JPH10501989A - 疾患治療用誘導型一酸化窒素シンターゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト肝細胞ｉＮＯＳのｃＤＮＡクローン及びｉＮＯＳのＤＮＡ配列を用いた種々の遺伝子治療の応用を開示する。この開示された発明の好ましい態様においては、ｉＮＯＳにより指示される遺伝子治療は、血管疾患および血管障害の治療、抗腫瘍応用、及びある特定の微生物感染への応答のために、ｉＮＯＳの生物学的活性を有するタンパク質又はタンパク質断片をコードするＤＮＡ配列の特異的ターゲッティングを含む。

Description

【発明の詳細な説明】 疾患治療用誘導型一酸化窒素シンターゼ遺伝子 ここに記載された発明は、合衆国国立衛生研究所、一般医学からの公衆衛生サ ービス、認可番号ＧＭ４４１００及びＧＭ３７７５３によって部分的に助成され た研究の過程においてなされたものである。合衆国政府はこの発明において特定 の権利を有する。 １．序論 本発明は、ヒト誘導型一酸化窒素シンターゼタンパク質を発現し得るヒト組織 誘導型一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡクローン、及びヒト誘導型一酸化窒素シン ターゼのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡをクローニングするのに適した方法 に関する。より具体的には、本発明はヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼｃ ＤＮＡクローン、及びヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼ酵素源を提供する ためのヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡのクローニングと発現の 方法に関する。 図１Ａ−Ｇはヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡのセンス鎖の ４，１４５のヌクレオチド塩基を示し、またヌクレオチド配列のコーディング部 分についてはトリプレット（コドン）としての塩基コードを示す。図１Ａ−Ｇは 、ヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼ酵素の１から１１５３までのアミノ酸 をコードする、ヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡクローンのア ミノ酸配列を示す。 本発明はさらに、哺乳動物宿主の疾患又は障害の遺伝子治療応用における、誘 導型ＮＯＳ（ｉＮＯＳ）又は生物学的に活性なｉＮＯＳタンパク質断片をコード する核酸配列の使用に関する。このような疾患は、血管閉塞性疾患ならびに癌、 及び微生物感染の治療を含むが、それらに限定はされない。 ２．発明の背景 一酸化窒素（ＮＯ）が、アミノ酸であるＬ−アルギニンに由来する生物学的メ ディエーターであることは当業者には公知である。一酸化窒素シンターゼ（ＮＯ Ｓ）として知られている酵素の一族は、Ｌ−アルギニンに作用してグアニジノ窒 素の一つを一酸化窒素へと酸化させ、その際にＬ−アルギニン分子の残渣からシ トルリンが形成される。一酸化窒素は非常に短寿命のフリーラジカルで、急速に 亜硝酸塩（ＮＯ₂ ^-）及び硝酸塩（ＮＯ₃ ^-）に酸化され、これらは一酸化窒素形成 における安定で不活性な最終生成物として測定される。 一酸化窒素シンターゼ酵素には多様なアイソフォームが存在し、それらは一般 的に、（１）構成型及び（２）誘導型という２つの広いカテゴリーに分類される ことが当業者によく知られている。これらのＮＯＳ酵素はクラスによって、大き さ、アミノ酸配列、活性、及び調節がかなり異なる。例えば、神経細胞や血管内 皮細胞のような細胞は構成型ＮＯＳのアイソフォームを含んでおり、一方マクロ ファージや血管平滑筋細胞は誘導型ＮＯＳを発現する。 構成型ＮＯＳにより生成された少量の一酸化窒素は、可溶性グアニル酸シクラ ーゼを活性化し、それにより細胞内のグアノシン−３’，５’−サイクリック一 リン酸（ｃＧＭＰ）を増加させ、さらに二次メッセンジャーとしてのｃＧＭＰに 依存する生物学的応答を誘導することによって、メッセンジャー分子として作用 するらしいということが一般によく知られている。例えばこの機序を通じて内皮 由来の一酸化窒素は血管平滑筋の弛緩を誘発し、内皮由来弛緩因子（ＥＤＲＦ） であることが明らかにされている［Palmerら，1987，Nature 327: 524-526 及び Ignarro ら，1987，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84: 9265-9269］。別の例とし ては、中枢神経系及び自律神経系に重要な機能を持ち、グアニル酸シクラーゼを 活性化することにより神経伝達物質として作用する神経細胞の一酸化窒素がある が、それに限定はされない（Bredt ら，1989，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86: 9030-9033 及びBurnett ら，1992，Science 257: 401-403）。誘導型一酸化窒 素シンターゼによる一酸化窒素の持続的生産が、抗微生物及び抗腫瘍機能を有す ることは、当業者に一般的に知られている（Granger ら，1989，J．Clin．Inves t．81: 1129-1136 及びHibbs ら，1987，Science 235: 473-476をそれぞれ参照 ）。炎症性サイトカインにより血管平滑筋細胞が刺激されＮＯＳ酵素を発現する 時に、放出される大量の一酸化窒素が敗血症にみられる血管拡張及び低血圧の一 因となることも当業者に知られている（Busse 及びMulsch，1990，FEBS Letter 265: 133-136）。 このように、一酸化窒素が通常の生理的な細胞内及び細胞外調節機能を有し、 また、過剰な一酸化窒素の生成が有害となり得る場合もあることがわかるであろ う。例えば、敗血症において増加する、例えば細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）等の細 菌性エンドトキシン及びサイトカインによって、血管内の誘導型一酸化窒素合成 が刺激されると、敗血症性ショックによく見られる血管の過剰な拡張及び持続性 低血圧を引き起こす（Kilbournら，1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87: 362 9-3632）。免疫複合体により刺激された肺における一酸化窒素の過剰生成が肺に 直接障害を与えることが知られている（Mulliganら，1992，J．Immunol．148: 3 086-3092）。膵島における一酸化窒素シンターゼの誘導はインシュリン分泌を弱 め、若年性糖尿病の発症の一因となる（Corbett ら，1991，J．Biol．Chem．266 : 21351-21354）。免疫が介在する関節炎における関節内の一酸化窒素の生成は 関節破壊の一因となる（McCartney ら，1993，J．Exp．Med．178: 749-754）。 医学界では、ヒトにおいて、構成型のＮＯＳではなく、誘導型のＮＯＳの選択的 阻害に対する必要性が大きいことが理解されよう。これは、血管運動の正常状態 や中枢神経系における神経伝達の生理的調節を阻害することなく、例えば膵島の 障害又は関節炎における関節破壊を予防する方法を見込んでいるからであろう。 多くの場合、一酸化窒素は、たとえ誘導型一酸化窒素シンターゼの発現に伴っ てみられるように大量に産生されても有益であり得る。例えば、誘導された一酸 化窒素合成は内毒素血症における肝障害の予防において重要である（Billiar ら ，1990，J．Leuk．Biol．48: 565-569; Harbrecht ら，1992，J．Leuk．Biol．5 2: 390-392）。 いくつかの文献では、一酸化窒素を血管疾患にみられる変化と関連付けようと の試みがなされている。例えば、Bucalaら（1991，J．Clin．Inv．87: 432-438 ）は、高血糖症において血管壁に蓄積するグリコシル化産物が一酸化窒素を消失 させ、一酸化窒素の量を減少させるかもしれないと開示している。Chinら（1992 ，J．Clin．Inv．89: 10-18）は、酸化したリポタンパク質が、一酸化窒素を不 活性化して類似の効果を有することを開示している。Chester ら（1990，Lancet 336: 897-900）は、アテローム性動脈硬化を起こしたヒトの心外膜動脈では一 酸化窒素合成が減少していることを開示している。これらの参考文献はいずれも 、ｉＮＯＳ作動性遺伝子治療に関する治療手段を解明してはいない。 血管の完全性とアテローム性動脈硬化病変の予防にとって重要な一酸化窒素の 作用としては、血管拡張（Palmerら，1987，Nature 327: 524-526; Ignarroら， 1987，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84: 9265-9269）、血小板の粘着と凝集の阻 害（Radomskiら，1987，Br．J．Pharmacol．92: 639-646）、血管平滑筋の阻害 （Nunokawaら，1992，Biochem．Biophys．Res．Com．188: 409-415）及び線維芽 細胞（Werner-Felmayer ら，1990，J．Exp．Med．172: 1599-1607）の細胞増殖 が含まれる。一酸化窒素は通常血管内皮により産生され、非常に短い半減期（ｔ_1/2 秒）のため、隣接する平滑筋にしか拡散せず、そこで可溶性グアニル酸シク ラーゼの活性化を経て弛緩を引き起こす（Moncada ら，1991，Pharmacol．Rev． 43: 109-142）。内腔に向かって放出された一酸化窒素は、血小板の粘着の防止 を助ける。Ｌ−アルギニンは一酸化窒素形成における基質として働き、内皮細胞 由来の少量の一酸化窒素がｃＮＯＳにより継続的に産生される(Palmerら，1987 ，Nature 327: 524-526; Ignarroら，1987，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84: 9 265-9269)。ｃＮＯＳは、主としてミクロソーム及び原形質膜上に位置している 。アセチルコリンやブラジキニンのようなアゴニストは、この酵素へのカルシウ ム／カルモジュリンの結合を増強する活性によってｃＮＯＳを増加させる。この 酵素をコードするｃＤＮＡはヒト内皮細胞からクローニングされた（Janssens ら，1992，J．Biol．Chem．267: 14519-14522; Marsdenら，1992，FEBS Letters 307: 287-293）。 我々は最近、単離されたヒト肝細胞において、インターロイキン−１、腫瘍壊 死因子−α、インターフェロン−γ及び細菌性リポ多糖（細菌性エンドトキシン ）による刺激後に一酸化窒素の生合成が誘導されることを実証した［Nussler ら ，1992年 4月，FASEB J．6(5): A1834 及びNussler ら，1992，J．Exp．Med．17 6: 261-264)］。これまでは、サイトカインで処理した際にｉＮＯＳの発現に特 徴的な一酸化窒素の産生の増加を示す細胞種は知られていなかった（Drapier，1 991，Res．Immunol.，Vol．142: 557）。ヒトマクロファージ及び齧歯類のマク ファージにみられるものに代表される関連細胞において、一酸化窒素シンターゼ を誘導する試みがすべて失敗してきたことは当業者には一般に知られている（Dr apier，Res．Immunol．142: 562，589-590）。これが背景資料ではあるが、ヒト 組織誘導型一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡクローン及びその分子クローニング 法に関する、非常に現実的で実質的な必要性は残されている。 誘導型ＮＯＳは、サイトカイン及びエンドトキシンが活性化する条件下のネズ ミのマクロファージ(Stuehrら，1985，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82: 7738-7 742; Hibbs ら，1987，Sciece 235: 473-476; Hibbsら，1987，J．Immunol．248 : 550-565)、ラットの肝細胞（Curranら，1989，J．Exp．Med．170: 1769-1774; Billiar ら，1990，Biophys．Res．Com 168: 1034-1040）、ラットの血管平滑 筋細胞（Busse ら，1990，FEBS Letter 275: 87-90; Nakayamaら，1992，Am．J ．Respir．Cell．Mol．Biol．7: 471-476）及び毛細血管内皮細胞（Gross ら，1 991，Biochem．Biophys．Res．Com 179: 823-829）のような細胞種において発現 され得る。休止細胞には完全に欠けているこの酵素は、何時間にもわたって持続 的に大量の一酸化窒素を産生する。カルモジュリンはｉＮＯＳ分子に強固に結合 し、この酵素を完全に活性化された状態に保つ（Cho ら，1992，J．Exp．Med．1 76: 599-604; Iidaら，1992，J．Biol．Chem．267: 25385-25388）。マクロファ ージにおけるｉＮＯＳ誘導後の大量の一酸化窒素の放出は細胞増殖を抑制する 性質を有し、腫瘍細胞（Hibbs ら，1987，Science 235: 473-476）及び微生物（ Green ら，1992，J．Leuk．Biol．50: 93-103）の増殖の防止に関係している。 ｉＮＯＳに関連する全身性毒性は種々の組織にみられるが、ｉＮＯＳ又は生物学 的に活性なフラグメントあるいは誘導体をコードするＤＮＡ配列を用いて、局所 的な細胞集団をターゲティングすることは有利であろう；このような遺伝子治療 処置は、血管閉塞性疾患、癌に関連する腫瘍細胞の成長及び多数の微生物感染を 含むが必ずしもこれらに限定されない疾患又は障害に関する予防及び／又は治療 作用を増進するであろう。 ３．発明の概要 本発明は上述した必要性を満たした。本発明はヒト組織誘導型一酸化窒素シ ンターゼのｃＤＮＡクローン及びその調製方法を提供する。 より詳細には、本発明はヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡク ローン及びその調製方法を提供する。この方法はヒト肝細胞における一酸化窒素 シンターゼの発現の誘導、ヒト肝細胞一酸化窒素シンターゼメッセンジャーＲＮ Ａの存在の確認、ヒト肝細胞ポリ（Ａ）メッセンジャーＲＮＡの回収、ヒト肝細 胞ポリ（Ａ）メッセンジャーＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの構築、このｃ ＤＮＡライブラリーのヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡクローン についてのスクリーニング、及びヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼをコー ドする全長ｃＤＮＡクローンを得るために、該ヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シン ターゼｃＤＮＡクローンをプラスミドベクターに変換することを含む。この方法 はさらに、このｃＤＮＡの配列の決定、発現系においてヒト肝細胞誘導型一酸化 窒素シンターゼｃＤＮＡをタンパク質として発現させること、及び該ｃＤＮＡに コードされるヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼタンパク質の精製を含む。 本発明のさらなる態様においては、誘導型一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ） もしくは生物学的に活性な断片又はその誘導体をコードするｃＤＮＡクローンは 、一酸化窒素により効果がもたらされる疾患をいくつでも治療する遺伝子治療技 術、 すなわちこれらにのみ限定されるわけではないが、（１）アテローム性動脈硬化 に付随する血管閉塞性疾患、（２）血栓症、内膜肥厚、あるいはアテローム性動 脈硬化に起因する血管導管閉塞の阻止、（３）若年における心筋梗塞、腎不全、 発作、失明、及び肢の喪失の高率の発症を結果として招く糖尿病に付随する進行 した血管閉塞性疾患の治療、（４）癌治療、特に腫瘍内部及び周辺における局所 的な一酸化窒素濃度を高める抗腫瘍剤としての治療、及び（５）種々の微生物感 染の治療を含む治療に用いられるであろう。 前の段落に開示された治療（１）、（２）及び（３）（ここでは血管疾患又は 血管障害という）については、標的細胞におけるｉＮＯＳの局所的な組織特異的 発現の結果、発現領域内で有効な量の一酸化窒素が産生され、そのため最大限の 局所的な血管拡張が増進され、局所的な血栓症が阻止され、局所的な平滑筋の細 胞増殖が遅延させられる可能性がある。これらはすべてアテローム性動脈硬化症 の過程を阻止するかもしれない。誘導型のＮＯＳ、好ましくはヒトｉＮＯＳをコ ードする核酸配列はいずれも、組織源に関係なく、例えばアテローム性動脈硬化 に付随する血管閉塞性の合併症、血管バイパス、及び糖尿病に起因する血管疾患 の吻合箇所の遺伝子治療に利用される候補の１つであることを、当業者は理解す るだろう。さらに、生物学的に活性な形態のｉＮＯＳ、好ましくはヒト型ｉＮＯ Ｓをコードする核酸配列はいずれも本願発明に使用し得ることを当業者は理解す るだろう。この配列は、生物学的に活性なタンパク質断片又はその誘導体をコー ドするゲノミックもしくはｃＤＮＡ配列又はそれらの断片を含むが、それらに限 定されるわけではない。 本発明は、動脈管内腔の内層、すなわち内皮細胞及び血管平滑筋細胞を含む哺 乳動物の細胞集団をターゲッティングすることを通して、局所的ｉＮＯＳ活性、 したがって一酸化窒素濃度を増大させることによって血管疾患又は血管障害を治 療することを開示する。より具体的には、標的とする哺乳動物細胞は、（１）イ ンビトロで培養された内皮細胞及び（２）インビトロで培養された血管平滑筋細 胞であってよいが、必ずしもそれらに限定はされない。これらの細胞に、ｉＮＯ Ｓもしくは生物学的に活性な断片又はその誘導体をコードするＤＮＡ配列を形質 導入し、またそれに続いて患者の動脈管内に細胞を再生着させるために使用する ことができる。罹患した血管に再生着させるためか、或いは合成又は自己移植片 を植えつけるために、ｉＮＯＳを発現する内皮細胞、血管平滑筋細胞、又は両方 を組み合わせて使用することもまた本発明の範囲内である。 患者から得られた内皮及び／又は平滑筋細胞を使用することが好ましく、これ らの細胞は当業者にとって公知の方法をいくつでも用いて単離し培養することが できる。これらの動脈内腔細胞の直接源は、例えば患者から伏在静脈又は他の採 取可能な静脈あるいは動脈の一部を採取することによって得ることができる。ｉ ＮＯＳの感染又はトランスフェクション工程に先立つインビトロでの培養のため の標的細胞源材料を得るこのやり方は、患者へ導入するための合成又は自己の移 植片の植えつけにおいて特に有用であろう。 本発明の別の態様においては、内皮細胞、血管平滑筋細胞、又はその両方の組 み合わせが、動脈管の選ばれた部分内での局所的なｉＮＯＳ発現の増加を促進す るための、ｉＮＯＳもしくは生物学的に活性な断片又はその誘導体をコードする ＤＮＡ配列の原位置での感染又はトランスフェクション用に標的とされる。 当業者は、インビトロでの内皮細胞及び血管平滑筋細胞のトランスフェクショ ン又は感染において類似の手法を利用し得ることを理解するだろう。内皮細胞及 び血管平滑筋細胞の両方をin situ 法によって、同時に感染させてもよい。この 方法として、実施例第１３．１．２項に概述する方法が例示されるがこれに限定 されるわけではない。 ｉＮＯＳに基づく遺伝子治療のために罹患血管を調製し、またｉＮＯＳをコー ドするＤＮＡ配列を治療目標の導管領域に送達するために、血管系外科熟練医が 利用し得る１以上の血管内の工程を使用できることも理解されるだろう。このよ うな手法としては、必ずしもこれらに限定されるわけではないが、バルーン血管 形成術、レーザー補助バルーン血管形成術、ダブルバルーンカテーテル法、機械 的動脈内膜切除術、及び血管内視鏡検査が含まれ、これらは単独でも組み合わせ てもよい。 外科的修復部位又は合成移植片内での局所的なｉＮＯＳ発現の遺伝子治療に基 づく増加を促進するために、この明細書中でさらに開示される方法の組み合わせ を、外科的血管バイパス法と共に使用し得ることもまた当業者には理解されるだ ろう。 血管疾患の遺伝子治療のための、インビトロで培養した内皮細胞、血管平滑筋 細胞、又は両方の組み合わせのターゲッティングについての特別な態様では、組 織特異的に送達し且つ発現させるための準備として、ｉＮＯＳ又はその生物学的 に活性な断片をコードするＤＮＡ配列をウイルスベクターに連結する。本発明で 用いられるウイルスベクター系としては、（ａ）限定はないが、Ｍａｌｏｎｅｙ マウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ゲノム由来のベクターを含むレトロウイル スベクター、（ｂ）アデノ随伴ベクター、（ｃ）アデノウイルスベクター、（Ａ ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター、（ｅ）ＳＶ４０ベクター、（ｆ）ポリオー マウイルスベクター、（ｇ）パピローマウイルスベクター、（ｈ）ピコルナウイ ルスベクター及び（ｉ）種痘ウイルスベクターを含むが、これらに限定されない 。 当業者が、血管疾患の遺伝子治療のために内皮細胞、血管平滑筋細胞又はそれ らの組み合わせにターゲッティングする際に、単独で、あるいはウイルスベクタ ーと組み合わせて使用し得る付加的方策には、（ａ）リポソームを介する形質転 換、（ｂ）リン酸カルシウム［Ｃａ₃（ＰＯ₄）₂］を介する細胞のトランスフェ クション、（ｃ）エレクトロポーレーションによる標的細胞のインビトロトラン スフェクション、（ｄ）ＤＥＡＥ−デキストランを介する細胞のトランスフェク ションと次いで哺乳動物宿主に再生着させるために利用されるインビトロでトラ ンスフェクトされた該細胞、（ｅ）ポリブレンを介する送達、（ｆ）プロトプラ スト融合、（ｇ）マイクロインジェクション、（ｈ）ポリリジンを介する形質転 換及び（ｉ）裸のＤＮＡの直接インジェクションを含むが、それらに限定されな い。これらの方策のいずれかにより作り出された遺伝的に形質転換された細胞は 、次いで哺乳動物宿主に再生着させるために使用される。 血管疾患の治療に関する特別の態様においては、動脈管内に再生着させるため の哺乳動物の内皮細胞、血管平滑筋細胞又は両方の組み合わせを、感染させるの に使用される、ｉＮＯＳもしくは生物学的に活性な断片又は誘導体をコードする ＤＮＡ配列を含む組換えウイルスベクターは、組換えレトロウイルスベクターで ある。それぞれのｉＮＯＳのＤＮＡ配列はレトロウイルスベクター内に連結され てレトロウイルス−ｉＮＯＳ組換え体構築物を形成する。 血管疾患の治療に関する好ましい態様では、適当なレトロウイルスベクター中 でサブクローニングされたｉＮＯＳ配列はヒトｉＮＯＳ配列である。 血管疾患の遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用に関するさらに 好ましい態様では、組換えレトロウイルスベクターはＭｏＭＬＶ−ｉＮＯＳ構築 物である。このｉＮＯＳを含むレトロウイルス構築物は、ｉＮＯＳもしくは生物 学的に活性な断片又はその誘導体をコードするヒトＤＮＡ配列を含有する。 血管疾患の遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用に関する好まし い態様では、ＭｏＭＬＶ−ｉＮＯＳ構造は、図６及び図７に示されるＭＦＧ−ｉ ＮＯＳである。このＭＦＧ−ｉＮＯＳ構築物は標的細胞の原位置での感染にとっ て好ましい。 血管疾患の遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用に関する別の好 ましい態様では、ＭｏＭＬＶ−ｉＮＯＳ構築物は、図６及び図８に示されるＤＦ Ｇ−ｉＮＯＳ−Ｎｅｏである。このＤＦＧ−ｉＮＯＳ−Ｎｅｏ構築物は、内皮細 胞又は血管平滑筋細胞のインビトロでの感染にとって好ましい。 次いで、上記のレトロウイルス−ｉＮＯＳ組換え体構築物のいずれかを標準的 なレトロウイルスパッケージング細胞系に転移する。そして回収された組換えウ イルス粒子を、培養された内皮細胞又は血管平滑筋細胞にインビトロで感染させ るのに使用する。血管疾患の治療はさらに、インビトロで形質導入あるいは感染 された内皮細胞、血管平滑筋細胞、又は両方の組み合わせを、患者内の罹患した 動脈の特異的部分に転移することに基づいている。感染した内皮細胞、血管平滑 筋、又は両方の組み合わせを送達する好ましいやり方として、バルーン血管形成 術法、動脈内膜切除術又は外科的血管バイパスの後によくみられる、その内皮細 胞の内壁から部分的又は全体的に剥離した、哺乳動物宿主の動脈の部分を単離す るために用いられるダブルバルーンカテーテルを用いる。 ｉＮＯＳ又はその生物学的に活性な断片をコードするＤＮＡ配列を、インビト ロで内皮細胞又は血管平滑筋細胞にウイルスを介して感染させるか、又はベクタ ーを介してトランスフェクトするのは、上述したレトロウイルスベクター以外の 、多くの無生物的及び／又は生物的担体によっても達成できる。それ故、ｉＮＯ Ｓを治療又は予防上のレベルで発現するように局所的な標的に、ｉＮＯＳをコー ドするＤＮＡ配列を送達する能力を有する無生物的及び／又は生物的担体であれ ばいずれも、本発明を実施する際に使用することができる。 例えば、本発明の付加的な態様では、ｉＮＯＳ又はその生物学的に活性な断片 をコードするＤＮＡ配列をアデノウイルスベクター（Ａｄ）中にサブクローニン グしてもよい。この組換えＡｄ−ｉＮＯＳ構築物は、インビトロで培養された内 皮細胞、血管平滑筋細胞又はそれらの組み合わせを直接感染させるために使用す ることができるし、あるいは、リポソームのマイクロカプセルと連携して標的細 胞へと送達させることもできる。 本発明の別の態様は、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）中にサブクロー ニングすることができる、ｉＮＯＳ又はその生物学的に活性な断片をコードする ＤＮＡ配列を包含する。Ａｄ−ｉＮＯＳ構築物の場合と同様に、組換えＡＡＶ− ｉＮＯＳ構築物はインビトロで培養された内皮細胞、血管平滑筋細胞又はそれら の組み合わせを直接感染させるために使用することができ、あるいは、リポソー ムの微小被膜と連携して標的細胞へと送達させることもできる。 血管疾患を治療するために、組換えｉＮＯＳ構築物を送達する、リポソームを 介した技術の使用に関するさらなる態様においては、ｉＮＯＳをコードするＤＮ Ａ配列を含むウイルス又は非ウイルス性ベクターが、リポフェクタミンのトラン スフェクションによって標的細胞へと送達される。例えば、ｉＮＯＳ又はその生 物学的に活性な断片をコードするＤＮＡ配列は、標的細胞のトランスフェクショ ンに続いてｉＮＯＳを発現するように、ＤＮＡプラスミドベクター中にサブクロ ーニングされる。このような非ウイルスを基礎とする哺乳類ベクターとしては、 プラスミドＤＮＡ哺乳類発現ベクターが含まれるが、それのみに限定はされない 。ｉＮＯＳの発現を正に制御することが知られている、当業者が使用し得る真核 生物のプロモーター及び／又はエンハンサー配列はいずれも、哺乳類発現ベクタ ー構築物に使用できる。このような配列としては、サイトメガロウイルス（ＣＭ Ｖ）プロモーター、ラウス肉腫（ＲＳＶ）プロモーター、マウス白血病（ＭＬＶ ）プロモーター、ＨＳＶ−ｔｋのような単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモ ーター、β−アクチンプロモーター、並びに対象となる標的細胞又は組織におけ る発現を誘導するあらゆる付加的な組織特異的又はシグナル特異的調節配列が含 まれるが、それらに限定はされない。シグナル特異的プロモーター断片としては ＴＮＦに応答するプロモーター断片がふくまれるが、それに限定されない。 このような１つの態様においては、ヒトｉＮＯＳをコードするＤＮＡ配列を、 ＤＮＡプラスミド発現ベクターであるｐＣＩＳ（ジェネンテック）中にサブクロ ーニングしてｐＣＩＳ−ｉＮＯＳとする。ｐＣＩＳは標準的な哺乳類発現ベクタ ーであり、大腸菌中で増殖するための抗生物質耐性遺伝子と哺乳動物細胞中で活 性なＣＭＶプロモーターを含む。多数の源から入手できる構成要素を用いて当業 者が構築できるこのような構築物は、標的細胞のトランスフェクションに続いて ＣＭＶプロモーターの下流領域に結合したｉＮＯＳのＤＮＡ断片の発現を誘導す る。より具体的には、ヒトｉＮＯＳコード領域を含むＮｏｔＩ／ＸｈｏＩ制限断 片がｐＨＩＮＯＳ（ｐＨＩＮＯＳは寄託番号７５３５８で、ＡＴＣＣに寄託され ている。）から作られて単離され、ＮｏｔＩ／ＸｈｏＩで消化されたｐＣＩＳ中 に連結される。あるいは、ヒトｉＮＯＳの発現が標的細胞中で誘導され得るよう に、単離されたヒトｉＮＯＳ配列を、野性型のヒトｉＮＯＳプロモーター配列の いずれかの部分に融合させてもよい。。 インビトロで培養された内皮細胞、血管平滑筋又はそれらの組み合わせを感染 又はトランスフェクトするのに使用する、上述したウイルス又は非ウイルス性組 換えｉＮＯＳ構築物は、いずれも標的細胞を原位置で感染又はトランスフェクト するために使用してもよいことが、本明細書を検討することにより当業者に明ら かになるであろう。例えば、バルーン血管形成術は、動脈内腔を再建するために 、罹患した動脈の閉塞した部分を拡張するのに利用できる。次いで、この拡張さ れた部分をバルーンカテーテルを挿入することによって動脈の残りの部分から分 離する。ウイルス又は非ウイルスを基礎とする組換えｉＮＯＳ構築物を、カテー テルを通じて選択的に血管形成術領域に送達させ、そのようにして罹患した血管 部分内での付随するｉＮＯＳの発現の局所的増加を伴う内皮及び／又は血管平滑 筋細胞の原位置でのトランスフェクション又は感染を促進することができる。 本発明はまた、癌患者における抗腫瘍効果を増進するヒトｉＮＯＳに従う遺伝 子治療の方法を開示する。このようなヒトｉＮＯＳ指示的遺伝子治療は、治療す べき腫瘍領域内の一酸化窒素濃度の局所増加をもたらし、したがって一酸化窒素 レベルの全身的な増加なしに抗腫瘍活性を増進させるだろう。ｉＮＯＳ介在型治 療について開示したように、ｉＮＯＳもしくは生物学的に活性な断片又はその誘 導体をコードするヒト由来ＤＮＡ配列が好ましい。 単離されたヒトｉＮＯＳのＤＮＡ配列は、セクション５．２．１で述べられて いるウイルス的及び非ウイルス的方法のうちのいずれかの方法を用いた形質導入 によって操作され、インビトロで標的細胞へ送達され得る。次いで、腫瘍領域で の局所的なｉＮＯＳ発現を増進するために、インビトロで形質導入された標的細 胞が患者に導入される。それ故、生物学的に活性な断片又はその誘導体をコード するヒトｉＮＯＳのＤＮＡ配列は、組織源に関係なく、いずれも抗腫瘍治療の候 補となることが理解されよう。 癌遺伝子治療に関する態様の１つでは、インビトロで形質導入された標的細胞 を患者に静脈内注射する。形質導入された標的細胞としては、患者から採取した 腫瘍浸潤リンパ球又は培養腫瘍細胞を含むが、それらに限定はされない。 対象となる標的細胞へヒトｉＮＯＳ配列を送達する好ましい方法においては、 腫瘍浸潤リンパ球を感染させるために、ｉＮＯＳ又はその生物学的に活性な断片 をコードするＤＮＡ配列を含む組換えレトロウイルスベクターを使用する。そし て腫瘍領域におけるｉＮＯＳの局所的な発現を増進するために、これらの感染し た腫瘍浸潤リンパ球を患者に再導入する。 癌の遺伝子治療に関する好ましい態様においては、患者から採取した腫瘍浸潤 リンパ球又は培養腫瘍細胞を感染させるために、ＤＦＧ−ｉＮＯＳ−Ｎｅｏ（図 ８）を使用する。ネオマイシン耐性細胞を選択し、次いでこれらのｉＮＯＳを発 現する細胞を、活発な腫瘍の内部又は周囲に局在化させる。 上述した、標的細胞を感染させるためのウイルスベクターの使用に加えて、本 明細書中に記載された公知の非ウイルスベクターのいずれもが、抗腫瘍活性を増 強するために使用できる。 本発明のヒトｉＮＯＳのＤＮＡ配列は、微生物感染の治療にも利用することが できる。特に、ｉＮＯＳ作動性抗微生物治療は、一酸化窒素濃度の上昇に対し感 受性の高いことが知られている微生物を処置するために使用する。例えば、一酸 化窒素は、マイコバクテリア、蠕虫、真菌、原生動物、及びＤＮＡウイルスに対 しての細胞毒性効果を有する分子として知られている。従って、本発明は、疾患 を克服するために治療的なレベル及び期間で発現され得るｉＮＯＳ活性、好まし くはヒトｉＮＯＳをコードするＤＮＡ配列を、感染細胞又は組織種にターゲッテ ィングすることにより、感染部位での一酸化窒素濃度を局所的に上昇させる方法 を開示する。 ｉＮＯＳ作動性抗微生物治療を用いる好ましい態様においては、標的細胞種は 、マラリアの原因であるプラスモディウム属胞子虫に感染したヒト肝細胞である 。ヒトマラリアは４種のプラスモディウム：熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリ ア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫のうち１つにより引き起こされ る。 ｉＮＯＳ−抗微生物治療によるマラリア治療の好ましい態様においては、標的 肝細胞のリポソームを介した形質転換によりｉＮＯＳ−ベクターを送達する。 ｉＮＯＳ−抗微生物治療によるマラリア治療の特に好ましい態様においては、 患者への投与に先立ってリポソーム膜に肝細胞特異的アシアロタンパク質を挿入 することによりリポソームを改変する。 抗微生物治療でｉＮＯＳ−ベクターを使用する別の態様は、結核及びハンセン 病を含むがそれらに限定されない、肺に生じる微生物感染の治療を含む。 ｉＮＯＳ−抗微生物治療による結核の好ましい治療は、標的組織内部の細胞を ウイルスを介して形質転換することにより、標的組織へｉＮＯＳベクターをター ゲッティングすることを含む。 ｉＮＯＳ−抗微生物治療により結核を治療する好ましい方法は、感染部位への アデノウイルスを介した送達である。 ｉＮＯＳ作動性の生物学的治療により結核を治療する別の好ましい方法は、セ クション５．２．１．で述べるレトロウイルスを介した送達である。結核を治療 するために、セクション５．２．１．及び５．２．２．に開示されているｉＮＯ Ｓを基礎とするベクターもまたレトロウイルスを介した送達技術に使用すること ができる。 本明細書によれば、結核の治療に用いるために選択される送達系に合ったｉＮ ＯＳベクターを構築することは、当業者の技術範囲内のことである。 肺組織の感染領域内部にｉＮＯＳ感染レトロウイルスを投与する好ましい方法 は、エアロゾル噴霧の形態の吸入投与である。 本発明の別の態様は、ハンセン病の原因であるらい菌の処置に関する。遺伝子 治療によるハンセン病の治療の好ましい態様は、吸入投与による標的組織の細胞 種のレトロウイルスを介した形質導入を伴う。 本発明の目的は、ヒト組織における誘導型一酸化窒素シンターゼの分子クロー ニング及び特性付けを提供することである。 本発明の目的は、ヒト肝細胞由来の誘導型一酸化窒素シンターゼの分子クロー ニング及び特性付けを提供することである。 本発明の目的は、ヒト組織誘導型一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡクローンを 単離することである。 本発明の目的は、ヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡクローン を単離することである。 本発明の目的は、ヒト組織誘導型一酸化窒素シンターゼ酵素の発現及び精製の 方法を提供することである。 本発明の目的は、ヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼ酵素の発現及び精製 の方法を提供することである。 本発明の目的は、ヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼ酵素の遺伝子発現調 節を提供することである。 本発明の目的は、ヒト誘導型一酸化窒素シンターゼを含有し、実質的に他のヒ トタンパク質を含まないタンパク質を提供することである。 本発明の目的は、ｉＮＯＳ又はその生物学的に活性な断片を発現するトランス フェクトされた内皮細胞、血管平滑筋、又は両方を組み合わせて、患者の罹患し た血管、血管導管、又はその内皮細胞の内壁が部分的又は全体的に剥離した血管 に提供することによって、血管の遺伝子治療を促進し、限定はされないが、アテ ローム性動脈硬化、血管バイパス、及び糖尿病に付随する血管閉塞性疾患を含む 血管疾患を予防的及び治療的に緩和することである。 本発明の目的は、腫瘍成長を抑制するためにｉＮＯＳ作動性遺伝子治療技術を 用いて局所的な一酸化窒素濃度を上昇させる、腫瘍成長の治療処置を提供するこ とである。 本発明の目的は、ｉＮＯＳ作動性遺伝子治療技術を用いて、感染、特に本明細 書に記載される種々の肺及び肝臓の感染の部位又はその周囲における局所的な一 酸化窒素濃度を上昇させることにより、攻撃に弱い種々の微生物の感染を治療的 に緩和することである。 本発明のこれらの及び他の目的は、以下の本発明の記載、図面、配列表、及び ここに付された特許請求の範囲からより十分に理解されるだろう。 ３．１．定義 下に挙げ言葉は、本明細書中では以下のものを意味する。 ｍＲＮＡ− メッセンジャーＲＮＡ ＤＮＡ − デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ− 相補的デオキシリボ核酸 ＮＯ − 一酸化窒素 ＮＯＳ − 一酸化窒素シンターゼ ｃＮＯＳ− 構成型一酸化窒素シンターゼ ｉＮＯＳ− 誘導型一酸化窒素シンターゼ ＥＤＲＦ− 内皮由来弛緩因子 ＬＰＳ − リポ多糖 ＣＭＶ − サイトメガロウイルス Ａｄ − アデノウイルス ＡＡＶ − アデノ随伴ウイルス ＩＲＥＳ− 内部リボゾーム導入部位 ＰＴＦＥ− ポリテトラフルオロエチレン ここにおいて、「患者」という語は、人間を含むがそれに限定されない、動物 界のメンバーを意味する。 ここにおいて、「哺乳動物宿主」という語は、人間を含むがそれに限定はされ ない、哺乳動物を意味する。 ここにおいて、「生物学的に活性な断片又はその誘導体」という語は、野性型 ｉＮＯＳと類似の生物学的活性を持つｉＮＯＳタンパク質断片、又は野性型ｉＮ ＯＳと類似の生物学的活性を維持しているｉＮＯＳの置換、付加、及び／又は欠 失突然変異体のような誘導体を含む。当業者は、ここで開示されている遺伝子治 療の応用に有用であるために必要な生物学的活性を保持している野性型ｉＮＯＳ の変異体を発現する目的で、野性型ｉＮＯＳ ＤＮＡ配列にそのような変化を生 じさせるのに本明細書を使用し得る。 ４．図面の簡単な説明 図１Ａ〜Ｇはヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡクローンのｃ ＤＮＡセンス配列（各横列の上段；配列番号１）及びアミノ酸１〜１１５３のア ミノ酸配列（各横列の下段；配列番号１及び２）を示している。 図２はヒト肝細胞（ＨＣ）一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡと交差ハイブリダイ ズするマウスマクロファージＮＯＳ ｃＤＮＡのノザンブロットを示している。 図３は３つの別々のヒト肝臓試料から単離された誘導型一酸化窒素シンターゼ ｍＲＮＡの、マウスマクロファージｃＤＮＡを用いたノザンブロットを示してい る。 図４はヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡクローンを単離する ためのｃＤＮＡライブラリーの構築に使用される、２つの別々のヒト肝臓試料か ら精製されたポリ（Ａ）ｍＲＮＡのノザンブロットを示している。 図５はサイトカイン及びＬＰＳ刺激に続くヒト一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡ の誘導の経時変化を示す、ヒト肝細胞から単離されたｃＤＮＡを用いたノザンブ ロットを示している。 図６は本明細書を通して開示される疾患又は障害を治療するための遺伝子治療 の応用を例示するのに利用されるＭＦＧ−ｉＮＯＳ及びＤＦＧ−ｉＮＯＳ−Ｎｅ ｏ組換えレトロウイルスベクターを示している。Ｎｅｏ^rはネオマイシンに対す る耐性をコードする；ＩＲＥＳ断片は多シストロン性のｍＲＮＡの翻訳をもたら す；ＬＴＲはＭｏＭＬＶゲノムの長い末端反復配列である；ｉＮＯＳはヒト肝細 胞ｉＮＯＳをコードするｃＤＮＡである。 図７は本明細書を通して開示される種々の遺伝子治療の応用を例示するために 利用される組換えレトロウイルスベクターであるＭＦＧ−ｉＮＯＳを構築するの に用いられる詳細な方法を示している。 図８は本明細書を通して開示される種々の遺伝子治療の応用を例示するために 利用される組換えレトロウイルスベクターであるＤＦＧ−ｉＮＯＳ−Ｎｅｏを構 築するのに用いられる詳細な方法を示している。 図９はｉＮＯＳ阻害剤であるＮ^G−モノメチルアルギニンの非存在下及び存在 下での、ＭＦＧ−ｉＮＯＳ、ＭＦＧ−ｌａｃＺを感染させた培養内皮細胞及び非 感染細胞における亜硝酸塩の産生を示している。 図１０はｉＮＯＳ阻害剤であるＮ^G−モノメチルアルギニンの非存在下及び存 在下での、ＤＦＦ−ｉＮＯＳ−Ｎｅｏ、ＭＦＧ−ｌａｃＺを感染させた培養内皮 細胞及び非感染細胞における亜硝酸塩の産生を示している。 図１１はＮ^G−モノメチルアルギニン、ｐＳＶ−ｌａｃＺ及びリポソームを添 加した場合あるいはしない場合の無ブラスミド対照の非存在下及び存在下での、 ｐＣＩＳ−ｉＮＯＳのリポフェクタミン トランスフェクション後の血管平滑筋 細胞における亜硝酸塩の産生を示している。 ５．発明の詳細な説明 一酸化窒素はアミノ酸、Ｌ−アルギニンから誘導される生体媒介物質である。 一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）は、シトルリンが余剰のＬ−アルギニン分子か ら形成される際、Ｌ−アルギニンに作用してグアニジノ窒素の１つを一酸化窒素 にまで酸化する。一酸化窒素が通常生理的な細胞内外の調節的機能を有すること は当業者に理解されているとはいえ、一酸化窒素の過剰生産は有害にも有益にも 成り得る。ヒト組織誘導型一酸化窒素シンターゼの容易に入手可能な他の源がな いことは当業者に認識されよう。本発明はヒト組織誘導型一酸化窒素シンターゼ のｃＤＮＡクローン及びその調製方法を提供する。したがって、本発明のヒト組 織一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡをクローニングして発現させることにより、一 酸化窒素シンターゼの選択的阻害物質を開発するための酵素源が得られることに なる。また、本発明は、アテローム性動脈硬化、血管のバイパス及び糖尿病に伴 う血管閉塞疾患、癌に伴う腫瘍細胞の増殖、並びに微生物感染のような疾患又は 障害を治療して緩和するための、ヒトｉＮＯＳのＤＮＡ配列を利用した遺伝子治 療技術に関する。 本発明のヒト組織一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡをクローニングして発現させ ることによって、治療効果を与えるに十分高濃度の酵素源が得られることになる 。 ５．１．ヒト誘導型一酸化窒素シンターゼをコードするｃＤＮＡクローンの 単離及び特性解析 本発明の１つの態様において、ヒト組織誘導型一酸化窒素シンターゼをコード するｃＤＮＡクローンの調製方法が提供される。この方法は、生体外でのヒト組 織一酸化窒素シンターゼの発現誘導、ヒト組織誘導型一酸化窒素シンターゼメッ センジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とハイブリッド形成し得る交差種ｃＤＮＡプロー ブを用いることによるヒト組織一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡの存在の確認、ヒ ト組織一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡを含んだヒト組織ポリ（Ａ）ｍＲＮＡの回 収、逆転写酵素を用いたヒト組織ポリ（Ａ）ｍＲＮＡ由来ｃＤＮＡライブラリー の構築及び一本鎖ｃＤＮＡのファージベクターへの挿入、ヒト組織誘導型一酸化 窒素シンターゼクローンについての交差種ｉＮＯＳ ｃＤＮＡプローブによる該 ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、該ｃＤＮＡを含むファージベクターを 細菌とインキュベートしてヒト組織誘導型一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡクロ ーンを含む少なくとも１つの陽性プラークを形成させること、ヘルパーファージ を用いてのファージベクターからの該ｃＤＮＡクローンのレスキュー、並びに該 ｃＤＮＡをプラスミドベクターに変換してヒト組織誘導型一酸化窒素シンターゼ をコードする全長ｃＤＮＡクローンを取得することを包含する。 本発明の別の態様においては、前述のように、この方法は、さらに該プラスミ ドベクターから該ヒト組織誘導型一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡインサートを 切り出すことを包む。また、この方法はジデオキシヌクレオチドＤＮＡ配列決定 法を用いて該ｃＤＮＡインサートを確認することを含む。さらに、この方法はマ ウスマクロファージｉＮＯＳ由来の交差種ｃＤＮＡとのサザンブロットハイブリ ダイゼーションを用いて該ｃＤＮＡインサートを確認することを含む。 本発明のもう１つの態様においては、前述のように、この方法は、例えば細菌 の発現系又は哺乳動物の発現系のような発現系においてヒト組織誘導型一酸化窒 素シンターゼｃＤＮＡをタンパク質に発現させることを含む。 当業者は、ここに記載された方法を通して得られるヒト組織誘導型一酸化窒素 シンターゼｃＤＮＡは好適なプロモーター及び適当な転写調節因子を含む発現ベ クターに分子クローニングし、それを原核又は真核の宿主細胞に移入して組換え 誘導型一酸化窒素シンターゼを生産させることにより組換え発現するであろうと 正しく認識するだろう。このような操作に関する技術はManiatisら，上述，に十 分に記載されており、当技術分野において周知のものである。 ここでは、発現ベクターとは、適当な宿主中での遺伝子のクローン化されたコ ピーの転写及びそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列と定義される。この ようなベクターは、例えば細菌、ラン藻、植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞のよ うな様々な宿主中で真核遺伝子を発現させるのに使用できる。 特別に設計されたベクターでは、細菌−酵母又は細菌−動物細胞間でＤＮＡを 往復させることができる。適切に構築された発現ベクターは、宿主細胞中で自律 的に複製するための複製起点、選択マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位 、多コピー数になり得るコピー及び活性なプロモーターを含むはずである。プロ モーターは、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡへ結合してｍＲＮＡの合成を開始する ように指図するＤＮＡとして定義される。強力なプロモーターとはｍＲＮＡを高 頻度で開始させるプロモーターのことである。ｍＲＮＡは、特に制限はないが、 クローニングベクター、改変されたクローニングベクター、特別に設計されたプ ラスミド又はウイルスを含んでもよい。様々な哺乳動物発現ベクターを、哺乳動 物細胞中で組換え誘導型一酸化窒素シンターゼを発現させるのに用いることがで きる。 組換え誘導型一酸化窒素シンターゼの発現に好適と考えられる市販されている 細菌発現ベクターとしては、特に制限はないが、ｐＫＣ３０（ＡＴＣＣ ３７２ ８６）、ｐＰＬａ２３１１（ＡＴＣＣ ３１６９４）、ｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３１３４４及び３７０１７）、ｐｔａｃ１２（ＡＴＣＣ ３７１３８）、λｇｔ １１（ＡＴＣＣ ３７１９４）、ｐＡＳ１（ＡＴＣＣ ３９２６２）、ｐＬＣ２ ４、ｐＳＢ２２６、ＳＶ４０及びｐＫＫ２２３−３が含まれる。 組換え誘導型一酸化窒素シンターゼの発現に好適と考えられる市販されている 哺乳動物発現ベクターとしては、特に制限はないが、ｐＢＣ１２Ｂ１（ＡＴＣＣ ６７６１７）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（ストラタジーン）、ｐＸＴＩ（ストラタジーン ）、ｐＳＧ５（ストラタジーン）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７ ５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−Ｍ ＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴ ＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈ ｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ ３７４６０）及びλ ＺＤ３５（ＡＴＣＣ ３７５６５）が含まれる。 誘導型一酸化窒素シンターゼをコードするＤＮＡはまた、組換え体宿主細胞中 で発現させるための発現ベクターにクローニングしてもよい。組換え体宿主細胞 としては、原核もしくは真核生物であってもよく、特に制限はないが、細菌、酵 母、限定はされないがヒト、ウシ、ブタ、サル及び齧歯類起源の細胞系を含む哺 乳動物細胞、並びに限定はされないがショウジョウバエ由来の細胞系を含む昆虫 細胞が包含される。好適と考えられる市販されている哺乳動物種より誘導された 細胞系としては、特に制限はないが、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）、ＣＯ Ｓ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１ ）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ９２） 、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ Ｃ ＣＬ２６）及びＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１７１）が含まれる。組換え蛋白 質の発現用に最もよく用いられる細菌細胞は大腸菌である。様々な大腸菌株が入 手可能で当技術分野において周知である。 該発現ベクターは、制限はないが形質転換、トランスフェクション、感染、プ ロトプラスト融合及びエレクトロポーレーションを含む数多くの技術のいずれか のものによって宿主細胞に導入してもよい。 本発明の好適な態様においては、前述のように、該方法はヒト組織誘導型一酸 化窒素シンターゼタンパク質をバキュロウイルス発現系にて発現させることを含 む。 本発明の別の態様においては、前述のように、ヒト組織誘導型一酸化窒素シン ターゼタンパク質を精製することを含む該方法が提供される。 本発明の好適な態様においては、前述のように、該方法はヒト組織誘導型一酸 化窒素シンターゼとしてヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼを用いることを 含む。この方法は、さらにヒト組織誘導型一酸化窒素シンターゼタンパク質とし てヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼタンパク質を用いることを含む。 本発明の別の態様においては、前述のように、生体外で以下のうちの少なくと も１つでヒト組織を刺激することによって生体外でヒト組織一酸化窒素シンター ゼを誘導することを含む方法が提供される。すなわち、（１）少なくとも１つの サイトカイン、例えば、組織壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン−１（ＩＬ −１）及びインターフェロンγ（ＩＦＮ−ｇ）からなる群より選択されるサイト カイン、（２）例えば、細菌のリポ多糖等を含む細菌のエンドトキシンの少なく とも１つ、及び（３）それらの組み合わせ、である。 本発明のさらに好適な態様においては、前述のように、ヒト組織ｉＮＯＳｍＲ ＮＡを含むヒト組織ポリ（Ａ）ｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡライブ ラリーを構築し、少なくとも約１，０００塩基対の長さを有するｃＤＮＡ鎖をフ ァージベクター中に挿入することを含む方法が提供される。さらにまた、別の好 適な態様においては、前述のように、該ファージベクターとしてλＺａｐIIを用 いることを含む方法が提供される。 本発明のもう１つの態様において、前述のように、該ファージベクター細菌と ともに約３４〜４０℃の温度で約６〜２４時間インキュベートしてファージに細 菌を溶解させることにより、該ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすること を含む方法が提供される。この方法はさらに、例えば、ＥｘＡｓｓｉｓｔヘルパ ーファージ（ストラタジーン，ラ・ホラ(LaJolla)，カリフォルニア）のような ヘルパーファージを用いて、該ファージベクターから該ｃＤＮＡクローンをレス キューすることを含む。 本発明の好適な態様において、前述のように、レスキューされたｃＤＮＡクロ ーンをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン，ラ・ホラ(LaJolla)，カリフ ォルニア）を含むプラスミドベクターに変換して、ヒト組織誘導型一酸化窒素シ ンターゼコードする全長ｃＤＮＡを取得することを含む方法が提供される。 本発明の別の好適な態様において、前述のように、ヒト組織誘導型一酸化窒素 シンターゼとして、ヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼを用いることを含む 方法が提供される。 本発明の別の態様において、好適な宿主中でヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シン ターゼをコードするＤＮＡ配列を発現し得る複製可能なＤＮＡ発現ベクターを用 意し、該宿主を形質転換して組換え体宿主を得、ヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シ ンターゼタンパク質を用意するための該ＤＮＡ配列の発現が可能な条件下で、該 組換え体宿主を維持することを含むヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼタン パク質の製造方法が提供される。 本発明の別の態様は、ヒト組織誘導型一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡクローン を提供する。本発明の好適な態様は、ヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼｃ ＤＮＡクローンを提供する。本発明のヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼは 、図１Ａ〜Ｇに示されるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを有する。図１Ａ〜 Ｇは本発明のヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡクローンについ て、該ｃＤＮＡのセンス配列（各横列の上段；配列番号：１）及び導かれるアミ ノ酸１〜１１５３のアミノ酸配列（各横列の下段；配列番号：１及び２）を示し ている。図１Ａ〜Ｇより、本発明の本発明のヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンタ ーゼのｃＤＮＡ配列は４，１４５ヌクレオチド（塩基）の長さで、塩基番号２０ ７に開始コドンの始まりを、また、塩基番号３６６８に終始コドンの終わりを有 することがわかる。ｃＤＮＡ二本鎖の配列は、Genesis 2000 シーケンスシステ ム（ ＵＳＢ，クリーブランド，オハイオ）でサンガー・ジデオキシヌクレオチド配列 決定技術（Sangerら，1977，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 74: 5463-5467）を用 いて決定した。 本発明の別の態様は、ヒト組織誘導型一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡクローン より発現するヒト組織誘導型一酸化窒素シンターゼ組換えタンパク質を提供する 。好ましい態様においては、ヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡク ローンより発現するヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼ組換えタンパク質が 提供される。 本発明の別の態様は、実質的に他のヒトタンパク質が無いヒト誘導型一酸化窒 素シンターゼを含むタンパク質を提供する。 本発明の別の態様は、本質的に転写読み取り枠の上流で且つそれに隣接して位 置する開始コドンとヒト誘導型一酸化窒素シンターゼをコードするＤＮＡ配列と からなる単離されたヒト誘導型一酸化窒素シンターゼをコードするＤＮＡ配列を 提供する。 本発明のさらなる態様は、本質的に転写読み取り枠の上流で且つそれに隣接し て位置する開始コドンとヒト誘導型一酸化窒素シンターゼタンパク質をコードす るＤＮＡ配列とからなる単離されたヒト誘導型一酸化窒素シンターゼをコードす るＤＮＡ配列を提供する。ヒト誘導型一酸化窒素シンターゼタンパク質は該開始 コドンにて始まり、終始コドンにて終わる。 本発明のさらに別の態様においては、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ クションに寄託された受託番号ＡＴＣＣ ７５３５８を有する組換えプラスミド ｐＨＩＮＯＳを含む組換えプラスミドが提供される。本発明のさらなる態様は、 組換えプラスミドｐＨＩＮＯＳで形質転換された細菌を提供する。 本発明のもう１つの態様においては、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ クションに寄託された受託番号ＡＴＣＣ ６９１２６を有する、大腸菌ＳＯＬＲ 細菌に形質転換されたＨＩＮＯＳ ｃＤＮＡプラスミドを含有する微生物が提供 される。 ５．２．ヒトｉＮＯＳを利用する遺伝子治療応用 ５．２．１．ヒトｉＮＯＳを利用する血管の遺伝子治療 アテローム性動脈硬化による血管閉塞性疾患は結果として発作、心筋梗塞及び 肢の喪失という形で重大な病態に至る。このような変化に対抗する有効な手段は 現在のところ存在しない。閉塞した管をバイパスさせる能力は血栓症やバイパス の移植組織の閉塞によってしばしば制限される。 糖尿病に付随して加速された血管閉塞性疾患は、結果として若年での心筋梗塞 、腎不全、発作、失明及び肢の喪失の高率発症に至る。小さな動脈がしばしば選 択的に関与するので、狭窄した管の緩和を目的とするバイパスや血管形成外科術 等の治療は、効果が無いかもしくは早期の血栓症又は早期の再狭窄によって悪化 させてしまうことが頻繁にある。アテローム性動脈硬化や糖尿性の血管障害に寄 与する要素として内皮の傷害及び機能不全、マクロファージや血小板の蓄積、脂 質やリポタンパク質の蓄積、グリコシル化産物の蓄積並びに血管平滑筋細胞の増 殖が挙げられる（Colwell，1991，Am．J．Med．90: 6A-50S - 6A-54S）。 本発明は、動脈内腔内層を形成する哺乳動物細胞集団、すなわち、内皮細胞と 血管平滑筋細胞を標的とすることを通じて局所的なｉＮＯＳの発現を増加させる ことによる血管の疾患又は血管障害の治療を開示する。より具体的には、標的哺 乳動物細胞としては、必ずしも限定されるものではないが、（１）インビトロ培 養された内皮細胞及び（２）インビトロ培養された血管平滑筋細胞であり、それ らにｉＮＯＳもしくはその生物学的に活性な断片或いはその誘導体をコードする ＤＮＡ配列をトランスフェクト又は感染させ、次いで患者の動脈内に再生着させ るのにそれらを使用することができる。感染及び／又はトランスフェクトされた 内皮及び血管平滑筋細胞を組み合わせて、病んだ管内での再生着のために使用す ることもまた本発明の範囲内である。 患者から得られる内皮及び／又は血管平滑筋細胞を用いることが好ましいであ ろう。それらは当業者に知られた方法をいくつでも用いて培養に付される。この ような動脈を基本とする細胞の源は、このような細胞源を患者から回収すること により得ることができ、限定はされないが、伏在静脈の一部を患者から回収する ことが挙げられる。ｉＮＯＳの感染又はトランスフェクション操作に先立ってイ ンビトロ培養のための標的細胞材料を取得するというやり方は、患者に移すため の合成又は自己移植片を植え付けるのに特に有用であろう。 本発明の別の態様においては、内皮細胞、血管平滑筋細胞又は両方の組合せは 、動脈管の選択された部分における局所的なｉＮＯＳ発現の増大を推進するよう に、ｉＮＯＳ又はその生物学的に活性な断片もしくはその誘導体をコードするＤ ＮＡ配列によって原位置で感染又はトランスフェクトされる標的となる。 ｉＮＯＳタンパク質又はその生物学的に活性な断片をコードするヒト核酸断片 を使用することは、本発明の１つの好ましい側面である。ヒトｉＮＯＳ構築物を 適当な細胞の種類及び動脈での位置に方向付けることに関して、さらに好適な態 様では、ヒト肝細胞ｉＮＯＳ又はその生物学的に活性な断片をコードするｃＤＮ Ａクローンの使用を含む。このｃＤＮＡクローンは、決して限定はされないが、 アテローム性動脈硬化及び糖尿病に付随する血管閉塞性疾患を含む血管の疾患や 、結果として若年での高率の心筋梗塞、腎不全、発作、失明及び肢の喪失に至る 血管障害の治療、また、脈管内膜の過形成の予防のために動脈での局所的なｉＮ ＯＳ発現を増大させるという遺伝子治療応用に使用するためのさまざまな生物学 的に活性なｉＮＯＳ構築物を生み出すのに用いることができる。標的細胞中での ヒトｉＮＯＳの細胞及び動脈内特異的な発現の結果として、予防上及び治療上有 効な量の一酸化窒素が発現領域内で局所的に産生されるであろう。局所的ｉＮＯ Ｓの発現は局所的な血管拡張を最大に促進し、局所的な血栓症を阻止し且つ局所 的な血管平滑筋細胞の増殖を遅延させ得るであろう。それらはすべてアテローム 性動脈硬化症の過程及び血管の閉塞を阻止するものといえる。しかしながら、ヒ トｉＮＯＳの誘導型をコードするいかなるＤＮＡ配列も、組織の源に関係なく、 ヒトの血管閉塞性疾患の遺伝子治療への利用の候補であることが当業者にはさら に理解されるであろう。当業者はさらに、ヒト肝細胞ｉＮＯＳの生物学的活性に よ く似た性質をもつタンパク質あるいはタンパク質断片をコードするいかなる単離 されたＤＮＡ配列も本発明の実施に利用できるかもしれないと理解するであろう 。そのような単離されたＤＮＡ配列としては、必ずしも限定されるわけではない が、（１）ヒト肝細胞ｉＮＯＳ又はその生物学的に活性な断片をコードする単離 されたｃＤＮＡもしくはゲノミック断片、（２）非肝細胞ヒトｉＮＯＳの生物学 的に活性なタンパク質又はタンパク質断片をコードする単離されたｃＤＮＡ、ゲ ノミック断片もしくは核酸断片、（３）非ヒトｉＮＯＳの生物学的に活性なタン パク質又はそのタンパク質断片をコードする単離されたｃＤＮＡ、ゲノミック断 片もしくはその核酸断片、あるいは（４）ｉＮＯＳについて記載されるのと類似 の生物学的活性を有するポリペプチド断片をコードする合成ＤＮＡ分子が挙げら れる。 ｉＮＯＳをコードするＤＮＡ配列はウイルスが媒介するもしくはしない経路で 内皮又は血管平滑筋の標的細胞に送達することができる。本発明に使用されるウ イルスベクターとしては、限定はないが、（ａ）レトロウイルスベクター、限定 はないがＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）由来のベクター等 、（ｂ）アデノ随伴ベクター、（ｃ）アデノウイルスベクター、（ｄ）ヘルペス 単純ウイルスベクター、（ｅ）ＳＶ４０ベクター、（ｆ）ポリオーマウイルスベ クター、（ｇ）パピローマウイルスベクター、（ｈ）ピコルナウイルスベクター 及び（ｉ）ワクシニアウイルスベクターが含まれる。選択されるウイルスベクタ ー系に従って当業者が利用できる技術を用いて該組換えウイルスベクターを選択 された標的細胞に感染させる。 例示のためであって、限定ではないが、ｉＮＯＳ又はその生物学的に活性な断 片をコードするＤＮＡ配列を含む組換えレトロウイルスベクターが哺乳動物の培 養内皮細胞を感染させるのに利用される。該細胞は次いで動脈管又は血管バイパ ス移植片に生着させるのに用いられる。レトロウイルス−ｉＮＯＳ組換え構築物 を標準的なレトロウイルスパッケージング細胞系に移入し、回収されるウイルス 粒子を用いて培養内皮細胞に感染させる。それから、このようなインビトロで感 染させた細胞集団を患者に再導入する。 当業者は本発明を実施するのに、生物学的に活性な形態のｉＮＯＳを発現する いかなるレトロウイルス構築物をいくつでも用いることができる。しかしながら 、本発明の好ましい態様は、ｉＮＯＳを含有する組換えＭｏｌｏｎｅｙマウス白 血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）レトロウイルスベクターを内皮細胞に感染させるこ とに依存している。ＭｏＭＬＶはＲＮＡウイルスであるが、宿主細胞のゲノム中 に安定に組み込まれるＤＮＡの中間形態を有する。該ウイルスはプロウイルスＤ ＮＡの５’及び３’末端に該ウイルスの生活環に必要なプロモーター、ポリアデ ニル化及びインテグレーション配列を含む２つの長い末端反復配列（ＬＴＲ）を 有する。Psi と呼ばれるパッケージング配列もまた、感染力のあるウイルスの生 産にシスで必要である。該ウイルスは、ウイルス複製にトランスで必要な３つの タンパク質、gag，pol及びenv をコードする。gag 及びpol タンパク質はスプラ イシングされないメッセージから発現するが、env タンパク質は示される５’及 び３’スプライシング部位を用いて生み出されるメッセージから発現する。レト ロウイルスベクターを生み出すために、gag，pol及びenv 遺伝子を取り除き、結 果としてＭｏＭＬＶの複製欠損誘導体ＭＦＧを得た。ｉＮＯＳをコードするｃＤ ＮＡをＭＦＧにサブクローニングし、その結果ＭＦＧ−ｉＮＯＳを得た。ＭＦＧ −ｉＮＯＳにおいて、該遺伝子はＬＴＲにより作動するスプライシングされたメ ッセージから発現する。該ＭＦＧ−ｉＮＯＳ構築物は組換えＲＮＡをウイルス粒 子にパッケージングするのに必要なpsi 部位を有している。感染力のあるウイル スを生ずるために、プロウイルスＤＮＡをgag，pol 及びenv タンパク質を構成 的に産生するパッケージング細胞系にトランスフェクトする。図１Ａ〜Ｇにヒト 肝細胞ｉＮＯＳをコードするｃＤＮＡの配列が示されている。該ｃＤＮＡがレト ロウイルスベクターＭＦＧのNcoI−BamHI クローニング部位に挿入されている（ 図６及び図７；レトロウイルスベクターの総説はMiller，1992，Current Topics Microbiology and Immunology 158:1-24 を参照）。 ｉＮＯＳの生物学的に活性な部分をコードする、追加の単離されたＤＮＡ配列 又は合成的に生産されたＤＮＡ配列を、先に示したように、最終的に培養内皮細 胞又は培養血管平滑筋細胞にインビトロで感染させるためにレトロウイルスベク ター中にサブクローニングしてもよい。感染した内皮細胞又は血管平滑筋細胞は 次いでこの明細書に記載したように患者の特別の組織標的部位に送達される。 本発明はまた、選ばれた動脈の部分又は血管バイパス移植片内での局所的なｉ ＮＯＳの発現の増大を促進するように、ｉＮＯＳをコードするＤＮＡ配列を内皮 細胞又は血管平滑筋細胞に原位置で感染もしくはトランスフェクトすることによ って血管疾患を治療する遺伝子治療応用におけるｉＮＯＳ−レトロウイルスベク ターの使用を開示する。 血管疾患の治療のために、内皮細胞にｉＮＯＳ又はその生物学的に活性な断片 をコードするＤＮＡ配列をインビトロでウイルスを介して感染させるかもしくは ベクターを介してトランスフェクトすることは、先に述べたレトロウイルスベク ター以外の多数の無生物的及び／又は生物的担体によっても達成できる。 例えば、本発明のさらなる態様においては、ｉＮＯＳ又はその生物学的に活性 な断片をコードするＤＮＡ配列をアデノウイルスベクター中にサブクローニング してもよい。対象とする標的細胞においてｉＮＯＳの発現を促進するいかなるア デノウイルス（Ａｄ）ベクターも利用できる。当業者が入手できるいかなる真核 プロモーターもアデノウイルス−ｉＮＯＳ遺伝子治療用ベクターを構築するのに 用いることができる。それ故、限定はされないがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ ）プロモーター、ラウス肉腫（ＲＳＶ）プロモーター、マウス白血病（ＭＬＶ） プロモーター、β−アクチンプロモーター、並びに対象とする標的細胞での発現 を誘導するいかなる追加の組織特異的又はシグナル特異的制御配列も含めて、対 象とする核酸の発現を調節することが知られている当業者が入手可能なあらゆる 真核プロモーター及び／又はエンハンサー配列もＡｄベクター構築物に使用する ことができる。アデノウイルス遺伝子治療用ベクターは、例えば、（１）内皮細 胞や肝細胞のような非分裂細胞に効果的に感染すること及び、（２）標的細胞中 でアデノウイルスベクターの発現が一時的であるという性質のために有利であろ う。このことは、血管拡張術直後の血栓症の予防に適用するのに有利であろう。 本発明のさらなる態様においては、ｉＮＯＳ又はその生物学的に活性な断片を コードするＤＮＡ配列をアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）中にサブクロー ニングしてもよい。当業者は数多くの遺伝子治療応用のいずれかに利用される組 換えＡＡＶ−ｉＮＯＳベクターを構築することができる。レトロウイルスの末端 反復配列とは対照的に、ＡＡＶの末端反復配列は外来遺伝子の発現を促進する制 御配列を含まない。Ａｄベクターについて前述したように、限定はされないがサ イトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫（ＲＳＶ）プロモータ ー、マウス白血病（ＭＬＶ）プロモーター、β−アクチンプロモーター、並びに 対象とする標的細胞又は組織での発現を誘導するいかなる追加の組織特異的又は シグナル特異的制御配列も含めて、対象とする核酸の発現を調節することが知ら れている当業者が入手可能なあらゆる真核プロモーター及び／又はエンハンサー 配列もＡＡＶベクター構築物に使用することができる。 適当な組換えＡＡＶ−ｉＮＯＳベクターがインビトロ培養された内皮細胞又は 血管平滑筋細胞の直接的感染に使用できる。組換えＡＡＶ−ｉＮＯＳを感染させ た内皮細胞は、次いで、限定されるものではないが、本明細書中で開示したカテ ーテル法技術等の当該技術分野において公知の方法を利用して特別の組織標的部 位に送達することができる。あるいは、組換えＡＡＶ−ｉＮＯＳはリポソームマ イクロカプセルと連携させて標的細胞に送達させられ得る。リポソームとＡＡＶ 構築物のハイブリッドを用いたトランスフェクションのプロトコールは、ｉＮＯ ＳのＤＮＡ配列を含む（おそらく両方のＬＴＲが存在する）ＡＡＶベクターを使 用することを含む。この構築物をＡＡＶのrep 遺伝子を含むプラスミドとともに 標的の内皮細胞又は血管平滑筋細胞に共トランスフェクトする。rep タンパク質 の一時的な発現により、組換えＡＡＶ−ｉＮＯＳゲノムの内皮細胞又は血管平滑 筋細胞への安定的組込みが増進される。 標的細胞を感染させるための前記ウイルスベクターの使用に加えて、特定の真 核標的細胞をトランスフェクトすることにより発現し得るいかなる公知の非ウイ ルスベクターも本発明の実施に利用し得る。このような非ウイルス由来のベクタ ーとしては、プラスミドＤＮＡが含まれるが単にこれに限定されない。 当業者は文献の手引きにより、本発明に使用するのに適当なＤＮＡプラスミド ベクターを選択するであろう。組換えＡｄ及びＡＡＶベクターについて先に述べ たように、限定はされないがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラ ウス肉腫（ＲＳＶ）プロモーター、マウス白血病（ＭＬＶ）プロモーター、ＨＳ Ｖ−ｔｋ等のヘルペス単純ウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、β−アクチンプロ モーター、並びに対象とする標的細胞又は組織での発現を誘導するいかなる追加 の組織特異的又はシグナル特異的制御配列も含めて、対象とする核酸の発現を調 節することが知られており、当業者が入手可能なあらゆる真核プロモーター及び ／又はエンハンサー配列もプラスミドベクター構築物に使用することができる。 シグナル特異的なプロモーター断片としては、ＴＮＦに応答するプロモーター断 片が含まれるがこれに限定されない。 １つのこのような態様においては、ヒトｉＮＯＳをコードするＤＮＡ配列をＤ ＮＡプラスミド発現ベクター、ｐＣＩＳ（ジェネンテック）中にサブクローニン グし、結果としてｐＣＩＳ−ｉＮＯＳを得る。ｐＣＩＳは標準的な哺乳動物発現 ベクターであり、大腸菌中で増殖するための抗生物質耐性遺伝子と哺乳動物細胞 中で活性なＣＭＶプロモーターを含んでいる。このような構築物は、多数の源か ら入手可能な構成成分を用いて当業者が構築し得るものであるが、標的細胞のト ランスフェクションに続いてＣＭＶプロモーターの下流に連結されたｉＮＯＳ ＤＮＡ断片の発現を駆動する。より具体的には、ヒトｉＮＯＳコード領域を含む ＮｏｔＩ／ＸｈｏＩ制限断片をｐＨＩＮＯＳ（ｐＨＩＮＯＳはＡＴＣＣに寄託番 号７５３５８で寄託されている）から作り出して単離し、ＮｏｔＩ／ＸｈｏＩで 消化したｐＣＩＳに連結する。あるいは、ヒトｉＮＯＳの発現が標的細胞内で誘 導されるように、単離されたヒトｉＮＯＳを野生型ヒトｉＮＯＳプロモーター配 列のいずれかの部分に融合してもよい。 標的細胞をトランスフェクトするのにプラスミドＤＮＡを利用する好ましい態 様においては、ｉＮＯＳ又はその生物学的に活性な断片をコードするＤＮＡ配列 を含有するプラスミドベクターが、本明細書の中に記載されるように、選ばれた 標的細胞のリポソームを介したトランスフェクションに利用されるだろう。リポ ソームの安定性が不透過性とあいまって、この小胞を治療用ＤＮＡ配列を送達す るための有用なビヒクルにしている（総説としては、Mannino とGould-Forgerit e，1988，BioTecniques 6(7): 682-690）。リポソームは融合により多くの細胞 種に吸収されることが知られている。１つの態様においては、カチオン性のコレ ステロール誘導体を含むカチオン性のリポソーム、例えば、ＳＦ−ｃｈｏｌある いはＤＣ−ｃｈｏｌ等を利用し得る。ＤＣ−ｃｈｏｌ分子は、Gao とHuang（199 1，Biochem．Biophys．Res．Comm．179: 280-285）に記載されるように、第三級 アミノ基、中程度の長さのスペーサーアーム及びカルバモイルリンカー結合を含 む。限定ではないが、一例として、ｐＣＩＳ−ｉＮＯＳプラスミド構築物は培養 内皮細胞のリポソームを介したインビトロでのトランスフェクション及び内皮細 胞の原位置でのトランスフェクションに利用できる。 リポソーム技術の使用に関する別の態様においては、生物学的に活性なｉＮＯ Ｓタンパク質断片をコードするＤＮＡ配列を含むウイルス又は非ウイルスを基礎 とするベクターは、リポフェクタミン（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリー）と ともに標的細胞のトランスフェクションにより標的細胞に送達される。リポフェ クタミンはポリカチオン性脂質２，３ジオレイロキシ−Ｎ−［２（スペルミンカ ルボキグミド）エスリル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリック フルロアセテート（ＤＯＰＳＡ）及び中性脂肪ジオレオリ−ホスファチジルエ タノールアミン（ＤＯＰＥ）の３：１リポソーム調剤である。 遺伝子送達の非ウイルス的方法の他の使用としては、それらに限定されるわけ ではないが、（ａ）裸のＤＮＡの直接インジェクション、（ｂ）リン酸カルシウ ム［Ｃａ₃（ＰＯ₄）₂］を介する細胞のトランスフェクション、（ｃ）エレクト ロポーレーションによる哺乳動物宿主細胞のトランスフェクション、（ｄ）ＤＥ ＡＥ−デキストランを介する細胞のトランスフェクション、（ｅ）ポリブレンを 介する送達、（ｆ）プロトプラスト融合、（ｇ）マイクロインジェクション、 及び（ｈ）ポリリジンを介する形質転換及び哺乳動物宿主に再導入された遺伝子 操作された細胞が含まれる。 本明細書は、動脈のターゲッティングされた領域内又は動脈の罹患した部分を バイパスするのに利用される合成の導管内での遺伝子治療に基づく局所的なｉＮ ＯＳ発現の増加の好ましい方法を開示する。 例えば、好ましい方法として、培養内皮細胞、血管平滑筋細胞又は両細胞種の 組合せにＭＦＧのようなレトロウイルスベクターに連結したヒトｉＮＯＳ断片を インビトロでターゲッティングすることが含まれる。好適なレトロウイルス構築 物はＭＦＧ−ｉＮＯＳである。このようなレトロウイルスベクターを適当なパッ ケージング細胞系にトランスフェクトして感染力のあるウイルスを作り出し、次 いでそれを内皮細胞、血管平滑筋細胞又は両細胞種の組合せにインビトロで感染 させるのに用いる。一旦、罹患した動脈から実質的に狭窄や閉塞が取り除かれる と、ｉＮＯＳを感染させた内皮細胞及び／又は血管平滑筋細胞を、罹患した動脈 壁の領域に再生着させるのに用いることができる。血管系の外科熟練医は閉塞の 重篤度及び罹患した動脈管の位置に応じて種々の血管内外科術が利用できるとわ かるであろう（総説については、一般にAhn，1993，”Endovascular Surgey”， in Vascular Surgey，A Comprehensive Review，W.S．Moore 編，W.B．Saunders & Co.,フィラデルフィアを参照）。例えば、このような血管内の外科的手法と しては、限定はされないが、バルーン血管形成術、レーザー補助バルーン血管形 成術、ダブルバルーンカテーテル法、動脈内膜切除術及び血管内視鏡検査が含ま れる。また、ｉＮＯＳ発現細胞の送達のために動脈の罹患した領域を物理的に分 離するのに好ましい方法は、ダブルバルーンカテーテルの使用であろう。 動脈内腔細胞のインビトロ感染の好ましい方法は、ヒトｉＮＯＳを含む組換え レトロウイルス、特にＭＦＧ−ｉＮＯＳ；組換えｉＮＯＳ含有プラスミドベクタ ー、特にｐＣＩＳ−ｉＮＯＳ、組換えアデノウイルスベクター又は組換えアデノ 随伴ウイルスベクターのリポソームを介したトランスフェクションを含む。標的 細胞が内皮細胞であれ血管平滑筋細胞であれ、同様のインビトロ感染又はトラン スフェクションの手法を用いることができることは当業者には理解されるだろう 。 動脈内の特異的部位での局所的なｉＮＯＳ発現の増加を指示する付加的な方法 として、内皮細胞、血管平滑筋細胞又は両方を組合わせた原位置での組換えウィ ルス感染が挙げられる。前の段落で述べたように、この方法は、該動脈管の血栓 又は閉塞領域を実質的に取り除き、該動脈管の取り除いた領域を組換えｉＮＯＳ ウイルス粒子の受け皿として働くように物理的に分離することを含む。ここでも 、血栓除去の好ましい方法としては、限定されないが、バルーン血管形成術、レ ーザー補助バルーン血管形成術、ダブルバルーンカテーテル法、動脈内膜切除術 及び血管内視鏡検査が含まれる。さらに、組換えｉＮＯＳ−ウイルス粒子の送達 のために、動脈管の操作された部分を物理的に分離する好ましい手段は、ダブル バルーンカテーテルの使用だろう。 動脈内腔細胞の原位置での感染の好ましい手段としては、ｉＮＯＳ含有組換え ウイルス粒子、特にＭＦＧ−ｉＮＯＳ；組換えｉＮＯＳ含有プラスミドベクター 、特にｐＣＩＳ−ｉＮＯＳ、組換えアデノウイルスベクター又は組換えアデノ随 伴ウイルスベクターのリポソームを介したトランスフェクションが含まれる。内 皮細胞と血管平滑筋細胞の両方をin situ の手法で同時に感染又はトランスフェ クトすることができ、例えば、実施例１３．１．２．章に概説されるin situ の 手法が例示される。 ｉＮＯＳに基づく血管疾患の遺伝子治療処置の付加的な好ましい方法は、血管 の外科術を含む。より具体的には、以下により特徴づけられる血管の外科的手法 である。 （１）内皮細胞、血管平滑筋細胞及び両方の細胞種からなる群より選択されるイ ンビトロで培養された哺乳動物細胞に、生物学的に活性なｉＮＯＳタンパク質も しくはタンパク質断片をコードするヒトｉＮＯＳ含有ウイルス又は非ウイルスベ クターを感染又はトランスフェクションし；ヒトｉＮＯＳでトランスフェクトさ れた細胞の集団を有する合成または自己の導管を移植し；該患者内の罹患した動 脈管部分をバイパスする近位及び遠位の吻合を形成する。血管バイパス技術と結 合したｉＮＯＳに基づく遺伝子治療は移植片内でのｉＮＯＳの発現を促進し、結 果として血管バイパス手法の後によく起こる脈管内膜の過形成、血栓形成、及び 他の形態の術後閉塞性合併症を防止又は実質的に減じることにより、予防及び治 療緩和をもたらす。 （２）インビトロで培養された内皮細胞、血管平滑筋細胞又は両方の組合せに、 組換えヒトｉＮＯＳを感染又はトランスフェクションし；該患者内部の動脈管の 罹患した部分をバイパスする近位及び遠位の吻合を行い；移植片の縫合に続いて 各吻合を物理的に分離し；吻合の近位内での局所的なｉＮＯＳ発現の増加を促進 するために、ヒトｉＮＯＳ構築物を感染又はトランスフェクトした動脈細胞とと もに、遠位及び近位の吻合及びその周囲の単離された領域を移植する。 （３）患者内部の動脈管の罹患した部分をバイパスするための近位及び遠位の吻 合を形成し；移植片の縫合に続いて該各吻合を物理的に単離し；ｉＮＯＳの局在 化した発現により、該ヒト血管疾患及び脈管内膜の過形成の進行が予防及び治療 緩和されるように、ヒトｉＮＯＳ構築物を、標的吻合の周囲の動脈内腔に沿って 並ぶ細胞（内皮、平滑筋又はその両方）に原位置でトランスフェクトする。 （４）狭窄または閉塞している内腔部位で外科的に動脈管を切開し、動脈内膜切 除術を行って開存性を再確立し；この修復部位が閉じた後に、再閉塞を防ぐため にｉＮＯＳの局所的な発現を増すように、ヒトｉＮＯＳ構築物を担持する培養内 皮細胞又は血管平滑筋細胞をこの外科的傷害部位に移植することができる。 （５）狭窄または閉塞している内腔部位で外科的に動脈管を切開し、動脈内膜切 除術を行って開存性を再確立し；この修復部位が閉じた後に、この外科的傷害部 位に、本明細書中に記載されるin situ 法のいずれか又は当業者が利用可能な他 の何れかのin situ 技術によって移植を行うことができる。 近位及び又は遠位の吻合を物理的に分離する好適な手段はダブルバルーンカテ ーテルの使用であろう。 血管移植片を移植する好ましい手段としては、ｉＮＯＳ含有組換えウイルス粒 子、好ましくは組換えレトロウイルス粒子、特にＭＦＧ−ｉＮＯＳのようなＭｏ ＭＬＶレトロウイルス粒子を感染又はトランスフェクトされた内皮及び血管平滑 筋細胞；組換えｉＮＯＳ構築物、特にｐＣＩＳ−ｉＮＯＳ、及びアデノウイルス 又はアデノ随伴ウイルスを基礎とするベクターｉＮＯＳ構築物のリポソームを介 したトランスフェクションが挙げられる（ウイルス上清として直接的にか、動脈 細胞のリポソームを介したトランスフェクションのいずれかによる）。 本明細書は、古典的なバイパス手法における血管外科に利用できる導管はいず れもここに記載されるｉＮＯＳに基づく遺伝子治療法において使用できることを 開示するものである。本発明は、自己静脈移植片（特に、伏在静脈）、合成移植 片（特に、ポリテトラフルオロエチレン［ＰＴＦＥ］）、自己動脈移植片、臍帯 の自己静脈移植片及び異種移植片を含むがこれらに限定されない、数多くの導管 の使用を想定している。 ５．２．２．抗腫瘍効果の増進による生物学的治療 Ｌ−アルギニン：ＮＯ経路が抗腫瘍活性と関係があることが示されてきた（Hi bbs ら，1987_,Science 235: 473-476; Kilbournら，1990，Proc．Natl．Acad．S ci．USA 87: 3629-3632）。一酸化窒素の生物学的活性としては、ＤＮＡ合成及 び呼吸に関与するミトコンドリア酵素の阻害が含まれる。 本発明は、癌患者における抗腫瘍効果を増進するヒトｉＮＯＳ指示的な遺伝子 治療方法を開示する。このようなヒトｉＮＯＳ指示的な癌の遺伝子治療は、治療 すべき腫瘍領域内での一酸化窒素濃度の局所的に増加させ、よって一酸化窒素レ ベルの全身における増加なしに抗腫瘍効果を増進するだろう。 それ故、本発明は、ｉＮＯＳの局所的発現が一酸化窒素濃度の増加を引き起こ し、それによって抗腫瘍活性を刺激するように、患者体内の特異的部位にＤＮＡ 配列をターゲッティングすることを開示する。 組換えｉＮＯＳ又はその生物学的に活性な断片の局所的発現を促進するために 、単離されたヒトｉＮＯＳ配列を当業者が利用可能な数多くの方法によってイン ビトロで操作することができる。 完全なｉＮＯＳタンパク質をコードするヒトｉＮＯＳ ＤＮＡ配列又はその生 物学的に活性な断片をコードするその部分的なＤＮＡ配列を５．２．１．章で述 べられたウイルス又は非ウイルス的方法を用いたインビトロ形質導入により標的 細胞に送達する。次いで、腫瘍部位でのｉＮＯＳの局所的発現を促進するために インビトロ形質導入された標的細胞を患者に導入する。したがって、組織源に関 係なく、あらゆるヒトｉＮＯＳ ＤＮＡ配列が癌の遺伝子治療の候補であると理 解されよう。このようなｉＮＯＳ ＤＮＡ配列としては、（１）ヒト肝細胞から 精製された、単離されたｃＤＮＡもしくはゲノミック断片、又は該組織源由来の ヒトｉＮＯＳの生物学的に活性な断片をコードするＤＮＡ配列、あるいは（２） 肝細胞以外のヒト組織源から精製された、単離されたｃＤＮＡもしくはゲノミッ ク断片、又は該組織源由来のヒトｉＮＯＳの生物学的に活性な断片をコードする ＤＮＡ配列が含まれるが、これらに限定はされない。 上記ｉＮＯＳ配列を該標的細胞内で活性な組織特異的又はシグナル特異的プロ モーター断片に融合させてもよい。あるいは、野生型のヒトｉＮＯＳプロモータ ー配列に融合させてもよい。ｉＮＯＳ作動性の生物学的治療応用におけるシグナ ル特異的プロモーターの一例として、ＴＮＦに応答して正に制御するプロモータ ーが挙げられるが、これに限定されない。したがって、形質転換された標的細胞 内でのｉＮＯＳの局所的発現を増加させるプロモーター又はエンハンサー配列の いずれもが抗腫瘍応用への使用の候補である。 腫瘍部位又はその周囲でのｉＮＯＳの局所的発現の促進は、インビトロ形質導 入及び患者への導入に適した標的細胞を利用することにかかっている。癌の遺伝 子治療に関する１つの態様においては、限定されないが、元々患者から回収した 腫瘍浸潤性リンパ球を含め、インビトロで形質導入された標的細胞を該患者に静 脈注射する。 標的細胞への送達は、主として５．２．１．章に記載されたウイルス又は非ウ イルス的方法によって達成することができる。このような方法としては、（ａ） これに限定はされないが、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ） を含むレトロウイルスベクター、（ｂ）アデノ随伴ベクター、（ｃ）アデノウイ ルスベクター、（ｄ）ヘルペス単純ウイルスベクター、（ｅ）ＳＶ４０ベクター 、（ｆ）ポリオーマウイルスベクター、（ｇ）パピローマウイルスベクター、（ ｈ）ピコルナウイルスベクター及び（ｉ）種痘ウイルスベクターを含むが、これ らに限定されない。選択されたベクター系に応じて、当業者が利用できる技術が 選ばれた標的細胞を該組換えウイルスベクターに感染させるのに用いられる。 ヒトｉＮＯＳ配列を対象とする標的細胞に送達する好ましい方法においては、 ｉＮＯＳ又はその生物学的に活性な断片をコードするＤＮＡ配列を担持する組換 えレトロウイルスベクターが腫瘍浸潤性リンパ球に感染させるのに使用される。 こうして感染した腫瘍浸潤性リンパ球は、次いで、腫瘍部位での局所的ｉＮＯＳ 発現を促進するために患者に再導入される。 生物学的に活性な形態のｉＮＯＳを発現するレトロウイルス性構築物がいくつ でも、抗腫瘍活性を増進させるのに利用できる。好ましくは、ＭＦＧ−ｉＮＯＳ 又はＤＦＧ−ｉＮＯＳ−Ｎｅｏが患者から回収された培養腫瘍浸潤性リンパ球又 は腫瘍細胞に感染させるのに利用される。 前に開示した、ｉＮＯＳの生物学的に活性な部分をコードする追加の単離され たＤＮＡのどれでも、最終的に患者から回収された培養腫瘍浸潤性リンパ球また は腫瘍細胞にインビトロで感染させるためにレトロウイルスベクター中にサブク ローニングすることができると当業者は理解するだろう。 標的細胞の感染のための前述のウイルスベクターの使用に加えて、特定の真核 標的細胞のトランスフェクションによって発現し得るあらゆる非ウイルスベクタ ーが本発明を実施するのに使用できる。このような非ウイルスベクターとしては 、プラスミドＤＮＡが含まれるが、それだけに限定されない。 当業者は文献の手引きにより本発明への使用に適したプラスミドベクターを選 択するであろう。対象とする核酸の発現を調節することが知られている、当業者 が入手可能なプロモーター及び／又はエンハンサー配列はすべてプラスミドベク ター構築物中に使用することができ、限定されるものではないが、サイトメガロ ウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫（ＲＳＶ）プロモーター、マウス 白血病（ＭＬＶ）プロモーター、β−アクチンプロモーター、並びに対象とする 標的細胞又は組織での発現を誘導するあらゆる追加の組織特異的又はシグナル特 異的制御配列が含まれる。本発明の特別な態様においては、ｉＮＯＳ ＤＮＡ配 列を含有するプラスミドベクターはｐＣＩＳ−ｉＮＯＳである。 腫瘍細胞のような標的細胞種へのｉＮＯＳ−プラスミド構築物の送達は、当業 者が利用できる多くの生物的又は無生物的担体により達成することができる。標 的細胞をトランスフェクトするのにプラスミドＤＮＡを用いる好適な態様におい ては、ｉＮＯＳ又はその生物学的に活性な断片をコードするＤＮＡ配列を含むプ ラスミドベクターは５．２．１．章において詳細に記載されるように、リポソー ムを介したトランスフェクションに利用される。 遺伝子送達の非ウイルス的方法の他の使用としては、（ａ）裸のＤＮＡの直接 インジェクション、（ｂ）リン酸カルシウム［Ｃａ₃（ＰＯ₄）₂］を介した細胞 のトランスフェクション、（ｃ）エレクトロポーレーションによる哺乳動物宿主 細胞のトランスフェクション、（ｄ）ＤＥＡＥ−デキストランを介した細胞のト ランスフェクション、（ｅ）ポリブレンを介した送達、（ｆ）プロトプラスト融 合、（ｇ）マイクロインジェクション及び（ｈ）ポリリシンを介した形質転換が 含まれるが、これらに限定はされない。遺伝的に形質転換された細胞は、次いで 哺乳動物宿主に再移入される。 ５．２．３．微生物感染を処置するための生物学的治療 本発明のヒトｉＮＯＳ ＤＮＡ配列は、微生物感染の治療に利用することがで きる。具体的には、高濃度の一酸化窒素に感受性の高いことが知られている微生 物を処置するのにｉＮＯＳ作動性の生物学的治療を用いることができる。一酸化 窒素はマイコバクテリア、蠕虫、真菌、原生動物、及びウイルスに対しての細胞 毒性効果を有する分子であることが知られている。 本明細書を読めば、当業者は、５．２．１．章で列挙されたｉＮＯＳ配列のい ずれかを利用するよう導かれるであろう。ｉＮＯＳ作動性の抗微生物治療は、各 ヒトｉＮＯＳ配列を該微生物を有する組織特異的細胞種又は該微生物自身にター ゲッティングすることにかかっている。ターゲッティングする微生物又は細胞種 によって、ヒトｉＮＯＳ ＤＮＡの送達は生物的又は無生物的手段で達成され得 る。 ｉＮＯＳ作動性抗微生物治療を利用する好ましい態様においては、標的細胞は マラリアの原因であるプラスモディウム属胞子虫に感染したヒト肝細胞である。 ヒトマラリアは４種のプラスモディウム：熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア 原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫のうちの１つにより引き起こされ る。プラスモディウムの胞子母細胞は、ヒト宿主の循環系への侵入に続いて肝細 胞に入り込む。 ｉＮＯＳ作動性の生物学的治療によるマラリア治療の好ましい態様においては 、標的肝細胞をリポソームを介して形質転換することにより、ｉＮＯＳ−ベクタ ーを送達する。 本発明の別の態様においては、ｉＮＯＳ作動性の抗微生物治療は、それのみに 限定されないが住血吸血症［例えば、シストソマ・マンソミ（Schistosoma mans omi）、シストソマ・ヘマトビウム（Schistosoma haematobium）及びシストソマ ・ジャポニカム（Schistosoma japonicum）］を含む蠕虫感染の治療に利用され る。蠕虫に感染した肝細胞の直接的治療には、ｉＮＯＳ作動性のマラリア治療に ついての上記技術がすべて包含される。 ｉＮＯＳ作動性の抗微生物治療によるマラリア治療の特に好ましい態様におい ては、リポソームがリポソーム複合体への肝細胞特異的アシアロタンパク質の挿 入によって改変される。その結果生じるアシアロタンパク質は肝細胞に特有のガ ラクトース受容体に結合する（Wallら，1980，Cell 21: 79-83参照）。したがっ て、アシアロタンパク質含有リポソーム内にｉＮＯＳ ＤＮＡベクターを被膜す ることにより、肝細胞へ特異的に送達されるよう方向付けられる。 ｉＮＯＳ−ベクターを抗微生物治療に利用する別の態様は、結核及びらいを含 むがそれらに限定されない、肺に生じる微生物感染の治療を含む。 結核の原因は結核菌であり、飛沫核または呼吸経路を通じて肺に侵入する。一 旦肺に入ると、この細菌は生長して最終的にはリンパ球、マクロファージ及び結 合組織に囲まれ、結核結節と呼ばれる小結節を形成する。通常、これは悪影響の ない感染終期を意味する。あるいは、チーズ状の病変が形成し、それが固化して Ｇｈｏｎ複合体を形成し、さらに液化して結核性腔を形成することもある。 ｉＮＯＳ作動性抗微生物治療による結核の好ましい治療は、標的組織内部の細 胞をウイルスを介して形質転換することにより、標的組織へｉＮＯＳベクターを 向かわせることを含む。 ウイルスを介する送達の１つの好ましい方法は、５．２．１．章にて述べたよ うにレトロウイルスを介した送達である。本明細書の手引きにより結核の治療に 使用するｉＮＯＳベクターを構築することは、当業者の技術範囲内のことである 。 ウイルスを介する送達の別の好ましい方法は、アデノウイルスを介した送達で あり、対象とするｉＮＯＳ ＤＮＡ断片をアデノウイルスベクター中に挿入する 。 肺の感染領域にｉＮＯＳ−レトロウイルス又はｉＮＯＳアデノウイルスベクタ ーを投与する好ましい方法は、エアロゾル噴霧の形態の吸入投与である。 標的となるのは、それに限定されないが結核治療のほか、臓器移植患者におけ る真菌感染や、エイズ患者における播種性アスペルギルス症又は真菌もしくはサ イトメガロウイルスのような付加的なウイルスの感染といった微生物感染を含む 進行した播種性疾患であろう。 ハンセン病の原因はらい菌である。ハンセン病の伝染は、子供がらい菌を発散 する感染個体に晒された時に最も高い。鼻からの分泌物が家族内接触での最もあ り得る感染源である。ｉＮＯＳのウイルス的送達の好適な方法は吸入投与による ものであり、結核菌について記載されたと同様に、らい菌の治療にも好ましい方 法である。 ６．実施例：ヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼの誘導 ｉＮＯＳｍＲＮＡは、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン（ ＩＬ−１）あるいはインターロイキン−γ（ＩＦＮ−ｇ）のような個々のサイト カインでの刺激に続いて肝細胞内で僅かに誘導される。サイトカインはｉＮＯＳ ｍＲＮＡのレベル及び一酸化窒素シンターゼの活性をさらに正に調節するのに相 乗的に働くことができる。ｉＮＯＳの最大誘導は、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＦＮ− ｇ及び細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）を組み合わせることによってなし遂げられた。 （Gellerら，1993，Proc．Natl．Acad．Sci．90: 522-526; Nussler ら，1992， J．Exp．Med．176:261-264）。 ７．実施例：ヒト肝細胞一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡの同定と単離 ヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡとハイブリダイズすることの できる種交差性のｉＮＯＳｃＤＮＡプローブをヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シン ターゼのｍＲＮＡの同定と単離に使用した。それから、サイトカイン及びＬＰＳ ［以後、サイトカン混合物（ＣＭ）］刺激の後のｉＮＯＳｍＲＮＡレベルの各時 点でのピークを測定した。 培養ヒト肝細胞の、ＣＭ刺激後２−４８時間での全細胞ＲＮＡをChomczynski とSacchiの、ＲＮＡｚｏｌ Ｂ改変法を用いて抽出した。２０マイクログラム量 の全ＲＮＡを、NotI制限酵素消化後単離した、マウスのｉＮＯＳｃＤＮＡの断片 から調整したマウスのマクロファージｉＮＯＳのｃＤＮＡプローブとの種交差ハ イブリダイゼーションによるノザンブロット解析により調べた。（Lowensteinら ，1992，Proc．Natl．Acad．Sci．USA．89:6711-6715; GenBank Accession No． M92649）。ヒト肝細胞一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡの存在は約４．５Ｋｂサイ ズの単一バンドとして確認され、最大のｉＮＯＳｍＲＮＡレベルはＣＭ誘導後約 ８時間で観察された。 図２はヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼの４．５ｋｂメッセージの存在 を示している。新たに単離したヒト肝細胞（ＨＣ）を細胞培養に付し、ヒト組換 え腫瘍壊死因子（５００単位／ミリリットル）、ヒト組換えインターロイキン− １（５単位／ミリリットル）、ヒト組換えインターフェロン−ガンマ（１００単 位／ミリリットル）、及びリポ多糖（１０マイクログラム／ミリリットル）を組 み合わせたものに暴露した。図２は全ＲＮＡを、示した時点（２、４、６及び８ 時間）で単離し、サンプルあたり２０マイクログラムをノザンブロット解析に付 したものを示している。マウスマクロファージ誘導型一酸化窒素シンターゼの２ ．７ＫｂのｃＤＮＡ断片をヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡを確 認するために用いた。図２は、刺激後約８時間で４．５Ｋｂのメッセージのレベ ルがピークに達したことを示している。図２は対照の（刺激されていない）肝細 胞にはｍＲＮＡのシグナルが検出されなかったことを示している。図３は３つの 別々の個体から単離された肝細胞［パテント（Ｐｔ．）１，２及び３］からの、 上述のサイトカインに暴露して約８時間後の時点での４．５Ｋｂのヒト肝細胞誘 導型一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡの発現を示している。図３は対照の（刺激さ れていない）肝細胞にはシグナルが検出されなかったことを示している。 ８時間の時点でｉＮＯＳｍＲＮＡのレベルが最大となったので、生体外でのＣ Ｍ刺激後約８時間で２つのヒト肝臓から全細胞ＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡ合成 には全ＲＮＡよりむしろ約１０〜２０マイクログラムのポリ（Ａ）ｍＲＮＡが必 要である。ポリ（Ａ）ｍＲＮＡは、オリゴｄＴセルロースカラムを通した溶出に よって全細胞ＲＮＡから精製された。精製したポリ（Ａ）ｍＲＮＡ中のヒト肝細 胞ｉＮＯＳｍＲＮＡの存在を確認するために、２つのヒト肝臓各々からの精製Ａ ｍＲＮＡの０．５マイクログラムを用いて、マウスマクロファージ誘導型一酸化 窒素シンターゼに対する２．７ＫｂのｃＤＮＡプローブを用いて繰り返しノザン ブロット解析を行った。図４は、２人の異なった患者由来の強い一酸化窒素シン ターゼｍＲＮＡのバンドを示しているが、ポリ（Ａ）ＲＮＡが分解した証拠はな い。 図４はマウスマクロファージ誘導型一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡプローブが 有効に交差ハイブリダイズし、ポリ（Ａ）ＲＮＡ中のヒト肝細胞誘導型一酸化窒 素シンターゼｍＲＮＡを同定することを示している。該２患者由来のポリ（Ａ） ｍＲＮＡのサンプルを貯え、ヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡ クローンの単離のためのｃＤＮＡライブラリー構築のために使用した。 ８．実施例：ヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼの ｃＤＮＡライブラリーの構築 ＣＭ刺激したヒト肝細胞から単離したポリ（Ａ）ｍＲＮＡを約２０マイクログ ラムを用いて、ｃＤＮＡライブラリーを構築した（ストラタジーン、ラ・ホラ、 カリフォルニアによる）。第１鎖ｃＤＮＡをヒト肝細胞ポリ（Ａ）ｍＲＮＡから 、オリゴｄＴプライマーとともにＭｏＭＬＶ逆転写酵素を用いて合成した。長さ にして１０００ヌクレオチド塩基対よりも小さい鎖を排除した後、ｃＤＮＡをラ ムダＺａｐIIファージベクター（ストラタジーン，ラ・ホラ，カリフォルニア） に挿入し、力価を調べた。 ９．実施例：ヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡクローン のためのｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために、１×１０⁶個のファージ を細菌（E.coli Sure 株）と３４〜４０℃で１５〜３０分間インキュベートした 。該混合物を、溶解した寒天に添加し、２０×２０センチメーターの寒天プレー トに、２×１０⁵個プラーク／プレートの密度になるように注いだ（Maniatisら ，1982，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，コールドスプリングハーバ ー研究所，コールドスプリングハーバー，ニューヨーク）。プレートを３４〜４ ０℃で、一晩、６〜２４時間インキュベートしてファージで細菌を溶菌させた。 プラークをニトロセルロースフィルターに転写しｉＮＯＳｃＤＮＡ挿入断片を保 有するクローンを³²Ｐ標識したマウスマクロファージ誘導型一酸化窒素シンター ゼｃＤＮＡプローブを用いたフィルターハイブリダイゼーションによって同定し た。オートラジオグラフ系列による場所付けの後、陽性に標識されたクローンを 寒天 プレートからくり抜いた。陽性クローンをラムダＺａｐIIファージベクターから ヘルパーファージＥｘＡｓｓｉｓｔ（ストラタジーン，ラ・ホラ，カリフォルニ ア州）を用いてレスキューし、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン ，ラ・ホラ，カリフォルニア州）を用いてプラスミドベクターに転換した。ヒト 肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼのｃＤＮＡをEcoRI 酵素を用いた切断によっ てＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドから切除し、ゲル電気泳動によって分子量を 決め、全長のクローンを同定した。ｃＤＮＡの同一性はＤＮＡの配列決定により 、及びマウスマクロファージｉＮＯＳｃＤＮＡプローブを用いたサザンブロット ハイブリダイゼーションによって確認した。加えて、本発明の全長のヒト誘導型 一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡクローンをプローブとして用いて、サイトカイン で刺激したヒト肝細胞のポリ（Ａ）ｍＲＮＡのノザンブロット解析を行った。図 ５はヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡの発現の経時変化を示して いる。該ＲＮＡは図２及び３に挙げられた患者とは異なった患者から単離された ものである。図５の患者の細胞を図２に記載したものと同じ薬剤に暴露した。図 ５はクローン化されたヒト誘導型一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡが、マウスマク ロファージｉＮＯＳｃＤＮＡプローブと同じサイズのｍＲＮＡシグナルに相違な いことの確認、すなわち、それの同一性のさらなる確証を示している。単離され た、本発明のヒト誘導型一酸化窒素シンターゼをコードするｃＤＮＡクローンが 、ヒト誘導型一酸化窒素シンターゼｍＲＮＡとハイブリダイズすることができる 、つまり本発明のｃＤＮＡクローンが持つ、ヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンタ ーゼｍＲＮＡを同定する能力を立証することができるということは重要なことで ある。 １０．実施例：ｃＤＮＡの配列決定 プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔは、２本鎖ＤＮＡの配列決定を容 易にするのに使用された万能プライマー領域を含んでいる。陽性クローンはSang er、上述、のジデオキシヌクレオチド技術を用いてＧｅｎｅｓｉｓ２０００ シークエンシングシステム（ＵＳＢ，クリーブランド，オハイオ州）で配列を決 定した。配列解析はピッツバーグ スーパーコンピューターセンター（Billiar TR.，ピッツバーグ スーパーコンピューターセンター，ピッッバーグ，ペンシ ルヴァニア州）から入手可能なＧｅｎＢａｎｋ ＤＮＡ シークエンシングソフ トウェアプログラムを用いて行った。 １１．実施例：ヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼの発現 全長ｃＤＮＡの同一性の確認を組換えヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼ タンパク質の発現によって行った。ヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼｃＤ ＮＡを、ＣＭＶプロモーターを利用しているｐＣＩＳ発現ベクター（ジェネンテ ック，カリフォルニア州）に連結させた。次に該発現ベクターをヒト胎児腎２９ ３細胞（ＡＴＣＣ，メリーランド）にトランスフェクトした。一酸化窒素シンタ ーゼは［³Ｈ］アルギニンの［³Ｈ］シトルリンへの変換を測定することにより検 定した。当業者であれば、この発現系がクローン化されたラットの脳の構成型一 酸化窒素シンターゼの発現にも首尾よく利用できたことを、また刺激していない ２９３腎細胞においては一酸化窒素シンターゼの活性が無視できるほど僅かであ ったことを認識するであろう（Bredt ら，1991，Nature，351: 714-718）。本発 明の肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡクローンの同一性を前述のよう にして確認した後、ｃＤＮＡを、大量に酵素を産生させる（1988，Texas Agricu lture Experiment Station Bulletin，No．1555）バキュロウイルス発現系（イ ンビトロゲン，サンディエゴ，カリフォルニア州）で発現させた。詳しくは、ヒ ト肝細胞一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡをバキュロウイルス運搬ベクターに挿入 し、野生型のウイルスＤＮＡとともにＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ，メリーランド ）に共トランスフェクトした。組換えウイルスプラークを単離しタンパク質を過 剰発現させた。 １２．実施例：ヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼタンパク質の精製 得られたヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼタンパク質を２段階の手順を 用いて精製した。まず、タンパク質をＤＥＡＥセルロースの陰イオン交換カラム に通した。続いて２’５’−ＡＤＰセファロースを用いたアフィニティークロマ トグラフィーに通した（Evans ら，1992，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:536 1-5365）。純度はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって調べた。活 性は各々の段階後に、ＬアルギニンからＮＯ₂-及びＮＯ₃-を産生する酵素の活性 を測定することによって定量した。ＮＯ₂-及びＮＯ₃-はGreen 反応（Green ら， 1982，Anal．Biochem．126:131-137）に基づく自動比色反応を用いて測定した。 説明の目的で、本発明の特定の実施態様を上述してきたが、当業者であれば本 発明の詳細の数多くの変化態様が、配列表に続いて付された特許請求の範囲に定 義されている発明から逸脱することなく成し得るものであることは明らかであろ う。 １３．実施例：血管閉塞性疾患の治療 １３．１ 材料と方法 全ＲＮＡ抽出、ノザン、サザン、ウエスタンブロット、及びＰＣＲは当業者に は通常行われる技術である（例えば、一般的にManiatisら，1989，Molecular Cl oning: A Laboratory Manual，コールドスプリングハーバー研究所，コールドス プリングハーバー，ニューヨーク州；Gellerら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 9 0: 522-526; Towbinら，1979，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 76: 4350; Brenner ら，1989，BioTechniques 7: 1096-1103）。直接的なｉＮＯＳ酵素アッセイ法は 、（Bredt ら，1991，Nature，351: 714-718）に述べられている様に、［³Ｈ］ アルギニンの［³Ｈ］シトルリンへの変換を測定するものである。ＮＯ₂-＋ＮＯ₃ -のレベルは培養上清中でGriess反応（Green ら，1982，Anal．Biochem．126: 1 31-137）に基づいた自動方法によって測定する。簡単に言えば、ｉＮＯＳの免疫 組織化学は以下の様にして行われる：細胞をリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で ２回洗浄し、ＰＢＳで２％としたパラホルムアルデヒドで固定し、０．１％トラ イトンＸ１００を含有する、ＰＢＳで２％としたパラホルムアルデヒドで透過性 とする。細胞を１次抗体と２時間インキュベートする。抗ＮＯＳ抗体で標識し標 本を洗浄し、ビオチン化した２次抗体とインキュベートし、再び洗浄して０．１ ％過酸化水素で処理する。さらに続いて細胞を洗浄し、ＡＢＣ試薬で４５分間処 理し、洗浄し、ジアミノベンチジンで５分間処理し、最後に水で洗浄してトルイ ジンブルーで計数染色する。 １３．１．１ ヒトｉＮＯＳｃＤＮＡでの標的細胞の 生体外トランスフェクション ユカタンミニブタ由来の初代ブタ内皮細胞（ＹＰＥ細胞）はReitman ら(1982 ，Atherosclerosis 43: 119-132)によって記載され、Nabel ら(1989，Science 2 44: 1342-1344)に略述されている様にして単離される。細胞を１０％ＦＢＳ、２ ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０単位／ｍｌペニシリン、及び５μｇ／ｍｌストレプ トマイシンを添加した培地１９９（Ｍ１９９）でインキュベートする。 レトロウイルスによる感染、アデノ関連ウイルスによる感染及びリポソーム介 在性のトランスフェクションによる内皮細胞への遺伝子導入が利用される。レト ロウイルス感染を例示すると、レトウイルスベクターはＭＦＧ−ｉＮＯＳを構築 するのに利用されるＭＦＧベクターである（図６及び図７参照）。ＭＦＧベクタ ーは複製欠損にするために、pol 及び envタンパク質をコードしているＤＮＡ配 列を削除した単純化ＭｏＭＬＶベクターである。gag 配列もほとんどが削除され ている。ヒト肝細胞ｉＮＯＳｃＤＮＡを、図６及び図７に示す様に、レトロウイ ルスベクターＭＦＧのNcoI及びBamHI クローニングサイトに挿入した。要は、Ｍ ＦＧベクターは、５’NcoIサイト及び３’BamHI サイトからなるユニークなクロ ーニング領域を有するのである。ｉＮＯＳｃＤＮＡの塩基対２０５の位置で点変 異を起こさせるために、ＰＣＲプライマーを用い、ＡＴＧ開始コドンが取り込ま れたNcoIサイトを作った。ｉＮＯＳｃＤＮＡのＰＣＲ産物の、塩基対２０５の位 置のNcoIサイトから塩基対１０５９の位置でのEcoRI サイトにわたる５’断片を 単離した。ｐＢＳｃｒｉｐｔ−ｉＮＯＳプラスミドを、ｉＮＯＳｃＤＮＡの塩基 対３７０５の位置で特異的に切断するAflII で線状化することによって、３’Ba mHI サイトを作製した。この制限部位はｉＮＯＳの停止コドンから下流およそ４ ０塩基対に位置している。そして、BclIリンカーを線状化したプラスミドに連結 した。EcoRI 及びBclIで２重消化して、塩基対１０６０（EcoRI）から塩基対３ ７１０（BclI）の、ｉＮＯＳｃＤＮＡの３’断片を単離した。BclI突出部はBamH I によってできた突出部に相補的である。ＭＦＧ、５’NcoIサイトを有する５’ ＰＣＲ産物、及び３’BclIリンカーを有する３’断片の間での３つの部分の連結 を行った。Escherichia coliをライゲーション混合物で形質転換し、アンピシリ ン選別上で生育させた。形質転換体を単離し、正しく再構築されているＭＦＧ− ｉＮＯＳ構築物を求めてスクリーニングした。正しい形質転換体を１つ単離し、 大容量のプラスミドＤＮＡの調製を行った。 また、２つめのレトロウイルスベクターを選択的なネオマイシン耐性マーカー を含むように構築した（図６及び図７参照）。ＭＦＧレトロウイルスベクターは 、ＭＦＧの３’BamHI クローニングサイトの位置で挿入された内部リボソーム侵 入部位（ＩＲＥＳ）に続いてネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ^R）を含むように 予め設計されている。ＩＲＥＳ配列により１つの多シストロン性ｍＲＮＡ由来の 多重タンパク質産物の翻訳が見込まれる。このＭＦＧ−ＩＲＥＳ−Ｎｅｏ^Rプラ スミドを制限酵素SalI（ＭＦＧのNcoIクローニングサイトの上流およそ３０００ 塩基対を切断する）およびBamHI で消化した。ＩＲＥＳ及びＮｅｏ^Rに付いたＭ ＦＧのバックボーンの大部分を含んでいる大きな方の断片を精製した。あらかじ め構築しておいたＭＦＧ−ｉＮＯＳベクターもまた、SalI及びEcoRI で消化し、 ｉＮＯＳｃＤＮＡの５’部位を含む３．７Ｋｂの断片を単離した。ｉＮＯＳｃＤ ＮＡの３’末端はＭＦＧ−ｉＮＯＳを構築するために用いられるBclIリンカーの ３’断片と同一である。ＭＦＧ−ＩＲＥＳ−Ｎｅｏ^R、ｉＮＯＳｃＤＮＡの５’ 末端を有する５’SalI−EcoRI 断片、及びBclIリンカーを有する３’ｉＮＯＳｃ ＤＮ Ａの３つの部分の連結を行った。そしてライゲーション混合物をE．coli に形質 転換し、アンピシリン耐性形質転換体を選択した。正しく配向された構築物を有 するそのような陽性の形質転換体を本明細書ではＤＦＧ−ｉＮＯＳ−Ｎｅｏ^Rと 呼ぶが、それを単離し、大容量のプラスミド調製を行った。 ヒト肝細胞ｉＮＯＳｃＤＮＡの一部を保有するこれらのレトロウイルスベクタ ーを、通常のリン酸カルシウムトランスフェクション法を用いてＣＲＩＰ細胞パ ッケージング系（Danos とMulligan，1988，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85: 6 460-6464）にトランスフェクトした。ウイルスベクターＤＦＧ−ｉＮＯＳ−Ｎｅ ｏ^Rは合成抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を供与することができる。ＤＦＧ−ｉ ＮＯＳ−Ｎｅｏ^RでトランスフェクトしたＣＲＩＰ細胞をＧ４１８に対する耐性 に基づいて選別した。ＣＲＩＰ細胞系は、組換えウイルスＲＮＡを感染粒子にパ ッケージングするのに必要な３つのウイルスタンパク質を発現する。さらに、Ｃ ＲＩＰ細胞系によって産生されるウイルス粒子は、ヒト細胞を含む広く多種にわ たる哺乳類細胞に効率よく感染することができる。この細胞系によって産生され る全てのレトロウイルス粒子は、複製欠損があるが哺乳類細胞への安定な組み込 み能力は維持しており、これらの細胞に遺伝的な特性を伝達する。この方法によ って産生されたウイルス保存株は実質的に、ヘルパーウイルス粒子の混入がなく 、また非病原性である。 ＭＦＧ−ｉＮＯＳ及びＤＦＧ−ｉＮＯＳ−Ｎｅｏ^Rの両ベクターのウイルス上 清を用いて、Zwiebel ら(1989，Science 249:220-222)によって述べられた様に して生体外で内皮細胞に感染させた。要は、ＭＦＧ−ｉＮＯＳプロウイルスＤＮ ＡでトランスフェクトされたＣＲＩＰ産生細胞は選択マーカーを保有していなか った。ＭＦＧ−ｉＮＯＳウイルスを産生するものもあり、また産生しないものも あるという不均一な分布を示すＣＲＩＰ細胞を生育し、ウイルス上清を回収し、 内皮細胞に感染させた。ＤＦＧ−ｉＮＯＳ−Ｎｅｏ^Rでトランスフェクトされた ＣＲＩＰ細胞は選択マーカー（Ｇ４１８に対する耐性）を保有し、そして高力価 のＭＦＧ−ｉＮＯＳ−Ｎｅｏウイルス上清を産生するＣＲＩＰ産生細胞を単離し 、 繁殖させた。ＭＦＧ−ｉＮＯＳ及びＤＦＧ ｉＮＯＳ−Ｎｅｏ^Rのウイルス上清 にはこれらのウイルスはみられなかった。以下に述べる様にして、これらのウイ ルス上清を用いて内皮細胞に生体外で感染させ、感染後４８−７２時間でのｉＮ ＯＳ活性を定量した（図９及び１０）。 実効感染を測定するために、内皮細胞の一酸化窒素産生をいくつかの方法を用 いて測定し、対照のウイルスで感染させた内皮細胞と比較する。手をつけていな い細胞によって産生される一酸化窒素は、培養培地中へのＮＯ₂-＋ＮＯ₃-の遊離 を測定することにより定量する。図９及び１０は、ＭＦＧ−ｉＮＯＳ及びＤＦＧ −ｉＮＯＳ−Ｎｅｏ^Rの両ベクターを用いたｉＮＯＳ機能の内皮細胞への成功し た伝達を示し、それは非感染の、及び対照のウイルスで感染させた内皮細胞に比 べて、ＮＯ₂-産生が増加したことによって立証されている。細胞内での酵素活性 は、培養細胞からのサイトゾル調製品で測定できる。ｉＮＯＳは、本来のｃＮＯ Ｓの７０−９０％が分布する膜分画における活性を排除することによって、本来 のｃＮＯＳと区別できる。ｉＮＯＳｍＲＮＡの存在はノザンブロット解析によっ て検出されるであろう。内皮ｃＮＯＳｍＲＮＡは増幅しない、ｉＮＯＳに対する ヒト特異的ＰＣＲプライマーを、ヒトｉＮＯＳ配列に基づいて一組設計する。ｉ ＮＯＳタンパク質はサイトゾルタンパク質のウエスタンブロット解析及び完全な 状態の細胞の免疫組織化学（細胞内の発現部位を定めるため）によって調べる。 ウエスタンブロット解析及び免疫組織化学的な技術には、あらかじめ特性を調べ てあるヒト及びマウスｉＮＯＳ抗体、及びヒトｃＮＯＳ抗体を用いる。免疫組織 化学では、陽性に染色された内皮細胞の割合を算出することで感染の効率を評価 できる。内皮細胞のｉＮＯＳの発現の安定性は続く細胞継代の間にわたって追跡 される。一酸化窒素により誘導される毒性は細胞の形態及びＤＮＡ合成の為の³ Ｈ−チミジンの取り込みによって測定する。過剰の一酸化窒素の産生によって生 じる生体外での毒性は、Ｎ^G−モノメチル−Ｌ−アルギニン（ＮＭＡ）のような 、ｉＮＯＳ酵素を競合的に阻害するが遺伝子の発現には影響を及ぼさない阻害剤 を添加することによって制御され得る。一酸化窒素の毒性を制限するための２ 番目の技術としては、培養中へのヘモグロビンの添加である。ヘモグロビンは速 やかに結合し一酸化窒素を不活性化する。 また、標的細胞中での一過性の及び長期のｉＮＯＳ ＤＮＡ配列の発現を促進 するように、裸のＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡ構築物のような非ウイルス 性のベクターも含むがこれに限定されない）による内皮細胞へのトランスフェク ションを行う。Gao とHuang（1991，Biochem．Biophys．Res．Comm．179: 280-2 85）によって述べられた様にして、ＤＮＡ−陽イオンリポソーム複合体を形成し て、内皮細胞へのトランスフェクション用のｉＮＯＳ含有構築物を調製する。ヒ ト肝細胞ｉＮＯＳｃＤＮＡ配列を、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーを利用し ているｐＣＩＳ発現ベクター（ジェネンテック）にサブクローニングし、結果と して、一過性のトランスフェクション実験において高いｉＮＯＳ活性を得る。ｐ ＣＩＳのＣＭＶエンハンサー／プロモーター配列に加えて、５３７０塩基対の哺 乳類発現プラスミドのプロモーターエンハンサー断片の下流の配列は、５’−３ ’の順に、ＣＭＶイントロン、対象とするＤＮＡ断片の連結のためのポリリンカ ー配列、ＳＶ４０ポリアデニレーション部位、ＳＶ４０複製開始点、ＤＨＦＲｃ ＤＮＡ断片及びβ−ラクタマーゼｃＤＮＡを含み、アンピシリン耐性を供与する 。明細書の他の部分で考察してある様に、対象とするｉＮＯＳ配列を標的細胞に 送達するためには、幾つでも哺乳類発現ベクターが利用できる。ｐＣＩＳ−ｉＮ ＯＳ ＤＮＡをリポフェクタミン（ＢＲＬ）に１μｇＤＮＡ／１０ｎモルリポソ ームの割合で結合させ、ゆっくりと内皮細胞に添加する。細胞を無血清の培地で ５時間インキュベートし、続いて洗浄し、４８時間後にｉＮＯＳ活性を測定した 。リポフェクタミン試薬は、培養マウス内皮細胞において、およそ１０％のトラ ンスフェクション効率が証明されている。ベクターＤＮＡのリポソームトランス フェクションは、一過性の及び長期のｉＮＯＳの発現の促進と同様に、上記で考 察したありうる一酸化窒素の毒性の測定系もまた提供する。 標的内皮細胞集団のための、上記に開示された方法の幾つかを血管平滑筋細胞 の指示性トランスフェクションあるいは感染に適用してもよい。限定はされない が、一つの例として、図１１は血管平滑筋細胞を標的とするｐＣＩＳ−ｉＮＯＳ ／リポフェクタミン トランスフェクションの結果を表している。ｐＣＩＳ−ｉ ＮＯＳでトランスフェクトされた血管平滑筋細胞において、有意な亜硝酸塩の産 生が、Ｎ^G−モノエチルアルギニン非存在下で検出され存在下で検出されない。 さらに、対照のプラスミド（ｐＳＶ−ｌａｃＺ）及びリポソームを添加あるいは 非添加した場合のプラスミド欠損対照でのトランスフェクションでは亜硝酸塩の 産生は検出されない。明細書を通して考察した様に、この内皮及び／又は血管平 滑筋細胞をターゲティングする方法は動脈内腔内層標的細胞の、生体内原位置で のトランスフェクションに特に好適である。 ｉＮＯＳをコードしているＤＮＡ配列を送達するさらなる様式は雑種リポソー ム：アデノに関連した（ＡＡＶ）構築物を利用するものである。リポソームトラ ンスフェクション手法の利用により、ｉＮＯＳ ＤＮＡ配列からなるＡＡＶウイ ルスベクターの利用が許される。この組換えＡＡＶ構築物をＡＡＶのrep 遺伝子 を含むプラスミドと共に標的内皮細胞に共トランスフェクトし、rep タンパク質 の一過性の発現を与え、標的細胞ゲノム内への組換えＡＡＶゲノムの安定な組み 込みをエンハンスする。トランスフェクトされたｉＮＯＳと内皮細胞によって発 現されているかもしれない在来の少量のｉＮＯＳとを識別するために、ｉＮＯＳ 構築物には赤血球凝集素エピトープの標識を含める。エピトープ標識は５’及び ３’の両方に挿入し、ｉＮＯＳ活性における影響について調べる。当業者には既 知の方法によって、赤血球凝集素エピトープに対する抗体を用いてトランスフェ クトされたｉＮＯＳを確認する。 決してこれに限定はされないが、１例では、ｐＣＩＳ−ｉＮＯＳのＣＭＶプロ モーターｉＮＯＳ領域をＡＡＶの末端反復配列の間に連結させる。ｉＮＯＳ−Ａ ＡＶ構築物をＡＡＶのrep 遺伝子を含むプラスミド及びリポフェクタミン（ＢＲ Ｌ）とともに内皮細胞に共トランスフェクトする。ｉＮＯＳ活性の測定を４８− ７２時間後に測定する。 さらに、ＡＡＶ−ｉＮＯＳ構築物は標的内皮細胞を感染させるために用いても よい（ベクターに基づいた遺伝子治療としてのＡＡＶゲノムの利用の総説、Muzy czka，1992，Current Topics in Microbiology and Immunology 158: 97-129 参 照）。組換えウイルス単独の利用においては、ヒト肝細胞ｉＮＯＳ ＤＮＡ配列 及び野生型のＡＡＶ遺伝子産物をトランスに供与する非パッケージング相補的Ａ ＡＶプラスミドを含む組換えＡＡＶプラスミドで、アデノウイルスやヘルペスウ イルスの様なヘルパーウイルスを含むヒト細胞をトランスフェクトする。該組換 えＡＡＶウイルス（ｉＮＯＳ ＤＮＡ配列を含む）をヘルパーウイルスの混入か ら精製し、標的内皮細胞の感染に利用する。 １３．１．２．生体内での動脈細胞の操作 ユカタンミニブタをペントバルビタールで麻酔し、腸骨大腿骨動脈を無菌技術 によって露出する。Nabel ら(1989，Science 244: 1342-1344)に述べられている 様にして、特別に設計された２重にバルーンのあるカテーテル（シー．アール． バード社）を腸骨の動脈に挿入し、部分的に膨らませ、そして通過させて機械的 に内皮を露出させる。露出された部分内でカテーテルの場所を移し、近位及び遠 位のバルーンを膨らませ、続いてヘパリンを灌漑し、そして１０分間ディスパー ゼの点滴を行って、残っている内皮細胞を除去する。続いて、生体外でｉＮＯＳ で感染させた内皮細胞（２×１０⁶）を、３０分間点滴し、カテーテルを除去し 、動脈側の一次分枝を結合させ傷口を閉じる。 対照としては、対照ウイルスで感染させた内皮細胞を、対側性の腸骨大腿骨動 脈に植え付ける。実験及び対照の動脈の切片を２あるいは６週間後に除去する。 免疫組織化学及びｉＮＯＳ酵素の測定で生体内での発現を確認する。組織を固定 し、電子顕微鏡法を行い、内皮細胞及び血管の形態を同定する。血管系及び全身 に対する、ごくわずかな一酸化窒素による毒性が生体内で予測される。過剰の、 細胞からもれる一酸化窒素は、管腔内を循環する赤血球のヘモグロビンによって ただちに一掃されるだろう。内皮細胞の機能はアセチル化された低密度のリポタ ンパク質の取り込み、フォンウイルブランド因子の存在、及びアンジオテンシン 変換酵素活性によって確認される。 前の２つの段落で述べられている方法は、内皮細胞を、生体外でｉＮＯＳで感 染させた血管平滑筋細胞に代えて行うことができる。 １４．実施例：ＮＯＳ指示性癌治療 ｉＮＯＳ指示性の癌治療は、患者の腫瘍浸潤性リンパ球集団の回収及び選択的 な培養、ウイルス性あるいは非ウイルス性のベクターを含むｉＮＯＳの導入、及 びそれに続くｉＮＯＳが導入された細胞の患者への再移入によって例示される。 末梢血のリンパ球を患者から除去し、Rosenberg ら（1992，Human Gene Therapy 3:57-73，ここに引用することにより組み込まれる）に述べられた様に培養中で ＴＩＬを選択する。ＴＩＬはＤＦＧ−ｉＮＯＳ−Ｎｅｏ^Rを用いた形質導入のた めの標的細胞集団として利用される。導入されたＴＩＬをＧ４１８を添加した培 地中で選択し、既知の方法によって患者に再投与するように調製する。 癌を治療するためのｉＮＯＳ指示性治療の別の方法は、リポソームカプセルで の、ＭＦＧ−ｉＮＯＳの腫瘍への直接送達である。リポソームの安定性が、これ らの小胞の不浸透性の性質と合わさり、これらを、ｐＣＩＳ−ｉＮＯＳ（それに 限定はされない）のような配列を含んでいるｉＮＯＳの腫瘍への送達のための有 効な伝達手段としているのである。リポソームカプセルの腫瘍部位への部位特異 的な送達はリポソームの膜を、リポソームの腫瘍細胞のみへの接着及び融合を促 進するように、腫瘍特異的な抗体を提示するように修飾することにより促進され る。組換えｉＮＯＳベクターの腫瘍部位への局所的な送達は結果として局所的な ｉＮＯＳの発現をもたらし、一酸化窒素の産生を増加させ、然るに抗腫瘍活性を 与える。 ｐＣＩＳ−ｉＮＯＳリポソームは、注射あるいは外科的な移殖によって生体内 投与されるよう、好適な医薬担体に製剤化する。 １５．実施例：ＮＯＳ指示性抗菌治療 局所的なｉＮＯＳ発現の増加による微生物感染の治療を、マラリア感染の治療 を通じて例示する。組換えプラスミドベクターｐＣＩＳ−ＮＯＳをリポソームカ プセルで肝臓に局所的に送達させる。該リポソームカプセルは肝臓に特異的な表 面リガンドを提示するように修飾されている。アシアロタンパク質はシアル酸（ 例えばノイラミン酸）を除去する様に処理された糖タンパク質である。得られた アシアロタンパク質は肝細胞に特徴的なガラクトース受容体に特異的に結合する (Wall ら，1980，Cell 21: 79-83参照)。従って、アシアロタンパク質でコーテ ィングされたリポソームの中に封じ込められたｐＣＩＳ−ｉＮＯＳは確実に送達 され、肝細胞でのみｉＮＯＳが局所的に発現する。 リポソームに取り込まれたｐＣＩＳ−ｉＮＯＳベクターは、限定されないが、 注射、上皮や粘膜皮膚内層への吸着を含む適当な経路による、あるいは細胞移殖 片であろうと組織移殖片であろうと、持続放出性移殖片によって生体内投与され るように、好適な医薬担体に製剤化する。 １６．微生物の寄託 以下の微生物は、ユニバーシティ オヴ ピッツバーグ オヴ ザ コモンウ ェルス システム オヴ ハイアー エデュケーション（University of Pittsb urgh of the Commonwealth System of Higher Education）、ピッツバーグ、ペ ンシルヴァニア１５２６０、ＵＳＡの代理として、David A．Geller によって、 常設のコレクションであるアメリカン タイプ カルチャー コレクション（Ａ ＴＣＣ）、１２３０１ パークローンドライヴ、ロックヴィル、メリーランド ２０２８５２−１７７６、ＵＳＡ：に１９９２年１１月１８日に寄託され、入手 可能である。 ＡＴＣＣ ７５３５８−ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内のヒト肝細胞誘導型一酸化 窒素シンターゼｃＤＮＡ（ｐＨＩＮＯＳ） ＡＴＣＣ ６９１２６−Ｅ．coli ＳＯＬＲ細菌に形質転換されたｐＢｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔ内のヒト肝細胞誘導型一酸化窒素シンターゼｃＤＮＡ（プラスミド Ｈ ＩＮＯＳｃＤＮＡ） アメリカン タイプ カルチャー コレクションは上記の寄託された微生物の 各々の生存性のテストを行い、１９９２年１１月２０日に、上記の寄託された微 生物は生存しており、再産生する能力を有すると結論づけている。 これらの寄託物は、それらを開示した譲受人であるユニバーシティ オヴ ピ ッツバーグ オヴ ザ コモンウェルス システム オヴ ハイアー エデュケ ーションに対する特許の許可に基づいて、公に入手可能である。しかしながら、 これらの寄託物の入手可能性が、政府の決定によって許可される特許権を減損さ せて本発明を実施するためのライセンスを構成するものではないということを理 解しておくべきである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年５月２９日 【補正内容】特許請求の範囲 ： １．哺乳動物宿主の血管閉塞を伴う血管疾患又は障害の治療方法であって、該閉 塞によって特徴づけられる血管の領域内の哺乳動物細胞集団に、生物学的に活性 なｉＮＯＳタンパク質又はタンパク質断片をコードする単離された核酸断片を移 入し、そのようにしてｉＮＯＳの発現を局所的に増加させることにより該血管疾 患又は障害を治療することを含む方法。 ２．該哺乳動物宿主がヒトである特許請求の範囲１の方法。 ３．該生物学的に活性なｉＮＯＳタンパク質又はｉＮＯＳタンパク質断片をコー ドする該核酸断片が、単離されたヒトＤＮＡ配列である特許請求の範囲２の方法 。 ４．該哺乳動物の細胞集団が内皮細胞及び血管平滑筋細胞からなる群より選択さ れる原位置の哺乳動物細胞である特許請求の範囲３の方法。 ５．バルーン血管形成術、機械的動脈内膜切除術及び血管内視鏡検査からなる群 より選択される血管内の外科的手法により該閉塞を実質的に一掃することを含む 特許請求の範囲４の方法。 ６．該血管の該領域を物理的に隔離し、該核酸断片を該細胞に送達するために、 ダブルバルーンカテーテルを利用することを含む特許請求の範囲５の方法。 ７．生物学的に活性なｉＮＯＳタンパク質をコードする該ヒトＤＮＡ配列が組換 えレトロウイルスベクターとして該細胞に渡されるものである、特許請求の範囲 ５の方法。 ８．生物学的に活性なｉＮＯＳタンパク質をコードする該ヒトＤＮＡ配列が組換 えレトロウイルスベクターとして該細胞に渡されるものである、特許請求の範囲 ６の方法。 ９．該組換えレトロウイルスベクターが組換えＭｏＭＬＶレトロウイルスベクタ ーである特許請求の範囲７の方法。 １０．該組換えレトロウイルスベクターが組換えＭｏＭＬＶレトロウイルスベク ターである特許請求の範囲８の方法。 １１．該組換えＭｏＭＬＶベクターがＭＦＧ−ｉＮＯＳである特許請求の範囲９ の方法。 １２．該組換えＭｏＭＬＶベクターがＤＦＧ−ｉＮＯＳ−Ｎｅｏである特許請求 の範囲９の方法。 １３．該組換えＭｏＭＬＶベクターがＭＦＧ−ｉＮＯＳである特許請求の範囲１ ０の方法。 １４．該組換えＭｏＭＬＶベクターがＤＦＧ−ｉＮＯＳ−Ｎｅｏである特許請求 の範囲１０の方法。 １５．該ヒトＤＮＡ配列が組換えプラスミドＤＮＡベクターとしてリポソームを 介するトランスフェクションにより該培養哺乳動物細胞に渡されるものである、 特許請求の範囲６の方法。 １６．該組換えプラスミドＤＮＡベクターがｐＣＩＳ−ｉＮＯＳである特許請求 の範囲１５の方法。 １７．該組換えウイルスベクターがアデノウイルスベクターである特許請求の範 囲６の方法。 １８．該組換えウイルスベクターがアデノ随伴ベクターである特許請求の範囲６ の方法。 １９．動脈管の閉塞によって特徴づけられるヒトの血管疾患又は障害の治療方法 であって、 （ａ）該動脈管の閉塞した領域を一掃し、 （ｂ）該動脈管の一掃された領域を物理的に隔離し、 （ｃ）内皮細胞及び血管平滑筋細胞からなる動脈内腔細胞群より選択される 哺乳動物細胞の原位置でのトランスフェクションを促進するために、生物学的に 活性なｉＮＯＳタンパク質をコードする核酸断片の集団を該動脈管の一掃された 領域に送達し、そのようにして該原位置でトランスフェクトされた哺乳動物細胞 内でのｉＮＯＳの発現が該閉塞を長期に渡って軽減するようにすることにより治 療効果を与えることを含む方法。 ２０．工程（ａ）がバルーン血管形成術、機械的動脈内膜切除術及び血管内視鏡 検査からなる群より選択される血管内の外科的手法により達成されるものである 、特許請求の範囲１９の方法。 ２１．工程（ｂ）及び（ｃ）が該動脈の一掃された該領域を物理的に隔離するた めにダブルバルーンカテーテルを利用することを含むものである、特許請求の範 囲２０の方法。 ２２．生物学的に活性なｉＮＯＳタンパク質又はｉＮＯＳタンパク質断片をコー ドする該核酸断片が、組換えウイルスベクターとして、該原位置の哺乳動物細胞 に渡されるものである、特許請求の範囲２１の方法。 ２３．該組換えレトロウイルスベクターが組換えＭｏＭＬＶレトロウイルスベク ターである特許請求の範囲２２の方法。 ２４．該組換えＭｏＭＬＶベクターがＭＦＧ−ｉＮＯＳである特許請求の範囲２ ３の方法。 ２５．該組換えＭｏＭＬＶベクターがＤＦＧ−ｉＮＯＳ−Ｎｅｏである特許請求 の範囲２３の方法。 ２６．該核酸断片が組換えプラスミドＤＮＡベクターとして、リポソームを介す るトランスフェクションにより、該原位置の哺乳動物細胞に渡されるものである 、特許請求の範囲１９の方法。 ２７．該組換えブラスミドＤＮＡベクターがｐＣＩＳ−ｉＮＯＳである特許請求 の範囲２６の方法。 ２８．該組換えウイルスベクターがアデノウイルスベクターである特許請求の範 囲１９の方法。 ２９．該組換えウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである特許請求 の範囲１９の方法。 ３０．血管閉塞を伴う血管疾患又は障害を有する患者を血管バイパス手術を通し て治療する方法であって、 （ａ）内皮細胞、血管平滑筋細胞、及び内皮細胞と血管平滑筋細胞との組み 合わせからなる群より選択される、インビトロで培養された哺乳動物細胞に、生 物学的に活性なｉＮＯＳタンパク質をコードする単離された核酸断片の集団をト ランスフェクトすることにより、ｉＮＯＳトランスフェクト哺乳動物細胞集団を 生じせしめ、 （ｂ）合成又は内生の導管に該ｉＮＯＳトランスフェクト哺乳動物細胞集団 を接種し、 （ｃ）該合成又は内生の導管に結合された該ｉＮＯＳトランスフェクト哺乳 動物細胞内でのｉＮＯＳの発現を促進するために、近位及び遠位の吻合を形成さ せて該患者体内の動脈をバイパスすることにより、該血管疾患又は障害を予防及 び治療することを含む方法。 ３１．生物学的に活性なｉＮＯＳタンパク質をコードする該核酸断片が組換えウ イルスベクターとして該培養哺乳動物細胞に渡されるものである、特許請求の範 囲３０の方法。 ３２．該組換えレトロウイルスベクターが組換えＭｏＭＬＶレトロウイルスベク ターである特許請求の範囲３１の方法。 ３３．該組換えＭｏＭＬＶベクターがＭＦＧ−ｉＮＯＳである特許請求の範囲３ ２の方法。 ３４．該組換えＭｏＭＬＶベクターがＤＦＧ−ｉＮＯＳ−Ｎｅｏである特許請求 の範囲３２の方法。 ３５．該核酸断片が組換えブラスミドＤＮＡベクターとして、リポソームを介す る形質転換により、該培養哺乳動物細胞に渡されるものである、特許請求の範囲 ３０の方法。 ３６．該組換えＤＮＡベクターがｐＣＩＳ−ｉＮＯＳである特許請求の範囲３５ の方法。 ３７．該組換えウイルスベクターがアデノウイルスベクターである特許請求の範 囲３０の方法。 ３８．該組換えウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである特許請求 の範囲３０の方法。 ３９．該合成バイパス移植片がポリテトラフルオロエチレンからなる移植片であ る特許請求の範囲３０の方法。 ４０．生物学的に活性なｉＮＯＳタンパク質をコードする該核酸断片が、組換え ウイルスベクターとして、該培養哺乳動物細胞に渡されるものである、特許請求 の範囲３９の方法。 ４１．該組換えレトロウイルスベクターが組換えＭｏＭＬＶレトロウイルスベク ターである特許請求の範囲４０の方法。 ４２．該組換えＭｏＭＬＶベクターがＭＦＧ−ｉＮＯＳである特許請求の範囲４ １の方法。 ４３．該組換えＭｏＭＬＶベクターがＤＦＧ−ｉＮＯＳ−Ｎｅｏである特許請求 の範囲４１の方法。 ４４．該核酸断片が、組換えプラスミドＤＮＡベクターとして、リポソームを介 する形質転換により該培養内皮細胞に渡されるものである、特許請求の範囲３９ の方法。 ４５．該組換えＤＮＡベクターがｐＣＩＳ−ｉＮＯＳである特許請求の範囲４４ の方法。 ４６．該組換えウイルスベクターがアデノウイルスベクターである特許請求の範 囲３９の方法。 ４７．該組換えウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである特許請求 の範囲３９の方法。 ４８．血管閉塞を伴う血管疾患又は障害を有する患者を血管バイパス手術を通し て治療する方法であって、 （ａ）内皮細胞、血管平滑筋細胞、及び内皮細胞と血管平滑筋細胞との組み 合わせからなる群より選択される、インビトロで培養された哺乳動物細胞に、生 物学的に活性なｉＮＯＳタンパク質をコードする、単離された核酸断片の集団を トランスフェクトすることにより、ｉＮＯＳトランスフェクト哺乳動物細胞集団 を生じせしめ、 （ｂ）近位及び遠位の吻合を形成させて該患者の動脈の罹患した部分をバイ パスし、 （ｃ）移植片の縫合に続いて該吻合を物理的に隔離し、 （ｄ）該吻合に近接した該動脈の動脈壁に再生着させるために、該ｉＮＯＳ トランスフェクト哺乳動物細胞を該吻合の隔離された領域に接種し、そのように して局所的にｉＮＯＳ濃度を増加させることにより該疾患又は障害を予防及び治 療することを含む方法。 ４９．工程（ｃ）の該吻合が該遠位の吻合である特許請求の範囲４８の方法。 ５０．工程（ｃ）が該動脈の操作された部分を物理的に隔離するためにダブルバ ルーンカテーテルを利用することを含む特許請求の範囲４９の方法。 ５１．生物学的に活性なｉＮＯＳタンパク質をコードする該核酸断片が、組換え ウイルスベクターとして、該原位置の哺乳動物細胞に渡されるものである、特許 請求の範囲５０の方法。 ５２．該組換えレトロウイルスベクターが組換えＭｏＭＬＶレトロウイルスベク ターである特許請求の範囲５１の方法。 ５３．該組換えＭｏＭＬＶベクターがＭＦＧ−ｉＮＯＳである特許請求の範囲５ ２の方法。 ５４．該組換えＭｏＭＬＶベクターがＤＦＧ−ｉＮＯＳ−Ｎｅｏである特許請求 の範囲５２の方法。 ５５．該核酸断片が組換えプラスミドＤＮＡベクターとして、リポソームを介す るトランスフェクションにより該原位置の哺乳動物細胞に渡されるものである、 特許請求の範囲５０の方法。 ５６．該組換えＤＮＡベクターがｐＣＩＳ−ｉＮＯＳである特許請求の範囲５５ の方法。 ５７．該組換えウイルスベクターがアデノウイルスベクターである特許請求の範 囲５０の方法。 ５８．該組換えウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである特許請求 の範囲５０の方法。 ５９．血管閉塞を伴う血管疾患又は障害に悩まされる患者を血管バイパス手術を 通して治療する方法であって、 （ａ）近位及び遠位の吻合を形成させて該患者の動脈をバイパスし、 （ｂ）移植片の縫合に続いて該吻合を物理的に隔離し、 （ｃ）該吻合において又はその周辺の内腔に沿って並ぶ、内皮細胞及び血管 平滑筋細胞からなる動脈内腔細胞群より選択される原位置の哺乳動物細胞に、生 物学的に活性なｉＮＯＳタンパク質をコードする単離された核酸断片をトランス フェクトし、そのようにして哺乳動物細胞内でのｉＮＯＳの発現により該ヒトの 血管疾患又は障害を予防及び治療する方法。 ６０．工程（ｂ）の該吻合が該遠位の吻合である特許請求の範囲５９の方法。 ６１．工程（ａ）が該動脈の一掃された領域を物理的に隔離するためにダブルバ ルーンカテーテルを利用することを含む特許請求の範囲６０の方法。 ６２．生物学的に活性なｉＮＯＳタンパク質をコードする該核酸断片が、組換え ウイルスベクターとして該原位置の哺乳動物細胞に渡されるものである、特許請 求の範囲６１の方法。 ６３．該組換えレトロウイルスベクターが組換えＭｏＭＬＶレトロウイルスベク ターである特許請求の範囲６２の方法。 ６４．該組換えＭｏＭＬＶベクターがＭＦＧ−ｉＮＯＳである特許請求の範囲６ ３の方法。 ６５．該組換えＭｏＭＬＶベクターがＤＦＧ−ｉＮＯＳ−Ｎｅｏである特許請求 の範囲６３の方法。 ６６．該核酸断片が組換えプラスミドＤＮＡベクターとして、リポソームを介す るトランスフェクションにより該原位置の哺乳動物細胞に渡されるものである、 特許請求の範囲６１の方法。 ６７．該組換えＤＮＡベクターがｐＣＩＳ−ｉＮＯＳである特許請求の範囲６６ の方法。 ６８．該組換えウイルスベクターがアデノウイルスベクターである特許請求の範 囲６１の方法。 ６９．該組換えウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである特許請求 の範囲６１の方法。 ７０．配列表配列番号１の単離されたｉＮＯＳ ＤＮＡ断片又はその生物学的に 活性な断片を含むレトロウイルス性哺乳動物発現ベクター。 ７１．ＭＦＧを基礎とするベクターである特許請求の範囲７０のレトロウイルス 性哺乳動物発現ベクター。 ７２．図７に示される、ＭＦＧ−ｉＮＯＳである特許請求の範囲７１のＭＦＧを 基礎とするレトロウイルス性哺乳動物発現ベクター。 ７３．図８に示される、ＤＦＧ−ｉＮＯＳ−Ｎｅｏである特許請求の範囲７１の ＭＦＧを基礎とするレトロウイルス性哺乳動物発現ベクター。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 5/10 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 9/06 9735−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 チェン、エディス アメリカ合衆国、ペンシルヴァニア州 15211、ピッツバーグ、ナンバー 502ピ ー、トリアモント レーン、１ (72)発明者 ヌスラー、アンドレアス ケイ. ドイツ連邦共和国、ノイ−ウルム、デー− 89231、ハルトベク、４ (72)発明者 ゲラー、デイヴィッド エイ. アメリカ合衆国、ペンシルヴァニア州 15235、ピッツバーグ、ハリウッド ドラ イヴ、2329 (72)発明者 シモンズ、リチャード エル. アメリカ合衆国、ペンシルヴァニア州 15208、ピッツバーグ、エス．マートラン ド アヴェニュー、123

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ｉＮＯＳ発現の局所的増加により疾患又は障害が治療上緩和されるように、 単離された核酸断片を哺乳動物の細胞集団に移入することを含む、哺乳動物宿主 における該疾患又は障害の治療方法であって、該核酸断片が生物学的に活性なｉ ＮＯＳタンパク質又はタンパク質断片をコードするものである方法。 ２．該哺乳動物宿主がヒトである特許請求の範囲１の方法。 ３．該疾患又は障害が血管疾患又は障害である特許請求の範囲２の方法。 ４．該生物学的に活性なｉＮＯＳタンパク質又はｉＮＯＳタンパク質断片をコー ドする単離された核酸断片が単離されたヒトＤＮＡ配列である特許請求の範囲３ の方法。 ５．該哺乳動物の細胞集団が内皮細胞、血管平滑筋細胞、及び内皮細胞と血管平 滑筋細胞との組み合わせからなる群より選択されるものである特許請求の範囲４ の方法。 ６．（ａ）該哺乳動物細胞をインビトロで培養し、 （ｂ）工程（ａ）の哺乳動物細胞を、生物学的に活性なｉＮＯＳタンパク質 又はｉＮＯＳタンパク質断片をコードする該ヒトＤＮＡ配列とともにインキュベ ートすることにより、ｉＮＯＳトランスフェクト哺乳動物細胞を得、 （ｃ）動脈の閉塞した領域を実質的に一掃し、 （ｄ）内腔への接着とそれに続く該ヒトＤＮＡ配列の発現を促進するために 、該動脈に該ｉＮＯＳトランスフェクト哺乳動物細胞を生着させ、その結果、ｉ ＮＯＳ濃度の局所的増加を生じることを含む、特許請求の範囲５の方法。 ７．工程（ｃ）がバルーン血管形成術、レーザー補助バルーン血管形成術、機械 的動脈内膜切除術及び血管内視鏡検査からなる群より選択される血管内の外科的 手法により達成されるものである、特許請求の範囲６の方法。 ８．工程（ｄ）が、該動脈の該領域を物理的に隔離し、該ｉＮＯＳをトランスフ ェクトされた哺乳動物細胞を送達するために、ダブルバルーンカテーテル法を利 用することを含むものである、特許請求の範囲７の方法。 ９．生物学的に活性なｉＮＯＳタンパク質又はｉＮＯＳタンパク質断片をコード する該ヒトＤＮＡ配列が組換えウイルスベクターとして該培養哺乳動物細胞に渡 されるものである、特許請求の範囲７の方法。 １０．生物学的に活性なｉＮＯＳタンパク質又はｉＮＯＳタンパク質断片をコー ドする該ヒトＤＮＡ配列が組換えレトロウイルスベクターとして該培養哺乳動物 細胞に渡されるものである、特許請求の範囲８の方法。 １１．該組換えレトロウイルスベクターが組換えＭｏＭＬＶレトロウイルスベク ターである特許請求の範囲９の方法。 １２．該組換えレトロウイルスベクターが組換えＭｏＭＬＶレトロウイルスベク ターである特許請求の範囲１０の方法。 １３．該組換えＭｏＭＬＶベクターがＭＦＧ−ｉＮＯＳである特許請求の範囲１ １の方法。 １４．該組換えＭｏＭＬＶベクターがＤＦＧ−ｉＮＯＳ−Ｎｅｏである特許請求 の範囲１１の方法。 １５．該組換えＭｏＭＬＶベクターがＭＦＧ−ｉＮＯＳである特許請求の範囲１ ２の方法。 １６．該組換えＭｏＭＬＶベクターがＤＦＧ−ｉＮＯＳ−Ｎｅｏである特許請求 の範囲１２の方法。 １７．該ヒトＤＮＡ配列が組換えプラスミドＤＮＡベクターとしてリポソームを 介するトランスフェクションにより該培養哺乳動物細胞に渡されるものである、 特許請求の範囲８の方法。 １８．該組換えプラスミドＤＮＡベクターがｐＣＩＳ−ｉＮＯＳである特許請求 の範囲１７の方法。 １９．該組換えウイルスベクターがアデノウイルスベクターである特許請求の範 囲８の方法。 ２０．該組換えウイルスベクターがアデノ随伴ベクターである特許請求の範囲８ の方法。 ２１．動脈の少なくとも部分的な閉塞によって特徴づけられるヒトの血管疾患又 は障害の治療方法であって、 （ａ）該動脈管の閉塞した領域を実質的に一掃し、 （ｂ）該動脈管の一掃された領域を物理的に隔離し、 （ｃ）内皮細胞、血管平滑筋細胞、及び内皮細胞と血管平滑筋細胞との組み 合わせからなる動脈内腔細胞群より選択される哺乳動物細胞の原位置でのトラン スフェクションを促進するために、生物学的に活性なｉＮＯＳタンパク質又はタ ンパク質断片をコードする核酸断片の集団を該動脈管の一掃された領域に送達し 、そのようにして該原位置でトランスフェクトされた哺乳動物細胞内でのｉＮＯ Ｓの発現により、該ヒトの血管疾患又は障害を治療上緩和する方法。 ２２．工程（ａ）がバルーン血管形成術、レーザー補助バルーン血管形成術、機 械的動脈内膜切除術及び血管内視鏡検査からなる群より選択される血管内の外科 的手法により達成されるものである、特許請求の範囲２１の方法。 ２３．工程（ｂ）及び（ｃ）が該動脈の一掃された領域を物理的に隔離するため にダブルバルーンカテーテルを利用することを含むものである、特許請求の範囲 ２２の方法。 ２４．生物学的に活性なｉＮＯＳタンパク質又はｉＮＯＳタンパク質断片をコー ドする該核酸断片が組換えウイルスベクターとして該原位置の哺乳動物細胞に渡 されるものである、特許請求の範囲２３の方法。 ２５．該組換えレトロウイルスベクターが組換えＭｏＭＬＶレトロウイルスベク ターである特許請求の範囲２４の方法。 ２６．該組換えＭｏＭＬＶベクターがＭＦＧ−ｉＮＯＳである特許請求の範囲２ ５の方法。 ２７．該組換えＭｏＭＬＶベクターがＤＦＧ−ｉＮＯＳ−Ｎｅｏである特許請求 の範囲２５の方法。 ２８．該核酸断片が組換えプラスミドＤＮＡベクターとしてリポソームを介する トランスフェクションにより該原位置の哺乳動物細胞に渡されるものである、特 許請求の範囲２１の方法。 ２９．該組換えプラスミドＤＮＡベクターがｐＣＩＳ−ｉＮＯＳである特許請求 の範囲２８の方法。 ３０．該組換えウイルスベクターがアデノウイルスベクターである特許請求の範 囲２１の方法。 ３１．該組換えウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである特許請求 の範囲２１の方法。 ３２．血管疾患又は障害を有する患者を血管バイパス手術を通じて治療する方法 であって、 （ａ）内皮細胞、血管平滑筋細胞、及び内皮細胞と血管平滑筋細胞との組み 合わせからなる群より選択されるインビトロで培養された哺乳動物細胞に、生物 学的に活性なｉＮＯＳタンパク質又はタンパク質断片をコードする単離された核 酸断片の集団をトランスフェクトすることにより、ｉＮＯＳトランスフェクト哺 乳動物細胞集団を生じせしめ、 （ｂ）合成又は内生の導管に該ｉＮＯＳトランスフェクト哺乳動物細胞集団 を接種し、 （ｃ）該合成又は内生の導管に結合された該ｉＮＯＳトランスフェクト哺乳 動物細胞内でのｉＮＯＳの発現を促進するために、近位及び遠位の吻合を形成さ せて患者体内の動脈をバイパスすることにより、該血管疾患又は障害を予防及び 治療することを含む方法。 ３３．該生物学的に活性なｉＮＯＳタンパク質又はｉＮＯＳタンパク質断片をコ ードする核酸断片が組換えウイルスベクターとして該培養哺乳動物細胞に渡され るものである、特許請求の範囲３２の方法。 ３４．該組換えレトロウイルスベクターが組換えＭｏＭＬＶレトロウイルスベク ターである特許請求の範囲３３の方法。 ３５．該組換えＭｏＭＬＶベクターがＭＦＧ−ｉＮＯＳである特許請求の範囲３ ４の方法。 ３６．該組換えＭｏＭＬＶベクターがＤＦＧ−ｉＮＯＳ−Ｎｅｏである特許請求 の範囲３４の方法。 ３７．該核酸断片が組換えプラスミドＤＮＡベクターとしてリポソームを介する 形質転換により該培養哺乳動物細胞に渡されるものである、特許請求の範囲３２ の方法。 ３８．該組換えＤＮＡベクターがｐＣＩＳ−ｉＮＯＳである特許請求の範囲３７ の方法。 ３９．該組換えウイルスベクターがアデノウイルスベクターである特許請求の範 囲３２の方法。 ４０．該組換えウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである特許請求 の範囲３２の方法。 ４１．該合成バイパス移植片がポリテトラフルオロエチレンからなる移植片であ る特許請求の範囲３２の方法。 ４２．該生物学的に活性なｉＮＯＳタンパク質又はｉＮＯＳタンパク質断片をコ ードする核酸断片が組換えウイルスベクターとして該培養哺乳動物細胞に渡され るものである、特許請求の範囲４１の方法。 ４３．該組換えレトロウイルスベクターが組換えＭｏＭＬＶレトロウイルスベク ターである特許請求の範囲４２の方法。 ４４．該組換えＭｏＭＬＶベクターがＭＦＧ−ｉＮＯＳである特許請求の範囲４ ３の方法。 ４５．該組換えＭｏＭＬＶベクターがＤＦＧ−ｉＮＯＳ−Ｎｅｏである特許請求 の範囲４３の方法。 ４６．該核酸断片が組換えプラスミドＤＮＡベクターとしてリポソームを介する 形質転換により該培養内皮細胞に渡されるものである、特許請求の範囲４１の方 法。 ４７．該組換えＤＮＡベクターがｐＣＩＳ−ｉＮＯＳである特許請求の範囲４６ の方法。 ４８．該組換えウイルスベクターがアデノウイルスベクターである特許請求の範 囲４１の方法。 ４９．該組換えウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである特許請求 の範囲４１の方法。 ５０．血管疾患又は障害を有する患者を血管バイパス手術を通じて治療する方法 であって、 （ａ）内皮細胞、血管平滑筋細胞、及び内皮細胞と血管平滑筋細胞との組み 合わせからなる群より選択されるインビトロで培養された哺乳動物細胞に、生物 学的に活性なｉＮＯＳタンパク質又はタンパク質断片をコードする単離された核 酸断片の集団をトランスフェクトすることにより、ｉＮＯＳトランスフェクト哺 乳動物細胞集団を生じせしめ、 （ｂ）近位及び遠位の吻合を形成させて患者の動脈の罹患した部分をバイパ スし、 （ｃ）移植片の縫合に続いて該吻合を物理的に隔離し、 （ｄ）該吻合に近接した該動脈の動脈壁に再生着させるために、該ｉＮＯＳ トランスフェクト哺乳動物細胞を該吻合の隔離された領域に接種し、そのように して局所的にｉＮＯＳ濃度を増加させることにより該疾患又は障害を予防及び治 療することを含む方法。 ５１．工程（ｃ）の該吻合が該遠位の吻合である特許請求の範囲５０の方法。 ５２．工程（ｃ）が該動脈の操作された部分を物理的に隔離するためにダブルバ ルーンカテーテルを利用することを含む特許請求の範囲５１の方法。 ５３．該生物学的に活性なｉＮＯＳタンパク質又はｉＮＯＳタンパク質断片をコ ードする核酸断片が組換えウイルスベクターとして該原位置の哺乳動物細胞に渡 されるものである、特許請求の範囲５２の方法。 ５４．該組換えレトロウイルスベクターが組換えＭｏＭＬＶレトロウイルスベク ターである特許請求の範囲５３の方法。 ５５．該組換えＭｏＭＬＶベクターがＭＦＧ−ｉＮＯＳである特許請求の範囲５ ４の方法。 ５６．該組換えＭｏＭＬＶベクターがＤＦＧ−ｉＮＯＳ−Ｎｅｏである特許請求 の範囲５４の方法。 ５７．該核酸断片が組換えプラスミドＤＮＡベクターとしてリポソームを介する トランスフェクションにより該原位置の哺乳動物細胞に渡されるものである、特 許請求の範囲５２の方法。 ５８．該組換えＤＮＡベクターがｐＣＩＳ−ｉＮＯＳである特許請求の範囲５７ の方法。 ５９．該組換えウイルスベクターがアデノウイルスベクターである特許請求の範 囲５２の方法。 ６０．該組換えウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである特許請求 の範囲５２の方法。 ６１．血管疾患又は障害を有する患者を血管バイパス手術を通じて治療する方法 であって、 （ａ）近位及び遠位の吻合を形成させて患者の動脈をバイパスし、 （ｂ）移植片の縫合に続いて該吻合を物理的に隔離し、及び （ｃ）該吻合において又はその周辺の内腔に沿って並ぶ、内皮細胞、血管平 滑筋細胞、及び内皮細胞と血管平滑筋細胞との組み合わせからなる動脈内腔細胞 群より選択される哺乳動物細胞に原位置で、生物学的に活性なｉＮＯＳタンパク 質又はタンパク質断片をコードする単離された核酸断片をトランスフェクトし、 そのようにして該原位置の哺乳動物細胞内でのｉＮＯＳの発現により該ヒトの血 管疾患又は障害を予防及び治療する方法。 ６２．工程（ｂ）の該吻合が該遠位の吻合である特許請求の範囲６１の方法。 ６３．工程（ａ）が該動脈の一掃された領域を物理的に隔離するためにダブルバ ルーンカテーテルを利用することを含む特許請求の範囲６２の方法。 ６４．該生物学的に活性なｉＮＯＳタンパク質又はｉＮＯＳタンパク質断片をコ ードする核酸断片が組換えウイルスベクターとして該原位置の哺乳動物細胞に渡 されるものである、特許請求の範囲６３の方法。 ６５．該組換えレトロウイルスベクターが組換えＭｏＭＬＶレトロウイルスベク ターである特許請求の範囲６４の方法。 ６６．該組換えＭｏＭＬＶベクターがＭＦＧ−ｉＮＯＳである特許請求の範囲６ ５の方法。 ６７．該組換えＭｏＭＬＶベクターがＤＦＧ−ｉＮＯＳ−Ｎｅｏである特許請求 の範囲６５の方法。 ６８．該核酸断片が組換えプラスミドＤＮＡベクターとしてリポソームを介する トランスフェクションにより該原位置の哺乳動物細胞に渡されるものである、特 許請求の範囲６３の方法。 ６９．該組換えＤＮＡベクターがｐＣＩＳ−ｉＮＯＳである特許請求の範囲６８ の方法。 ７０．該組換えウイルスベクターがアデノウイルスベクターである特許請求の範 囲６３の方法。 ７１．該組換えウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである特許請求 の範囲６３の方法。 ７２．配列表配列番号１の単離されたｉＮＯＳ ＤＮＡ断片又はその生物学的に 活性な断片を含むレトロウイルス性哺乳動物発現ベクター。 ７３．ＭＦＧを基礎とするベクターである特許請求の範囲７２のレトロウイルス 性哺乳動物発現ベクター。 ７４．図７に示される、ＭＦＧ−ｉＮＯＳである特許請求の範囲７３のＭＦＧを 基礎とするレトロウイルス性哺乳動物発現ベクター。 ７５．図８に示される、ＤＦＧ−ｉＮＯＳ−Ｎｅｏである特許請求の範囲７３の ＭＦＧを基礎とするレトロウイルス性哺乳動物発現ベクター。 ７６．配列表配列番号１の単離されたｉＮＯＳ ＤＮＡ断片又はその生物学的に 活性な断片を含むＤＮＡプラスミド発現ベクター。 ７７．ｐＣＩＳ−ｉＮＯＳである特許請求の範囲７６のＤＮＡプラスミド発現ベ クター。