JP3328260B2 - ミオシン重鎖ｓｍ１アイソフォームタンパク質をコードするｄｎａをベクターｄｎａに組み込んだ組換え体ｄｎａ並びに該組換え体ｄｎａを含有する微生物及び動脈硬化治療剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子治療に用い
るミオシン重鎖ＳＭ１アイソフォームタンパク質をコー
ドするＤＮＡをベクターＤＮＡに組み込んだ組換え体Ｄ
ＮＡ並びに該組換え体ＤＮＡを含有する微生物及び動脈
硬化治療剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】平滑筋型ミオシン重鎖ＳＭ１アイソフォ
ームタンパク質は平滑筋細胞で特異的に発現しているミ
オシン重鎖アイソフォームタンパク質の一つで、平滑筋
の収縮弛緩を担うタンパク質である。該タンパク質のＤ
ＮＡとしては、ウサギＳＭ１アイソフォームのｃＤＮＡ
の塩基配列が知られている〔ピー・バビジ(P. Babij)
ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. US
A), 88, 10676 (1991) 〕が、それらのＤＮＡの間の塩
基配列の相同性は知られていない。また、動物細胞へ注
入できる平滑筋型ミオシン重鎖ＳＭ１アイソフォームタ
ンパク質のＤＮＡをベクターＤＮＡに組み込んだ組換え
体ＤＮＡは知られていない。

【０００３】平滑筋細胞に存在するカルポニンと呼ばれ
るタンパク質のｃＤＮＡをラット肺動脈由来血管平滑筋
細胞株に導入して発現したところ、細胞の倍増時間が約
４時間長くなること〔高橋ら：サーキュレイション(Cir
culation), 88, I-174（1993）〕、ウサギの頸動脈をバ
ルーン擦過した部位にヒトカルポニンのｃＤＮＡを局所
注入すると内膜肥厚が抑制されること〔高橋ら：Circul
ation, 88, I-656 （1993）〕が報告されているが、ミ
オシン重鎖ＳＭ１アイソフォームタンパク質のＤＮＡを
ベクターＤＮＡに組み込んだ組換え体ＤＮＡが薬理効果
を持つこと、遺伝子治療に用いられることは全く知られ
ていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】動脈硬化症の治療とし
て、バルーンカテーテルで狭窄部位を広げる経皮的冠動
脈形成術（ＰＴＣＡ）が盛んに行われている。該治療法
はバイパス手術などに比べて容易に行うことができ、成
功率も高いという利点を持つ反面、治療を行った患者の
３０〜４０％に血管細胞の異常増殖により、再び血管が
塞がってしまう再狭窄を起こすという欠点がある。その
ため、該再狭窄を防ぐために有用な動脈硬化治療剤の開
発が望まれている。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、以下の発明を
包含する。 （１）平滑筋型ミオシン重鎖ＳＭ１アイソフォームタン
パク質をコードするＤＮＡをベクターＤＮＡに組み込ん
だ組換え体ＤＮＡ。 （２）ベクターＤＮＡがレトロウイルスベクター、アデ
ノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター又は
発現動物用プラスミドである前記（１）に記載の組換え
体ＤＮＡ。 （３）発現動物用プラスミドがｐＣＸＮ２又はＰＡＧＥ
２０８である前記（２）に記載の組換え体ＤＮＡ。 （４）平滑筋型ミオシン重鎖ＳＭ１アイソフォームタン
パク質がヒト平滑筋型、ウサギ平滑筋型又はマウス平滑
筋型である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の組換
え体ＤＮＡ。 （５）平滑筋型ミオシン重鎖ＳＭ１アイソフォームタン
パク質をコードするＤＮＡが配列番号１記載の塩基配列
又は該塩基配列において１又は複数の塩基が付加、欠失
又は置換されている前記（１）〜（３）のいずれかに記
載の組換え体ＤＮＡ。 （６）平滑筋型ミオシン重鎖ＳＭ１アイソフォームタン
パク質をコードするＤＮＡであって、配列番号１記載の
塩基配列からなるＤＮＡ又は該塩基配列において１もし
くは複数の塩基が付加、欠失もしくは置換されているＤ
ＮＡ。 （７）前記（５）に記載の組換え体ＤＮＡを保持する微
生物。 （８）エシェリヒア属に属する前記（７）に記載の微生
物。 （９）前記（１）〜（５）のいずれかに記載の組換え体
ＤＮＡを含有する動脈硬化治療剤。

【０００６】平滑筋型ミオシン重鎖ＳＭ１アイソフォー
ムタンパク質をコードするＤＮＡとしては、平滑筋型ミ
オシン重鎖ＳＭ１アイソフォームタンパク質をコードす
るｃＤＮＡ又はゲノム型ＤＮＡがあげられ、好ましくは
ヒト、ウサギ、マウス等のＤＮＡがあげられる。

【０００７】平滑筋型ミオシン重鎖ＳＭ１アイソフォー
ムタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列としては、
ウサギＳＭ１アイソフォームタンパク質のｃＤＮＡ〔Pr
oc.Natl. Acad. Sci. USA), 88, 10676 (1991) 〕、配
列番号１で示されるマウスミオシン重鎖ＳＭ１アイソフ
ォームタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列又はこ
れらの塩基配列の相同部で特定した配列番号２で示され
る塩基配列〔なお配列中、ＹはＴ、Ｕ又はＣを表し、Ｓ
はＧ又はＣを表し、ＶはＡ、Ｇ又はＣを表し、ＢはＧ、
Ｃ、Ｔ又はＵを表し、ＷはＡ、Ｔ又はＵを表し、Ｎは
Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴもしくはＵ又は単結合を表す。また、コ
ドンＹＡＳ（３８８−３９０）はＴＡＣ又はＣＡＧを表
す。〕があげられる。従って、配列番号２で示される塩
基配列は、配列番号１で示される塩基配列及びウサギＳ
Ｍ１アイソフォームタンパク質のｃＤＮＡの塩基配列を
含む。また、ヒト平滑筋型ミオシン重鎖ＳＭ１アイソフ
ォームタンパク質のｃＤＮＡ部分塩基配列が知られてい
るが〔アメリカン・ジャーナル・オブ・メデイカル・ジ
ェネテイックス（Amer. J. of Medical Genetics), 46,
61-67(1993)〕、該ＤＮＡ部分配列と配列番号２で示さ
れる塩基配列の部分配列とを組み合わせた塩基配列も、
本発明における平滑筋型ミオシン重鎖ＳＭ１アイソフォ
ームタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列に含まれ
る。

【０００８】更に、部位特定変異誘発〔ヌクレイック・
アシド・リサーチ（Nucleic Acid Research), 10, 6487
-6508(1982)〕により、配列番号２で示される塩基配列
又は配列番号２で示される塩基配列の部分配列とヒト平
滑筋由来のＤＮＡの塩基配列とを組み合わせた塩基配列
において、１又は複数の塩基が付加、欠失又は置換され
た場合も、本発明における平滑筋型ミオシン重鎖ＳＭ１
アイソフォームタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配
列に含まれる。

【０００９】ベクターＤＮＡとしては、ウイルスベクタ
ーとしてレトロウイルスベクター、アデノウイルスベク
ター、アデノ随伴ウイルスベクター又は発現動物用プラ
スミドであるｐＣＸＮ２〔ジーン(Gene), 108, 193-200
(1991)〕、ＰＡＧＥ２０７（特開平６−４６８４１号公
報）又はその改変体等を用いることができる。

【００１０】本発明の動脈硬化治療剤は、活性成分であ
る平滑筋型ミオシン重鎖ＳＭ１アイソフォームタンパク
質をコードするＤＮＡをベクターＤＮＡに組み込んだ組
換え体ＤＮＡを、遺伝子治療剤に用いる基剤と共に調合
して製造することができる。なお、該製剤は投与する直
前に、必要によりリポソーム等に封入した後、動脈硬化
の遺伝子治療に用いることができる〔Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA., 90, 11307(1993) 〕。

【００１１】また、平滑筋型ミオシン重鎖ＳＭ１アイソ
フォームタンパク質をコードするＤＮＡをウイルスベク
ターに組み込んだ場合は、組換え体ＤＮＡを含有するウ
イルス粒子を調製し、遺伝子治療剤に用いる基剤と共に
調合して治療剤を製造することができる〔ネイチャー・
ジェネテイクス(Nature Genet.), 8, 42(1994)〕。

【００１２】遺伝子治療剤に用いる基剤としては、通常
注射剤に用いる基剤であればどのようなものでもよく、
蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩と
の混合物等の塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキ
ストラン、グルコース等の溶液、グリシン、アルギニン
等のアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース
溶液との混合溶液等があげられる。また、常法に従い、
これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、ゴマ油、ダ
イズ油等の植物油又はレシチンもしくは非イオン界面活
性剤等の界面活性剤等の助剤を用いて、溶液、懸濁液、
分散液として注射剤を調製してもよい。これらの注射剤
を、粉末化、凍結乾燥等の操作により用時溶解用製剤と
して調製することもできる。

【００１３】前記の動脈硬化治療剤は、遺伝子治療の直
前に液体の場合はそのままで、固体の場合は必要により
滅菌処理をした前記の基剤に溶解して治療に使用するこ
とができる。

【００１４】本発明の動脈硬化治療剤の投与方法は、Ｐ
ＴＣＡ処置を行った患者に対して、毎日又は術後１回の
投与で、１日１ｎｇ〜１ｇの用量を、患者の治療部位の
血管平滑筋細胞に吸収されるように、カテーテル等を用
いて局所的に投与すればよい。

【００１５】本発明の動脈硬化治療剤は、投与量内で安
全である。

【００１６】以下に、本発明の平滑筋型ミオシン重鎖Ｓ
Ｍ１アイソフォームタンパク質をコードするＤＮＡをベ
クターＤＮＡに組み込んだ組換え体ＤＮＡの製造方法を
説明する。

【００１７】平滑筋型ミオシン重鎖ＳＭ１アイソフォー
ムタンパク質をコードするＤＮＡをベクターＤＮＡに組
み込んだ組換え体ＤＮＡは、以下に述べる一般の遺伝子
工学的手法あるいはそれに準じる方法を用いて製造する
ことができる。

【００１８】子宮、大動脈等の平滑筋が主である組織の
ｃＤＮＡライブラリーからエイ・アベらの方法〔ＥＣＬ
ダイレクトＤＮＡラベリング検出システム解説書（アマ
シャム(Amersham)社）〕により平滑筋型ミオシン重鎖Ｓ
Ｍ１アイソフォームタンパク質をコードするＤＮＡのク
ローンを検出する。

【００１９】該ＤＮＡ断片を適当なベクターＤＮＡ中の
プロモーターの下流に連結することによりミオシン重鎖
ＳＭ１アイソフォームタンパク質を組み込んだ組換え体
ＤＮＡを製造することができる〔ジェイ・サンブルック
(J. Sambrook) ら、モレキュラー・クローニング(Molec
ular Cloning) 、第２版、１巻、コールドスプリングハ
ーバーラボラトリープレス(Cold Spring Harbor Labora
tory Press) 、１９８９年〕。なお、プロモーターとし
ては動物細胞を宿主とするため、ＳＶ４０由来のプロモ
ーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネ
インプロモーター、βアクチンプロモーター等が利用で
きる。なお、発現にエンハンサーの利用も効果的であ
る。

【００２０】以下に、前記組み換え技法における反応の
条件を示す。ＤＮＡの制限酵素による消化反応は、通常
0.1 〜20μg のＤＮＡを２〜200mM （好ましくは10〜40
mM）のTris-HCl(pH6.0〜9.5 好ましくはpH7.0 〜8.0
）、0 〜200mM の塩化ナトリウム、２〜20mM（好まし
くは５〜10mM）の塩化マグネシウムを含む反応液中で、
制限酵素0.1 〜100 単位（好ましくは１μｇのＤＮＡに
対して１〜３単位）を用い、20〜70℃（至適温度は用い
る制限酵素により異なる）において、15分間〜24時間行
う。反応の停止は、通常55〜75℃で、５〜30分間加熱す
ることによるが、フェノール等の試薬により制限酵素を
失活させる方法も用いることができる。制限酵素消化に
よって生じたＤＮＡ断片あるいはギャップト・デュプレ
ックスＤＮＡの精製はPrep-A-Gene Matrix（バイオラッ
ド(BIO-RAD) 社）を用いて行うことができる。ＤＮＡ断
片の結合反応は、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造
社）を用いて行うことができる。

【００２１】このようにして構築された平滑筋型ミオシ
ン重鎖ＳＭ１アイソフォームタンパク質をコードするＤ
ＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを用いて、形質転換体を
製造する。

【００２２】発現動物用プラスミドベクターの宿主とし
ては、エシェリヒア属に属するエシェリヒア・コリのＫ
１２・ＨＢ１０１〔エイチ・ダブリュー・ボイヤー（H.
W. Boyer）ら：ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジー（J. Mol. Biol. ）, 41, 459 (1969)〕、ＤＨ
５α〔ディー・ハナハン（D. Hanahan）：J. Mol. Bio
l., 166, 557 (1983)〕等が用いられる。該エシェリヒ
ア属菌の形質転換は、コーエンらの方法〔エス・エヌ・
コーエン（S. N. Cohen ）ら：Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 69, 2110（1972）〕に従って行うことができる。

【００２３】ウイルスベクターの宿主としては、ウイル
ス生産能を有する動物細胞である、サル細胞ＣＯＳ−
７、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、マウス細胞BA
LB/3T3、ヒト細胞ＨｅＬａ等が用いられ、レトロウイル
スベクターの宿主としては、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ〔Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 6460(1988)〕、ＭＬＶ
〔ジャーナル・オブ・ヴィロロジー(J. Virol.), 65, 1
202 (1991)〕等が、アデノウイルスベクター及びアデノ
随伴ウイルスベクターの宿主としては、ヒト胎児腎臓由
来の２９３細胞〔実験医学、12, 316 (1994)〕等が用い
られる。ウイルスベクターの動物細胞への導入はリン酸
カルシウム法〔ヴイロロジー（Virology),52, 456(197
3)〕等で行うことができる。

【００２４】得られた形質転換体は、細胞種の違いによ
り以下のように培養し、組換え体ＤＮＡの生産に供する
ことができる。

【００２５】宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体
を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地
が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な
炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭
素源としては、例えばグルコース、デキストリン、可溶
性でんぷん、ショ糖、グリセロール等、窒素源として
は、例えばアンモニウム塩類、ペプトン、カゼイン等、
無機物としては、例えば塩化カルシウム、リン酸二水素
ナトリウム、塩化マグネシウム等が挙げられる。また酵
母抽出物、ビタミン類等を添加してもよい。培地のｐＨ
は約５〜８が望ましい。エシェリヒア属菌を培養する際
の培地としては、例えばTerrific broth（ケイ・ディー
・タートフ（K. D. Tartof）ら：ベテスダ・レサーチ・
ラボラトリー・フォーカス（Bethesda Res. Lab. Focu
s）, 9, 12（1987））が好ましい。培養は通常約１５〜
４３℃で約８〜２４時間行い、必要により通気や攪拌を
加えることもできる。培養終了後、バーンボイムの方法
〔Nucleic Acid Res., 7,1513(1979) 〕等により精製す
ることにより、平滑筋型ミオシン重鎖ＳＭ１アイソフォ
ームタンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換え体
ＤＮＡを得ることができる。

【００２６】宿主が動物細胞である形質転換体を培養す
る際、培地としては、例えば約５〜20％のウシ胎児血清
を含む１９９培地〔モーガン（Morgan) ら：Proc. Soc
i. Biol. Med., 73, 1 （1950）〕、ＭＥＭ培地〔エイ
チ・イーグル（H. Eagle）：サイエンス（Science ）,
122, 501（1952）〕、ＤＭＥＭ〔アール・ダルベッコ
（R. Dulbecco ）ら：Virology, 8, 396（1959）〕等が
用いられる。ｐＨは約６〜８が好ましい。培養は通常約
30〜40℃で約18〜60時間行い、必要に応じて通気や攪拌
を加える。

【００２７】組換え体ＤＮＡを含有するウイルス粒子は
培養上清中に放出されるので、ウイルス粒子の濃縮、精
製を塩化セシウム遠心法〔沢田幸治ら、新生化学実験講
座２−Ｖ，33(1992)〕、ポリエチレングリコール沈澱法
〔アーチーブ・ヴィロォジー（Arch. Virol.), 71, 185
(1982)〕、フィルター濃縮法〔ジャーナル・オブ・セル
・バイオロジー(J.Cell Biol.), 111, 217(1990)〕等で
行うことにより、平滑筋型ミオシン重鎖ＳＭ１アイソフ
ォームタンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換え
体ＤＮＡを得ることができる。

【００２８】

【実施例】以下、実施例により本発明をより具体的に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００２９】（実施例１） マウス平滑筋型ミオシン重
鎖ＳＭ１アイソフォームタンパク質をコードするＤＮＡ
をベクターＤＮＡに組み込んだ組換え体ＤＮＡ （ａ）プローブの作製 ウサギ平滑筋型ミオシン重鎖ＳＭ２アイソフォームタン
パク質のｃＤＮＡ断片をクローニングしたプラスミドpS
MHC29 及びpIH61〔ジャーナル・オブ・バイオケミスト
リー(J. Biol. Chem.), 264, 9734-9737(1989)〕を使用
した。これをEcoRＩ（宝酒造社製、以下制限酵素に関し
ては特記しないかぎりすべて宝酒造社製）で切断し、ウ
サギ平滑筋型ミオシン重鎖ＳＭ２アイソフォームタンパ
ク質の挿入用ｃＤＮＡ断片を調製した。これをＥＣＬダ
イレクトＤＮＡラベリングシステム（アマシャム社）を
用いて標識し、以下のスクリーニングにおけるプローブ
として用いた。 （ｂ）スクリーニング λgt11ベクターマウス子宮ｃＤＮＡライブラリー（クロ
ーンテック(CLONTECH)社製）を大腸菌Y1090 （クローン
テック社製）と混ぜ、３７℃で１５分間インキュベート
した後、0.7 ％アガロースＮＺＹ〔Nucleic Acid Res.,
16, 7583-7600(1988)〕を加え、1.5 ％寒天ＮＺＹプレ
ートにまいた。プラークのできたプレートにナイロンフ
ィルターを置き、フィルターにプラークを転写した。こ
のフィルターをアルカリ処理することによって変性させ
た後、８０℃２時間の加熱によってＤＮＡの固定を行っ
た。（ａ）において、ＥＣＬダイレクトＤＮＡラベリン
グシステムのプロトコールにしたがって先に標識したプ
ローブと、ＤＮＡをハイブリダイズさせた。更にＥＣＬ
検出システム〔アマシャム社製〕を用いてオートラジオ
グラフィーを行ってハイブリダイズするクローンを検出
した。 （ｃ）ＤＮＡ塩基配列解析 ４個のクローンが同定され、各クローンを配列解析のた
めにpUC119（宝酒造社）又はpBluescript SK(-) （スト
ラタジーン(STRATAGENE)社）にサブクローニングした。
得られたプラスミドで大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、形
質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＤＨ
５α／pmsmhc20、pmsmhcC5、pmsmhcN08、pmsmhcN14 を
得た。該形質転換体から産生されたプラスミドを、更に
エキソヌクレアーゼ消化によって段階的に削っていき、
又は適当な制限酵素によって切断後、自己閉環あるいは
サブクローニングし、配列解析のための鋳型ＤＮＡを調
製した〔Gene, 28, 351-359(1984) 〕。配列決定には蛍
光式ＤＮＡシーケンサー（アプライドバイオシステムズ
(Applied Biosystems)社）を用い、データー解析にはMa
cMolly〔Soft Gene GmbH社製〕を使用した。ＤＮＡの塩
基配列の結果を配列番号１に示した。また該塩基配列の
結果から得たアミノ酸配列の推定結果も配列番号１に示
した。 （ｄ）マウス平滑筋型ミオシン重鎖ＳＭ１アイソフォー
ム発現プラスミドの作製 先に得た４個のクローンからＳＭ１アイソフォーム全翻
訳領域をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドpmSM1 を
以下の方法により作製した〔ジェイ・サンブルックら、
モレキュラー・クローニング、第２版、１巻、コールド
スプリングハーバーラボラトリープレス、１９８９
年〕。まず５’非翻訳領域を短くするために、４個のク
ローンの一つであるプラスミドpmsmhcN14 を制限酵素Ba
mHI とBglIIで切断し５kbのＤＮＡ断片を精製、回収し
た。このＤＮＡ断片を自己閉環して大腸菌ＤＨ５αを形
質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを得た。このコ
ロニーの培養菌体から公知の方法〔エイチ・シー・バー
ンボイム（H. C. Birnboim）ら：Nucleic Acid Res.,
7, 1513（1979）〕に従ってプラスミドＤＮＡを回収し
た。得られたプラスミドの構造は、BamHI 及びKpnIで切
断後、アガロースゲル電気泳動により確認した。このプ
ラスミドをpmsmhcN14'とよぶ。

【００３０】得られたプラスミドpmsmhcN14'を制限酵素
であるNsiI（ニューイングランドバイオラブ(New Engla
nd Biolabs) 社）とEcoRV で切断し、４kbのＤＮＡ断片
を精製、回収した。またプラスミドpmsmhcN08 もNsiIと
EcoRV で切断して１kbのＤＮＡ断片を精製、回収し、先
に得られたプラスミドpmsmhcN14'由来の４kbのＤＮＡ断
片と結合させて、pmsmhcN14-08を構築した。このプラス
ミドの構造はNsiI及びEcoRV で切断して確認した。得ら
れたpmsmhcN14-08を制限酵素ApaIとKpnIで切断して５kb
のＤＮＡ断片を精製、回収した。また同様にプラスミド
pmsmhc20もApaIとKpnIで切断して1.5kb のＤＮＡ断片を
精製、回収し、先の５kbのＤＮＡ断片と結合させて、プ
ラスミドpmsmhcN14-08-20 を構築した。このプラスミド
の構造はApaI及びKpnIで切断して確認した。

【００３１】得られたpmsmhcN14-08-20 を制限酵素ApaI
で切断して６kbのＤＮＡ断片を精製、回収した。またpm
smhcC5をApaIで切断して２kbのＤＮＡ断片を精製、回収
し、pmsmhcN14-08-20 の６kbのＤＮＡ断片と結合させて
プラスミドpmsmhcN14-08-5-20 を構築した。このプラス
ミドの構造はEcoRI 及びNruIで切断して確認した。

【００３２】プラスミドpmsmhcN14-08-5-20 を制限酵素
NsiIとNruIで切断して８kbのＤＮＡ断片を精製、回収し
た。またプラスミドpmsmhcN08 も同様にNsiIとNruIで切
断し、1.5kb のＤＮＡ断片を精製、回収し、先の８kbの
ＤＮＡ断片と結合させて、マウス平滑筋型ミオシン重鎖
ＳＭ１アイソフォームの全翻訳領域を含むプラスミドpm
SM1 を構築した。プラスミドの構造はNsiI及びNruIで切
断して確認した。

【００３３】得られたpmSM1 を制限酵素XbaIとKpnIで切
断して６kbのＤＮＡ断片を精製、回収した。また発現ベ
クターＰＡＧＥ２０７（特開平６−４６８４１号公報）
のハイグロマイシンＢ耐性遺伝子のプロモーター部にあ
るSmaI部位を欠失させたＰＡＧＥ２０８を用い、これを
XbaIとKpnIで切断して６kbのＤＮＡ断片を精製、回収
し、先に得られたpmSM1 由来の６kbのＤＮＡ断片と結合
させて、発現プラスミドpSE-SM1-Hyg を構築した。この
プラスミドの構造はXbaI及びKpnIで切断して確認した。

【００３４】pmSM1 をXbaIとKpnIで切断したＤＮＡ断片
をＤＮＡブランティングキット（宝酒造社）を用いて平
滑化した。更に、発現ベクターｐＣＸＮ２をXhoIで切断
してＤＮＡブランティングキット（宝酒造社）を用いて
平滑化した。この２つのＤＮＡを結合させて、発現プラ
スミドpCAG-SM1を構築した。このプラスミドの構造はBg
lII で切断して確認した。

【００３５】前記プラスミドpSE-SM1-Hyg を Escherich
ia coli に組み込んで形質転換体を得た。

【００３６】なお、本形質転換体は、 Escherichia col
i pSE-SM1-Hyg (FERM BP-4974 ) として工業技術院生命
工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１
番３号）に平成７年１月２４日付けにて寄託されてい
る。

【００３７】（実施例２） ＣＨＯ細胞及びＨｅＬａ細
胞でＳＭ１アイソフォームを発現させた際の細胞増殖に
与える効果 発現プラスミドpSE-SM1-Hyg ２μｇとリポフェクトアミ
ン（商品名：ギブコ社製）４μｌを混合して１５分間イ
ンキュベートして複合体を作った。これをＣＨＯ細胞あ
るいはＨｅＬａ細胞に添加して、３７℃で５時間インキ
ュベートして遺伝子を導入した。遺伝子導入細胞を希釈
してシャーレにまき、ハイグロマイシン（商品名：シグ
マ社製）で遺伝子導入細胞を選択した。約１０日後、薬
剤耐性細胞のコロニーをクマシーブルー（商品名：バイ
オラッド社製）で染色して、面積を画像解析装置で測定
した。その結果、対照のベクターＰＡＧＥ２０８を導入
した場合に比べて面積の小さなコロニーが多く、ＳＭ１
アイソフォームの発現により増殖が抑制させることが示
された（図２、図３）。また、このハイグロマイシン耐
性ＣＨＯ細胞のクローニングを行い、得られたクローン
SM1-5-2-1 及びSM1-5-3-3 の増殖速度を調べたところ、
野生型あるいはＰＡＧＥ２０８導入細胞と比べ低下して
いた（図４）。

【００３８】（実施例３） バルーン傷害ウサギモデル
の血管壁にSM1 遺伝子を強制導入した時の内膜肥厚抑制
効果 体重 2.4〜3.2kg の日本白色家兎の大腿動脈からＸ線透
視下、３フレンチ（Fr）のＰＴＣＡカテーテルを挿入し
右総頸動脈まで誘導した。10気圧で拡張させたバルーン
により右総頸動脈を３回擦過し、血管壁を傷害した。擦
過３日後の血管傷害部に対して、pCAG-SM1 300mgとリポ
フェクチン（GIBCO BRL 社）の混合液をバード社製ヴォ
リンスキー型インフュージョンカテーテルを用いて、６
気圧でインフュージョンした。別の家兎を用い、同様の
方法で傷害血管を作製し、pCAG-SM1の代わりにβ−ガラ
クトシダーゼの発現プラスミドを導入して比較例とし
た。

【００３９】インフュージョン後３日目にヘパリン生理
食塩水により灌流して儀死せしめた後、右総頸動脈を摘
出し、細切後ISOGEN（和光純薬）１mlを加え、ポリトロ
ンホモジナイザーによりホモジナイズした。AGPC法〔ピ
ー・コムジンスキー（P. Chomczynski）とエヌ・サッチ
（N. Sacchi）：Anal. Biochem., 162, 156-159(198
7)〕により総ＲＮＡを抽出した後、RT-PCR法によりＳＭ
１のｍＲＮＡを増幅した。実施例（ＳＭ１遺伝子導入）
および比較例（β−ガラクトシダーゼ遺伝子導入）につ
き、増幅させたDNA 、及びそれを制限酵素NheIで切断し
たものをアガロースゲル電気泳動にかけた。実施例には
強く、比較例ではわずかにＳＭ１のバンドが検出された
が、実施例のバンドのみがNheIにより切断された。同酵
素の切断部位は、家兎のＳＭ１にはなく、マウスＳＭ１
のみにあることから、実施例においてマウス由来のＳＭ
１遺伝子が発現していることが裏付けられた。

【００４０】導入２週後に２％パラホルムアルデヒドを
含むＰＢＳにより灌流し屠殺、固定を行い、右総頸動脈
を摘出した。インフュージョンカテーテルにより導入さ
れた部分を切り出し、パラフィン包埋し、血管の輪切り
切片を作製した。１本の血管を４等分し、それぞれの組
織から１枚ずつ切片を作製し、ヘマトキシリン−エオジ
ン染色により染色した。血管の内弾性板を境に内膜を中
膜にわけ、それぞれの面積を測定した。得られた各切片
につき、内膜面積と中膜面積の比をとり、その平均を取
って内膜肥厚度を求めた。実施例３頭、比較例３頭につ
き内膜肥厚度を求めた結果、ＳＭ１遺伝子の強制導入に
より内膜肥厚が抑制されることが確認された（図５）。

【００４１】以上の結果から、プラスミドpSE-SM1-Hyg
及びpCAG-SM1に細胞増殖低下作用があり、血管細胞の異
常増殖により生じる動脈硬化の再狭窄に有効であること
が示唆された。

【００４２】

【発明の効果】本発明の平滑筋型ミオシン重鎖ＳＭ１ア
イソフォームタンパク質をコードするＤＮＡをベクター
ＤＮＡに組み込んだ組換え体ＤＮＡを動物細胞で発現さ
せると、その増殖が抑制されることが明らかとなった。
この効果はヒト由来のＨｅＬａ細胞においても見られ
た。したがって、本発明の組換え体ＤＮＡはＰＴＣＡ処
置後の再狭窄に対する遺伝子治療剤として有効に用いる
ことができる。

【００４３】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：６１７５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源 生物名：マウス 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１０５，６０２３ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：１０５，６０２０ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 AGATTTGGAC CATCCCAGCC TGGGATCAGT GCCAGATCCG AGCTCTCCAT CCGGTGTCCT 60 CCTGCTAATC CACCCCCGGA GTAGATCTGG GACCACCAGA CATC ATG GCG CAG AAA 116 Met Ala Gln Lys 1 GGG CAG CTC AGC GAT GAT GAG AAG TTC CTC TTT GTG GAT AAA AAC TTC 164 Gly Gln Leu Ser Asp Asp Glu Lys Phe Leu Phe Val Asp Lys Asn Phe 5 10 15 20 ATG AAC AGC CCA ATG GCT CAG GCC GAC TGG GTA GCC AAG AAG CTG GTG 212 Met Asn Ser Pro Met Ala Gln Ala Asp Trp Val Ala Lys Lys Leu Val 25 30 35 TGG GTC CCT TCA GAG AAG CAG GGC TTC GAA GCA GCC AGC ATC AAG GAG 260 Trp Val Pro Ser Glu Lys Gln Gly Phe Glu Ala Ala Ser Ile Lys Glu 40 45 50 GAG AAG GGC GAT GAG GTG GTC GTG GAG TTG GTG GAA AAT GGA AAG AAG 308 Glu Lys Gly Asp Glu Val Val Val Glu Leu Val Glu Asn Gly Lys Lys 55 60 65 GTC ACA GTT GGC AAA GAT GAC ATC CAA AAA ATG AAC CCA CCC AAG TTC 356 Val Thr Val Gly Lys Asp Asp Ile Gln Lys Met Asn Pro Pro Lys Phe 70 75 80 TCT AAG GTG GAG GAC ATG GCA GAG CTG ACG TGC CTC AAT GAG GCC TCT 404 Ser Lys Val Glu Asp Met Ala Glu Leu Thr Cys Leu Asn Glu Ala Ser 85 90 95 100 GTG CTG CAC AAC CTG AGG GAG CGA TAC TTC TCA GGC CTC ATC TAT ACC 452 Val Leu His Asn Leu Arg Glu Arg Tyr Phe Ser Gly Leu Ile Tyr Thr 105 110 115 TAC TCT GGC CTC TTC TGT GTG GTG GTC AAC CCC TAC AAG TAC CTA CCC 500 Tyr Ser Gly Leu Phe Cys Val Val Val Asn Pro Tyr Lys Tyr Leu Pro 120 125 130 ATC TAC TCA GAA AAG ATC GTG GAT ATG TAC AAG GGC AAG AAG AGG CAT 548 Ile Tyr Ser Glu Lys Ile Val Asp Met Tyr Lys Gly Lys Lys Arg His 135 140 145 GAG ATG CCG CCT CAC ATC TAT GCC ATT GCC GAC ACA GCC TAC AGA AGC 596 Glu Met Pro Pro His Ile Tyr Ala Ile Ala Asp Thr Ala Tyr Arg Ser 150 155 160 ATG CTA CAA GAT CGT GAA GAC CAG TCC ATT CTG TGC ACA GGT GAG TCT 644 Met Leu Gln Asp Arg Glu Asp Gln Ser Ile Leu Cys Thr Gly Glu Ser 165 170 175 180 GGA GCC GGA AAG ACA GAG AAC ACA CAG AAA GTC ATA CAG TAC TTG GCT 692 Gly Ala Gly Lys Thr Glu Asn Thr Gln Lys Val Ile Gln Tyr Leu Ala 185 190 195 GTG GTG GCG TCC TCC CAC AAG GGC AAG AAA GAC AGC AGC ATC ACG GGG 740 Val Val Ala Ser Ser His Lys Gly Lys Lys Asp Ser Ser Ile Thr Gly 200 205 210 GAG CTG GAA AAG CAG CTT CTA CAG GCA AAC CCA ATC CTG GAG GCT TTC 788 Glu Leu Glu Lys Gln Leu Leu Gln Ala Asn Pro Ile Leu Glu Ala Phe 215 220 225 GGC AAT GCG AAA ACC GTC AAG AAC GAC AAC TCC TCT CGC TTT GGC AAG 836 Gly Asn Ala Lys Thr Val Lys Asn Asp Asn Ser Ser Arg Phe Gly Lys 230 235 240 TTC ATT CGC ATC AAC TTC GAT GTC ACT GGT TAC ATT GTA GGT GCC AAT 884 Phe Ile Arg Ile Asn Phe Asp Val Thr Gly Tyr Ile Val Gly Ala Asn 245 250 255 260 ATT GAA ACA TAT CTT CTG GAA AAG TCT AGG GCT ATT CGA CAG GCT AGG 932 Ile Glu Thr Tyr Leu Leu Glu Lys Ser Arg Ala Ile Arg Gln Ala Arg 265 270 275 GAT GAG AGA ACA TTT CAC ATC TTC TAC TAC CTG CTC GCC GGA GCC AAG 980 Asp Glu Arg Thr Phe His Ile Phe Tyr Tyr Leu Leu Ala Gly Ala Lys 280 285 290 GAA AAG ATG AAA AGT GAC CTG CTT TTG GAG AGC TTC AAC AGC TAC ACA 1028 Glu Lys Met Lys Ser Asp Leu Leu Leu Glu Ser Phe Asn Ser Tyr Thr 295 300 305 TTT TTA TCC AAT GGC TTT GTG CCC ATC CCA GCT GCA CAA GAT GAT GAG 1076 Phe Leu Ser Asn Gly Phe Val Pro Ile Pro Ala Ala Gln Asp Asp Glu 310 315 320 ATG TTC CAG GAG ACA CTG GAA GCC ATG TCT ATC ATG GGC TTC AAT GAA 1124 Met Phe Gln Glu Thr Leu Glu Ala Met Ser Ile Met Gly Phe Asn Glu 325 330 335 340 GAG GAA CAG CTA GCC ATC TTG AAG GTA GTA TCA TCT GTC CTT CAG CTT 1172 Glu Glu Gln Leu Ala Ile Leu Lys Val Val Ser Ser Val Leu Gln Leu 345 350 355 GGA AAC ATT GTC TTC AAG AAG GAG CGA AAC ACA GAC CAG GCA TCC ATG 1220 Gly Asn Ile Val Phe Lys Lys Glu Arg Asn Thr Asp Gln Ala Ser Met 360 365 370 CCT GAT AAC ACA GCG GCT CAG AAA GTT TGC CAC CTC GTG GGG ATT AAT 1268 Pro Asp Asn Thr Ala Ala Gln Lys Val Cys His Leu Val Gly Ile Asn 375 380 385 GTG ACA GAT TTC ACT AGA GCC ATC CTG ACC CCA CGT ATC AAA GTT GGA 1316 Val Thr Asp Phe Thr Arg Ala Ile Leu Thr Pro Arg Ile Lys Val Gly 390 395 400 CGG GAT GTG GTG CAG AAG GCT CAG ACC AAA GAA CAG GCT GAC TTC GCC 1364 Arg Asp Val Val Gln Lys Ala Gln Thr Lys Glu Gln Ala Asp Phe Ala 405 410 415 420 ATC GAG GCC TTA GCC AAG GCC ACC TAT GAG CGC CTT TTC CGA TGG ATT 1412 Ile Glu Ala Leu Ala Lys Ala Thr Tyr Glu Arg Leu Phe Arg Trp Ile 425 430 435 CTC AGC CGT GTA AAC AAG GCC TTG GAC AAG ACC CAT CGG CAG GGG GCC 1460 Leu Ser Arg Val Asn Lys Ala Leu Asp Lys Thr His Arg Gln Gly Ala 440 445 450 TCC TTC CTG GGC ATT CTG GAT ATT GCT GGG TTT GAA ATC TTT GAG GTA 1508 Ser Phe Leu Gly Ile Leu Asp Ile Ala Gly Phe Glu Ile Phe Glu Val 455 460 465 AAC TCC TTC GAG CAG CTG TGC ATC AAC TAC ACC AAC GAG AAG CTG CAG 1556 Asn Ser Phe Glu Gln Leu Cys Ile Asn Tyr Thr Asn Glu Lys Leu Gln 470 475 480 CAG CTG TTC AAC CAC ACG ATG TTC ATC CTG GAG CAG GAA GAG TAC CAG 1604 Gln Leu Phe Asn His Thr Met Phe Ile Leu Glu Gln Glu Glu Tyr Gln 485 490 495 500 CGA GAG GGC ATC GAG TGG AAC TTC ATC GAC TTC GGC CTG GAC CTG CAG 1652 Arg Glu Gly Ile Glu Trp Asn Phe Ile Asp Phe Gly Leu Asp Leu Gln 505 510 515 CCT AGT ATT GAG CTG ATT GAG CGG CCG AAC AAC CCT CCC GGT GTG CTG 1700 Pro Ser Ile Glu Leu Ile Glu Arg Pro Asn Asn Pro Pro Gly Val Leu 520 525 530 GCC CTG CTG GAT GAA GAA TGC TGG TTC CCC AAA GCT ACA GAC AAG TCT 1748 Ala Leu Leu Asp Glu Glu Cys Trp Phe Pro Lys Ala Thr Asp Lys Ser 535 540 545 TTT GTG GAG AAG CTA TGC TCA GAG CAG GGA AAT CAC CCC AAA TTT CAG 1796 Phe Val Glu Lys Leu Cys Ser Glu Gln Gly Asn His Pro Lys Phe Gln 550 555 560 AAG CCC AAG CAG CTA AAG GAC AAA ACA GAG TTC TCC ATC ATC CAC TAT 1844 Lys Pro Lys Gln Leu Lys Asp Lys Thr Glu Phe Ser Ile Ile His Tyr 565 570 575 580 GCT GGG AAG GTG GAC TAC AAT GCA AGT GCC TGG CTG ACC AAG AAC ATG 1892 Ala Gly Lys Val Asp Tyr Asn Ala Ser Ala Trp Leu Thr Lys Asn Met 585 590 595 GAC CCG CTA AAT GAC AAT GTG ACA TCA CTC CTC AAT GCC TCC TCT GAC 1940 Asp Pro Leu Asn Asp Asn Val Thr Ser Leu Leu Asn Ala Ser Ser Asp 600 605 610 AAG TTT GTG GCT GAC CTG TGG AAG GAT GTG GAC CGC ATT GTG GGG CTG 1988 Lys Phe Val Ala Asp Leu Trp Lys Asp Val Asp Arg Ile Val Gly Leu 615 620 625 GAC CAG ATG GCC AAG ATG ACT GAG AGC TCA CTG CCC AGT GCC TCA AAG 2036 Asp Gln Met Ala Lys Met Thr Glu Ser Ser Leu Pro Ser Ala Ser Lys 630 635 640 ACC AAA AAG GGC ATG TTC CGC ACC GTG GGA CAG CTC TAC AAA GAG CAG 2084 Thr Lys Lys Gly Met Phe Arg Thr Val Gly Gln Leu Tyr Lys Glu Gln 645 650 655 660 TTG GGG AAA CTG ATG GCT ACA CTG CGC AAT ACC ACG GCT AAC TTT GTG 2132 Leu Gly Lys Leu Met Ala Thr Leu Arg Asn Thr Thr Ala Asn Phe Val 665 670 675 CGC TGC ATC ATC CCC AAC CAT GAG AAG AGG TCT GGC AAG CTG GAT GCA 2180 Arg Cys Ile Ile Pro Asn His Glu Lys Arg Ser Gly Lys Leu Asp Ala 680 685 690 TTT CTA GTG CTG GAA CAG CTG CGC TGC AAC GGT GTG TTG GAA GGC ATC 2228 Phe Leu Val Leu Glu Gln Leu Arg Cys Asn Gly Val Leu Glu Gly Ile 695 700 705 CGC ATC TGC CGT CAG GGC TTC CCC AAC AGG ATT GTC TTC CAA GAG TTC 2276 Arg Ile Cys Arg Gln Gly Phe Pro Asn Arg Ile Val Phe Gln Glu Phe 710 715 720 CGG CAA CGC TAT GAG ATC CTG GCA GCG AAC GCC ATC CCC AAA GGC TTC 2324 Arg Gln Arg Tyr Glu Ile Leu Ala Ala Asn Ala Ile Pro Lys Gly Phe 725 730 735 740 ATG GAT GGA AAG CAA GCC TGC ATT CTC ATG ATC AAA GCC CTC GAA CTT 2372 Met Asp Gly Lys Gln Ala Cys Ile Leu Met Ile Lys Ala Leu Glu Leu 745 750 755 GAC CCT AAC CTG TAC AGG ATT GGG CAG AGC AAA ATC TTC TTC CGA ACG 2420 Asp Pro Asn Leu Tyr Arg Ile Gly Gln Ser Lys Ile Phe Phe Arg Thr 760 765 770 GGG GTC CTG GCC CAC CTA GAG GAG GAA CGA GAC CTG AAA ATT ACT GAT 2468 Gly Val Leu Ala His Leu Glu Glu Glu Arg Asp Leu Lys Ile Thr Asp 775 780 785 GTC ATC ATG GCC TTC CAG GCA ATG TGT CGT GGC TAC CTT GCC AGA AAG 2516 Val Ile Met Ala Phe Gln Ala Met Cys Arg Gly Tyr Leu Ala Arg Lys 790 795 800 GCC TTC ACC AAG AGG CAG CAA CAG CTG ACA GCC ATG AAG GTG ATC CAG 2564 Ala Phe Thr Lys Arg Gln Gln Gln Leu Thr Ala Met Lys Val Ile Gln 805 810 815 820 AGG AAC TGC GCT GCC TAC CTT AAG CTC CGC AAC TGG CAA TGG TGG CGG 2612 Arg Asn Cys Ala Ala Tyr Leu Lys Leu Arg Asn Trp Gln Trp Trp Arg 825 830 835 CTC TTC ACC AAA GTA AAG CCA TTG CTC CAG GTG ACA CGG CAG GAG GAG 2660 Leu Phe Thr Lys Val Lys Pro Leu Leu Gln Val Thr Arg Gln Glu Glu 840 845 850 GAG ATG CAG GCC AAG GAG GAG GAG ATG CAA AAG ATC ACG GAG CGG CAG 2708 Glu Met Gln Ala Lys Glu Glu Glu Met Gln Lys Ile Thr Glu Arg Gln 855 860 865 CAG AAG GCA GAG ACT GAG TTG AAG GAG CTG GAG CAG AAG CAC ACT CAG 2756 Gln Lys Ala Glu Thr Glu Leu Lys Glu Leu Glu Gln Lys His Thr Gln 870 875 880 CTG GCT GAG GAG AAG ACT CTG CTG CAG GAG CAG TTG CAG GCA GAG ACA 2804 Leu Ala Glu Glu Lys Thr Leu Leu Gln Glu Gln Leu Gln Ala Glu Thr 885 890 895 900 GAG CTG TAT GCT GAG TCT GAG GAG ATG CGG GTC CGG TTG GCA GCC AAG 2852 Glu Leu Tyr Ala Glu Ser Glu Glu Met Arg Val Arg Leu Ala Ala Lys 905 910 915 AAG CAG GAA CTG GAG GAG ATC CTA CAT GAG ATG GAG GCC CGC CTG GAG 2900 Lys Gln Glu Leu Glu Glu Ile Leu His Glu Met Glu Ala Arg Leu Glu 920 925 930 GAA GAG GAA GAC CGG CGC CAG CAA CTA CAG GCT GAG AGG AAG AAG ATG 2948 Glu Glu Glu Asp Arg Arg Gln Gln Leu Gln Ala Glu Arg Lys Lys Met 935 940 945 GCT CAG CAG ATG CTA GAC CTG GAG GAG CAA CTG GAG GAG GAA GAG GCC 2996 Ala Gln Gln Met Leu Asp Leu Glu Glu Gln Leu Glu Glu Glu Glu Ala 950 955 960 GCC AGA CAG AAA CTA CAG CTA GAG AAG GTC ACG GCT GAG GCC AAG ATC 3044 Ala Arg Gln Lys Leu Gln Leu Glu Lys Val Thr Ala Glu Ala Lys Ile 965 970 975 980 AAG AAA CTG GAG GAT GAC ATC TTG GTT ATG GAT GAT CAG AAC AGT AAA 3092 Lys Lys Leu Glu Asp Asp Ile Leu Val Met Asp Asp Gln Asn Ser Lys 985 990 995 CTT TCA AAA GAA CGA AAA CTC CTT GAA GAG AGG GTC AGC GAC TTG ACA 3140 Leu Ser Lys Glu Arg Lys Leu Leu Glu Glu Arg Val Ser Asp Leu Thr 1000 1005 1010 ACC AAC CTA GCA GAA GAG GAA GAA AAG GCT AAA AAC CTC ACA AAG CTG 3188 Thr Asn Leu Ala Glu Glu Glu Glu Lys Ala Lys Asn Leu Thr Lys Leu 1015 1020 1025 AAG AGC AAG CAT GAG TCT ATG ATC TCA GAG CTG GAG GTG AGG CTG AAG 3236 Lys Ser Lys His Glu Ser Met Ile Ser Glu Leu Glu Val Arg Leu Lys 1030 1035 1040 AAA GAG GAG AAG AGC CGG CAG GAG CTG GAG AAA CTC AAG AGG AAA CTG 3284 Lys Glu Glu Lys Ser Arg Gln Glu Leu Glu Lys Leu Lys Arg Lys Leu 1045 1050 1055 1060 GAG GGT GAT GCC AGT GAC TTC CAT GAG CAG ATC GCT GAC TTG CAG GCC 3332 Glu Gly Asp Ala Ser Asp Phe His Glu Gln Ile Ala Asp Leu Gln Ala 1065 1070 1075 CAG ATT GCA GAG CTC AAG ATG CAG CTG GCA AAG AAA GAG GAA GAG CTA 3380 Gln Ile Ala Glu Leu Lys Met Gln Leu Ala Lys Lys Glu Glu Glu Leu 1080 1085 1090 CAG GCA GCT CTA GCC AGG CTT GAT GAA GAG ATC GCC CAG AAA AAC AAT 3428 Gln Ala Ala Leu Ala Arg Leu Asp Glu Glu Ile Ala Gln Lys Asn Asn 1095 1100 1105 GCC CTA AAG AAG ATT CGC GAG CTA GAG GGC CAT ATC TCA GAC CTA CAA 3476 Ala Leu Lys Lys Ile Arg Glu Leu Glu Gly His Ile Ser Asp Leu Gln 1110 1115 1120 GAG GAC CTA GAC TCA GAG CGG GCT GCC AGG AAC AAG GCC GAG AAG CAG 3524 Glu Asp Leu Asp Ser Glu Arg Ala Ala Arg Asn Lys Ala Glu Lys Gln 1125 1130 1135 1140 AAG CGA GAC CTG GGG GAG GAG CTG GAG GCA CTC AAG ACG GAG CTG GAG 3572 Lys Arg Asp Leu Gly Glu Glu Leu Glu Ala Leu Lys Thr Glu Leu Glu 1145 1150 1155 GAT ACG CTG GAC AGC ACA GCT ACC CAG CAG GAG CTC AGA GCC AAG AGG 3620 Asp Thr Leu Asp Ser Thr Ala Thr Gln Gln Glu Leu Arg Ala Lys Arg 1160 1165 1170 GAA CAG GAG GTG ACA GTG CTG AAG AAG GCC CTG GAT GAG GAG ACG CGG 3668 Glu Gln Glu Val Thr Val Leu Lys Lys Ala Leu Asp Glu Glu Thr Arg 1175 1180 1185 TCC CAT GAG GCC CAG GTC CAG GAG ATG AGG CAG AAG CAC ACA CAG GCA 3716 Ser His Glu Ala Gln Val Gln Glu Met Arg Gln Lys His Thr Gln Ala 1190 1195 1200 GTG GAG GAA CTC ACA GAG CAG CTG GAG CAG TTC AAA AGG GCC AAG GCA 3764 Val Glu Glu Leu Thr Glu Gln Leu Glu Gln Phe Lys Arg Ala Lys Ala 1205 1210 1215 1220 AAC CTG GAC AAA AGC AAG CAG ACA CTG GAG AAG GAG AAC GCG GAC CTG 3812 Asn Leu Asp Lys Ser Lys Gln Thr Leu Glu Lys Glu Asn Ala Asp Leu 1225 1230 1235 GCT GGG GAG CTG CGT GTC CTG GGC CAG GCG AAG CAG GAG GTG GAA CAC 3860 Ala Gly Glu Leu Arg Val Leu Gly Gln Ala Lys Gln Glu Val Glu His 1240 1245 1250 AAG AAG AAG AAG CTG GAG GTG CAG CTG CAG GAT CTG CAG TCC AAG TGC 3908 Lys Lys Lys Lys Leu Glu Val Gln Leu Gln Asp Leu Gln Ser Lys Cys 1255 1260 1265 AGT GAT GGG GAG CGT GCC CGG GCT GAG CTC AGT GAC AAG GTC CAC AAG 3956 Ser Asp Gly Glu Arg Ala Arg Ala Glu Leu Ser Asp Lys Val His Lys 1270 1275 1280 CTA CAG AAT GAA GTG GAG AGT GTC ACT GGC ATG CTC AAT GAG GCA GAG 4004 Leu Gln Asn Glu Val Glu Ser Val Thr Gly Met Leu Asn Glu Ala Glu 1285 1290 1295 1300 GGC AAA GCC ATC AAA CTG GCC AAA GAT GTG GCT TCC CTT GGA TCC CAG 4052 Gly Lys Ala Ile Lys Leu Ala Lys Asp Val Ala Ser Leu Gly Ser Gln 1305 1310 1315 CTT CAG GAC ACC CAA GAG CTG CTC CAA GAA GAA ACC CGG CAG AAG CTC 4100 Leu Gln Asp Thr Gln Glu Leu Leu Gln Glu Glu Thr Arg Gln Lys Leu 1320 1325 1330 AAT GTG TCT ACC AAG CTG CGT CAG TTG GAA GAT GAA AGG AAC AGC CTG 4148 Asn Val Ser Thr Lys Leu Arg Gln Leu Glu Asp Glu Arg Asn Ser Leu 1335 1340 1345 CAG GAC CAG CTG GAT GAG GAG ATG GAG GCT AAG CAA AAC CTG GAG CGC 4196 Gln Asp Gln Leu Asp Glu Glu Met Glu Ala Lys Gln Asn Leu Glu Arg 1350 1355 1360 CAT GTC TCA ACA CTG AAC ATT CAG CTC TCA GAC TCT AAG AAG AAG CTG 4244 His Val Ser Thr Leu Asn Ile Gln Leu Ser Asp Ser Lys Lys Lys Leu 1365 1370 1375 1380 CAG GAC TTT GCA AGT ACC ATC GAG GTC ATG GAG GAG GGG AAG AAG AGG 4292 Gln Asp Phe Ala Ser Thr Ile Glu Val Met Glu Glu Gly Lys Lys Arg 1385 1390 1395 TTA CAG AAA GAG ATG GAG GGC CTC AGC CAG CAG TAT GAG GAG AAG GCG 4340 Leu Gln Lys Glu Met Glu Gly Leu Ser Gln Gln Tyr Glu Glu Lys Ala 1400 1405 1410 GCT GCC TAT GAC AAA CTG GAG AAA ACC AAG AAC AGG CTC CAG CAG GAG 4388 Ala Ala Tyr Asp Lys Leu Glu Lys Thr Lys Asn Arg Leu Gln Gln Glu 1415 1420 1425 CTG GAT GAC CTG GTC GTG GAC TTG GAC AAC CAG CGG CAA CTG GTA TCC 4436 Leu Asp Asp Leu Val Val Asp Leu Asp Asn Gln Arg Gln Leu Val Ser 1430 1435 1440 AAT CTG GAA AAG AAG CAG AAG AAA TTT GAC CAG TTG TTA GCT GAG GAG 4484 Asn Leu Glu Lys Lys Gln Lys Lys Phe Asp Gln Leu Leu Ala Glu Glu 1445 1450 1455 1460 AAG AAC ATC TCC TCC AAG TAT GCG GAT GAG AGA GAC CGA GCT GAA GCA 4532 Lys Asn Ile Ser Ser Lys Tyr Ala Asp Glu Arg Asp Arg Ala Glu Ala 1465 1470 1475 GAG GCC AGG GAA AAG GAG ACA AAG GCT TTG TCT CTA GCC CGG GCC CTG 4580 Glu Ala Arg Glu Lys Glu Thr Lys Ala Leu Ser Leu Ala Arg Ala Leu 1480 1485 1490 GAG GAA GCC CTG GAA GCC AAA GAA GAG CTG GAG AGG ACC AAC AAG ATG 4628 Glu Glu Ala Leu Glu Ala Lys Glu Glu Leu Glu Arg Thr Asn Lys Met 1495 1500 1505 CTC AAA GCT GAG ATG GAA GAC CTG GTC AGC TCC AAG GAT GAT GTA GGC 4676 Leu Lys Ala Glu Met Glu Asp Leu Val Ser Ser Lys Asp Asp Val Gly 1510 1515 1520 AAG AAC GTG CAT GAA CTG GAG AAG TCC AAG CGT GCC TTG GAG ACC CAG 4724 Lys Asn Val His Glu Leu Glu Lys Ser Lys Arg Ala Leu Glu Thr Gln 1525 1530 1535 1540 ATG GAA GAG ATG AAA ACC CAG CTG GAG GAG TCG GAG GAT GAC GTG CAG 4772 Met Glu Glu Met Lys Thr Gln Leu Glu Glu Ser Glu Asp Asp Val Gln 1545 1550 1555 GCC ACT GAG GAT GCC AAG CTG CGG CTA GAG GTC AAC ATG CAG GCC CTC 4820 Ala Thr Glu Asp Ala Lys Leu Arg Leu Glu Val Asn Met Gln Ala Leu 1560 1565 1570 AAG GGC CAG TTT GAA CGC GAT CTC CAG GCT CGG GAT GAA CAG AAT GAG 4868 Lys Gly Gln Phe Glu Arg Asp Leu Gln Ala Arg Asp Glu Gln Asn Glu 1575 1580 1585 GAG AAG AGG AGG CAG CTA CAG CGG CAG CTG CAC GAG TAT GAG ACA GAA 4916 Glu Lys Arg Arg Gln Leu Gln Arg Gln Leu His Glu Tyr Glu Thr Glu 1590 1595 1600 CTG GAA GAT GAA CGG AAG CAG AGA GCT CTG GCG GCG GCA GCT AAG AAG 4964 Leu Glu Asp Glu Arg Lys Gln Arg Ala Leu Ala Ala Ala Ala Lys Lys 1605 1610 1615 1620 AAG CTG GAA GGG GAC CTA AAA GAC CTA GAG CTC CAG GCT GAC TCA GCC 5012 Lys Leu Glu Gly Asp Leu Lys Asp Leu Glu Leu Gln Ala Asp Ser Ala 1625 1630 1635 ATC AAA GGG AGG GAG GAA GCC ATC AAG CAG CTT CGA AAA CTG CAG GCT 5060 Ile Lys Gly Arg Glu Glu Ala Ile Lys Gln Leu Arg Lys Leu Gln Ala 1640 1645 1650 CAG ATG AAG GAC TTC CAA AGA GAG CTG GAT GAT GCC CGT GCC TCC AGG 5108 Gln Met Lys Asp Phe Gln Arg Glu Leu Asp Asp Ala Arg Ala Ser Arg 1655 1660 1665 GAT GAG ATC TTT GCC ACC TCA AAA GAG AAT GAG AAG AAA GCC AAG AGT 5156 Asp Glu Ile Phe Ala Thr Ser Lys Glu Asn Glu Lys Lys Ala Lys Ser 1670 1675 1680 CTG GAG GCA GAC CTC ATG CAG CTC CAA GAG GAC CTG GCA GCA GCT GAG 5204 Leu Glu Ala Asp Leu Met Gln Leu Gln Glu Asp Leu Ala Ala Ala Glu 1685 1690 1695 1700 AGA GCT CGC AAG CAA GCT GAC CTG GAG AAG GAG GAG CTG GCC GAG GAG 5252 Arg Ala Arg Lys Gln Ala Asp Leu Glu Lys Glu Glu Leu Ala Glu Glu 1705 1710 1715 CTG GCT AGC AGC TTG TCA GGA AGG AAT ACA CTG CAG GAT GAG AAG CGC 5300 Leu Ala Ser Ser Leu Ser Gly Arg Asn Thr Leu Gln Asp Glu Lys Arg 1720 1725 1730 CGC CTG GAG GCA AGG ATC GCC CAA CTA GAG GAG GAG CTG GAG GAA GAG 5348 Arg Leu Glu Ala Arg Ile Ala Gln Leu Glu Glu Glu Leu Glu Glu Glu 1735 1740 1745 CAG GGC AAC ATG GAG GCC ATG AGT GAT AGA GTA CGC AAG GCC ACA CTG 5396 Gln Gly Asn Met Glu Ala Met Ser Asp Arg Val Arg Lys Ala Thr Leu 1750 1755 1760 CAG GCT GAG CAA CTG AGC AAT GAG CTG GCC ACA GAA CGC AGC ACG GCT 5444 Gln Ala Glu Gln Leu Ser Asn Glu Leu Ala Thr Glu Arg Ser Thr Ala 1765 1770 1775 1780 CAG AAG AAT GAG AGC GCA CGG CAA CAG CTG GAG CGC CAG AAC AAG GAA 5492 Gln Lys Asn Glu Ser Ala Arg Gln Gln Leu Glu Arg Gln Asn Lys Glu 1785 1790 1795 CTG CGA AGC AAG TTG CAG GAG GTA GAA GGT GCT GTC AAA GCC AAG CTC 5540 Leu Arg Ser Lys Leu Gln Glu Val Glu Gly Ala Val Lys Ala Lys Leu 1800 1805 1810 AAG TCC ACT GTT GCG GCG CTG GAG GCC AAG ATT GCA CAG CTG GAG GAG 5588 Lys Ser Thr Val Ala Ala Leu Glu Ala Lys Ile Ala Gln Leu Glu Glu 1815 1820 1825 CAG GTT GAA CAG GAG GCC AGA GAG AAA CAG GCG GCC ACC AAG TCG CTG 5636 Gln Val Glu Gln Glu Ala Arg Glu Lys Gln Ala Ala Thr Lys Ser Leu 1830 1835 1840 AAG CAA AAG GAC AAG AAG CTA AAG GAG GTC CTG CTG CAG GTG GAG GAT 5684 Lys Gln Lys Asp Lys Lys Leu Lys Glu Val Leu Leu Gln Val Glu Asp 1845 1850 1855 1860 GAG CGC AAG ATG GCA GAG CAG TAC AAG GAG CAG GCA GAG AAA GGA AAC 5732 Glu Arg Lys Met Ala Glu Gln Tyr Lys Glu Gln Ala Glu Lys Gly Asn 1865 1870 1875 ACC AAG GTC AAG CAG CTG AAG AGG CAG CTG GAA GAG GCA GAG GAG GAG 5780 Thr Lys Val Lys Gln Leu Lys Arg Gln Leu Glu Glu Ala Glu Glu Glu 1880 1885 1890 TCC CAG TGC ATC AAC GCC AAC CGC AGG AAG CTG CAG CGG GAG CTA GAT 5828 Ser Gln Cys Ile Asn Ala Asn Arg Arg Lys Leu Gln Arg Glu Leu Asp 1895 1900 1905 GAG GCC ACA GAG AGC AAT GAG GCC ATG GGC CGT GAG GTG AAC GCC CTC 5876 Glu Ala Thr Glu Ser Asn Glu Ala Met Gly Arg Glu Val Asn Ala Leu 1910 1915 1920 AAG AGC AAA CTC AGG AGA GGA AAC GAG GCT TCA TTT GTT CCT TCC AGA 5924 Lys Ser Lys Leu Arg Arg Gly Asn Glu Ala Ser Phe Val Pro Ser Arg 1925 1930 1935 1940 AGG GCT GGG GGC CGT AGA GTT ATT GAA AAC ACA GAT GGT TCT GAA GAA 5972 Arg Ala Gly Gly Arg Arg Val Ile Glu Asn Thr Asp Gly Ser Glu Glu 1945 1950 1955 GAA ATG GAC GCT CGG GAC TCA GAC TTC AAT GGA ACC AAA GCC AGT GAA 6020 Glu Met Asp Ala Arg Asp Ser Asp Phe Asn Gly Thr Lys Ala Ser Glu 1960 1965 1970 TAAATTCAGG ATTGGACACC ATGTCAGGGA AAACAGAACA CTAAACGACA GCAGAGCCCA 6080 GCAGACTGCT TAGCACTTGT GTCCATTCGT TCTCAAGTCA CAGAAATCAC TCCACCCCTC 6140 ACCAGGAGTC AACCACAGCC CTGCACAAAG GGTGT 6175 配列番号：２ 配列の長さ：５９１９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ATG GCG CAG AAN GGN CAN CTC AGC GAN GAT GAG AAG TTC CTC TTT GTG 48 GAN AAN AAC TTC ATN AAC AGC CCN NTG GCN CAG GCC GAC TGG GTN GCC 96 AAG ANG CTG GTG TGG GTC CCT TCN GAG AAG CAG GGC TTC GAN GCN GCC 144 AGC ATC AAG GAG GAG AAG GGN GAT GAG GTG GTC GTG GAG NTG GTG GAN 192 AAT GGN AAG AAG GTC ACN GTN GGC AAN GAT GAC ATC CAN AAN ATG AAC 240 CCN CCC AAG TTC TCN AAG GTG GAN GAC ATG GCN GAG CTG ACG TGB CTC 288 AAN GAN GCN TCN GTG CTG CAC AAC CTG AGG GAG VGN TAC TTC TCN GGN 336 CTC ATC TAN ACN TAC TCN GGC CTC TTC TGB GTG GTG GTC AAC CCC TAC 384 AAG YAS CTN CCC ATC TAC TCN GAN AAG ATC GTG GAN ATG TAC AAG GGC 432 AAG AAG AGG CAN GAG ATG CCN CCN CAC ATC TAB GCC ATN GCC GAC ACN 480 GCC TAC AGN AGC ATG CTN CAN GAT CGN GAN GAC CAG TCC ATT CTN TGC 528 ACA GGN GAG TCT GGA GCC GGN AAG ACN GAG AAC ACN VAG AAA GTC ATN 576 CAG TAC NTG GCN GTG GTG GCN TCN TCC CAC AAG GGC AAG AAN GAC ANN 624 AGC ATC ACG GGG GAG CTG GAN AAG CAG CTT CTN CAN GCA AAC CCN ATC 672 CTG GAG GCN TTN GGC AAN GCN AAN ACN GTC AAG AAN GAC AAC TCC TCN 720 CGN TTN GGC AAG TTC ATN CGC ATC AAC TTN GAN GTC ACT GGT TAC ATN 768 GTN GGN GCC AAN ATT GAN ACN TAT CTN CTG GAA AAG TCN VGN GCN ATN 816 CGN CAN GCN VGN GAN GAG AGN ACN TTN CAC ATC TTN TAC TAC CTG NTN 864 GCN GGN GCC AAG GAN AAG ATG ANA ANT GAC NTG CTN TTG GAG NGC TTC 912 AAC ANC TAC ACA TTN NTN TCC AAT GGC TTT GTG CCC ATC CCA GCN GCN 960 CAN GAT GAN GAG ATG TTC CAG GAN ACN NTG GAN GCC ATG TCN ATC ATG 1008 GGC TTC ANT GAA GAG GAN CAG CTN NCN NTN TTG AAG GTN GTN TCN TCN 1056 GTC CTN CAG CTT GGA AAC ATN GTC TTC AAG AAG GAN VGA AAC ACA GAC 1104 CAG GCN TCC ATG CCN GAN AAC ACA GCN GCN CAG AAA GTT TGC CAC CTC 1152 NTG GGN ATT AAN GTG ACA GAT TTC ACN AGA NCC ATC CTG ACC CCN CGT 1200 ATC AAA GTT GGA CGG GAN GTN GTG CAG AAN GCT CAG ACN AAA GAA CAG 1248 GCN GAC TTC GCN NTC GAG GCN TTN GCN AAG GCC ACN TAT GAN CGC CTT 1296 TTC CGN TGG ATN CTC AGC CGT GTN AAC AAN GCC NTG GAC AAG ACC CAT 1344 CGG CAG GGG GCN TCC TTC CTG GGN ATN CTG GAN ATN GCT GGN TTT GAN 1392 ATC TTT GAG GTN AAC TCC TTC GAG CAG CTG TGC ATC AAC TAC ACC AAC 1440 GAG AAG CTG CAG CAG CTG TTC AAC CAC ACN ATG TTC ATC CTG GAG CAG 1488 GAN GAG TAC CAG CGN GAG GGC ATC GAG TGG AAC TTC ATC GAC TTC GGN 1536 CTN GAC CTG CAG CCN WGY ATT GAG CTN ATT GAG CGG CCG AAC AAC CCT 1584 CCN GGT GTG CTG GCC CTG CTG GAT GAN GAN TGC TGG TTC CCC AAA GCN 1632 ACA GAN AAG TCT TTT GTG GAG AAG CTN TGC NCA GAG CAN GGN AAN CAC 1680 CCC AAN TTN CAG AAG CCC AAG CAG CTN AAG GAC AAA ACN GAG TTC TCC 1728 ATC ATC CAN TAN GCT GGG AAG GTG GAC TAC AAN GCN AGT GCC TGG CTG 1776 ACC AAG AAC ATG GAC CCN CTN AAT GAC AAN GTG ACN TCN CTC CTC AAN 1824 GCC TCC TCN GAC AAG TTN GTG GCN GAC CTN TGG AAG GAN GTG GAC CGC 1872 ATN GTG GGG CTG GAC CAG ATG GCC AAG ATG ACN GAG AGC TCA CTG CCC 1920 AGN GCC TCN AAG ACC AAN AAG GGC ATG TTC CGC ACN GTG GGN CAG CTN 1968 TAC AAN GAG CAG NTG GGG AAN CTG ATG NCN ACN CTG CGC AAN ACC ACG 2016 NCN AAC TTN GTG CGC TGC ATC ATC CCC AAC CAN GAG AAG NGG TCN GGC 2064 AAG CTG GAN GCN TTN CTN GTG CTG GAN CAG CTG CGN TGC AAC GGN GTG 2112 NTG GAA GGC ATC CGN ATC TGC CGN CAG GGC TTC CCC AAC AGG ATN GTC 2160 TTC CAN GAG TTC CGN CAA CGC TAN GAG ATC CTG GCA GCN AAC GCC ATC 2208 CCC AAN GGC TTC ATG GAT GGN AAG CAA GCC TGC ATT CTC ATG ATC AAA 2256 GCN CTN GAA CTN GAC CCN AAC NTG TAC AGG ATN GGG CAG AGC AAA ATC 2304 TTC TTC CGN ACG GGN GTN CTG GCC CAC CTN GAG GAG GAN CGN GAC NTG 2352 AAN ATN ACN GAN GTC ATC ATG GCC TTC CAG GCN ATG TGT CGT GGC TAC 2400 CTN GCC VGN AAG GCC TTC NCC AAG NGG CAG CAN CAG CTG ACN GCC ATG 2448 AAG GTG ATC CAG AGG AAC TGC GCN GCC TAC CTN AAG CTN CGN AAC TGG 2496 CAN TGG TGG CGN CTC TTC ACC AAN GTN AAG CCN NTG CTN CAG GTG ACA 2544 CGG CAG GAG GAG GAG ATG CAG GCC AAG GAG GAN GAG NTG CAN AAG ATC 2592 ANG GAG CGN CAG CAG AAG GCN GAG ANN GAG NTN VAG GAG CTG VAG CAG 2640 AAG CAC ACN CAG CTG NCN GAG GAG AAG ANN CTG CTG CAG GAG CAG NTG 2688 CAG GCN GAG ACN GAG CTG TAN GCN GAG NCN GAG GAG ATG CGN GTC CGG 2736 NTG GCN GCC AAG AAG CAG GAN CTG GAG GAN ATC CTN CAT GAG ATG GAG 2784 GCC CGC CTG GAG GAN GAG GAA GAC CGG NGC CAG CAN CTN CAG GCN GAG 2832 AGG AAG AAG ATG GCN CAG CAG ATG CTN GAC CTG GAN GAG CAA CTG GAG 2880 GAG GAN GAN GCN GCC AGN CAG AAN CTA CAG CTN GAN AAG GTC ACN GCN 2928 GAG GCC AAG ATC AAG AAN NTG GAG GAN GAC ATC NTG GTN ATG GAN GAT 2976 CAG AAC ANN AAN CTN TCA AAA GAN CGA AAA CTC CTN GAA GAG AGG NTN 3024 AGN GAN TTN ACA ACN AAN CTN GCN GAN GAG GAA GAN AAG GCN AAN AAC 3072 CTN ACN AAG CTG AAG ANC AAG CAT GAN TCN ATG ATC TCA GAN CTG GAN 3120 GTG NGG CTG AAG AAN GAG GAG AAG AGC CGG CAG GAG CTG GAG AAN CTN 3168 AAG NGG AAN NTG GAN GGN GAN GCC AGT GAC NTC CAN GAG CAG ATC GCN 3216 GAC NTN CAG GCN CAG ATN GCA GAG CTC AAG ATG CAG CTG GCN AAG AAN 3264 GAN GAN GAG CTN CAG GCN GCN CTN GCC AGG CTN GAN GAN GAN ANN NCN 3312 CAG AAN AAC AAN GCC CTN AAG AAG ATN CGN GAG CTN GAG GGN CAN ATC 3360 TCN GAC CTN CAN GAG GAC CTN GAC TCA GAG CGG GCN GCC AGG AAC AAG 3408 GCN GAN AAG CAG AAG CGA GAC CTN GGN GAG GAG CTG GAG GCN CTN AAG 3456 ACN GAG CTG GAN GAN ACN CTG GAC ANC ACN GCN ACN CAG CAG GAG CTC 3504 VGN GCC AAG NGG GAN CAG GAG GTG ACN GTG CTG AAG AAG GCC CTG GAN 3552 GAN GAG ACN CGG TCC CAT GAG GCN CAG GTC CAG GAG ATG AGG CAG AAN 3600 CAC NCA CAG GNN GTG GAG GAN CTC ACN GAG CAG CTN GAN CAG TTC AAN 3648 AGG GCC AAG GCN AAC CTN GAC AAN ANC AAG CAG ACN CTG GAG AAN GAG 3696 AAC GCN GAC CTG GCN GGN GAG CTG CGN GTC CTG GGC CAG GCN AAG CAG 3774 GAG GTG GAN CAN AAG AAG AAG AAG CTG GAG GNG CAG NTG CAG GAN CTG 3792 CAG TCC AAG TGC AGN GAT GGG GAG CGN GCC CGG GCN GAG CTC ANN GAC 3840 AAN GTC CAC AAG CTN CAG AAT GAA GTN GAG AGN GTC ACN GGN ATG CTN 3888 ANN GAG GCN GAG GGN AAN GCC ATN AAN CTG GCC AAN GAN GTG GCN TCC 3936 CTN GGN TCC CAG CTN CAG GAN ACC CAN GAG CTG CTN CAA GAA GAA ACC 3984 CGG CAG AAG CTC AAN GTG TCN ACN AAG CTG CGN CAG NTG GAN GAN GAN 4032 NGG AAC AGC CTG CAN GAN CAG CTG GAN GAG GAG ATG GAG GCN AAG CAN 4080 AAC CTG GAG CGC CAN NTC TCN ACN CTN AAC ATN CAG CTC TCN GAC TCN 4128 AAG AAG AAG CTG CAG GAC TTT GCN AGN ACC NTN GAN NNY NTG GAN GAN 4176 GGN AAG AAG AGG TTN CAG AAN GAN ATN GAG NNC CTC ANC CAG CAG TAY 4224 GAN GAG AAN GCN GCN GCN TAN GAN AAA CTG GAN AAN ACC AAG AAC AGG 4272 CTN CAG CAG GAG CTG GAN GAC CTG GTN GTN GAN TTG GAN AAC CAG CGG 4320 CAA CTN GTN TCC AAN CTG GAA AAG AAG CAG ANG AAN TTN GAN CAG TTG 4368 TTA GCN GAG GAN AAN AAC ATC TCN TCC AAN TAN GCG GAT GAN AGN GAC 4416 VGA GCN GAN GCN GAN GCN AGG GAN AAG GAN ACN AAG GCN NTG TCN CTN 4464 GCN CGG GCC CTN GAN GAN GCC NTG GAN GCC AAA GAN GAN CTN GAG VGN 4512 ACC AAC AAN ATG CTC AAN GCN GAN ATG GAA GAC CTN GTC AGC TCC AAG 4560 GAN GAN GTN GGC AAG AAC GTN CAT GAN CTG GAG AAG TCC AAG CGN GCC 4608 NTG GAG ACN CAG ATG GAN GAG ATG AAN ACN CAG CTG GAN GAG YYR GAG 4656 GAN GAN NTG CAN GCC ACN GAG GAN GCC AAN CTG CGG NTN GAN GTC AAC 4704 ATG CAG GCN CTC AAN GNC CAG TTN GAN VGN GAT CTC CAN GCN CGG GAN 4752 GAN CAG AAN GAG GAG AAG AGG AGG CAN CTN CAG VGN CAG CTN CAN GAG 4800 TAN GAG ACN GAA CTG GAA GAN GAN CGN AAG CAN VGN GCN CTG GCN GCN 4848 GCA GCN AAG AAG AAG CTG GAN GGG GAC CTN AAA GAC CTN GAG CTN CAG 4896 GCN GAC TCN GCC ATC AAN GGG NGG GAG GAA GCC ATC AAG CAG CTN CNN 4944 AAA CTG CAG GCT CAG ATG AAG GAC TTN CAN AGA GAN CTG GAN GAT GCC 4992 CGT GCC TCC AGN GAN GAG ATC TTT GCC ACN NCN AAN GAG AAN GAG AAG 5040 AAA GCC AAG AGN NTG GAN GCA GAC CTC ATG CAG CTN CAA GAG GAN CTN 5088 GCN GCN GCN GAG AGN GCT CGC AAN CAN GCN GAC NTN GAG AAG GAG GAN 5136 CTG GCN GAG GAG CTG GCN AGN AGC NTG TCN GGA AGG AAN NCN CTN CAG 5184 GAN GAG AAG CGC CGC CTG GAG GCN NGG ATC GCN CAN CTN GAG GAG GAG 5232 CTG GAG GAN GAN CAG GGC AAC ATG GAG GCN ATG AGN GAN VGN GTN CGC 5280 AAN GCN ACN CNG CAG GCN GAG CAN CTN AGC AAN GAG CTG GCC ACA GAN 5328 CGC AGC ACN GCN CAG AAG AAT GAG AGN NCN CGG CAN CAG CTN GAG CGN 5376 CAG AAC AAG GAN CTN MRN AGC AAG NTN CAN GAG NTN GAN GGN GCN GTC 5424 AAN NCC AAG NTC AAN TCC ACN NTN GCG GCG CTG GAG GCC AAG ATT GCN 5472 CAG CTN GAG GAG CAG GTN GAN CAG GAG GCC AGA GAG AAN CAG GCG GCC 5520 NCC AAG NCG CTG AAG CAN ANN GAC AAG AAG CTN AAG GAN NTN NTG CTG 5568 CAG GTG GAN GAN GAG CGC AAG ATG GCN GAG CAG TAC AAG GAG CAG GCA 5616 GAG AAA GGN AAN NCC ANG GTC AAG CAG CTN AAG AGG CAG CTG GAN GAG 5664 GCN GAG GAG GAG TCN CAG NGC ATC AAC GCC AAC CGC AGG AAG CTG CAG 5712 CGG GAG CTN GAN GAG GCC ACN GAG AGC AAN GAG GCC ATG GGC CGN GAG 5760 GTG AAC GCN CTC AAG AGC AAN CTC AGG VGA GGA AAC GAG NCN TCN TTN 5808 GTT CCT NCN AGA AGG NCT GGN GGN CGT AGA GTT ATT GAA AAN NCA GAT 5856 GGN TCT GAN GAN GAA NBG GAC NCT CGN GAC NCA GAC TTC AAT GGA ACC 5904 AAN NCC AGT GAA TRA 5919

【図面の簡単な説明】

【図１】マウス平滑筋型ミオシン重鎖ＳＭ１アイソフォ
ームタンパク質をコードするｃＤＮＡの制限酵素地図及
び翻訳領域の位置を示す。 プラスミド名：ＳＭ−１Ｆtext プラスミドのサイズ：６１７５ｂｐ 枠内部：翻訳領域 Ａ：ApaI Ｂ：BamHI Sa：SacI Sm：SmaI

【図２】ＣＨＯ細胞にpSE-SM1-Hyg を導入してハイグロ
マイシンで選択して出現したコロニーとＰＡＧＥ２０８
を導入して出現したコロニーとの面積比を示す。

【図３】ＨｅＬａ細胞にpSE-SM1-Hyg を導入してハイグ
ロマイシンで選択して出現したコロニーとＰＡＧＥ２０
８を導入して出現したコロニーとの面積比を示す。

【図４】ＣＨＯ細胞の野生型、ＰＡＧＥ２０８導入クロ
ーン、ＳＭ１アイソフォーム発現クローン（SM1-5-2-
1、SM1-5-3-3）の増殖速度のＭＴＴ法を用いての比較を
示す。

【符号の説明】

ＣＨＯ ＰＡＧＥ２０８−１ ＳＭ１ ５−２−１ ＳＭ１ ５−３−３

【図５】バルーン傷害ウサギモデルの血管壁にＳＭ１遺
伝子を導入した例（実施例）とβ−ガラクトシダーゼ遺
伝子を導入した例（比較例）における内膜肥厚度を示
す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） 5/00 Ｂ (72)発明者 小田 祥二 神奈川県横浜市青葉区桂台１丁目17番30 号 (72)発明者 松田 譲 東京都小金井市貫井南町一丁目22番７号 (72)発明者 高橋 克仁 大阪府池田市鉢塚三丁目９番25−506号 (72)発明者 菅原 理裕 静岡県富士宮市三園平1661 (72)発明者 石山 晴生 神奈川県中郡二宮町中里891−１ (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．88，Ｐ．10676− 10680（1991) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 264，Ｎｏ．17，Ｐ．9734−9737（1989) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 A61K 48/00 A61P 9/10 101 C12N 7/00 A61K 35/76 C07K 14/47 C12N 1/21 C12N 5/10 C12P 21/02 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 平滑筋型ミオシン重鎖ＳＭ１アイソフォ
   ームタンパク質をコードするＤＮＡであって、配列番号
   ２記載の塩基配列からなるＤＮＡ又は該塩基配列におい
   て１もしくは複数の塩基が付加、欠失もしくは置換され
   ているＤＮＡをベクターＤＮＡに組み込んだ組換え体Ｄ
   ＮＡを含有する動脈硬化治療剤。
2. 【請求項２】 平滑筋型ミオシン重鎖ＳＭ１アイソフォ
   ームタンパク質をコードするＤＮＡであって、配列番号
   １記載の塩基配列からなるＤＮＡ又は該塩基配列におい
   て１もしくは複数の塩基が付加、欠失もしくは置換され
   ているＤＮＡをベクターＤＮＡに組み込んだ組換え体Ｄ
   ＮＡを含有する動脈硬化治療剤。
3. 【請求項３】 ベクターＤＮＡがレトロウイルスベクタ
   ー、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベク
   ター又は発現動物用プラスミドである請求項１又は２記
   載の動脈硬化治療剤。
4. 【請求項４】 発現動物用プラスミドがｐＣＸＮ２又は
   ＰＡＧＥ２０８である請求項３記載の動脈硬化治療剤。
5. 【請求項５】 平滑筋型ミオシン重鎖ＳＭ１アイソフォ
   ームタンパク質がヒト平滑筋型又はマウス平滑筋型であ
   る請求項１〜４のいずれか１項に記載の動脈硬化治療
   剤。