JP3092944B2 - ミオシン重鎖ｓｍ１アイソフォームタンパク質をコードするｄｎａをベクターｄｎａに組み込んだ組換え体ｄｎａ並びに該組換え体ｄｎａを含有する微生物及び動脈硬化治療剤 - Google Patents

ミオシン重鎖ｓｍ１アイソフォームタンパク質をコードするｄｎａをベクターｄｎａに組み込んだ組換え体ｄｎａ並びに該組換え体ｄｎａを含有する微生物及び動脈硬化治療剤

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JP3092944B2 JP08522776A JP52277696A JP3092944B2 JP 3092944 B2 JP3092944 B2 JP 3092944B2 JP 08522776 A JP08522776 A JP 08522776A JP 52277696 A JP52277696 A JP 52277696A JP 3092944 B2 JP3092944 B2 JP 3092944B2
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絵美 荒川
祥二 小田
譲 松田
克仁 高橋
理裕 菅原
晴生 石山
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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、遺伝子治療に用いるミオシン重鎖SM1アイ
ソフォームタンパク質をコードするDNAをベクターDNAに
組み込んだ組換え体DNA並びに該組換え体DNAを含有する
微生物及び動脈硬化治療剤に関する。
背景技術 平滑筋型ミオシン重鎖SM1アイソフォームタンパク質
は平滑筋細胞で特異的に発現しているミオシン重鎖アイ
ソフォームタンパク質の一つで、平滑筋の収縮弛緩を担
うタンパク質である。該タンパク質のDNAとしては、ウ
サギSM1アイソフォームのcDNAの塩基配列が知られてい
る〔ピー・バビジ（P.Babij）ら：プロシーディング・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA），88,10676（1991）〕が、
それらのDNAの間の塩基配列の相同性は知られていな
い。また、動物細胞へ注入できる平滑筋型ミオシン重鎖
SM1アイソフォームタンパク質のDNAをベクターDNAに組
み込んだ組換え体DNAは知られていない。
平滑筋細胞に存在するカルポニンと呼ばれるタンパク
質のcDNAをラット肺動脈由来血管平滑筋細胞株に導入し
て発現したところ、細胞の倍増時間が約４時間長くなる
こと〔高橋ら：サーキュレイション（Circulation），8
8,I−174（1993）〕、ウサギの頸動脈をバルーン擦過し
た部位にヒトカルポニンのcDNAを局所注入すると内膜肥
厚が抑制されること〔高橋ら:Circulation,88,I−656
（1993）〕が報告されているが、ミオシン重鎖SM1アイ
ソフォームタンパク質のDNAをベクターDNAに組み込んだ
組換え体DNAが薬理効果を持つこと、遺伝子治療に用い
られることは全く知られていない。
動脈硬化症の治療として、バルーンカテーテルで狭窄
部位を広げる経皮的冠動脈形成術（PTCA）が盛んに行わ
れている。該治療法はバイパス手術などに比べて容易に
行うことができ、成功率も高いという利点を持つ反面、
治療を行った患者の30〜40％に血管細胞の異常増殖によ
り、再び血管が塞がってしまう再狭窄を起こすという欠
点がある。そのため、該再狭窄を防ぐために有用な動脈
硬化治療剤の開発が望まれている。
発明の開示 本発明は、以下の発明を包含する。
（１）平滑筋型ミオシン重鎖SM1アイソフォームタンパ
ク質をコードするDNAをベクターDNAに組み込んだ組換え
体DNA。
（２）ベクターDNAがレトロウイルスベクター、アデノ
ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター又は発
現動物用プラスミドである前記（１）に記載の組換え体
DNA。
（３）発現動物用プラスミドがpCXN2又はPAGE208である
前記（２）に記載の組換え体DNA。
（４）平滑筋型ミオシン重鎖SM1アイソフォームタンパ
ク質がヒト平滑筋型、ウサギ平滑筋型又はマウス平滑筋
型である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の組換え
体DNA。
（５）平滑筋型ミオシン重鎖SM1アイソフォームタンパ
ク質をコードするDNAが配列番号１記載の塩基配列又は
該塩基配列において１又は複数の塩基が付加、欠失又は
置換されている前記（１）〜（３）のいずれかに記載の
組換え体DNA。
（６）平滑筋型ミオシン重鎖SM1アイソフォームタンパ
ク質をコードするDNAであって、配列番号１記載の塩基
配列からなるDNA又は該塩基配列において１もしくは複
数の塩基が付加、欠失もしくは置換されているDNA。
（７）前記（５）に記載の組換え体DNAを保持する微生
物。
（８）エシェリヒア属に属する前記（７）に記載の微生
物。
（９）前記（１）〜（５）のいずれかに記載の組換え体
DNAを含有する動脈硬化治療剤。
平滑筋型ミオシン重鎖SM1アイソフォームタンパク質
をコードするDNAとしては、平滑筋型ミオシン重鎖SM1ア
イソフォームタンパク質をコードするcDNA又はゲノム型
DNAがあげられ、好ましくはヒト、ウサギ、マウス等のD
NAがあげられる。
平滑筋型ミオシン重鎖SM1アイソフォームタンパク質
をコードするDNAの塩基配列としては、ウサギSM1アイソ
フォームタンパク質のcDNA〔Proc.Natl.Acad.Sci.US
A），88,10676（1991）〕、配列番号１で示されるマウ
スミオシン重鎖SM1アイソフォームタンパク質をコード
するDNAの塩基配列又はこれらの塩基配列の相同性で特
定した配列番号２で示される塩基配列〔なお配列中、Ｙ
はＴ、Ｕ又はＣを表し、ＳはＧ又はＣを表し、ＶはＡ、
Ｇ又はＣを表し、ＢはＧ、Ｃ、Ｔ又はＵを表し、Ｗは
Ａ、Ｔ又はＵを表し、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、ＴもしくはＵ又
は単結合を表す。また、コドンYAS（388−390）はTAC又
はCAGを表す。〕があげられる。従って、配列番号２で
示される塩基配列は、配列番号１で示される塩基配列及
びウサギSM1アイソフォームタンパク質のcDNAの塩基配
列を含む。また、ヒト平滑筋型ミオシン重鎖SM1アイソ
フォームタンパク質のcDNA部分塩基配列が知られている
が〔アメリカン・ジャーナル・オブ・メデイカル・ジェ
ネテイックス（Amer.J.of Medical Genetics），46,61
−67（1993）〕、該DNA部分配列と配列番号２で示され
る塩基配列の部分配列とを組み合わせた塩基配列も、本
発明における平滑筋型ミオシン重鎖SM1アイソフォーム
タンパク質をコードするDNAの塩基配列に含まれる。
更に、部位特定変異誘発〔ヌクレイック・アシド・リ
サーチ（Nucleic Acid Research），10,6487−6508（19
82）〕により、配列番号２で示される塩基配列又は配列
番号２で示される塩基配列の部分配列とヒト平滑筋由来
のDNAの塩基配列とを組み合わせた塩基配列において、
１又は複数の塩基が付加、欠失又は置換された場合も、
本発明における平滑筋型ミオシン重鎖SM1アイソフォー
ムタンパク質をコードするDNAの塩基配列に含まれる。
ベクターDNAとしては、ウイルスベクターとしてレト
ロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ
随伴ウイルスベクター又は発現動物用プラスミドである
pCXN2〔ジーン（Gene），108,193−200（1991）〕、PAG
E207（特開平６−46841号公報）又はその改変体等を用
いることができる。
本発明の動脈硬化治療剤は、活性成分である平滑筋型
ミオシン重鎖SM1アイソフォームタンパク質をコードす
るDNAをベクターDNAに組み込んだ組換え体DNAを、遺伝
子治療剤に用いる基剤と共に調合して製造することがで
きる。なお、該製剤は投与する直前に、必要によりリポ
ソーム等に封入した後、動脈硬化の遺伝子治療に用いる
ことができる〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,90,11307（19
93）〕。
また、平滑筋型ミオシン重鎖SM1アイソフォームタン
パク質をコードするDNAをウイルスベクターに組み込ん
だ場合は、組換え体DNAを含有するウイルス粒子を調製
し、遺伝子治療剤に用いる基剤と共に調合して治療剤を
製造することができる〔ネイチャー・ジェネテイクス
（Nature Genet.），８,42（1994）〕。
遺伝子治療剤に用いる基剤としては、通常注射剤に用
いる基剤であればどのようなものでもよく、蒸留水、塩
化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物等
の塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、
グルコース等の溶液、グリシン、アルギニン等のアミン
酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とクルコース溶液との混
合溶液等があげられる。また、常法に従い、これらの基
剤に浸透圧調整剤、pH調整剤、ゴマ油、ダイズ油等の植
物油又はレシチンもしくは非イオン界面活性剤等の界面
活性剤等の助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として
注射剤を調製してもよい。これらの注射剤を、粉末化、
凍結乾燥等の操作により用時溶解用製剤として調製する
こともできる。
前記の動脈硬化治療剤は、遺伝子治療の直前に液体の
場合はそのままで、固体の場合は必要により滅菌処理を
した前記の基剤に溶解して治療に使用することができ
る。
本発明の動脈硬化治療剤の投与方法は、PTCA処理を行
った患者に対して、毎日又は術後１回の投与で、１日1n
g〜1gの用量を、患者の治療部位の血管平滑筋細胞に吸
収されるように、カテーテル等を用いて局所的に投与す
ればよい。
本発明の動脈硬化治療剤は、投与量内で安全である。
以下に、本発明の平滑筋型ミオシン重鎖SM1アイソフ
ォームタンパク質をコードするDNAをベクターDNAに組み
込んだ組換え体DNAの製造方法を説明する。
平滑筋型ミオシン重鎖SM1アイソフォームタンパク質
をコードするDNAをベクターDNAに組み込んだ組換え体DN
Aは、以下に述べる一般の遺伝子工学的手法あるいはそ
れに準じる方法を用いて製造することができる。
子宮、大動脈等の平滑筋が主である組織のcDNAライブ
ラリーからエイ・アベらの方法〔ECLダイレクトDNAラベ
リング検出システム解説書（アマシャム（Amersham）
社）〕により平滑筋型ミオシン重鎖SM1アイソフォーム
タンパク質をコードするDNAのクローンを検出する。
該DNA断片を適当なベクターDNA中のプロモーターの下
流に連結することによりミオシン重鎖SM1アイソフォー
ムタンパク質を組み込んだ組換え体DNAを製造すること
ができる〔ジェイ・サンブルック（J.Sambrook）ら、モ
レキュラー・クローニング（Molecular Cloning）、第
２版、１巻、コールドスプリングハーバーラボラトリー
プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、198
9年〕。なお、プロモーターとしては動物細胞を宿主と
するため、SV40由来のプロモーター、レトロウイルスの
プロモーター、メタロチオネインプロモーター、βアク
チンプロモーター等が利用できる。なお、発現にエンハ
ンサーの利用も効果的である。
以下に、前記組み換え技法における反応の条件を示
す。DNAの制限酵素による消化反応は、通常0.1〜20μｇ
のDNAを２〜200mM（好ましくは10〜40mM）のTris−HCl
（pH6.0〜9.5、好ましくはpH7.0〜8.0）、０〜200mMの
塩化ナトリウム、２〜20mM（好ましくは５〜10mM）の塩
化マグネシウムを含む反応液中で、制限酵素0.1〜100単
位（好ましくは１μｇのDNAに対して１〜３単位）を用
い、20〜70℃（至適温度は用いる制限酵素により異な
る）において、15分間〜24時間行う。反応の停止は、通
常55〜75℃、５〜30分間加熱することによるが、フェノ
ール等の試薬により制限酵素を失活させる方法も用いる
ことができる。制限酵素消化によって生じたDNA断片あ
るいはギャップト・デュプレックスDNAの精製はPrep−
Ａ−Gene Matrix（バイオラッド（BIO−RAD）社）を用
いて行うことができる。DNA断片の結合反応は、DNAライ
ゲーションキット（宝酒造社）を用いて行うことができ
る。
このようにして構築された平滑筋型ミオシン重鎖SM1
アイソフォームタンパク質をコードするDNAを含有する
組換え体DNAを用いて、形質転換体を製造する。
発現動物用プラスミドベクターの宿主としては、エシ
ェリヒア属に属するエシェリヒア・コリのK12・HB101
〔エイチ・ダブリュー・ボイヤー（H.W.Boyer）ら：ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.
Biol.），41,459（1969）〕、DH5α〔ディー・ハナハン
（D.Hanahan）:J.Mol.Biol.,166,557（1983）〕等が用
いられる。該エシェリヒア属菌の形質転換は、コーエン
らの方法〔エス・エヌ・コーエン（S.N.Cohen）ら:Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110（1972）〕に従って行う
ことができる。
ウイルスベクターの宿主としては、ウイルス生産能を
有する動物細胞である、サル細胞COS−７、チャイニー
ズハムスター細胞CHO、マウス細胞BALB/3T3、ヒト細胞H
eLa等が用いられ、レトロウイルスベクターの宿主とし
ては、ΨCRE、ΨCRIP〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,646
0（1988）〕、MLV〔ジャーナル・オブ・ヴィロロジー
（J.Virol.），65,1202（1991）〕等が、アデノウイル
スベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターの宿主とし
ては、ヒト胎児腎臓由来の293細胞〔実験医学、12,316
（1994）〕等が用いられる。ウイルスベクターの動物細
胞への導入はリン酸カルシウム法〔ヴイロロジー（Viro
logy），52,456（1973）〕等で行うことができる。
得られた形質転換体は、細胞種の違いにより以下のよ
うに培養し、組換え体DNAの生産に供することができ
る。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体を培養する
際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であ
り、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒
素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源として
は、例えばグルコース、デキストリン、可溶性でんぷ
ん、ショ糖、グリセロール等、窒素源としては、例えば
アンモニウム塩類、ペプトン、カゼイン等、無機物とし
ては、例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウ
ム、塩化マグネシウム等が挙げられる。また酵母抽出
物、ビタミン類等を添加してもよい。培地のpHは約５〜
８が望ましい。エシェリヒア属菌を培養する際の培地と
しては、例えばTerrific broth（ケイ・ディー・タート
フ（K.D.Tartof）ら：ベテスダ・レサーチ・ラボラトリ
ー・フォーカス（Bethesda Res.Lab.Focus），９,12（1
987）〕が好ましい。培養は通常約15〜43℃で約８〜24
時間行い、必要により通気や撹拌を加えることもでき
る。培養終了後、バーンボイムの方法〔Nucleic Acid R
es.,７,1513（1979）〕等により精製することにより、
平滑筋型ミオシン重鎖SM1アイソフォームタンパク質を
コードするDNAを含有する組換え体DNAを得ることができ
る。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地
としては、例えば約５〜20％のウシ胎児血清を含む199
培地〔モーガン（Morgan）ら:Proc.Soci.Biol.Med.,73,
1（1950）〕、MEM培地〔エイチ・イーグル（H.Eagl
e）：サイエンス（Science），122,501（1952）〕、DME
M（アール・ダルベッコ（R.Dulbecco）ら:Virology,８,
396（1959）〕等が用いられる。pHは約６〜８が好まし
い。培養は通常約30〜40℃で約18〜60時間行い、必要に
応じて通気や撹拌を加える。
組換え体DNAを含有するウイルス粒子は培養上清中に
放出されるので、ウイルス粒子の濃縮、精製を塩化セシ
ウム遠心法〔沢田幸治ら、新生化学実験講座２−V,33
（1992）〕、ポリエチレングリコール沈澱法〔アーチー
ブ・ヴィロォジー（Arch.Virol.），71,185（198
2）〕、フィルター濃縮法〔ジャーナル・オブ・セル・
バイオロジー（J.Cell Biol.），111,217（1990）〕等
で行うことにより、平滑筋型ミオシン重鎖SM1アイソフ
ォームタンパク質をコードするDNAを含有する組換え体D
NAを得ることができる。
図面の簡単な説明 図１は、マウス平滑筋型ミオシン重鎖SM1アイソフォ
ームタンパク質をコードするcDNAの制限酵素地図及び翻
訳領域の位置を示す。
プラスミド:SM−1Ftext プラスミドのサイズ:6175bp 枠内部：翻訳領域 A:Apa I B:BamH I Sa:Sac I Sm:Sma I 図２は、CHO細胞にpSE−SM1−Hygを導入してハイグロ
マイシンで選択して出現したコロニーとPAGE208を導入
して出現したコロニーとの面積比を示す。
図３は、HeLa細胞にpSE−SM1−Hygを導入してハイグ
ロマイシンで選択して出現したコロニーとPAGE208を導
入して出現したコロニーとの面積比を示す。
図４は、CHO細胞の野生型、PAGE208導入クローン、SM
1アイソフォーム発現クローン（SM1−５−２−１、SM1
−５−３−３）の増殖速度のMTT法を用いての比較を示
す。
図５は、バルーン傷害ウサギモデルの血管壁にSM1遺
伝子を導入した例（実施例）とβ−ガラクトシダーゼ遺
伝子を導入した例（比較例）における内膜肥厚度を示
す。
発明を実施するための最良の形態 以下、実施例により本発明をより具体的に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１） マウス平滑筋型ミオシン重鎖SM1アイソ
フォームタンパク質をコードするDNAをベクターDNAに組
み込んだ組換え体DNA （ａ）プローブの作製 ウサギ平滑筋型ミオシン重鎖SM2アイソフォームタン
パク質のcDNA断片をクローニングしたプラスミドpSMHC2
9及びpIH61〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー
（J.Biol.Chem.），264,9734−9737（1989）〕を使用し
た。これをEcoR I（宝酒造社製、以下制限酵素に関して
は特記しないかぎりすべて宝酒造社製）で切断し、ウサ
ギ平滑筋型ミオシン重鎖SM2アイソフォームタンパク質
の挿入用cDNA断片を調製した。これをECLダイレクトDNA
ラベリングシステム（アマシャム社）を用いて標識し、
以下のスクリーニングにおけるプローブとして用いた。
（ｂ）スクリーニング λgtllベクターマウス子宮cDNAライブラリー（クロー
ンテック（CLONTECH）社製）を大腸菌Y1090（クローン
テック社製）と混ぜ、37℃で15分間インキュベートした
後、0.7％アガロースNZY〔Nucleic Acid Res.,16,7583
−7600（1988）〕を加え、1.5％寒天NZYプレートにまい
た。プラークのできたプレートにナイロンフィルターを
置き、フィルターにプラークを転写した。このフィルタ
ーをアルカリ処理することによって変性させた後、80℃
２時間の加熱によってDNAの固定を行った。（ａ）にお
いて、ECLダイレクトDNAラベリングシステムのプロトコ
ールにしたがって先に標識したプローブと、DNAをハイ
ブリダイズさせた。更にECL検出システム〔アマシャム
社製〕を用いてオートラジオグラフィーを行ってハイブ
リダイズするクローンを検出した。
（ｃ）DNA塩基配列解析 ４個のクローンが同定され、各クローンを配列解析の
ためにpUC119（宝酒造社）又はpBluescript SK（−）
（ストラタジーン（STRATAGENE）社）にサブクローニン
グした。得られたプラスミドで大腸菌DH5αを形質転換
し、形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia col
i）DH5α/pmsmhc20、pmsmhcC5、pmsmhcN08、pmsmhcN14
を得た。該形質転換体から産生されたプラスミドを、更
にエキソヌクレアーゼ消化によって段階的に削ってい
き、又は適当な制限酵素によって切断後、自己閉環ある
いはサブクローニングし、配列解析のための鋳型DNAを
調製した〔Gene,28,351−359（1984）〕。配列決定には
蛍光式DNAシーケンサー（アプライドバイオシステムズ
（Applied Biosystems）社）を用い、データー解析には
MacMolly〔Soft Gene GmbH社製〕を使用した。DNAの塩
基配列の結果を配列番号１に示した。また該塩基配列の
結果から得たアミノ酸配列の推定結果も配列番号１に示
した。
（ｄ）マウス平滑筋型ミオシン重鎖SM1アイソフォーム
発現プラスミドの作製 先に得た４個のクローンからSM1アイソフォーム全翻
訳領域をコードするcDNAを含むプラスミドpmSM1を以下
の方法により作製した〔ジェイ・サンプルックら、モレ
キュラー・クローニング、第２版、１巻、コールドスプ
リングハーバーラボラトリープレス、1989年）。まず
５′非翻訳領域を短くするために、４個のクローンの一
つであるプラスミドpmsmhcN14を制限酵素BamH IとBgl I
Iで切断し5kbのDNA断片を精製、回収した。このDNA断片
を自己閉環して大腸菌DH5αを形質転換し、アンピシリ
ン耐性のコロニーを得た。このコロニーの培養菌体から
公知の方法〔エイチ・シー・バーンボイム（H.C.Birnbo
im）ら:Nucleic Acid Res.,７,1513（1979）〕に従って
プラスミドDNAを回収した。得られたプラスミドの構造
は、BamH I及びKpn Iで切断後、アガロースゲル電気泳
動により確認した。このプラスミドをpmsmhcN14′とよ
ぶ。
得られたプラスミドpmsmhcN14′を制限酵素であるNsi
I（ニューイングランドバイオラブ（New England Biol
abs）社）とEcoR Vで切断し、4kbのDNA断片を精製、回
収した。またプラスミドpmsmhcNO8もNsi IとEcoR Vで切
断して1kbのDNA断片を精製、回収し、先に得られたプラ
スミドpmsmhcN14′由来の4kbのDNA断片と結合させて、p
msmhcN14−08を構築した。このプラスミドの構造はNsi
I及びEcoR Vで切断して確認した。得られたpmsmhcN14−
08を制限酵素Apa IとKpn Iで切断して5kbのDNA断片を精
製、回収した。また同様にプラスミドpmsmhc20もApa I
とKpn Iで切断して1.5kbのDNA断片を精製、回収し、先
の5kbのDNA断片と結合させて、プラスミドpmsmhcN14−0
8−20を構築した。このプラスミドの構造はApa I及びKp
n Iで切断して確認した。
得られたpmsmhcN14−08−20を制限酵素Ana Iで切断し
て6kbのDNA断片を精製、回収した。またpmsmhcC5をAna
Iで切断して2kbのDNA断片を精製、回収し、pmsmhcN14−
08−20の6kbのDNA断片と結合させてプラスミドpmsmhcN1
4−08−５−20を構築した。このプラスミドの構造はEco
R I及びNru Iで切断して確認した。
プラスミドpmsmhcN14−08−５−20を制限酵素Nsi Iと
Nru Iで切断して8kbのDNA断片を精製、回収した。また
プラスミドpmsmhcN08も同様にNsi IとNru Iで切断し、
1.5kbのDNA断片を精製、回収し、先の8kbのDNA断片と結
合させて、マウス平滑筋型ミオシン重鎖SM1アイソフォ
ームの全翻訳領域を含むプラスミドpmSM1を構築した。
プラスミドの構造はNsi I及びNru Iで切断して確認し
た。
得られたpmSM1を制限酵素Xba IとKpn Iで切断して6kb
のDNA断片を精製、回収した。また発現ベクターPAGE207
（特開平６−46841号公報）のハイグロマイシンＢ耐性
遺伝子のプロモーター部にあるSma I部位を欠失させたP
AGE208を用い、これをXba IとKpn Iで切断して6kbのDNA
断片を精製、回収し、先に得られたpmSM1由来の6kbのDN
A断片と結合させて、発現プラスミドpSE−SM1−Hygを構
築した。このプラスミドの構造はXba I及びKpn Iで切断
して確認した。
pmSM1をXba IとKpn Iで切断したDNA断片をDNAブラン
ティングキット（宝酒造社）を用いて平滑化した。更
に、発現ベクターpCXN2をXho Iで切断してDNAブランテ
ィングキット（宝酒造社）を用いて平滑化した。この２
つのDNAを結合させて、発現プラスミドpCAG−SM1を構築
した。このプラスミドの構造はBgl IIで切断して確認し
た。
前記プラスミドpSE−SM1−HygをEscherichia coliに
組み込んで形質転換体を得た。
なお、本形質転換体は、Escherichia coli pSE−SM1
−Hyg（FERM BP−4974）として工業技術院生命工学工業
技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）
に平成７年１月24日付けにて寄託されている。
（実施例２） CHO細胞及びHeLa細胞でSM1アイソフォー
ムを発現させた際の細胞増殖に与える効果 発現プラスミドpSQ−SM1−Hyg2μｇとリポフェクトア
ミン（商品名：ギブコ社製）４μｌを混合して15分間イ
ンキュベートして複合体を作った。これをCHO細胞ある
いはHeLa細胞に添加して、37℃で５時間インキュベート
して遺伝子を導入した。遺伝子導入細胞を希釈してシャ
ーレにまき、ハイグロマイシン（商品名：シグマ社製）
で遺伝子導入細胞を選択した。約10日後、薬剤耐性細胞
のコロニーをクマシーブルー（商品名：バイオラッド社
製）で染色して、面積を画像解析装置で測定した。その
結果、対照のベクターPAGE208を導入した場合に比べて
面積の小さなコロニーが多く、SM1アイソフォームの発
現により増殖が抑制させることが示された（図２、図
３）。また、このハイグロマイシン耐性CHO細胞のクロ
ーニングを行い、得られたクローンSM1−５−２−１及
びSM1−５−３−３の増殖速度を調べたところ、野生型
あるいはPAGE208導入細胞と比べ低下していた（図
４）。
（実施例３） バルーン傷害ウサギモデルの血管壁にSM
1遺伝子を強制導入した時の内膜肥厚抑制効果 体重2.4〜3.2kgの日本白色家兎の大腿動脈からＸ線透
視下、３フレンチ（Fr）のPTCAカテーテルを挿入し右総
頸動脈まで誘導した。10気圧で拡張させたバルーンによ
り右総頸動脈を３回擦過し、血管壁を傷害した。擦過３
日後の血管傷害部に対して、pCAG−SM1 300mgとリポフ
ェクチン（GIBCO BRL社）の混合液をバード社製ヴォリ
ンスキー型インフュージョンカテーテルを用いて、６気
圧でインフュージョンした。別の家兎を用い、同様の方
法で傷害血管を作製し、pCAG−SM1の代わりにβ−ガラ
クトシダーゼの発現プラスミドを導入して比較例とし
た。
インフュージョン後３日目にヘパリン生理食塩水によ
り灌流して儀死せしめた後、右総頸動脈を摘出し、細切
後ISOGEN（和光純薬）1mlを加え、ポリトロンホモジナ
イザーによりホモジナイズした。AGPC法〔ピー・コムジ
ンスキー（P.Chomczynski）とエヌ・サッチ（N.Sacch
i）:Anal.Biochem.,162,156−159（1987）〕により総RN
Aを抽出した後、RT−PCR法によりSM1のmRNAを増幅し
た。実施例（SM1遺伝子導入）および比較例（β−ガラ
クトシダーゼ遺伝子導入）につき、増幅させたDNA、及
びそれを制限酵素Nhe Iで切断したものをアガロースゲ
ル電気泳動にかけた。実施例には強く、比較例にはわず
かにSM1のバンドが検出されたが、実施例のバンドのみ
がNhe Iにより切断された。同酵素の切断部位は、家兎
のSM1にはなく、マウスSM1のみにあることから、実施例
においてマウス由来のSM1遺伝子が発現していることが
裏付けられた。
導入２週後に２％パラホルムアルデヒドを含むPBSに
より灌流し屠殺、固定を行い、右総頸動脈を摘出した。
インフュージョンカテーテルにより導入された部分を切
り出し、パラフィン包埋し、血管の輪切り切片を作製し
た。１本の血管を４等分し、それぞれの組織から１枚ず
つ切片を作製し、ヘマトキシリン−エオジン染色により
染色した。血管の内弾性板を境に内膜を中膜にわけ、そ
れぞれの面積を測定した。得られた各切片につき、内膜
面積と中膜面積の比をとり、その平均を取って内膜肥厚
度を求めた。実施例３頭、比較例３頭につき内膜肥厚度
を求めた結果、SM1遺伝子の強制導入により内膜肥厚が
抑制されることが確認された（図５）。
以上の結果から、プラスミドpSE−SM1−Hyg及びpCAG
−SM1に細胞増殖低下作用があり、血管細胞の異常増殖
により生じる動脈硬化の再狭窄に有効であることが示唆
された。
産業上の利用可能性 本発明の平滑筋型ミオシン重鎖SM1アイソフォームタ
ンパク質をコードするDNAをベクターDNAに組み込んだ組
換え体DNAを動物細胞で発現させると、その増殖が抑制
されることが明らかとなった。この効果はヒト由来のHe
La細胞においても見られた。したがって、本発明の組換
え体DNAはPTCA処置後の再狭窄に対する遺伝子治療剤と
して有効に用いることができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小田 祥二 神奈川県横浜市青葉区桂台１丁目17番30 号 (72)発明者 松田 譲 東京都小金井市貫井南町１丁目22番７号 (72)発明者 高橋 克仁 大阪府池田市鉢塚３丁目９番25−506号 (72)発明者 菅原 理裕 静岡県富士宮市三園平1661 (72)発明者 石山 晴生 神奈川県中郡二宮町中里891−１ (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．88，Ｐ．10676− 10680（1991) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 A61K 31/00 A61K 48/00 A61K 9/10 101 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】平滑筋型ミオシン重鎖SM1アイソフォーム
    タンパク質（但し、ウサギ平滑筋型ミオシン重鎖SM1ア
    イソフォームタンパク質を除く。）をコードするDNAで
    あって、配列番号２記載の塩基配列からなるDNA又は該
    塩基配列において１もしくは複数の塩基が付加、欠失も
    しくは置換されているDNAをベクターDNAに組み込んだ組
    換え体DNAを含有する動脈硬化治療剤。
  2. 【請求項２】平滑筋型ミオシン重鎖SM1アイソフォーム
    タンパク質（但し、ウサギ平滑筋型ミオシン重鎖SM1ア
    イソフォームタンパク質を除く。）をコードするDNAで
    あって、配列番号１記載の塩基配列からなるDNA又は該
    塩基配列において１もしくは複数の塩基が付加、欠失も
    しくは置換されているDNAをベクターDNAに組み込んだ組
    換え体DNAを含有する動脈硬化治療剤。
  3. 【請求項３】ベクターDNAがレトロウイルスベクター、
    アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター
    又は発現動物用プラスミドである請求の範囲第１項又は
    第２項記載の動脈硬化治療剤。
  4. 【請求項４】発現動物用プラスミドがpCXN2又はPAGE208
    である請求の範囲第３項記載の動脈硬化治療剤。
  5. 【請求項５】平滑筋型ミオシン重鎖SM1アイソフォーム
    タンパク質がヒト平滑筋型又はマウス平滑筋型である請
    求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載の動脈硬
    化治療剤。
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