の大きさは、意図する用途に従って決定されるであろう。例えば
、タンパク質の活性部分をコードするように断片を選択する場合には、断片は、
Ａｋｔリン酸化部位を含むタンパク質の機能領域をコードするために十分なほど
大きい必要がある。断片が核酸プローブまたはＰＣＲプライマーとして使用され
る場合には、断片長さは、ＮＯＳＡｋｔリン酸化部位に位置または近接する領
域に対するプロービング／プライミングの間に擬陽性(false positive)の比較的
小さい数を得るように選ばれる。

【００２３】プローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための特異性プライマー、
または本発明のタンパク質をコードする合成遺伝子配列として使用される本発明
のコードする核酸分子の断片（すなわち、合成オリゴヌクレオチド）は、化学的
技術、例えばMatteucci et al., 1981, J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191 のリ
ン酸トリエステル法によりまたは慣用の自動化合成法を用いて容易に合成できる
。さらに、一層大きいＤＮＡ断片は、周知の方法、例えば遺伝子の種々の調節セ
グメントを決定するオリゴヌクレオチドの群の合成、次いで完全に変性遺伝子を
構築するためのオリゴヌクレオチドの連結で容易に調製できる。

【００２４】本発明のコードする核酸分子は、診断およびプローブの目的のための検出でき
る標識を含むようにさらに変性してもよい。種々のこのような標識が当該業界で
は公知でありそして本明細書中に記載するコードする分子に容易に使用できる。
適する標識は、ビオチン、放射能標識したヌクレオチドなどを含み、これらに限
定はされない。熟練者は、標識したコードする核酸分子を得るために業界では公
知の標識のいずれかを使用できるであろう。

【００２５】本発明は、さらに上記のＮＯＳコーディング配列を含む組換えＤＮＡ分子（ｒ
ＤＮＡ）を提供する。本明細書中に使用する場合に、ｒＤＮＡ分子は、分子操作
(manipulation)を行なわれたＤＮＡ分子である。ｒＤＮＡ分子を作製する方法は
、当該技術分野では周知であり、例えばSambrook et al., Molecular Cloning (
1989) 参照。好ましいｒＤＮＡ分子中では、コーディングＤＮＡ配列は、発現制
御配列および／またはベクター配列に操作可能に連結している。

【００２６】本発明の配列をコードするタンパク質ファミリーの一つが操作可能に連結して
いるベクターおよび／または発現制御配列の選択は、当該技術分野では周知のよ
うに、希望する機能性、例えばタンパク質発現、および形質転換すべき宿主細胞
に直接依存する。本発明で意図するベクターは、少なくとも宿主染色体内に複製
または挿入を指令でき、そして好ましくはｒＤＮＡ分子内に含まれる構造遺伝子
の発現も可能である。

【００２７】操作可能に連結するタンパク質コード配列の発現を制御するために使用される
発現制御要素は、当該技術分野では公知であり、そして誘導可能なプロモーター
、構成性プロモーター、分泌シグナル、およびその他の制御要素を含みこれに限
定はされない。好ましくは、誘導可能なプロモーターは、例えば宿主細胞の媒体
内の栄養に応答して、容易に制御される。

【００２８】一つの態様では、コーディング核酸分子を含むベクターは、原核生物レプリコ
ン、すなわち原核生物宿主細胞、例えば細菌宿主細胞内で染色体外的に形質転換
された組換えＤＮＡ分子の自律的複製および保持を指令する能力を有するＤＮＡ
配列を含むであろう。このようなレプリコンは、当該技術分野では公知である。
さらに、原核生物レプリコンを含むベクターは、発現が検出可能なマーカー、例
えば薬剤耐性を与える遺伝子も含んでもよい。代表的な細菌薬剤耐性遺伝子は、
アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を与えるものである。

【００２９】原核生物レプリコンを含むベクターは、さらに、細菌宿主細胞、例えば大腸菌
(E. coli) 内のコーディング遺伝子配列の発現（転写および翻訳）を指示する能
力がある原核生物またはバクテリオファージプロモーターを含むことができる。
プロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写の発生を許容するＤＮ
Ａ配列により形成される発現制御要素である。細菌宿主と許容性のプロモーター
配列は、代表的には、本発明のＤＮＡ断片の挿入のために便利な制限部位を含む
プラスミドベクター内に提供される。このようなベクタープラスミドの典型は、
Biorad Laboratories(Richmond, CA) から入手できるｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢ
Ｒ３２２およびｐＢＲ３２９およびPharmacia, Piscataway, N.J. から入手でき
るｐＰＬおよびｐＫＫ２２３である。

【００３０】真核生物細胞と許容性の発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞と許容性のも
のは、コーディング配列を含むｒＤＮＡ分子を形成するためにも使用できる。真
核生物細胞発現ベクターは、当該技術分野では周知でありそして幾つかの商業的
供給源から入手できる。代表的には、このようなベクターは、所望のＤＮＡ断片
を挿入するための便利な制限部位を含んで提供される。このようなベクターの典
型は、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０(Pharmacia) 、ｐＢＲＶ−１／ｐＭＬ２ｄ
(International Biotechnologies, Ltd.) 、ｐＴＤＴ１(ATCC,#31255) 、などの
真核生物発現ベクターである。

【００３１】本発明のｒＤＮＡ分子を構築するために使用される真核生物細胞発現ベクター
は、さらに真核生物細胞内で有効な選択可能なマーカー、好ましくは薬剤耐性選
択マーカーを含んでもよい。好ましい薬剤耐性選択マーカーは、発現がネオマイ
シン耐性をもたらす遺伝子、すなわちネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ
（ｎｅｏ）遺伝子である(Southern et al.(1982) J. Mol. Anal. Genet. 1:327-
341)。あるいは、選択可能なマーカーは、別のプラスミド上に存在してもよく、
そして２個のベクターは宿主細胞の同時−トランスフェクションにより導入され
、そして選択可能なマーカーに対して適当な薬剤内で培養して選択される。

【００３２】本発明は、さらに本発明のＮＯＳタンパク質、好ましくはｅＮＯＳまたはｎＮ
ＯＳタンパク質をコードする核酸分子を用いて形質転換またはトランスフェクシ
ョンされた宿主細胞を提供する。宿主細胞は、原核生物でも真核生物でもよい。
本発明のタンパク質の発現に有用な真核生物宿主細胞は、細胞株が細胞培養と許
容性でありそして発現ベクターの伝達および遺伝子産物の発現と許容性である限
り、制限されない。好ましい真核生物宿主細胞は、酵母、昆虫および哺乳類細胞
を含み、これに限定はされず、好ましくは脊椎動物細胞、例えばマウス、ラット
、サル、またはヒト細胞株である。好ましい真核生物宿主細胞は、ＡＴＣＣから
ＣＣＬ６１として入手できるチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ａ
ＴＣＣからＣＲＬ１６５８として入手できるＮＩＨスイスマウス胚細胞ＮＩＨ／
３Ｔ３、ハムスター幼児腎臓細胞（ＢＨＫ）などの真核生物組織培養細胞株を含
む。いずれの原核生物宿主も、本発明のタンパク質をコードするｒＤＮＡ分子を
発現するために使用できる。好ましい原核生物宿主は、大腸菌、特には構成性活
性ＮＯＳ変異体である。

【００３３】本発明のｒＤＮＡ分子を用いる適当な細胞宿主の形質転換またはトランスフェ
クションは、標準的には使用するベクターの形式および使用する宿主系に依存す
る周知の方法により行なわれる。原核生物宿主細胞の形質転換に関して、エレク
トロポレーションおよび塩処理法が標準的に使用され、例えばCohen et al.(197
2) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110;およびManiatis et al., Molecular C
loning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, NY (1982) 参照。ｒＤＮＡを含むベクターを用いる脊椎動物細胞の形質
転換に関して、エレクトロポレーション、カチオン性脂質または塩処理法が標準
的に用いられ、例えばGraham et al (1983) Virol. 52: 456; Wigler et al.,(1
979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1373-1376参照。形質転換またはトランス
フェクションに成功した細胞すなわち本発明のｒＤＮＡ分子を含む細胞は、選択
可能マーカーの選択を含む周知の技術を用いて同定できる。例えば、本発明のｒ
ＤＮＡ分子導入からもたらされた細胞は、単一コロニーを産生するようにクロー
ニングできる。これらのコロニーからの細胞は、採取、溶解およびｒＤＮＡの存
在に関してそのＤＮＡ内容を、Southern (1975) J. Mol. Biol. 98:503またはBe
rent et al.(1985) Biotech. 3:208が記載した方法を用いて検査し、または細胞
から産生したタンパク質を免疫学的方法によりアッセイできる。

【００３４】本発明は、さらに本明細書中に記載の核酸分子を用いる本発明のＮＯＳタンパ
ク質、好ましくはｅＮＯＳタンパク質またはｎＮＯＳタンパク質を産生する方法
を提供する。一般的に、タンパク質の組換え形の産生は、標準的には下記の段階
を含む。核酸分子は最初に本発明のタンパク質をコードするものとして得られる
。コードする配列がイントロンにより中断されていない場合には、これは直接あ
らゆる宿主内の発現に適する、次いで好ましくは核酸分子を適当な制御配列と操
作可能に連結するように配置し、上記のようにタンパク質オープンリーディング
フレームを含む発現単位を形成する。発現単位は、適当な宿主の形質転換または
トランスフェクションのために使用され、そして形質転換またはトランスフェク
ーションされた宿主は、組換えタンパク質の産生を許容する条件下で培養される
。場合により、組換えタンパク質は、媒体からまたは細胞から単離される。タン
パク質の回収および精製は、一部の不純物が許容できる場合には回収および精製
の必要はない。

【００３５】上記のそれぞれの段階は、種々の方法で行なうことができる。例えば、所望の
コーディング配列は、ゲノム断片から入手し、そして直接適当な宿主内に使用さ
れてもよい。種々の宿主内で操作可能な発現ベクターの構築は、上記のような適
当なレプリコンおよび制御配列を用いて行なわれる。制御配列、発現ベクター、
および形質転換またはトランスフェクションの方法は、遺伝子を発現するために
使用する宿主細胞のタイプに依存しそしてすでに詳細に考察した。適当な制限部
位は、正常では利用できない場合には、これらのベクター内に挿入する切除可能
な遺伝子を提供するようにコーディング配列の末端に付加される。熟練者は、組
換えタンパク質を産生するために、本発明の核酸分子を使用するための当該技術
分野で公知のいかなる宿主／発現系も容易に適用できる。遺伝子治療最も適する送達経路を用いる適当な遺伝子発現系と組み合わせるいかなる適当
な遺伝子送達系も、本発明に包含される。例えば、本発明のＮＯＳ変異体または
変種遺伝子、好ましくはｅＮＯＳまたはｎＮＯＳ変異体または変種遺伝子または
Ａｋｔ遺伝子は、コードするタンパク質の直接産生のために、生体外または生体
内で、心筋細胞（および骨格筋細胞）を含む心臓（または骨格筋）に導入しても
よい。特に有用には、ヒトＡｋｔ遺伝子および負に荷電したＲ基を有するアミノ
酸、例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸をヒトｅＮＯＳのセリン１１７７
に相当する位置に含むＮＯＳ変異体、好ましくはヒトｅＮＯＳである。ＮＯＳ変
異体または変種遺伝子の投与経路は、静脈内、筋肉内、腹膜内、皮内、および動
脈内注射を含み、これらに限定はされない。

【００３６】アデノウイルス遺伝子送達系は、種々の利点を提供する。アデノウイルスは、
（ｉ）比較的大型のＤＮＡ挿入物を収容し、（ｉｉ）高い力価(titer) に増殖し
、（ｉｉｉ）広範囲の哺乳類細胞形に感染し、そして（ｉｖ）種々のプロモータ
ーを含む多数の入手できるベクターと一緒に使用できる。また、アデノウイルス
は血流中で安定なので、これらは静脈内注射で投与できる。好ましい送達ベクタ
ーは、ヘルパー非依存性複製欠失ヒトアデノウイルス５であるが、しかし他の送
達手段も利用できそして、関係する細胞へ直接核酸の送達も含めて使用してもよ
い(Sawa et al.(1998) Gene Ther. 5(11): 1472-1480; Labhasetwar et al.(199
8) J. Pharm. Sci. 87(11)1347-50; Lin et al.(1997) Hypertension 30: 307-3
13; Chen et al.(1997) Circ. Res. 80(3):327-335;Channon et al.(1996) Card
iovasc. Res. 32:962-972; Harv Heart Lett. (1999) 9(8)5-6; およびNabel et
al.(1999) Nat. Med. 5(2):141-2 参照) 。

【００３７】アデノウイルス５系を用いて、６０％以上のトランスフェクション頻度が単回
冠動脈内注射による生体内の心筋細胞内で証明された(Giordano and Hammond (1
994) Clin. Res. 42:123A)。非−複製組換えアデノウイルスベクターは、冠動脈
内皮および心筋細胞にトランスフェクションする際に特に有用であり、冠動脈内
注射の後に高度に有効なトランスフェクションをもたらす。非−複製組換えアデ
ノウイルスベクターは、末梢血管系の所望の細胞にトランスフェクションするた
めにも有用である（引用することにより本明細書に全体を編入する米国特許(US)
第5,792,453 号参照）。

【００３８】本発明に使用されるアデノウイルスベクターは、Graham et al (1988) Virolo
gy 163:614-617に記載の救出(rescue)組換え技術により構築できる。要約すると
、ｅＮＯＳ導入遺伝子を、プロモーター、ポリリンカーおよびＥ１Ａ／Ｅ１Ｂ遺
伝子を除去された部分近接アデノウイルス配列を含むシャトルベクター内にクロ
ーニングする。シャトルベクターとして、ウイルス複製に必須であるＥ１Ａおよ
びＥ１Ｂ配列をコードする初期タンパク質を除いたヒトアデノウイルス５ゲノム
(Virology 163:614-617,1988) の左末端の部分をコードするプラスミドｐＡＣ１
(Virology 163:614-617,1988) （または類似体）、およびポリリンカー、ＣＭＶ
プロモーターおよびＥＡ／Ｅ１Ｂ遺伝子が欠失している部分アデノウイルス配列
により近接されているＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含むプラスミドＡＣＣ
ＭＶＰＬＰＡ(J. Biol. Chem. 267:25129-25134, 1992)が例として挙げられる。
プラスミドＰＡＣ１またはＡＣＣＭＶＰＬＡの使用は、クローニング操作を簡単
にする。次いで、シャトルベクターは、タンパク質膜固定には大きすぎる長さを
有する全ヒトアデノウイスル５ゲノムを含むプラスミドと一緒に２９３細胞中に
同時トランスフェクションされる。同時トランスフェクションは、リン酸カルシ
ウム沈降またはリポフェクションにより行なうことができる(Biotechnique 15:8
68-872, 1993) 。プラスミドＪＭ１７は、全ヒトアデノウイルス５ゲノムに加え
てアンピシリン耐性のための遺伝子を含むベクターｐＢＲ３２２の一部分（４．
３ｋｂ）をコードする。ＪＭ１７は成熟ウイルス粒子を作製するために必要なす
べてのアデノウイルスタンパク質をコードするけれども、タンパク質膜固定には
大きすぎる（４０ｋｂ、これに対して野生型は３６ｋｂ）。同時トランスフェク
ションされた細胞の小さい部分セット内で、シャトルベクターを含む導入遺伝子
、例えばプラスミドｐＡＣ１と、全アデノウイルスゲノムを有するプラスミド、
例えばプラスミドｐＪＭ１７との間の救出組換えは、Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂ配列内で欠
失し、そして関係する導入遺伝子は含むが、しかし追加の配列、例えばｐＢＲ３
２２配列を二次的に欠失している組換えゲノムを組み替えの間に提供し、これに
よりタンパク質膜固定に十分なほど小さくなる。ＣＭＶ駆動のアデノウイルスＨ
ＣＭＶＳＰ１ｌａｃＺをコードするβ−ガラクトシダーゼ(Clin. Res. 42:123A,
1994)は、Ｘ−ｇａｌ処理を用いる遺伝子導入の効率の評価に使用できる。

【００３９】他の態様では、ＮＯＳ、好ましくはｅＮＯＳまたはｎＮＯＳをコードする遺伝
子は、減衰または欠失ＤＮＡウイルス、例えば、これらの限定はされないが単純
ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、乳頭腫ウイルス、エプステインバーウイルス（Ｅ
ＢＶ）、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を介して生体内
に導入されてもよい。ウイルス遺伝子を全くまたはほとんど欠いている欠失ウイ
ルスが好ましい、欠失ウイルスは、細胞内に導入した後では感染性ではない。欠
失した重要なベクターの使用は、特定の極限した領域内の細胞に、ベクターが他
の細胞に感染できるという懸念なしに投与できる。従って、例えば脳または脊髄
内の特定の座をベクターを用いて特異的に標的とすることができる。特定の態様
では、欠失ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）ベクターを使用してもよい(Kaplitt
et al.(1991) Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330) 。さらに別の態様では、ウ
イルスベクターは、弱毒アデノウイルス、例えばStratford-Perricaudet et al(
J. Clin. Invest. 90:626-630, (1992))により記載されたベクターである。さら
に別の態様では、ベクターは欠失アデノ随伴ウイルスベクターである(Samulski
et al.(1987) J. Virol. 61: 3096-3101;Samulski et al.(1989) J. Virol. 63:
3822-3828) 。

【００４０】本発明は、例えば冠動脈または大腿動脈内への導入遺伝子の送達による細胞標
的の使用だけでなく、組織特異性プロモーターの使用も意図する。例えば、左心
室心筋軽鎖−２（ＭＬＣ〔２Ｖ〕）またはミオシン重鎖（ＭＨＣ）の組織特異性
転写制御配列の、導入遺伝子、例えばアデノウイルス構築物内の本発明のＮＯＳ
遺伝子への融合により、導入遺伝子発現は、心室心筋細胞内に限定される。ｌａ
ｃＺを用いてＭＬＣ〔２Ｖ〕またはＭＨＣプロモーターにより提供される遺伝子
発現の効力および特異性の程度を本発明の組換えアデノウイルス系を用いて測定
した。心臓特異性発現は、以前にLee et al.(J. Biol. Chem. 267:15875-15885(
1992))により報告されている。ＭＬＣ〔２Ｖ〕プロモーターは２５０ｂｐを含ん
でなり、そしてアデノウイルス−５パッケージング拘束内に容易に適合する。転
写の強力なプロモーターとして知られるミオシン重鎖プロモーターは、適度な代
替心臓特異性プロモーターを提供し、そして３００ｂｐ以下を含んでなる。平滑
筋細胞プロモーター、例えばＳＭ２２アルファープロモーター(Kemp et al.(199
5) Biochem. J. 310(Pt3):1037-43)およびＳＭアルファーアクチンプロモーター
(Shimizu et al.(1995) J. Biol. Chem. 270(13):7631-43) も利用できる。その
他のプロモーター、例えばトロポニン−Ｃプロモーターは、効力が高くそして十
分に小さいけれども、適当な組織特異性を欠く。ＭＬＣ〔２Ｖ〕またはＭＨＣプ
ロモーターを使用し、そして導入遺伝子を生体内で送達することにより、心筋細
胞のみ（すなわち心臓内の内皮細胞、平滑筋細胞、そして繊維芽細胞内の平行発
現がない）にＮＯＳタンパク質の適当な発現をもたらすと信じられる。

【００４１】心筋細胞への限定された発現も、臨床心筋虚血の処置における遺伝子導入の利
用に関して利点を有する。心臓への発現を制限することにより、心筋以外の組織
、例えば網膜において考えられる血管新生の有害な作用が避けられる。心臓内の
細胞に加えて、筋細胞は、最も長い導入遺伝子発現を与えると思われるが、それ
は細胞が急速な交替(turnover)を受けないからである。従って、内皮細胞で起き
るように発現は細胞分裂および死亡により低下しない。内皮特異性プロモーター
は、すでにこの目的で利用できる。内皮特異性プロモーターの例には、Ｔｉｅ−
２プロモーター(Schlaeger et al.(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 1:94(7):305
8-63) 。内皮プロモーター(Lee et al.(1990) J. Biol. Chem. 265:10446-10450
、およびｅＮＯＳプロモーター(Zhang et al.(1995) J. Biol. Chem. 270(25):1
5320-6) が含まれる。

【００４２】本発明は、心臓疾患に関して、ベクターの高い力価を用いる動脈内または筋肉
内注射による心臓の標的治療を含み、そしてすべてのタイプの細胞のトランスフ
ェクションが現在では好ましい。心筋梗塞、心筋虚血、心不全、再狭窄、ステン
ト狭窄症、血管形成術後の狭窄症、および人工副行路不全を含む勃起不全および
冠動脈疾患のような疾患は、ＮＯＳ導入遺伝子、好ましくはｅＮＯＳまたはｎＮ
ＯＳ導入遺伝子を用いて上記のように治療してもよい。

【００４３】成功する組換えベクターは、標準法に従ってプラーク精製できる。得られたウ
イルスベクターを２９３細胞に移行させ、これらは、好ましくは約１０¹⁰〜約１
０¹²ウイルス粒子／ｍｌの範囲内の力価のトランス型(in trans)のＥ１Ａおよび
Ｅ１Ｂ機能を与える。細胞は８０％集密で感染できそして４８時間後に採取した
。３回の冷凍−解糖サイクルの後、細胞片を遠心分離のよりペレット化しそして
ウイルスをＣｓＣｌ勾配超遠心分離（二重ＣｓＣｌ勾配超遠心分離が好ましい）
により精製する。生体内注射の前に、ウイルスストックをセファロース(Sepharo
se) カラム、例えばＧ２５セファデックス(Sephadex)を通してゲル濾過により脱
塩する。次いで産生物を３０μｍフィルターを通して濾過し、これにより未濾過
ウイルスの冠動脈内注射の有害な作用（生命に危険な不整脈）を低下させ、そし
て効率的な遺伝子導入を推進する。得られたウイルスストックは、１０¹⁰〜１０ ¹² ウイルス粒子／ｍｌの範囲内の最終ウイルス力価を有する。組換えアデノウイ
ルスは、野生型（複製可能）を含まないように高度に精製しなければならない。
不純な構築物は、宿主動物内に強い免疫反応を起こすことがある。この観点から
、移行および精製は、汚染および野生型ウイルスを、例えば適当なプライマーを
用いるＰＣＲによる成功した組換えで同定、プラーク精製２ラウンド実施、およ
び二重ＣｓＣｌ勾配超遠心分離により排除して行なってもよい。さらに、患者内
に注射したアデノウイルスベクターにより誘発される不整脈に関連する問題は、
動脈内注射の前の適当な大きさのフィルターを通す組換えアデノウイルスの濾過
により避けることができる。この戦略は、遺伝子導入および発現を本質的に改善
するとも考えられる。

【００４４】ウイルスストックは、薬剤的に許容できるキャリヤー、例えば生理食塩水を必
要に応じて含む注射用調剤の形であることができる。注射用調剤中のベクターの
最終力価は、好ましくは有効な遺伝子導入を許容する約１０⁷〜約１０¹³ウイル
ス粒子の範囲内である。その他の薬剤キャリヤー、配合および投与量は、以下に
記載する。アデノウイルス導入遺伝子構築物は、Ｘ線透視のガイダンスに従う方
法に基づく標準経皮カテーテルを用いる直接冠動脈（または移植血管）内注射に
より、高度に有効な治療をする程度に導入遺伝子を発現させるために十分な量を
心筋に投与する。注射は、冠動脈（または移植血管）の管腔（動脈管腔内約１ｃ
ｍ）内に深く行なってもよく、そして好ましくは両方の冠動脈内に行い、これは
平行する血管の成長は、個別の患者内で大幅に変動するからである。冠動脈カテ
ーテルにより冠動脈の管腔内に物質を直接注射することにより、かなり有効に遺
伝子を標的に送り、そして注射の間の隣接大動脈への組換えベクターの損失を最
小化できる。この方法で送達した場合の遺伝子発現は、肝細胞内では起こらず、
そしてウイルスＲＮＡは冠動脈注射の後のいかなる時点でも尿中に見い出すこと
ができないことが知られている。種々の冠動脈カテーテル、すなわち例えばスタ
ック(Stack) 灌流カテーテルが本発明に使用できる。さらに、当該技術分野の通
常の熟練者に公知のその他の技術が、ＮＯＳ遺伝子、好ましくはｅＮＯＳまたは
ｎＮＯＳの動脈壁への導入のために使用できる。

【００４５】末梢血管疾患、すなわち脚への不十分な血液供給を特徴とする疾患の治療のた
めに、本発明のＮＯＳ、好ましくはｅＮＯＳまたはｎＮＯＳ、ペプチドまたはタ
ンパク質を発現する組換えアデノウイルスが、１本または複数本の大腿動脈の近
接部分内に挿入されたカテーテルにより送達されてもよく、これにより大腿動脈
からの血流を受ける骨格筋の細胞内に遺伝子導入を行なう。

【００４６】本発明のＮＯＳ、好ましくはｅＮＯＳまたはｎＮＯＳ、またはＡｋｔタンパク
質をコードする導入遺伝子または核酸が、患者自身の細胞を含み、生体外の内皮
または血管平滑筋細胞に最初に導入される場合に、ＤＮＡは細胞内にトランスフ
ェクションされてもよい（米国特許(US)第5,658,565 号参照）。一般に、トラン
スフェクションされた標的細胞、本発明のＡｋｔまたはＮＯＳをコードするＤＮ
Ａ配列を含んでなるプラスミドベクターまたはこれらの生物学的に活性な断片は
、標的細胞のリポソーム−媒介トランスフェクションに使用されてもよい。リポ
ソームの安定性は、これらのベシクルの不透過性と一緒になって、これらを治療
用ＤＮＡ配列の送達のための有用なビヒクルとしている（総説として、Mannino
and Gould-Forgerite(1988)BioTechniques 6(7):682-690 参照）。リポソームは
、融合により多くの細胞タイプにより吸収されることが知られている。一つの態
様では、カチオン性コレステロール誘導体、例えばＳＦ−ｃｈｏｌまたはＤＣ−
ｃｈｏｌを含むカチオン性リポソームを使用してもよい。ＤＣ−ｃｈｏｌ分子は
、第三級アミノ基、中位の長さのスペーサーアームおよびカルバモイル・リンカ
ー結合を含み、これはGao and Huang(Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:280-2
85,1991)に記載されている。

【００４７】リポソーム技術の使用に関する他の態様では、生物学的に活性なＮＯＳタンパ
ク質断片、好ましくはｅＮＯＳまたはｎＮＯＳタンパク質断片をコードするＤＮ
Ａ配列を含んでなるウイルスまたは非ウイルスに基づくベクターが、リポフェク
タミン(lipofectamine, Bethesda Research Laboratory) を用いる標的細胞のト
ランスフェクションにより標的細胞に送達される。リポフェクタミンは、ポリカ
チオン性脂質２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−〔２（スペルミンカルボキシミド
(sperminecarboxymido) ）エチル〕−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウム
トリック(propanaminiumtric) ・フルオロアセタート（ＤＯＰＳＡ）と中性脂質
ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の３：１リポソー
ム配合物である。

【００４８】その他の遺伝子送達の非ウイルスモードは、下記を含むがこれらの限定される
ものではない：（ａ）裸のＤＮＡ直接注射、（ｂ）リン酸カルシウム〔Ｃａ₃（
ＰＯ₄）₂〕媒介細胞トランスフェクション、（ｃ）エレクトロポレーションに
よる哺乳類宿主細胞トランスフェクション、（ｄ）ＤＥＡＥ−デキストラン媒介
細胞トランスフェクション、（ｅ）ポリブレン(polybrene) 媒介送達、（ｆ）プ
ロトプラスト融合、（ｇ）ミクロ注入、および（ｈ）哺乳類宿主に復帰導入され
た遺伝子操作細胞を用いるポリリシン媒介形質転換。形質転換動物の生産本明細書中に記載の変異ＮＯＳ遺伝子、好ましくは変異ｅＮＯＳまたはｎＮＯ
Ｓ遺伝子を含む形質転換動物も本発明内に含まれる。形質転換動物は、組換え、
外来またはクローニングした遺伝物質が実験的に導入された遺伝子変性動物であ
る。このような遺伝物質は、しばしば「導入遺伝子」と呼ばれる。導入遺伝子の
核酸配列、この場合にはＮＯＳの形のものは、特定の核酸配列がさもなければ正
常では発見されないゲノムの座においてまたは導入遺伝子の正常な座のいずれか
において組み込まれてもよい。導入遺伝子は、同じ種のゲノムから誘導された核
酸配列または標的動物の種とは異なる種から成ってもよい。

【００４９】用語「生殖細胞系形質転換動物」は、遺伝改変または遺伝情報が生殖細胞系内
に導入され、これにより子孫に遺伝情報を導入する形質転換動物の能力を与えら
れた形質転換動物を呼ぶ。このような子孫が実際にこの改変または遺伝情報の一
部またはすべてを有する場合には、これらも形質転換動物である。

【００５０】改変または遺伝情報は、レシピエントが属する動物の種にとって外来であるか
、特定の個体レシピエントにとってのみ外来であってもよく、またはレシピエン
トによりすでに所有されている遺伝情報であってもよい。最後の場合には、改変
または導入された遺伝子は、生来の遺伝子とは異なって発現されてもよい。

【００５１】形質転換動物は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、ミクロ注
入、胚幹細胞内への遺伝子標的法、および組換えウイルスおよびレトロウイルス
感染を含む種々の異なる方法で生産できる（例えば米国特許(US)第4,736,866 号
、米国特許(US)第5,602,307 号、Mullins et al.(1993) Hypertension 22(4):63
0-633 、Brenin et al.(1997) Surg. Oncol. 6(2)99-110 、Tuan(ed.), Recombi
nant Gene Expression Protocols, Methods In Molecular Biology No.62, Huma
na Press(1997)参照）。

【００５２】多数の組換えまたは形質転換マウスが生産され、これには活性化腫瘍遺伝子配
列の発現（米国特許(US)第4,736,866 号）、サルＳＶ−４０Ｔ抗原の発現（米国
特許(US)第5,728,915 号）、インターフェロン制御因子１（ＩＲＦ−１）の発現
欠失（米国特許(US)第5,731,490 号）、ドーパミン作動不全を示す（米国特許(U
S)第5,723,719 号）、血圧制御に関与する少なくとも１種のヒト遺伝子の発現（
米国特許(US)第5,731,489 号）、本態的に発生するアルツハイマー病に存在する
状態への大きい類似性を示す（米国特許(US)第5,720,936 号）、細胞付着を媒介
する能力低下を有する（米国特許(US)第5,602,307 号）、ウシ成長ホルモン遺伝
子を有する(Clutter et al.(1996) Genetics 143(4):1753-1760)、または、完全
なヒト抗体反応を発生する能力を有する(McCarthy(1997) The Lancet 349(9049)
:405) ものを含む。

【００５３】マウスおよびラットが多くの遺伝子導入実験のために選択される動物であるけ
れども、ある例では別の動物種の使用が好ましいかまたは必要でもある。遺伝子
導入操作は、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、ハムスタ
ー、ラビット、ウシおよびモルモットを含む、種々のネズミ属以外の動物にも用
いられて成功している（例えばKim et al.(1997) Mol. Reprod. Dev. 46(4):515
-526; Houdebine(1995) Reprod. Nutr. Dev. 35(6):609-617; Petters(1994) Re
prod. Futil. Dev. 6(5):643-645; Schnieke et al.(1997) Science 278(5346):
2130-2133;およびAmoah(1997) J. Animal Science 75(2):578-585 参照）。

【００５４】組換えした有用な哺乳類細胞内への核酸断片の導入の方法は、複数の核酸分子
の同時トランスフェクションに有利なあらゆる方法であることができる。形質転
換動物生産のための詳細な操作法は、当該技術業界の熟練者には容易に入手でき
、これには米国特許(US)第5,489,743 号および米国特許(US)第5,602,307 号の開
示が含まれる。さらに、ＮＯＳ形質転換動物の生産は、十分に開発されている。
例えば、野生型ｅＮＯＳを誘導的に発現または過剰発現する遺伝子導入マウスが
生産されている（Ohashi et al.(1998) J. Clin. Invest. 102(12):2061-71; お
よびDrummond et al.(1998) J. Clin. Invest. 102(12):2033-4;参照）。これら
の方法を本発明のＮＯＳ変異体を発現する形質転換マウスを生産するために使用
してもよい。治療スクリーニングアッセイｅＮＯＳのリン酸化がその活性を制御するという発見は、Ａｋｔ制御されたＮ
ＯＳ、好ましくはｅＮＯＳまたはｎＮＯＳの活性または発現を調節する薬剤を同
定するためのスクリーニングアッセイの開発を可能とした。生体内形質転換動物
アッセイ、生体外のタンパク質に基づくアッセイ、細胞培養アッセイおよび高収
量フォーマットを含むあらゆる利用できるフォーマットを使用してもよい。

【００５５】化合物のライブラリーを試験する多くの薬剤スクリーニングプログラムで、与
えられた時間内で試験する化合物の数を最大化するためには、高収量アッセイが
望ましい。細胞を用いない系で行なわれるアッセイ、例えば精製または半精製タ
ンパク質を用いて誘導されるものは、しばしば「一次」スクリーニングと呼ばれ
、これではこれらが迅速な増殖を可能としそして供試化合物により媒介される分
子標的内での改変の比較的容易な検出を行なうことが可能であるからである。さ
らに、供試化合物の細胞毒性および／または生物利用可能性の影響は、一般に生
体外系では無視でき、その代わりにアッセイは、例えば分子間の結合の阻害に現
れるような分子標的に対する薬剤の作用に最も焦点が当てられる。

【００５６】細胞および組織培養に基づくアッセイは、例えば、ＣＯＳ−７細胞をプレーテ
ィングし（１００ｍｍ皿）そしてＮＯＳ（７．５〜３０ｍｇ）およびＡｋｔ（１
ｍｇ）プラスミドをリン酸カルシウムを用いてトランスフェクションして行なっ
てもよい。すべてのトランスフェクションをバランスするために、β−ガラクト
シダーゼｃＤＮＡに対する発現ベクターを同時トランスフェクションしてもよい
。トランスフェクションの２４〜４８時間後に、適当なタンパク質の発現（４０
〜８０ｍｇ）を、ｅＮＯＳｍＡｂ（９Ｄ１０、Zymed ）、ＨＡｍＡｂ（１２
ＣＡ５、Boehringer Mannheim ）、ｉＮＯＳｐＡｂ（Zymed Laboratories）ま
たはｎＮＯＳｍＡｂ（Zymed Laboratories）を用いるウエスタンブロット分析
により確認してもよい。

【００５７】トランスフェクションの２４〜４８時間後に、水溶液中の亜硝酸イオン（ＮＯ ₂ ^- ）、すなわちＮＯの安定な分解産生物を記載(Sessa et al.(1995))に従って
ＮＯ特異性化学発光法により測定するために、培地を処理してもよい。培地を脱
プロトンし、そしてＮＯ₂ ^-を含む試料をヨウ化ナトリウムを含む氷酢酸中で還
流する。これらの条件下で、ＮＯ₂ ^-は定量的にＮＯに還元され、これはＮＯ分
析器内でオゾンとの反応の後に化学発光検出器により定量される(Sievers, Boul
ders, CO) 。すべての実験で、ＮＯＳ阻害剤を用いてＮＯ₂ ^-放出を阻害して対
照を調製してもよい。さらに、β−ガラクトシダーゼｃＤＮＡを用いてトランス
フェクションした細胞からのＮＯ₂ ^-放出を、血清または培地内に見いだされる
ＮＯ₂ ^-の背景レベルのための対照として差し引いてもよい。ＣＯＳ内のｃＧＭ
Ｐ蓄積は、記載に従ってＮＯの産生に対する生物アッセイとして使用してもよい
。別のフォーマットでは、³Ｈ−Ｌ−アルギニンの³Ｈ−Ｌ−シトルリンへの変
換を、従来の記載(Garcia-Cardena et al., 1998) に従って、ＣＯＳ細胞または
内皮細胞溶解物中のＮＯＳ活性測定のために使用してもよい。

【００５８】生体内リン酸化試験のために、野生型またはＳ６３５（対照）、ウシ１１７９
Ａ、ＤまたはＥｅＮＯＳ、ヒト１１７７ＤまたはＥｅＮＯＳ、ラット１４１
２ＤまたはＥｎＮＯＳ、ヒト１４１５ＤまたはＥｎＮＯＳおよびＨＡ−Ａｋ
ｔに対するｃＤＮＡを用いて、一晩、ＣＯＳ細胞にトランスフェクションしても
よい。トランスフェクションの３６時間後に、細胞を透析した血清レプリート(r
eplete) 、³²Ｐオルトリン酸の８０μＣｉ／ｍｌを補足したリン酸を含まないダ
ルベッコの最少必須培地中に３時間置く。細胞試料をウオートマンニン(wortman
nnin)(500nM)を用いてリン酸を含まない培地内で１時間および標識付けの間前処
理してもよい。次いで溶解物を採取し、ＮＯＳを溶解させそしてＡＤＰセファロ
ースアフィニティークロマトグラフィーにより上記のようにして部分的に精製し
、そしてＮＯＳ内への³²Ｐ組込みをオートラジオグラフィーによるＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ（７．５％）により可視化し、そしてＮＯＳタンパク質の量をＮＯＳに対す
るウエスタンブロッティングにより確認した。

【００５９】生体外リン酸化試験のために、大腸菌から精製した組換えＮＯＳ、他の起源か
ら精製したｅＮＯＳ、またはＡｋｔリン酸化部位に位置するＮＯＳペプチドを、
トランスフェクションしたＣＯＳ細胞から免疫沈降した野生型またはキナーゼ不
活性Ａｋｔと一緒にインキュベーションする。要約すると、ＮＯＳタンパク質ま
たはペプチドを、ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）、ＭｎＣｌ₂（１０ｍ
Ｍ）、ＭｇＣｌ₂（１０ｍＭ）および免疫沈降したＡｋｔを含む緩衝液中の³²Ｐ
ｇ−ＡＴＰ（２ｍｌ、比放射能３０００Ｃｉ／ミリモル）、ＡＴＰ（５０ｍＭ）
、ＤＴＴ（１ｍＭ）と一緒に、２０分間、室温でインキュベーションする。

【００６０】野生型および変異ＮＯＳの生体外リン酸化を試験する実験において、バキュロ
ウイルス感染したＳＦ９細胞から精製した組換えＡｋｔ（１ｍｇ）を、野生型、
Ｓ１１７９ＡウシｅＮＯＳ、Ｓ１１７７ＡヒトｅＮＯＳ、Ｓ１１７９ＤまたはＥ
ウシｅＮＯＳ、Ｓ１１７７ＤまたはＥヒトｅＮＯＳ、Ｓ１４１２ＤまたはＥラッ
トｎＮＯＳ、またはＳ１４１５ＤまたはＥヒトｎＮＯＳと一緒に、本質的に上記
と同じ条件を用いてインキュベーションする。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに
より溶解してもよくそして³²Ｐ組込みおよびタンパク質の量を上記のようにクー
マシー染色により測定する。

【００６１】ＮＯＳ、好ましくはｅＮＯＳまたはｎＮＯＳのＡｋｔ依存性リン酸化または活
性化をアッセイする上記のスクリーニングアッセイを、広範囲の種々の薬剤に対
するスクリーニングに使用してもよい。例えば、ウシｅＮＯＳ中のセリン１１７
９、ヒトｅＮＯＳ中の残基１１７７、ラットｎＮＯＳ中の残基１４１２、または
ヒトｎＮＯＳ中の１４１５に相当するアミノ酸におけるＮＯＳの脱リン酸化を阻
害する薬剤（ホスファターゼ阻害剤）は、治療用分子として有用であろう。同様
に、Ａｋｔを活性化させるかまたはｅＮＯＳにおけるＡｋｔリン酸化部位に類似
する薬剤は、治療用分子として有用であろう。

【００６２】上記の方法でアッセイされる薬剤は、ランダムに選択または理論的に選択また
は設計してもよい。本明細書中に使用する場合に、薬剤(agent) は、薬剤が本発
明のタンパク質単独ろ関連またはその関連する基質、結合相手などに含まれる特
定の配列を考慮しないでランダムに選定される場合に、ランダムに選択されたと
いう。ランダムに選択された薬剤の一例は、化学ライブラリーまたはペプチド結
合ライブラリー、または生物体の培養ブロスの使用である。

【００６３】本明細書中に使用する場合に、薬剤は、薬剤の作用に関連して標的に配列およ
び／またはその配置を考慮して非ランダムに薬剤が選択される場合に、合理的に
選択または設計されたという。例えば、合理的に選択されたペプチド薬剤は、そ
のアミノ酸配列がＮＯＳ、特にはＮＯＳリン酸化状態に類似するペプチドまたは
小分子中のＡｋｔリン酸化部位に類似するペプチドであることができる。

【００６４】本発明の薬剤は、例えばペプチド、小分子、ビタミン誘導体、ならびに炭水化
物であることができる。熟練者は、本発明の薬剤の構造的性質に関して限界がな
いことを容易に認めることができる。

【００６５】本発明のペプチド薬剤は、当該技術分野では公知の標準の固相（または液相）
ペプチド合成法を用いて調製できる。さらに、これらのペプチドをコードするＤ
ＮＡは、商業的に入手できるオリゴヌクレオチド合成装置を用いて合成してもよ
く、そして標準の組換え生産系を用いる組換えにより生産してもよい。固相ペプ
チド合成を用いる生産は、非遺伝子コードされたアミノ酸が含まれる場合には必
要である。

【００６６】本発明の別の種類の薬剤は、本発明のタンパク質の重要な位置と免疫反応性の
抗体である。抗体薬剤は、抗原領域として含まれるペプチドを用いる適当な哺乳
類対象の免疫化により得られ、これらのタンパク質の部分は、抗体により標的と
するように意図する。ｅＮＯＳ活性を調節するとして同定された薬剤の使用本発明の薬剤、例えばウシｅＮＯＳ中のセリン１１７９、ヒトｅＮＯＳ中の残
基１１７７、ラットｎＮＯＳ中の残基１４１２、またはヒトｎＮＯＳ中の残基１
４１５に相当するアミノ酸においてＮＯＳの脱リン酸化を阻害する薬剤（ホスフ
ァターゼ阻害剤）として、ならびにＡｋｔを活性化するかまたはＮＯＳ上のＡｋ
ｔリン酸化部位に類似する薬剤は、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹膜内、経
皮、または口内経路を介して投与できる。あるいは、または平行して、経口経路
により投与してもよい。投与される用量は、レシピエントの年齢、健康および体
重、存在する場合には、同時に行なう治療の種類、治療の頻度、および希望する
作用の性質に依存する。以下に記載するように、このような薬剤を投与するため
に容易に適合できる多くの方法がある。

【００６７】本発明は、さらに本発明の１種またはそれ以上の薬剤を含む組成物も提供する
。個々に要求は異なるが、それぞれの成分の有効量の最適範囲の決定は、当該分
野の技術内である。代表的な用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）を含ん
でなる。好ましい用量は、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）を含んでなる。最も
好ましい用量は、０．１〜１ｍｇ／ｋｇ（体重）を含んでなる。

【００６８】薬学的な有効成分に加えて、本発明の組成物は、作用場所への送達のために薬
剤的に使用できる調剤への活性化合物の加工を容易にする賦形剤および助剤を含
んでなる適当な薬剤的に許容できるキャリヤーを含んでもよい。非経口投与のた
めに適する配合は、水溶性の形の活性化合物、例えば水溶性塩の水溶液を含む。
さらに、適当な油性注射用懸濁液としての活性化合物の懸濁液を投与してもよい
。適当な親油性溶剤またはビヒクルは、脂肪油、例えばゴマ油、または合成脂肪
酸エステル、例えばオレイン酸エチルまたはトリグリセリドを含む。水性注射用
懸濁液は、懸濁液の粘度を上昇する物質、例えばカルボキシメチルセルロースナ
トリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含んでもよい。場合に
より懸濁液は安定剤を含んでもよい。リポソームも細胞内への送達のための薬剤
をカプセル化するために使用できる。

【００６９】本発明による全身投与のための薬剤配合は、経口、非経口または局所投与のた
めに配合してもよい。実際に、すべて３種類の配合形式は、有効成分の全身投与
を達成するために同時に使用してもよい。

【００７０】経口投与のために適する配合は、これらの硬質または軟質ゼラチンカプセル、
ピル、被覆錠剤を含む錠剤、エリキシル剤、懸濁液剤、シロップ剤または吸入剤
および制御放出形を含む。

【００７１】本発明の方法を実施する際に、本発明の化合物は、単独または組み合わせ、ま
たは他の治療または診断要薬剤と組み合わせて使用してもよい。一部の好ましい
態様では、本発明の化合物は、一般的に受容されている医学治療に従うこれらの
状態に対して標準的に処方される他の化合物、例えば抗凝固剤、血栓溶解剤、ま
たは血小板凝固阻害剤を含む抗血栓剤、組織プラスミノゲン活性化剤、ウロキナ
ーゼ、プロウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヘパリン、アスピリン、または
ワルファリンと一緒に投与してもよい。本発明の化合物は、生体内、通常は哺乳
類、例えばヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ラットおよびマウス
に、または生体外で使用できる。

【００７２】下記の実施例は、本発明の好ましい態様を特定して指摘するものであり、そし
て本開示の残部をいかなる方法でも制限するように解釈してはならない。他の包
括的な形態も当該分野の熟練者には明らかであろう。

【００７３】実施例下記の操作を実施例１〜２で使用する。

【００７４】細胞トランスフェクション：ウシｅＮＯＳ、ヒトｉＮＯＳ、ｐｃＤＮＡ３中の
ラットｎＮＯＳｃＤＮＡ、およびＨＡタグ付けした野生型Ａｋｔ、Ａｋｔ（Ｋ
１７９Ｍ）またはｐＣＭＶ６中のｍｙｒ−Ａｋｔを標準クローニング法により作
製した。ｐｃＤＮＡ３中のｍｙｒ−ｎＮＯＳは、ＰＣＲにより、ｎＮＯＳコーデ
ィング配列の第二アミノ酸にインフレームで融合したｅＮＯＳＮ−ミリストイ
ル化共通部位（ＭＧＮＬＫＳＶＧ、配列番号１）を含む新しいアミノ末端を組込
んで作製した。ＣＯＳ細胞内の予備実験で、この構築物は、³Ｈ−ミリスチン酸
の組込みによりＮ−ミリストイル化されており、一方、生来のｎＮＯＳはそうで
はなく、タンパク質の約６０％は、細胞の膜画分内に標的とされ、一方ｎＮＯＳ
の５〜１０％だけがＣＯＳ細胞と関連する膜であった。ｅＮＯＳ内の推定Ａｋｔ
リン酸化部位の突然変異が、クイック・チェンジ(Quick Change)部位指定突然変
異誘発キット(Stratagene)を用い、製造者の指定に従って発生した。すべての変
異体をＤＮＡ配列決定により確認した。ＣＯＳ−７細胞をプレーティングし（１
００ｍｍ皿）、そしてリン酸カルシウムを用いてＮＯＳ（７．５〜３０ｍｇ）お
よびＡｋｔ（１ｍｇ）プラスミドを用いてトランスフェクションした。すべての
トランスフェクションをバランスするために、β−ガラクトシダーゼｃＤＮＡに
対する発現ベクターを使用した。トランスフェクションの２４〜４８時間後に、
適当なタンパク質の発現（４０〜８０ｍｇ）が、ｅＮＯＳｍＡｂ（９Ｄ１０、
Zymed ）、ＨＡｍＡｂ（１２ＣＡ５、Boehringer Mannheim ）、ｉＮＯＳｐ
Ａｂ（Zymed Laboratories）またはｎＮＯＳｍＡｂ（Zymed Laboratories）を
用いるウエスタンブロット分析により確認された。

【００７５】トランスフェクションされたＣＯＳ細胞からのＮＯ放出：トランスフェクショ
ンの２４〜４８時間後に、水溶液中の亜硝酸イオン（ＮＯ₂ ^-）、すなわち安定
なＮＯの分解産生物を記載(Sessa et al.(1995))に従ってＮＯ特異性化学発光法
により測定するために、培地を処理した。培地を脱プロトンし、そしてＮＯ₂ ^- を含む試料を、ヨウ化ナトリウムを含む氷酢酸中で還流した。この条件下で、Ｎ
Ｏ₂ ^-は定量的にＮＯに還元され、これはＮＯ分析器内でオゾンとの反応の後に
化学発光検出器により定量された(Siever, Boulders, CO)。すべての実験で、Ｎ
ＯＳ阻害剤によりＮＯ₂ ^-放出剤が阻害された。さらに、β−ガラクトシダーゼ
ｃＤＮＡを用いてトランスフェクションされた細胞からのＮＯ₂ ^-放出を、血清
または培地内に見いだされるＮＯ₂ ^-の背景レベルのための対照として差し引い
た。一部の実験では、ＣＯＳ内のｃＧＭＰ蓄積を記載に従ってＮＯの産生に対す
る生物アッセイとして使用した。

【００７６】ＮＯＳ活性アッセイ：³Ｈ−Ｌ−アルギニンの³Ｈ−Ｌ−シトルリンへの変換
を、従来の記載(Garcia-Cardena et al., 1998) に従って、ＣＯＳ細胞または内
皮細胞溶解物中のＮＯＳ測定に使用した。

【００７７】生体内および生体外におけるリン酸化試験：生体内リン酸化試験のために、野
生型またはＳ６３５、１１７９ＡｅＮＯＳおよびＨＡ−Ａｋｔに対するｃＤＮ
Ａを用いて、一晩、ＣＯＳ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクシ
ョンの３６時間後に、細胞を透析した血清レプリート、³²Ｐオルトリン酸の８０
μＣｉ／ｍｌを補足したリン酸を含まないダルベッコの最少必須培地中に３時間
置いた。一部の細胞をウオートマンニン（５００ｎＭ）を用いてリン酸を含まな
い培地内で１時間および標識付けの間前処理した。次いで溶解物を採取し、ｅＮ
ＯＳを可溶性化させそして部分的にＡＤＰセファロースアフィニティークロマト
グラフィーにより上記のようにして精製し、そしてｅＮＯＳ内への³²Ｐ組込みを
オートラジオグラフィーによりＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５％）により可視化し、
そしてｅＮＯＳタンパク質の量をｅＮＯＳに対するウエスタンブロッティングに
より確認した。生体外リン酸化試験のために、大腸菌から精製した組換えｅＮＯ
Ｓを、トランスフェクションしたＣＯＳ細胞から免疫沈降した野生型またはキナ
ーゼ不活性Ａｋｔと一緒にインキュベーションした。ｅＮＯＳを、ＨＥＰＥＳ（
２０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）、ＭｎＣｌ₂（１０ｍＭ）、ＭｇＣｌ₂（１０ｍＭ）
および免疫沈降したＡｋｔを含む緩衝液中の³²Ｐｇ−ＡＴＰ（２ｍｌ、比放射能
３０００Ｃｉ／ミリモル）、ＡＴＰ（５０ｍＭ）、ＤＴＴ（１ｍＭ）と一緒に、
２０分間、室温でインキュベーションした。

【００７８】野生型および変異ｅＮＯＳの生体外リン酸化を試験する実験では、バキュロウ
イルス感染したＳＦ９細胞から精製した組換えＡｋｔ（１ｍｇ）を、野生型また
はＳ１１７９ＡｅＮＯＳ（２．４ｍｇ、大腸菌から精製）と一緒に、本質的に
上記と同じ条件を用いてインキュベーションした。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにより溶解しそして³²Ｐ組込みおよびタンパク質の量を上記のようにクーマシ
ー染色により測定した。

【００７９】標識したｅＮＯＳペプチドを同定する試験では、免疫沈降したＡｋｔを上記の
ようにして組換えｅＮＯＳと一緒にインキュベーションした。試料をＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで処理し、そしてｅＮＯＳバンドをゲル内で消化し、そして得られたトリ
プシン作用断片をＲＰ−ＨＥＬＣにより精製した。ペプチド質量および³²Ｐ組込
みを測定し、そして明瞭な標識ピークをさらに質量分析により分析した。他の実
験では、考えられるＡｋｔリン酸化部位に相当するペプチドを合成し、ＨＰＬＣ
で精製しそして質量分析で確認した(W.M. Keck Biotechnology Resource Center
, Yale University,School of Medicine) 。野生型ペプチドは、１１７４ＲＩＲ
ＴＱＳＦＳＬＱＥＲＨＬＲＧＡＶＰＷＡ１１９４（配列番号２）であり、そして
変異ペプチドは、Ｓ１１７９がアラニンに変化した以外は一致していた。生体外
キナーゼ反応物では、組換えＡｋｔ（１ｍｇ）を用いてインキュベーションした
上記のペプチド（２５ｍｇ）の記載と本質的に同様であった。次いで、反応物を
ホスホセルロースフィルター上にスポットし、そして組み込まれたリン酸の量を
チェレンコフ計数により測定した。

【００８０】内皮細胞内のアデノウイルス感染およびＮＯ放出：ウシ肺毛細血管内皮細胞（
ＢＬＭＶＥＣ）を１００ｍｍ皿内（基礎ＮＯ放出およびＮＯＳ活性アッセイのた
め）およびＣ６ウエルプレート内（刺激されたＮＯのため）のいずれかで、従来
の記載(Garcia-Cardena et al., 1996a)に従って培養した。β−ガラクトシダー
ゼ２９、ＨＡ−タグ付けした不活性リン酸化変異Ａｋｔ（ＡＡ−Ａｋｔ；Alessi
et al., 1996)またはカルボキシ末端でＨＡ−タグ付けした構成性活性Ａｋｔ（
ｍｙｒ−ａＫＴ）を含むアデノウイルスの２００ＭＯＩを用いて、ＢＬＭＶＥＣ
を４時間感染させた。ウイルスを取り除き、そして細胞を回復のために１８時間
、完全培地内で放置した。β−ガラクトシダーゼウイルスを用いた予備実験で、
これらの条件は培地の１００％感染に最適であった。基礎ＮＯ産生を測定するた
めに、ウイルスを用いた最初の感染の２４時間後にＮＯ放出のために培地を集め
た。刺激されたＮＯ放出測定のために、次いで細胞を血清を含まない培地を用い
て洗浄し、次いでＶＥＧＦ（４０ｎｇ／ｍｌ）を用いて３０分間刺激した。一部
の実験で、ＮＯＳのカルシウム依存性をアデノウイルス感染の２４時間後に測定
した。感染された細胞を、１％ＮＰ４０を含むＮＯＳアッセイ緩衝液中に溶解し
そして界面活性剤可溶性物質を活性のために使用した。溶解物をＥＧＴＡ緩衝カ
ルシウムと一緒にインキュベーションすると、適当な量の遊離カルシウムがイン
キュベーション物内に生成した。

【００８１】統計：データは平均±ＳＥＭとして表現する。比較は、適合する場合に、両側
スチューデントｔ−検定または適合する場合にはｐｏｓｔ−ｈｏｃ検定を用いる
ＡＮＯＶＡを用いて行なった。差異は、ｐ＜０．０５の場合に有意と考えた。

【００８２】実施例１：ｅＮＯＳからのＡｋｔ調節ＮＯ産生ＰＩ−３キナーゼ、Ａｋｔ、の下流エフェクターがＮＯの産生に直接影響でき
る可能性を研究するために、ＣＯＳ−７細胞（ＮＯＳを発現しない）をｅＮＯＳ
および野生型Ａｋｔ（ＨＡ−Ａｋｔ）またはキナーゼ不活性Ａｋｔ（ＨＡ−Ａｋ
ｔＫ１７９Ｍ）と一緒に同時トランスフェクションし、そして亜硝酸イオン（
ＮＯ₂ ^-）をＮＯ特異性化学発光により測定した。ｅＮＯＳのトランスフェクシ
ョンはＮＯ₂ ^-蓄積の増加をもたらし、これは野生型Ａｋｔの同時トランスフェ
クションにより著しく強化される効果であるが、しかしキナーゼ不活性変種では
強化されない（図１Ａ）。同様の結果は、生物学的活性ＮＯに対する生物アッセ
イとしてｃＧＭＰを用いても得られた。この実験条件下で、Ａｋｔは、ホスホ−
Ａｋｔ特異性Ａｂ（これはセリン４７３を認識する、記載しない）を用いるウエ
スタンブロッティングおよびＡｋｔ活性アッセイにより決定されたように触媒的
活性であった（図２Ａ参照）。Ａｋｔの構成性活性形（ｍｙｒ−Ａｋｔ）のトラ
ンスフェクションは、ｃＧＭＰ蓄積（ＣＯＳ細胞内でアッセイした）を、５．５
±０．８から１１．６±０．９ｐｍｏｌ（ｃＧＭＰ）／ｍｇ（タンパク質）に増
加し（それぞれｅＮＯＳ単独またはｍｙｒ−Ａｋｔを伴うｅＮＯＳでトランスフ
ェクションされた細胞中）、一方、キナーゼ不活性ＡｋｔはｃＧＭＰ蓄積に影響
しなかった（５．８±０．８ｐｍｏｌ（ｃＧＭＰ）、ｎ＝４回実験）。挿入図か
ら分かるように、ｅＮＯＳとＡｋｔの等レベルがＣＯＳ細胞溶解物中で発現され
、ＡｋｔがｅＮＯＳを調節し、これにより基礎条件下でＮＯ産生が増加すること
を示唆する。

【００８３】ｅＮＯＳは、二重にアシル化された周辺膜タンパク質であり、これは内皮細胞
のゴルジ領域内および形質膜を標的とし(Lie et al., 1997; Garcia-Cardena et
al., 1996a; Shaal et al., 1996)、そして区画化がアゴニストチャレンジに応
答するＮＯの効果的な産生のために必要である(Sessa et al., 1995; Liu et al
., 1996; Kantor et al., 1996) 。ＡｋｔによるｅＮＯＳ活性化が膜区画化を要
求するかどうかを検討するために、ＣＯＳ−７細胞をＡｋｔに対するｃＤＮＡと
一緒に同時トランスフェクションし、そしてｅＮＯＳのミリストイル化、パルミ
トイル化欠失変異体（Ｇ２ＡｅＮＯＳ）およびＮＯの放出を定量した。図１Ｂ
から分かるように、Ａｋｔは、ｅＮＯＳの非アシル化形を活性化せず、膜への両
方のタンパク質の区画化が、これらの機能性相互作用ために要求されることを示
唆している(Downward et al., 1998) 。次いで、構造的には類似しているが明ら
かに溶解性のＮＯＳアイソフォーム、ニューロン性および誘導可能なＮＯＳ（そ
れぞれｎＮＯＳおよびｉＮＯＳ）をＡｋｔが活性化できるかどうかを決定した。
ＡｋｔとｎＮＯＳおよびｉＮＯＳとの同時トランスフェクションは、ＮＯ放出に
これ以上の増加をもたらさず、ｅＮＯＳに対するＡｋｔの特異性を証明する。し
かし、生物学的膜とのこれらの相互作用増強のためのｎＮＯＳへのＮ−ミリスト
イル化部位の付加は、ｅＮＯＳの場合と同様の様式でのｎＮＯＳのＡｋｔ刺激を
もたらし、膜が固定されている場合に、両方のアイソフォームがＡｋｔキナーゼ
により活性化されるらしいことを示唆する。

【００８４】実施例２：ｅＮＯＳ変異体の産生上記の実験は、Ａｋｔが、多分ｅＮＯＳのリン酸化を介して、不変の細胞から
のＮＯ放出を調節できることを意味する。実際、二個の推定Ａｋｔリン酸化モチ
ーフ（ＲＸＲＸＸＳ／Ｔ）がｅＮＯＳ内に存在し（ウシｅＮＯＳ内のセリン６３
５および１１７９およびヒトｅＮＯＳ内のセリン６３３および１１７７）そして
１個のモチーフがｎＮＯＳ内に存在し（ラット内のセリン１４１２およびヒトｎ
ＮＯＳ内の１４１５）、ｉＮＯＳ内には明瞭なモチーフは見いだされない。ｅＮ
ＯＳが生体外でのＡｋｔリン酸化の可能な基質であるかどうかを検討するために
、ＣＯＳ細胞をＨＡ−ＡｋｔまたはＨＡ−Ａｋｔ（Ｋ１７９Ｍ）を用いてトラン
スフェクションし、そして組換えｅＮＯＳを基質として用いてキナーゼ活性を評
価した。図２Ａから分かるように、活性キナーゼはヒストン２ＢおよびｅＮＯＳ
をリン酸化し（それぞれ６９．３±２．９および１１５．４±３．８ｐｍｏｌ（
ＡＴＰ）／ｎｍｏｌ（基質）、ｎ＝３）、一方不活性ＡｋｔはヒストンもｅＮＯ
Ｓリン酸化も有意には増加させなかった。ｅＮＯＳ中の推定Ａｋｔリン酸化部位
が³²Ｐの組込みに関係するかどうかを解明するために、２個のセリンをアラニン
残基に変異させそして野生型および変異ｅＮＯＳリン酸化を刺激するＡｋｔの能
力を不変ＣＯＳ細胞内で試験した。トランスフェクションした細胞をオルトリン
酸³²Ｐを用いて標識し、ｅＮＯＳをＡＤＰ−セファロースアフィニティークロマ
トグラフィーにより部分的に精製し、そしてリン酸化状態およびタンパク質レベ
ルを定量した。図２Ｂから分かるように、Ａｋｔの同時発現は、非刺激細胞に対
してｅＮＯＳのリン酸化に２倍の増加をもたらす。ウオルトマンニンを用いるｅ
ＮＯＳ／Ａｋｔトランスフェクション細胞の前処理は、リン酸化におけるＡｋｔ
誘発増加を消滅させる。その上、セリン６３５および１１７９のアラニン残基へ
の変異は、ｅＮＯＳのＡｋｔ依存性リン酸化を消滅させ、これらの残基が不変の
細胞内の可能なリン酸化部位として機能することを示唆する。

【００８５】Ａｋｔによりリン酸化された残基を直接特定するために、野生型ｅＮＯＳを免
疫精製したＡｋｔと共にインキュベーションしそしてリン酸化された部位をＨＰ
ＬＣおよび引き続いてＭＡＬＤｉ−質量分析（ＭＡＬＤｉ−ＭＳ）により決定し
た。図２Ｃから分かるように、一次的に³²Ｐにより標識されたトリプシンホスホ
ペプチドが、合成ホスホペプチド（アミノ酸１１７７−１１８５、位置１１７９
にホスホセリン）と同時溶離し、そして線型モードＭＳにより測定して同じ質量
のイオンを有する。レフレクトロン(reflextron)モードＭＡＬＤｉ−ＭＳ測定を
用いると、両方の標識トリプシンペプチドおよび標準ホスホペプチドがＨＰ₃Ｏ ₄ の損失を証明し、これはトリプシンペプチドがリン酸化されたことを示す。そ
の上、Ａ１１７９のＡへの変異は、野生型タンパク質と比較して、ｅＮＯＳのＡ
ｋｔ依存性リン酸化を著しく低下させる（図２Ｄ）。同様の結果は、組換えＡｋ
ｔの基質として野生型から誘導したペプチド（アミノ酸１１７４−１１９４）ま
たはｅＮＯＳＳ１１７９Ａを用いて得られた（野生型ペプチドは２４．６±３
．７ｎｍｏｌリン酸）／ｍｇを組込み、これに対してアラニン変異ペプチドは０
．２２±０．０２ｎｍｏｌ（リン酸）／ｍｇを組込んだ。ｎ＝５）。要約すると
、これらのデータは、ｅＮＯＳがＡｋｔの基質でありそしてリン酸化の一次部位
はセリン１１７９（ヒトｅＮＯＳではセリン１１７７）であることを証明してい
る。

【００８６】次いで、我々は、セリン６３５における推定Ａｋｔリン酸化部位およびセリン
１１７９における特定された部位の機能的重要性を検討した。二重変異したｅＮ
ＯＳＳ６３５／１１７９Ａを用いるＣＯＳ細胞のトランスフェクションは、Ａ
ｋｔ依存性ＮＯ放出を消滅させた。セリン６３５のアラニンへの変異は、ＮＯ放
出を減衰させず、一方ｅＮＯＳＳ１１７９ＡはｅＮＯＳのＡｋｔ依存性活性化
を消滅させた（図３）。これらの結果は、セリン１１７９がＮＯ放出に対して機
能的に重要であることを示唆する。リン酸の添加により与えられる負電荷を置換
するためのセリン１１７９のアスパラギン酸への変異（ｅＮＯＳＳ１１７９Ｄ
）は、Ａｋｔにより誘発される活性化部位に部分的に類似する（ヒトｅＮＯＳに
おけるＳ１１７７Ｄ）。すべての部位指示変異は、広範に発現され（挿入したウ
エスタンブロット参照）そして細胞溶解物内のＮＯＳ触媒活性を保持した（ｅＮ
ＯＳでトランスフェクションされたＣＯＳ細胞内でのみ、ＮＯＳ活性は８５．３
±２７．０、７１．９±２．９、８０．８±２３．２および１３１．８±３６．
７ｐｍｏｌ（産生Ｌ−シトルリン）／ｍｇ（ＣＯＳ細胞の溶解物からのタンパク
質）をそれぞれ野生型、Ｓ１１７９Ａ、Ｓ６３５、１１７９ＡおよびｅＮＯＳ
Ｓ１１７９Ｄが発現、実験回数ｎ＝３）。

【００８７】Ａｋｔが内皮細胞からＮＯ放出を媒介するかどうかを試験するために、ウシ肺
毛細血管内皮細胞（ＢＬＭＶＥＣ）を、アデノウイルス発現活性化Ａｋｔ（ｍｙ
ｒ−Ａｋｔ）、活性化欠失Ａｋｔ（ＡＡ−Ａｋｔ）またはβ−ガラクトシダーゼ
を対照として感染させ、そしてＮＯ蓄積を測定した。図４Ａから分かるように、
ｍｙｒ−ＡｋｔはＢＬＭＶＥＣからのＮＯの基礎産生を刺激し、一方β−ガラク
トシダーゼまたは活性化欠失Ａｋｔで感染された細胞は検出限界に近いような低
いＮＯのレベルを放出した。これらのデータは、ＣＯＳ細胞内の同様の結果と組
み合わせて、ｅＮＯＳのＡｋｔリン酸化は、カルシウムの一定レベルにおいてＮ
Ｏ産生を制御するために十分であることを示唆する。実際、ｍｙｒ−Ａｋｔを感
染されたＢＬＭＶＥＣ内からの溶解物中で測定されたＮＯＳ活性は、一定カルモ
ジュリン濃度でアッセイしたカルシウムによる活性化に対する酵素の感受性が、
β−ガラクトシダーゼウイルスで感染されたＢＬＭＶＥＣ内で見られるＮＯＳ活
性よりも高いことを証明している（図４Ｂ）。興味あることには、活性化欠失Ａ
ｋｔにより感染された細胞内のＮＯＳ活性のカルシウム感受性は、ｍｙｒ−Ａｋ
ｔおよびβ−ガラクトシダーゼ感染細胞の両方に対して大きく阻害された。

【００８８】ＶＥＧＦを用いる内皮細胞の処理は、Ａｋｔ２３およびＰＩ−３キナーゼの阻
害剤により部分的にブロックされた機構を通じてＮＯの放出を活性化することが
知られている(Papapetropoulos et al.,1997) 。ＮＯ放出に対するアゴニストと
してのＶＥＧＦとＡｋｔ活性化との間の機能的関連を試験するために、ＢＬＭＶ
ＥＣをｍｙｒ−Ａｋｔ、ＡＡ−Ａｋｔまたはβ−ガラクトシダーゼに対するアデ
ノウイルスで感染させ、そしてＶＥＧＦ刺激ＮＯ放出を定量した。図４Ｃから分
かるように、ｍｙｒ−Ａｋｔを用いた内皮細胞の感染はＶＥＧＦ刺激ＮＯ産生を
増加し、一方ＡＡ−ＡｋｔはＮＯ放出を減衰させる。これらの結果は、内皮細胞
内の基礎および刺激されたＮＯ産生に対して要求させるシグナル伝達イベントに
Ａｋｔが関与することを意味する。

【００８９】要約すると、これらのデータは、Ａｋｔがセリン１１７９（ヒトｅＮＯＳ内で
はセリン１１７７）上のｅＮＯＳをリン酸化できそしてリン酸化は酵素のＮＯ産
生の能力を上昇させることを証明する。

【００９０】実施例３材料および方法ｅＮＯＳ構築物およびタンパク質精製−プラスミドｐＣＷ中の野生型ウシｅＮ
ＯＳを以前の記載に従ってあらかじめ大腸菌ＢＬ２１細胞内のｇｒｏＥＬＳを用
いて発現した(Martasek et al.,1996)。大腸菌発現のためのＳ１１７９Ｄ変異ｅ
ＮＯＳを下記のようにして産生した。ｐｃＤＮＡ３中のｅＮＯＳＳ１１７９Ｄ
(Fullton et al., 1999)をＸｈｏＩ／ＸｂａＩを用いて消化し、ｐＣＷ中のｅＮ
ＯＳの同じ部位内にサブクローニングし、そしてｇｒｏＥＬＳと同時に再発現し
た。組換えｅＮＯＳの単離は、以前にの報告に従い(Roman et al.,1995; Martas
ek et al.,1999) 下記の変更を加えて行なった。１０ｍＭＮＡＤＰＨまたは１
０ｍＭ２’−ＡＭＰのいずれかを用いて２’５’−ＡＤＰセファロースからｅＮ
ＯＳを溶離した。ｅＮＯＳの量は、０．１μＭ^-1ｃｍ^-1のヘム含有量に対する吸
光計数を用いて、４０９−４１２ｎｍにおけるピーク吸光を用いて定量した。ｅ
ＮＯＳの純度は、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いでクーマシー染色により測定
した。低温ＳＤＳ−ＰＡＧＥは同様に行なったが、ただし試料を煮沸せずそして
電気泳動を氷／水のスラリー中、４℃で行なった点異なる(Klatt et al.,1995)
。ＮＯＳ補因子（Ｌ−アルギニン、カルモジュリン、およびＮＡＤＰＨ）を滴定
する実験では、これらを酵素の精製および貯蔵から除外しそして下記のようにイ
ンキュベーションした。

【００９１】ＮＯＳ活性のアッセイ−ＮＯ産生は、記載に従ってヘモグロブリン捕そくアッ
セイにより測定した(Kelm et al., 1988) 。要約すると、反応混合物は、ｅＮＯ
Ｓ（０．５〜２．５μｇ）、オキシヘモグロビン（８μＭ）、Ｌ−アルギニン（
１００μＭ）、ＢＨ４（５μＭ）、ＣａＣｌ₂（１２０μＭ）、カルモジュリン
（１２０〜２００ｎＭ）、およびＮＡＤＰＨ（１００μＭ）をＨＥＰＥＳ緩衝液
（５０ｍＭ）、ｐＨ７．４中に含んでいた。ｅＮＯＳに対するカルシウムＥＣ５
０値の決定では、上記の反応混合物を下記のように変性した：ＭＯＰＳ緩衝液（
１０ｍＭ、ｐＨ７．９）、ＫＣｌ（１００ｍＭ）およびＣａＭ（２５０ｎＭ）を
置換した。これらの条件下で、遊離のカルシウムをＷｉｎＭＡＸＣプログラム、
バージョン１．８(Stanford University) で、２．２ｘ１０^-8ＭのＫｄを用いて
算出した。正確な遊離カルシウム濃度は、１０ｍＭＫ₂ＥＧＴＡと１０ｍＭ
ＣａＥＧＴＡストック溶液とを適当な比率で混合して得られた（Molecular Prob
es）。ＮＯＳ活性は、４０１ｎｍにおいて２分間の線型性を測定し、そしてＮＯ
産生は、６０ｍＭ^-1ｃｍ^-1の吸光係数を用いて吸光度の変化に基づいて算出した
。すべての反応は２３℃で行い、そしてそれぞれのデータ点は、３〜８回の観察
を表す。２７６ｎｍにおける０．００３３ｍＭ^-1ｃｍ^-1の吸光係数をカルモジュ
リン濃度の測定のために使用した。この方法を用いるＮＯの産生は、ニトロ−Ｌ
−アルギニン（１ｍＭ）の添加により完全にブロックされた。ｅＮＯＳの不活性
化を反応混合物へのＥＧＴＡ（２００〜８００μＭ）の添加により測定する場合
に、ＮＡＤＰＨによる反応開始の１分後にキレート化剤を加えた。ＮＡＤＰＨシ
トクロムｃレダクターゼ活性を試験する場合にも同様の条件を用いた。これらの
反応は、ＣａＭ（１２０ｎＭ）およびＣａＣｌ₂（２００μＭ）をｅＮＯＳ（０
．５μｇ）を含む体積０．５ｍｌ内に含んでいた。

【００９２】Ｌ−アルギニンのＬ−シトルリンへの変換は、以前のBrent et al.(1990)によ
る記載に従ってアッセイした。要約すると、ｅＮＯＳ（０．２５〜２μｇ）を３
〜１０分間、２３℃、下記の反応混合物内でインキュベーションした：最終体積
５０〜１００μｌ中のＬ−〔３Ｈ〕アルギニン（５５Ｃｉ／ミリモル）の３ｐｍ
ｏｌ、１０〜３００μＭアルギニン、１ｍＭＮＡＤＰＨ、１２０〜２００ｎＭ
カルモジュリン、２ｍＭＣａＣｌ₂、および３０μＭＢＨ４。反応は、２ｍ
ＭＥＧＴＡおよびＥＤＴＡを含む２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ５．５の０．５
ｍｌの添加により終結させた。反応混合物をダウエックスＡＧ５０ＷＸ８上に置
き、そして流通量をパッカード(Packard) １５００液体シンチレーションアナラ
イザーで計数した。

【００９３】レダクターゼ活性のアッセイ−ＮＡＤＰＨ−シトクロムｃレダクターゼ活性お
よび２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）還元を、５５０
ｎｍにおいて、Martasek et al.(1999) およびMasters et al.(1967)の記載に従
い、シトクロムｃおよびＤＣＩＰの両者に対する吸光計数０．０２１μＭ^-1ｃｍ ^-1 を用いて、吸光の変化として測定した。要約すると、反応混合物（１ｍｌ）は
、シトクロムｃ（９０μＭ）；ＤＣＩＰ（３６μＭ）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０
ｍＭ）、ｐＨ７．６、ＮａＣｌ（２５０ｍＭ）、ＮＡＤＰＨ（１００μＭ）、カ
ルモジュリン（１２０ｎＭ）、およびＣａＣｌ₂（２００μＭ）；または指定の
他の物質のいずれかを含んでいた。反応は、ｅＮＯＳの添加後の６０秒間（２３
℃において）測定した。レダクターゼ活性の不活性化がＥＧＴＡ（２００〜８０
０μＭ）の添加により決定された場合には、反応開始の１分後にキレート化剤を
添加し、さらに１分間測定した。反応物は、ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ）、ｐ
Ｈ７．６、ＣａＭ（１２０ｎＭ）、およびＣａＣｌ₂（２００μＭ）を含んでお
りそしてＮＡＤＰＨ（１００μＭ）により開始された。ヘモグロビン捕そく実験
に使用した条件に類似させるために、ｅＮＯＳのＥＧＴＡ不活性化を試験する実
験では、ＮａＣｌを添加しなかった。ＮＯＳ阻害剤の添加は、シトクロムｃ還元
の速度に影響しなかった（記載しない）。ｅＮＯＳの対するカルシウムＥＣ５０
の決定は、ヘモグロビン捕そくアッセイに対する上記のようにして行なった。

【００９４】データ解析および統計−すべてのデータを平均±Ｓ．Ｅ．（標準偏差）として
表した。それぞれのデータの組に対して、少なくとも３個の酵素の異なるバッチ
を用いて、少なくとも３回測定した。野生型および変異酵素は、調製物間の活性
変動を制御するために同時に精製した。統計的有意性は、スチューデントｔ検定
を用い、そしてｐ＜０．０５を統計的有意と考えた。結果ｅＮＯＳの発現および精製−野生型およびＳ１１７９ＤｅＮＯＳの両者を大
腸菌から発現および精製した。１．６リットルの培養物内で、ｅＮＯＳの約２．
５〜４．０ｍｇが、２’５’−ＡＤＰセファロース４Ｂクロマトグラフィーを用
いて標準的に回収された。図５Ａから明らかなように、両方の酵素は、クーマシ
ー染色に基づいて＞９０％純度であった。これらの結果は標準的であり、これは
平行して産生した野生型およびＳ１１７９ＤｅＮＯＳの両者の７回の独立した
調製から分かる。両方の酵素は一次的にはそのダイマー形であり、これは低温Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥにより示される（図５Ｂ）。

【００９５】ｅＮＯＳＳ１１７９Ｄは、野生型ｅＮＯＳよりも大きいＮＯ合成酵素および
レダクターゼ活性を有する−次いで、野生型およびＳ１１７９ＤｅＮＯＳの活
性をＮＯ産生速度を測定して比較した。Ｓ１１７９ＤｅＮＯＳは、野生型酵素
と比較してさらに高い交替数（８４±６に対して２７±１分^-1、ｎ＝６、酵素の
分離して対となった調製）を有していた（最適条件下）。Ｌ−アルギニンを用い
たＫｍ値は、野生型およびＳ１１７９ＤｅＮＯＳで同様であった（図６Ａ、そ
れぞれ１．８に対して２．５μＭ、図１参照）。

【００９６】

【表１】

【００９７】レダクターゼ領域からオキシゲナーゼ領域への電子フラックスの速度がＮＯＳ
触媒に対して重要なので、これが上昇したレダクターゼ活性に帰せられるかどう
かを決定するためにＳ１１７９ＤｅＮＯＳ活性の増加を試験した。ＤＣＩＰお
よびシトクロムｃ還元の両者を試験する場合に、野生型ｅＮＯＳと比較してＳ１
１７９Ｄの活性の著しく高い増加が観察された（図６）。さらに、この増加は、
ＣａＭの存在により強化され、これは両方の酵素で総合活性を増加した。ＣａＭ
が存在しない場合の基礎シトクロムｃ還元は、野生型ｅＮＯＳと比較してＳ１１
７９Ｄの方が４倍高かった。ＣａＭ刺激シトクロムｃ還元の大きさは、Ｓ１１７
９ＤｅＮＯＳの方が高かった（野生型およびＳ１１７９ＤｅＮＯＳに対して
それぞれ７４９±３５と１２７２±５５分^-1、ｎ＝３〜５）。しかし、ＣａＭに
よる刺激のレベルは、Ｓ１１７９ＤｅＮＯＳでの３倍だけに対して野生型では
８倍であった。

【００９８】次いで、シトクロムｃを還元できる野生型ｅＮＯＳよりもＳ１１７９ＤｅＮ
ＯＳがさらに多くのスーパーオキシドを産生するかどうかを決定した。予想通り
に、スーパーオキシドジスムターゼを阻害可能なシトクロムｃは、ＣａＭが存在
しないと観察されず（スーパーオキシドアニオン生成の指数として）、これは以
前に報告された野生型ｅＮＯＳ（８６±６に対して９５±８分^-1）およびＳ１１
７９ＤｅＮＯＳ（２７８±９に対して２８８±７分^-1、ｎ＝３〜５）と同様で
あった。しかし、ＣａＭが存在すると、スーパーオキシドジスムターゼは野生型
（６１０±５１に対して８６６±８分^-1）およびＳ１１７９Ｄ（１１７９±４３
に対して１５１８±１９分^-1）ｅＮＯＳの両者でのシトクロムｃ還元の速度を低
下させた。スーパーオキシドジスムターゼの存在下におけるシトクロムｃ活性の
相対的低下は、両方の酵素で類似しており（野生型で３０％、Ｓ１１７９Ｄｅ
ＮＯＳで２２％）、野生型ｅＮＯＳと比較したＳ１１７９Ｄの高いレダクターゼ
活性（シトクロムｃ還元でアッセイした）が酵素の脱結合によるものではないこ
とを示唆する。

【００９９】ＮＡＤＰＨ依存性ＮＯ形成およびレダクターゼ活性は、野生型とＳ１１７９Ｄ
ｅＮＯＳとで異ならない−ＮＯ産生およびシトクロムｃ還元のＮＡＤＰＨ依存
性を試験したが、それはＮＡＤＰＨ結合部位がｅＮＯＳ内のＳｅｒ−１１７９の
近位に近いためである。ＣａＭの存在下でアッセイしたＮＯ産生に基づいて、Ｓ
１１７９ＤｅＮＯＳは、野生型酵素よりも高い最高交替数（ｋ_cat）を有する
（図７Ａ）。増加したｋ_catは、野生型ｅＮＯＳと比較してＳ１１７９ＤｅＮ
ＯＳでのＮＡＤＰＨに対するＫｍの増加が４倍であった（それぞれ３６に対して
８μＭ）。ＣａＭが存在しない場合のＮＡＤＰＨ依存性シトクロムｃ還元に対す
るｋ_catは、ｅＮＯＳＳ１１７９Ｄの方が野生型ｅＮＯＳよりも大きい（それ
ぞれ２９０に対して７０分^-1、図７Ｂ）。ＣａＭが存在する場合に、シトクロム
ｃ還元に対するｋ_catはＳ１１７９Ｄの方が野生型ｅＮＯＳと比較して著しく高
い（それぞれ８４０に対して４６０分^-1）。ＮＡＤＰＨに対するＫｍ値は、Ｃａ
Ｍが存在してもしなくても変わらない（ＣａＭの存在および非存在の場合にそれ
ぞれ野生型ｅＮＯＳでは０．４０および０．７５μＭそしてＳ１１７９ＤｅＮ
ＯＳでは２．０および１．９μＭ）。

【０１００】ＣａＭに対するＥＣ５０値は野生型およびＳ１１７９ＤｅＮＯＳの間で変化
しない−Ｓ１１７９ＤｅＮＯＳの増加した活性がＣａＭに対する酵素の親和性
における変化に帰せられるかどうかを評価するために、ＮＯＳ活性およびシトク
ロムｃ還元の速度アッセイをすべてのＮＯＳ補因子の過剰の存在下で、ＣａＭ濃
度の関数として試験した。ＮＯＳ活性のＣａＭ活性化に対するｋ_catは、野生型
では２２分^-1、そしてＳ１１７９ＤｅＮＯＳでは４３分^-1であった。ｋ_catの
差異を正規化するデータの変換は、Ｓ１１７９ＤｅＮＯＳの左側の曲線に僅か
なシフトを明らかにしたが、しかしＣａＭに対するＥＣ５０値はほとんど差異が
なく、ホスホ−ｅＮＯＳに関して報告されたデータ(Mitchell et al.,1999)と一
致した。ＥＣ５０値は、野生型では８ｎＭ、Ｓ１１７９ＤｅＮＯＳでは７ｎＭ
であった（図８Ａ）。ＮＡＤＰＨ媒介シトクロムｃ還元を測定した。シトクロム
ｃ還元のＣａＭ活性化に対するｋ_catは、Ｓ１１７９ＤｅＮＯＳの方が野生型
酵素と比較して約２倍高かった（Ｓ１１７９Ｄおよび野生型ｅＮＯＳに対してそ
れぞれ１１４０および６２０分^-1）。ｋ_catに関して正規化したデータの変換は
、野生型とＳ１１７９ＤｅＮＯＳとの間でＣａＭに対するＥＣ５０に小さい差
異を明らかにした（２１に対して１３ｎＭ、図８Ｂ）。

【０１０１】ｅＮＯＳのカルシウム活性化および不活性化の比較−以前の実験で、ｅＮＯＳ
の「見かけカルシウム感受性」がホスホ−ｅＮＯＳまたはＳ１１７９ＤｅＮＯ
Ｓのいずれかを発現して細胞内で上昇することを証明し、これはリン酸化がカル
シウム／ＣａＭ活性化の大部分の親和性を変化したことを示唆する(Dimmeler et
al.,1999; Fulton et al.1999) 。図８Ｃに見られるように、最高活性における
差異を正規化した後で、カルシウム依存性はＳ１１７９ＤｅＮＯＳで僅かに上
昇した（ｐ＜０．０５、変動の二重解析）。野生型およびＳ１１７９ＤｅＮＯ
Ｓでのカルシウムに対するＥＣ５０値も、ＮＯ産生により測定して（２５０ｎＭ
ＣａＭの存在下）、僅かに差異があった（それぞれ３１０および２５０ｎＭ）
。図８Ｃの挿入図に見られるように、遊離カルシウムの濃度増加は、Ｓ１１７９
ＤｅＮＯＳ交替を野生型酵素で見られるよりも大幅に増強する。さらに、シト
クロムｃ還元をアッセイするカルシウムに対するＥＣ５０値は、ＮＯ産生を測定
して得られたものと同様であった（図８Ｄ、野生型およびＳ１１７９ＤｅＮＯ
Ｓに対してそれぞれ２９０および２２０ｎＭ）。この場合にも、Ｓ１１７９Ｄ
ｅＮＯＳ交替のカルシウム活性化のＶｍａｘは野生型よりも大きかった（図４Ｄ
、挿入図）。

【０１０２】Ｓ１１７９ＤｅＮＯＳの不活性化が野生型酵素のものと異なるかどうかを検
討するために、ＥＧＴＡを用いるカルシウムのキレート化の後のｅＮＯＳ活性の
減衰を測定した。これらの実験において、すべてのＮＯＳ補因子をカルシウムの
存在下で添加し（２００μＭ）、そしてＮＯ産生を１分間測定し、次いで種々の
濃度のＥＤＴＡを添加しそしてさらに１分間測定した。図９Ａに見られるように
、野生型およびＳ１１７９ＤｅＮＯＳに対するＥＧＴＡの添加は、濃度依存性
の様式でＮＯ産生を低下した。しかし、Ｓ１１７９ＤｅＮＯＳからのＮＯ産生
は、ＥＧＴＡの添加に対して感受性が低い。すなわち野生型ｅＮＯＳ活性は、Ｅ
ＧＴＡの低濃度においてＳ１１７９ＤｅＮＯＳ活性よりもさらに急速に低下し
た。酵素間の活性の最大の相違は、４００μＭＥＧＴＡで認められた。さらに
、６００μＭＥＧＴＡにおいて、野生型ｅＮＯＳでは活性が認められないが、
一方Ｓ１１７９ＤｅＮＯＳでは残留活性がまだ認められた。同様の結果は、シ
トクロムｃ還元でも得られ（図９Ｂ）、この場合には反応への４００および６０
０μＭのキレート化剤の添加で著しい活性の相違が認められた。しかし、ＥＧＴ
Ａの最高濃度で、残留活性が野生型およびＳ１１７９ＤｅＮＯＳの両方に対し
て認められた。

【０１０３】要約すると、ウシ内皮窒素酸化物合成酵素（ｅＮＯＳ）は、セリン１１７９に
おいてタンパク質キナーゼＡｋｔにより直接リン酸化され(Fulton et al.,1999)
、そしてヒト内皮窒素酸化物合成酵素は、セリン１１７７においてタンパク質キ
ナーゼＡｋｔにより直接リン酸化される(Dimmeler et al.,1999)。ウシｅＮＯＳ
における残基１１７９の負に荷電したアスパラギン酸への突然変異は、アゴニス
トのチャレンジがなくても酸化窒素（ＮＯ）産生を構成性に増加する。

【０１０４】上記の考察および実施例は、一定の好ましい態様の詳細な説明を提供するもの
であることを理解すべきである。従って、当該技術分野の熟練者には、種々の変
更および等価のものを本発明の精神および範囲から逸脱することなく得ることが
可能なことが明らかであろう。上記および下記に特定するすべての引用文献、論
文および特許明細書は、引用することによりその全体を本明細書中に編入する。引用文献本文中でその完全な引用が行なわれなかったその他の文献を引用することによ
りその全体を編入する。

【０１０５】

【表２】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ−１Ｂ】野生型Ａｋｔであるが、しかしキナーゼ不活性ではないＡｋｔは、ｅＮＯＳに
関連する膜を発現する細胞からのＮＯ放出を増加する。図１Ａでは、ＣＯＳ細胞
をＡｋｔまたはキナーゼ不活性Ａｋｔ（Ｋ１７９Ｍ）の存在または不存在でｅＮ
ＯＳに対するプラスミドでトランスフェクションし、そしてＮＯ産生（ＮＯ₂ ^- としてアッセイ）を化学発光法で測定した。図１Ｂでは、ＣＯＳ細胞を上記と同
様の種々のＮＯＳプラスミドでトランスフェクションした、図１Ａおよび１Ｂの
両方で、β−ガラクトシダーゼｃＤＮＡのみを用いてトランスフェクションした
細胞から得られたレベルからＮＯ₂ ^-産生の値を差し引いた。挿入図は、全細胞
溶解物内のタンパク質の発現を示す。データは平均±ＳＥＭであり、実験回数Ｎ
＝３〜７。^*はｐ＜０．０５を表す。

【図２Ａ−２Ｄ】生体内および生体外における活性ＡｋｔによるｅＮＯＳのリン酸化。図２Ａで
は、ＣＯＳ細胞をＨＡ−ＡｋｔまたはＨＡ−Ａｋｔ（Ｋ１７９Ｍ）を用いてトラ
ンスフェクションし、溶解物を免疫沈降しそしてヒストン２Ｂ（２５ｍｇ）また
は組換えｅＮＯＳ（３ｍｇ）を基質として生体外キナーゼ反応を行なわせた。上
図は基質内への³²Ｐの組込みを示しそして下図はゲルのクーマシー染色による基
質の量を示す。図２Ｂでは、³²Ｐ標識野生型またはｅＮＯＳの二重セリン変異体
（ｅＮＯＳＳ６３５／１１７９）をトランスフェクションしたＣＯＳ細胞から
アフィニティー精製しそしてオートラジオグラフィー（上図）またはウエスタン
ブロット（下図）した。図２Ｂのグラフデータは、ゲル内の免疫活性遺伝子の量
に対する標識タンパク質の相対量を反映している。図２Ｃでは、標識したｅＮＯ
Ｓをトリプシンと消化し、そしてペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣにより分離した。上
のクロマトグラム図は、非標識合成ホスホペプチド標準（下クロマトグラム）と
同時移動した優勢な標識トリプシンペプチドを示す。挿入図は、標識ペプチド（
上）とホスホペプチド標準の線型モードＭＳが同じ質量イオンであることを示す
。図２Ｄでは、組換え野生型ｅＮＯＳまたはｅＮＯＳＳ１１７９Ａを精製し、
そして方法の説明の項の記載のようにして同量（２．４ｍｇ）を組換えＡｋｔと
生体外キナーゼ反応を行なわせた。図２Ｄの上図は、ｅＮＯＳ内への³²Ｐの組込
みを示し、そして下図は、ゲルのクーマシー染色による基質の量を示す。グラフ
データ（ｎ＝３）は、生体外キナーゼ反応におけるｅＮＯＳ（クーマシー）の質
量に対する標識ｅＮＯＳの相対量を反映している。

【図３】セリン１１７９がＡｋｔ刺激ＮＯ放出に対して機能的に重要であることの証明
。Ａｋｔの存在または非存在において、野生型ｅＮＯＳまたはｅＮＯＳ変異体に
対するプラスミドを用いてＣＯＳ細胞をトランスフェクションし、そしてタンパ
ク質の発現およびＮＯ産生（ＮＯ₂ ^-としてアッセイ）を測定した。興味あるこ
とには、ＡへのＳ１１７９変異を有する構築物はＡｋｔにより活性化されず、そ
してＤへのＳ１１７９の変異は、機能獲得をもたらした。Ａにおいて、データは
４〜７回の実験の平均±ＳＥＭであり、^*は有意の相違ｐ＜０．０５を表す。

【図４Ａ−４Ｃ】Ａｋｔは内皮細胞内のＮＯの基礎および刺激産生を制御する。図４Ａでは、Ｂ
ＬＭＶＥＣをアデノウイルス構築物（対照としてβ−ｇａｌ、ｍｙｒ−Ａｋｔお
よびＡＡ−Ａｋｔ）を用いて感染させ、そして２４時間で産生したＮＯ₂ ^-量を
測定した（ｎ＝３）。挿入図は、ｅＮＯＳおよびＡｋｔの発現を示す。図４Ｂで
は、アデノウイルス感染ＢＬＭＶＥＣからの溶解物をＮＯＳ活性に関して試験し
た。等量のタンパク質（５０ｍｇ）を種々の濃度の遊離カルシウムと一緒にイン
キュベーションしそしてＮＯＳ活性を測定した（ｎ＝３回実験）。図４Ｃでは、
ＢＬＭＶＥＣを上記のようにしてアデノウイルスを用いて感染させ、次いでＶＥ
ＧＦ（４０ｎｇ／ｍｌ）を用いて３０分間刺激しそしてＮＯ₂ ^-放出を化学発光
法により定量した。データは、基礎レベルを差し引いた後のＮＯ₂ ^-のＶＥＧＦ
刺激放出を示す。データは平均±ＳＥＭ、ｎ＝４であり、^*は有意の相違（ｐ＜
０．０５）を表す。

【図５Ａおよび５Ｂ】野生型およびｅＮＯＳＳ１１７９Ｄの純度およびダイマー／モノマー比。Ａ
およびＢにおいて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析をクーマシー・ブルーで染色した７．
５％ポリアクリルアミドゲル上で行なった。分子量標準（レーン１）およびｋＤ
ａで表したこれらの大きさを左側に記載した。野生型ｅＮＯＳ（レーン２）およ
びｅＮＯＳＳ１１７９Ｄ（レーン３）（それぞれ１μｇ）を溶解し矢印で示し
た。Ｂでは、タンパク質（それぞれ２μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で４℃で試験
した。分子量標準はレーン１である。野生型およびｅＮＯＳＳ１１７９Ｄの非
煮沸試料をそれぞれレーン２および３で分離した。レーン４では、野生型ｅＮＯ
ＳをＳＤＳ試料緩衝液中で煮沸した。

【図６Ａおよび６Ｂ】ｅＮＯＳＳ１１７９Ｄは、野生型ｅＮＯＳよりも高いＮＯ産生速度（Ａ）お
よびレダクターゼ活性（Ｂ）を有する。Ａでは、ヘモグロビン捕そくアッセイを
用いて、Ｌ−アルギニン濃度の関数として野生型（●）およびＳ１１７９Ｄ（○
）ｅＮＯＳからのＮＯ産生速度を測定し、そしてデータを両逆数プロットで示す
。Ｂでは、ＣａＭの存在または非存在下でＤＣＩＰおよびシトクロムアッセイを
行なった。値は平均±Ｓ．Ｅ．、ｎ＝４〜６である。同様の結果が、少なくとも
３種の酵素調剤を用いて得られた。野生型およびＳ１１７９ＤｅＮＯＳの間の
有意の相違（ｐ＜０．０５）は、星印で指示した。

【図７Ａおよび７Ｂ】ＮＯＳ活性（Ａ）およびＮＡＤＰＨ依存性のレダクターゼ（Ｂ）は、野生型酵
素と比較するとｅＮＯＳＳ１１７９Ｄを用いると高い。ヘモグロビン捕そく（
Ａ）およびＮＡＤＰＨ依存性シトクロムｃ還元（Ｂ）アッセイを、野生型および
Ｓ１１７９ＤｅＮＯＳの両方に関して行なった。Ａでは、ＮＯ産生速度をすべ
てのＮＯＳ補因子（野生型（黒印）およびＳ１１７９Ｄ（中抜き印）ｅＮＯＳ）
の存在下で行った。シトクロムｃ還元の速度は、野生型（円形）およびＳ１１７
９Ｄ（三角形）に対してアルギニンおよびＢＨ４（Ａ）の非存在、１２０ｎＭカ
ルモジュリンの存在（黒印）および非存在（中抜き印）で行なった。値は、少な
くとも３種類の酵素調剤からの平均±Ｓ．Ｅ．であり、ｎ＝３〜６回測定である
。

【図８Ａ−８Ｄ】ＮＯＳおよびレダクターゼ活性のカルモジュリン依存性活性化およびカルシウ
ム依存性活性化は、Ｓ１１７９ＤｅＮＯＳでわずかに強い。カルモジュリン依
存性ヘモグロビン捕そく（Ａ）およびシトクロムｃ還元（Ｂ）を、野生型（黒印
）およびＳ１１７９ＤｅＮＯＳ（中抜き印）の両者で行なった。ヘモグロビン
捕そく法で検出したＮＯ産生の速度は、すべてのＮＯＳ補因子の存在下であり、
一方シトクロムｃ還元は、アルギニンおよびＢＨ４の存在なしで行なった。Ｃお
よびＤでは、遊離カルシウムの量を増加させて、同じ実験を行なった。Ｃおよび
Ｄ中の挿入図は、ＮＯ産生およびシトクロムｃアッセイの両方におけるＳ１１７
９Ｄおよび野生型ｅＮＯＳのカルシウム依存性交替を示す。最高交替速度は、そ
れぞれ野生型およびＳ１１７９ＤｅＮＯＳの両方に対して、Ａ、２２および４
３分^-1、Ｂ、６２０および１４００分^-1、Ｃ、５８および１００分^-1、およびＤ
、１９３０および３８１０分^-1である。値は、少なくとも３種類の酵素調剤から
の平均±Ｓ．Ｅ．であり、ｎ＝３〜６回測定である。

【図９Ａおよび９Ｂ】ＮＯＳのＥＧＴＡ開始不活性化は、Ｓ１１７９ＤｅＮＯＳ内で低下する。ヘ
モグロビン捕そく（Ａ）およびレダクターゼアッセイ（Ｂ）は、上記と同様に行
なったが、ただし以下を変更した。反応を１分間、開始速度を決定するために測
定し、次いでＥＧＴＡを反応混合物に加え、そして速度をさらに１分間測定した
。反応物内の遊離カルシウム濃度は２００μＭであり、そして添加したＥＧＴＡ
の量により、キレート剤の最終濃度０、２００、４００および６００μＭとした
。比放射能は、野生型およびＳ１１７９ＤｅＮＯＳに対して１００％に正規化
した。値は、少なくとも３種類の酵素調剤からの平均±Ｓ．Ｅ．であり、ｎ＝３
〜６回測定であり、ｎｄは野生型ＮＯＳに対して測定可能な放射能がなかったこ
とを示す。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年１月２２日（２００２．１．２２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００１７】本発明は、ＮＯＳタンパク質またはポリペプチド、ＮＯＳタンパク質の対立変
種、およびヒトｅＮＯＳの残基１１７７、ウシｅＮＯＳの残基１１７９、ラット
ｎＮＯＳの残基１４１２、およびヒトｎＮＯＳの残基１４１５に相当する置換
されたアミノ酸残基を含むＮＯＳタンパク質の保存的アミノ酸置換を提供し、こ
こで置換されたアミノ酸残基は、非−負荷電のＲ基、例えばアラニンを含んでな
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 9/10 １０１４Ｃ０８７Ａ６１Ｐ 3/10 9/12 9/10 15/10 １０１Ｃ１２Ｎ 9/02 9/12 Ｃ１２Ｑ 1/02 15/10 1/26 Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＣ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/26 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＧ０１Ｎ 33/15 Ａ６１Ｋ 37/50 33/50 37/60 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 2G045 AA34 AA35 AA40 DA12 DA13 DA14 DA20 DA77 FB01 4B024 AA01 BA08 CA04 DA02 GA25 HA01 HA17 4B050 CC04 DD07 HH01 LL01 4B063 QA01 QQ08 QQ22 QQ89 QR02 QR50 QR77 QS38 QX07 4C084 AA01 AA02 AA07 AA13 BA01 BA08 CA18 CA20 CA23 CA53 DC23 DC28 MA23 MA35 MA37 MA52 MA55 MA56 MA57 MA63 MA66 NA14 ZA362 ZA422 ZA452 ZA812 ZC352 4C087 AA01 AA02 BC83 MA23 MA35 MA37 MA52 MA55 MA56 MA57 MA63 MA66 NA14 ZA36 ZA42 ZA45 ZA81 ZC35

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】構成性活性ＮＯＳポリペプチド、ＮＯ産生の高い速度を有す
るＮＯＳポリペプチド、および高いレダクターゼ活性を有するＮＯＳポリペプチ
ドから成る群より選ばれるＮＯＳポリペプチドをコードする単離された核酸分子
。
【請求項２】ＮＯＳポリペプチドが、ウシｅＮＯＳの残基１１７９、ヒト
ｅＮＯＳの残基１１７７、ラットｎＮＯＳの残基１４１２、またはヒトｎＮＯＳ
の残基１４１５に相当する置換されたアミノ酸残基を含む、請求項１記載の単離
された核酸分子。
【請求項３】ウシｅＮＯＳの残基１１７９、ヒトｅＮＯＳの残基１１７７
、ラットｎＮＯＳの残基１４１２、またはヒトｎＮＯＳの残基１４１５に相当す
る置換されたアミノ酸残基が、ホスホセリンに類似する、請求項２記載の単離さ
れた核酸分子。
【請求項４】ウシｅＮＯＳの残基１１７９、ヒトｅＮＯＳの残基１１７７
、ラットｎＮＯＳの残基１４１２、またはヒトｎＮＯＳの残基１４１５に相当す
るセリンが、アスパラギン酸またはグルタミン酸残基で置換されている、請求項
２記載の単離された核酸分子。
【請求項５】置換されたアミノ酸がホスフェート基に類似するＲ基を含む
、請求項２記載の単離された核酸分子。
【請求項６】請求項１から５のいずれか１項記載の単離された核酸分子に
よりコードされるポリペプチド。
【請求項７】構成性活性ＮＯＳポリペプチド、ＮＯ産生の高い速度を有す
るＮＯＳポリペプチド、および高いレダクターゼ活性を有するＮＯＳポリペプチ
ドから成る群より選ばれる単離されたＮＯＳポリペプチド。
【請求項８】ウシｅＮＯＳの残基１１７９、ヒトｅＮＯＳの残基１１７７
、ラットｎＮＯＳの残基１４１２、またはヒトｎＮＯＳの残基１４１５に相当す
る置換されたアミノ酸残基を含む、請求項７記載のＮＯＳポリペプチド。
【請求項９】置換されたアミノ酸が、アスパラギン酸またはグルタミン酸
残基で置換されている、請求項８記載の構成性活性ｅＮＯＳ。
【請求項１０】請求項７記載のポリペプチドまたはＡｋｔポリペプチドを
コードする導入遺伝子を冠動脈副行血管発生を促進するために有効な方法で送達
する段階を含んでなる、患者内の冠動脈副行血管発生を刺激するための方法。
【請求項１１】導入遺伝子が、心室筋細胞特異性プロモーター、平滑筋細
胞特異性プロモーター、または内皮細胞特異性プロモーターから発現される、請
求項１０記載の方法。
【請求項１２】心室筋細胞特異性プロモーターが、心室ミオシン軽鎖−２
またはミオシン重鎖プロモーターの配列を有する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】請求項７記載のペプチドまたはＡｋｔポリペプチドをコー
ドする導入遺伝子を患者の末梢血管系に、末梢血管発生を刺激するために有効な
方法で送達する段階を含んでなる、末梢欠失血管疾患を有する患者内の血管発生
を刺激するための方法。
【請求項１４】請求項７記載のポリペプチドまたはＡｋｔポリペプチドを
コードする導入遺伝子を心筋に、心筋虚血を治療するために有効な方法で送達す
る段階を含んでなる、心筋虚血を治療するための方法。
【請求項１５】導入遺伝子の発現が心筋細胞に限定される、請求項１４記
載の方法。
【請求項１６】導入遺伝子の発現が心室筋細胞に限定される、請求項１５
記載の方法。
【請求項１７】導入遺伝子が、複製欠失ベクターによりコードされる、請
求項１０から１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】複製欠失ベクターがアデノウイルスである、請求項１７記
載の方法。
【請求項１９】導入遺伝子が、生体外で細胞内にトランスフェクションさ
れる、請求項１０から１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】トランスフェクションされた細胞を患者に投与する、請求
項１９記載の方法。
【請求項２１】請求項７記載のポリペプチドを発現する、ヒト以外の形質
転換動物。
【請求項２２】（ａ）ＮＯＳを発現する細胞を薬剤に対して暴露し、そし
て（ｂ）ＮＯＳのＡｋｔで制御された活性を測定し、これによりＮＯＳのＡｋｔで
制御された活性を調節する薬剤を同定する段階を含んでなる、ＮＯＳのＡｋｔで制御された活性を調節する薬剤を同定する
ための方法。
【請求項２３】段階（ｂ）が、ウシｅＮＯＳの残基１１７９、ヒトｅＮＯ
Ｓの残基１１７７、ラットｎＮＯＳの残基１４１２、またはヒトｎＮＯＳの残基
１４１５に相当するアミノ酸残基におけるＮＯＳのリン酸化状態の決定を含んで
なる、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】ＮＯＳが薬剤により活性化される、請求項２３記載の方法
。
【請求項２５】薬剤が、ｅＮＯＳのＡｋｔ媒介リン酸化を模倣する、請求
項２４記載の方法。
【請求項２６】薬剤が、ウシｅＮＯＳの残基１１７９、ヒトｅＮＯＳの残
基１１７７、ラットｎＮＯＳの残基１４１２、またはヒトｎＮＯＳの残基１４１
５に相当するアミノ酸残基の脱リン酸化を阻害する、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】段階（ｂ）が、ＮＯ産生の測定を含んでなる、請求項２２
記載の方法。
【請求項２８】ＮＯが、ナイトライトの濃度または³Ｈ−Ｌ−シトルリン
への³Ｈ−Ｌ−アルギニンの変換を測定して検出される、請求項２７記載の方法
。
【請求項２９】（ａ）ＡｋｔおよびＮＯＳタンパク質またはペプチドを薬
剤に対して暴露し、（ｂ）ＮＯＳの活性を測定する段階を含んでなる、ｅＮＯＳのＡｋｔで制御された活性を調節する薬剤を同定す
る生体外の方法。
【請求項３０】ＮＯＳ活性が、ＮＯＳのＡｋｔ依存性リン酸化状態を決定
して測定される、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】ＮＯＳペプチドが配列番号２を含んでなる、請求項３０記
載の方法。
【請求項３２】段階（ｂ）において、ＮＯＳの活性がレダクターゼ活性で
ある、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】段階（ｂ）において、ＮＯＳの活性がＮＯＳによるＮＯ産
生である、請求項３０記載の方法。
【請求項３４】残基１１７７に相当する置換されたアミノ酸残基を含むウ
シｅＮＯＳ、残基１１７９に相当する置換された残基を含むヒトｅＮＯＳ、残基
１４１２に相当する置換された残基を含むラットｎＮＯＳ、および残基１４１５
に相当する置換された残基を含むヒトｎＮＯＳからなる群より選ばれるＮＯＳポ
リペプチドをコードする単離された核酸分子であって、置換されたアミノ酸残基
が非−負荷電のＲ基を含んでなる核酸分子。
【請求項３５】置換されたアミノ酸残基がアラニンである、請求項３４記
載の単離された核酸分子。
【請求項３６】残基１１７７に相当する置換されたアミノ酸残基を含むウ
シｅＮＯＳ、残基１１７９に相当する置換された残基を含むヒトｅＮＯＳ、残基
１４１２に相当する置換された残基を含むラットｎＮＯＳ、および残基１４１５
に相当する置換された残基を含むヒトｎＮＯＳからなる群より選ばれる単離され
たＮＯＳポリペプチドであって、置換されたアミノ酸残基が非−負に荷電のＲ基
を含んでなるＮＯＳポリペプチド。
【請求項３７】置換されたアミノ酸残基がアラニンである、請求項３６記
載のＮＯＳポリペプチド。
【請求項３８】内皮細胞特異性プロモーターがＴｉｅ−２プロモーター、
エンドセリンプロモーター、またはｅＮＯＳプロモーターである、請求項１１記
載の方法。
【請求項３９】平滑筋細胞プロモーターが、ＳＭ２２プロモーターまたは
ＳＭアルファ−アクチンプロモーターである、請求項１１記載の方法。
【請求項４０】請求項７記載のポリペプチドまたはＡｋｔポリペプチドを
コードする導入遺伝子を患者に投与する段階を含んでなる、患者内の心臓血管疾
患を治療するための方法。
【請求項４１】心臓血管疾患が、心不全、心筋梗塞、再狭窄、血管形成術
後の狭窄、ステント狭窄、および人工副行路不全から成る群より選ばれる、請求
項４０記載の方法。
【請求項４２】請求項７記載のポリペプチドまたはＡｋｔポリペプチドを
コードする導入遺伝子を患者に投与する段階を含んでなる、患者内の勃起不全を
治療するための方法。
【請求項４３】導入遺伝子が静脈内、筋肉内、皮内、腹膜内、または動脈
内に投与される、請求項１０、１３、１４、４０、または４２のいずれか１項記
載の方法。